JPS61501490A - 組換えｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ分子 ［発明の分野］ この発明は、ＤＮＡ配列、ａ換え体ＤＮＡ分子および特定の血液細胞の産生を制 御する蛋白分子の特異性をもつ蛋白群またはポリペブタイド群の製法に関するも のである。さらに具体的には、この発明は顆粒球・マクロファージ・コロニー刺 激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）として知られている蛋白分子に関する遺伝暗号を指定す るか、あるいは遺伝暗号を指定するフラグメントを包含することを特徴とするＤ ＮＡ配列および組換えＤＮＡ分子に関するものである。

［発明の背景コ 赤血球（赤色血液細胞）、顆粒球、マクロファージおよびリンパ球などのような 血液細胞の産生は、骨髄中の多能性前駆体または幹細胞を刺激する一組の蛋白分 子の制御下に行なわれる。造血過程において、これらの多能性細胞は、始動前駆 細胞、コロ臣−形成細胞または個々の血液細胞に対するＣＦＣ群等の様々の名で 呼ばれる限定された分化能を有する細胞を形成する。フユング、エム、シー、等 著、ネイチャー３０７＠、２３３−２３７頁（１９８４年）およびヨコタ、ティ 等著、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（ アメリカ）８１巻、１０７０−１０７４頁（１９８４年）に記載のいわゆるマル チ−ＣＳＦ　（インターロイキン３）の様な前駆体幹細胞またはＣＦＣ群の非特 異的刺激因子も存在し得るが、一方では個々の異種細胞系に対する特異的調節遺 伝子が存在する。特に、それぞれのＣＦＣ群からの顆粒球およびマクロファージ の産生は、プルゲル、エイ、ダブル６等著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー　２５２＠、１９９８−２００３頁（１９７７年）に記載の顆粒 球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ　）、スタンレイ、イー 、アール、およびハード、ピー、エム、著、ジャーナル・才ブ・バイオロジカル ・ケミストリー２５２巻、４３０５−４３１２頁（１９７７年）に記載のＩｌＸ 泣球コロニー刺激因子およびニコラ、エフ。エイ、等著、ジャーナル・才ブ・バ イオロジカル・ケミストリー　２５８巻、９０１７−９０２１頁（１９８３年） に記載のマクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の様な糖蛋白の制御 下で行なわれる。これらの糖蛋白は体内での発生量が少ないにもかかわらず、一 部分のアミノ酸配列分析および生物的特徴づけのために少量のねずみＧＭ−ＣＳ ＦをＩＥすることが可能であった。

しかし、これらの蛋白の代替源を発見できるまでは、この上うな少量では臨床的 応用には不十分である。しかしながら、もしこれらやコロニー刺激因子が化学的 にまたは生合成的に産生できれば、これらの因子を使用することによって生体内 の血液細胞産生を向上し、実験室において輸血用の血液細胞を産生じ、白血肩細 胞が熟成するのを促進することが可能になるであろう。これら各々の応用につい て、血液細胞の型が制限されるのは避けられない。特に、リンパ球および／また はそれらの前駆体を産生または活性化するのを制限することは重要である。従っ てマル疾患に応用できると同時に、ＧＭ−Ｃ９Ｆ、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ の様な糖蛋白の用途も、これらの糖蛋白が一次感染に対抗しまたは破壊された組 織を除去するために必要な細胞の産生のみを刺激するという理由で特に重要であ る。

［発明の簡単な記載コ この発明は哺乳類の顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子Ｐ（ＧＭ−Ｃ９ Ｆ）またはこの因子の単一性または複合性塩基置換、欠失、挿入または逆転の遺 伝暗号を指定するＤＮＡ配列を提供するものである。

ら誘導するものであり、試験管内で上記のものを含むｍＲＮＡ混合物からＧＭ− ＣＳＦ合成を指令する能力があるａＲＮＡの種を選択し得るものである。

別の実施′に３１として、この発明は、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを含むｍ ＲＮＡ源を８１し、（ｂ）上記１ＩＲＮＡ源の二重鎖ＤＮＡ復製を合成し、（Ｃ ）上記ＤＮＡ複製をクローン化し、（ｄ）合成ＧＭＣＳＦプローブを調整し、（ ｅ）段Ｐｒ１（ｄ）のプローブを用いたコロニーハイブリダイゼイションによっ て段１Ｍ（ｈ）のＤＮＡＰＸＥを潜んだりσ−ンを選択し、（Ｄさらに上記プロ ーブとハイブリダイゼイシ３ンしたクローンを採取する段行から成るＧＭ−Ｃ５ Ｆの遺伝暗号を指定するＤＮＡ５２列の製法を提供する。

別の実施態様として、この発明は、組換え型として、コード配列が顆粒球・マク ロファージ・コロニー・刺激因子（ＧＭ−Ｃ９Ｆ）と実質的にｌ対ｌに対応する 、蛋白暗号化部分を育するＤＮＡ配列を含むクローン化ベクターを提供する。

さらに別の実施態様として、この発明は、宿主内で作用するプロモーターフラグ メントとＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定するＤＮＡ断片を含み、Ｄ　Ｎ　Ａ断片 はＣＭ−Ｃ５Ｆ−ＤＮＡが宿主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白として発現されるよ うにプロモーターと共に配向されている発現ベクターによって形質転換された宿 主器官を培養することから成る顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ｃ Ｍ−ＣＳＦ）の製法を提供する。

最後に、この発明は刺激に効果的な量の顆粒球・マクロファージ刺激因子を上記 顆粒球およびマクロファージの各々のＦＪ駆細胞と接触させることから成る顆粒 球およびマクロファージの産生を刺激する方法を提供する。

［図面の簡単な説明］ 第４図はＧＭ−ＣＳＦクローンを同定するために用いた合成オリゴヌクレオチド を示している。ねずみＧＭ−ＣＳＦ　（残基７〜１６）のアミノ酸配列の一部が 一番上の段に、このペプチド断片の遺伝暗号を指定できるヌクレオチド（ｎＲＮ Ａ）配列の可能な組合せを中央に、ｌｌｌＲＮＡの領域に対して相補的なオリゴ ヌクレオチドプローブの４つの異なる組を下に示す。

第２（ａ）［ｉＵは、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの、およびＩ）ＧＭ３７と９６Ｍ ３８のクローンの、遺伝子地図である。このｍＲＮＡは鎖長１２００ヌクレオチ ドになる。成熟蛋白を暗号指令するｍ　ＲＮ　Ａの領域を太い線で示す。非翻訳 領域はＵＴで表し、推定される前駆体ペプチドはＰで表す。９０Ｍ３７クローン およびｐＧＭ３８クローンを中に含む領域を棒線で示す。９６Ｍ３８は図（ｂ） に表示された配列のヌクレオチド１４からポリＡ末端まで延びており、一方ｐＧ Ｍ３７はヌクレオチド配列５゜から位置５７４に表示された配列まで延びている 。

第２（ｂ）図は、ＧＭ−ＣＳＦのＷＲＮＡのヌクレオチド配列およびＧＭ−ＣＳ Ｆの内包されたアミノ酸配列を示している。示されたヌクレオチド配列はｐＣ； Ｍ３７および９６Ｍ３８のクローンから由来する複合配列である。そして、９０ Ｍ３７のヌクレオチド配列がｐＧＭ３Ｂのヌクレオチド配列およびｐＧＭ３７オ ルターナテイプと異なる３点が線の下に与えられている。ｍＲＮＡ−同義ストラ ンドは上で与えられたにＭ−ＣＳＦアミノ酸配列配列に５゛から３′にリストさ れている。列の終端にある数字は、その列の最終残基（アミノ酸またはヌクレオ チド）の位置を示す。Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆについて決定した部分のアミノ酸配列 はクローン由来の配列上に示される。また、二者の間に一致しない所がない位置 にダッシュを付す。蛋白分析による最初のアミノ酸残基は同定できず、疑問符で 示す。

第３図は、ｐＪＬ３ベクターの地図を示している。５Ｖ−４０由来のまたはｐＡ Ｔ１５３の配列を示している。

第４図は、ｐＧＭ由来の３１ｐで標識したＤＮＡを用いてハイブリダイゼイショ ンさせた種々の細胞中のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの検出を表示第５図は、胎児の 肝臓の造血前駆細胞（上のプレート）および複合−ＣＳＦ依存性３２Ｄ　Ｃｌ２ ａｌ胞（下のプレート）の培＃悲濁液での細胞の増殖を、ｍＲＮＡを注射したつ めがえるの卵母細胞の培養基を用いて刺激したものを表示する。非分画ＬＢ３の ｍＲＮＡは太線で示され、ｐＧＭ３８のＤＮＡにハイブリダイゼイションして選 択したｍＲＮＡは〇−〇で示され、ベクターＤＮＡのみによって選択したらのは 〇−〇で示される。３つの異なる曲線は３つの実験を現わしている。

第６図は、ＬＢ３細胞由来のｐＧＭ３１１１択ｍＲＮＡで注射した卵母細胞から 得た培養基で刺激後の精製胎児肝臓造血前駆細胞の４日培養懸濁液の写真である 。分裂活性および成熟中の顆粒球とマクロファージの産生が注目される。

第７図は、ｐＧＭ３８由来の！″Ｐ標ｍＤＮＡでハイブリダイゼイションしたＥ Ｃ０ＲＩまたはＰｓｔＩ消化ＤＮＡ由来のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を検出したものを 表示する。

［発明の詳細な説明］ この発明は、特異的血液細胞調節遺伝子である顆粒球・マクロファー。

ノ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）を産生ずるための組換え体ＤＮＡ分子の 産生および特徴づけに関するものである。特にこの発明は、細菌および動物細胞 のような代替宿主中におけるＧＭ−ＣＳＦ産生に基礎を与えるで特に重要である ことを示し得るねずみＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定するＤＮＡ分子の製造を包 含する。例てして、この発明のＤＮＡ分子は、ひとの顆粒球およびマクロファー ジの産主に使用するための等価ひとＣＭ−ＣＳＦに対する遺伝子配列を単離する プローブとして使用できる。

一つの実施５様において、この発明は少なくともその一部が、ねずみＧＭ−ＣＳ Ｆの生物学的活性を示している蛋白またはポリペプチドの遺伝暗号を指定するこ とを特徴としたＤＮＡ配列を提供する。この発明に係る特異的なヌクレオチド配 列を第２　（ｂ）ＥＵに示す。

この発明を実施する上で有用なヌクレオチド配列を宿すクローンは以下に示すク ローン化法によって得られる。

［ねずみＧＭ−Ｃ５ＦのｃＤＮＡのクローンの単離コ最良のＧＭＣＳＦ供給源の 一つは、刺激されたはっがねずみの肺である。エンドトキシンで処置したはっか ねずみ由来の肺のｗＲＮＡに対する１０’個より大きいｃＤＮＡの相補的クロー ンのライブラリーは実施例Ｉで詳細に述べる。

組換え体を含むｃＭ−ＣＳＦは、蛋白の一部のアミノ酸配列から予測される、Ｇ Ｍ−Ｃ９ＦのｃＲＮＡ配列の内２つの部分に相補的な、短い合成オリゴヌクレオ チドをプローブとして使用するこのライブラリーで同定された。第１図は、残基 ７と１６の間のＧＭＣＳＦアミノ酸配列、このペプチドを暗号化することのでき るヌクレオチド配列の可能な組合せおよびハイブリダイゼイション・プローブと して使用されたオリゴヌクレオチドの領域を示している。アミノ酸残基９の指定 がはっきりしない（ヒスチジンまたはシスティンのいずれか）ので、この領域を 包含する異なった２組のオリゴヌクレオチドが生成される。９の位置にプローブ ｌはヒスチジン残基を採り、プローブ２はシスティンを採る。アミノ酸配列をそ の中に伴う第２の領域は４８の部分からなる変性した２組として合成される極端 に変性した１組のオリゴヌクレオチドを必要とする（プローブ３および４）。

ＧＭ　ＣＳＦ、ｌ換え体を同定するために、コロニー・ハイブリダイゼイション ・アッセイを行った。寒天平板上でｃＤＮＡクローン群のライブラリーを単一コ ロニ一群として生育させ、コロニ一群の複製を、ニトロセルロース・フィルター に移植し、そこでコロニーを溶解しプラスミドＤＮＡをその場所で固定する。こ れらのフィルターを′Ｐで標識した総ての合成オリゴヌクレオチド・プローブの 混合物でハイブリダイゼイションすることによってスクリーニングする。

ハイブリダイゼイション後フィルターを洗浄しプローブでハイブリダイズされた コロニ一群をオートラジオグラフィーで同定する。この方法を用いて、プローブ の混合物でハイブリダイズした２２の独立組換え体を同定する。これらの内のい くつかはオリゴヌクレオチドの内の１つと偶然相同である不適当な配列を発現さ せ得るが、共生のＧＭ−ＣＳＦ配　。

列がプローブ３／４と１もしくは２の両者とハイブリダイズしなければならない ので、不適当な配列が独立に２つの異なったプローブとハイブリダイズすること は起りそうにない。それで両方の２２クローン白来のプラスミドＤＮＡを単離し 、３枚のアガロースゲルで電気泳動さけた。

ＤＮＡをサースン法（ジャーナル・才ブ・モレキュラー・バイオロジー９８巻、 ５０３頁（１９７５年）によってニトロセルロースに移植し、３枚のフィルター を３つの異なったプローブを独立に用いてハイブリダイズする。実験した２２の クローンの内２つ（クローン３７および３８）をプローブｌと３７４の両方でハ イブリダイズし、それからＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡと成るための強力な候補を現し た。

［クローンの同一性の確認］ ２つの実験系はクローン３７および３８が実際にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子配列に関与 していることを示している。最初に、クローン群のヌクレオチド配列を決定し、 遺伝暗号の指定されたアミノ酸配列と共に第２（ｂ）図に示した。クローンのヌ クレオチド配列によって予測されるアミノ酸配列は蛋白を分匠して決定したＮ末 端アミノ酸配列と実質的に一致する。

ただし、比較した２９の位置の内両者の食い違いがたった４つだけある。

良い違いの内２つは、蛋白配列に仮に指定されただけの位置に起る。さらに、ク ローンのヌクレオチド配列は、ＧＭ−Ｃ５Ｆ蛋白に対して予期されるのと極めて 近い分子ｆｆ１（１３，５００ダルトン）をもつペプチド　。

を予告する。

二番目に、クローン３８は生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦのｍ　ＲＮ　Ａを特異 的に選択できる。クローン３８のＤＮＡ　（および親のプラスミドｐＪＬ３由来 のＤＮＡ）をニトロセルロース上に固定し、細胞をｃｏｎＡで刺激した後、はつ かねずみの肺およびＧＭ−ＣＳＦおよび関連（但し別個の）調節因子ＩＬ３を造 るＴセルラインからのＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼイション後 、フィルターを洗浄しノーイブリダイズされていないＲＮＡを取り除き、その後 特異的にハイブリダイズしたＲＮＡを溶出する。このＲＮＡをつめがえるの卵母 細胞に４射しく外来のｍＲＮＡを置換する能力がよ＜Ｘ２録されている）、その 培養基のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ３の存在を３−５日後測定する。数回の実験結 果は、（２）ベクターＤＮＡはそれ一つではＧＭ−ＣＳＦのｒｘ　ＲＮ　Ａを選 択しないし、（ｂ）クローン３８のＤＮＡは肺のＲＮＡからとＬＢ３からの両方 から由来のＧＭ−ＣＳＦを選択し、および（Ｃ）クローン３８は特異性を内部制 御するＬＢ３のＲＮＡ由来のＩＬ３のｍＲＮＡを選択しないということを示して いる（実施例ＩＩを参８）。

３番目の実験は、クローン３８を同定するための強力で付加的な支持を提供する 。ノースン・プロッティング法でハイブリダイゼイシ３ン・プローブとして使用 されると、クローン３８は、ＧＭ−ＣＳＰを合成しないリンパ細胞のある骨髄の 範囲でなく、ｃｏｎ　Ａで刺激されないＬＢ３細胞由来のＲＮＡ中でもなくて、 Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆを合成する細胞（はつかねずみの肺およびｃｏｎＡで刺戯し たＬＢ３）から由来するＲＮＡ中にある長さ約１．２ｋｂのｍＲＮＡ［を検出す る。従って、ＬＢ３の場合にはクローン３８に対応するｍＲＮＡがＧＭ−ＣＳＦ ’蛋白と共に誘導できる（実施例ＩＩＩ参照）。

［この発明を実施するのに有用な株の寄託］以下に記載する株の生物学的に純粋 な培養物の寄託は、１９８５年２月２１日付でアメリカ合衆国マリ−ランド、ロ ックビル、パークラウン・ドライブ　１２３０１番のアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクシランに行った。生存試験及指示された取得番号が与えられ、必 要な料金を支払った。上述の培養の入手は、本特許出願が係属中、３７Ｃ，Ｆ、 Ｒ，ｆｌｌ、１４および３ｓｖ、ｓ、ｃ、　弓１２２＋７）下に長官によって決 められた方法で入手可能である。公衆に対する上述の培養の入手の可能性におけ る全ての制限は本出願の特許後に不可逆的に取り徐かれる。そして、上述の培養 は、備え付けの標本を最も最近に請求してから少なくとも５年間、またはいかな る場合にも寄託の日から少なくとも３０年の終りまで不変的に入手可能にしであ る。もしその培養が生存不可能になったり不注意にもそこなわれた場合には、同 じ分類学的内容の生存可能な培養（Ｓ）で置き換える。

［抹／プラスミド］　［ＡＴＣＣ番号］ｐＧＭ３７　５３０３２ ｐＧＭ３８　５３０３６ ［ｐＧＭ３７およびｐＧＭ３８の有用性］ねずみＧＭ−ＣＳＦのクローン化可能 な遺伝子情報源を提供することに加えて、ここに記載するハイブリッドＤ　Ｎ　 Ａ分子ら、他の哺乳類のＤＮＡライブラリーから関連遺伝子配列を検出または分 離するためのプローブとして有用である。関連遺伝子配列を検出する用途では、 このプローブは分析的に検出可能な試薬で適当に標識される。しかしながら、本 発明は標識するいかなる特定手段によっても限定されるべきでない。実施例は、 検出のため放射ｉｎｉを使うが、他の検出法は当業者に公知であり簡単に代用し てもよい。代替系としては、ビオチン・アビジン、蛍光染料、蛋白、誘導したプ ローブ分子に対する抗体が使用されるかまたはＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド自体 に対する抗体が使われるＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセイ、およびその中で 一本鎖のＤＮＡか酵素の不活性サブユニットで標識され、およびプローブが、ハ イブリダイゼイションにおいてサブユニットが再結合し酵素活性が復活するよう に第２の不活性サブユニットで標識されるアッセイが含まれるが、これらに限定 されるものではない。

クローン化した配列は発現ベクター中ヘサブクローン化されてもよい。

遺伝子配列が一部の配列を欠失しているかもしれない場合にはそのような配列を 化学的に合成し、クローン化した配列と連結して発現ベクター中に導入できる。

適切な発現ベクターの選択は、この分野の技術者の技術のｃＡ囲内にある。最小 限として、この発現ベクターが形質転換される宿主内で作用するプロモータ・フ ラグメントと適当なエンドヌクレアーゼ開裂部位をＧＭ−Ｃ３Ｆの遺伝暗号を指 定する遺伝子配列が結合できるように含んでいる。

［実施例１］ この実施例は、この発明を実施するのに有益なＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡクローン 群の単離を示す。

［はっかねずみの肺のｍＲＮＡの単離］Ｃ５７ＢＬ／６はつかねずみ９０匹に細 菌性内毒素（５μｇ／−匹）を注射する。３時間後、肺を摘出し、血清非含有ダ ルベツコ改良イーグル培地（セリダン・ジエイ、およびデ仁メカルフ著、ジャー ナル・オプ・セルラル・フィジオロジ−８１巻、１１−２４頁（１９７３年）） 中で試験管内でインキュベイトする。０．５お上び１５時間後、一群３０組の肺 を６０秒間、１モル　トリス（ｐＨ７，５）、１モル　Ｎ　ａ　Ｃｌ　ｓ１モル ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２００ｔｔｇ／ａｉ、プロテイナーゼ　Ｋを含む１ ５０ｍ、ｌ溶液中でホモジナイズする。３７℃で１時間インキュベイトした後、 ホモジナイズ液を７モル　尿素、０．３５モルＮ　ａ　Ｃｌ　ｓｌＯミリモルＥ ＤＴＡ、１％ＳＤＳおよび１０ミリモル　トリス−Ｃ１゜（ｐ）（７，４）を含 む同量溶液と混合し、その後フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコー ルで抽出する。エタノールを加えて水相からＲＮＡを沈降させる。２段階のオリ ゴ−ｄＴセルロース・クロマトグラフィによって全ＲＮＡからポリＡ゛のＲＮＡ を選択する。別に３回試験管中で培養して製造したＲＮＡを保存する。

［ｃＤＮＡクローン群の合成および構造］標準の技術［エブストラティダス、エ イ等著、セル　７巻、２７９−２８８頁（１９７６年）およびマニアティス、テ ィ等著、「モレキュラル・クローニング」（コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボ刊、ニューヨーク（１９８２年））］を用い、第−埴を合成するためのにわ とり骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素および第二鎖を合成するためのエッシエリヒ ア・コリＤＮＡポリメラーゼｌ　（クレノー・フラグメント）を用いて、保存し た肺のｍＲＮＡの二重鎖コピーを合成する。Ｓ１ヌクレアーゼでヘアピンループ を開裂した後、ターミナルジオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ミッチ ェルソン、エイ、エムおよびエン。オーキン・シエイ、著、バイオロジカル・ケ ミストリー　２５７＠、１４７７３−１４７８２頁（１９８２年））を用いて、 オリゴ（ｄＣ）末端を付加する。

連結したｃＤＮＡを１．５％アガロース上で電気泳動して分画し、長さが５００ 塩基以上の長い分子を採取し、ｄＧ連結ＤＮＡプラスミドにアニール化する。用 いたプラスミド（ｐＪＬ３）は、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｐＡＴ１５３由来の ＤＮＡ複製の起点、ＤＮＡ複製およびＴ抗原暗号を指定する配列ＳＶ４０起点お よびＳＶ４０の後期プロモータに隣接する複合クローニング部位を含むＳＶ４０ に基づく発現ベクターである（第３図参照）。ＤＮＡベクターｌμｇ当り！０１ 耘換転換得るかなり効果的な形質転換によってエッシエリヒア・コリ（Ｅ、　ｃ ｏｊｉ　）　ＭＣ１０６１（カサダボン、エムおよびニス、コーエン著、ジャー ナル・才０００−３，０００のアンピシリン耐性クローンを包含する４６の独立 プールを一７０℃で１０％グリセロール中に保存する。

［ｃＤＮＡクローンのスクリーニング］コロニー・ハイブリダイゼイションによ ってスクリーニングするため、各プールから約４，０００個の細菌コロニーを寒 天平板（４０μｇ／ｄアンピシリンを含む）上に形成し、これをニトロセルロー スフィルターディスク１こ移し、プラスミドＤＮＡを２００μｇ／麿２　クロラ ムフェニコール（ハナハン、ディ・およびエム、メセルソン著、ジーン　１０巻 、６３−６７頁（１９１１１０年））を含む寒天平板上でフィルターをインキュ ベイトして増幅する０元の平板でコロニーを再生した後、第２のニトロセルロー スフィルターを造る。マスタープレートを２回再生した後、４℃で保存する。プ ラスミドＤＮＡを細菌コロニーから溶離し、ニトロセルロースフィルターに固定 するにコラ・エヌ、およびディ、メヵルフ著、ジャーナル・才ブ・セルラル・フ ィジオロジ−１１２＠、２５７−２６４頁（１９８２年））。ハイブリダイゼイ ションする前に、そのフィルターを数時間、３７℃で、５Ｘｓｓｃ　（ＳＳＣ＝ ２．５モルＮａＣｆ１．０．０１５　モル’）エン酸＋　）　’Ｊ　ウＡ）、０ ．２％Ｖイコ　ｋ、０．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および変性さけ精 子ＤＮＡ（５０μｇ／ｗｌ）と変性エッンエリヒア・コリＤＮＡ（１０μｇ／ｍ ｌ）を含む０．２％うし血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）中でインキュベイトする 。０．１％ＮＰ４０を含む上記と同様の溶液で、３７℃で約１８時間ハイプリダ イゼイションする。［γ−”Ｐｌ　ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用 いて、上記合成オリゴヌクレオチドプローブを放射性ｉｔする。

各々は１．５ｎｍ／ｉｉ、でハイブリダイゼイション反応物中に存在する。ハイ ブリダイゼイション後、フィルターを６ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用い４ ２℃で隅々まで洗浄しオートラジオグラフに付す。！Ｒフィルター上の完全なコ ロニーを取り、前と同様にして密度を下げて再スクリーニングする。

１００．０００以下のｃＤＮＡクローンをスクリーニングし、２２の陽性物を得 、そのうち２つ（ｐＧＭ３７および９０Ｍ３８）をプローブｌおよびプローブ３ ＋４と別々にハイブリダイズし、したがってＧＭ−ＣＳ　Ｆ暗号化配列を含むた めの有力候補となった。

［実施例■］ この実施例はＧＭ−ＣＳＦの合成を指令する力のあるｍＲＮＡを選択する９０Ｍ ３８の能力を立証する。

［ＧＭ　ＣＳＦの検定］ ＧＭ　ＣＳＦ　ｍＲＮＡをつめかえる卵母細胞中で同定し、この培養基が３種の ミクロ培養系、（１）　４種全てのコロニー・刺激因子に直接応答する精製胎児 肝臓造血前駆細胞を含む液体培地（プルゲス、エイ、ダブル、等著、ブラッド　 ６０巻、ｌ　２１９−２３頁（１９８２年））、（２）４［全での刺激因子によ って刺激されうる形態学的に同一とみなし得る顆粒球、マクロファージ・コロニ ーを形成する骨髄細胞を含むミクロ寒天培地および（３）複合ＣＳＦに応答しＧ Ｍ−ＣＳＦには応答しない因子従属マストセルライン３２Ｄ　Ｃ１３を含む液体 培地での顆粒球／マクロファージ増殖を刺激する能力を検定する。この組の検定 から見て、ＣＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦは疑いなしに識別できる。

［種々の細胞におけるＧＭ　ＣＳＦ　ａ＋ＲＮＡの検出］初めに、種々の細胞型 において９０Ｍ３８に関連する転写の発生量がＧＭ−Ｃ３Ｆを合成するそれらの 細胞の能力と平行して表れるかどうかを決める。はっかねずみの肺（ＧＭ−ＣＳ Ｆを合成する）からとＧ　Ｍ　−ＣＳＦを生成しない種々の細胞から由来するメ ツセンジャーＲＮＡ　ｍＲＮＡをホルムアルデヒド寒天ゲル上で分画し、ニトロ セルロースに移し、上に詳説した９０Ｍ３８から誘導したプローブでハイブリダ イゼイションする。第４図はこのプローブが、はっかねずみの肺由来のＩ＋１Ｒ ＮＡ上に約　１．２キロ塩基（ｋｂ　）という低い発生量を検出したことを示し ている（レーン３）が、ＧＭ−ＣＳＤを合成しない任意に選択した数種の・細胞 系由来のＧＲＮＡには胸腺腫由来の細胞系であるティヵウト（ＴＩＫＡＵＴＸレ ーン１）およびプラズマ細胞腫（レーン２）では検出しないことを示している。

さらにこのプローブを行なって、複合ＣＳＦ％Ｇ−Ｃ９ＦおよびＭＣ５Ｆをそれ ぞれ合成するＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ−（レーン６）、Ｒ１１１（レーン７）および Ｌ細胞（レーン８）由来のｍＲＮＡに転写していることを検出しなかった。肺の ｒＰＩＲＮ　Ａに９０Ｍ３８に関連する転写の発生がかなり低いのは意外なもの で、肺のｃＤＮＡライブラリーのｐＧＭ３８関連ｃＤＮＡクローンでまれにしか 見られないものである（５０，０００中１以内）。

ｐＧ＼１８３に対して相補的な転写がＧｋｌ−Ｃ９Ｆ産生に関連しているかどう かについてのさらに重要な試験として、ＣＭ−Ｃ３Ｆおよび複合Ｃ５Ｆの両方の 合成がコンカナバリンＡによってその中で誘発されるクローン化した１９２６球 セルライン（ＬＢ３）を用いた。第４図は、ｐＧＭ３８追跡プローブはコンカナ バリンＡで刺激されたＬＢ３細抱中に豊富にｍＲＮＡを検出する（レーン５）が 非刺激のＩ、Ｂ３細胞由来のｌＲＮＡでは転写を検出しないことを示している（ レーン４）。用いたプローブが、ＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ−’中の複合ＣＳＦ露ＲＮ Ａにハイブリダイゼイションしていないので、このことは９０Ｍ３ｇがＬＢ３細 胞中ＧＭ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡにハイブリダイゼイションしたことのいっそうの証 拠になる。

種々の！ｉｌｌ胞中のＧＭ　Ｃ９Ｆ　＠ＲＮＡの検出は以下のように行なわれる 。ＴＩＫＡｔＪＴ（レーンｌ）、Ｐ３（レーン２）、はつかねずみの肺（レーン ３）、非刺激ＬＢ３　（レーン４）、コンカナバリンＡ刺激ＬＢ３　（レーン５ ）、ＷＥＨ１３Ｂ　Ｄ−’（レーン６）、ＲＩＩＩ（レーン７）およびＬ細胞（ レーン８）由来のポリ（Ａ）５Ｆｇをそれぞれ１％ホルムアルデヒド／寒天ゲル 上で電気泳動し、ニトロセルロースに移し、ニック・トランスレーション（ｎ１ ｃｋ・ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）法（リグビー、ビー、ダブル、ジエイ５等著 、ジャーナル・才ブ・モレキュラー・バイオロジー　。

１１３巻、２３７−２５１頁（１９７７年））によってｆｆ１ｐ標識された２０ Ｍ３８の完全挿入をスパンするＤＮＡフラグメントとハイブリダイゼイションす る。６５℃で１６時間、２１ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、０．２％フィコール、０ ．２％ＰＶＰ　および変性さけ精子のＤ　Ｎ　Ａ　５０Ｆｇ／ｍＬを含む０．２ ％ＢＳＡ中でハイブリダイゼイションする。ＬＢ３（以前はＢ３）は、白血球培 養を混合したＢＡＬＢ／Ｃ抗ＤＢＡ／２から誘導し、インターロイキン−２の存 在下で被照射ＤＢＡ／２牌臓細胞（１５００Ｒ）と−週間継代で維持されたクロ ーン化ＴｂＹ−１″″、Ｌｙｔ−２−１ＭＴ４”　＋リンパ球である。フンカナ バリンＡＩｉ′ｌＩ激ＬＢ３細胞は、５％子うし胎児の血清を含んだ組織培養基 中で５時間、コンカナバリンＡ５μｇ／ｎｉと共にｌ　ａｌｌ中に１０６の割で 細胞を培養することによって製造する。分子量マーカーを用いると、推定分子量 は、咄乳類２８および１８５のｒＲＮＡは４７００および１８００ヌクレオチド 、エッシェリヒア・コリ２３および１６Ｓのｒ　ＲＮ　Ａは２９０４および１５ ４１ヌクレオチドである。長時間オートラジオグラフィにかけた後では、残りの ２８ＳｒＲＮＡに低水準のハイブリダイゼイションしているのが明らかである（ トラック　１−３）。

［ＧＭ　ＣＳＦ　０ＩＲＮＡのハイブリッド選択およびつめがえるの卵母細胞中 への移植］ ハイブリッド選択は、基本的にミラー、ジエイ、ニス、等著、（メソッド・才ブ ・エンチモロジ−１０１巻、６５０−６７４頁（１９８３年））に記載のように 形成された。２０Ｍ３８またはベクター（ｐＪＬ３）ＤＮＡ　（５−μｇ部部分 木）をニトロセルロースの小さな四角い左上に付けて、コンカナバリンＡ刺激Ｌ Ｂ３　（５０％ホルムアミド中）のｍＲＮＡの一部１−２μｇ、０．５　モルト リス−Ｈ（４（１）Ｈ７，５）、０．７５モルＮａＣＪｊ、０．００２モルＥＤ ＴＡ、０．４％ＳＤＳおよび１０Ｆｇ／ｒＡｆ！、エッシェリヒア・コリのｔＲ ＮＡと共に、反応容量３０μえ、３７℃で１６時間培養する。培養後、５戸紙を ハイブリダイゼイション用緩衡液中、３７°Ｃで含入りに洗浄し、その後５２℃ で１０ミリモルトリス−ＨＣＬ　（ｐＨ７，５）および２ミリモルＥＤＴＡを用 いて洗浄する。結合したＲ　Ｎ　Ａをエッシェリヒア・コリのｔＲＮＡｌ、５Ｆ ｇを含む１０ミリモルトリス−Ｈ（４（ｐＨ７，５）および２ミリモルＥＤＴＡ 、３００μＬ中で１分間煮沸して溶出する。酢酸ナトリウムおよびエタノールを 加えてＲＮ　Ａを沈澱させ、１６時間、−２０℃で冷やす。遠心分離後、沈降し たＲＮＡを冷７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、１ミリモルトリスーＨＣえ（ ｐＨ７，５）および０．１ミリモルＥＤＴＡ　１．’５μえに溶かす。各々のＲ ＮＡ標品に対して、つめがえる卵母細胞３０個ごとの集団に一卵当りＲＮＡ５０ 　ｎＪ！−の割合で注射する。非分画ＬＢ３のｍＲＮＡは一投与につきｌμｇ／ ｍｌであり、−卵当り５０ｎ４注射した。

注射した卵母細胞を４日間培養した後、卵母細胞培養基を５％子うし胎児の血清 を含む培養基で１＝２に希釈し、シ濾過し、５μｇ容量を、１４日ＣＢＡ胎仔肝 臓前駆細胞分画蛍光活性化細胞ソーター２００を含む１５μＱ培美中で系列希釈 して２００・３２ＤＣ１３細胞にっていてアッセイした。第５図の各点はインキ ュベーション２日後の２培養からの平均細胞カウントを示す。

初めに、ｐｃｙ３ｓのＤＮＡがはつかねずみの肺のＲＮＡからＧ　Ｍ　−Ｃ５Ｆ 　ＷＲＮＡを選択できるかどうかを決定するために試験した。非分画の肺のｍ　 ＲＮ　Ａまたは９０Ｍ３８のＤ　Ｎ　Ａと／％イブリダイズして選別した＠ＲＮ Ａをつめがえるの卵母細胞の中に注射すると、きわめて低いレベルのＣ９Ｆ活性 が培養基中に検出されるが、°この知見は、はつかねずみの肺にあるｐＧＭ３Ｂ に対応している１ＲＮＡが極めて少ないことから予測されるたちのである（第４ 図）。対照的に、コンカナ、（リンＡで刺激したＬＢ３細胞群（ＧＭ−Ｃ５Ｆお よび複合ＣＳＦの両方を合成する）由来の０１　ＲＮ　Ａは９０Ｍ３８に対応す るＷＲＮＡに富んでおり（第４図）、つめがえるの卵母細胞の中に注射したとき 、胎児肝臓お上び３２Ｄ　Ｃ１３細胞の増殖を刺激する物質で高濃度に生成する よう再指示する（第５図）。それで、９０Ｍ３８またはベクターＤＮＡ群のいず れかを含んだ３枚の１紙を上述と同様のハイブリッド選択実験によって、コンカ ナバリンＡ＠ｆｉＬＢ３のａＲＮＡを作用させた。第５図は、９０Ｍ３８のＤＮ Ａによって選択したｍＲＮＡを用いて注射した卵母細胞由来の培養基が胎児前駆 細胞の増殖を強力に刺激し、成熟途中の顆粒球とマクロファージの成長を刺激し たこと（第６図）を示している。これらのつめがえる調製培養基も微量寒天培養 （１８％顆類球、５３％顆粒球・マクロファージ混合物および２９％マクロファ ージのコロニー）で典型的な顆粒球・マクロファージ・コロニー影成を刺激する 。他のどんな検出においても、これらの卵母細胞調整培養基が赤血球細胞、巨大 核細胞または好酸性細胞の増殖を刺激し、したがって活性因子が複合ＣＳＦでは なくＧＭ　ＣＳＦであるという証拠はなかった。この結論のｉ認として、これら の卵母細胞調製培養基が３２Ｄ　Ｃ１３細胞の増殖を刺激することができないと いうことが分かった。ベクターＤＮＡだけではＧＭ−ＣＳＦまたは複合ＣＳＦに 対応するｍＲＮＡを選択しない（第５図のＳＦおよび複合ＣＳＦのＷＲＮＡ群を どちらも含む混合物からＧＭ−Ｃ９Ｆの独特の生物学的特徴を持つ因子の暗号配 列を指令するｍＲＮＡを特異的に選択できることを示している。

［実施例ｍ］ この実施例はＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。

ｐＧＭ３７および９０Ｍ３８のｃＤＮＡ部についてのヌクレオチド配列分匠は、 同じｍＲＮＡの重複部分に相捕的な配列を含んでいるこれら２つのクローンが推 定ＧＭ−ＣＳＦのｔＡＲＮ　Ａ配列を有していることを示している。この２つの クローンのｃＤＮＡ部とｍ　ＲＮ　Ａの関係を第２ａ図に示す、第２ｂ図に与え られたヌクレオチド配列は両方のクローンから誘導した複合物である。ｍＲＮＡ のポリ（Ａ）末端に対応しており、ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡ　（はとんど の真核生物のｍＲＮＡの３゜末端の近くで見られる）より前に置かれる２０アデ ノシン残基の区間が９０Ｍ３８の一方の末端に現れる。これはｃＤＮＡクローン の配列と膿ＲＮ　Ａの配列の配向を可能にする。　第２ｂ図に表した配列は一本 の３５４ヌクレオチドの長いオープン・リーディング・フレームを含む、そして この領域によって予告されたアミノ酸配列は成熟蛋白の最初の残基から発現し、 ヌクレオチド配列の上方に示す。残基２から２９まではアミノ酸配列が、ｃＤＮ Ａによって予告された上記配列を示すＧＭ−ＣＳＦに対する部分的なＮＨ，末端 アミノ酸配列と一致する（ただし４つの残基については一致しない。）４つの食 い違いのうち２つの残基（２０および２４）は蛋白の配列においてただ仮に指定 されただけである。蛋白配列内で位置を決定できない成熟ペプチド上の最初の残 基は、ヌクレオチド配列によってイソロイシンと予測される。ヌクレオチド配列 から導き出された一次構造の蛋白は、分子量　１３，５００、エンドグリコシダ ーゼＦで広範囲に脱グリコジル化したＧＭ−ＣＳＦの見かけの分子量１６．８０ ０と上く一致する。予告されたアミノ酸配列の内で起こるＮ−グリコジル化の２ つの強い部位（Ａｓｎ　−Ｘ　−Ｔｈｒ　）を第２ｂ図に星印で示す。

ｐＧＭ３７は第２ｂ図に示される最初の位置まで２０のヌクレオチド５°を伸ば すが、開始コドンを含まない。このコドンは数種の疎水性アミノ酸をこの籟囲内 に含み（図示しない）、分泌された蛋白のシグナル・ペプチドの特徴を示さない 。ＧＭ−Ｃ８ＦのｍＲＮＡの大きさは　１゜２００ヌクレオチド以内であり（第 ４図）、その内の１５０ヌクレオチド以内のものはたぶんポリ（Ａ）末端の寄与 による。３°非移殖領域は３１９ヌクレオチドで成熟蛋白の暗号を指令する領域 は３５４ヌクレオチドである（第２ｂ図）、それで約３５０のヌクレオチドが、 推定されるＮＨ，−末端シグナル・ベフチドのために５°側の翻訳されない頌域 を２つのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン（位置、２３７．３４６および５０７）から導 びかれたヌクレオチド配列には３箇所食い違うところがある。その内の１つ（位 ；！　３４６）はアミノ酸配列のあいまいさによるものである（１１６番目のア ミノ酸残基にＧｌｙまたは５ｅｒ）。ｅＤＮＡクローンが単離されたはっかねず み（Ｃ５７ＢＬ／６）は高度に同系交配しているのでそのため（１；Ｍ−ＣＳＦ の座ではホモ接合になるはずである。また、はつかねずみの生殖細胞系上のＧＭ −Ｃ５Ｆの暗号を指令するのは唯一の遺伝子であるらしいので、これら３つの配 列の食い違いはｃＤＮＡ合成の間に造られた人為構造を反映しているようだ。モ して尖際には逆転写は６００ヌクレオチド中に約１個の合成ポリヌクレオチド誤 謬頻度である。

第２図に現わした配列を決定するのには標準の方法を使用した。簡単に述べると 、Ｍ＋３ベクター中でサブクローン化したＤＮＡフラグメントをジブオキサ・ヌ クレオシドトリスフォスフエイトを使用するチェーン・ターミネインヨン法によ って配列した（サンガー、エフ、等著、プロシーディング・才ブ・ナショナル・ アカデミ−・才ブ・サイエンス（アメリカ）７４巻、５４６３−６７頁（１９７ ７年））。配列した反応物は、厚さ０　、２　ｍｍにした８％（重量比）ポリア クリルアミドゲル上で温度を調節して電気泳動にかける。第２図に関して上で述 べたようにｍＲＮＡに同調する鎖のストランドは上で得たＧＭ　ＣＳＦの予測さ れるアミノ酸配列をもち、５°から３′まで列挙される。列の一番終りにある数 は、その列での最終残基（アミノ酸またはヌクレオチド）の位置を示す。ＧＭ− ＣＳＦを決定する部分的なアミノ酸配列はクローンから導いた配列の上に示しで ある。二者の間に食い違いのない位置には「棒線」を付けた。蛋白分析によって 決定した最初のアミノ酸残基は同定できず疑問符で示す。強いＮ−グリフシル化 部位は星印で示し、推定されるポリアデニル化シグナルは下線で示しである。

［実施例■］ この実施例はＧＭ−ＣＳＦが１個の特定の遺伝子によって暗号を指定されること を示す。

種々のはつかねずみの器官から単離したＧＭ−Ｃ９Ｆの多分子形Ｓが知られてい るので、どれだけの数の遺伝子を成熟ゲノム中でＣＭ−Ｃ９Ｆのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ が検出できるかを試験した。種々の制限エンドヌクレアーゼによって消化された ＢＡＬＢ／ｃの胚またはＣ５７ＢＬ／６の肝のＤＮＡをアガロースゲルで分画し 、ニトロセルロースに移してから、２０Ｍ３８に完全ｃＤＮＡ挿入を含んだフラ グメントとハイブリダイズする。

両方のはつかねずみの系統には、単−ＥｃｏＲＩフラグメント（第７図、第１お よび第２レーン）、単−ＰｓｔＩフラグメント（第３および第４レーン）および 単−ＢａｍＨＩフラグメント（図示しない）が検出される。

Ｐｓｔｌフラグメントは、僅か２．５ｋｂの長さしかないので、このフラグメン トは一つより多い遺伝子に適応しそうにない。それで、２個（またはそれ以上） の遺伝子を、同位置のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＴおよびＢａｍＨＩ制限部位で囲まれ ているという可能性は低いから除いて、はつかねずみの生殖系において肺をのＧ Ｍ−ＣＳＦを暗号化しているのは唯一の遺伝子であると結論する。

第７図は、ＧＭ−Ｃ５Ｆ遺伝子が胚のＤＮＡ中と同様にコンカナバリンＡ刺激Ｌ Ｂ３細胞（レーン６）由来のＤＮＡ中にも同じＥｃｏＲＩフラグメント中に含は れことを示している。　ＬＢａＤＮＡ中に別のバンドはなく、胚ＤＮＡと異なる ハイブリダイゼイション強度もないので、大量のＧＭ−ＣＳＦを合成する細胞中 のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子脈中におけるコピー数変化または総体的変化はないと推論 される。

ＨＶＩ　Ｅ−ａＣＪ　ト○　＜Ｃｊ　＜。

ロ　（０トＱ　←Ｑ ＦＩＧＵＰ、Ｅ　２ ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＴｈｒＣｙｓＶａＨ：１ｎＴｈｒ＾ｒｑＬｅｕＬｙｓτ１ｅ Ｐｈｅに１ｕＣ１ｎＣ１ｙＬｅｕ＾ｒｇにｌｙ＾ｓｎ　ＧＱＡＡＣＡＡＣＣＴＡ ＡＣＡＴＣ７Ｇ７ＣＣＡＣＡ（ＣＣ（：ＣＣ？ＣＡＡＣＡＴ人Ｔ丁ＣＧＡＣＣ入 （：ＣにＴＣＴＡ（ＣＣｃに（大入Ｔ　hｌ！＋１　。

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Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類の顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）また はその単一または複合塩基置換、欠失、挿入または逆転の暗号を指示するＤＮＡ 配列であって、上記ＤＮＡは、天然源、合成源および半合成源から誘導したもの であり、試験管内で上記のものを含むｍＲＮＡ混合物からＧＭ−ＣＳＦの合成を 指令する能力のあるｍＲＮＡ種を選択する能力があるものである、ＤＮＡ配列。
2. ２．天然源がはつかねずみである、請求の範囲第１項記載の配列。
3. ３．配列がｃＤＮＡのもねである、請求の範囲第１項記載の配列。
4. ４．５′から３′の方向に以下に示すＤＮＡ配列を持つ、請求の範囲第１項記載 の配列。 【配列があります】 【配列があります】
5. ５．５′から３′の方向に以下に示すＤＮＡ配列を持つ、請求の範囲第４項記載 の配列。 【配列があります】
6. ６．下記段階、すなわち （ａ）ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの供給源を調整し、（ｂ）上記供 給源ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡコピーを合成し、（ｃ）上記ＤＮＡコピーをクロー ン化し、（ｄ）合成ＧＭ−ＣＳＦプローブを調整し、（ｅ）段階（ｄ）のプロー ブを用いてコロニーをハイブリダイゼイションして段階（ｂ）のＤＮＡコピーを 潜ませているクローンをスクリーニングし、 （ｆ）さらに上記のプローブとハイブリダイズしているクローンを採取する、 段階から成る請求の範囲第１項記載のＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定するＤＮＡ 配列の製法。
7. ７．ｍＲＮＡの供給源が、細菌の内毒素を注射したＣ５７ＢＬ／６はつかねずみ から単離した肺のｍＲＮＡである請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．プローブが、 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 請求の範囲第４項の配列および請求の範囲第５項の配列からなる群から選択され たものである請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．組換え体形として、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ ＳＦ）と実質上１対１に対応するコード配列を有する蛋白暗号化部分をもつＤＮ Ａ配列を含むクローン化ベクター。
10. １０．配列が請求の範囲第４項の配列である請求の範囲第９項記載のベクター。
11. １１．配列が請求の範囲第５項の配列である請求の範囲第９項記載のベクター。
12. １２．べクターがブラスミドｐＧＭ３７である請求の範囲第９項記載のベクター 。
13. １３．ベクターがブラスミドｐＧＭ３８である請求の範囲第９項記載のベクター 。
14. １４．請求の範囲第９項のべクターによって形質転換された宿主。
15. １５．プラスミドｐＧＭ３７で形質転換した宿主。
16. １６．ＡＴＣＣ５３０３２の同定特性を持つ請求の範囲第１５項記載の宿主。
17. １７．プラスミドｐＧＭ３８で形質転換した宿主。
18. １８．ＡＴＣＣ５３０３６の同定特性を持つ請求の範囲第１７項記載の宿主。
19. １９．宿主内で作用するブロモーターフラグメントＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指 定するＤＮＡセグメントを含み、ＤＮＡセグメントはＧＭ−ＣＳＦ・ＤＮＡが宿 主内で非天然ＧＭ−ＣＳＦ蛋白として発現されるように上記プロモータと共に配 向されている、発現ベクターによって形質転換された宿主器官を培養することか ら成る顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の製法。
20. ２０．ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡセグメントが請求の範囲第５項の配列を含む請求の 範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．刺激するのに効果的な量の顆粒球・マクロファージ刺激因子と上記顆粒球 およびマクロファージのそれぞれの前駆細胞を接触させることから成る顆粒球お よびマクロファージの産生を刺激する方法。