CN109153977B - 溶瘤病毒株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒，其是或源自临床分离株，其通过以下来选择：比较相同病毒种类的一组三种或更多种临床分离株在体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的肿瘤细胞的能力，并选择能够比该组中其他临床分离株中的一种或多种更快速地和/或以更低的剂量体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的细胞的临床分离株。

Description

溶瘤病毒株
发明领域
本发明涉及溶瘤免疫治疗剂和该溶瘤免疫治疗剂在治疗癌症中的用途。
背景技术
病毒具有以高效率进入细胞的独特能力。进入细胞后，表达病毒基因并复制病毒。这通常导致受感染细胞的死亡和细胞的抗原成分的释放，因为当细胞死亡时细胞破裂。结果，病毒介导的细胞死亡倾向于导致对这些细胞组分的免疫应答，所述细胞组分包括源自宿主细胞的那些和由病毒本身编码或掺入病毒本身的那些。
病毒也与先天免疫应答的各种介质相互作用，作为宿主对病毒感染识别的反应的一部分，例如，通过toll样受体和cGAS/STING信号传导识别，所述识别导致干扰素反应和炎症(它们也是对宿主的免疫原性信号)的激活。这些免疫应答可以对癌症患者产生免疫原性益处，使得对肿瘤抗原的免疫应答提供系统的总体益处，从而导致治疗未感染病毒的肿瘤，包括微转移性疾病，并提供针对复发的疫苗接种。
病毒的组合直接(“溶瘤”)效应和针对肿瘤抗原的免疫应答(包括非自身“新生抗原”，即源自个体肿瘤中的特定突变基因)被称为“溶瘤免疫疗法”。
病毒也可用作递送媒介物(“载体”)以在感染的细胞中表达插入病毒基因组中的异源基因。这些特性使病毒可用于各种生物技术和医学应用。例如，表达异源治疗基因的病毒可用于基因治疗。在溶瘤免疫疗法的背景下，递送的基因可包括编码特定肿瘤抗原的基因，旨在增加病毒复制和细胞死亡后释放的抗原的免疫原性、增加肿瘤的一般免疫激活状态或增加病毒的直接溶瘤特性(即细胞毒性作用)的基因。
已经证明，包括单纯疱疹病毒(HSV)在内的许多病毒在癌症的溶瘤治疗中具有应用。必须使用于癌症的溶瘤治疗的HSV失去能力，使其不再致病，但仍可进入并杀死肿瘤细胞。已经鉴定了许多对HSV的致残突变，包括编码ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶的基因的破坏，其不能阻止病毒在培养物中或在体内肿瘤组织中复制，但是其阻止显著的在正常组织中的复制。其中仅有ICP34.5基因被破坏的HSV在体外在许多肿瘤细胞类型中复制，并且在小鼠肿瘤模型中选择性地在肿瘤组织中复制，但不在周围组织中复制。缺失ICP34.5或缺失ICP34.5和ICP6的HSV的临床试验也显示出安全性和在人类肿瘤组织中的选择性复制。
如上所述，包括HSV在内的溶瘤病毒也可用于在癌症治疗中递送治疗基因。另外缺失ICP47并且编码用于GM-CSF的异源基因的这种类型缺失ICP34.5的病毒也已经在临床试验中进行了测试，包括在黑素瘤中的3期试验，其中显示了对人的安全性和功效。试验数据表明，在注射的肿瘤中可以看到肿瘤反应，在未注射的肿瘤中可以看到较小程度的肿瘤反应。反应倾向于高度持久(数月-数年)，并且在响应患者中似乎实现了生存益处。除了直接溶瘤作用外，这些中的每一个都表明免疫系统在癌症治疗中的参与。然而，这一数据和使用溶瘤病毒的其他数据通常表明并非所有肿瘤都对治疗有响应，并且并非所有患者都能获得生存优势。结果，显然需要改进溶瘤治疗和溶瘤免疫治疗的技术。这些可用于增加治疗的直接溶瘤作用、治疗的抗肿瘤免疫刺激作用或一起增加这两种作用。
最近已经表明，溶瘤免疫疗法可以与免疫检查点阻断(即免疫检查点途径的抑制或“拮抗作用”)结合产生加和或协同治疗效果，也称为免疫共抑制途径阻断。检查点(免疫共抑制途径)阻断旨在阻断宿主免疫抑制机制，其通常用于防止自身免疫性的发生。然而，在癌症患者中，这些机制也可用于抑制或阻断诱导的针对肿瘤的任何免疫应答的潜在有益作用。或者，由于缺失激活或缺失免疫增强途径的完全激活，免疫应答可能不会被完全加强。因此，减轻这些阻断或刺激免疫增强途径(即激活这些免疫增强途径或是这些免疫增强途径的“激动剂”)的药物对于测试和开发癌症治疗是有吸引力的。这些批准或实验药物的靶标包括CTLA-4，PD-1，PD-L1，LAG-3，TIM-3，VISTA，CSF1R，IDO，CEACAM1，GITR，4-1-BB，KIR，SLAMF7，OX40，CD40，ICOS或CD47。
为了这些方法的成功，需要预先存在的针对肿瘤的免疫应答，即，使得预先存在的免疫应答可以被加强或能够解除对抗肿瘤免疫的阻断。还需要存在发炎的肿瘤微环境，其表明这种持续的反应。预先存在的对肿瘤新生抗原的免疫应答似乎对免疫共抑制途径阻断和相关药物的活性特别重要。只有一些患者可能对肿瘤抗原(包括新生抗原)有持续的免疫应答和/或发炎的肿瘤微环境，这两者都是这些药物活性所必需的。因此，可以诱导针对肿瘤抗原(包括新生抗原)的免疫应答和/或可以诱导发炎的肿瘤微环境的溶瘤剂对于与免疫共抑制途径阻断和免疫增强药物组合使用是有吸引力的。这可能也解释了迄今为止观察到的小鼠和人类中溶瘤剂和免疫共抑制途径阻断的有希望的联合抗肿瘤作用。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径在肿瘤和肿瘤引流淋巴结中均通过直接抑制T细胞和增强局部调节性T细胞(Treg)介导的免疫抑制作用产生致耐受性环境而促进肿瘤诱导的耐受性。IDO催化沿犬尿氨酸途径的色氨酸降解的限速步骤，并且局部色氨酸浓度的降低和免疫调节性色氨酸代谢物的产生都有助于IDO的免疫抑制作用。在许多癌症患者中IDO被长期激活，IDO激活与更广泛的疾病相关。它还可以作为其他抗肿瘤免疫性激活剂的拮抗剂。因此，正在开发IDO途径的抑制剂作为抗癌剂，特别是与检查点阻断剂(例如靶向CTLA-4、PD-1或PDL-1的那些)组合。IDO抑制剂还可以与溶瘤免疫疗法协同，包括与靶向其他免疫检查点或免疫共刺激途径的药物一起。
发明概述
本发明提供了改进的溶瘤病毒。改进的溶瘤病毒具有改善的直接溶瘤作用。由本发明的病毒提供的改善的直接溶瘤作用还将导致改善的全身抗肿瘤免疫作用。由本发明的病毒提供的改善的直接溶瘤作用还将导致改善的患者治疗效果。在肿瘤细胞中增强的复制和对肿瘤细胞的杀伤将导致增强的肿瘤抗原释放和增强的对释放的抗原的系统免疫应答。插入以增加直接溶瘤作用和/或免疫刺激的任何基因的表达水平也将增加。
病毒种类天然存在于天然群体内的一系列变体(毒株)中，其可以通过少量或更多数量的核苷酸而不同，同时仍然保留抗原特征和足够的序列同一性以仍被认为是相同的病毒种类。由于它们的序列不同，这些毒株可能表现出一系列不同的性质，包括通过在其一种或多种天然宿主中进行自然选择而选择的性质(例如在讨论的病毒的靶细胞类型中感染或复制、在这些细胞之间扩散、或逃避宿主先天或获得性免疫系统、或在宿主种类的感染个体之间扩散的能力)，以及没有为之进行特异性选择的性质(例如在不是所讨论的病毒的天然靶标的细胞类型中复制并杀死所述细胞类型或在所述细胞类型之间扩散的能力，所述细胞类型包括肿瘤或其他非靶细胞类型或组织)。本发明人已经认识到，取样在天然宿主群体中存在的特定病毒种类的一系列病毒株(在感染人类的病毒的情况下，在这里被称为“临床分离株”)并将这些相互比较以选择具有用于其预期目的(例如感染和杀死肿瘤细胞)的最佳性质的毒株，可用于鉴定具有用于该目的的最佳性质的病毒(即病毒株)。最佳性质可以是为开发提供最佳起点从而产生可用作治疗剂的病毒的性质。通过这种方法鉴定的病毒可能比“原型”或“实验室”病毒株或没有针对一种或多种需要的性质从宽泛病毒株组中进行选择的临床毒株具有更好的用于预期目的性质。这是因为，考虑到天然病毒群体中存在的序列变异的程度，自然群体中的完全生物复杂性，特别是对于一种或多种特定的理想性质，不太可能通过采用狭隘的筛选一种或多种所需的性质的方法来进行取样。特别地，这些可在感染的宿主内(这通常是具有RNA病毒或逆转录病毒群体的情形，其中通常存在所谓的准种)、个别感染宿主之间、或者在不同的地理上分开的病毒群体之间在序列上变化。
因此，通过对特定病毒种类的天然群体中存在的一系列病毒毒株进行取样并相互测试这些病毒毒株以获得一种或多种所需的性质(例如感染和杀死肿瘤细胞的能力)来选择本发明的病毒。具有用于预期目的的最佳性质的一种或多种病毒株用于进一步开发。
在预期用途是溶瘤病毒疗法的情况下，采用这种方法为溶瘤剂的开发提供了改进的起点，这可能需要对有利的病毒株进行进一步操作。这种操作包括缺失病毒基因以提供例如肿瘤选择性和/或插入外源基因以进一步改善溶瘤或免疫增强特性。
因此，本发明的病毒包括新的病毒种类临床分离株，其具有比与它们进行比较并通过所述比较鉴定它们的其他临床分离株更好的抗肿瘤作用。特别地，本发明的临床分离株在体外比相同病毒类型的参考临床分离株更快和/或以更低的剂量杀死肿瘤细胞系。通常，本发明的临床分离株将通过针对一种或多种所需的性质比较病毒种类多于5个临床分离株而鉴定，优选通过比较病毒种类多于10个临床分离株，并且更优选通过比较病毒种类多于20个临床分离株而鉴定。本发明的临床分离株通常显示出比所测试病毒株的3/5、6/10或11/20、优选比所测试病毒株的4/5、8/10或17/20、更优选比所测试病毒株的9/10或19/20更好的肿瘤细胞杀伤活性。
通常，本发明的临床分离株可在以0.01至0.001或更低的感染复数(MOI)感染后24至48小时内在体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系。
可以修饰本发明的临床分离株以进一步增强它们的抗肿瘤作用。可以修饰本发明临床分离株的基因组以缺失或改变一种或多种病毒基因的表达，和/或可以修饰临床分离株的基因组以表达一种或多种异源基因，例如编码融合蛋白和/或一种或多种免疫刺激分子的基因。
本发明的溶瘤病毒通过改善的直接溶瘤作用、病毒复制和通过肿瘤的扩散来提供改善的癌症治疗，其(i)增加肿瘤抗原的量，所述肿瘤抗原包括新生抗原，其被释放用于诱导抗肿瘤免疫应答；以及(ii)增强病毒编码的一种或多种免疫刺激分子的表达。一种或多种免疫刺激分子通过病毒的表达可进一步增强和加强抗肿瘤免疫效果。病毒对一种或多种促融合蛋白的表达可以进一步增强病毒通过肿瘤的扩散。病毒对一种或多种促融合蛋白的表达可以进一步增强肿瘤细胞杀伤。
当病毒作为单一药剂使用时以及当病毒与其他抗癌方式组合使用时，实现本发明的溶瘤病毒的抗肿瘤功效，所述其他抗癌方式包括化学疗法、靶向药物治疗、放射、免疫检查点阻断(即施用一种或多种免疫共抑制途径的拮抗剂)和/或免疫增强药物(例如免疫共刺激途径的一种或多种激动剂)。本发明病毒的改进的直接溶瘤作用(即病毒在肿瘤细胞中复制、在肿瘤细胞之间扩散并直接杀死肿瘤细胞)和改善的全身抗肿瘤免疫作用改善了溶瘤治疗和免疫共抑制途径阻断和/或免疫共刺激途径激活的综合益处。
因此，本发明提供了一种溶瘤病毒，其是或源自临床分离株，其通过下述被选出来：比较相同病毒种类的一组三种或更多种临床分离株在体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的肿瘤细胞的能力，并选择能够比组中的其他临床分离株中的一种或多种更快速地和/或以更低的剂量体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的细胞的临床分离株。可以修饰临床分离株。修饰的临床分离株可具有突变，例如病毒基因组中的缺失和/或可表达一种或多种异源基因。
该病毒可以是可用于癌症的溶瘤治疗的任何病毒种类的毒株，包括疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒(rhabdovirus)、副粘病毒或呼肠孤病毒的毒株。病毒优选是单纯疱疹病毒(HSV)，例如HSV1。HSV通常不表达功能性ICP34.5和/或功能性ICP47和/或将US11基因表达为立即早期基因。
该病毒可包含(i)促融合蛋白编码基因；和/或(ii)免疫刺激分子或编码免疫刺激分子的基因。该病毒可以编码多于一种促融合蛋白和/或多于一种免疫刺激分子。促融合蛋白优选是来自长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白，并且具有突变或去除的R跨膜肽(GALV-R-)。免疫刺激分子优选为GM-CSF和/或免疫共刺激途径的激动剂，包括GITRL、4-1-BBL、OX40L、ICOSL或CD40L或其每种情况的修饰形式，或能够阻断通过CTLA-4的信号传导的蛋白质，例如结合CTLA-4的抗体或其片段。
本发明还提供：
-药物组合物，其包含本发明的病毒和药学上可接受的运载体或稀释剂；
-用在通过疗法治疗人体或动物体的方法中的本发明的病毒；
-用在治疗癌症的方法中的本发明的病毒，其中所述方法任选地包括施用另外的抗癌剂；
-在无菌小瓶、安瓿或注射器中包含本发明的病毒的制品；
-治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的病毒或药物组合物，其中所述方法任选地包括施用另外的抗癌剂；
-本发明的病毒在制备用在治疗癌症的方法中的药物中的用途，其中所述方法任选地包括施用另外的抗癌剂，所述抗癌剂任选地是免疫共抑制途径的拮抗剂或免疫共刺激途径的激动剂；
-一种治疗癌症的方法，所述方法包括对有此需要的患者施用治疗有效量的溶瘤病毒、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径的抑制剂和免疫共抑制途径的另一种拮抗剂、或免疫共刺激途径的激动剂；和
-一种选择溶瘤病毒的方法，该方法包括：
(i)比较相同病毒株的一组三种或更多种临床分离株在体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的肿瘤细胞的能力；
(ii)对病毒组中的每种病毒杀死肿瘤细胞的能力评分；
(iii)选择具有最佳分数之一的病毒；
(iv)任选地修饰病毒以使一种或多种病毒基因失去活性；和/或
(v)任选地修饰病毒以表达一种或多种编码免疫刺激分子的基因和/或一种或多种编码促融合蛋白的基因。
另外的抗癌剂可以是免疫共抑制途径的拮抗剂或免疫共刺激途径的激动剂。
附图简述
图1描绘了本发明的示例性病毒的结构，其包含插入ICP34.5基因座的编码GALV-R-的基因和编码GM-CSF的基因，并且其中ICP47基因被删除使得US11基因处在ICP47立即早期启动子的控制下(上图)。图1还显示了本发明仅表达GALV-R编码基因(第二图)或仅表达GM-CSF编码基因(第三图)的类似示例性病毒。还显示了缺失ICP34.5基因和ICP47基因的示例性病毒。
图2描绘了本发明的示例性病毒的结构，其包含编码GALV-R-的基因、编码GM-CSF的基因和编码CD40L的基因。
图3显示了如图所示以0.1、0.01或0.001的MOI感染后24小时或48小时通过结晶紫染色评估的八种排名最高的HSV1临床分离株杀死Fadu、SK-mel-28、A549、HT1080、MIA-PA-CA-2、HT29和MDA-MB-231人肿瘤细胞系的差异能力。显示了针对每个细胞系排名第一和第二的病毒株。病毒RH018A针对Fadu、HT1080、MIA-PA-CA-2和HT29细胞系中的每一种排名第一，针对SK-mel-28、A549和MDA-MB-231细胞系中的每一种排名第二。RH004A针对HT29细胞系与RH018A和RH015A并列排在第一位，针对SK-mel-28和A549细胞系排第一，并且针对Fadu细胞系排第二。RH023A针对MDA-MB-231细胞系排第一，针对HT1080细胞系排名第二。RH031A针对MIA-PA-CA-2和HT29细胞系中的每一种排名第二。RH040A针对HT29细胞系并列排名第二。
图4显示毒株RH018A(在所有测试毒株中排名第一的毒株)与来自筛选的“平均”毒株(即毒株RH065A)之间的比较。如在SK-mel-28、HT1080、MDA-MB-231、Fadu、MIA-PA-CA-2和A549细胞系中以0.1、0.01和0.001的MOI感染后24或48小时的结晶紫染色所示，与毒株RH065A所需的相比，杀死相同比例的细胞需要大约10倍更少的RH018A毒株。
图5描绘了通过缺失ICP34.5和ICP47和在ICP34.5基因座中含有异源基因而修饰的HSV1病毒的结构，其中所述缺失ICP34.5和ICP47使得US11基因处在ICP457立即早期启动子的控制下。除非图中另有说明，否则使用RH018A毒株构建病毒。
图6显示了用于检测感染病毒16(mGM-CSF和GALVR-)、病毒17(hGM-CSF和GALVR-)和病毒19(mGM-CSF)的BHK细胞的上清液中人或小鼠GM-CSF表达的ELISA结果。
图7是其中缺失ICP34.5并且表达GALVR-和GFP的毒株RH018A(病毒10)与仅表达GFP的病毒(病毒12)的细胞杀伤能力之间的比较，如通过在低放大倍数下在三个细胞系中的结晶紫染色所确定的。
图8是其中ICP34.5和ICP47缺失并且表达GALVR-和GM-CSF的毒株RH018A(病毒17)与具有相同修饰的现有技术毒株的细胞杀伤能力之间的比较，如通过在四个细胞系中的结晶紫染色所确定的。
图9显示病毒16(ICP34.5和ICP47缺失，表达GALVR-和mGM-CSF)在治疗两侧腹部携带A20淋巴瘤肿瘤的小鼠中的有效性。在右侧腹部的肿瘤注射病毒或媒介物(vehicle)，持续30天观察对肿瘤大小的影响。该病毒对注射的肿瘤和未注射的肿瘤均有效。
图10显示了通过结晶紫染色评估的病毒15(ICP34.5和ICP47缺失，表达GALVR-和GFP)和病毒24(ICP34.5和ICP47缺失，表达GFP)在体外对大鼠9L细胞的影响。与不表达GALV的病毒(病毒24)相比，表达GALV的病毒(病毒15)在体外显示出对大鼠9L细胞的增强的杀伤作用
图11显示病毒16在左侧和右侧腹部中携带小鼠CT26肿瘤的Balb/c小鼠中的抗肿瘤作用。然后用以下物质处理10只小鼠的组：媒介物(每隔一天向右侧腹部肿瘤注射3次)；每隔一天在右侧腹部肿瘤中注射5x10exp6 pfu的病毒16(mRP1)；单独的抗小鼠PD1(每3天腹膜内10mg/kg，BioXCell克隆RMP1-14)；抗小鼠CTLA-4(每3天腹膜内3mg/kg，BioXCell克隆9D9)；抗小鼠PD1和病毒16一起；抗小鼠CTLA4与病毒16一起；1-甲基色氨酸(I-MT；IDO抑制剂(饮用水中5mg/ml))；抗小鼠PD1与1-甲基色氨酸一起；或抗小鼠PD1与1-甲基色氨酸和病毒16一起。持续另外30天观察对肿瘤大小的影响。在用病毒和检查点阻断组合治疗的动物中观察到比单一治疗组更大的肿瘤减小。图11A显示组合使用病毒16和抗PD1比单独使用抗PD1或病毒具有更好的抗肿瘤效果。图11B显示病毒16与抗-CTLA-4组合的抗肿瘤作用优于单独的病毒16或抗-CTLA-4的抗肿瘤作用。图11C显示，与不存在病毒的抗PD1和1-MT抑制相比，使用病毒16以及抗PD1和IDO抑制观察到增强的肿瘤减小。
图12显示与单独的病毒或单独的检查点阻断(抗-PD1)相比，病毒16与免疫检查点阻断相组合在Balb/c小鼠两侧腹部的小鼠A20肿瘤中增强的抗肿瘤活性。
图13显示了表达GALVR-、GM-CSF和密码子优化的抗小鼠或抗人CTLA-4抗体构建体(分泌的scFv分子与人或小鼠IgG1 Fc区连接)的ICP34.5和ICP47缺失病毒的结构。scFv含有来自抗体9D9(US2011044953：小鼠形式)和伊匹单抗(ipilimumab)(US20150283234；人类形式)的连接的([G4S]3)轻链和重链。还显示了CTLA-4抑制剂的所得结构。
图14显示病毒16和病毒19在人异种移植模型(A549)中的抗肿瘤作用。在一周内以三个不同的剂量水平(N＝10/组)注射三次病毒16、病毒19或媒介物。显示了所用病毒的剂量。表达GALV的病毒16的抗肿瘤作用优于不表达GALV的病毒19的抗肿瘤作用。
图15显示了本发明表达GALVR-的病毒对Fischer 344大鼠侧腹中的9L细胞的作用。对大鼠组(每组10只)进行以下治疗，每只大鼠的一侧腹部每周仅三次，持续三周：50μl媒介物；50μl 107pfu/ml病毒19(表达mGM-CSF但不表达GALV R-)；或50μl 107pfu/ml病毒16(表达小鼠GM-CSF和GALV-R-)。然后持续另外30天观察对肿瘤生长的影响。与仅表达GM-CSF的病毒相比，用表达GM-CSF和GALV-R-的病毒观察到优异的肿瘤控制和收缩。
图16显示了表达抗mCTLA-4(病毒27)、mCD40L(病毒32)、mOX40L(病毒35)、m4-2BBL(病毒33)的病毒的抗肿瘤作用，与病毒16(表达GALV和mGM-CSF)相比，每种病毒也含有mGM-CSF和GALV-R-。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1是小鼠GM-CSF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是小鼠GM-CSF的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是人GM-CSF的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是人GM-CSF的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是小鼠GM-CSF的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是人GM-CSF的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是GALV-R-的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是GALV-R-的密码子优化形式的核苷酸序列(前三个核苷酸是可选的)
SEQ ID NO：9是GALV-R-的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是人膜结合形式的CD40L的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是人膜结合形式的CD40L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是人CD40L的多聚体分泌形式的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是人CD40L的多聚体分泌形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是小鼠CD40L的多聚体分泌形式的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是小鼠CD40L的多聚体分泌形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是野生型人CD40L的核苷酸序列的密码子优化形式。
SEQ ID NO：17是野生型人CD40L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18是野生型小鼠CD40L的核苷酸序列的密码子优化形式。
SEQ ID NO：19是野生型小鼠CD40L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20是鼠4-1BBL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是人4-1BBL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是分泌的小鼠4-1BBL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是人分泌的4-1BBL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是鼠GITRL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：25是人GITRL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是分泌的鼠GITRL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27是分泌的人GITRL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是鼠OX40L的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29是人OX40L的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是分泌的鼠OX40L的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是分泌的人OX40L的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是鼠ICOSL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是人ICOSL的密码子优化形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是鼠scFv CTLA-4抗体的核苷酸序列。前六个和后八个核苷酸是为克隆目的而添加的限制性位点。
SEQ ID NO：35是鼠scFv CTLA-4抗体的核苷酸序列。前六个和后八个核苷酸是为克隆目的而添加的限制性位点。
SEQ ID NO：36是CMV启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37是RSV启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38是BGH polyA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：39是SV40晚期polyA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40是SV40增强子启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是兔β-球蛋白(RBG)polyA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42是GFP的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是MoMuLV LTR启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44是EF1a启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：45是HGH polyA的核苷酸序列。
发明详述
溶瘤病毒
本发明的病毒是溶瘤的。溶瘤病毒是在肿瘤细胞中感染和复制从而杀死肿瘤细胞的病毒。因此，本发明的病毒具有复制能力。优选地，病毒选择性地在肿瘤组织中复制。如果病毒在肿瘤组织中比在非肿瘤组织中更有效地复制，则病毒能够选择性地在肿瘤组织中复制。可以使用本领域的标准技术确定病毒在不同组织类型中复制的能力。
本发明的病毒可以是具有这些特性的任何病毒，包括疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒、副粘病毒或呼肠孤病毒、或这些较大组内的任何种类或毒株。本发明的病毒可以是野生型(即不由亲本病毒种类改变)，或者具有基因破坏或基因添加。具体是这些情况中的哪一个将取决于要使用的病毒种类。优选地，病毒是疱疹病毒的种类，更优选是HSV的毒株，包括HSV1和HSV2的毒株，并且最优选是HSV1的毒株。本发明的病毒基于待使用的病毒种类的临床分离株。可以基于其具有用于治疗癌症的特别有利特性来选择临床分离株。与从其他患者分离的相同病毒的其他毒株相比，本发明的病毒具有令人惊讶的良好抗肿瘤效果，其中患者是携带待测试病毒种类的个体。用于比较以鉴定本发明的病毒的病毒株可以从患者或其他健康(即，不携带待测试的病毒种类)志愿者分离，优选从其他健康志愿者分离。用于鉴定本发明病毒的HSV1毒株通常从携带HSV1的个体的唇疱疹中分离，通常通过使用例如Virocult(Sigma)品牌拭子/包含运输介质的容器擦拭，然后运输到机构用于进一步测试。
在从个体分离要比较的病毒后，通常制备病毒原种，例如通过在BHK或vero细胞上培养分离的病毒而制备。优选地，这是在取样和在例如BHK或vero细胞上生长之间不超过3个循环的冻融之后进行的，以制备病毒原种以供进一步使用。更优选地，病毒样品在制备用于进一步使用的原种之前经历2次或少于2次的冻融循环，更优选一次冻融循环，最优选没有冻融循环。比较用分离后以这种方式制备的病毒感染的细胞系的裂解物，通常通过测试病毒在体外杀死肿瘤细胞系的能力进行比较。或者，可以在测试之前将病毒原种储存在合适的条件下，例如通过冷冻。与从其他个体分离的相同病毒的其他毒株相比，优选与从>5个个体、更优选>10个其他个体、最优选>20个其他个体分离的那些毒株相比时，本发明的病毒具有令人惊讶的良好抗肿瘤效果。
在修饰之前或之后，鉴定为本发明的病毒(即，与它们所比较的其他病毒株相比具有令人惊讶的良好杀伤肿瘤细胞的性质)的临床分离株的原种可以在合适的条件下储存，并适当地用于生成其他原种。
临床分离株是从其天然宿主中分离的病毒种类的毒株。优选分离临床分离株，用于测试和比较临床分离株与该病毒种类的其他临床分离株的所需性质，在本发明的病毒的情况下是杀死人肿瘤细胞的能力。可用于比较的临床分离株还包括来自临床试验库中存在的临床样品的那些，即先前为临床诊断或其他目的而收集的临床分离株。在任一种情况下，用于比较和鉴定本发明病毒的临床分离株优选在测试所需性质之前在体外经历最小的培养，优选仅经历足够的培养以允许产生足够的原种用于比较测试目的。因此，用于比较以鉴定本发明病毒的病毒还可包括保藏的毒株，其中保藏的毒株已从患者分离，优选为从患者唇疱疹中分离的HSV1毒株。
本发明的病毒是一种溶瘤病毒，其是或来自临床分离株，其通过下述被选出来：比较相同病毒种类的一组三种或更多种临床分离株在体外杀死两种或更多种肿瘤细胞的能力，并选择能够比组中的一种或多种其他临床分离株更快速地和/或以更低的剂量体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系的细胞的临床分离株。因此，该病毒是这样的临床分离株，其比相同病毒种类的一种或多种参考临床分离株更快速地和/或以更低的剂量体外杀死两种或更多种肿瘤细胞系。
通常，本发明的临床分离株将在以小于或等于0.1的感染复数(MOI)、优选小于或等于0.01的MOI、更优选小于或等于0.001的MOI感染的72小时内，优选在48小时内，更优选在24小时内杀死两种或更多种肿瘤细胞系。优选地，临床分离株将杀死广泛的人肿瘤细胞系，例如以下细胞系中的2、3、4、5、6、7种或全部：HT29(结肠直肠癌)，MDA-MB-231(乳腺癌)，SK-MEL-28(黑色素瘤)，Fadu(鳞状细胞癌)，MCF7(乳腺癌)，A549(肺癌)，MIAPACA-2(胰腺癌)，HT1080(纤维肉瘤)。因此，本发明的病毒可能能够杀死两种或更多种细胞，例如3、4、5、6、7或更多种不同类型的肿瘤，例如两种或更多种，例如3、4、5、6、7或更多种实体瘤，包括但不限于结肠直肠肿瘤细胞，前列腺肿瘤细胞，乳腺肿瘤细胞，卵巢肿瘤细胞，黑素瘤细胞，鳞状细胞癌细胞，肺肿瘤细胞，胰腺肿瘤细胞，肉瘤细胞和/或纤维肉瘤细胞。
可以通过任何合适的方法确定肿瘤细胞系杀伤。通常，首先从患者中分离样品，优选地，在HSV1的情况下，从唇疱疹中分离样品，用于感染BHK细胞或另一种合适的细胞系，例如vero细胞。通常通过感染后24-72小时(例如感染后48小时)存在细胞病变效应(CPE)来鉴定阳性样品，并通过例如免疫组织化学或PCR确认其为靶病毒种类。然后从阳性样品中产生病毒原种。通常测试来自病毒原种的样品，并与使用来自不同患者的拭子以相同方式产生的其他样品进行比较。可以通过确定在感染复数(MOI)范围内和感染后不同时间达到的CPE水平来进行测试。
例如，80％汇合的细胞系可以用病毒样品以MOI为1、0.1、0.01和0.001进行感染，并且板一式两份在37℃，5％CO2下孵育24和48小时，然后测定病毒细胞杀伤程度。这可以通过例如用戊二醛固定细胞并用标准方法用结晶紫染色来测定。然后可以通过标准方法评估细胞裂解水平，所述标准方法例如粗略观察、显微镜检查(细胞计数)和摄影。可以，用在测定细胞杀伤之前孵育更短的时间段，例如8、12或16小时，或更长的时间段，例如72小时，或以如0.0001或更低的另外的MOI孵育的细胞，重复该方法。
还可以进行生长曲线实验以评估不同临床分离株在体外肿瘤细胞系中复制的能力。例如，80％汇合的细胞系可以用病毒样品以MOI为1、0.1、0.01和0.001进行感染，在37℃，5％CO2孵育，在感染后0、8、16、24和48小时，通常通过冷冻/解冻裂解细胞，然后测定病毒细胞杀伤的程度。这可以通过例如通过标准空斑测定评估病毒滴度来确定。
本发明的临床分离株可以比与其进行比较的其他临床分离株(优选相同的病毒种类的2、3、4、5或10或更多种其他临床分离株)更快速地和/或以更低的MOI杀死感染的肿瘤细胞系。与同本发明的临床分离株相比较的相同病毒种类的至少一种、优选2、3、4、5或10或更多种其他临床分离株以相同MOI和在相同时间点相比，本发明的临床分离株以特定MOI和在特定时间点通常杀死10％、25％或50％更大比例的存在的肿瘤细胞。本发明的临床分离株通常杀死相同或更大比例的肿瘤细胞，其MOI为用于比较的相同病毒种类的一种或多种、优选2、3、4、5、10或15或更多种其他临床分离株在相同时间点(通常在12、24和/或48小时)杀死相同比例的肿瘤细胞的MOI的一半或小于该MOI的一半。优选地，本发明的临床分离株通常杀死相同或更大比例的肿瘤细胞，其MOI比用于比较的相同病毒的一种或多种、优选2、3、4、5、10或15或更多种其他临床分离株在相同时间点(通常在12、24和/或48小时)杀死相同比例的肿瘤细胞的MOI低5倍或10倍。与用于比较的相同病毒种类的其他临床分离株的至少50％、75％或90％相比，通常实现本发明病毒的改善的肿瘤细胞杀伤能力。优选将病毒与至少4种其他病毒株进行比较，例如，与相同种类的7、9、19、39或49种其他病毒株进行比较。
分离的毒株可以分批测试，例如一次4-8个病毒株针对例如一次4-8个肿瘤细胞系。对于每批实验，对在该实验中比较的病毒，实现的杀伤程度针对每个细胞系排列为最佳(即每个时间点的最少存活细胞/MOI)至最差(即每个时间点的最多存活细胞/MOI)。然后可以将来自每个实验在所测试的肿瘤细胞系范围内表现最佳的病毒株(即，一致地被列为杀死细胞系的最佳之一)在使用其他临床分离株和/或在其他肿瘤细胞系的进一步实验中进行头对头比较，以鉴定所取样的全部病毒株(例如，>20个病毒株)中的最佳病毒株。整体排名最高的那些是本发明的病毒。
在优选的实施方案中，本发明的病毒是选自以下的毒株：
毒株RH018A，其具有临时保藏号ECACC 16121904；
毒株RH004A，其具有临时保藏号ECACC 16121902；
毒株RH031A，其具有临时保藏号ECACC 16121907；
毒株RH040B，其具有临时保藏号ECACC 16121908；
毒株RH015A，其具有临时保藏号ECACC 16121903；
毒株RH021A，其具有临时保藏号ECACC 16121905；
毒株RH023A，其具有临时保藏号ECACC 16121906；和
毒株RH047A，其具有临时保藏号ECACC 16121909。
更优选地，本发明的病毒是选自以下的毒株：
毒株RH018A，其具有临时保藏号ECACC 16121904；
毒株RH004A，其具有临时保藏号ECACC 16121902；
毒株RH031A，其具有临时保藏号ECACC 16121907；
毒株RH040B，其具有临时保藏号ECACC 16121908；和
毒株RH015A，其具有临时保藏号ECACC 16121903；
最优选地，本发明的病毒是保藏号为ECACC 16121904的毒株RH018A。
本发明的HSV能够选择性地在肿瘤(例如人肿瘤)中复制。通常，HSV在靶肿瘤中有效复制，但在非肿瘤组织中不能有效复制。该HSV包含在一种或多种病毒基因中的一种或多种突变，所述突变抑制在正常组织中的复制但仍允许在肿瘤中复制。例如，突变可以是阻止HSV表达功能性ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶的突变。
在一个优选的实施方案中，突变ICP34.5编码基因以赋予HSV选择性的溶瘤活性。阻止功能性ICP34.5表达的ICP34.5编码基因的突变记载在Chou等人(1990)Science 250：1262-1266，Maclean等人(1991)J.Gen.Virol.72：631-639和Liu等人(2003)GeneTherapy10：292-303中，它们通过引用并入本文。也可以使ICP6编码基因和/或胸苷激酶编码基因失活，也可以使其他基因失活，条件是这种失活不会阻止病毒在肿瘤中感染或复制。
HSV可以含有另外的一种或多种增强HSV在肿瘤中复制的突变。由此导致的肿瘤中病毒复制的增强不仅导致病毒改善的直接“溶瘤”肿瘤细胞杀伤，而且还提高了异源基因(即插入病毒的基因，在本发明的病毒的情况下，为编码一种或多种促融合蛋白和一种或多种免疫调节分子的基因)表达的水平，并增加肿瘤细胞死亡时释放的肿瘤抗原的量，这两者也可以改善治疗癌症的疗法的免疫原性。例如，在本发明的一个优选实施方案中，以使US11基因置于通常控制ICP47编码基因表达的立即早期启动子控制下的方式缺失ICP47编码基因导致在肿瘤中增强的复制(参见Liu等人，2003，其通过引用并入本文)。
也可以在本发明的病毒中引入使US11编码序列(其为HSV晚期基因)置于不依赖于病毒复制的启动子控制下的其他突变。此类突变允许在HSV复制发生之前表达US11并增强肿瘤中的病毒复制。特别地，此类突变增强了缺失功能性ICP34.5编码基因的HSV的复制。
因此，在一个实施方案中，本发明的HSV包含与启动子可操作地连接的US11基因，其中启动子的活性不依赖于病毒复制。启动子可以是立即早期(IE)启动子或是在哺乳动物(优选人)肿瘤细胞中有活性的非HSV启动子。启动子可以是，例如，真核启动子，例如衍生自哺乳动物(优选人)的基因组的启动子。启动子可以是普遍存在的启动子(例如β-肌动蛋白或微管蛋白的启动子)或细胞特异性启动子，例如肿瘤特异性启动子。启动子可以是病毒启动子，例如莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子或人或小鼠巨细胞病毒(CMV)IE启动子。HSV立即早期(IE)启动子在本领域中是众所周知的。HSV IE启动子可以是驱动ICP0、ICP4、ICP22、ICP27或ICP47表达的启动子。
上述基因可以通过任何合适的方法使其功能失活，例如通过缺失或取代所述基因和/或所述基因的控制序列的全部或部分、或通过将一个或多个核酸插入所述基因和/或所述基因的控制序列中或代替所述基因和/或所述基因的控制序列使所述基因功能失活。例如，本领域标准的同源重组方法可用于产生本发明的病毒。
如本文所用，术语“基因”意指编码蛋白质的核苷酸序列，即基因的编码序列。通过突变基因本身或基因侧翼的控制序列，例如启动子序列，可以使上述各种基因成为没有功能的。缺失可以去除基因的一个或多个部分、整个基因或整个基因以及所有或一些控制序列。例如，可以仅缺失基因内的一个核苷酸，导致移码。然而，可以进行更大的缺失，例如总编码和/或非编码序列的至少约25％，更优选至少约50％。在一个优选的实施方案中，缺失要被功能失活的基因。例如，可以从病毒中除去整个基因和任选的一些侧翼序列。当病毒基因组中存在两个或更多个基因拷贝时，使基因的两个拷贝都功能失活。
可以通过取代其他序列使基因失活，例如通过用异源基因和任选的启动子序列取代全部或部分内源基因使基因失活。在没有启动子序列被取代的情况下，可插入异源基因，使所述异源基因受失去功能的基因的启动子控制。在本发明的HSV中，优选通过在每个ICP34.5编码基因的基因座中插入一种或多种异源基因和与其可操作地连接的一种或多种启动子序列和任选的其他调节元件(如聚腺苷酸化序列)使ICP34.5编码基因失去功能。
本发明的病毒可以用于在肿瘤中表达促融合蛋白和/或免疫刺激蛋白。这通常通过在具有选择性复制能力的病毒的基因组中插入编码促融合蛋白的异源基因和/或编码免疫刺激蛋白的异源基因来实现，其中每个基因在启动子序列的控制下。由于这种病毒的复制将选择性地在肿瘤组织中发生，因此与体内的非肿瘤组织相比，肿瘤组织中所述病毒的促融合蛋白和/或免疫刺激蛋白的表达也增强。与身体的其他组织相比，在肿瘤中发生表达更高的增强的表达。因此，本发明提供了选择性地在肿瘤中表达促融合蛋白和/或免疫刺激蛋白两者联合由溶瘤病毒复制提供的抗肿瘤作用的益处。
促融合蛋白
本发明的病毒可包含编码促融合蛋白的基因。促融合蛋白可以是能够促进被本发明病毒感染的细胞与另一细胞融合的任何异源蛋白。促融合蛋白，优选野生型或修饰的病毒糖蛋白(即，经过修饰以增加其促融合特性)，是能够诱导其中表达所述促融合蛋白的细胞中细胞与细胞融合(合胞体形成)的蛋白质。促融合糖蛋白的实例包括VSV-G，合胞蛋白(syncitin)-1(来自人内源性逆转录病毒-W(HERV-W))或合胞蛋白-2(来自HERVFRDE1)，副粘病毒SV5-F，麻疹病毒-H，麻疹病毒-F，RSV-F，来自逆转录病毒或慢病毒(例如长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠白血病病毒(MLV)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和马传染性贫血病毒(EIAV))的糖蛋白，其中R跨膜肽被去除(R-形式)。在优选的实施方案中，促融合蛋白来自GALV并且去除了R-肽(GALV-R-)。
本发明的病毒可包含多个拷贝、优选1或2个拷贝的促融合蛋白编码基因。病毒可包含两种或更多种不同的促融合蛋白，包括上文列出的促融合蛋白中的任一种。
由本发明的病毒表达的一种或多种促融合蛋白可以与天然存在的蛋白质相同，或者可以是修饰的蛋白质。
促融合蛋白编码基因(促融合基因)可以具有天然存在的核酸序列或修饰的序列。例如，可以修饰促融合基因的序列以增加所编码的蛋白质的促融合特性，或提供密码子优化并因此提高所编码的蛋白质的表达效率。
免疫刺激分子
本发明的病毒可包含一种或多种免疫刺激分子和/或一种或多种编码免疫刺激分子的基因。免疫刺激分子包括可以帮助诱导免疫应答的蛋白质，可以减轻针对免疫应答诱导或有效性的抑制信号的蛋白质和抑制免疫抑制分子表达的RNA分子(例如shRNA，反义RNA，RNAi或微小RNA)。
免疫刺激分子的实例包括IL-2，IL12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-24，CD40配体，GITR配体，4-1-BB配体，OX40配体，ICOS配体，flt3配体，I型干扰素，包括干扰素α和干扰素β，干扰素γ，III型干扰素(IL-28，IL-29)，其他细胞因子如TNFα或GM-CSF，TGFβ或免疫检查点拮抗剂。免疫检查点拮抗剂包括抗体，单链抗体和RNA1/siRNA/微小RNA/反义RNA敲低方法。免疫增强/共刺激途径的激动剂包括突变或野生型、可溶性、分泌性和/或膜结合的配体，以及包括单链抗体的激动性抗体。关于免疫共抑制或免疫共刺激途径的靶向，特别优选靶向下述的蛋白或其他分子(依据情形为激动性的或拮抗性的)：CTLA-4(拮抗剂)，PD-1(拮抗剂)，PD-L1(拮抗剂)，LAG-3(拮抗剂)，TIM-3(拮抗剂)，VISTA(拮抗剂)，CSF1R(拮抗剂)，IDO(拮抗剂)，CEACAM1(拮抗剂)，GITR(激动剂)，4-1-BB(激动剂)，KIR(拮抗剂)，SLAMF7(拮抗剂)，OX40(激动剂)，CD40(激动剂)，ICOS(激动剂)或CD47(拮抗剂)。因此，本发明的病毒优选编码这些分子中的一种或多种。更优选地，本发明的病毒编码GM-CSF和/或野生型或修饰形式的CD40L、ICOSL、4-1-BBL、GITRL或OX40L，最优选GM-CSF。
共抑制途径的抑制剂可以是CTLA-4抑制剂。CTLA-4抑制剂通常是结合CTLA-4并减少或阻断通过CTLA-4的信号传导(例如通过减少经由B7的活化)的分子，例如肽或蛋白质。通过减少CTLA-4信号传导，该抑制剂减少或消除CTLA-4对免疫刺激途径的阻断。
CTLA-4抑制剂优选为抗体或其抗原结合片段。本文提及的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(κ)(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
抗体通常是单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体。抗体优选为人源化抗体，更优选为人抗体。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个保留特异性结合CTLA-4的能力的片段。抗原结合片段还保留抑制CTLA-4的能力，从而减少或消除刺激性免疫应答的CTLA-4阻断。合适片段的实例包括Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补决定区(CDR)。单链抗体如scFv和重链抗体如VHH和骆驼抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。在优选的实施方案中，抗体是scFv。合适的scFv分子的实例公开于例如WO2007/123737和WO2014/066532中，其通过引用并入本文。scFv可以由SEQ ID NO：34中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO：35中所示的核苷酸序列编码。
本发明的病毒可编码一种或多种免疫刺激分子，优选1、2、3或4种免疫刺激分子，更优选1或2种免疫刺激分子。
编码免疫刺激分子的基因的序列可以进行密码子优化，以便与使用未改变的序列相比，增加靶细胞中各蛋白质的表达水平。
病毒株的修饰
本发明的经修饰的病毒是与用于比较的其他病毒株相比被鉴定为具有杀死肿瘤细胞的有利特性的临床分离株的修饰形式。使用本领域熟知的方法构建本发明的经修饰的病毒。例如，编码待包装的病毒基因组的质粒(用于较小的病毒和单个和多个基因组组分RNA病毒)或BAC(用于较大的DNA病毒，包括疱疹病毒)，包括在适当的调节控制下编码促融合和/或免疫刺激分子的任意基因，可以通过标准分子生物学技术构建并转染到可以回收重组病毒的允许细胞中。
或者，在一个优选的实施方案中，可构建含有位于预期插入位点侧翼的DNA区域的质粒，然后与病毒基因组DNA共转染到允许细胞中，从而发生在质粒中靶向插入位点侧翼区域与亲本临床分离株中相同区域之间的同源重组。然后可以通过丢失或添加用于修饰的质粒插入或缺失的功能来选择和纯化重组病毒，例如，在亲本病毒预期的插入位点插入或缺失标记基因如GFP或lacZ。在最优选的实施方案中，插入位点是HSV的ICP34.5基因座，因此用于操作的质粒含有位于该插入位点侧翼的HSV序列，其间是编码促融合蛋白和免疫刺激分子的表达盒。在这种情况下，亲本临床分离株可以含有编码GFP的盒代替ICP34.5，并且通过丧失GFP的表达来选择重组病毒空斑。在最优选的实施方案中，HSV的US11基因也表达为IE基因。这可以通过缺失ICP47编码区域或通过其他方式来实现。
可以将促融合蛋白编码序列和免疫刺激分子编码序列插入病毒基因组中处在适当的调节控制下。根据种类和插入位点，这可以在所用的本发明病毒种类的天然启动子的调节控制之下，或者优选在异源启动子的控制下。合适的异源启动子包括哺乳动物启动子，例如IEF2a启动子或肌动蛋白启动子。更优选的是强病毒启动子，例如CMV IE启动子，RSVLTR，MMLV LTR，或衍生自SV40的启动子。优选地，每个外源基因(即，编码促融合蛋白和免疫调节分子)将处在单独的启动子控制下，但也可以从单个RNA转录物表达，例如通过在蛋白质编码序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。来自每个启动子的RNA通常使用多腺苷酸化序列(例如哺乳动物序列，例如牛生长激素(BGH)poly A序列，合成的多腺苷酸化序列，或病毒序列，例如SV40早期或晚期多腺苷酸化序列)终止。
本发明还提供了一种病毒，如痘病毒或HSV，优选HSV1，其表达至少三种异源基因，其中三种异源基因中的每一种由选自CMV启动子、RSV启动子、EF1a启动子、SV40启动子和逆转录病毒LTR启动子的不同启动子驱动。例如，病毒可以表达四种异源基因，其中四种异源基因中的每一种由选自CMV启动子、RSV启动子、EF1a启动子、SV40启动子和逆转录病毒LTR启动子的不同启动子驱动。逆转录病毒LTR优选来自MMLV(SEQ ID NO：43)，也称为MoMuLV。异源基因可以通过多腺苷酸化序列终止。多腺苷酸化序列可以相同或不同。优选地，每个异源基因由不同的多腺苷酸化序列终止，所述多腺苷酸化序列优选选自BGH、SV40、HGH和RBG多腺苷酸化序列。
本发明还提供了一种病毒，如痘病毒或HSV，优选HSV1，其表达至少三种异源基因，其中三种异源基因中的每一种都被选自BGH、SV40、HGH和RBG多聚腺苷酸化序列的不同多聚腺苷酸化序列终止。例如，病毒可以表达分别由BGH、SV40、HGH和RBG多聚腺苷酸化序列中的每一个终止的四个异源基因。
药物组合物
本发明提供了包含本发明的病毒和药学上可接受的运载体或稀释剂的药物组合物。合适的运载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。该组合物可以进一步包含其他成分，例如糖或蛋白质，以改善诸如产品稳定性的性质。或者，可以使用冻干制剂，其在使用前在药学上可接受的运载体或稀释剂中重构。
如果需要，运载体的选择通常是组合物递送途径的函数。在本发明中，可以配制组合物用于任何合适的给药途径和方式。药学上可接受的运载体或稀释剂是用于适合于肿瘤内给药、静脉内/动脉内给药、施用到脑内或施用到体腔内(例如膀胱、胸膜腔或通过腹膜内给药)的组合物中的那些。组合物可以以任何合适的形式给药，优选以液体形式给药。
本发明还提供了在无菌小瓶、安瓿或注射器中包含本发明的病毒的制品。
医药用途/治疗方法
本发明提供了本发明的病毒，其用于通过疗法治疗人体或动物体，特别是用于治疗癌症的方法。癌症通常在哺乳动物中，优选在人中。该病毒通过病毒介导的毒性杀死感染的肿瘤细胞，包括通过裂解、坏死或凋亡，优选通过裂解或坏死。本发明的病毒还引发全身性抗肿瘤免疫应答，通过免疫刺激分子的表达而增强，所述全身性抗肿瘤免疫应答也杀死癌细胞。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的病毒施用给有需要的个体。
本发明另外提供了本发明的病毒在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的病毒特别适用于治疗任何实体瘤，包括任何腺癌，癌，或肉瘤。例如，本发明的病毒可用于治疗头颈癌，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，子宫内膜癌，膀胱癌，胆囊癌，胰腺癌，结肠癌，肾癌，胃/胃癌，食道癌或宫颈癌，间皮瘤，黑色素瘤或其他皮肤癌，淋巴瘤，神经胶质瘤或其他神经系统癌症，或肉瘤如软组织肉瘤。
本发明的病毒可用于治疗恶性肿瘤，包括已从原始肿瘤部位转移的肿瘤。在该实施方案中，病毒可以施用于原发性肿瘤或一种或多种继发性肿瘤。
本发明的病毒可以与其他治疗剂组合施用，包括化学疗法，靶向疗法，免疫疗法(包括免疫共抑制途径阻断或免疫共刺激途径激活)和/或与放射疗法组合和/或与这些中的任意组合组合。治疗剂优选为抗癌剂。
本发明的病毒可以与第二种病毒组合施用，例如与第二种溶瘤病毒组合施用。
例如，治疗剂可以包含免疫原(包括重组或天然存在的抗原，包括这样的抗原或以编码其的DNA或RNA递送的抗原组合)，以进一步刺激针对肿瘤细胞(特别是肿瘤新生抗原)的免疫应答，例如细胞或体液免疫应答。治疗剂可以是旨在增加或增强免疫应答的药剂，例如细胞因子，旨在抑制免疫检查点途径或刺激免疫增强途径的药剂或抑制调节性T细胞(Tregs)活性的药剂。
治疗剂可以是已知用于现有癌症治疗处理的药剂。治疗剂可以是放射疗法或化学治疗剂。治疗剂可选自环磷酰胺，烷化样药剂如顺铂或美法仑，植物生物碱和萜类化合物如长春新碱或紫杉醇(Taxol)，抗代谢物如5-氟尿嘧啶，拓扑异构酶抑制剂I型或II型如喜树碱或多柔比星，细胞毒性抗生素如放线菌素，蒽环霉素如表柔比星，糖皮质激素如曲安西龙，蛋白质、DNA和/或RNA合成的抑制剂如甲氨蝶呤和达卡巴辛，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂或任何其他化学治疗剂。
治疗剂可以是下述的一种或其组合：免疫治疗剂或免疫调节剂，例如TLR激动剂；下调T-调节细胞的药物，如环磷酰胺；或旨在阻断免疫检查点或刺激免疫增强途径的药剂，包括但不限于单克隆抗体，如CTLA-4抑制剂，PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂，LAG-3抑制剂，TIM-3抑制剂，VISTA抑制剂，CSF1R抑制剂，IDO抑制剂，CEACAM1抑制剂，GITR激动剂，4-1-BB激动剂，KIR抑制剂，SLAMF7抑制剂，OX40激动剂，CD40激动剂，ICOS激动剂或CD47抑制剂。在一个优选的实施方案中，治疗剂是CTLA-4抑制剂，例如抗-CTLA-4抗体，PD1抑制剂，例如抗PD-1抗体或PD-L1抑制剂，例如抗PD-L1抗体。可以通过本领域已知的标准方法产生和测试这些抑制剂、激动剂和抗体。
免疫治疗剂还可包括双特异性抗体，基于细胞的疗法，所述基于细胞的疗法基于树突细胞、NK细胞或工程化T细胞，例如CAR-T细胞或表达工程化T细胞受体的T细胞。免疫治疗剂还包括靶向肿瘤中发生的特定基因突变的药剂，旨在诱导针对特定肿瘤抗原或肿瘤抗原(包括新生抗原)的组合的免疫应答的药剂，和/或旨在激活STING/cGAS途径、TLR或其他先天免疫应答和/或炎症途径的药剂，包括肿瘤内药剂。
例如，可以使用本发明的病毒：与达卡巴嗪，BRAF抑制剂和/或CTLA-4，PD1或PD-L1阻断联合以治疗黑素瘤；与紫杉醇，多柔比星，长春瑞滨，环磷酰胺和/或吉西他滨联合治疗乳腺癌；与5-氟尿嘧啶和任选的甲酰四氢叶酸，伊立替康和/或奥沙利铂联合治疗结肠直肠癌；与紫杉醇，卡铂，长春瑞滨和/或吉西他滨，PD-1或PD-L1阻断联合治疗肺癌；与顺铂和/或放射疗法联合治疗头颈癌。
治疗剂可以是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径的抑制剂。IDO抑制剂的实例包括epacadostat(INCB024360)，1-甲基-色氨酸，Indoximod(1-甲基-D-色氨酸)，GDC-0919或F001287。
IDO在抑制抗肿瘤免疫应答中的作用机制也可以抑制溶瘤病毒治疗后产生的免疫应答。IDO表达由toll样受体(TLR)激活和干扰素-γ诱导，这两者都可能由溶瘤病毒感染引起。用于癌症治疗的溶瘤病毒疗法的一个实施方案包括溶瘤病毒与IDO途径的抑制剂和任选的免疫共抑制途径的一种或多种其他拮抗剂和/或免疫共刺激途径的一种或多种激动剂(包括靶向CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的那些)的组合，所述溶瘤病毒包括表达一种或多种免疫刺激蛋白和/或促融合蛋白的病毒。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括对需要其的患者施用治疗有效量的溶瘤病毒、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径的抑制剂和免疫共抑制途径的另一种拮抗剂、和/或免疫共刺激途径的激动剂。溶瘤病毒优选是经修饰的临床分离株。溶瘤病毒优选为痘病毒，更优选为HSV，例如HSV1和/或使ICP34.5和/或ICP47功能性失活的HSV。溶瘤病毒可以表达免疫刺激分子，例如GM-CSF和/或促融合蛋白，例如GALV促融合糖蛋白，其中R序列突变或缺失。免疫共抑制途径的其他拮抗剂优选是CTLA-4的拮抗剂、PD1的拮抗剂或PD-L1的拮抗剂。例如，免疫共抑制途径的其他拮抗剂可以是PD1和PD-L1之间相互作用的抑制剂。
当治疗剂和/或放射疗法与本发明的病毒结合使用时，病毒和治疗剂和/或放射疗法的施用可以是同时的或者在时间上分开。本发明的组合物可以在治疗剂或放射疗法之前、同时或之后施用。治疗癌症的方法可包括多次施用本发明的病毒和/或治疗剂和/或放射疗法。熟练的从业者将能够容易地确定病毒和治疗剂的合适给药疗程。
在优选的实施方案中，在与免疫共抑制途径的一种或多种拮抗剂、免疫共刺激途径的一种或多种激动剂和/或其它免疫增强剂组合的情况下，本发明的病毒在同时施用免疫共抑制途径的拮抗剂、免疫共刺激途径的激动剂和/或一种或多种其他免疫增强剂之前施用一次或多次，或与免疫共抑制途径的拮抗剂、免疫共刺激途径的激动剂和/或一种或多种其他免疫增强剂的施用同时施用一次或多次，而没有本发明病毒的在先施用。
可以通过任何合适的途径将本发明的病毒施用于受试者。通常，通过直接肿瘤内注射施用本发明的病毒，包括通过使用成像指导来靶向一个或多个肿瘤。可以将病毒施用到体腔中，例如施用到胸膜腔、膀胱中或通过腹膜内施用。可以将病毒注射到血管中，优选地是供应肿瘤的血管。
可以与本发明的病毒组合的治疗剂可以使用各种已知的途径和技术在体内施用给人或动物受试者。例如，组合物可以作为可注射溶液、悬浮液或乳液提供，并使用常规针头和注射器或使用液体喷射注射系统通过肠胃外、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉内、动脉内、腹膜内、静脉内注射施用。组合物可局部施用至皮肤或粘膜组织，例如鼻腔，气管内，肠内，舌下，直肠或阴道施用，或以适于呼吸或肺部给药的细碎喷雾形式提供。在优选的实施方案中，组合物通过静脉内输注、口服或直接施用于肿瘤内。
病毒和/或治疗剂可以以与治疗有效的剂量组合物相容的量施用于受试者。施用本发明的病毒是为了“治疗”目的。如本文所用，术语“治疗性”或“治疗”包括以下任何一种或多种作为其目的：预防任何转移或进一步发生转移；减少或消除症状；减少或完全消除肿瘤或癌症，增加患者癌症进展的时间；治疗后复发时间增加；或者增加生存时间。
治疗性治疗可以给予I、II、III或IV期癌症，优选II、III或IV期，更优选III期或IV期，手术前或手术后干预，优选在手术干预之前(用于切除原发性或复发性/转移性疾病)，即存在残留肿瘤时。
在将病毒组合物直接注射到靶组织(可以是肿瘤)、体腔或血管内之后，可以进行治疗性治疗。作为指导，在HSV的情况下施用的病毒量为104至1010pfu，优选105至109pfu。在HSV的情况下，可以向患者给予初始较低剂量(例如104至107pfu)，以使针对HSV为血清阴性的患者血清转化并且在血清阳性患者中增强免疫力，然后在之后给予更高剂量(例如，106到109pfu)。通常，高达20ml的基本上由病毒和药学上可接受的合适的运载体或稀释剂组成的药物组合物可以用于直接注射到肿瘤中，或者最多50ml用于施用到体腔中(在施用之前，可以进行进一步稀释到适当的稀释剂中)或进入血流中。然而，对于一些溶瘤治疗应用，也可以使用更大或更小的体积，这取决于肿瘤和给药途径和部位。
所描述的给药途径和剂量仅作为指导，因为熟练的从业者将能够容易地确定最佳给药途径和剂量。剂量可根据各种参数确定，尤其是根据肿瘤的位置，肿瘤的大小，待治疗患者的年龄、体重和状况以及给药途径。优选地，通过直接注射到肿瘤中来施用病毒。病毒还可以通过注射到血管或体腔中来施用。最佳给药途径取决于肿瘤的位置和大小。可能需要多个剂量以实现免疫学或临床效果，如果需要，通常间隔2天至12周，优选间隔3天至3周。可以给予长达5年或更长的重复剂量，优选长达一个月至两年，取决于所治疗的肿瘤类型的响应速度和特定患者的响应，以及也可能给予的任何组合疗法。
以下实施例举例说明了本发明。
实施例1.具有改善的抗肿瘤作用的临床分离株
用于举例说明本发明的病毒种类是HSV，特别是HSV1。唇疱疹拭子取自20多名健康志愿者。每个拭子的样品用于感染BHK细胞。含有HSV1的样品通过感染后24-72小时的细胞病变效应(CPE)的存在进行鉴定，并通过免疫组织化学和阳性临床分离株的病毒原液从阳性样品中产生。
测试了HSV1的原代临床分离株杀死一组人肿瘤衍生细胞系的能力，并且选择具有最大能够以低剂量快速杀死大范围这些细胞的能力的病毒株。用于该比较的肿瘤细胞系是HT29(结肠直肠癌)，MDA-MB-231(乳腺癌)，SK-MEL-28(黑素瘤)，Fadu(鳞状细胞癌)，MCF7(乳腺癌)，A549(肺癌)，MIAPACA-2(胰腺癌)，CAPAN-1(胰腺癌)，HT1080(纤维肉瘤)。细胞系用于测试每种原代临床分离株以一定范围的MOI和感染后的时间达到的CPE水平。
更具体地，肿瘤细胞系用于接种多孔组织培养板，使得它们在感染当天约80％汇合。来自每个肿瘤细胞系的代表性孔用胰蛋白酶消化并测定孔中的细胞数。这些细胞计数用于确定给出MOI为1、0.1、0.01和0.001所需的每种临床分离株的体积。以这些MOI，用临床分离株感染单独孔中的肿瘤细胞系，并用生长培养基和羧甲基纤维素覆盖。所有感染均一式四份进行。将一式两个孔孵育24小时，一式两个孔孵育48小时，均在37℃，5％CO2下孵育，然后用戊二醛固定细胞并用结晶紫染色。然后通过粗略观察、显微镜检查(细胞计数)和摄影或使用代谢测定例如MTT测定来评估细胞裂解水平。
还进行生长曲线实验以评估不同临床分离株在体外肿瘤细胞系中复制的能力。肿瘤细胞系用于接种多孔组织培养板，使得它们在感染当天约80％汇合。如上测定细胞计数并用于确定使MOI为1、0.1、0.01和0.001的病毒体积。对于MOI和时间点，肿瘤细胞一式两份被感染。将感染的细胞在37℃，5％CO2下孵育，并在感染后0、8、16、24和48小时通过冷冻/解冻裂解细胞。通过标准空斑测定评估病毒滴度。
实施例2.临床分离株的修饰
在该实施例中，修饰了实施例1中选择的临床分离株(即本发明的病毒)，其通过使用与含有在HSV1核苷酸145300至145582侧翼的区域(在其之间编码GFP)的质粒(HSV1核苷酸145300至145582是要缺失的序列；HSV1毒株17序列参见Genbank文件NC_001806.2)的同源重组从病毒基因组中缺失ICP47来进行。选择表达GFP的病毒空斑，然后通过与空的侧翼区域同源重组除去GFP，并选择不表达GFP的空斑。这导致ICP47缺失的病毒，其中US11表达为IE蛋白，因为它现在处于ICP47启动子的控制下。然后通过使用与含有在HSV1核苷酸124953至125727侧翼的区域(在其之间编码GFP)的质粒(HSV1核苷酸124953至125727是要缺失的序列；HSV1毒株17序列参见Genbank文件NC_001806.2)进行同源重组来缺失ICP34.5。再次选择表达GFP的病毒空斑，然后通过与相同侧翼区域(但现在其之间是包含密码子优化形式的小鼠GM-CSF序列和密码子优化形式的GALV R-序列的表达盒，其分别由CMVIE启动子和RSV启动子驱动并且处于背对背的方向)的同源重组除去GFP，并再次选择不表达GFP的病毒空斑。使用本领域标准的方法进行该病毒构建。
所得病毒的结构如图1(上图)所示。mGM-CSF和GALV-R-序列分别显示于SEQ ID NO2和8中。通过限制性消化和Southern印记确认所得病毒的结构，通过ELISA确认GM-CSF表达，并通过感染人HT1080肿瘤细胞和观察到合胞体斑块来确认GALV-R-表达。
病毒也使用类似的程序构建，这些程序没有插入ICP34.5，或者只插入了小鼠GM-CSF或GALV-R-的基因。这些病毒的结构也显示在图1中。
对于人类使用，使用hGM-CSF，其密码子优化形式的序列显示在SEQ ID NO 4中。
实施例3.来自表达促融合蛋白的病毒的两种免疫刺激分子的表达
构建了与上述表达GALV-R-和mGM-CSF的病毒相似的病毒，但另外表达了CD40L的形式。这里，没有使用含有ICP34.5侧翼区和包含由CMV和RSV启动子驱动的GM-CSF和GALV-R-的表达盒的质粒，而是使用含有ICP34.5侧翼区和包含由CMV、RSV和SV40启动子驱动的GM-CSF、GALV和CD40L的表达盒的质粒用于与含有插入到ICP34.5中的GFP的病毒重组，并且再次选择不表达GFP的空斑。
实施例4.来自溶瘤病毒的促融合蛋白和免疫刺激分子在小鼠肿瘤模型中的组合表达的影响
GALV R-蛋白在人细胞中导致细胞与细胞融合，但在小鼠细胞中不导致此，因为发生细胞融合所需的PiT-1受体在小鼠中具有不允许细胞融合发生的序列。结果，首先使用本领域标准方法制备表达人PiT-1的小鼠肿瘤细胞。将人PiT-1克隆到也包含选择标记基因的慢病毒载体中。将载体转染到靶CT26小鼠结肠直肠癌肿瘤细胞中，选择对选择标记具有抗性的克隆以产生CT26/PiT-1细胞。通过蛋白质印迹在未转染的细胞和用表达PiT-1的慢病毒转染的细胞中以及通过转染表达GALV-R-的质粒并确认细胞融合发生来证实PiT-1表达。
通过将CT26/PiT-1细胞施用到Balb/c小鼠的两侧腹部并允许CT26/PiT-1肿瘤生长至直径约0.5cm来证明本发明的效用。
然后对小鼠组(每组5只)进行以下治疗，只对每只小鼠的一侧腹部进行，每周3次，持续两周：
-50μl生理盐水(1组)；
-50μl 105pfu/ml、106pfu或107pfu/ml没有插入的基因的HSV(3组)；
-50μl 105pfu/ml、106pfu/ml或107pfu/ml仅插入小鼠GM-CSF的HSV(3组)；
-50μl 105pfu/ml、106pfu/ml或107pfu/ml仅插入GALV-R-的病毒(3组)；或
-50μl 105pfu/ml、106pfu/ml或107pfu/ml插入小鼠GM-CSF和GALV-R-的病毒(3组)。
然后观察对肿瘤生长的影响长达一个月。与其他组相比，使用表达GM-CSF和GALV-R-的病毒在注射的和未注射的肿瘤中均观察到优异的肿瘤控制和收缩，包括通过改善的剂量响应曲线所观察到的。
实施例5.来自溶瘤病毒的促融合蛋白和免疫刺激分子的组合表达对小鼠肿瘤模型中免疫检查点阻断的治疗效果的影响
重复上述实施例3中的实验，但是通过腹膜内途径每两周一次给小鼠另外给予靶向小鼠PD-1的抗体(10mg/kg；Bioxcell RMP-1-14，与病毒给药同一天)或靶向小鼠CTLA-4的抗体(10mg/kg；Bioxcell9H10，与病毒给药同一天)。增加未接受抗体治疗的另外一组小鼠。更具体地，小鼠组接受：(1)盐水，(2)没有插入基因的HSV，(3)如实施例3中插入GM-CSF和GALV-R-的HSV，(4)PD-1抗体，(5)CTLA-4抗体，(6)没有插入基因的HSV加PD-1抗体，(7)没有插入基因的HSV加CTLA-4抗体，(8)具有GM-CSF和GALV-R-的HSV和PD-1抗体或(9)具有GM-CSF和GALV-R-的HSV和CTLA-4抗体。与其他组相比，使用表达GM-CSF和GALV-R-的病毒以及抗PD-1抗体或抗-CTLA-4抗体在注射的和未注射的肿瘤中均观察到优异的肿瘤控制和收缩，包括通过改善的剂量响应曲线所观察到的。
实施例6.临床分离株的采集
用于举例说明本发明的病毒种类是HSV，特别是HSV1。为了举例说明本发明，招募了181名患有复发性唇疱疹的志愿者。这些志愿者被给予样品采集试剂盒(包括SigmaVirovult采集管)，并且当唇疱疹出现时用它们擦拭唇疱疹，随后将这些样品运送到Replimune,Oxford UK。从2015年6月至2016年2月，收到了来自72名志愿者的拭子。每个拭子的样品用于感染BHK细胞。在铺板并在BHK细胞上生长后，从这些中回收到36个活病毒样品。这些样品详见表1。
表1：经测试的拭子样品和结果的详细信息
Figure GDA0003747294320000331
Figure GDA0003747294320000341
Figure GDA0003747294320000351
Figure GDA0003747294320000361
Figure GDA0003747294320000371
Figure GDA0003747294320000381
名称A、B、C等表示来自同一志愿者的多个拭子。实施例7.具有改善的抗肿瘤作用的临床分离株的鉴定
测试了HSV1的原代临床分离株杀死一组人肿瘤来源的细胞系的能力。用于该比较的肿瘤细胞系是HT29(结肠直肠癌)，MDA-MB-231(乳腺癌)，SK-MEL-28(黑素瘤)，Fadu(鳞状细胞癌)，MCF7(乳腺癌)，A549(肺)，MIAPACA-2(胰腺癌)和HT1080(纤维肉瘤)。细胞系用于测试每种原代临床分离株以一系列的MOI和感染后的时间达到的CPE水平。
同时使用5至8个新病毒株平行地进行实验。将病毒株以一系列MOI(0.001-1)一式两份铺板，并在感染后24和48小时评估结晶紫染色后的CPE程度。对杀死肿瘤细胞系最有效的病毒株进行评分，并且在进一步的实验中鉴定并平行比较来自5-8个毒株的每次筛选的最有效的两个或三个毒株，以鉴定用于进一步开发的最强毒株。
初始筛选证明了不同毒株杀死不同肿瘤细胞系的能力的显著可变性。在最初测试的29个毒株中，在初始筛选中鉴定了8个感兴趣的毒株用于进一步比较。它们是毒株RH004A，RH015A，RH018A，RH021A，RH023A，RH31A，RH040A和RH047A。
在肿瘤细胞系组中平行测试用于进一步比较的8个毒株，并且在结晶紫染色和观察CPE后评估它们杀死这些肿瘤细胞系的相对能力。图3显示了这些病毒中每种病毒针对每种细胞系的代表性时间点和MOI，证明了观察到的病毒杀死靶肿瘤细胞系的差异能力。
毒株之间存在显著差异，并且发现虽然特定毒株可能在杀死一种细胞系方面特别有效，但它对杀死其他细胞系也不一定特别有效，进一步证明了HSV的临床株杀死不同类型的肿瘤细胞的能力的可变性程度。
图3还表明哪种病毒株在杀死每种细胞系中是最佳和次佳的，使得病毒株能够按其杀死整个细胞系组的整体相对能力排序。该分析表明毒株RH004A，RH015A，RH018A，RH031A和RH040A比其他毒株相对更有效，并且选择这五种毒株用于作为溶瘤剂的潜在的进一步开发。在这前五种毒株中，基于它们杀死一组细胞系的能力的相对等级顺序是RH018A>RH004A>RH031A>RH040A>RH015A。
更具体地，在这些实验中，肿瘤细胞系用于接种多孔组织培养板，使得它们在感染当天约80％汇合。来自每个肿瘤细胞系的代表性孔用胰蛋白酶消化并测定孔中的细胞数。这些细胞计数用于确定给出MOI为1、0.1、0.01和0.001所需的每种临床分离株的体积。以这些MOI，用临床分离株感染单独孔中的肿瘤细胞系。所有感染均一式四份进行。将一式两个孔孵育24小时，一式两个孔孵育48小时，均在37℃，5％CO2下孵育，然后用戊二醛固定细胞并用结晶紫染色。然后通过粗略观察、显微镜检查(细胞计数)和摄影评估细胞裂解水平。
将毒株RH018A(在所有测试毒株中排名第一)与筛选的“平均”毒株(即毒株不在前8位，但也不在杀灭肿瘤细胞系组的效果最差的毒株组中)进行比较。该比较显示毒株RH018A在杀死肿瘤细胞系时比该平均毒株(毒株RH065A)约10倍更有效(即杀死等量细胞需要的毒株RH018A比所需的毒株RH065A少约10倍)。这显示在图4中。
实施例8.临床分离株的修饰
在该实施例中，修饰实施例7中选择的临床分离株，通过使用与含有在ICP34.5编码基因侧翼的区域(其间是编码的GFP和GALV-R-促融合糖蛋白)(核苷酸143680-145300和145,582-147,083；HSV1毒株17序列参见Genbank文件NC_001806.2)的质粒的同源重组，从病毒基因组中缺失ICP34.5来进行。该病毒(病毒10)的结构如图5所示。
还构建了基于毒株RH018A的其他病毒，其中ICP34.5和ICP47(使用含有核苷酸123464-124953和125727-126781的侧翼区域；HSV1毒株17序列参见Genbank文件NC_001806.2)均缺失(导致US11置于ICP47启动子的控制下)。为了构建这些病毒，首先选择表达GFP的病毒空斑，其中表达的GFP代替ICP47。然后通过与空侧翼区域的同源重组除去GFP，并选择不表达GFP的空斑。这导致ICP47缺失的病毒，其中US11表达为IE蛋白，因为它现在处于ICP47启动子的控制下。然后使用与含有在HSV1核苷酸143680-145300和145,582-147,083(HSV1毒株17序列参见Genbank文件NC_001806.2)侧翼的区域(其之间编码GFP)的质粒进行同源重组来缺失ICP34.5。再次选择表达GFP的病毒空斑，然后通过与相同侧翼区域(但现在其之间是包含待插入基因的表达盒)的同源重组除去GFP。构建的病毒显示在图1和5中。这些包括分别由CMV IE启动子和RSV启动子驱动的密码子优化形式的小鼠GM-CSF序列和密码子优化形式的GALV R-序列，其处于背靠背方向，以及再次选择不表达GFP的病毒空斑。使用本领域标准的方法进行该病毒构建。
mGM-CSF和GALV-R-序列分别显示于SEQ ID NO 2和8中。通过PCR确认所得病毒的结构，通过ELISA确认GM-CSF表达，并通过感染人HT1080肿瘤细胞和观察到合胞体斑块来确认GALV-R-表达。
对于人类使用，使用hGM-CSF，其密码子优化形式的序列显示在SEQ ID NO 4中。该病毒的结构如图5所示。来自病毒16、17和19的小鼠或人GM-CSF的表达示于图6中。
实施例9.与不表达促融合糖蛋白的病毒相比，经修饰用于溶瘤使用并表达促融合糖蛋白的本发明病毒在体外显示出增强的肿瘤细胞杀伤作用
基于临床毒株RH018A的病毒10(参见图5)(其中ICP34.5缺失并且表达GALVR-和GFP)在体外与仅表达GFP的病毒(病毒12)进行比较。与病毒12相比，病毒10在一组人肿瘤细胞系中显示出增强的杀伤，如图7所示。
实施例10.与不是本发明的经类似修饰的病毒相比，经修饰用于溶瘤使用的本发明的病毒显示出增强的肿瘤细胞杀伤
基于临床毒株RH018A的病毒17(参见图5)(其中ICP34.5和ICP47缺失并且表达GALVR-和GM-CSF)在体外与已知的病毒(该病毒也缺失ICP34.5和ICP47，但它不是来源于本发明的毒株，并且仅表达GM-CSF)进行比较。与先前的病毒相比，病毒17在一组人肿瘤细胞系中显示出增强的杀伤，如图8所示。
实施例11.经修饰用于溶瘤使用的本发明的病毒在体内有效地治疗小鼠肿瘤
在左侧和右侧腹部携带A20淋巴瘤肿瘤的小鼠中测试病毒16。首先将100万个肿瘤细胞植入Balb/c小鼠的两侧腹部，允许肿瘤直径增大至0.5-0.7cm。然后将右侧腹部的肿瘤用媒介物(10只小鼠)或5×10exp6 pfu的病毒16(10只小鼠)注射3次(每隔一天)，并观察对肿瘤大小的影响，持续另外30天。这证明，注射和未注射的肿瘤均得到病毒16的有效治疗(参见图9)。
实施例12.来自本发明的溶瘤病毒的促融合蛋白和免疫刺激分子在大鼠肿瘤模型中的组合表达的影响
GALV R-蛋白导致人细胞中的细胞与细胞融合，但在小鼠细胞中不能这样。然而，GALV R-确实引起大鼠细胞融合。
通过将9L细胞施用到Fischer 344大鼠的侧腹并使9L肿瘤生长至直径约0.5cm，进一步证明了本发明的效用。
然后对大鼠组(每组10只)进行以下治疗，只对每只大鼠的一侧腹部进行，每周3次，持续三周：
-50μl媒介物；
-50μl的107pfu/ml病毒19(表达mGM-CSF但不表达GALV R-)；
-50μl的107pfu/ml病毒16(表达小鼠GM-CSF和GALV-R-二者)。
然后观察对肿瘤生长的影响，进行另外≈30天。这表明使用表达GALV-R-的病毒在注射和未注射的肿瘤中优异的肿瘤控制和收缩，证明了改善的系统效应。这显示在图15中。图10显示与不表达GALV的病毒(病毒24)相比，表达GALV的病毒(病毒15)在体外也显示出增强的大鼠9L细胞杀伤。
实施例13.在小鼠肿瘤模型中，经修饰用于溶瘤使用的本发明的病毒与免疫检查点阻断是协同的
在左侧和右侧腹部携带CT26肿瘤的小鼠中测试病毒16。首先将100万个肿瘤细胞植入Balb/c小鼠的两侧腹部，并允许肿瘤生长至直径0.5-0.6cm。
然后用以下物质处理10只小鼠的组：
-媒介物(向右侧腹部肿瘤注射3次，每隔一天注射一次)；
-每隔一天在右侧腹部肿瘤中注射5x10exp6 pfu的病毒16；
-单独的抗小鼠PD1(每3天腹膜内10mg/kg，BioXCell克隆RMP1-14)；
-抗小鼠CTLA-4(每3天腹膜内3mg/Kg，BioXCell克隆9D9)；
-抗小鼠PD1和病毒16；
-抗小鼠CTLA4和病毒16；
-1-甲基色氨酸(IDO抑制剂(饮用水中5mg/ml))；
-抗小鼠PD1和1-甲基色氨酸；
-抗小鼠PD1与1-甲基色氨酸和病毒16；
观察对肿瘤大小的影响，进行另外30天。与用单一治疗组治疗的动物相比，用病毒和检查点阻断组合治疗的动物的肿瘤减小更多(见图11)。与仅与抗PD1一起的病毒16相比，还证实了病毒16与抗PD1和IDO抑制一起的增强的肿瘤减小(参见图11)。
在A20肿瘤中也观察到病毒16与免疫检查点阻断组合的增强活性(图12)。
实施例14.来自本发明的溶瘤病毒的促融合蛋白在免疫缺陷小鼠的人异种移植模型中的表达的影响
GALV R-蛋白导致人细胞中的细胞与细胞融合，但在小鼠细胞中不能如此。然而，在免疫缺陷小鼠中生长的人异种移植肿瘤可用于评估GALV表达对抗肿瘤功效的影响。
因此，通过将A549人肺癌细胞施用到裸鼠的侧腹并允许肿瘤生长至直径约0.5cm，进一步证明了本发明的效用。
然后对一组小鼠(每组10只)进行以下治疗，对每只小鼠的含肿瘤侧腹部进行，在一周进行3次：
-50μl媒介物；
-50μl 107pfu/ml病毒16(表达小鼠GM-CSF和GALV-R-二者)；
-50μl 106pfu/ml病毒16；
-50μl 105pfu/ml病毒16；
-50μl 107pfu/ml病毒19(仅表达小鼠GM-CSF)；
-50μl 106pfu/ml病毒19；
-50μl 105pfu/ml病毒19。
然后观察对肿瘤生长的影响，进行另外≈30天。该实验证明了在两种肿瘤模型中使用表达GALV-R-的病毒的优异的肿瘤控制和收缩(参见图14)。
实施例15.来自表达促融合蛋白的病毒的两种免疫刺激分子的表达
构建了与上述表达GALV-R-和mGM-CSF的病毒(病毒16)相似的病毒，但其另外表达了小鼠形式的CD40L(病毒32)、ICOSL(病毒36)、OX40L(病毒35)、4-1BBL(病毒33)和GITRL(病毒34)。这里，不使用含有ICP34.5侧翼区和包含由CMV和RSV启动子驱动的GM-CSF和GALV-R-的表达盒的质粒，而是使用含有ICP34.5侧翼区和包含分别由CMV、RSV和MMLV启动子驱动的GM-CSF、GALV和另外蛋白质的表达盒的质粒用于与含有插入到ICP34.5中的GM-CSF、GALV和GFP的病毒重组。再次选择不表达GFP的空斑。通过PCR确认正确插入，并通过蛋白质印迹和/或ELISA确认另外插入的基因的表达。这些病毒显示在图5中。类似地，还构建了除GALV和mGM-CSF之外还表达抗小鼠和抗人CTLA-4的病毒(图5中的病毒27和31，还参见图13)。除了mGM-CSF和GALVR-之外，还表达抗小鼠CTLA-4(病毒27)、mCD40L(病毒32)、m4-1BBL(病毒33)或mOX40L(病毒35)的病毒的体内效果如图16所示：与病毒16(表达mGM-CSF和GALVR-)相比，其在A20肿瘤中显示出增强的活性。在这些实验中，在小鼠的两侧腹部诱导肿瘤，并且仅将病毒或媒介物注射到右侧腹部肿瘤中。使用的病毒剂量为5×104pfu(每种情况下50ul的1×106pfu/ml)，在一周内给予三次。对于病毒16而言，对未注射的肿瘤，该病毒剂量水平是未达治疗剂量的，这使得可以清楚地看到递送由病毒27、32、33和35编码的另外的分子的益处。
保藏信息
以下HSV1毒株于2016年12月19日由Replimune Limited保藏于ECACC,CultureCollections,Public Health England,Porton Down,Salisbury,SP4 0JG,英国，并分配了指定的临时保藏号：
RH004A-临时保藏号16121902
RH015A-临时保藏号16121903
RH018A-临时保藏号16121904
RH021A-临时保藏号16121905
RH023A-临时保藏号16121906
RH031A-临时保藏号16121907
RH040B-临时保藏号16121908
RH047A-临时保藏号16121909。
序列表
<110> Replimune Limited
<120> VIRUS STRAIN
<130> N406715WO
<150> GB1600380.8
<151> 2016-01-08
<150> GB1600381.6
<151> 2016-01-08
<150> GB1600382.4
<151> 2016-01-08
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 1
atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc agcacccacc 60
cgctcaccca tcactgtcac ccggccttgg aagcatgtag aggccatcaa agaagccctg 120
aacctcctgg atgacatgcc tgtcacattg aatgaagagg tagaagtcgt ctctaacgag 180
ttctccttca agaagctaac atgtgtgcag acccgcctga agatattcga gcagggtcta 240
cggggcaatt tcaccaaact caagggcgcc ttgaacatga cagccagcta ctaccagaca 300
tactgccccc caactccgga aacggactgt gaaacacaag ttaccaccta tgcggatttc 360
atagacagcc ttaaaacctt tctgactgat atcccctttg aatgcaaaaa accagtccaa 420
aaatga 426
<210> 2
<211> 426
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 2
atgtggctcc agaacctcct cttcctcggt atcgtcgtgt attcactctc cgcacctact 60
cgctcaccta tcactgtcac cagaccctgg aagcacgtgg aggccatcaa ggaggctctg 120
aacctgctgg acgatatgcc agtgaccctg aacgaggagg tggaggtggt gagcaacgag 180
ttctccttta agaagctgac ctgcgtgcag acaaggctga agatcttcga gcagggcctg 240
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tactgccccc ctacccccga gacagactgt gagacacagg tgaccacata cgccgacttc 360
attgatagcc tgaaaacatt cctgaccgac attccatttg agtgtaagaa gcccgtccag 420
aagtaa 426
<210> 3
<211> 435
<212> DNA
<213> 智人
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gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420
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<210> 5
<211> 141
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His
20 25 30
Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val
35 40 45
Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys
50 55 60
Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu
65 70 75 80
Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser
85 90 95
Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr
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Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu
115 120 125
Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln Lys
130 135 140
<210> 6
<211> 144
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
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Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
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Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
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<210> 7
<211> 2010
<212> DNA
<213> 长臂猿白血病病毒
<400> 7
atggtattgc tgcctgggtc catgcttctc acctcaaacc tgcaccacct tcggcaccag 60
atgagtcctg ggagctggaa aagactgatc atcctcttaa gctgcgtatt cggcggcggc 120
gggacgagtc tgcaaaataa gaacccccac cagcccatga ccctcacttg gcaggtactg 180
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tataagcaaa tcacctgggg agccataggg tgcagctacc ctcgggctag gactagaatg 420
gcaagctcta ccttctacgt atgtccccgg gatggccgga ccctttcaga agctagaagg 480
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tattggctat ctaaatcctc aaaagacctc ataactgtaa aatgggacca aaatagcgaa 600
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actggcctca ccccttgcct ctccacctca gtttttaatc agactagaga tttctgtatc 1380
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gggttgggaa tcacggcggg aataggtact ggttcaactg ccttaattaa aggacctata 1560
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aataggagag gccttgactt gctgtttcta aaagaaggtg gcctctgtgc ggccctaaag 1740
gaagagtgct gtttttacat agaccactca ggtgcagtac gggactccat gaaaaaactc 1800
aaagaaaaac tggataaaag acagttagag cgccagaaaa gccaaaactg gtatgaagga 1860
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ctcctccttc tgttgctcat cctcgggcca tgcatcatca ataagttagt tcaattcatc 1980
aatgatagga taagtgcagt taaaatttaa 2010
<210> 8
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<212> DNA
<213> 长臂猿白血病病毒
<400> 8
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tggcccaccc tgaagcctga cgtgtgcgcc ctggccgcct ccctggagtc ttgggacatc 300
cccggcacag acgtgagcag cagcaagagg gtgagaccac ccgactctga ttatacagcc 360
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atggccagct ccacctttta cgtgtgccca cgcgacggaa ggaccctgtc tgaggcaagg 480
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gactttacag ataagggcaa gctgtccaag gactggatca ccggcaagac atggggcctg 720
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atgggcccac cctactatga ggcaatcgcc tcctctggag aggtggcata ttccacagac 1140
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atcaacgacc gaatctccgc agtgaaaatc taa 2013
<210> 9
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<212> PRT
<213> 长臂猿白血病病毒
<400> 9
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210 215 220
Gly Lys Leu Ser Lys Asp Trp Ile Thr Gly Lys Thr Trp Gly Leu Arg
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Phe Tyr Val Ser Gly His Pro Gly Val Gln Phe Thr Ile Arg Leu Lys
245 250 255
Ile Thr Asn Met Pro Ala Val Ala Val Gly Pro Asp Leu Val Leu Val
260 265 270
Glu Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ser Leu Ala Leu Pro Pro Pro Leu Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 智人
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<213> 人工序列
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<223> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 小家鼠
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atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60
atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180
gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240
ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300
aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360
attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420
aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaatgc ttgaaaatgg gaaacagctg 480
acggttaaaa gagaaggact ctattatgtc tacactcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540
gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600
gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660
tctgttcact tgggcggagt gtttgaatta caagctggtg cttctgtgtt tgtcaacgtg 720
actgaagcaa gccaagtgat ccacagagtt ggcttctcat cttttggctt actcaaactc 780
tga 783
<210> 19
<211> 260
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
85 90 95
Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
100 105 110
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr
130 135 140
Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu
145 150 155 160
Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe
165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu
180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
195 200 205
Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu
210 215 220
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly
245 250 255
Leu Leu Lys Leu
260
<210> 20
<211> 930
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 20
atggatcagc acacactgga cgtggaggat accgctgacg ctaggcaccc agctggcacc 60
tcctgccctt ctgatgccgc tctgctgcgc gacacaggac tgctggccga tgccgctctg 120
ctgtctgaca cagtgcggcc aaccaacgcc gctctgccaa ccgatgctgc ttaccctgct 180
gtgaacgtga gggacagaga ggctgcttgg ccacctgccc tgaacttctg cagccgccac 240
cctaagctgt acggcctggt ggccctggtg ctgctgctgc tgatcgctgc ttgcgtgcca 300
atctttaccc ggacagagcc acgccccgct ctgacaatca ccacatcccc caacctgggc 360
accagggaga acaacgccga tcaggtgaca ccagtgtctc acatcggctg ccccaacacc 420
acacagcagg gaagcccagt gttcgccaag ctgctggcta agaaccaggc cagcctgtgc 480
aacaccacac tgaactggca cagccaggac ggagctggaa gctcctacct gtcccagggc 540
ctgagatacg aggaggataa gaaggagctg gtggtggact cccctggact gtactacgtg 600
ttcctggagc tgaagctgtc tccaaccttt acaaacaccg gccacaaggt gcagggatgg 660
gtgtctctgg tgctgcaggc taagccccag gtggacgatt tcgataacct ggccctgacc 720
gtggagctgt ttccttgtag catggagaac aagctggtgg acaggtcttg gagccagctg 780
ctgctgctga aggctggcca caggctgtcc gtgggactga gagcctacct gcacggcgcc 840
caggatgctt acagagactg ggagctgagc taccctaaca ccacatcctt cggactgttt 900
ctggtgaagc ctgacaaccc atgggagtga 930
<210> 21
<211> 765
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
atggagtacg cctctgacgc cagcctggat ccagaggccc cttggccacc tgcaccaagg 60
gcccgcgcct gccgcgtgct gccctgggcc ctggtggccg gcctgttatt actgctgctg 120
ctggccgccg cctgcgccgt gttcctggca tgtccttggg ccgtgagcgg agccagagcc 180
tccccaggct ctgccgccag ccctcggctg agagagggac cagagctgtc cccagacgat 240
ccagcaggcc tgctggacct gaggcaggga atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg 300
ctgctgatcg acggccccct gtcctggtac tctgatcctg gcctggccgg cgtgtctctg 360
accggcggcc tgagctataa ggaggataca aaggagctgg tggtggccaa ggccggcgtg 420
tactacgtgt tcttccagct ggagctgagg agagtggtgg caggagaggg ctctggaagc 480
gtgtccctgg ccctgcacct gcagcccctg cggagcgccg caggagccgc cgccctggcc 540
ctgaccgtgg acctgccacc agccagctcc gaggcaagga attccgcctt cggctttcag 600
ggcagactgc tgcacctgtc tgccggacag aggctgggag tgcacctgca caccgaggcc 660
agggcccgcc acgcatggca gctgacccag ggagcaacag tgctgggcct gttccgcgtg 720
acacctgaga tcccagcagg cctgcctagc ccacggtccg agtga 765
<210> 22
<211> 1389
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 22
atgctgcctt tcctgtccat gctggtgctg ctggtgcagc cactgggcaa cctgggagcc 60
gagatgaagt ctctgagcca gcgcagcgtg cctaacacct gcacactggt catgtgctcc 120
cctacagaga acggcctgcc aggaagggac ggaagagatg gaagggaggg accaagggga 180
gagaagggcg accccggact gcctggacca atgggactga gcggcctgca gggaccaacc 240
ggccccgtgg gacctaaggg agagaacgga tccgctggag agccaggacc taagggagag 300
agaggactgt ctggaccacc tggactgcca ggaatcccag gaccagctgg caaggaggga 360
ccatccggca agcagggaaa catcggacca cagggaaagc ctggaccaaa gggagaggct 420
ggacctaagg gagaagtggg cgccccagga atgcagggct ctacaggagc taagggcagc 480
accggaccaa agggagagag gggagccccc ggagtgcagg gagcccctgg caacgctgga 540
gccgctggcc cagccggacc cgctggccct cagggagccc ccggctctag gggaccacca 600
ggcctgaagg gagacagagg cgtgcccgga gatcggggca tcaagggaga gagcggcctg 660
cctgactccg ccgctctgag acagcagatg gaggctctga agggcaagct gcagcggctg 720
gaggtggcct tctcccacta ccagaaggcc gctctgtttc ctgacggaag gacagagccc 780
aggcctgctc tgaccatcac cacatctcca aacctgggca caagagagaa caacgccgat 840
caggtgaccc ccgtgtctca catcggatgc cctaacacca cacagcaggg cagccccgtg 900
tttgccaagc tgctggctaa gaaccaggcc agcctgtgca acaccacact gaactggcac 960
tcccaggatg gcgccggaag ctcctacctg tctcagggcc tgcggtacga ggaggacaag 1020
aaggagctgg tggtggatag cccaggcctg tactacgtgt tcctggagct gaagctgtcc 1080
cccaccttta caaacaccgg acacaaggtg cagggatggg tgagcctggt gctgcaggct 1140
aagccccagg tggacgattt cgacaacctg gccctgaccg tggagctgtt tccttgctct 1200
atggagaaca agctggtgga tagatcctgg agccagctgc tgctgctgaa ggctggacac 1260
cgcctgagcg tgggcctgag ggcttacctg cacggagctc aggacgctta cagggattgg 1320
gagctgtcct accctaacac cacatctttc ggcctgtttc tggtgaagcc agacaacccc 1380
tgggagtga 1389
<210> 23
<211> 1389
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
atgctgctgt tcctgctgtc cgccctggtg ctgctgaccc agcctctggg ctacctggag 60
gccgagatga agacctattc tcaccggaca atgccaagcg cctgcacact ggtcatgtgc 120
agcagcgtgg agtctggcct gccaggaagg gacggaaggg atggaaggga gggacctaga 180
ggcgagaagg gcgaccctgg cctgccagga gcagcaggac aggcaggaat gcccggccag 240
gccggccccg tgggacctaa gggcgacaac ggaagcgtgg gagagccagg accaaagggc 300
gataccggcc cttccggacc acctggacca ccaggcgtgc ctggcccagc cggcagggag 360
ggccctctgg gcaagcaggg caatatcggc ccacagggca agcccggccc taagggcgag 420
gccggcccca agggcgaagt gggcgcccct ggcatgcagg gaagcgccgg agcccgcggc 480
ctggccggac ctaagggcga gagaggcgtg cctggagaga ggggcgtgcc aggaaacaca 540
ggcgcagcag gatctgccgg agcaatggga ccccagggca gccctggcgc caggggccct 600
ccaggcctga agggcgacaa gggcatccca ggcgataagg gagcaaaggg agagagcggc 660
ctgccagatg tggcctccct gcgccagcag gtggaggccc tgcagggcca ggtgcagcac 720
ctgcaggccg ccttctctca gtacaagaag gtggagctgt ttccaaacgg cgcctgcccc 780
tgggccgtga gcggagcccg ggcctcccca ggctctgccg ccagccctag gctgcgcgag 840
ggaccagagc tgagcccaga cgatccagca ggcctgctgg acctgagaca gggaatgttc 900
gcccagctgg tggcccagaa tgtgctgctg atcgacggcc cactgtcctg gtactctgat 960
ccaggcctgg ccggcgtgtc cctgaccggc ggcctgtctt ataaggagga tacaaaggag 1020
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttcttcc agctggagct gaggagagtg 1080
gtggcaggag agggatccgg atctgtgagc ctggccctgc acctgcagcc cctgcggtcc 1140
gccgcaggag ccgccgccct ggccctgacc gtggacctgc cacctgcctc tagcgaggca 1200
cgcaattccg ccttcggctt tcagggccgg ctgctgcacc tgtctgccgg acagagactg 1260
ggagtgcacc tgcacaccga ggcccgggcc agacacgcct ggcagctgac ccagggagca 1320
acagtgctgg gcctgtttag ggtgacacct gagatcccag ccggcctgcc aagcccccgc 1380
tccgagtga 1389
<210> 24
<211> 522
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 24
atggaggaga tgcctctgag ggagagctcc ccacagaggg ccgagagatg caagaagagc 60
tggctgctgt gcatcgtggc tctgctgctg atgctgctgt gctctctggg caccctgatc 120
tacacaagcc tgaagccaac cgccatcgag tcctgtatgg tgaagttcga gctgtctagc 180
tccaagtggc acatgacatc ccccaagcct cactgcgtga acaccacatc tgacggaaag 240
ctgaagatcc tgcagagcgg cacctacctg atctacggac aggtcatccc cgtggacaag 300
aagtacatca aggataacgc ccctttcgtg gtgcagatct acaagaagaa cgacgtgctg 360
cagacactga tgaacgattt tcagatcctg cccatcggcg gagtgtacga gctgcacgct 420
ggcgacaaca tctacctgaa gttcaactcc aaggatcaca tccagaagac caacacatac 480
tggggaatca tcctgatgcc agatctgccc tttatctctt ga 522
<210> 25
<211> 600
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
atgaccctgc acccaagccc catcacatgc gagttcctgt tttctaccgc cctgatcagc 60
ccaaagatgt gcctgagcca cctggagaat atgcccctgt cccactctcg gacacaggga 120
gcccagagaa gctcctggaa gctgtggctg ttctgctcta tcgtgatgct gctgttcctg 180
tgcagctttt cctggctgat cttcatcttt ctgcagctgg agacagccaa ggagccttgc 240
atggccaagt ttggccctct gccatccaag tggcagatgg cctctagcga gcccccttgc 300
gtgaacaagg tgagcgactg gaagctggag atcctgcaga acggcctgta cctgatctat 360
ggccaggtgg cccccaacgc caattacaac gacgtggccc ctttcgaggt gcggctgtat 420
aagaacaagg atatgatcca gaccctgaca aataagtcta agatccagaa cgtgggcggc 480
acatacgagc tgcacgtggg cgacaccatc gacctgatct tcaacagcga gcaccaggtg 540
ctgaagaaca atacatattg gggcatcatc ctgctggcca acccccagtt tatctcctga 600
<210> 26
<211> 1164
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 26
atgctgcctt tcctgtctat gctggtgctg ctggtgcagc cactgggcaa cctgggagcc 60
gagatgaaga gcctgtccca gagatccgtg cccaacacct gcacactggt catgtgctct 120
cctaccgaga acggcctgcc aggaagggac ggaagagatg gaagggaggg acctcgggga 180
gagaagggcg acccaggact gcctggacca atgggactga gcggcctgca gggaccaaca 240
ggccccgtgg gacctaaggg agagaacgga agcgccggag agccaggacc taagggagag 300
aggggactgt ccggaccacc tggactgcct ggaatcccag gaccagctgg caaggaggga 360
ccatccggca agcagggaaa catcggacca cagggaaagc ctggaccaaa gggagaggct 420
ggaccaaagg gagaagtggg cgctcctgga atgcagggct ccaccggagc caagggctct 480
acaggaccaa aaggagagag gggagctccc ggagtgcagg gagcccctgg caacgctgga 540
gccgctggcc cagccggacc cgctggccct cagggagccc caggcagcag gggaccaccc 600
ggcctgaagg gcgacagggg cgtgccagga gataggggca tcaagggaga gtctggcctg 660
ccagacagcg ccgctctgag acagcagatg gaggccctga agggcaagct gcagcggctg 720
gaggtggctt tctcccacta ccagaaggcc gctctgtttc cagatggcag cctgaagccc 780
accgccatcg agtcctgcat ggtgaagttt gagctgagct cctctaagtg gcacatgaca 840
tctcccaagc ctcactgcgt gaacaccaca tctgacggca agctgaagat cctgcagagc 900
ggcacctacc tgatctacgg ccaggtcatc cccgtggaca agaagtacat caaggataac 960
gcccctttcg tggtgcagat ctacaagaag aacgacgtgc tgcagacact gatgaacgat 1020
tttcagatcc tgccaatcgg cggagtgtac gagctgcacg ctggcgacaa catctacctg 1080
aagttcaact ctaaggatca catccagaag accaacacat actggggcat catcctgatg 1140
ccagatctgc cctttatcag ctga 1164
<210> 27
<211> 1152
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
atgctgctgt tcctgctgtc tgccctggtg ctgctgaccc agccactggg ctacctggag 60
gccgagatga agacctattc ccaccgcaca atgccttctg cctgcacact ggtcatgtgc 120
agcagcgtgg agagcggcct gccaggaagg gacggaagag atggaaggga gggacccaga 180
ggcgagaagg gcgaccctgg cctgccagga gcagcaggac aggcaggaat gccaggccag 240
gccggccccg tgggccctaa gggcgacaat ggatccgtgg gagagccagg accaaagggc 300
gataccggcc cttctggacc acctggacca ccaggcgtgc ctggaccagc aggaagagag 360
ggacctctgg gcaagcaggg aaacatcgga ccacagggca agccaggccc taagggcgag 420
gccggcccca agggcgaagt gggcgcccct ggcatgcagg gatccgccgg agccaggggc 480
ctggccggac ctaagggcga gcgcggcgtg cctggagaga ggggcgtgcc aggaaataca 540
ggcgcagcag gatctgccgg agcaatggga ccacagggca gccccggcgc cagaggccct 600
ccaggcctga agggcgacaa gggaatccct ggcgataagg gagcaaaggg agagagcggc 660
ctgccagacg tggcctccct gaggcagcag gtggaggccc tgcagggaca ggtgcagcac 720
ctgcaggccg ccttcagcca gtacaagaag gtggagctgt ttccaaatgg cgagacagcc 780
aaggagccct gcatggccaa gttcggccca ctgcccagca agtggcagat ggcctctagc 840
gagccccctt gcgtgaacaa ggtgagcgat tggaagctgg agatcctgca gaacggcctg 900
tacctgatct atggccaggt ggcccccaac gccaattaca acgacgtggc cccttttgag 960
gtgcggctgt ataagaacaa ggatatgatc cagaccctga caaataagtc taagatccag 1020
aacgtgggag gcacctacga gctgcacgtg ggcgacacaa tcgacctgat cttcaacagc 1080
gagcaccagg tgctgaagaa caatacatat tggggcatca tcctgctggc caacccccag 1140
tttatctcct ga 1152
<210> 28
<211> 597
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 28
atggagggcg agggagtgca gcccctggat gagaacctgg agaacggctc ccggcctcgc 60
ttcaagtgga agaagaccct gcggctggtg gtgtctggaa tcaagggcgc cggaatgctg 120
ctgtgcttta tctacgtgtg cctgcagctg agctcctctc ccgccaagga tccccctatc 180
cagaggctga gaggagctgt gaccaggtgc gaggacggac agctgttcat cagctcctac 240
aagaacgagt accagacaat ggaggtgcag aacaacagcg tggtcatcaa gtgtgatggc 300
ctgtacatca tctacctgaa gggatccttc tttcaggagg tgaagatcga cctgcacttt 360
cgggaggatc acaacccaat ctctatcccc atgctgaacg acggcaggag aatcgtgttc 420
acagtggtgg ccagcctggc ttttaaggac aaggtgtacc tgaccgtgaa cgccccagat 480
acactgtgcg agcacctgca gatcaacgac ggagagctga tcgtggtgca gctgacccct 540
ggctactgtg ctccagaggg atcttaccac agcacagtga accaggtgcc cctgtga 597
<210> 29
<211> 552
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
atggagaggg tgcagcccct ggaggagaac gtgggaaatg ccgcccggcc tagattcgag 60
aggaacaagc tgctgctggt ggcctctgtg atccagggcc tgggcctgct gctgtgcttc 120
acctacatct gtctgcactt ttctgccctg caggtgagcc acagataccc ccgcatccag 180
agcatcaagg tgcagttcac cgagtataag aaggagaagg gctttatcct gacatcccag 240
aaggaggacg agatcatgaa ggtgcagaac aattctgtga tcatcaactg cgatggcttc 300
tacctgatct ccctgaaggg ctatttttct caggaagtga atatcagcct gcactatcag 360
aaggacgagg agccactgtt tcagctgaag aaggtgcgga gcgtgaattc cctgatggtg 420
gccagcctga cctacaagga caaggtgtat ctgaacgtga ccacagataa tacatccctg 480
gacgatttcc acgtgaacgg cggcgagctg atcctgatcc accagaatcc cggcgagttt 540
tgcgtgctgt ga 552
<210> 30
<211> 1215
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 30
atgctgccct tcctgtccat gctggtgctg ctggtgcagc ctctgggcaa cctgggagcc 60
gagatgaagt ctctgagcca gagatccgtg ccaaacacct gcacactggt catgtgctct 120
cccaccgaga acggcctgcc tggaagggac ggaagagatg gaagggaggg accccgggga 180
gagaagggcg atcctggact gccaggacct atgggactga gcggcctgca gggaccaaca 240
ggccccgtgg gacctaaggg agagaacgga agcgccggag agccaggacc aaagggagag 300
aggggactgt ccggcccacc tggactgcct ggaatccctg gaccagctgg caaggaggga 360
ccttccggca agcagggaaa catcggacca cagggaaagc caggacctaa gggagaggct 420
ggaccaaagg gagaagtggg cgctcccgga atgcagggct ctaccggagc caagggcagc 480
acaggaccta agggagagag gggagctcca ggagtgcagg gagcccccgg caacgctgga 540
gctgctggac cagctggacc agctggccct cagggagccc caggctctag gggaccacca 600
ggcctgaagg gcgacagggg cgtgccagga gataggggca tcaagggaga gagcggcctg 660
ccagattccg ccgctctgag acagcagatg gaggccctga agggcaagct gcagcggctg 720
gaggtggctt tcagccacta ccagaaggcc gctctgtttc ctgacggcag ctcctctcca 780
gccaaggatc ctccaatcca gcggctgcgc ggagctgtga ccaggtgcga ggatggccag 840
ctgttcatca gctcctacaa gaacgagtac cagacaatgg aggtgcagaa caactctgtg 900
gtcatcaagt gtgacggcct gtacatcatc tacctgaagg gcagcttctt tcaggaggtg 960
aagatcgacc tgcactttag agaggatcac aacccaatct ccatccccat gctgaacgac 1020
ggcaggagaa tcgtgttcac cgtggtggcc tctctggctt ttaaggacaa ggtgtacctg 1080
accgtgaacg cccccgatac actgtgcgag cacctgcaga tcaacgacgg cgagctgatc 1140
gtggtgcagc tgacccctgg atactgtgct ccagagggct cctaccactc tacagtgaac 1200
caggtgcctc tgtga 1215
<210> 31
<211> 1170
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
atgctgctgt tcctgctgag cgccctggtg ctgctgaccc agccactggg ctacctggag 60
gccgagatga agacctattc ccacagaaca atgccttctg cctgcacact ggtcatgtgc 120
agcagcgtgg agtccggcct gccaggaagg gacggcagag atggcaggga gggccccagg 180
ggcgagaagg gcgaccccgg cctgcctgga gcagcaggcc aggccggcat gccaggccag 240
gccggcccag tgggccccaa gggcgacaac ggcagcgtgg gcgagcccgg ccctaagggc 300
gataccggcc cctccggccc ccctggccca cccggcgtgc caggaccagc aggaagggag 360
ggaccactgg gcaagcaggg caatatcgga cctcagggca agcctggacc aaagggagag 420
gcaggaccaa agggagaagt gggcgcccct ggcatgcagg gatctgccgg agcccggggc 480
ctggccggcc ccaagggcga gagaggcgtg cccggcgaga ggggcgtgcc tggcaacaca 540
ggcgccgccg gctccgccgg cgccatggga cctcagggct ctccaggagc cagaggccct 600
ccaggcctga agggcgacaa gggaatccct ggcgataagg gagcaaaggg agagagcggc 660
ctgccagacg tggcctccct gcggcagcag gtggaggccc tgcagggcca ggtgcagcac 720
ctgcaggccg ccttcagcca gtacaagaag gtggagctgt ttcctaatgg cgtgtctcac 780
cgctacccac ggatccagag catcaaggtg cagttcaccg agtataagaa ggagaagggc 840
tttatcctga catctcagaa ggaggacgag atcatgaagg tgcagaacaa tagcgtgatc 900
atcaactgcg atggcttcta cctgatcagc ctgaagggct atttttccca ggaagtgaat 960
atctctctgc actatcagaa ggatgaggag cctctgtttc agctgaagaa ggtgagatct 1020
gtgaacagcc tgatggtggc ctccctgacc tacaaggaca aggtgtatct gaacgtgacc 1080
acagataata catctctgga cgatttccac gtgaacggcg gcgagctgat cctgatccac 1140
cagaatcccg gcgagttttg cgtgctgtga 1170
<210> 32
<211> 969
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 32
atgcagctga agtgtccatg cttcgtgtcc ctgggaacaa gacagcccgt ctggaagaaa 60
ctgcacgtga gctccggctt ctttagcggc ctggggctgt ttctgctgct gctgtctagt 120
ctgtgcgccg cttccgcaga gactgaagtc ggagccatgg tgggcagtaa cgtggtcctg 180
tcatgcatcg acccacaccg acggcatttc aacctgtctg gcctgtacgt gtattggcag 240
attgagaatc ccgaagtgtc agtcacctac tatctgcctt acaagagccc agggatcaac 300
gtggactcaa gctataaaaa tagggggcac ctgtccctgg attctatgaa gcagggaaac 360
ttcagcctgt acctgaaaaa tgtgacccct caggacacac aggagttcac ttgtcgcgtc 420
tttatgaaca ctgcaaccga actggtgaag attctggagg aagtggtccg gctgagagtc 480
gcagccaact ttagcactcc tgtgatctct accagtgatt cctctaatcc aggccaggag 540
cggacatata cttgcatgtc taagaacgga taccccgaac ctaatctgta ttggatcaac 600
accacagaca atagtctgat tgataccgct ctgcagaaca atacagtcta cctgaacaag 660
ctggggctgt atgacgtgat ctctactctg cggctgccat ggaccagtag aggagatgtg 720
ctgtgctgcg tggagaacgt ggccctgcac cagaatatca cctcaattag ccaggctgag 780
tcctttaccg gcaacaatac aaagaatcct caggagacac ataacaatga actgaaagtg 840
ctggtgccag tgctggccgt cctggctgca gcagctttcg tgtcttttat catctacaga 900
aggacccgcc ctcaccgctc atacactgga cctaagaccg tgcagctgga actgacagac 960
catgcttga 969
<210> 33
<211> 909
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
atgcgtctgg gttcacctgg tctgctgttt ctgctgtttt caagtctgcg tgctgatact 60
caggagaagg aagtccgggc tatggtcgga agtgacgtgg agctgtcatg cgcttgtccc 120
gaagggtccc ggttcgacct gaacgatgtc tacgtgtatt ggcagacctc tgagagtaag 180
accgtggtca cataccacat ccctcagaac tccagcctgg aaaatgtgga ttcaaggtat 240
cggaacagag ccctgatgtc ccctgctggc atgctgcggg gagacttctc tctgagactg 300
tttaatgtga caccacagga tgagcagaaa ttccattgcc tggtcctgtc acagtccctg 360
ggatttcagg aggtgctgag tgtcgaagtg actctgcacg tcgccgctaa tttctccgtg 420
cctgtggtca gcgcaccaca tagcccctct caggacgagc tgacctttac atgtacttcc 480
atcaacggct acccccgccc taacgtgtac tggattaaca agactgacaa tagcctgctg 540
gatcaggcac tgcagaacga caccgtgttt ctgaatatgc gaggactgta cgatgtggtc 600
agcgtcctgc gtattgccag gaccccatct gtgaacatcg ggtgctgtat tgagaacgtc 660
ctgctgcagc agaatctgac agtggggagc cagactggta atgacatcgg cgagagggat 720
aagattaccg aaaaccccgt gagtacaggc gagaagaacg cagccacatg gtcaatcctg 780
gctgtgctgt gcctgctggt ggtcgtggct gtcgcaattg gctgggtgtg ccgcgatcgg 840
tgtctgcagc actcttatgc cggtgcttgg gcagtgagtc cagagactga actgaccggc 900
catgtctaa 909
<210> 34
<211> 1574
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 34
cttaagatgg aaactgatac tctgctgctc tgggtgctgc tcctctgggt gcctggttca 60
actggggaca ttcgacgggc tgacattgtg atgacccaga ccacactgag cctgcccgtg 120
tccctgggcg accaggccag catctcctgc cggagctccc agtctatcgt gcacagcaac 180
ggaaacacat acctggagtg gtatctgcag aagcctggcc agtccccaaa gctgctgatc 240
tacaaggtgt ccaacaggtt cagcggcgtg cctgaccgct tttctggaag cggctccgga 300
acagatttca ccctgaagat cagcagggtg gaggctgagg acctgggcgt gtactactgc 360
ttccagggat cccacgtgcc ttacaccttt ggcggaggca caaagctgga gatcaagaga 420
gccgatgctg ctccaaccgt gtctggaagc ggaggcgggg gttctggagg cggtgggagc 480
ggtggcggag ggtctgaggc taagctgcag gagagcggcc ccgtgctggt gaagcctgga 540
gccagcgtga agatgtcctg taaggcttct ggatacacct tcacagacta ctacatgaac 600
tgggtgaagc agagccacgg caagtccctg gagtggatcg gagtgatcaa cccttacaac 660
ggcgacacct cttacaacca gaagtttaag ggcaaggcca ccctgacagt ggataagtct 720
agctccaccg cttacatgga gctgaacagc ctgacatccg aggattctgc cgtgtactac 780
tgtgctaggt actacggaag ctggttcgcc tactggggcc agggaacact gatcaccgtg 840
tccacagcca agaccacacc ccctagcgtg taccccctgg ctcctaggtc tagcagaggc 900
tgcaagccat gcatctgtac cgtgcccgag gtgagcagcg tgttcatctt tccacccaag 960
cccaaggacg tgctgaccat cacactgacc cctaaggtga catgcgtggt ggtggatatc 1020
agcaaggacg atccagaggt gcagttctcc tggtttgtgg acgatgtgga ggtgcacacc 1080
gcccagacac agccaaggga ggagcagttc aactccacct ttagatccgt gtctgagctg 1140
cccatcatgc accaggactg gctgaacgga aaggagttca agtgccgggt gaactccgcc 1200
gcttttcctg ctccaatcga gaagaccatc tctaagacaa agggccgccc aaaggctcca 1260
caggtgtaca ccatccctcc acccaaggag cagatggcta aggataaggt gagcctgacc 1320
tgtatgatca cagacttctt tcccgaggat atcacagtgg agtggcagtg gaacggacag 1380
cctgccgaga actacaagaa cacccagcca atcatggaca cagatggctc ttacttcgtg 1440
tacagcaagc tgaacgtgca gaagtctaac tgggaggctg gcaacacctt cacctgcagc 1500
gtgctgcacg aaggtctcca taatcaccac accgaaaaga gcctcagtca cagccctggg 1560
aaatgaggcg cgcc 1574
<210> 35
<211> 1484
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
cttaagatgg aaactgacac cctgctgctg tgggtcctgc tgctgtgggt gcctggatcc 60
accggcgata tcgtgctgac ccagtctcct ggcacactga gtctgtcacc aggggagcga 120
gcaacactgt cttgtagagc cagccagtct gtgggaagct cctacctggc ttggtatcag 180
cagaagccag gccaggcacc caggctgctg atctacggag ccttcagccg ggccactggc 240
attccagaca ggttctctgg aagtggctca gggaccgact tcaccctgac catcagccga 300
ctggagcccg aagacttcgc cgtgtactat tgccagcagt acggctctag tccttggact 360
tttggacagg gcaccaaagt ggagatcaag cgcggcgggg gaggctctgg gggaggcggg 420
agtggaggcg ggggatcaca ggtccagctg gtggaaagcg gcgggggagt ggtccagcca 480
ggccggagcc tgcggctgag ctgcgccgct tcaggattca cattttcaag ctataccatg 540
cactgggtcc ggcaggcacc agggaaggga ctggagtggg tgaccttcat cagctatgac 600
ggcaacaaca agtattacgc tgattccgtg aaagggaggt ttaccattag ccgcgacaac 660
tccaaaaata cactgtacct gcagatgaac agcctgcggg ccgaggatac tgctatctac 720
tattgcgcaa gaaccgggtg gctgggaccc ttcgactatt ggggccaggg gactctggtc 780
accgtgtcct ctgataagac acacacatgc cctccctgtc ctgcaccaga gctgctgggc 840
gggccatccg tgttcctgtt tccacccaag cctaaagaca ccctgatgat cagccggaca 900
cctgaagtca cttgcgtggt cgtggacgtg agtcacgagg atccagaagt caagtttaac 960
tggtacgtgg atggcgtcga ggtgcataat gccaagacca aacctcgcga ggaacagtac 1020
aatagcacat atcgagtcgt gtccgtcctg actgtgctgc atcaggattg gctgaacggc 1080
aaagagtata agtgcaaagt gagcaataag gcactgcctg ccccaatcga gaaaacaatt 1140
tccaaggcta aaggccagcc cagggaacct caggtgtaca ctctgcctcc aagtcgcgag 1200
gaaatgacca agaaccaggt gagcctgacc tgtctggtga aagggttcta tccatcagac 1260
attgcagtgg agtgggaaag caatggacag cccgaaaaca attacaagac cacaccccct 1320
gtgctggaca gcgatggctc cttctttctg tattctaagc tgactgtgga taaaagtcgc 1380
tggcagcagg ggaacgtctt tagctgttcc gtgatgcatg aggctctgca caatcattac 1440
acacagaagt ctctgagtct gtcacccggc aaatgaggcg cgcc 1484
<210> 36
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV启动子
<400> 36
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa tt 632
<210> 37
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RSV启动子
<400> 37
tgtacgggcc agatatacgc gtatctgagg ggactagggt gtgtttaggc gaaaagcggg 60
gcttcggttg tacgcggtta ggagtcccct caggatatag tagtttcgct tttgcatagg 120
gagggggaaa tgtagtctta tgcaatacac ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt 180
tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg 240
tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacaggtc tgacatggat tggacgaacc 300
actgaattcc gcattgcaga gataattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgc 360
catttgacca ttcaccacat tggtgtgcac ctcc 394
<210> 38
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH polyA
<400> 38
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagac 188
<210> 39
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV40晚期polyA
<400> 39
gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 60
tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 120
ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 180
ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 240
aatgtggta 249
<210> 40
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV40增强启动子
<400> 40
gctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 60
tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 120
agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 180
aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 240
actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 300
gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagct 345
<210> 41
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔beta-球蛋白polyA
<400> 41
gacctctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg 60
tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattt 99
<210> 42
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP
<400> 42
accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 60
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 120
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 180
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 240
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 300
ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 360
ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 420
cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 480
aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 540
gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 600
cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 660
gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 720
taa 723
<210> 43
<211> 454
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MoMuLV LTR
<400> 43
ttaattaagt aacgccattt tgcaaggcat ggaaaaatac ataactgaga atagagaagt 60
tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg 120
taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa 180
acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc 240
agatgcggtc cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca 300
aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct 360
gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggggcg 420
ccagtcctcc gattgactga gtcgcccgct taag 454
<210> 44
<211> 1349
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF1alpha启动子
<400> 44
ttaattaaga gtaattcata caaaaggact cgcccctgcc ttggggaatc ccagggaccg 60
tcgttaaact cccactaacg tagaacccag agatcgctgc gttcccgccc cctcacccgc 120
ccgctctcgt catcactgag gtggagaaga gcatgcgtga ggctccggtg cccgtcagtg 180
ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac 240
cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg 300
cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct 360
ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc 420
tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccacgc ccctggctgc 480
agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt 540
gcggttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc ctggcttggg cgctggggcc 600
gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag 660
ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa 720
atgcgggcca agatctgcac actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg 780
cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa 840
tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt 900
gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa 960
gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag 1020
agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt 1080
catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt 1140
ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg 1200
agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg 1260
ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt 1320
ttcttccatt tcaggtgtcg tgacttaag 1349
<210> 45
<211> 481
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HGH polyA
<400> 45
gacgggtggc atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact 60
ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg 120
tccttctata atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag 180
acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct 240
tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag 300
ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga 360
cggggtttca ccatattggc caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca 420
ccttggcctc ccaaattgct gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt 480
t 481

Claims (25)

1.一种溶瘤病毒，其是经修饰的临床分离株，其中所述临床分离株是单纯疱疹病毒HSV1毒株RH018A，其具有保藏号ECACC16121904，
其中所述溶瘤病毒：(a)包含在一种或多种病毒基因中的一种或多种突变，所述突变抑制在正常组织中的复制但仍允许在肿瘤中复制，其中所述一种或多种突变阻止HSV表达功能性ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶；和/或(b)在肿瘤中表达促融合蛋白和/或免疫刺激蛋白。
2.根据权利要求1所述的病毒，其中所述病毒：
(a)不表达功能性ICP34.5；
(b)不表达功能性ICP47；和/或
(c)将US11基因表达为立即早期基因。
3.根据权利要求1所述的病毒，其包含：
(a)一种或多种免疫刺激分子或一种或多种免疫刺激分子编码基因；和/或
(b)一种或多种促融合蛋白编码基因。
4.根据权利要求3所述的病毒，其中：
(a)所述促融合蛋白选自：水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白，合胞蛋白-1，合胞蛋白-2，猿猴病毒5(SV5)F蛋白，麻疹病毒(MV)H蛋白，MV F蛋白，呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白和来自长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠白血病病毒(MLV)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的糖蛋白，其中已缺失R肽；和/或
(b)所述免疫刺激分子是：GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，IL-21，IL-24，I型干扰素，干扰素γ，III型干扰素，TNFα，TGFβ的拮抗剂，免疫检查点拮抗剂或免疫增强途径激动剂。
5.根据权利要求3所述的病毒，其中：
所述免疫刺激分子是CD40配体(CD40L)、ICOS配体、GITR配体、4-1-BB配体、OX40配体或flt3配体。
6.根据权利要求3所述的病毒，其中：
(a)所述促融合蛋白是来自长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白并且具有突变或去除的R跨膜肽(GALV-R-)；和/或
(b)所述免疫刺激分子是GM-CSF、GITRL、ICOSL、4-1-BBL、OX40L或CD40L，或所述免疫刺激分子是GM-CSF和GITRL、OX40L、4-1-BBL、ICOSL或CD40L。
7.根据权利要求3所述的病毒，其中所述促融合蛋白编码基因和/或所述免疫刺激分子编码基因被插入到ICP34.5编码基因座中，通过插入或部分或完全缺失进行，其各自处于单独的调节控制下，任选地相对于彼此处于背对背的方向。
8.根据权利要求3所述的病毒，其中编码促融合蛋白的基因的序列和/或编码免疫刺激分子的基因的序列经密码子优化以增加在靶细胞中的表达水平。
9.根据权利要求1所述的病毒，其表达三种异源基因，其中所述三种异源基因中的每一种由选自CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子和逆转录病毒LTR启动子的不同启动子驱动。
10.根据权利要求9所述的病毒，其表达分别由CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子和逆转录病毒LTR启动子中的每一种驱动的四种异源基因。
11.根据权利要求9所述的病毒，其中所述逆转录病毒LTR来自MMLV。
12.根据权利要求1所述的病毒，其表达三种异源基因，其中三种异源基因中的每一种被选自BGH、SV40、HGH和RBG多聚腺苷酸化序列的不同多聚腺苷酸化序列终止。
13.根据权利要求12所述的病毒，其表达分别由BGH、SV40、HGH和RBG多聚腺苷酸化序列中的每一种终止的四种异源基因。
14.一种溶瘤病毒，其是HSV1毒株RH018A，其具有保藏号ECACC 16121904。
15.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项的病毒和药学上可接受的运载体或稀释剂。
16.权利要求1-14中任一项所述的病毒在制备用于通过疗法治疗人体或动物体的方法的药物中的用途。
17.权利要求1-14中任一项所述的病毒在制备用于治疗癌症的方法的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述方法包括施用另外的抗癌剂。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述另外的抗癌剂选自：免疫共抑制途径的拮抗剂，免疫共刺激途径的激动剂，放射和/或化学疗法，靶向在肿瘤中存在的特定基因突变的药剂，旨在诱导针对一种或多种肿瘤抗原或新生抗原的免疫应答的药剂，源自T细胞或NK细胞的细胞产物，旨在刺激STING、cGAS、TLR或其他先天性免疫应答和/或炎性途径的药剂，任选地为溶瘤病毒的第二种病毒，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径的抑制剂，及其组合。
20.根据权利要求19所述的用途，其中免疫共抑制途径的拮抗剂是CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、LAG-3抑制剂、TIM-3抑制剂、VISTA抑制剂、CSF1R抑制剂、IDO抑制剂、CD47抑制剂、KIR抑制剂、SLAMF7抑制剂或CEACAM1抑制剂，和/或免疫共刺激途径的激动剂是GITR激动剂、4-1-BB激动剂、OX40激动剂、CD40激动剂或ICOS激动剂。
21.根据权利要求18所述的用途，其中所述另外的抗癌剂是抗体。
22.根据权利要求18所述的用途，其中所述方法包括施用吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径的抑制剂和免疫共抑制途径的另外的拮抗剂，或免疫共刺激途径的激动剂。
23.根据权利要求18所述的用途，其中所述病毒和一种或多种另外的抗癌剂分开施用。
24.根据权利要求18所述的用途，其中所述病毒和一种或多种所述另外的抗癌剂同时施用。
25.根据权利要求17所述的用途，其中所述癌症是实体瘤。
CN201780012759.3A 2016-01-08 2017-01-09 溶瘤病毒株 Active CN109153977B (zh)

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US (11) US10612005B2 (zh)
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WO (4) WO2017118865A1 (zh)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60107203T3 (de) * 2000-01-21 2009-07-23 Biovex Ltd. Herpes-virusstämme für die gentherapie
AP2911A (en) 2005-12-02 2014-05-31 Sinai School Medicine Chimeric Viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
WO2008153832A2 (en) 2007-05-31 2008-12-18 Krishnan Ramu Switched reluctance machines with minimum stator core
MX2015011886A (es) 2013-03-14 2016-05-31 Icahn School Med Mount Sinai Virus de la enfermedad de newcastle y usos de los mismos.
KR20180036974A (ko) 2015-07-16 2018-04-10 바이오엑셀 테라퓨틱스 인코포레이티드 면역조절을 이용하는 암의 치료를 위한 신규한 접근법
ES2831080T5 (es) 2016-01-08 2023-10-30 Replimune Ltd Virus oncolítico modificado
EP4089166A1 (en) 2016-01-27 2022-11-16 Oncorus, Inc. Oncolytic viral vectors and uses thereof
EP3380621A4 (en) * 2016-04-22 2019-05-08 Immvira Co., Limited CONSTRUCTION OF THE VECTOR OF OBLIGATES ONCOLYTIC HERPES SIMPLEX VIRUSES (OHSV) AND CANCER THERAPY CONSTRUCTIONS
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
US10888594B2 (en) 2016-05-30 2021-01-12 National University Corporation Tottori University Genetically engineered vaccinia viruses
US20190336552A1 (en) 2016-05-30 2019-11-07 Astellas Pharma Inc. Genetically engineered vaccinia viruses
SG11201811600PA (en) 2016-06-30 2019-01-30 Oncorus Inc Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
CN108261426B (zh) * 2017-01-04 2019-04-05 杭州康万达医药科技有限公司 药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用
GB201700350D0 (en) * 2017-01-09 2017-02-22 Replimune Ltd Altered virus
RU2771110C2 (ru) 2017-07-26 2022-04-26 Онкорус, Инк. Онколитические вирусные векторы и их применение
CN118126157A (zh) 2017-08-03 2024-06-04 美国安进公司 白介素-21突变蛋白和治疗方法
EP4141005B1 (en) 2017-09-08 2024-04-03 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
CN109554353B (zh) * 2017-09-26 2021-08-06 杭州康万达医药科技有限公司 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
EP3710035A4 (en) * 2017-11-13 2021-12-29 Bioxcel Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating cancer by modifying multiple arms of the immune system
WO2019133847A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Oncorus, Inc. Oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
TW201930344A (zh) 2018-01-12 2019-08-01 美商安進公司 抗ｐｄ-１抗體及治療方法
WO2019147982A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer with dendritic cell mobilizing agents
GB201804473D0 (en) * 2018-03-21 2018-05-02 Valo Therapeutics Oy Modified oncolytic adenoviruses
CN108635380A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 北京唯源立康生物科技有限公司 重组溶瘤病毒组合物及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用
CN112601547A (zh) * 2018-06-21 2021-04-02 雷普利穆内有限公司 使用溶瘤病毒的治疗
CA3103374A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for antibody delivery
CN109161561A (zh) * 2018-08-09 2019-01-08 湖北科技学院 一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
WO2020052551A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Genesail Biotech (Shanghai) Co. Ltd. A modified oncolytic virus, composition and use thereof
JP7484717B2 (ja) * 2018-09-26 2024-05-16 アステラス製薬株式会社 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との併用によるがん療法並びにこれに用いるための医薬組成物及び組合せ医薬
JP2022516077A (ja) 2018-12-27 2022-02-24 アムジェン インコーポレイテッド 凍結乾燥ウイルス製剤
CN111606999B (zh) * 2019-02-26 2022-09-06 南京惟亚德生物医药有限公司 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用
EP3935182A1 (en) 2019-03-05 2022-01-12 Amgen Inc. Use of oncolytic viruses for the treatment of cancer
TW202102543A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商安進公司 溶瘤病毒在癌症新輔助療法中之用途
CN110054678B (zh) * 2019-05-16 2023-04-18 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种膜结合型mFLT3LG蛋白及其应用
CN110218707B (zh) * 2019-05-29 2021-10-22 上海市公共卫生临床中心 一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用
WO2021024897A1 (ja) * 2019-08-05 2021-02-11 国立大学法人東海国立大学機構 悪性腫瘍を治療するための併用薬、悪性腫瘍を治療するための医薬組成物、および、悪性腫瘍治療用医薬組成物
BR112022008726A2 (pt) * 2019-11-06 2022-07-19 Memgen Inc Vetor adenovírus recombinante com replicação viral melhorada, tipo celular específico e método de tratamento de uma malignidade
WO2021175293A1 (zh) * 2020-03-05 2021-09-10 北京唯源立康生物科技有限公司 一种单纯疱疹病毒及其用途
CN110982795B (zh) * 2020-03-05 2020-06-16 北京唯源立康生物科技有限公司 一种单纯疱疹病毒及其用途
CN110982794B (zh) * 2020-03-05 2020-06-16 北京唯源立康生物科技有限公司 一种修饰的单纯疱疹病毒
JPWO2021193081A1 (zh) * 2020-03-23 2021-09-30
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
US11839659B2 (en) 2020-07-02 2023-12-12 Northwestern University Proteolysis-targeting chimeric molecules (PROTACs) that induce degradation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) protein
CN112941039A (zh) * 2021-02-01 2021-06-11 南京大学 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用
DE102022104146A1 (de) 2021-03-19 2022-09-22 Yamada Manufacturing Co., Ltd. Lenkvorrichtung
WO2022245808A1 (en) * 2021-05-18 2022-11-24 The Penn State Research Foundation Oncolytic virus based cancer therapy
CN113583979B (zh) * 2021-08-03 2022-11-22 杭州荣谷生物科技有限公司 一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途
WO2024055022A2 (en) * 2022-09-08 2024-03-14 Virogin Biotech Canada Ltd Oncolytic virus expressing an immune cell engager for tumor targeting

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109312309A (zh) * 2016-01-08 2019-02-05 雷普利穆内有限公司 工程化的病毒

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU594014B2 (en) 1984-03-21 1990-03-01 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant DNA molecules
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
CA1282721C (en) 1984-06-04 1991-04-09 Bernard Roizman Herpes simplex virus as a vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5698531A (en) 1989-03-31 1997-12-16 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US6770274B1 (en) 1990-09-14 2004-08-03 The General Hospital Corporation Viral mutant HSV mediated destruction of neoplastic cells
US6040169A (en) 1991-01-31 2000-03-21 Medical Research Council Herpes simplex virus-1 deletion variants and vaccines thereof
JP3974167B2 (ja) 1992-03-31 2007-09-12 アーチ デベロプメント コーポレイション 遺伝子，腫瘍及びウイルス感染の治療，並びにプログラムされた細胞死（アポプトーシス）を予防するための方法及び組成物
US6699468B1 (en) 1994-06-23 2004-03-02 Georgetown University Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells
CA2234060A1 (en) 1995-10-06 1997-04-10 Arch Development Corporation Methods and compositions for viral enhancement of cell killing
US5824318A (en) 1996-07-24 1998-10-20 American Cyanamid Company Avirulent herpetic viruses useful as tumoricidal agents and vaccines
GB9700411D0 (en) 1997-01-10 1997-02-26 Univ London Eukaryotic gene expression cassette and uses thereof
US6379674B1 (en) 1997-08-12 2002-04-30 Georgetown University Use of herpes vectors for tumor therapy
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
CA2720361A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Oncolytics Biotech, Inc. Viruses for the treatment of cellular proliferative disorders
DE60107203T3 (de) 2000-01-21 2009-07-23 Biovex Ltd. Herpes-virusstämme für die gentherapie
WO2002076216A1 (en) 2001-03-27 2002-10-03 Medigene, Inc. Viral vectors and their use in therapeutic methods
GB0317511D0 (en) * 2003-07-25 2003-08-27 Biovex Ltd Viral vectors
US7731952B2 (en) 2004-06-24 2010-06-08 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
AU2005300315A1 (en) 2004-11-04 2006-05-11 Pfizer Products Inc. CTLA-4 antibody and aromatase inhibitor or combination treatment for breast cancer
US9866961B2 (en) 2004-12-01 2018-01-09 Todd Beauchamp Multi-channel loudspeaker enclosure with laterally projecting wings and method for orienting and driving multiple loudspeakers
WO2006096490A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc ANTI-MAdCAM ANTIBODY COMPOSITIONS
ES2605380T3 (es) 2005-05-06 2017-03-14 Providence Health & Services - Oregon Proteina de fusión OX40-inmunoglobulina trimérica y métodos de uso
US8986672B2 (en) 2005-06-23 2015-03-24 The University Of Houston Use of mutant Herpes Simplex Virus-2 for cancer therapy
GB0522476D0 (en) 2005-11-03 2005-12-14 Biovex Ltd Oncolytic herpes virus vectors
US9868961B2 (en) 2006-03-30 2018-01-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for localized secretion of anti-CTLA-4 antibodies
US8313896B2 (en) * 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
US8703120B2 (en) 2008-05-29 2014-04-22 The General Hospital Corporation Use of oncolytic herpes viruses for killing cancer stem cells
MX340972B (es) 2008-10-08 2016-08-02 Intrexon Corp Celulas manipuladas por ingenieria que expresan multiples inmunomoduladores, y uso de las mismas.
US20100297072A1 (en) 2009-05-19 2010-11-25 Depinho Ronald A Combinations of Immunostimulatory Agents, Oncolytic Virus, and Additional Anticancer Therapy
WO2011063309A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating hedgehog-associated cancers
US20130202639A1 (en) * 2010-03-25 2013-08-08 Konstantin G. Kousoulas Synthetic Herpes Simplex Viruses for Treatment of Cancers
WO2011118866A1 (ko) 2010-03-26 2011-09-29 연세대학교 산학협력단 네트워크를 통한 심사요청 방법
JP2014500004A (ja) * 2010-09-24 2014-01-09 オンコス セラピュティックス オサケ ユキチュア 抗ｃｔｌａ−４モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクター
ES2704632T3 (es) * 2011-09-08 2019-03-19 Univ New York Virus de herpes simplex oncolítico y sus usos terapéuticos
FI20115914L (fi) 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
CN104427992B (zh) * 2012-01-25 2017-12-19 德那翠丝有限公司 生物标志物及使用溶瘤病毒和免疫调节剂的组合疗法
US20150190505A1 (en) 2012-07-30 2015-07-09 Alex Wah Hin Yeung Live and in-vivo tumor specific cancer vaccine system developed by co-administration of either at least two or all three of the following components such as tumor cells, an oncolytic virus vector with transgenic expression of gm-csf and an immune checkpoint modulator
CN104704002B (zh) 2012-08-30 2022-05-10 安姆根有限公司 使用单纯疱疹病毒和免疫检查点抑制剂治疗黑色素瘤的方法
US9789182B2 (en) 2012-10-23 2017-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-KIR and anti-CTLA-4 antibodies to treat cancer
BR112015018418A2 (pt) 2013-02-22 2017-07-18 Hoffmann La Roche métodos para tratar câncer, para aumentar a eficácia de um tratamento, para adiar e/ou prevenir o desenvolvimento de câncer, para aumentar a sensibilidade a um terapêutico direcionado, para estender o período de sensibilidade, para estender a duração de resposta a um terapêutico direcionado e produto farmacêutico
MX2015011886A (es) 2013-03-14 2016-05-31 Icahn School Med Mount Sinai Virus de la enfermedad de newcastle y usos de los mismos.
LT3508209T (lt) 2013-09-03 2022-06-10 Medimmune Limited Kompozicijos, kurių būdingasis požymis yra susilpnintas niukaslio ligos virusas, ir naudojimo būdai, skirti neoplazijos gydymui
RS57043B1 (sr) 2013-10-25 2018-05-31 Psioxus Therapeutics Ltd Onkolitički adenovirusi snabdeveni heterologus genima
ES2781852T3 (es) 2013-10-28 2020-09-08 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Vector de HSV oncolítico
CN106029889A (zh) 2013-11-22 2016-10-12 德那翠丝有限公司 表达免疫细胞刺激受体激动剂的腺病毒
US10933106B2 (en) 2014-02-25 2021-03-02 Deutsches Krebsforschungszentrum RNA viruses for immunovirotherapy
MA39818A (fr) * 2014-03-30 2017-02-08 Benevir Biopharm Inc Virus oncolytiques « armés » comprenant un inhibiteur de tap exogène et leurs utilisations thérapeutiques
KR102504758B1 (ko) 2014-07-16 2023-02-28 트랜스진 종양 세포 붕괴성 바이러스와 면역 체크포인트 조절제의 배합물
CA3190510A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Transgene Sa Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators
US20160040186A1 (en) 2014-08-07 2016-02-11 Xiaoyun Liu Dna construct and method for transgene expression
GB201419579D0 (en) 2014-11-03 2014-12-17 Iomet Pharma Ltd Pharmaceutical compound
WO2016118865A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Dreamwell, Ltd. Automated mattress manufacturing process and apparatus
EP3380621A4 (en) 2016-04-22 2019-05-08 Immvira Co., Limited CONSTRUCTION OF THE VECTOR OF OBLIGATES ONCOLYTIC HERPES SIMPLEX VIRUSES (OHSV) AND CANCER THERAPY CONSTRUCTIONS
GB201700350D0 (en) 2017-01-09 2017-02-22 Replimune Ltd Altered virus
CN112601547A (zh) 2018-06-21 2021-04-02 雷普利穆内有限公司 使用溶瘤病毒的治疗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109312309A (zh) * 2016-01-08 2019-02-05 雷普利穆内有限公司 工程化的病毒
CN109415703A (zh) * 2016-01-08 2019-03-01 雷普利穆内有限公司 经修饰的病毒

Also Published As

Publication number Publication date
EP3400290B1 (en) 2023-04-05
EP4219696A3 (en) 2023-09-27
DK3400290T3 (da) 2023-05-01
SG11201805835WA (en) 2018-08-30
JP2022002531A (ja) 2022-01-11
ES2841300T3 (es) 2021-07-08
ES2943150T3 (es) 2023-06-09
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DK3400291T4 (da) 2024-04-02
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HK1257224A1 (zh) 2019-10-18
SG10202108724YA (en) 2021-09-29
CA3011009A1 (en) 2017-07-13
CN109312309A (zh) 2019-02-05
US10570377B2 (en) 2020-02-25
JP2022078225A (ja) 2022-05-24
EP3400291A1 (en) 2018-11-14
CN109415703A (zh) 2019-03-01
IL282985A (en) 2021-06-30
US12024724B2 (en) 2024-07-02
CN109312309B (zh) 2024-04-02
WO2017118864A1 (en) 2017-07-13
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