KR910002692B1 - 수정 호르몬의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

수정 호르몬의 제조방법
본 발명의 주 관건에 대한 범위는 본 출원인에 의해 1983년 11월 2일에 출원된 ""
본 발명은 이종 중합체의 단백질을 생산하는 재조합 DNA 기술의 활용에 관한 것이다.
여러가지 폴리펩티드 쇄가 박테리아, 효소 및 배양된 포유 동물 세포와 같은 숙주 세포내에서, 재조합 DNA 기술에 의해 형질발현 되었다. 파이데스, J.C.와 굳만 H.M.(1979)의
Figure kpo00004
제 281권 351-356페이지와 파이데스, J.C.와 굳만, H.M.(1980)의
Figure kpo00005
제286권 684-687페이지는 인체 융모성선 자극 호르몬(hCG)의 알파 및 베타 서브 유니트(subunit)를 각각 클로닝하는 것에 대하여 설명하고 있다.
카남의 미국 특허 제4,383,036호는 인체 임파아구 세포를 실험 동물에 주입하고, 그 동물로부터 회수하여, 실험관내에서 배양한 후, 축적된 hCG를 그 배양체로부터 수거하는 것을 특징으로 하는 hCG의 생산 방법을 설명한다.
발명의 개요
일반적으로 본 발명은 생물학적으로 활성인 이종 이량체(dimer) 인체 수정 호르몬, 바람직하게는 난포 자극 호르몬("FSH")를 제조하는 방법을 특징으로 하는데, 상기 호르몬은 알파와 베타의 서브 유니트를 포함하며, 각 서브 유니트는 그것을 코오딩하는 이종 DNA가 포함된 형질발현 벡터를 지닌 세포에 의해 합성된다.
"형질발현 벡터"는 숙주 세포내에서 형질발현이 허용되는 이종(벡터에 대하여)의 DNA를 서열 조절하에 포함한 클로닝 벡터로 의미한다. 그 벡터는 복제 비루스, 플라스미드 및 파아지 등이다. 바람직한 벡터는 송아지 유두종 비루스 게놈의 적어도 69%의 형질전환 부위, 가장 바람직하게는 100%의 형질전환 부위를 갖는 것들이다.
본 발명은 형질전환된 세포의 단일 배양체에서 생물학적으로 활성인 이종 이량체 FSH가 생산되도록 한다. FSH의 두개 서브 유니트가 동일 세포에서 생산됨으로써 각 배양체로부터 서브 유니트를 재결합 하여 활성 이종 이량체 분자를 조합하는 것이 필요치 않게 된다. 그 시스템은 또한 활성이나 안정성을 위하여 배양중 번역 후(post-translation) 변이(예. 글리코실화와 단백질 분해)과정 등을 거친 단일 배양체내에서 FSH가 생산되는 것을 가능케 한다.
바람직한 실례에 있어서, 각 형질발현 벡터는 자기 복제가 되는데, 즉 숙주 세포의 염색체에 통합되지 않는다. 자가 복제 형질발현 벡터를 사용함으로써, 숙주 염색체중의 조절 서열에 의한 필요한 코오딩 부위에서 바람직하지 못한 영향을 막을 수 있다.
본 발명의 다른 장점과 특징들은 하기의 바람직한 실례의 설명과 청구 범위에서 이해될 수 있을 것이다.
바람직한 실례의 설명
본 발명의 바람직한 실례를 하기에 기재하며 먼저, 도면을 간단히 설명한다.
구조
본 발명의 클로닝 백터는 상기 본 발명의 개요에서 언급된 일반적인 구조를 가진다. 바람직한 벡터는 도면에 나타낸 구조를 가지며 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
클로닝 벡터의 조립
공통적인 알파 서브 유니트를 코오딩하는 cDNA 클론의 분리
본 발명의 이종 이량체의 인체 수정 호르몬을 생산하기 위하여, 인체 융모 성선 자극 호르몬(hCG)의 알파 서브 유니트를 우선 분리한다 ; 이 알파 서브 유니트는 3가지 수정 호르몬, CG, LH 및 FSH에 공통이다.
본 발명에 사용되는 모든 기술들은 Maniatis 등의(1982) Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory)에서 상세히 설명되고 있다.
RNA를 하기 방법에 의해 태반 조직으로부터 추출한다. 조직의 균질화(Homogenization)는 페놀 : 1mM의 EDTA가 함유된 100mM Na-아세테이트(pH 5.5)의 1 : 1 혼합물중에서 실시하고 20분간 60℃로 가온한다. 10분간 얼음위에서 냉각한 후, 원심분리에 의해 층을 분리한다. 고온의 페놀로 2회 이상 추출시킨 후 클로로포름으로 2회 추출한다.
2.5부피의 에탄올을 가하여 RNA를 최종 수층으로부터 침전시킨다.
폴리 A+mRNA가 풍부해지도록 하기 위해, 태반의 RNA를 10mM 트리스-염산(pH 7.5)으로 완충된 0.5M NaCl중의 올리고(dT)-셀룰로오즈를 통과시킨 후 같은 용액으로 세척한다. 폴리 A+mRNA를 10mM의 트리스-염산(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.05% SDS로 용출시키고 에탄올로 2회 침전시킨다. 최초 수득물은 조직 1g당 총 RNA 1.5-2.0㎎이며 이중 약 2%가 폴리 A+mRNA이다.
태반의 cDNA 라이브러리(library)는 태반 mRNA를 역전사시키고 E.coli DNA 폴리머라제 Ⅰ(큰 단편)를 사용하여 이본쇄를 합성하고, S1 뉴클레아제로 처리하고, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제로 동종 중합체 테일링(dC)하여 조립하는데, 상기 모든 과정은 통용되는 기술에 의한다.
일반적인 제조시에 있어서, 20-30%의 mRNA가 일본쇄(ss) cDNA로 전환되며 ; 70%는 이본쇄 합성후 뉴클레아제 S1 분해에 대해 내성이며 ; 10 내지 25염기 길이의 dC "테일"이 얻어진다. 이 cDNA 분자를 플라스미드 pBR322의 DNA 단편에 어닐링하는데, 이것은 PstI으로 절단한 후 dG "테일"에 첨가한다. 이 재조합 플라스미드를 사용하여 E.coli 세포가 cDNA 라이브러리를 생산하도록 형질 전환시킨다(전환 세포는 테트라사이클린 내성에 근거하여 분별한다).
인체 알파 hCG 클론을 동정하기 위하여, 마우스의 알파 갑상선 자극 호르몬(TSH) 클론의 219염기쌍 단편을 하이브리드화 프로오브로서 사용한다. 프로오브는 인체 클론과의 77% 서열 동질성을 갖는다. 이것은 니크번역에 의해 방사성 표지되며, 동질성의 정도를 고려하는 조건하에 cDNA 라이브러리에 하이브리드 된다. 강하게 하이브리드되는 클론을 제한 지도화에 의해 분석하며 알파 hCG의 완전한 코오딩 서열이 포함된 클론을 DNA 서열화에 의해 확인한다.
플라스미드 pRF375의 조립
제1도에 대해 언급하자면, 쥐의 메탈로티오닌 프로모터, SV40DNA와 pBR322 서열이 포함된 플라스미드 CL28(플라스미드 JY.MMT(E)와 동일함) ; Hamer 등의(1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288)을 제한 엔도뉴클레아제 BglⅡ로 절단한다. 이 부위에, 이것의 5'와 3'말단의 각각 약 10과 220염기쌍의 비번역 부분을 함유한 알파 hCG의 cDNA 클론이 삽입된다. 이 클론은 이것의 말단에서 합성
Figure kpo00006
HI 링커를 가함으로써 유전 공학적으로 설계된다.
그 결과의 플라스미드 pRF302를 제한 효소
Figure kpo00007
HI와
Figure kpo00008
I으로 절단하여 SV40DNA 서열을 분리해낸다.
전체의 BPV 게놈과 일부의 pBR322 서열을 함유하는 플라스미드 pB2-2를
Figure kpo00009
HI와 Sal I으로 절단하여
Figure kpo00010
HI/
Figure kpo00011
I 말단의 BPV 게놈을 수득하며 이 단편을 메탈로티오네인-hCG 서열이 포함된 pRF302에 결합시킨다.
E.coli의 형질 전환 후, 플라스미드 CRF375를 동정하고 분리시킨다. 이것은 주의 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 공통의 알파 서브 유니트를 코오딩한다.
인체 베타 FSH 유전자의 분리
파아지 람다에서 인체의 게놈 라이브러리(Lawn 등의 1978, Cell 15, p. 1157-1174)를 "추측된" 긴 프로오브를 사용하여 선별한다. 제이 등의(1983) Nucleic Acids Research 11(8), 2325에서 설명된 상기 프로오브에 대한 아이디어는 만일 목적 단백질의 아미노산 서열이 적어도 부분적으로 알려진 것일때, 하나 이상, 내게 이하의 서로 다른 트리플레트(triplet)에 의해 코오딩될 수 있는 모든 아미노산을 코오딩하는 트리플레트에 대해 추정하여 긴 프로오브가 구성될 수 있다는 것이다. 정확한 추정은 동질물의 양을 증가시키며 그 결과의 특이성을 향상시킬 수 있다.
DNA의 목적 부분을 분리하기 위하여, 두개의 표지된 45-mer 프로오브를 사용한다 ; 인체 베타 FSH의 아미노산 56-70과 상동한 TB36 ; 아미노산 73-87과 상동한 TB21. 이 프로오브는 하기의 뉴클레오티드 조성물을 가진다(해당 아미노산이 제공된다) :
Figure kpo00012
상기 프로오브를 하기와 같이 인체 게놈 라이브러리를 선별하기 위해 사용한다. TB21을32P로 표지하고 벤톤과 데이바스(1977) Science
Figure kpo00013
, 180-182의 원위치 플라크 하이브리드화 기술에 의해 듀플리케이트 필터상의 약 5×105람다 플라크를 선별하기 위해 사용한다. 예비하이브리드화 용액은 55℃에서 몇시간 동안 유지하며, 상기 용액은 하기 조성물을 가진다 : 0.75M NaCl ; 0.15M 트리스/염산, pH 8.0 ; 10mM EDTA ; 5×Denhardt의 용액 ; 0.1% 소듐 피로포스페이트 ; 0.1% SDS ; 100㎎/㎖ E.coli t-RNA. 하이브리드화 용액은 그와 똑같은 조성물을 갖지만 이것은 45℃에서 하룻밤 동안 유지되며 약 0.5×106cpm/㎖의 농도로 표지된 프로오브를 포함한다. 하이브리드화 이후 그 필터를 1×SSC(=0.15M NaCl, 0.015M Na3-시트레이트) 중에서 4회 세척하고 X-레이 필름에 노출시킨다.
이 선별 과정은 필터 양면상에서 TB21에 하이브리드된 50플라크를 생산한다. 이 50개의 각 플라크를 수집하고, 5플라크를 각각 함유한 10개의 배양체 푸울에 혼합한다. 10개 배양체를 생장시키고 50㎖의 파아지 용해물로부터 DNA를 분리시킨다. 이 DNA를
Figure kpo00014
RI로 절단하고 두개의 동일한 1% 아가로즈 겔상에서 분획한 후, 이것을 써든(1975)의 J. MOl. Biol.
Figure kpo00015
, 503-517의 방법에 따라서 니트로셀룰로오즈 페이퍼에 옮긴다.
두개 필터상의 DNA를32P 표지된 TB21과 TB36에 각각 하이브리드시킨다. 그 두개 프로오브에 강하게 하이브리드된 제한 단편물이 포함된 푸울로부터의 각 플라크를 상기 방법에 의해 선별하는데, 그 DNA를
Figure kpo00016
RI,
Figure kpo00017
HI와
Figure kpo00018
RI+
Figure kpo00019
HI 로 절단시킨다. 이 방법으로 인체 베타 FSH가 포함된 6.8kb의
Figure kpo00020
RI-
Figure kpo00021
HI 단편이 분리된다.
6.8kb
Figure kpo00022
RI-
Figure kpo00023
HI 단편이 포함된 클론 15B의 부분 제한 지도를 제 2 도에 나타냈다. 베타 FSH 서열의 그 부위를 그 클론내에 배치하기 위하여, 크론 15B의 6.8kb
Figure kpo00024
RI-
Figure kpo00025
HI를 pBR322에 서브 클론 시켜서 플라스미드 p15B6.8R/B를 만든다(제 2 도). p15B6.8R/B를 여러가지 제한 효소로 절단하고 그 생산물을 통상의 방법에 따라서 아가로즈겔 전기영동에 의해 분리한다. 그 DNA를 니트로셀룰로오즈 페이퍼에 블롯하고 니크 번역에 의해32P로 표지된 돼지의 베타 FSH cDNA 클론의 단편에 하이브리드 한다.
제2도에 나타낸 바와 같이, 돼지의 베타 FSH 프로오브를 인체 DNA의 두개 분체, 즉, 1.1kb
Figure kpo00026
Ⅲ-
Figure kpo00027
I과 1.4kb
Figure kpo00028
I 단편에 하이브리드시킨다. 이 두개 단편의 부분적인 DNA 서열화는 이 DNA가 인체 베타 FSH를 암호하며 베타 FSH에 대한 전체 암호 부분이 이 두개 단편의 부분적인 DNA 서열화는 이 DNA가 인체 베타 FSH를 암호하며 베타 FSH에 대한 전체 암호 부분이 이 두개 분체내에 포함된 것을 나타낸다.
제3도의 제한 지도에 의해 나타낸 바와 같이, 베타 FSH 암호 서열은 성숙 베타 FSH의 아미노산 35와 36사이의 약 1.6kb의 간섭 서열에 의해 간섭받는다. 전체 인체 베타 FSH 코오딩 부분과 측면 및 간섭 서열의 뉴클로오티드 서열이 하기에 제공되었다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 아미노산 서열이 그 코오딩 서열에 대해 제공되었다.
Figure kpo00029
상기 서열에 대해 언급하자면, 18개 아미노산 시그널 펩티드의 개시 코돈 ATG에 박스가 표시되어 있는데, 이것은 번역 후 절단된다. 성숙 단백질은 원형 표시된 트리플레트 AAT에 의해 코오딩된 아미노산 Asn으로 시작된다. 엑손-인트론 경계는 화살표로 표시되었는데, 그들은 절단 공여체에 대한 인지 서열 GT와 절단 수용체 부위에 대한 AG와 인접해 있다. 정지 코돈 TAA와 코오딩 부분의 말단에 박스 표시가 있다.
하기는 트리플레트로 나누어지지 않은 상기 서열의 증식과 제한 부위를 나타내며 ; 그 ATG 개시와 TAA말단 코오딩 부위가 박스 표시 되었고 엑손-인트론 결합은 화살표로 표시되었다.
Figure kpo00030
Figure kpo00031
[BPV에 근거한 형질발현 벡터로 베타 FSH DNA의 삽입]
제3도를 참고로 합성
Figure kpo00032
HI 링커를 p15B6.8R/B의
Figure kpo00033
부위에 삽입시키는데, 이것은 ATG 개시 코돈의 5'의 42뉴클레오티드에 위치하고 있다.
제4도에서는, p15B6.8R/B를
Figure kpo00034
I으로 절단하고 E.coli DNA 폴리머라제(klenow)로 처리한 후, 이것을 합성
Figure kpo00035
HI 링커에 결합시키고
Figure kpo00036
HI로 절단한다. FSH의 첫번째 엑손을 함유한 295염기쌍 단편을 분리하고 pBR322의
Figure kpo00037
HI 부위에 클론시킨다. 수득한 플라스미드 pBR295Bam을
Figure kpo00038
I+
Figure kpo00039
R I+
Figure kpo00040
I으로 절단하고
Figure kpo00041
I+
Figure kpo00042
R I+
Figure kpo00043
I으로 절단된 p15B6.8R/B에 결찰시킨다. 결찰 혼합물을 사용하여 E.coli를 형질 전환시키고 인체 베타 FSH DNA 서열을
Figure kpo00044
HI 단편으로 포함한 플라스미드 pBR2.8Bam을 제한 지도에 의해 그 형질 전환체중에서 동정한다.
제4도에 나타낸 바와 같이, 형질발현 플라스미드 CL28FSH2.8BPV는 pRF375(제1도)를 제조하기 위해 사용한 것과 똑같은 방법으로 제조하는데, pBR2.8Bam의 2.8kb
Figure kpo00045
HI 단편을 알파 hCG cDNA 클론 대신에 사용한다. 플라스미드 CL28FSH2.8BPV를 통상 방법으로 포유 동물 숙주 세포의 형질 전환을 위해 사용할 수 있고, 인체 베타 FSH를 분리하여 정제할 수 있다.
마우스 세포의 트랜스펙숀
혼합된 트랜스펙숀을 사용하여 이종 이량체 FSH를 생산하기 위하여, 각 BPV 플라스미드, 즉 pRF375(알파 서브 유니트)와 CL28FSH2.8BPV(베타 FSH)의 5㎍을 혼합하고, 담체로서 연어 정자 DNA 10㎍이 함유된 250mM의 CaCl2용액 0.5㎖에 가한다. 이 혼합물을 280mM의 NaCl, 50mM의 Hepes와 1.5mM의 소듐 포스페이트 0.5㎖에 버블시킨다. 칼슘 포스페이트 침전물이 실온에서 30-40분간 형성되도록 한다.
트랜스펙숀 하기 24시간전에 마우스의 C127 세포의 5×105세포(Dr. Dean Harmer, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, Md로부터 시판)를 100㎜ 디쉬 또는 T-75 플라스크에 놓는다. 외인성 DNA를 첨가하기 직전에, 그 세포에 신선한 배지(Dulbecco의 변형 배지, 10% 태아송아지 혈청)를 공급한다. 1㎖의 칼슘 포스페이트 침전물을 각 디쉬(10㎖)에 가하고 그 세포를 6-8시간 동안 37℃에서 항온 보존한다.
그 배지를 흡출시키고 포스페이트 완충 염수(pH 7.0)중의 20% 글리세롤 5㎖로 2분간 실온에서 대체한다. 세포를 PBS로 세척하고 10㎖ 배지를 공급하고 37℃에서 항온 보존한다. 20-24시간 후, 그 배지를 교환하고 3-4일마다 그 세포의 연속적인 배지 재공급을 실시한다. 각 클론을 T-25 플라스크에서 증식시킨다. 7-21일 후, 분석용 큰 플라스크에 세포 클론을 옮긴다.
기탁
E.coli,중의 CL28FSH2.8BPV, NRRL B-15923은 일리노이주 61604, 페오리아에 소재한 농학 연구 배양체 수집소(NRRL, Agricultural Research Culture Collection)에 기탁되었다.
C127 세포중의 pRF375, ATCC CRL 8401는 메릴랜드 록크 빌리의 미합중국 배양물 수집소(ATCC)에 기탁되었다.
본 출원의 양수인, 인터그레이티드 제네틱스, 인코오포레이티드는 특허 기간 만료전에 그들이 죽었을때 이 배양체를 대체시켜야 할 의무를 알고 있으며, ATCC와 NRRL에 특허 발행을 알리어 그 시점에서 공증에게 그 기탁물이 시판되도록 할 의무를 지닌다. 그때까지, 그 기탁물은 37 CRF S1.14와 35 USC S112의 조건하에 특허청장에게 이용될 것이다.
활용
본 발명의 형질 전환 세포주는 글리코실화된 생물학적 활성 이종 이량체 인체 FSH를 생산하기 위해 사용되는데, 이것은 통상의 정제 방법에 의해 그 세포 및 또는 그들의 배양 배지로부터 정제된다. FSH는 인체 수정에 관련된 수많은 공지의 의학 용도를 가진다. 예컨대, FSH는 단독으로 또는 hCG 또는 LH와 함께 배란 또는 시험관 수정을 위한 초배란을 유도하도록 쓰일 수 있다.
더욱이, 이종 이량체 FSH, 또는 베타 서브 유니트만은 수정 및 뇌하수체 작용에 대한 진단 시험에 사용될 수 있다.
재조합 세포에 의해 생성되는 FSH는 천연 제공원으로부터 얻어지는 FSH에 비교하여, 다른 인체 단백질, 특히 다른 수정 호르몬에 의한 오염물이 없다는 장점이 있다.
다른 구체적 실례는 하기 청구범위내에 기술하였다. 예컨대, 하나는 알파 서브 유니트를 그리고 다른 하나는 베타 서브 유니트를 코오딩하는 두개의 각 형질발현 벡터가 함유된 세포를 배양함으로써 이종 이량체 FSH를 생산하는 것보다 두개 서브 유니트 모두를 코오딩하는 DNA를 동일한 형질발현 벡터에 포함할 수 있다.
제1도는 플라스미드 pRF375의 조립을 도식으로 나타낸 것이며,
제2도는 람다 클론 15B와 pBR322에 삽입되는 베타 FSH-함유의 6.8kb
Figure kpo00001
RI-
Figure kpo00002
HI 단편의 부분적 제한 효소 지도이며,
제3도는 베타 FSH 코오딩 부분과 BPV 근거의 형질발현 벡터에 삽입되는
Figure kpo00003
HI 단편의 부분적 제한 효소 지도이며,
제4도는 FSH 베타 서브 유니트를 코오딩하는, BPV-함유 플라스미드 CL28FSH2.8BPV의 조립을 도해한 것이다.

Claims (17)

  1. 수정 호르몬의 알파 및 베타 서브 유니트를 코오딩하는 이종 DNA를 함유한 적어도 하나의 형질발현 벡터로 트랜스펙트되는 세포를 배양하는 것을 포함하며, 상기 트랜스펙트된 세포는 생물학적 활성의 수정 호르몬을 생성할 수 있는 세포인, 알파 서브 유니트와 베타 서브 유니트를 포함한 생물학적 활성의 수정 호르몬을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 2개의 형질발현 벡터로 트랜스펙트되며, 그중 한 벡터는 알파 서브 유니트를 코오딩한 이종 DNA를 포함하고 다른 벡터는 베타 서브 유니트를 코오딩한 이종 DNA를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기의 수정 호르몬이 인체의 호르몬인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기의 수정 호르몬이 FSH인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기의 벡터(들)이 플라스미드를 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기의 벡터(들)이 송아지 유두종 비루스 게놈의 형질 전환 부위를 적어도 69% 포함하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기의 세포가 포유류 세포인 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기의 벡터가 하기 서열을 갖는 인체 FSH의 베타 서브 유니트를 코오딩한 이종 DNA를 포함하는 방법 ;
    Figure kpo00046
  9. 제8항에 있어서, 상기의 이종 DNA가 하기의 리더(leader) 서열을 추가적으로 코오딩하는 방법 ;
    Figure kpo00047
  10. 수정 호르몬의 알파 및 베타 서브 유니트를 코오딩한 이종 DNA를 함유하는 적어도 하나의 형질발현 벡터로 세포를 트랜스펙트시키며, 이 트랜스펙트된 세포는 생물학적 활성의 수정 호르몬을 제조할 수 있는 세포인 것을 특징으로 하는 트랜스펙트된 세포의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 두개의 벡터를 트랜스펙트에 사용하며, 그중 한 벡터는 알파 서브 유니트를 코오딩하는 이종 DNA를 포함하고 다른 벡터는 베타 서브 유니트를 코오딩하는 이종 DNA를 포함하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 수정 호르몬이 인체의 FSH인 방법.
  13. 제 10 항과 제 11 항에 있어서, 상기 벡터(들)이 플라스미드를 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기의 벡터(들)이 송아지 유두종 비루스 게놈의 형질 전환 부위의 적어도 69%를 포함하는 방법.
  15. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기의 세포가 포유류 세포인 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기의 벡터가 하기 서열을 갖는 인체 FSH의 베타 서브 유니트를 코오딩한 이종 DNA를 포함하는 방법 ;
    Figure kpo00048
  17. 제 16 항에 있어서, 상기의 이종 DNA가 하기의 리더 서열을 추가로 코오딩하는 방법 ;
    Figure kpo00049
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