JP2506322B2 - Ｇｒｆ前駆体をコ―ドするｄｎａ - Google Patents

Ｇｒｆ前駆体をコ―ドするｄｎａ

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JP2506322B2 JP59139738A JP13973884A JP2506322B2 JP 2506322 B2 JP2506322 B2 JP 2506322B2 JP 59139738 A JP59139738 A JP 59139738A JP 13973884 A JP13973884 A JP 13973884A JP 2506322 B2 JP2506322 B2 JP 2506322B2
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth-hormone releasing factors (GH-RF) (Somatoliberin)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト成長ホルモン放出因子（GRF）のプロセ
シングされていない前駆体であつてプレプロGRFと呼ば
れるペプチド、そのプレプロGRFをコードするDNA、なら
びに組み換えDNA技術を用いることによりプレプロGRFお
よびGRFの生産に関する。
発明の背景 いくつかの重要なホルモン類が哺乳動物の視床下部お
よび脳下垂体前葉において産生され、それらのうちの１
つの重要なホルモンは哺乳動物の成長を促進させる成長
ホルモン（GH）である。脳下垂体による成長ホルモンの
放出が視床下部で産生されるペプチドによつて調節され
ることはすでに認められている。しばらく前からソマト
スタチンと呼ばれる視床下部のペプチドがGHの放出を抑
制することは知られており、またGRFもしくはソマトク
リニンと呼ばれる視床下部産生性の物質がソマトスタチ
ンの相対物であつて脳下垂体からのGHの放出を促進させ
ることもよく知られている。
GRFは一般に視床下部に関係があるけれども、それは
膵臓の腫瘍細胞のような他の細胞からも産生される。実
際、完全に性状決定がなされかつGRF活性をもつ最初の
ペプチドはヒト膵臓ランゲルハンス島腫瘍から得られた
ものである（GuilleminらによるScience 218、585〜58
7ページ、1982年を参照）。ヒト膵臓GRFは、明らかには
示されていないが、ヒト視床下部GRFと同じであると考
えられる。いずれにせよ、膵臓GRFは成長ホルモンの放
出を促進させる点で非常に有効であり、そしてヒトの成
長を調節することの効力を考えると、ヒト膵臓GRFが実
質的な量で得られることが望まれるだろう。
Guilleminらにより性状決定がなされたGRFは44個のア
ミノ酸残基を有し、そのカルボキシル末端でアミド化さ
れている。40個のみのアミノ酸残基をもつGRF体も報告
されており、そして約27個程度に少ないアミノ酸残基を
もつGRF断片は、44個のアミノ酸残基からなるペプチド
よりもその効力が劣るけれども、生物学的に活性である
ことが見い出された。44個のアミノ酸残基全部をもつ膵
臓GRFペプチドは化学的に合成され、そして合成GRF、合
成GRF断片、およびそれらの合成類似体は非常に効力の
ある調節物質の源でありうるが、このような長鎖ペプチ
ドの化学合成は大そう費用のかかるものである。
ヒトGRFのDNAを細胞内に導入してGRFを発現せしめる
組み換えDNA技術は、安価にGRFを生産する可能性が最も
大きいと思われる。GRFをコードするDNAを得るための１
つの方法は逆に遺伝暗号を読み取つて、GRFアミノ酸配
列をコードするオリゴデオキシヌクレオチドを合成する
ことである。この種の合成“遺伝子”またはDNAは実際
に計画された。しかし、この種の合成“遺伝子”を細胞
内に導入する試みは、有意量のGRFを生産する形質転換
体をもたらさなかつた。
組み換えDNA技術を用いて得られる遺伝子発現におい
ては、もし天然のDNA源から単離したDNAをアミノ酸配列
から推定されるヌクレオチド配列に従つて合成したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの代わりに使用するならば、し
ばしば優れた結果が得られる。このことについての１つ
の理由は、一般に数種のコドン（３個の隣接するヌクレ
オチドの一定の配列）がただ１個のアミノ酸をコードす
るためにその遺伝暗号は重複することになるが、天然の
ヌクレオチド配列は適当なコドンの無作為選択に優れて
いるということかもしれない。さらに、天然の遺伝子は
観察されたペプチドをコードするばかりでなく、完成し
かつ活性のあるペプチドを生産するのに必要不可避のプ
ロセシング過程を受けるおよび／またはその過程をたど
る推定上の信号ならびに他の隠れた暗号配列を含む前駆
体をもコードすることがしばしば観察される。
発明の概要 本発明はGRFをコードするmRNAの単離、ならびに組み
換えDNA技術によりGRFを生産するためのその応用に関す
る。以下に詳細に述べるごとく、ヒト膵臓GRFの全44ア
ミノ酸残基配列と、GRFのカルボキシル末端およびアミ
ノ末端の横に結合した配列とを含むGRF前駆体をコード
するmRNAが単離された。
ヒトGRFを産生する膵臓腫瘍から得られたRNAを用いて
逆転与によりcDNAを生成し、そしてcDNAライブラリーか
らGRF前駆体をコードするcDNAクローンを識別した。こ
れらのcDNAクローンの塩基配列決定により、それらが互
いに密接な関係にある２種類のヒトGRF前駆体をコード
することが明らかになつた。各GRF前駆体はヒト膵臓GRF
の全44アミノ酸配列およびその前駆体をGRF（カルボキ
シル末端でのアミド化体を含む）へ変換させるためのプ
ロセシング信号を含む。cDNAクローンは細胞を形質転換
させるのに使用され、そして形質転換された細胞中でGR
F前駆体を合成させることが明らかになつた。その形質
転換された細胞中にプロセシング酵素が存在する場合に
は、その前駆体はGRFへ変換される。
発明の開示 本発明によれば、ヒト成長ホルモン放出因子プレプロ
ホルモンの探索はヒト膵臓成長ホルモン放出因子（hpGR
F）の２つの前駆体をコードする遺伝子の単離およびそ
れらの塩基配列決定へと導いた。ヒト膵臓成長ホルモン
放出因子は44個のアミノ酸残基からなるペプチドであ
り、hpGRF-44と呼ばれる。このhpGRF-44は生物学的、免
疫学的および物理化学的証拠に基づくと、ヒト視床下部
成長ホルモン放出因子（hhGRF）と同一である。２つのc
DNAのうち一方はプレプロGRF-107と呼ばれる107個のア
ミノ酸残基からなる前駆体をコードし、他方はプレプロ
GRF-108と呼ばれる108個のアミノ酸残基からなる前駆体
をコードしている。これらのプレプロGRFはそれぞれhpG
RFの全アミノ酸配列のほかに、アミノ末端とカルボキシ
ル末端の双方へ結合したペプチド断片を含んでいる。各
末端ペプチドは酵素作用によりそれらの除去を行わしめ
るプロセシング部位を有する。完成したGRFのカルボキ
シル末端のアミド化はカルボキシル−末端ペプチド中の
Gly-Arg配列により指図される。
メツセンジヤーRNA（mRNA）はまず非常に高度なヒト
膵臓成長ホルモン放出因子活性を有するヒト膵臓腫瘍か
ら単離され、次いでmRNAから逆転写によりcDNAが合成さ
れた。そのcDNAは大腸菌細胞を形質転換させるプラスミ
ドと会合（anneal）され、そして細胞は個々のコロニー
として培養されてcDNAライブラリーが作られた。そのcD
NAライブラリーから、hpGRF配列を含むペプチド類をコ
ードするcDNAで形質転換された細胞のコロニーを、GRF
アミノ酸配列の一部に呼応するように合成されたオリゴ
デオキシヌクレオチドを使用してハイブリダイゼーシヨ
ンによるスクリーニングで選択した。ハイブリダイゼー
シヨン−陽性クローンのcDNAはプラスミドDNAから切り
取られ、その塩基配列決定がなされ、そしてそのヌクレ
オチド配列はプレプロGRFと呼ばれるより大きな前駆体
蛋白質の一部からGRFアミノ酸配列が誘導されることを
明らかにした。また、単離されたcDNAはそれらの３′末
端および５′末端に暗号とならないセグメントを含む。
単離されたcDNAは、それらが制御DNAセグメントへ適
切に挿入される場合、形質転換された細胞においてプレ
プロGRFの合成を開始させる。プレプロGRFプロセシング
酵素を欠く形質転換細胞系からは、プレプロGRF含有ポ
リペプチドが単離されかつ精製される。プレプロGRFプ
ロセシング酵素をもつ細胞系は、それらが異種プレプロ
GRFcDNAを含むハイブリツド遺伝子で形質転換された場
合、さらにGRFを生産する。今や、本発明は例によつて
より詳細に述べられるだろう。
プレプロGRFをコードするmRNAの単離ならびにその塩
基配列決定には、Guilleminらの上記文献に記載された
高度なヒト膵臓成長ホルモン放出活性をもつ膵臓腫瘍が
大いに利用される。
ChirgwinらによるBiochemistry 18、5294ページ、19
79年に記載のグアニジンチオシアネート法ならびにNorg
ardらによるJ.Biol.Chem.225、7665〜7672ページ、1980
年に記載のオリゴdT−セルロースでのクロマトグラフイ
ーを用いて、15gの膵臓腫瘍（液体窒素中または−80℃
で保存）から３μｇのポリ（A+）‐RNAを単離する。３
μｇのポリ（A+）‐RNAからOkayamaらの方法（Mol．Cel
l Biol．２、161〜170ページ、1982年）のGublerらの変
法（準備中の原稿）を用いて、１μｇの二本鎖cDNAを合
成する。
そのcDNAはPeacockらによるBiochem.Biophys.Acta.65
5、243〜250ページ、1981年に記載の方法の変法を用い
て、cDNAライブラリーを作る際に使用される。cDNAはそ
の末端にポリdGTPがついており、そしてそのcDNAはEeoR
Vで切断されて末端にポリdCTPがついているpBR322プラ
スミドと会合される。その後、そのキメラ型プラスミド
は大腸菌RRIを形質転換し、そして形質転換された細胞
は平板上で増殖されて300000個の独立した形質転換体を
与える。
コロニーは次いでhpGRF配列をコードする遺伝子分画
の予め定められたヌクレオチド配列に対応するヌクレオ
チド配列をもつcDNAを含有するコロニーを捜すべく選別
される。天然GRF遺伝子のセグメントに相補的であるよ
うに予め定められたオリゴデオキシヌクレオチドを合成
し、これらのオリゴデオキシヌクレオチドがコロニー選
別用のハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用され
る。２つの混合されたヌクレオチドプローブのプールは
MiyoshiらによるNucleic Acids Res．８、5507〜5517ペ
ージ、1980年に記載の固相ホスホトリエステル法によつ
て合成され、そしてMaxamらの方法（Grossmanらの編集
によるMethods in Enzymology65巻、499〜560ページ、
アカデミツクプレス、ニユーヨーク、1980年）に従つて
それらの５′末端が／32P-ATPで標識される。プローブ
Ａと呼ばれる、混合されたオリゴデオキシヌクレオチド
プローブの１つは20個の塩基からなり、次式： のようにhpGRF配列のアミノ酸残基１〜７に対応する。
混合された他のプローブＢは14個の塩基からなり、次
式： のようにhpGRFのアミノ酸残基35〜39に対応する。
テトラデカマープローブＢはHanahanらによるGene 1
0、63〜67ページ、1978年に記載の方法によるコロニー
選別のために最初に使用される。ハイブリダイゼーシヨ
ンは0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウ
ム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、部分加水分解され
た酵母RNA（100μg/ml）、0.2％牛血清アルブミン（BS
A）、0.2％ポリビニルピロリドンおよび0.2％フイコー
ルからなる緩衝液中で、1ml当り標識プローブ1pmoleを
使用して30℃で２時間行われる。紙はすばやく0.3M塩
化ナトリウム、0.03Mクエン酸ナトリウムの溶液中室温
で洗浄され、そして0.6M塩化ナトリウム、0.06Mクエン
酸ナトリウムの溶液中40℃で60分間高ストリンジエンシ
ー洗浄（high stringency wash）を行われた後、その
紙はＸ線フイルムへ一晩さらされる。プローブＢを用い
た11000個のcDNAクローンの高密度および低密度スクリ
ーニングは、これらのクローンのうち９個の挿入DNA断
片がプローブＢとハイブリダイズすることを明らかにし
た。サザン（Southern）のブロツト分析はこれらの９個
の組み換え体のうち７個の挿入DNA断片がプローブＡと
もハイブリダイズすることを示した。
プローブＡおよびプローブＢの両方とハイブリダイズ
する形質転換体のプラスミドDNAはHind IIIで切断さ
れ、そしてSmithによるMethods of Enzymology 65、56
0〜580ページに記載の鎖成長停止反応（chain terminat
ion）法によつて、プライマーとしてプローブＢを使用
して部分的配列決定に付される。こうして、hpGRF配列
をコードする４つのクローンが識別され、これらのうち
クローンNo.21は最も大きなcDNA挿入物（520塩基対）を
含有する。
クローンNo.21のcDNA挿入物はMaxamらによる上記文献
の方法で完全にその塩基配列が決定され、その配列は下
記の表に示される。
クローンNo.21のヌクレオチド配列はそれが先に性状
決定されたhpGRF-44の全アミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードすることを示した。hpGRFの読取り枠におい
て、推定される開始コドンおよび終止コドンはhpGRF-44
の暗号配列からそれぞれ上流と下流の31コドンおよび32
コドンに位置する。それ故、このcDNAは107個のアミノ
酸からなりかつプレプロホルモンの代表的な特性を有す
るプレプロGRFをコードする（SteinerらによるAnnals o
f New York Acad.of Sci.243、１〜16ページ、1980年を
参照）。
塩基配列が決定されたcDNA断片から推定されるプレプ
ロGRFのアミノ酸配列が実際に天然の遺伝子産物に一致
し、逆転写の人工産物ではないことを確かめるために、
膵臓腫瘍細胞から得られるmRNAを用いて翻訳生産物が生
成され、そしてその翻訳生産物の分子量がプレプロGRF
の分子量と比較される。hpGRF-44mRNAの翻訳はウサギの
網状赤血球無細胞系で実施される。生産物は合成された
GRFに対して生じた特異的な抗体を用いて免疫沈降さ
れ、その後ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アミドゲルの電気泳動法により分離される。最も大きな
翻訳生産物はクローンNo.21（分子量12361）の大きさと
よく一致する約13000の分子量をもち２本鎖の形をして
いる。これより小さな翻訳生産物も２本鎖（分子量800
0）として延びており、大きい生産物と同様にGRFに特異
的な抗体と反応性である。この低分子量生産物は早期の
翻訳停止または大きなペプチドの低レベルのプロセシン
グを意味するかもしれない。二本鎖のバンドが現われる
理由は不明である。これらの結果はヌクレオチド配列が
正しく、かつクローンNo.21のcDNA断片がプレプロGRF-4
4の全暗号領域を含むことを示している。
クローンNo.21がプレプロGRF-44の全暗号領域を含む
ことが確かめられたので、今やその組み換えセグメント
を利用してポリ（A+）‐RNAからhpGRF-44mRNAを捜しあ
てることが可能である。ポリ（A+）‐RNAのサザン・ブ
ロツト分析のためにハイブリダイゼーシヨンプローブと
してクローンNo.21からのニツク−トランスレートされ
たプラスミドDNAを使用して、約820ヌクレオチドのmRNA
に対応する顕著なバンドが検出される。組み換え体No.1
は完全な３′−非暗号領域およびポリ（A+）部分を含む
ので、クローンNo.21を形質転換させた520塩基対のcDNA
セグメントはプレプロGRFmRNAの全５′−非暗号領域を
含まないと思われる。
クローンNo.21が全GRF-44暗号領域に対応する挿入DNA
遺伝子セグメントを含むことが確かめられたので、この
クローンからのcDNAは類似のDNAセグメントを含むクロ
ーンを捜しあてる際に有用なより長くてより特異的なハ
イブリダイゼーシヨンプローブを提供する。最初のcDNA
ライブラリーは表においてクローンNo.21のcDNA挿入物
の５′−末端から誘導されるプローブ（ヌクレオチドN
o.82〜149）を用いて再度選別される。
１つのクローン、No.8、は５′−末端で長さが40ヌク
レオチド長いDNA挿入セグメント、暗号領域に追加トリ
ヌクレオチド、および３′−非暗号領域に追加テトラヌ
クレオチドを含む。表に示されるように、そのトリヌク
レオチドは108アミノ酸残基ペプチド（プレプロGRF-10
8）の追加セリン（残基103）をコードする。分析された
さらに４つのクローンのうち、３つはプレプロGRF-108
をコードするヌクレオチド配列を含み、そして１つはプ
レプロGRF-107をコードするヌクレオチド配列を含んで
おり、少なくとも２つの異なるhpGRFmRNAの存在が確認
される。
クローンNo.8のDNAセグメントはGRF-44mRNAの実質的
に全ての逆転写を表わして、実質的に完全なプレプロGR
FcDNAであることが示される。さらに、hpGRFmRNAの小部
分は約80ヌクレオチド長いかもしれないことが示され
る。
プレプロGRF107および108をコードする２つのcDNAの
１次構造が確立されたので、いくつかの観察がその構造
についてなされる。プレプロGRF107およびプレプロGRF1
08の最初の20個のアミノ酸残基（表においてアンダーラ
インを施したもの）は、87個または88個のアミノ酸から
なるプロGRFへ結合される推定上の疎水性信号ペプチド
を構成する。プロGRF87およびプロGRF88はhpGRF-44の酵
素的生成のためのプロセシング部位（表において四角で
囲つたもの）、すなわちアミノ末端の前に位置する２個
のアルギニン残基（30-31）およびカルボキシル末端の
すぐ後に位置する１個のアルギニン残基（77）、を含有
する。hpGRF-44のカルボキシル末端ロイシンのすぐ後に
位置する配列Gly-Arg（76-77）は完成した生成物のアミ
ド化のための信号と一致する。
cDNAライブラリーのハイブリダイゼーシヨン−陽性ク
ローンから得られたcDNAセグメントは、GRF発現のため
に真核または原核宿主細胞へ導入する際に有用である。
プラスミドDNAはクローン21およびクローン８の各々か
ら得られる。そのプラスミドは挿入cDNA断片の５′末端
を露出すべくHind IIIエンドヌクレアーゼで切断され
る。プレプロGRFの５′配列は各種の発現ベクターで使
用するための種々の長さのアミノ端配列を含む一連のDN
Aセグメントを生成するために、Bal 31エキソヌクレア
ーゼで加水分解されてもよい。例えば、/gt11またはpCQ
V2で使用するためにはプレプロGRFのための開始コドン
までの全ての配列５′を除去することが必要だろう。そ
の後、化学合成されたオリゴヌクレオチドは純粋なプレ
プロGRF、プロGRFまたはGRF蛋白質の最高レベルの発現
のためにハイブリツドまたは融合遺伝子産物の生産を最
適化すべく、ベクターの特性に応じて加水分解されたDN
Aセグメントの５′末端へ付加される。続く加水分解DNA
セグメントの再クローニングの後、リンカー（linker）
が３′末端へ会合され、そして遺伝子工学的に処理され
た最終DNA断片は適当なエンドヌクレアーゼで加水分解
されて、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルの電
気泳動法によつてより大きなプラスミドDNAから分離さ
れる。プロセシングされたcDNAセグメントの各々は/gt1
1（YoungおよびDavisによるProc.Natl.Acad.of Sci.8
0、1194〜1198ページ）、pCQV2（Queen,C.によるJ.Mol.
and Appl.Genetics，２、１〜10ページ、1983年）、pMB
9−誘導ベクター（RobertsらによるProc.Natl.Acad.Sc
i.76、760〜764ページ、1979年）、またはpBR322−誘導
ベクター（JayらによるProc.Natl.Acad.Sci.78、5543〜
5548ページ、1981年）などの発現ベクターの適当な制限
部位へ会合される。その組み換え発現ベクターはPeacoc
kらの上記文献に記載の方法によつて大腸菌RRIへ導入さ
れる。プレプロGRFに関連したcDNAセグメントを含む細
菌コロニーはプローブＢとのDNAハイブリダイゼーシヨ
ンまたは抗体スクリーニング（YoungおよびDavisの上記
文献）によつて選択され、そしてプレプロGRF遺伝子を
含む50のハイブリダイゼーシヨン−陽性コロニーがその
後の培養のために選択される。推定上のcDNAベクターの
正確な構造は制限酵素による分析で確認される。
大腸菌中の細菌発現ベクターによりもたらされるプレ
プロGRFに関連したペプチド類の生産のための細菌コロ
ニーを試験すべく、コロニー中のGRF蛋白質配列の存在
がラジオイムノアツセイで測定される。溶菌液が調製さ
れ、ポリ塩化ビニルのマイクロタイターウエル（microt
iter well）に結合され、GRF−特異抗体へさらし、さら
にKohler,G.Y.によるHybridoma Techniques,Cold Sprin
g Harbor研究所、Cold Spring Harbor,ニユーヨーク、1
980年に記載の方法により125I−標識蛋白質Ａを結合さ
せることによつて抗原−抗体複合体を定量する。７つの
プレプロGRF-107コロニーのうちいくつかと、12のプレ
プロGRF-108コロニーのうちいくつかの溶菌物におけるG
RFペプチド配列の同定は、cDNAがこれらのコロニーにお
いてそれぞれ蛋白質生産物を発現させることを示す。
プレプロGRF-107に関連した遺伝子で形質転換され、
かつ適当な特異抗体と反応するペプチドを有意量産生す
る大腸菌のコロニーはその後の培養のために選択され、
プロプロGRF-108に関連した遺伝子で形質転換された大
腸菌のコロニーも同様である。これらのコロニーの各々
から溶菌物が調製され、そして各溶菌物は排除クロマト
グラフイー次いでポリアクリルアミドゲルの電気泳動法
によつて分画される。12000ないし13000の範囲にある分
子量の蛋白質を含む排除クロマトグラフイー分画は、抗
GRF抗体で共有結合されたセフアロース（Sepharose）ビ
ーズのカラムでの親和クロマトグラフイーにより、およ
び／またはイオン交換クロマトグラフイーにより精製さ
れ、これらの精製法は全て当技術分野において一般に既
知である。最後の精製は高圧液体クロマトグラフイー
（Guilleminらの上記文献）によつて得られるかもしれ
ない。
回収された分画中のそれぞれのプレプロGRF量は、最
初にGRFと反応性の抗血清を各種の分画希釈液とインキ
ユベートし、次いで125I−標識合成GRF-44へさらすこと
によるラジオイムノアツセイで評価される。各種の希釈
液中のプレプロGRFの濃度は、抗体−結合および非結合
標識GRFの濃度を対照（この場合、GRF抗血清は最初既知
濃度の未標識GRFへさらされ、次いで既知濃度の標識GRF
へさらされる）から誘導される標準曲線と比較すること
によつて算定される。この結果は精製分画が各々全蛋白
質の約75〜80％の範囲のプレプロGRFを含有することを
示す。
プロセシングされていないプレプロGRFの２つ形体、
または細菌配列とGRF配列とを含有するハイブリツド蛋
白質はどちらもGRF活性をもつことが確認されなかつた
が、それにもかかわらずこれらの物質は価値ある化合物
である。もし前駆体を動物に投与するなら、その前駆体
はその後生体内でGRFへプロセシングされる場合のある
ことが立証されるかもしれない。いずれにしろ、プレプ
ロGRFはプロセシング酵素を含むヒト視床下部抽出物へ
そのプレプロGRFをさらすことにより試験官内でプロセ
シングされうる。ヒトプレプロGRFをGRFへプロセシング
するヒト以外の動物からの視床下部抽出物が見い出され
る可能性もある。プレプロGRFの酵素的プロセシングは
生体内または生体外のどちらの場合にもGRF-44の末端カ
ルボキシル基をアミド化することが予測されるだろう。
このことはプレプロGRFに存在するプロセシング配列を
含まずかつGRFアミノ酸配列のみをコードする合成オリ
ゴデオキシヌクレオチドに比べて、天然遺伝子の明らか
に区別しえる利点となつている。プロセシングはまた精
製途中の分画において進めてもよく、その後分画は上述
のごとく精製される。アミノ末端に細菌配列を含有する
ハイブリツド蛋白質が細菌発現の産物である場合には、
臭化シアンなどの薬剤による部分加水分解が試験官内で
の組織抽出物によるその後のプロセシングのためにプレ
プロGRFを放出させるべく必要となるかもしれない。
細菌での発現のために遺伝子工学的に処理されたプレ
プロGRF遺伝子断片は、酵母や哺乳動物細胞のような真
核細胞系での発現にも使用することができる。酵母菌の
場合では、哺乳動物のインターフエロンは酵母ベクター
YEpIPT（HitzemanらによるScience,219、620〜625ペー
ジ、1983年）を使用して発現される時適当に分泌されて
プロセシングされることが見い出された。プレプロGRF
も同様にプロセシングされて分泌されるかもしれず、こ
のことは精製過程を助けることになり、その後プレプロ
GRFは上述のように試験官内プロセシング用基質として
役立つかもしれない。これとは別に、プレプロGRFをコ
ードすることが見い出されたcDNAセグメントはまた、酵
素がプレプロGRF-107およびプレプロGRF-108をプロセシ
ングするのに有効である場合、ヒト視床下部細胞系また
はラツト脳下垂体細胞系に導入することもできる。その
cDNAはSV40−誘導ベクターのpSV2属（Mulligan,R.C.お
よびBerg,P.によるEukaryotic Viral Vectors,Y.Gluzma
n編集、Cold Spring Harbor研究所、Cold Spring Harbo
r,ニユーヨーク）のような発現ベクターまたはより新し
いレトロウイルスベクター（Mulligan,P.によるScienc
e,209、1422〜1427ページ、1980年）の中でクローン化
される。次いでcDNAは微小注射、DNAトランスフエクシ
ヨンまたはウイルス感染によつて視床下部細胞へ導入さ
れる。その導入cDNAを安定に組み込んだ細胞はベクター
系により提供される２つの特徴のある標識物質、gptま
たはneoのための選択プロトコール（selection protoco
l）によつて選択される。コロニーによるGRFの産生は適
当な抗体を使用する上記一般方法によつて検定されるだ
ろう。コロニーのうち数個は形質転換されていない細胞
系により産生されるGRF量よりも多くGRFを産生するだろ
う。こうして、単離されたプレプロGRFcDNAは真核細胞
中での形質転換に適していると考えられ、そして少なく
ともいくつかの場合には発現生産物は宿主細胞内の酵素
により通常の方法でGRFへプロセシングされるだろう。
本発明はある好適な実施態様について記載したが、当
業者に明らかな変更が本発明の範囲から逸脱することな
くなされるだろう。例えば、ここに記載されたプレプロ
GRFcDNAは２種類の天然に存在する遺伝子セグメントの
正確な構造のみを表わすと解される。わずかに修飾され
た対立遺伝子は同様の機能を有する蛋白質をコードする
と予測され、そしてそのような遺伝子セグメントおよび
蛋白質は本発明の目的に対して均等物であると考えられ
る。また、わずかに修飾された蛋白質同族体が合成され
うること、およびそのような多くの修飾同族体がプレプ
ロGRF活性を示すと予測されうることも知られており、
これらは同様に本発明の範囲内であると考えられる。均
等のコドンをもつDNAは本発明の範囲内であると考えら
れ、またプレプロGRF活性を示す同族蛋白質をコードす
る合成遺伝子セグメントも同様である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】全hpGRFペプチド配列、該hpGRFペプチドの
    アミノ末端に結合したペプチドセグメント、および該hp
    GRFペプチドのカルボキシル末端に結合したペプチドセ
    グメントを含むhpGRF前駆体をコードするヌクレオチド
    配列を含む単離されたDNAであって、該hpGRF前駆体が下
    記の配列： Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala- Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg を含み、該末端セグメントが該hpGRFペプチドから該末
    端セグメントの酵素的除去を行わしめるための信号セグ
    メント、およびhpGRFカルボキシル末端の酵素的アミド
    化を行わしめるための信号セグメントを含み、かつ、前
    記ヌクレオチド配列が下記の配列： CGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT を含むことを特徴とするDNA。
  2. 【請求項２】ヌクレオチド配列が次のアミノ酸配列： Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-Ile-Leu-Thr-Leu-Ser- Asn-Ser-Ser-His-Cys-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Arg- Met-Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly- Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Met-Trp-Ala- Glu-Gln-Lys-Gln-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu- Leu-Gln-Lys-His-R-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly ［式中、ＲはSerおよびデス‐Ｒからなる群より選択さ
    れる］ をコードしており、次の配列： ATG CCA CTC TGG GTG TTC TTC TTT GTG ATG CTC ACC CTC AGC AAC AGC TCC CAC TGC TCC CCA CCT CCC CCT TTG ACC CTC AGG ATG CGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT CAG GTA GAC AGC ATG TGG GCA GAA CAA AAG CAA ATG GAA TTG GAG AGC ATC CTG GTG GCC CTG CTG CAG AAG CAC NNN AGG AAC TCC CAG GGA ［式中、NNNはAGCおよびデス‐NNNからなる群より選択
    される］ を含む、特許請求の範囲第１項記載のDNA。
  3. 【請求項３】形質転換された微生物または培養細胞中で
    前記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列
    を発現することができる発現ベクター内に挿入された、
    特許請求の範囲第１項または第２項記載のDNA。
  4. 【請求項４】形質転換された微生物または培養細胞中に
    挿入された発現ベクターであって、生成物が全hpGRFペ
    プチド配列、該hpGRFペプチドのアミノ末端に結合した
    ペプチドセグメント、および該hpGRFペプチドのカルボ
    キシル末端に結合したペプチドセグメントを含むhpGRF
    前駆体をコードするヌクレオチド配列によりコードされ
    るアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現され、 該hpGRF前駆体が下記の配列： Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala- Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg を含み、該末端セグメントが該hpGRFペプチドから該末
    端セグメントの酵素的除去を行わしめるための信号セグ
    メント、およびhpGRFカルボキシル末端の酵素的アミド
    化を行わしめるための信号セグメントを含み、かつ、前
    記ヌクレオチド配列が下記の配列： CGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT を含むことを特徴とするベクター。
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