JPS6037990A - Ｇｒｆ前駆体をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト成長ホルモン放出因子（ａＲＦ）のプロセ
シングされていない前駆体でるってプレプロＧＲＦと呼
ばれるペプチド、そのプレプロＧＲＦをコートするＤＮ
Ａ、ならびに組み換えＤＮＡ技術を用いることによるプ
レプロＧＲＦおよびＧＲＦの生産に関する。

発明の背景 いくつかの重要なホルモン類が咄乳動物の視床下部およ
び脳下垂体前葉において産生され、それらのうちの１つ
の重要なホルモンは哺乳動物の成長を促進させる成長ホ
ルモン（ＧＨ）である。脳下垂体による成長ホルモンの
放出が視床下部で産生されるペプチドによって調節され
ることはすでに認められている。しばらく前からンマト
スタチンと呼ばれる視床下部のペプチドがＧＩＩの放出
を抑制することは知られて才ｄす、１だＧ　Ｒ，７”も
しくはソマトクリニンと呼ばれる視床下品産生性の物質
がノマトスタチンの相対物でるって脳下垂体力・らのＧ
Ｈの放出を促進させることもよく仰られている。

ＧＲＦは一般に視床下部に関係があるけれども、それは
膵臓の腫瘍細胞のような他の細胞からも産生される。実
際、完全に性状決定がなされかつＧＲＦ活性をもつ最初
のペプチドはヒト膵臓ランゲルノ・ンス島腫揚から得ら
れたものである（　Ｇｕｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎらによる
Ｓｃｉ、ｅｎｃｅ　２１８．　５８５〜５８７ページ、
１９８２年を参照）。ヒト膵臓ＧＲＦは、明らかには示
されていないか、ヒト視床下部Ｇ　ＲＦと同じであると
考えられる。いずれにせよ、膵１１＠　Ｇ　ＲＦは成長
ホルモンの放出を促進させる点で非常に有効であり、そ
してヒトの成長を調節することの効力を考えると、ヒト
膵臓ＧＲＦが実質的な遣で得られることが望１れるだろ
う。

Ｇｕｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎらにより性状決定がなされた
ＧＲＦは４４個のアミノ酸残基を有し、そのカルボキシ
ル末端でアミド化されている。４０個のみのアミノ酸残
基をもつＧＲＦ体も報告されており、そして約２７個程
度に少ないアミノ酸残基をもつＧＲＦ断片は、４４個の
アミノ酸残基からなるペプチドよりもその効力が劣るけ
れども、生物学的に活性であることが見い出された。４
４個のアミノ酸残基全部をもつ膵”Ａ？ＡＧＲＦペプチ
ドは化学的に合成され、そして合成ＧＥＦ、合成Ｇ　Ｒ
Ｆ断片、およびそれらの合成類似体は非常に効力のある
調節物質の源でありうるが、このような長鎖ペプチドの
化学合成は太そり費用のかかるものである。

ヒトＧＲＦのＤＮＡを細胞内に導入してＧｌ−ｔＦを発
現せしめる組み換えＤＮＡ技術は、安価にＧＲＦを生産
する可能性が最も太きいと思われる。

ＧＲＦをコードするＤＮＡｋ得るための１つの方法は逆
に遺伝暗号を読み取って、ＧＲＦアミノ酸配列配列−ド
するオリゴデオキシヌクレオチドを合成することである
。この種の合成パ遺伝子″またはＤＮＡは実際に計画さ
れた。しかし、この種の合成゛遺伝子″を細胞内に導入
する試みは、有意量のＧ’ＲＦを生産する形質転換体を
もたらさなかった。

組み換えＤＮＡ技術を用いて得られる遺伝子発現におい
ては１．もし天然のＤＮＡ源から単離したＤＮＡをアミ
ノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に従って合成
したオリゴデオキシヌクレオチドの代わりに使用するな
らば、しばしば優れた結果が得られる。このことについ
ての１つの理由は、一般に数種のコドン（３個の隣接す
るヌクレオチドの一定の配列）がただ１個のアミノ酸を
コードするためにその遺伝暗号は重複することになるが
、天然のヌクレオチド配列は適当なコドンの無作為選択
に優れているということかもしれない。

さらに、天然の遺伝子は観察されたペプチドをコードす
るばかりでなく、完成しかつ活性のあるペプチドを生産
するのに必要不可避のプロセシング過程を受けるおよび
／またはその過程をたどる推定上の信号ならびに他の隠
れた暗号配列を営む前駆体をもコードすることがしばし
ば観察される。

発明の概要 本発明はＧＲＦをコードするｍ　ＲＮＡの単離、ならび
に組み換えＤＮＡ技術によりＧＲＦを生産するためのそ
の応用に関する。以下に詳細に述べるごとく、ヒト膵臓
ＧＲＦの全４４アミノ酸残基配列と、ＧＲＦのカルボキ
シル末端およびアミン末端の横に結合した配列とを含む
ＧＨＦ前駆体をコードするｍ　ＲＮ　Ａが単離された。

ヒトＧＲＦを産生ずる膵臓腫瘍から得られたＲＮＡを用
いて逆転与によりｃＤＮＡを生成し、そしてｃ　Ｄ　Ｎ
　ＡライブラリーからＧＲＦ前駆体をコードするｃＤＮ
Ａクローンを識別した。これらのｃＤＮＡクローンの塩
基配列決定により、それらが互いに密接な関係にある２
種類のヒトＧＲＦ前駆体をコードすることが明らかにな
った。各ＧＲＦ前駆体はヒト膵Ｊｉａ　Ｇ　ＩＩ　Ｆ′
の全４４アミノ酸配列およびその前、実体をＧＩＩＦｋ
カルボキシル末端でのアミド化体を含む）へ変換させる
ためのプロセシング信号を含む。ｃＤＮＡクローンは細
胞を形質転換させるのに使用され、そして形質転換され
た細胞中でＧＲＦ前駆体を合成させることが明らかにな
った。その形質転換された細胞中にプロセシング酵素が
存在する場合には、その前駆体ばＧＲＦへ変換される。

発明の開示 本発明によれば、ヒト成長ホルモン放出因子プレプロホ
ルモンの探索はヒ）　膵臓成長ホルモン放出因子（ｈｐ
ＧＲＦ）の２つの前駆体をコードする遺伝子の単離およ
びそれらの塩基配列決定へと導いた。ヒト膵臓成長ホル
モン放出因子は４４個のアミノ酸残基からなるペプチド
であり、ｈｐＧＲＦ−４４と呼ばれる。このｈｐＧＲＦ
−４４は生物学的、免疫学的および物理化学的証拠に基
づくと、ヒト視床下部成長ホルモン放出因子（ＩＬｈＧ
ｌｔＦ）と同一である。２つのｃＤＮＡのうち一方はプ
レプロＧＲＦ−１０７と呼ばれる１０７１固のアミノ酸
残基からなる前駆体をコードし、他方はプレプロＧＲ１
ｉ’−１０８と呼ばれる１０８個のアミノ酸残基からな
る前駆体をコードしている。これらのプレプロＧＲＦは
それぞれｈｐＧＲＦの全アミノ酸配列のほかに、アミン
末端とカルボキシル末端の双方へ結合したペプチド断片
を含んでいる。各末端ペプチドは酵素作用によりそれら
の除去を行わしめるプロセシング部位を有する。゛完成
したＧＲＦノカルホギシル末端のアミド化はカルボキシ
ル−末端ペプチド中のＧｌｙ−Ａｒｇ配列により指図さ
れる。

メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はまず非常に高度な
ヒト膵臓成長ホルモン放出因子活性を有するヒト膵臓腫
瘍から単離され、次いでｍ　ＲＡＴ　Ａがら逆転写によ
りｃＤＮＡが合成された。そのｃＤＮＡは大腸菌細胞を
形質転換させるプラスミドと会合（ａｎｎｅａ５され、
そして細胞は個々のコロニーとして培養されてｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａライブラリーが作られた。そのＣＤＮＡライブラ
リーから、ｈｐＧＲＦ配列を含むペプチド類をコードす
るｃＤＮＡで形質転換された細胞のコロニーを、ＧＲＦ
アミノ酸配列配列部に呼応するように合成されたオリ−
ボデオキシヌクレオチドを使用してハイブリダイゼーシ
ヨンによるスクリーニングで選択した。ハイブリダイゼ
ーション−陽性クローンのｃＤＮＡはプラスミドＤＮＡ
から切り取られ、その塩基配列決定がなされ、そしてそ
のヌクレオチド配列はプレプロＧ　ＩＩ　Ｆと呼ば八る
より大きな前駆体■白質の一部からＧＲＦアミノ酸配列
配列導されることを明らかにした。また、単離されたｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａはそれらの３′末端および５′末端に暗号
とならないセグメントを含む。

単離されたｃＤＮＡは、そ柱らが制御ＤＮＡセグノント
へ適切に挿入される場合、形質転換された細胞において
プレプロＧＲＦの合成を開始させる。プレプロＧ　ＲＦ
プロセシング酵素を欠く形質転換細胞系からは、プレプ
ロＧＲＦ含有ポリペプチドが単離されかつ精製される。

プレプロＧ　Ｌ、Ｆ　。

プロセシング酵素をもつ細胞系は、それらが異種プレプ
ロＧＲＦｃＤＮＡを含むハイブリッド遺伝子で形質転換
された場合、さらにＧＲＦを生産する。

今や、本発明は例によってより詳、ｉｌＫ述べられるだ
ろう。

プレプロＧＲＦをコードするｍＲＮＡの単離ならびにそ
の塩基配列決定には、Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ　らの上記文
献に記載された高度なヒト膵臓成長ホルモン放出活性を
もつ膵臓腫瘍が大いに利用される。

ＣｈｉｒｇｗｉｎらによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
１８゜５２９４ページ、１９７９年に記載のグアニジン
チオシアネート法ならびにＮｏｒｇａｒｔｌらによるＪ
　、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、２２５．７６６５〜７
６７２ページ、１９８０年に記載のオリゴｄＴ−セルロ
ースでのクロマトグラフィーを用いて、１５ｇの膵ＩＩ
　Ｉｆｉ　！（液体窒素中または一８０℃で保存）から
３μＩのポリ（Ａ　）−ＲＮＡを単離する。３μＩのポ
リ（Ａ＋）−ＲＮＡからＯｌｃａｙａｍａらの方法（Ｍ
ｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２．１６１〜１７０ページ、１
９８２年）のＧｕｂｌｅγらの変法（準備中の原稿）を
用いて、１μｙの二本鎖ＣＤＮＡを合成する。

そのｃＤＮＡはｐｅａｃｏｃｋらによるＢｉｏｃ／ｂｅ
ｍ。

Ｆ紳１すＬと坦α・μ且、２４３〜２５０ページ、１９
８１年に記載の方法の変法を用いて、ＣＤＮＡライブラ
リーを作る際に使用される。ｃＤＮＡはその末端にポＩ
Ｊ　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐがついており、そしてそのｃＤＮＡ
はＥｅｏＲＶで切断されて末端にポリｄＣＴＰがついて
いるｐＢ１ｔ３２２プラスミドと会合される。その後、
そのキノラ型プラスミドは大腸菌ＲＲＩを形質転換し、
そして形質転換された細胞は平板上で増殖されて３００
０００個の独立した形質転換体を与える。

コロニーは次いでｈｐＧＲＦ配列をコードする遺伝子分
画の予め定められたヌクレオチド配列に対応するヌクレ
オチド配列をもつｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａ　ｆ含有するコロニ
ーを捜すべく選別される。天然ＧｌｔＦ遺伝子のセグメ
ントに相補的であるように予め定められたオリゴデオキ
シヌクレオチドを合成し、これらのオリボデ万キシヌク
レオチドがコロニー選別用のハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用される。２つの混合されたヌクレオチ
ドプローブのプールはＡｄｉｙｏｓｈｉらによるＮｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＢｅｓ、　８．５５０７〜５５１
７ページ、１９８０年に記載の同相ホスホトリエステル
法によって合成され、そしてＭａｚａｍらの方法（Ｇｒ
　ｏ　ｓ　ｓｍａｎらの４９９〜５６０ページ、アカテ
ミツクプレス、ニューヨーク、１９８０年）に従ってそ
れらの５′末端が／３２Ｐ−ＡＴＰで標識される。プロ
ーブＡど呼ばれる、混合されたオリゴデオキシヌクレオ
チドプローブの１つは２０個の塩基からなり２、次式：
％式％ のようにｈｐＧＲＦ配列のアミノ酸残基１〜７に対応す
る。混合された他のプローブＢは１４個の塩基からなり
、次式： ％式％ のようにｈ７）ＧＲＦのアミノ酸残基３５〜３９（（対
応する。

テトラデカマープローブＢは１ｉａｎａｈａｎらによる
Ｇｅｎｅ　１０．６３〜６７ページ、１９７８年に記載
の方法によるコロニー選別のために最初に使用される。

ハイブリダイゼーションは０．７５　ｊＡ４塩化ナトリ
ウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％Ｉ・
デンル硫酸ナトリウム、部分加水分解された酵＠ニアｉ
’＃Ａ　（１，ＯＯμｇ／ｙｌ、０．２％牛血清アルブ
ミ／（ＢＳＡ）、０．２％ポリビニルピロリドンす６よ
び０．２％フィコールからなる緩衝液中で、１＋Ｔ＋７
！当り標識プローブｌｐｍｏｌｅを使用して３０Ｃで２
時間行われる。Ｐ紙はすはや（０，：３Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０３Ａ／クエン酸す！・リウムの溶液中室温で
洗浄され、そして０．６Ａ４塩化ナトリウム、０．０６
Ｍクエン酸ナトリウムの溶液中４０℃で６０分間高スト
リンジエンシー洗浄（ｈ、ｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃ
ｙｗａｓｈ）′ｆ：行われた後、そのＦ紙は’ＹＷ３Ｊ
ｌフィルムへ一晩さらされる。プローブＢを用いた１１
０００個のｃＤＮＡクローンの高密度および低密度スク
リーニングは、これらのクローンのうち９個の挿入ＤＮ
Ａ断片がプローブＢとハイブリダイズすることを明らか
にした。サザン（Ｓｏｕｔｌｔｅγｎ）のプロット分析
はこれらの９個の徂み換え体のうち７個の挿入ＤＮＡ断
片がプローブＡともハイブリダイズすることを示した。

プローブＡおよびプローブＢの両方とハイブリダイズす
る形質転換体のプラスミドＤＮＡはＨｉ″ｎｄ　Ｉｌｌ
で切断され、そしてＳｍ１ｔんによるＡ４’ｅｔｈｏｄ
ｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ￥６５．５６０〜５８０
ページに記載の鎖成長停止反応（ｃｈαｉｎ　ｔｅｒｍ
ｉ−ｎａｔｉｏｎ）法によって、プライマーとしてブロ
ーフ゛Ｂを使用して部分的配列決定に付される。こうし
て、ｈｐＧＲＦ配列をコードする４つのクローンが識別
され、これらのうちクローン／１６２１は最も大きなｃ
ＤＮＡ挿入物（５２０塩基対）全含有する。

クローン１６２１のｃＤＮＡ挿入物はＭαＸαｍらによ
る上記文猷の方法で完全にその塩基配列が決定され、そ
の配列は下記の表に示される。

クローンＡ６２１のヌクレオチド配列はそれが先に性状
決定されたｈｐＧＲＦ−４’４の全アミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードすることを示した。

ｈｐＧＲＦの読取り枠において、推定される開始コドン
および終止コドンはｈｐＧＲｐ　−４４の暗号配列から
それぞれ上流と下流の３１コドンおよび３２コドンに位
置する。それ故、このｃＤＮＡは１０７個のアミノ酸か
らなりかつプレプロホルモンの代表的な特性を有するプ
レプロＧｆｔＦをコーｒｋ　Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ
、２４３．１〜１６ページ、１９８０年を参照）。

塩基配列が決定されたｃＤＮＡｌＯＴ片から推定される
プレプロＧＲＦのアミノ酸配列が実際に天然の遺伝子産
物に一致し、逆転写の人工産物ではないことを確かめる
ために、膵臓腫瘍細胞から得られるｍ　Ｒ＃　Ａを用い
て翻訳生産物が生成され、そしてその翻訳生産物の分子
量がプレプロＧ　ＲＩ’の分子ｆｉｔ　ト比４ｔ１２　
サＦＬ　ル。ｈ　ｐＧｌｔＦ　−４４ｍ　ｌｔ　Ｎ　Ａ
　ノ翻訳はウサギの網状赤血球無細胞系で実施される。

生産物は合成されたＧＲＦに対して生じた特異的な抗体
を用いて免疫沈降され、その後ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲルの電気泳動法により分離
される。最も大きな翻訳生産物はクロー／／ｌ６２１（
分子量１２３６１）の大きさとよく一致する約１３００
０の分子ｋｋもち２本鎖の形をしている。これより小さ
な翻訳生産物も２本鎖（分子量８０００　）として延び
ており、大きい生産物と同様にＧ　ＲＦに特異的な抗体
と反応性である。この低分子量生産物は早期の翻訳停止
または大きなペプチドの低レベルのプロセシングを意味
するかもしれない。二本鎖のバンドが現われる理由は不
明である。これらの結果はヌクレオチド配列が正しく、
かつクローン／１６２１のｃＪＪＮＡＵＴ片がプレプロ
ＧＲＦ−４４の全暗号領域を含むことを示している。

クローンＡ６２１がプレプロＧＲＦ−４４の全暗号領域
を含むことが確かめられたので、今やその組み換えセグ
メントを利用してポリ（，４＋）　−ＲＮＡからｈｐＧ
ＲＦ　−４４ｍｋＮＡを捜しあてることが可能である。

ポリ（Ａ＋）−ＲＮＡのサザン・プロット分析のために
ハイブリダイゼーションプローブとしてクローン１６２
１からのニック−トランスレートされたプラスミドＤＮ
Ａを使用して、約８２０ヌクレオチドのηＬＲＮＡに対
応する顕著なバンドが検出される。組み換え体ｙｆ６１
は完全な３′−非暗号領域およびポリ（Ａ＋）部分を含
むので、クローン４２１を形質転換させた５２０塩基対
のｃ　ＤＮＡセグメントはプレプロＧＲＦＩｎＲＮＡの
全５７−非暗号領域を含寸ないと思われる。

クローンＡ２１が全Ｇ　Ｒｉイ゛−４４暗号領域に対応
する挿入１）ＮＡ遺伝子セグメントヲ含むことが確かめ
られたので、このクローンからのｃＤＮＡは類似のＤＮ
Ａセグメントを営むクローンを捜しあてる際に有用なよ
り長くてより特異的なハイブリダイゼーションプローブ
を提供する。最初のｃＤＮＡライブラリーは表において
クローンｙ１６２１のｃｌ）ＮＡ挿入物の５′−末端か
ら誘導されるプローブ（ヌクレオチドＡ６８２〜１４９
）を用いて再度選別される。

１つのクローン、／Ｉ６８、は５′−末端で長さが４０
ヌクレオチド長いＤＮＡ挿λセグメント、暗号領域に追
加トリヌクレ紛ド、および３′−非暗号領域に追加テト
ラヌクレオチドを含む。表に示されるように、そのトリ
ヌクレオチドは１０８アミノ酸残基ペプチド（プレプロ
ＧＲＦ−１０８）の追加セリン（残基１０３）をコード
する。分析されたさらに４つのクローンのうち、３つは
プレプロＧＲＦ−１０８にコードするヌクレオチド配列
を含み、そして１つはプレプロＧＲＦ−１０７をコード
するヌクレオチド配列を含んでおり、少なくとも２つの
異なるｈｐＧＲＦｍｌｌＮＡの存在が確認される。

クローン、′ｉ６８のＤＮＡセグメントはＧＲＦ−４４
ｍ　ＲＮ　Ａの実質的に全ての逆転写を表わして、実質
的に完全なプレプロＧＲＦｃＤＮＡであることが示され
る。さらに、ｈｐＧＲＦｍＲ−ＮＡの小部分は約８０ヌ
クレオチド長いかもしれないことが示される。

プレプロＧＲＦ１０７およびＬＯ８’ｔコードする２つ
のｃＤＮＡの１次構造が確立されたので、いくつかの観
察がその構造についてなされる。プレプロＧＲＦ１０　
’ＩＪ：びプレプ０ＧＲＦ１０８１）Ｒ初の２０個のア
ミノ酸残基（表においてアンダーラインを施したもの）
は、８７（Ｉｔたは８８個のアミノ酸からなるプロＧＲ
Ｆへ結合される推定上の疎水性信号ペプチドを構成する
。プロＧＲＦ８７およびプロＧＲＦ８ＢはんｐＧＲＦ−
４４の酵素的生成のためのプロセシング部位（表におい
て四角で囲ったもの）、すなわちアミノ末端の前に位置
する２個のアルギニン残基（３０−３１）およびカルボ
キシル末端のすぐ後に位置する１個のアルギニン残基（
７７）、全含有する。ｈｐＧＨ，Ｆ−４４のカルボキシ
ル末端ロイシンのすぐ後に位置する配列Ｇｌ　ｙ−Ａｒ
ｇ　（７６−７７）は完成した生成物のアミＦ化のため
の信号と一致する。

ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション−陽性
クローンから得られたｃＤＮＡセグメントは、ＧＲＦ発
現のために真核または原核宿主細胞へ導入する際に有用
である。プラスミドＤＮＡはクローン２１およびクロー
ン８の各々から得られる。そのプラスミドは挿入ｃ　Ｄ
　Ｎ　／Ｌ断片の５′末端を露出すべくＨｉミル　ＩＩ
Ｉエンドヌクレアーゼで切断される。プレプロＧ　ＲＩ
ｊ’の５′配列は各種の発現ベクターで使用するための
種々の長さのアミン端配列を含む一連のＤＮＡセグメン
ト・を生成するために、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼ
で加水分解されてもよい。例えば、／　ｇｔ　１１また
はｐＣＱ−Ｖ２で使用するためにはプレプロＧ　ＲＦの
ための開始コドン葦での全ての配列５′を除去すること
が必要だろう。その後、化学合成されたオリゴヌクレオ
チドは純粋なプレプロＧｌτＦ１　プロＧ　ＲＦ’なた
はＧｋＦ蛋白質の最高レベルの発現のためにハイブリッ
ドまたは融合遺伝子産物の生産を最適化すべく、ベクタ
ーの特性に応じて加水分解されたＤＮＡセグメントの５
′末端へ付刀目される。続く加水分解ＤＮＡセグメント
の再クローニングの後、リンカ−（ｉｉｎｋｅγ）が３
′末端へ会合され、そして遺伝子工学的に処理された最
終ＤＮＡ断片は適当なエンドヌクレアーゼで加水分解さ
れて、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルの電気
泳動法によってより大きなプラスミドＤＮＡから分離さ
れる。プロセシングされたｃＤＮＡセグメントの各々は
／　ｇｔ　１１　（ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓに〜１
１９８ページ）、ｐＣＱＶ２　ＣＱｕｅｅｎ、　Ｃ，に
よるＪ、Ｍｏ１．　ａｎｔｉ　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、　２．１〜１０ページ、１９８３年）、ｐＭ’
Ｂ９−誘導ベクター（ＩｉｏｂｅｒｔｓらによるＰｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

７６．７６０〜７６４ページ、１９７９年ン、またはｐ
ＢＲ３２２−誘導ベクター（ＪａｙらによるＰｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−５ｃｉ−７８，５５４３−５
５４８ペー；シ、１９８１年）などの発現ベクターの適
当な制限部位へ会合さＪしる。その組み換え発現ベクタ
ーはＰｅａｃｏｃｋらの上記文献に記載の方法によって
大腸菌ＲＩｔ　］へ導入される。プレプロＧＲＦＶＣ関
連したｃＤＮＡＤＮＡセグメントむ細菌コロニーはプロ
ーブＢとのＤＮＡノ・イブリダイゼーションまたは抗体
スクリーニング（ＹｏｕｎｇによびＤａτｉｓの上記文
献）によって選択され、そしてプレプロＧＲＦ遺伝子を
含む５０のノ・イブリダイゼーションー陽性コロニーが
その後の培養のために選択される。推定上のｃＤＮＡベ
クターの正確な構造は制限酵素による分析で確認される
。゛大腸菌中の細菌発現ベクターによりもたらされるプ
レプロＧＲＦに関連したペプチド類の生産のための細菌
コロニーを試験すべく、コロニー中のＧ　７’ｌ：　Ｆ
蛋白質配列の存在がラジオイムノアッセイで測定される
。溶菌液が調製され、ポＩＪＪ盆化ビニルのマイクロタ
イターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅ−１１）に
結合され、ＧＲＦ−！特異抗体へさらし、さらにＫｏｈ
ｌｅｒ＋　Ｇ、Ｙ、によるＨｙｂｒｉｄｏｍａ　’）’
ｅｃｈｎ−ｉｑｕｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ研究所、Ｃｏ１ｄ。

Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ’ａｒｂｏｒ、−ニー　ヨーク、１９
８０年に記載の方法により１２５Ｉ−標識蛋白質Ａを結
合させることによって抗原−抗体複合体を定量する。７
つのプレプロＧｌｔＦ−１０７コロニーのうちいくつか
と、１２のプレプロＧＲＩ’−１０８コロニーのうちい
くつかの溶菌物に′おけるＧＲＦペプチド“配列の同定
は、ＣＤＮＡがこれらのコロニーにおいてそれぞれ蛋白
質生産物を発現させることを示す。

プレプロＧＩＩＦ−１０７に関連した遺伝子で形質転換
され、かつ適当な特異抗体と反応するペプチドを有意量
産生する大腸菌のコロニーはその後の培養のために選択
され、プロプロＧＲＦ−１０８に関連した遺伝子で形質
転換された大腸菌のコロニーも同様である。こｔらのコ
ロニーの谷々から溶菌物が調製され、そして谷溶菌物は
排除クロマトグラフィー次いでポリアクリルアミドゲル
の電気泳動法によって分画される。１２０００ないし１
３０００の範囲にある分子量の蛋白質を含む排除クロマ
トグラフィー分画は、抗ＧＲＦ抗体で共有結合されたセ
ファロース（Ｓｅ７ｙｈαγｏｓｅ　）ビーズのカラム
での親和クロマトグラフ−Ｉ−により、および／捷たは
イオン交換クロマトグラフィーにより精製され、これら
の精製法は全て当技術分野にゴｄいて一般に既知である
。最後の精製は高圧液体クロマトグラフィー　（Ｇｕｉ
　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎ　らの上記文献）によって得られる
かもしれない。

回収された分画中のそれぞれのプレプロＧ　ＲＦ童は、
最初にＧＲＦと反応性の抗血清を各種の分画希釈液とイ
ンキュベートし、次いで１２５Ｉ−標識合成ＧＲＦ−４
４へさらすことによるラジオイムノアッセイで評価され
る。各棟の希釈液中のプレプロＧ　ＲＦの濃度は、抗体
−結合および非結合標識ＧＲＦの濃Ｋを対照（この場合
、ＧＲＦ抗皿消は最初既知濃度の未標識ＧｉτＦへさら
され、次いで既知濃度の標識Ｇ　ＲＦへさらされる）か
ら誘導される標準曲線と比較することによって算定され
る。この結果は精製分画が各々全蛋白質の約７５〜８０
％の範囲のプレプロＧ　ＲＦを含有することを示す。

プロセシングされていないプレプロＧ　ＲＦの２つの形
体、または細菌配列とＧ　ＲＦ配列とを含有するハイブ
リッド蛋白質はどちらもＧＲＦ活性をもつことが確認さ
れなかったが、それにもかかわらずこれらの物質は価値
ある化合物である。もし前駆体を動物に投与するなら、
その前駆体はその後生体内でＧ　ＲＦへプロセシングさ
れる場合のあることが立証されるかもしれない。いずれ
にしろ、プレプロＧＲＦはプロセシング酵素を含むヒト
視床下部抽出物へそのプレプロＧＲＦをさらすことによ
り試験管内でプロセシングされうる。ヒトプレプロＧ　
ＲＦ　ｆ　Ｇ　ＲＦヘプロセシングするヒト以外の動物
からの視床下部抽出物が見い出される可能性もある。プ
レプロＧＩＩＦの酵素的プロセシングは生体内育たば生
体外のどちらの場合にもＧＲＦ−４４の末端カルボキシ
ル基をアミド化することが予測されるだろう。このこと
はプレプロＧＲＦに存在するプロセシング配列を含１ず
がっＧ　ＲＩ’アミノ酸配列のみをコー１−する合成オ
リゴデオキシヌクレオチド（Ｃ比べて、天然遺伝子の明
らかに区別しえる利点となっている。プロセシングはま
た精製途中の分画において進めてもよく、その後分画は
上述のごとく精製される。アミン末端に細菌配列を含有
するハイブリッド蛋白質が細菌発現の産物である場合に
は、臭化シアンなどの薬剤による部分加水分解が試験管
内での組織抽出物によるその後のプロセシングのために
プレプロＧ　ＲＦを放出させるべく必要となるかもしれ
ない。

細菌での発現のために遺伝子工学的に処理されたプレプ
ロＧ　ＲＦ”遺伝子断片は、酵母や哺乳動物細胞のよう
な真核細胞系での発現にも使用することができる。酵母
菌の場合では、哺乳動物のインターフェロンは酵母ベク
ターＹＥｐＩＰＴ　＜Ｈｉｔ−ｚｅｍａｎらによる５ｃ
ｉｅｎｃｅ、２１９．６２０〜６２５ページ、１９８３
年）を使用して発現される時過当に分泌されてプロセシ
ングさすることか見い出された。プレプロＧ　ＲＦ’も
同様にプロセシングされて分泌されるかもしれず、この
ことは精製過程を助けることになり、その後プレプロＧ
ＲＦは上述のように試験管同プロセシング用基質として
役立つかもしれない。これとは別に、プレプロＧｌτＦ
をコードすることが見い出されたｃＤＮＡセグメントは
また、酵素がプレプロＧＲＦ−１０７およびプレプロＧ
ノ＜Ｆ−１０８をプロセシングするのに有効である場合
、ヒト視床下部細胞系またはラット脳下垂体細胞系に導
入することもできる。そのｃＤＮＡは５Ｖ４０−誘導ベ
クターのｐＳＶＺ属（Ａｈｔｌｌｉｇａｎ＋　ｉｉ、ｃ
、Ｍよび１３ｅｒｇ、Ｐ、によるＥｕ１ｃａｒｙｏｔｉ
ｃ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｙ、Ｇｔｕｚｍａ
ｎ編集、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ研死所
、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉ−ｎＱ　ｌ１ａｒｂｏｒ、ニュー
ヨーク）のような発現ベクターまたはより新しいレトロ
ウイルスベククー（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐ−ＶＣよる
５ｃｉｅｎｃｅ、２０９．１４２２〜１４２７ページ、
１９８０年）の中でクローン化される。次いでｃＤＮＡ
は微小注射、ＤＮＡトランスフェクションまたはウィル
ス感染によって視床下部細胞へ導入される。その導入ｃ
ＤＮ’Ａ′ｆｆ：安定に組み込んだ細胞はベクター系に
より提供される２つの特徴のある標識物質、（ｌｐｌ’
Ｊ、たはｎｅｏのための選択プロトコール（５ｅｌｅｃ
ｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって選択される。コロ
ニーによるＧ　ＩＩ　Ｆの産生は適当な抗体を使用する
上記−膜力法によって検定されるだろう。コロニーのう
ち数個は形質転換されていない細胞系により産生される
ＧＩｔＦ量よりも多くＧＮＦを産生ずるだろう。

こうして、単離されたブレプｏ　ＧＲＦ’　ｃ　Ｉ）Ｎ
　Ａは真核細胞中での形質転換に適していると考えられ
、そして少なくともいくつかの場合には発現生産物は宿
主細胞内の酵素により通常の方法でＧＲＦヘプロセシン
グされるだろう。

本発明はある好適な実施態様について記載したが、当業
者に明らかな変更が本発明の範囲から逸脱することなく
なされるだろう。例えば、ここに記載されたブｌ／プロ
ＧＲＦｃＤＮＡは２種類の天然に存在する遺伝子セグメ
ントの正確な構造のみを表わすと解される。わずかに修
飾された対立遺伝子は同様の機能を有する蛋白質をコー
ドすると予測され、そしてそのような遺伝子セグメント
および蛋白質は本発明の目的に対して均等物でめると考
えられる。１だ、わずかにイφ飾された蛋白乍（同族体
が合成されうろこと、芯よびそのような多くの修飾同族
体がブレブｏ　Ｇ　１１　ｆｉ’活性を示すと予測され
うることも仰らｎており、これらは同様に本発明の範囲
内であると考えられる。均等のコドンをもつＤＮＡは本
発明の範囲内であると考えられ、葦たプレプロＧＲＦ活
性を示す同族蛋白質をコードする合成遺伝子セグメント
も同様である。

第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番りＣ０７に
９９：叩

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）全んｐＧＲＦペプチド配列、該ｈｐＧＲＦペプチ
   ドのアばノ端に結合したペプチドセグメント、および該
   ｈｐＧＲ１ｊ’ペプチドのカルボキシル端に結合したペ
   プチドセグメントをコードするヌクレオチド配列を言む
   ｈｐＧＲＦ前駆体をコードするＤＮＡであって、該末端
   セグメントがｈｐＧｌｌＦペプチドからそれらの酵素的
   除去を行わしめる信号セグメントと、ｈｐＧＲＦカルボ
   キシル末端の酵素的アミド化を行わしめる信号セグメン
   トとを含むことを特徴とするＤ　Ａ’　Ａ　。 （２）前記ヌクレオチド配列配列が次のアミノ酸配列を
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 Ａｒｇ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ
   　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｔｈ　ｒ　−Ａ　
   ｓ　ｎ−８ｅ　ｒ　−Ｔ　ｙ　ｒ　Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５
   −Ｖａ　１−Ｌｅｖｂ−ＧＡ　１／−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｒ
   ｂ−Ｓ　ｅ　ｒ−ＡＬ　ａ−Ａｒ　ｇ　−Ｌｙ　５−Ｌ
   ｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−１１ｅ　−
   Ｍ　ｅ　ｔ　−８ｅ　ｒＧ　ｌ　？Ａ−Ａｒ　ｇ　−Ｇ
   　ｌ　１１−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａ
   ｒ　ｇ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ （３）前記ヌクレオチド配列が次のアミノ酸配列を特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 Ｍｅ　ｔ−Ｐｒ　ｏ−Ｌｅ　ｕ−Ｔｒｐ−Ｖａ　１−Ｐ
   ｈ　ｅ　−Ｐｈ、　ｅ　−Ｐｈ　ｅ−Ｖａ　ｌ−１１ｅ
   −Ｌｅ　ｕ−Ｔｈ、ｒ−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ−Ａｓｎ−
   Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−
   Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
   Ａｒｇ−Ｍｅ　ｔ　−Ａｒｇ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙ　ｒ　−
   Ａ　１．ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌ　ａ−１１ｅ−Ｐｈ　ｅ　
   −Ｔｈ、ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｓ　ｅ　ｒ−Ｔんｒ−Ａｒ　ｇ
   −Ｌｙ　５−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｌ　ｙ　−Ｇ　ｌ
   　ｎ　−Ｌ　ｅ　？Ａ−８ｅ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ
   　ｇ−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｅｒｂ−Ｌｅｕ、−Ｇｔｎ−Ａｓ
   ｐ−１１ｅ−Ｍｅ　ｔ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｉ
   ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−８ａｔ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｇ　ｌ
   　ｕ−Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　
   ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ−Ｌｅｖ。 −Ｇｌ　？／１−Ａｒ　ｇ−ＧＡ　ｎ−Ｖａ　１−Ａｓ
   　ｐ−８ｅ　ｒ−Ａ（ｅ　ｔ　−Ｔｒ　ｐ−Ａ　ｌ　ａ
   −Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−−Ｌｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ
   −Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−８ａｒ−１１ｅ
   −Ｌｅｒｂ−Ｖａ、１−Ａｌａ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ
   ｉｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉ　ｓ−Ｒ−Ａｒｇ−Ａｌｌ？Ｌ　−
   Ｓ　ｅ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ （但し、ＲはＳｅｒまたはデス−Ｒで多る）（４）前記
   ヌクレオチド配列が次の配列を含む特許請求の範囲第１
   〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ。 ＣＧＧ　ＣＧＧ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＴ
   ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　Ｇ
   ＴＧＣＴＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＣＣＣＧ
   ＣＡＡＧＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＡＴＧ　
   ＡＧＣＡＧＧＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＣ
   ＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡ　ＣＧＡＧＣＡ　ＡＧＧ　Ｇ
   ＣＡ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴＧＴ （５）前記ヌクレオチ１〜配列が次の配列を含む特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ。 ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＩ”Ｔ
   ＣＴＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＣ１’ＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣ
   ＡＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡ　ＣＣＴ
   　ＣＣＣＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ　ＡＴＧ
   　ＣＧＧ　ＣＧＧＴＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＴ
   ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　Ｇ
   ＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧＣＣＡＧＣ７’Ｇ　ＴＣＣＧＣＣＣ
   ＧＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧ
   　ＡＧＣＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＡＧＡＧ　ＡＧ
   ＣＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＣＡＡＧ
   Ｇ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＡＧ
   　ＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡ
   　ＣＡＡ　ＡＡＧＣＡ、Ａ、ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　
   ＧＡＧ　ＡＧＣＡＴＣＣＩ’ＧＧＴＧ　ＧＣＣＣＴＧ　
   ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣＮＮＮＡＧＧ　ＡＡＣ
   ＴＣＣＣＡＧ　ＧＧＡ （但し、ＮＮＮｒｔｓＡＧＣ’！たはテスーＮＮＮ″′
   ｃある） （６）　形質転換された微生物または細胞培養中で前記
   ＤＮＡ配列によりコートされたアミノ酸配列を発現する
   ことができる発現ベクター内に挿入された特許請求の範
   囲第１〜５項のいずれかに記載のＤＮＡ０ （７）前記ＤＮＡ配列の生産物がコートされたアミノ酸
   配列ｔもつポリペプチドとして発現される、形質転換さ
   れた微生物または細胞培養内に挿入された特許請求の範
   囲第６項に記載の発現ベクター。 （８）　コードされたアミノ酸配列または酵素的にプロ
   セシングされたその断片をもつ特許請求の範囲第７項に
   記載の微生物または細胞培養中で発現されたポリペプチ
   ド。 （９）全ｈｐＧＲＦペプチド配列、該ｌ乙ｐＧＲＦペプ
   チドのアミン末端に結合したペプチドセグメント、およ
   び該ｈｐＧＲＦペプチドのカルボキシル末端に結合した
   ペプチドセグメントをコードｆるＤＮＡヌクレオチド配
   列であって、該末端セグメントがｈｐＧＲＦペプチドか
   らそれらの酵素的除去を行わしめる信号セグメントと、
   ｈｐＧＲＦカルボキシル末端の酵素的アミド化を行わし
   める信号セグメントとを含む前記ＤＮＡヌクレオチド配
   列を用意すること： 該ＤＮＡ配列を別のＤＮＡ配列に結合させて、形質転換
   された微生物または細胞培養中で該ＤＮＡ配列によりコ
   ードされたアミノ酸配列をもつポリペプチドを発現する
   ことができる発現ベクターを作ること； 該発現ベクターを用いて微生物葦たは細胞培養の細胞を
   形質転換させること： 該形質転換された細胞を培養すること；および該ＤＮＡ
   配列によりコードされたアミノ酸配列葦たは酵素的にプ
   ロセシングされたその１舌片をもつポリペプチドを得る
   こと。 よりなるポリペプチドの産生方法。 （樽　前記ヌクレオチド配列が次のアミノ酸配列を特徴
   とする特許請求の範囲第９項に記載の方法。 Ａｒ　ｇ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　
   ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ
   ｎ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、−Ｌｙｓ−１１ａＬ−Ｌ
   ｅ　ｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−８ｅ　ｒ　−
   Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｌ　ｅ　ｑｂ−
   Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−１ｌ　ｅ　−Ｍｅ
   　ｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−ＧＬ
   ｕ−８ａｒ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ１　ｕ−Ａｒ　ｇ
   −ＧＡ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　−Ａ　ｌ　ａ−
   Ａｒｇ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒ（７ （旬　前記ヌクレオチド配列が次のアミノ酸配列を特徴
   とする特許請求の範囲第９項に記載の方法。 Ｍｅ　ｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｒｔ、−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｈ
   ｅ−Ｐｈｅ　−Ｐｈ、ｅ−ＶａＬ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ｔ
   ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−８ａ　ｒ　−８ｅ　ｒ
   −Ｈｉ　５−Ｃｒ１５−８ｅ　ｒ−Ｐｒ　ｏ−Ｐｒ　ｏ
   　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｗ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
   −Ｍｅ’ｔ−Ａｒｇ”Ａｒ　ｇ−Ｔｙ　ｒ−Ａｌ　ａ−
   Ａｓ　ｐ　−Ａ　ｌ　ａ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ　ｅ　−Ｔｈ
   ｒ−Ａｓｎ−８ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　ｓ−
   Ｔｌａｌ−Ｌａｗ−Ｇ１７１−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ
   −Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌａｗ−Ｇｌｎ−
   Ａｓｐ−Ｉ　ｌ　ａ　−Ｍｅ　ｔ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ
   　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇ・ｌ　ｕ
   　−Ｓ　ｅ　ｒ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｇ　ｌ　ｕ
   −Ａｒ　ｇ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒ　ｇ　
   −Ａ　ｌ　ａ−Ａｒｇ−Ｌｅｒｂ−Ｇｌ　ｙ−Ａｒ　ｇ
   −Ｇｌ　ｎ−Ｖａ　１−Ａｓ　ｐ−８ｅ　ｒ−Ｍｅ　ｔ
   　−Ｔｒｐ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｎ７
   Ｌｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
   Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｉｔ　ｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
   Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｒ−Ａｒｇ
   −ＡＳｎ−８ｅ　ｒ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ （但し、ＲはＳｅγまたはテスーＲである）（２）前記
   ヌクレオチド配列が次の配列を含む特許請求の範囲第９
   〜１１項のいずれかに記載の方法。 ＣＧＧ　ＣＧＧ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴＧＣＣＡ’ｌ
   ’ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　
   ＧＴＧＣＴＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＣＣＣ
   ＧＣＡＡＧＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＡｉ’
   Ｇ　ノＬＧＣＡＧＧＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　
   ＡＧＣＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＧＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＣＡ　
   ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧＩ’ＧＴ （ｌａ　前記ヌクレオチド配列が次の配列を営む特許請
   求の範囲第９〜１１項のいずれかＩＣ記載の方法。 ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＴＴＣ
   ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＩ’ＣＡＧＣＡ
   ＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡ　ＣＣＴ　
   ＣＣＣＣＣＴ　Ｔ’ｒＧ　ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ　ＡＴＧ
   　ＣＧＧ　ＣＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴ
   ｔＡＣＣＡＡＣＡ、ＧＣＴＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＴＧ
   　Ｃ１’Ｇ　ＧＧＣＣＡＧＣＴＧ　ＴＣＣＧＣＣＣＧＣ
   ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧ　Ａ
   ＧＣＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧＧＧＡＧＡＧ　ＡＧＣＡＡ
   ＣＣＡＡ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＣＡＡＧＧ　Ｇ
   ＣＡ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＡＧＧＴＡ
   ＧＡＣＡＧＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ
   ＡＡＧＣＡＡ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＡＧ
   ＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧ　ＧＣＣＣＴＧ　Ｃ７’Ｇ　ＣＡ
   Ｇ　ＡＡＧ　ＣＡＣＮＮＮＡＧＧ　ＡＡＣＴＣＣＣＡＧ
   　ＧＧＡ （但し、ＮＮＮはＡＧＣまたはテスーＮＮＮである） （２）前記ポリペプチドがヒトプレプロＧＲＦ（）Ｌｐ
   ｒｅｐｒｏ　ＧＲＦ　）である特許請求の範囲第９〜１
   ３項のいずれかに記載の方法。 （至）前記ポリペプチドがカルボキシル末端でアミド化
   されかつ酵素的にプロセシングされた３２〜７５アミノ
   酸残基のヒトプレプロＧＲＦでらる、特許請求の範囲第
   ９〜１３項のいずれかに記載の方法。