KR100271725B1 - cDNA 라이브러리의 작제 방법 및 신규의 폴리펩티드와 그것을 암호하는 DNA - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (1) 시그널 펩티드에 대해 선택성이 있는 효율적인 cDNA 라이브러리의 작제 방법 및 (2) 스트로마 세포주가 생산하는 89 개의 아미노산(시그널 펩티드도 포함)으로 이루어진 신규의 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 암호하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 상기 (1)의 방법에 의해 미지의 유용한 폴리펩티드를 효율적으로 발견할 수 있으며 (2)의 폴리펩티드는 빈혈, 백혈구 감소증, 감염증 등의 예방 또는 치료제로서 사용된다.

Description

cDNA 라이브러리의 작제 방법 및 신규의 폴리펩티드와 그것을 암호하는 DNA
제1도는 본 발명의 씨디엔에이(이하, cDNA 라고 함) 라이브러리의 작제 방법에 대한 개요도.
제2도는 플라스미드 벡터 PcDL-SRα의 구성도.
제3도는 hG-CSF의 EcoRI-SacI 단편의 작제 방법에 대한 개요도.
제4도는 hTac cDNA의 SacI-KpnI 단편의 작제 방법에 대한 개요도.
제5도는 pSGT 및 pSRT의 구성도.
제6도는 hRARα의 EcoRI-SacI 단편의 작제 방법에 대한 개요도.
제7도는 hG-CSF-hTac 융합 단백질의 막에서의 발현을 나타낸 FACS의 히스토그램.
제8도는 hRAR-hTac 융합 단백질의 막에서의 발현을 나타낸 FACS의 히스토그램.
제9도는 실시예의 cDNA 라이브러리의 작제 방법에 대한 개요도(전반).
제10도는 실시예의 cDNA 라이브러리의 작제 방법에 대한 개요도(후반).
제11도는 본 발명의 폴리펩티드(부분)의 소수성 프로파일.
본 발명은 cDNA 라이브러리의 작제 방법 및 신규의 폴리펩티드와 그것을 암호하는 DNA에 관한 것이다. 더욱 상세히 설명하면, 본 발명은 시그널 펩티드에 대해 선택성이 있는 더욱 효율적인 cDNA 라이브러리의 작제 방법 및 특정 스트로마 세포주가 생산하는 신규의 폴리펩티드와 이 폴리펩티드를 암호하는 DNA에 관한 것이다.
종래에는, 임의의 특정 폴리펩티드(예를 들면, 증식 및/또는 분화 인자) 또는 그것을 암호하는 DNA를 수득하려고 할 경우, 조직이나 세포 배양액중에서 목적하는 생물 활성을 확인하고, 이어서 폴리펩티드의 단리 정제를 거쳐, 유전자를 클로닝하는 방법 또는 그 생물활성을 지표로 하여 유전자를 발현 클로닝하는 또 다른 방법이 일반적으로 이용되어 왔다.
그러나, 생체내에서 발생하는 다수의 생리 활성 폴리펩티드는 다양한 생물 활성을 갖고 있는 경우가 많으므로, 임의의 하나의 활성을 지표로 하여 유전자를 클로닝한 결과, 그것이 공지의 폴리펩티드와 동일한 것으로 이후에 판명된 사례가 증가하고 있다. 또한, 생체내 생리 활성 폴리펩티드는 대부분이 극히 미량밖에 분비되지 않으므로 단리, 정제 및 생물 활성의 확인이 곤란하다.
근래에는, cDNA의 작제 기술이나 서열 결정 기술이 급속히 발전하여, 다량의 cDNA의 서열을 신속히 결정할 수 있게 되었다. 그래서 이들 기술을 이용하여, 각종 세포나 조직에서 cDNA 라이브러리를 작제하고, 무작위로 cDNA를 클로닝하여 이의 염기 서열을 결정하며, 해당되는 폴리펩티드를 발현시킨 다음, 그 생리 기능을 해석하는 방법이 개발되고 있다. 이 방법은 생화학적, 유전학적인 해석을 일체 필요로 함이 없이, 유전자를 클로닝하여, 그 염기 서열의 정보를 얻을 수 있다는 특징을 가지고 있지만 목적하는 유전자를 발견하는데 있어 우발적 요소가 크다.
본 발명자들은 지금까지 조혈계나 면역계에서 작용하는 증식 분화 인자의 유전자 클로닝을 연구해왔다. 그리고 증식 분화 인자(예를 들면, 각종 시토킨 등)와 같은 분비 단백질이나 그 수용체와 같은 막 단백질(이하, 이들을 총칭해서 분비 단백질등이라고 함)의 대부분이 그 N 말단에 시그널 펩티드로 불리우는 서열을 가지고 있다는 사실에 착안하여 시그널 펩티드를 암호하는 유전자를 효율적이고 선택적으로 클로닝하는 방법을 예의 검토해왔다. 그 결과, N 말단 단편을 효율적으로 증폭시켜, 시그널 펩티드의 유무를 간단히 검색할 수 있는 방법을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 시그널 펩티드를 포함할 가능성이 높은 cDNA 단편의 양 말단에 서로 다른 제한 효소 부위를 포함하는 링커(linker)를 결합시키고, 이 단편만을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR 법)으로 신속하게 대량 작제하여 시그널 펩티드를 포함할 가능성이 높은 단편의 존재 비율을 더욱 높였다. 다음에, 많은 분비 단백질은 그 시그널 펩티드를 다른 분비 단백질의 해당 시그널 펩티드로 치환하여도 분비되거나 또는 세포막상에 발현한다는 성질을 이용하여, 시그널 펩티드를 암호하는 DNA 부분이 결실된 공지의 분비 단백질의 DNA를 삽입한 발현 벡터에 상기 단편을 도입하여, 공지의 분비 단백질등이 세포막상 또는 세포외에서 발현된다면, 시그널 펩티드에 해당하는 cDNA 단편이 잘 도입되었음을 알 수 있는 확실하고 간편하게 검색할 수 있는 반음계를 확립했다.
폴리머라제 연쇄 반응은 종래부터 특정 DNA 단편을 대량으로 증폭시키는 방법으로서 공지되어 왔다. 또한, 많은 분비 단백질등은 시그널 펩티드가 다른 분비 단백질등의 것이라도 동일하게 발현된다는 사실이 잘 알려져 있다. 그러나, 이러한 사실들을 조합하여 시그널 펩티드를 선택적으로 클로닝하는 방법에 응용하는 것은 전혀 알려진 바 없으며, 또한 예상된 바도 없다.
또한, 본 발명은 조혈계 세포에서 수득한 신규의 폴리펩티드 및 그것을 암호하는 DNA에 관한 것이기도 하다. 조혈계 세포에서는 인터류킨을 비롯하여 각종 증식 및/또는 분화 인자가 분비되고 있는 것으로 알려져 있다. 이것은 지금까지 발견된 분비 인자 이외에도 동일한 작용, 또는 새로운 작용을 갖는 인자가 분비되고 있을 가능성을 시사하고 있다.
본 발명자들은 이 점에 주목하여 조혈계 세포가 생산하고 있는 신규의 인자(폴리펩티드)를 발견하는 것을 목적으로 하여 본 발명의 제1 주제의 방법을 사용하여 검색한 결과, 아주 신규한 폴리펩티드 및 그것을 암호하는 DNA를 발견하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 폴리펩티드 및 그것을 암호하는 DNA 와 동일하거나 또는 상동성이 높은 서열을 갖고 있는 폴리펩티드를 컴퓨터로 검색하였으나 결과는 전무하였다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 및 그것을 암호하는 DNA는 완전히 신규한 것이라는 사실이 확인되었다.
또한 상동성 검색의 결과, 본 발명의 폴리펩티드는 Cys-X-Cys(식중 X는 임의의 아미노산을 나타냄)의 모티브를 갖는 케모킨 부류(chemokine family)의 일종임이 확인되었다.
따라서 본 발명의 제1 목적은 시그널 펩티드의 cDNA 라이브러리를 효율적으로 작제하는 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 시그널 펩티드의 cDNA 라이브러리의 작제 방법은 다음의 공정으로 구성된다.
(1) 대상으로 하는 세포에서 단리한 mRNA에 대한 단일쇄 DNA를, 랜덤프라이머를 사용하여 합성한 다음, 수득된 단일쇄 DNA의 3′ 말단에 올리고 dT를 부가하고,
(2) 상기 (1) 에서 수득한 단일쇄 DNA에 대한 이중쇄 DNA를, 특정 제한 효소(효소 I) 부위를 연결한 폴리 A 올리고머를 프라이머로서 사용하여 합성하고,
(3) 상기 (2) 에서 수득한 이중쇄 DNA를 절단하여, 그 단편들을 크기에 따라 분획한 다음, 효소 I 과 상이한 특정 제한 효소(효소 II) 부위를 포함하는 링커를 연결하여 다시 분획하고.
(4) 효소 I 부위를 포함하는 프라이머와 효소 II 부위를 포함하는 또 다른 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(이하, PCR 이라고 함)에 사용하여, 증폭된 cDNA를 효소 I - 효소 II로 분해한 다음 분획하고,
(5) 수득된 cDNA 단편을 시그널 펩티드를 제거한 공지의 분비 단백질등의 유전자의 상류에 연결하고, 진핵세포 발현 플라스미드 벡터에 삽입한 다음 형질전환하는 공정으로 이루어진다.
이상의 각 공정의 개요도는 제1도에 도시되어 있다.
각 공정을 상세히 설명하면, 공정(1)에서는 대상으로 하는 세포를, 필요에 따라 적당한 자극제로 자극한 다음, 오카야마 H(Okayama H.) 등의 방법[Method in Enzymology, 154, 3(1987)에 기재]에 따라 mRNA의 단리를 수행한다.
대상으로 하는 세포로는 분비 단백질을 생산할 가능성이 있는 세포라면 어떠한 것이라도 좋다. 신경계 세포나 조혈계 세포를 예로 들 수 있다. 랜덤 프라이머를 사용하여 단일쇄 cDNA를 합성하는 것은 공지의 방법에 의해 행해진다. 랜덤 프라이머는 시판하는 것을 사용한다. 이어서 말단 데옥시트랜스퍼라제로 단일쇄 cDNA의 3′ 말단에 올리고 dT를 부가한다.
공정(2)의 이중쇄 cDNA의 합성도 공지의 방법에 의해 행해진다. 프라이머로 작용하는 폴리 A 올리고머에 연결되는 제한 효소(효소 I) 부위와 다음의 공정 (3)에서 사용되는 제한 효소(효소 II) 부위는 서로 상이한 것이면 어떠한 것을 사용해도 된다. 효소 I로서 EcoRI, 효소 II 로는 SacI을 사용하는 것이 바람직하다.
공정(3)은 초음파 처리에 의해 cDNA 길이가 평균 300 bp로 되도록 이중쇄 DNA를 단편화하고, 수득한 단편을 아가로스 젤 전기영동(AGE)에 의해 200∼500 bp의 cDNA로 분획한 다음, T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활화하고, 효소 II 어댑터를 연결하여, 재차, 아가로스 젤 전기 영동에 의해 cDNA를 200∼500 bP의 DNA로 분획함으로써 행해진다. 효소 II 는 상기한 바와 같이 효소 I 과 상이한 것이라면 어떠한 것이라도 좋다. 본 공정에 의해 시그널 펩티드를 포함하는 cDNA 단편은 효소 I 과 효소 II 사이의 부분에 존재할 가능성이 높아진다.
공정(4)에서는 시그널 펩티드를 포함하는 cDNA 단편이 효소 I 과 효소 II 사이의 부분에 존재할 가능성을 더욱 높이기 위해 PCR을 수행한다. PCR 은 잘 알려진 방법이며, 그것을 위한 자동화 장치도 시판되고 있다. 25∼30 회의 증폭이면 충분하다. 증폭된 cDNA 는 효소 I - 효소 II로 분해하고, 아가로스 젤 전기 영동에 의해 200∼500 bP의 cDNA로 분획한다.
공정(5)는 진핵 세포 발현용 플라스미드 벡터에, 시그널 펩티드가 제거된 공지의 분비 단백질등의 유전자(리포터 유전자라고 함)와 그 상류에 (4)에서 수득한 cDNA 단편을 넣어 형질전환하는 공정이다. 여기서 진핵세포 발현용 플라스미드 벡터로는 여러가지의 것이 알려져 있지만, 예를 들면 대장균내에서 작용하는 pcDL-SRα나 PcEV-4가 사용된다.
또한, 리포터 유전자로는 모든 종류의 가용성 분비 단백질 및 막 단백질의 성숙 단백질 부분의 유전자가 사용된다. 또한 이들 리포터 유전자는 항체법 등의 어떠한 방법으로도 그 발현이 확인될 수 있는 것이라야 한다. 적절하게는 사람 IL-2 수용체 α 유전자가 사용된다. 형질전환을 위한 숙주 대장균주로는 이미 많은 것이 알려져 있으며, 어떠한 것을 사용해도 되지만, DH5의 감응(competent) 세포[Gene, 96, 23(1990)에 기재]가 바람직하다. 형질전환체는 통상의 방법에 의해 배양되며, 본 발명의 cDNA 라이브러리가 수득된다.
본 발명의 cDNA 라이브러리 작제 방법에서는 라이브러리중에 시그널 펩티드를 암호하는 유전자 단편을 포함할 가능성은 높지만 모든 클론이 이 단편을 포함하고 있는 것은 아니며, 또 모두가 미지의(신규의) 시그널 펩티드를 암호하는 유전자 단편인 것은 아니다. 그러므로 이후 이 라이브러리에서 미지의 시그널 펩티드를 암호하는 유전자 단편을 스크리닝할 필요가 있다.
즉, cDNA 라이브러리를 적당한 크기의 푸울(pool) 세분화하여, 발현계에 넣는다. 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계로는 포유동물 세포(예를 들면, 원숭이 COS-7 세포, 중국산 햄스터-CHO 세포, 마우스 L 세포 등)를 들 수 있다. 형질감염은 공지의 방법, 예를 들면 DEAE-덱스트란법에 의해 행해진다. 배양후, 리포터 유전자의 발현의 유무를 판정한다. 리포터 유전자는 시그널 펩티드가 다른 분비단백질에 고유한 것이라 하더라도 발현되는 것으로 알려져 있다. 즉, 리포터 유전자가 발현되었다고 하는 것은 라이브러리중에 어떤 분비 단백질의 시그널 펩티드가 들어 있음을 나타낸다. 양성을 나타내는 푸울은 더욱 세분화하여, 단일 클론을 얻기까지 발현과 판정을 반복한다. 리포터 유전자 발현의 판정은 리포터 유전자의 종류에 따라 다르지만 형광 표지 항체법, 효소 연결 면역흡착분석 법(ELISA 법), 방사성 면역 분석법(RIA 법) 등에 의해 행해진다.
다음에, 단리한 양성 클론에 대해, 염기 서열을 결정하고, 미지의 단백질을 암호하는 것으로 밝혀진 cDNA에 대해서는 그것을 프로브로 사용하여 전 길이의 클론을 단리하며, 전 길이의 염기 서열을 결정할 수 있다. 이러한 조작은 당업자에게 모두 공지인 방법으로 행해진다. 예를 들면, 염기 서열의 결정은 맥삼·길버트(Maxam-Gilbert)법이나 디데옥시·터미네이터법에 의해 행해진다. 또한, 전 길이의 서열 결정은 Molecular Cloning[Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저. Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1989 년에 발행]에 기재된 방법에 따라 행해진다.
본 발명의 제2 목적은 전술한 제1 목적에 표시된 방법에 의해 발견된, 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 그 동족체, 그 서열의 단편, 및 그 동족체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호하는 DNA에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 및 서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편을 갖는 DNA에 관한 것이다.
특히 본 발명은
(1) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,
(2) 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA,
(3) 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 및
(4) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.
실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란 일반적으로 생산시 폴리펩티드의 90% 이상, 예를 들면 95%, 98% 또는 99% 가 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 동족체란 일반적으로 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 예를 들면 40개, 60개 또는 100개의 연속된 아미노산 영역에서, 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성이 있는 것으로, 그와 같은 동족체는 이하 본 발명의 폴리펩티드로서 기재된다.
또한, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 단편, 또는 그 동족체의 단편은 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 15개 이상의 아미노산, 예를 들면 20개, 25개, 30개 40개, 50개 또는 60개의 아미노산 부분을 의미한다. 특히 바람직한 단편은 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열중, 첫번째에서 70 번째까지의 서열로 이루어진 단편 또는 그 동족체이다.
서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA에 선택적으로 하이브리드하는 DNA 란 일반적으로 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 예를 들면 40개, 60개 또는 100개의 연속된 염기 서열 영역에서, 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성이 있는 것으로, 그와 같은 DNA는 이하 본 발명의 DNA로서 기재된다. 그와 같은 DNA 중 특히 바람직한 것은 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열중 139 번째부터 348 번째까지의 서열로 이루어진 DNA 또는 그 단편이다.
서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA의 단편이란 10개 이상의 염기, 바람직하게는 15개 이상의 염기, 예를 들면 20개 25개, 30개 또는 40개의 염기 부분을 의미하며, 그와 같은 단편도 본 발명의 DNA에 포함된다.
본 발명의 DNA는 유전자 재조합법, 합성법 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에는 본 발명의 DNA로 이루어진 복제 또는 발현 벡터가 포함된다. 벡터로서는 ori 영역과, 필요에 따라 상기 DNA의 발현을 위한 프로모터, 프로모터의 제어 인자 등으로 이루어진 플라스미드, 비루스 또는 파지 벡터를 예로 들 수 있다. 벡터는 1종 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자, 예를 들면 암피실린 내성 유전자를 포함하고 있어도 된다. 벡터는 생체외에서, 예를 들면 DNA에 해당하는 RNA를 작제하기 위해 또는 숙주 세포를 형질 전환시키기 위해 사용된다.
또한, 본 발명에는 서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열 또는 그 오픈 리딩 프레임을 갖는 DNA를 포함한 본 발명의 DNA를 복제 또는 발현시키기 위한 벡터로 형질전환된 숙주 세포도 포함된다. 세포는 벡터에 적합한 것중에서 선택되며 세균 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 예로 들 수 있다.
본 발명의 DNA는 안티센스 RNA(DNA)를 작제하기 위해 안티센스의 방향으로 상기 벡터에 삽입된다. 안티센스 RNA(DNA)는 또 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 이와 같이 해서 수득된 안티센스 RNA(DNA)는 세포중에서 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 생산량을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것으로 이루어진 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법도 포함된다. 더욱 바람직하게, 그와 같은 방법은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되고, 계속해서 숙주 세포에서 분비되는 조건하에서 행해진다.
또, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체가 포함된다. 또한 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체의 제조 방법이 포함된다. 모노클로널 항체는 항원으로서 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 단편을 사용하여, 통상의 하이브리도마 기술에 의해 제조된다. 또, 폴리클로널 항체는 숙주, 동물 예를 들면 래트 또는 토끼에게 본 발명의 폴리펩티드를 접종시키고, 감작된 혈청을 회수하는 것으로 이루어진 통상의 방법에 의해 제조된다.
본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 항체와, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체로 이루어진 약제 조성물도 포함된다.
본 발명에는 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 항체를 사용한 사람 또는 포유동물의 치료 방법 또는 진단 방법이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드에는 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것 이외에, 그 일부가 결실된 것(예를 들면 성숙 단백질 부분만, 또는 성숙 단백질중 생물활성의 발현에 필수적인 부분으로만 이루어진 폴리펩티드), 그 일부가 다른 아미노산으로 치환된 것(예를 들면 물성이 유사한 아미노산으로 치환된 것), 및 그 일부에 다른 아미노산이 부가되거나 삽입된 것도 포함된다.
잘 알려져 있는 바와 같이, 하나의 아미노산을 암호하는 코돈에는 1∼6 종류(예를 들면 Met는 1 종류, Leu 는 6 종류)가 알려져 있다. 따라서 폴리펩티드의 아미노산 서열은 바뀌지 않으면서 DNA의 염기 서열을 바꿀 수 있다.
(2) 에서 특정되는 본 발명의 DNA에는 (1)의 서열 번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 암호하는 모든 염기 서열군이 포함된다. 염기 서열을 바꿈으로써 폴리펩티드의 생산성이 향상되는 경우도 있다.
(3) 에서 특정되는 DNA는 (2) 에서 표시되는 DNA의 일 태양으로, 천연형 서열을 나타낸다.
(4)에 표시되는 DNA는 (3) 에서 특정되는 DNA에 천연의 비해독 부분을 가한 서열을 나타낸다.
시그널 펩티드는 해독 개시 아미노산 Met의 바로 뒤에 있는 소수성이 풍부한 영역이다. 이 폴리펩티드의 시그날 펩티드는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열중, 첫번째의 Met에서 19 번째의 Ser 까지로 추정된다. 생물 활성의 발현에 실질적으로 관여하는 영역은 시그날 펩티드를 제외한 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 부분(성숙 단백질 부분)에 있고, 따라서 시그널 펩티드는 활성에 관여하지 않는다.
서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA는 본 발명의 제1 목적에 기재된 방법에 따라 작제할 수 있다.
서열 번호 2 및 3으로 표시되는 염기 서열이 일단 확정되면, 본 발명의 DNA를 화학적으로 합성할 수 있다. 대안적으로, 이 염기 서열의 단편을 화학 합성하고, 이것을 프로브로 하여 하이브리드화시킴으로써, 본 발명의 DNA를 수득할 수 있다 또한, 상기 DNA를 함유하는 벡터 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 이 숙주를 증식시킴으로써, 목적하는 DNA를 필요량 수득할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 수득하는 방법으로는
(1) 생체 조직 또는 배양 세포에서 정제 단리하는 방법,
(2) 펩티드의 화학적 합성방법 또는
(3) 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하는 방법 등을 들 수 있지만 공업적으로는 (3)에 기재한 방법이 바람직하다.
유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계(숙주-벡터계)로는 예를 들어 세균 효모, 곤충 세포 및 포유동물 세포의 발현계를 들 수 있다.
예를 들어 대장균에서 발현시키는 경우에는 성숙 단백질 부분을 암호하는 DNA의 5′ 말단에 개시 코돈(ATG)를 부가하고, 이에 의해 수득된 DNA를, 적당한 프로모터(예를 들면 trp 프로모터, 1ac 프로모터, λPL프로모터, T7 프로모터 등)의 하류에 결합시켜, 대장균내에서 작용할 수 있는 벡터(예를 들면 pBR322, pUC18, p&C19 등)에 삽입해서 발현 벡터를 작제한다. 다음에 이 발현 벡터로 형질전환된 대장균(예를 들면, E. coli DH1, E. coli JM 109, E. coli HB 101 주 등)을 적당한 배지에서 배양하고, 배양된 세포에서 목적하는 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 또 박테리아의 시그널 펩티드(예를 들면 pe1B의 시그널 펩티드)를 이용하면 세포질중에 목적하는 폴리펩티드를 분비할 수도 있다. 또한, 다른 폴리펩티드와의 융합 단백질(fusion protein)을 생산할 수도 있다.
또, 포유동물 세포에서 발현시키는 경우에는, 예를 들면 서열번호 3에 표시된 염기 서열을 암호하는 DNA를 적당한 벡터(예를 들면, 레트로비루스 벡터, 파피로머비루스 벡터, 백시니어비루스 벡터. SV4O계 벡터 등)중 적당한 프로모터 (예를들면 SV4O 프로모터, LTR 프로모터, 메타로티오네인 프로모터 등)의 하류에 삽입하여 발현 벡터를 작제한다. 다음에, 수득된 발현 벡터로 적당한 포유동물 세포(예를 들면, 원숭이 COS-7 세포, 중국산 햄스터-CHO 세포, 마우스 L 세포 등)를 형질전환하고, 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하면, 그 배양액중에 목적하는 폴리펩티드가 분비될 수 있다. 이상과 같이 해서 수득된 폴리펩티드는 일반적인 생화학적 방법에 의해 단리 정제할 수 있다.
본 발명의 제1 목적인 cDNA 라이브러리의 작제 방법을 사용하면 분비 단백질 또는 막 단백질의 시그널 펩티드를 암호하는 DNA를 효율적으로 선택할 수 있고, 나아가서는 미지의 유용한 단백질을 효율적으로 발견할 수 있다.
본 발명의 제2 목적인 신규의 폴리펩티드는 스트로마 세포주가 생산, 분비하는 것으로, 조혈 간세포의 생존 및 증식과, B 세포계나 미엘로이드 세포계의 증식 및 분화에 관련된 생물 활성을 갖는 동시에, 호중구의 유주 활성도 갖고 있다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 그 자체로 빈혈, 백혈구 감소증, 감염증 등의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
또, 이 폴리펩티드의 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체를 사용하면, 생체내에서의 상기 폴리펩티드의 정량을 수행할 수 있고, 이를 이용하여 이 폴리펩티드와 질환과의 관계의 연구 또는 질환의 진단 등을 수행할 수 있다. 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체는 이 폴리펩티드 또는 그 단편을 항원으로 사용하여 통상의 방법에 의해 작제할 수 있다.
본 발명의 DNA는 유용성이 클 것으로 기대되는 본 발명의 폴리펩티드 생산시 중요하고 필수적인 주형으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 유전병의 진단이나 치료(유전자 결손증의 치료 또는 안티센스 DNA(RNA)에 의해 폴리펩티드의 발현을 중단시키는 것에 의한 치료 등)에 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 DNA를 프로브로 사용하여 게놈(genomic) DNA를 분리할 수 있다. 마찬가지로 본 발명의 DNA와 상동성이 높은 사람의 관련 폴리펩티드의 유전자, 또 사람 이외의 생물에 있어서의 본 발명의 폴리펩티드와 상동성이 높은 폴리펩티드의 유전자를 분리하는 것도 가능하다.
[실시예]
이하에서는 실시예 및 참고예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
[참고예 1]
[플라스미드 pcDL-SRα-hG-CSF-hTac(pSGT) 및 플라스미드 pcDL-SRα-hRARα-hTac(pSRT)의 작제와 발현]
hG-CSF(사람 과립구 콜로니 자극 인자, 시그널 펩티드를 갖는 단백질의 대표예) 또는 hRARα(사람 레티노인산 수용체α, 시그널 펩티드를 갖지 않는 단백질의 대표예)와 hTac(사람 IL-2 수용체α, 리포터 유전자로 사용)의 융합 단백질을 암호하는 cDNA를, SRα 프로모터를 갖는 진핵세포 발현 플라스미드 벡터 PcDL-SRα(Mol Cell. Biol.. 8, 466(1988)에 기재되어 있지만 국립 예방 위생 연구소의 다케베 유타카씨가 제공한 것을 사용했다)에 넣은 플라스미드를 작제하고 형질전환하여 리포터 단백질이 막상에서 발현하는지의 여부를 검토했다.
(1) 즉, 플라스미드 pSP72[프로메가(Promega) 사에서 구입]의 EcoRI 부위에 hG-CSF cDNA를 넣은 플라스미드 pSP72-hG-CSF를 주형으로 하여 SP6 프로모터 프라이머[다카라슈조(주)에서 구입] 및 SacI 부위를 부가한 hG-CSF 특이적 프라이머,
을 사용하여 95℃에서 1 분간, 48℃에서 2 분간, 72℃에서 2 분간의 조건으로 25 사이클의 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 SacI-EcoRI으로 분해하고, 일단 플라스미드 pBlue script SK(+) (pBS)에 서브클로닝한 다음, 재차 SacI-EcoRI로 분해하여 hG-CSF의 EcoRI-SacI 단편을 수득하였다. 한편 pBS의 Hind III 부위에 hTac의 cDNA를 넣은 플라스미드 pBS-hTac를 SacI-KpnI으로 분해하고, 시그널 서열을 제거한 hTac cDNA의 SacI-KpnI 단편을 수득하였다. 스터퍼 서열(stuffer)을 제거한 pcDL-SRα(제2도)의 EcoRI-KpnI 부위에 상기 양단편을 넣어 플라스미드 pcDL-SRα-hG-CSF-hTac(pSGT)를 수득했다(제3도, 제4도 및 제5도).
다음에 플라스미드 pGEM3의 EcoRI 부위에 hRARα cDNA를 넣은 플라스미드 pGEM3-hRARα를 주형으로 하여 SP6 프로모터 프라이머 및 SacI 부위를 부가한 hRARα 특이적 프라이머,
를 사용해서 PCR을 수행하였다. 그 이후 상기한 G-CSF의 경우와 동일한 방법으로 플라스미드 pcDL-SRα-hRARα-hTac(pSRT)를 수득했다(제6도, 제4도 및 제5도).
(2) (1)에서 수득된 pSGT 또는 pSRT를 DEAE-덱스트란법(Current Protocol in Molecular Biology. 9.2.1 장에 상세히 기재되어 있다)에 의해 COS-7 세포에 형질감염시켰다. 48 시간후, 세포를 접시에서 회수하여 마우스 항 Tac IgG 항체와 얼음에서 20 분간 항온처리했다. 유리 항체를 제거한 다음, FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트)로 표지한 염소 항마우스 IgG 항체와 함께 얼음에서 20 분간 항온처리했다. 재차, 유리 항체를 제거하여, G-CSF-Tac 또는 RARα-Tac의 융합 단백질이 막에서 발현하는지의 여부를 세포 자동 분석 분리장치(모델 FACS Can. 벡톤 디킨슨(BECTON DICKINSON)사제, 이하 FACS 라고 함.)로 판정했다. 그 결과는 제7도 및 제8도에 도시되어 있다.
제7도에서, G-CSF-Tac는 Tac과 마찬가지로 막에서 발현되는 것임을 알 수 있다. 또, 제8도에서, RARα-Tac은 전혀 막에서는 발현되지 않으며, 세포내에 있는 것임을 알 수 있다. 이 결과는 리포터 유전자의 상류에 시그널 펩티드를 포함하는 cDNA 단편이 연결되어 있으면 리포터 단백질이 세포막상에서 발현하며, 반대로 시그널 펩티드를 포함하지 않는 cDNA 단편이 연결되어 있으면 막상에서는 발현하지 않음을 나타내고 있다.
[실시예 1]
[시그널 펩티드에 대해 선택성이 있는 cDNA 라이브러리의 작제(제9도 및 제10도)]
마우스 스트로마 세포주 ST2(조혈 간세포의 생존 증식 및 B 세포와 미엘로이드 세포계의 증식 분화를 지지하는 세포로서 EMBO J., 7, 1337(1988)에 기재되어 있음)로부터 AGPC(산 구아니딘-페놀-클로로포름)법[세포 공학 실험 프로토콜(슈준사에서 발간), 28∼31 페이지에 상세히 기재되어 있음]에 의해 전체 RNA를 추출하고, 다시 올리고(dT)-라텍스[oligotex-dT3O(상품명, 다카라슈조(주)에서 판매)]를 사용하여 폴리 A-RNA를 정제했다. 랜덤 헥사머를 프라이머로 사용하여 역전사 효소에 의해 단일쇄의 cDNA를 합성하고, 말단 데옥시트랜스퍼라제에 의해 그 3′ 말단에 dT를 부가했다. EcoRI를 포함하는 제한 효소 부위를 연결한 17 mer의 dA
를 어닐링시키고, 그것을 프라이머로 하여 이중쇄의 cDNA을 합성했다. 평균 길이가 300 bp가 되도록 초음파 처리하여 cDNA를 단편화한 다음, 아가로스 젤 전기 영동으로 200∼500 bp의 cDNA를 분획했다. T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활화한 다음, SacI 부위를 포함하는 론(lone) 링커,
(Nucleic Acids Res., 18, 4293(1990) 참조)를 연결하고, 재차 아가로스 젤 전기 영동에 의해 200∼500 bp의 cDNA를 분획했다. EcoRI 부위를 포함하는 프라이머(NLC),
와 SacI 부위를 포함하는 또 다른 프라이머(LLHES),
를 사용하여 94℃에서 1 분간, 50℃에서 2 분간, 72℃에서 2 분간의 조건으로 25 사이클의 PCR을 수행하였다. 증폭된 cDNA를 SacI와 EcoRI으로 분해하여, 아가로스젤 전기 영동에 의해 250∼500 bp의 cDNA를 분획했다. 이 cDNA와 pSRT(참고예 1에서 작제)를 SacI 와 EcoRI로 분해한 플라스미드를 T4 DNA 리가제로 연결하고, 대장균 DH5α주로 형질전환하여, 시그널 펩티드에 대해 선택성이 있는 cDNA 라이브러리를 수득했다.
[실시예 2]
[시그널 펩티드를 암호하는 cDNA의 스크리닝 및 해석]
실시예 1에 의해 작제한 라이브러리에서 수득한 약 1200개의 콜로니를 24개의 푸울(약 50 콜로니/푸울)로 세분화했다. 각 푸울마다 플라스미드를 미니프렙(miniprep)법으로 단리하고, DEAE-덱스트란법에 의해 COS-7 세포로 형질감염시켰다. 48∼72 시간 후, 참고예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 형질감염체의 Tac에 대해 세포 표면 염색을 수행하고, 형광 현미경을 사용하여 양성을 나타내는 6개의 푸울을 선택했다. 그 중 1개의 푸울에 대해 다시 콜로니를 세분화하고, 단일 클론을 수득할 때까지 전술한 방법과 동일한 방법을 반복하여, 1개의 양성 클론(pS-TT3)을 수득했다. 그 후 pcDL-SRα-Tac 벡터에 특이적인 2 종류의 합성 프라이머,
(EcoRI 클로닝 부위에서 20 염기 상류 부분, 센스용)
및
(SacI 클로닝 부위에서 20 염기 하류 부분, 안티센스용)
를 사용하여, TT3 삽입체의 염기 서열을 결정했다. 시그널 서열 부분을 삭제한 Tac cDNA에 인프레임(in-frame)으로 계속되는 오픈 리딩 프레임을 찾아서 예상되는 아미노산 서열로 변환하여 소수성 프로화일을 그려, 시그널 펩티드에 특징적인 소수성 부분이 있는 것을 확인했다(제11도). 또한 DNA 및 아미노산 레벨에서 데이타 베이스와의 상동성 검색을 수행한 결과, TT3는 미지의 단백질을 암호함이 명백해졌다.
[실시예 3]
[전 길이의 cDNA 스크리닝 및 염기 서열의 결정]
cDNA 라이브러리의 작제는 슈퍼 스크립트(Super Script, 등록 상표) 람다 시스템(BRL 사에서 판매)을 사용하여 실시했다. 그 후 pS-TT3을 SacI와 EcoRI으로 분해하고, 아가로스 젤 전기 영동으로 TT3 cDNA 단편을 작제했다. 올리고로 라벨된 TT3 cDNA 단편을 프로브로 하여 라이브러리의 스크리닝을 실시하여 다수의 양성 클론을 수득했다. 그 중에서 삽입체가 가장 긴 TT3-1-6 클론에 대해 λgt 22A 벡터에서 잘라낸 SalI-NotI 단편을 pBS에 서브클로닝하여, 플라스미드 pBS-TT316을 수득했다. T7 프라이머를 사용해서 TT3-1-6 cDNA의 5′측 300 bp의 염기 서열을 결정하여 프로브의 TT3와 일치하는 서열이 TT3-1-6의 가장 5′ 측에 존재함을 먼저 확인했다.
다음에 ExoIII/Mung Bean deletion kit(상품명, Stratagene 사에서 판매)를 사용하여 TT3-1-6 cDNA의 5′ 말단 또는 3′ 말단이 결실된 pBS-TT316변이 플라스미드를 다수 제작했다. 이들 변이 플라스미드를 사용하여 cDNA 전 길이의 염기 서열을 결정했다(서열 번호 3). 이 cDNA 전 길이의 서열 데이타에서 오픈 리딩 프레임을 결정하고, 다시 아미노산 서열로 해독하여 서열 번호 1에 나타낸 서열을 얻었다. 또, 수득한 아미노산 서열의 N 말단측 30∼40 아미노산을 이미 알고 있는 시그널 펩티드와 비교함으로써, 본 폴리펩티드에 있어서의 시그널 펩티드 부분을 추정하여 서열 번호 4에 나타낸 서열을 얻었다.
[서열표]
서열 번호 : 1
서열의 길이 : 89
서열의 유형 : 아미노산
위상 : 직쇄상
서열의 종류 단백질
서열
서열 번호 : 2
서열의 길이 : 267
서열의 유형 : 핵산
연쇄의 수 : 단일쇄
위상 : 직쇄상
서열의 종류 : cDNA-mRNA
서열
서열 번호 : 3
서열의 길이 : 1797
서열의 유형 : 핵산
연쇄의 수 : 단일쇄
위상 : 직쇄상
서열의 종류 : cDNA-mRNA
서열
서열 번호 : 4
서열의 길이 : 1797
서열의 유형 : 핵산
연쇄의 수 : 단일쇄
위상 : 직쇄상
서열의 종류 : cDNA-mRNA
기원
생물명 : 마우스
세포주 : ST2
서열의 특징
특징을 나타내는 기호 : CDS
존재 위치 : 82..351
특징을 결정하는 방법 : P
특징을 나타내는 기호 : sig 펩티드
존재 위치 : 82..138
특징을 결정하는 방법 : S
특징을 나타내는 기호 : mat 펩티드
존재 위치 : 139..348
특징을 결정하는 방법 : S

Claims (12)

  1. (1) 대상으로 하는 세포에서 단리한 mRNA에 대한 단일쇄 DNA를, 랜덤 프라이머를 사용하여 합성한 다음, 수득된 단일쇄 DNA의 3′ 말단에 올리고 dT를 부가하고, (2) (1)에서 수득된 단일쇄 DNA에 대하여, 특정 제한 효소(효소 I) 부위를 연결한 폴리 A 올리고머를 프라이머로서 사용하여 이중쇄 DNA를 합성하며, (3) (2)에서 수득한 이중쇄 DNA를 절단하여, 단편 크기로 분획한 다음, 효소 I과 상이한 특정 제한 효소(효소 II) 부위를 포함하는 링커를 연결하여, 다시 분획하고, (4) 효소 I 부위를 포함하는 프라이머와 효소 II 부위를 포함하는 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하여 증폭된 cDNA를 효소 I - 효소 II로 분해한 다음 분획하며, (5) 수득된 cDNA 단편을 시그널 펩티드를 제거한 공지의 분비 단백질 또는 막 단백질 유전자의 상류에 연결하고, 진핵세포 발현 플라스미드 벡터에 삽입한 다음, 형질전환시키는 공정으로 이루어진 cDNA 라이브러리의 작제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 효소 I로서 EcoRI을 사용하고, 효소 II로서 SacI를 사용하며, 시그널 펩티드를 제거한 공지의 분비 단백질 또는 막 단백질의 유전자로서 사람 IL-2 수용체 α 유전자를 사용하는 cDNA 라이브러리의 작제 방법.
  3. 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열중 첫번째에서 70 번째까지의 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  5. 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
  6. 제5항에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
  7. 제5항에 있어서, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
  8. 제5항에 있어서, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열중 139 번째부터 348 번째까지 의 서열을 갖는 DNA.
  9. 제5항 내지 제8항중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터.
  10. 제9항에 기재된 복재 및 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
  11. 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 제10항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  12. 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드에 대한 모노클로널 항체 또는 폴리클로널 항체.
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