JPH06315380A - ｃＤＮＡライブラリーの作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 （１）シグナルペプチドに対して選択性のあ
る効率的なｃＤＮＡライブラリーの作製方法、（２）ス
トローマ細胞株が産生する、８９アミノ酸（シグナルペ
プチドも含めて）からなる新規なポリペプチド、（３）
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、（４）ベクタ
ー、（５）宿主細胞、（６）前記ポリペプチドの製造方
法、（７）前記ポリペプチドに対する抗体、及び（８）
前記ポリペプチドを有効成分とする薬剤組成物。 【効果】 （１）の方法により、未知の有用なポリペプ
チドを効率的に見出すことができる。（２）のポリペプ
チドは貧血、白血球減少症、感染症等の予防あるいは治
療剤として用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ｃＤＮＡライブラリー
の作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコード
するＤＮＡに関する。より詳細に述べると、本発明は、
シグナルペプチドに対して選択性のある効率的なｃＤＮ
Ａライブラリーの作製方法、およびある種のストローマ
細胞株が産生する新規なポリペプチドおよび該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ある特定のポリペプチド（例え
ば、増殖分化因子）またはそれをコードするＤＮＡを得
ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とする生物
活性を確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経て、
遺伝子をクローニングするという方法、あるいはその生
物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法
が一般的に用いられていた。しかしながら、生体内生理
活性ポリペプチドは多様な生物活性を有している場合が
多いので、あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクロ
ーニングした結果、それが既知のポリペプチドと同一で
あることが後になって判明するという事例が増えてい
る。また、生体内生理活性ポリペプチドは殆どのものが
ごく微量しか分泌されず、そのことが単離、精製および
生物活性の確認を困難なものにしている。

【０００３】近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。そこでこれら
の技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニング
して塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現さ
せた後、その生理機能を解析していくという方法が発展
しつつある。この方法は、生化学的、遺伝子学的な解析
を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、その塩基
配列の情報を得ることができるという特徴を有している
が、目的とする遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、これま
で造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のクロー
ニングを研究してきた。そして、増殖分化因子（例え
ば、各種サイトカイン等）のような分泌タン白やそのレ
セプターのような膜タン白（以下、これらをまとめて分
泌タン白等と呼ぶ）の大部分がそのＮ末端にシグナルペ
プチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、シ
グナルペプチドをコードする遺伝子を効率的かつ選択的
にクローニングする方法を鋭意検討した。その結果、Ｎ
末端断片を効率的に増幅させ、シグナルペプチドの有無
を簡単に検索できる方法を見出し本発明を完成した。

【０００５】すなわち、シグナルペプチドを含む可能性
の高いｃＤＮＡ断片の両端に互いに異なった制限酵素サ
イトを含むリンカーを結合させ、この断片のみをポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）で迅速かつ大量に作製し
て、シグナルペプチドを含む可能性の高い断片の存在比
率をさらに高めた。次に、多くの分泌タン白等は、その
シグナルペプチドを他の分泌タン白等のシグナルペプチ
ドに置きかえても分泌あるいは細胞膜上に発現するとい
う性質を利用して、公知の分泌タン白等のシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ部分の欠損したＤＮＡを挿入し
た発現ベクターに前述の断片を導入し、公知の分泌タン
白等が細胞膜上または細胞外に発現した場合には、シグ
ナルペプチドに相当するｃＤＮＡ断片がうまく導入され
たということが確実かつ簡便に検索できる系を確立し
た。

【０００６】ポリメラーゼ連鎖反応は従来から特定のＤ
ＮＡ断片を大量に増幅する方法として公知である。ま
た、多くの分泌タン白等はシグナルペプチドが他の分泌
タン白等のものであっても同じように発現されることは
よく知られている。しかしながら、これらの知見を組み
合わせて、シグナルペプチドを選択的にクローニングす
る方法に応用することは全く知られておらず、また予想
もされないことであった。 さらに、本発明は造血系細
胞から得られた新規なポリペプチドおよびそれをコード
するＤＮＡに関するものでもある。造血系細胞からは、
インターロイキンをはじめ種々の増殖、分化因子が分泌
されていることが知られている。このことはこれまでに
見出だされた分泌因子以外にも同様の作用、または新た
な作用を有する因子が分泌されている可能性を示唆して
いる。

【０００７】本発明者らはこの点に注目し、造血系細胞
が産生している新規な因子（ポリペプチド）を見出すこ
とを目的として、本発明の第１主題の方法を用いて検索
したところ、まったく新規なポリペプチドおよびそれを
コードするＤＮＡを見出すことに成功し、本発明を完成
した。本発明のポリペプチドおよびそれをコードするＤ
ＮＡと同一あるいは相同性の高い配列を有しているもの
をコンピューターで検索したが皆無であった。従って、
本発明のポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは
まったく新規なものであることが確認された。さらに、
ホモロジー検索の結果、本発明のポリペプチドは、Ｃｙ
ｓ−Ｘ−Ｃｙｓ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表わ
す。）のモチーフを有するケモカインファミリー（Chem
okine family）の一種であることが確認された。

【０００８】従って、本発明の第１の主題は、シグナル
ペプチドのｃＤＮＡライブラリーの効率的な作製方法で
ある。すなわち、本発明のシグナルペプチドのｃＤＮＡ
ライブラリーの作製方法は、以下の工程より構成され
る。

【０００９】（１） 対象となる細胞より単離したｍＲ
ＮＡに対する一本鎖ＤＮＡを、ランダムプライマーを用
いて合成した後、得られた一本鎖ＤＮＡの３′末端にオ
リゴｄＴを付加し、（２） （１）で得られた一本鎖Ｄ
ＮＡに対する二本鎖ＤＮＡを、特定の制限酵素（酵素
Ｉ）サイトを連結したポリＡオリゴマーをプライマーと
して用いて合成し、

【００１０】（３） （２）で得られた二本鎖ＤＮＡを
分断し、断片のサイズで分画後、酵素Ｉとは異なる特定
の制限酵素（酵素II）サイトを含むリンカーを連結し、
再度分画し、（４） 酵素Ｉサイトを含むプライマーと
酵素IIサイトを含むプライマーを用いてポリメラーゼ連
鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する。）に付し、増幅され
たｃＤＮＡを酵素Ｉ−酵素IIで消化した後分画し、

【００１１】（５） 得られたｃＤＮＡ断片を、シグナ
ルペプチドを削除した公知の分泌タン白等の遺伝子の上
流に連結し、真核細胞発現プラスミドベクターに組み込
んだ後形質転換する工程よりなる。以上の各工程の概念
図を図１に示す。

【００１２】各工程を詳しく説明すると、工程（１）で
は、対象となる細胞より、必要により適当な刺激剤で刺
激した後、オカヤマ Ｈ（Okayama H.）等の方法［Meth
od in Enzymology,154,3(1987)に記載］に従ってｍＲＮ
Ａの単離が行なわれる。対象となる細胞としては、分泌
タン白等を産生している可能性のある細胞なら何でもよ
い。例えば、神経系細胞や造血系細胞が挙げられる。ラ
ンダムプライマーを用いる一本鎖ｃＤＮＡの合成は公知
の方法により行なわれる。ランダムプライマーは市販の
ものが用いられる。続いて、ターミナルデオキシトラン
スフェレースにより一本鎖ｃＤＮＡの３′末端にオリゴ
ｄＴが付加される。

【００１３】工程（２）の二本鎖ＤＮＡの合成も、公知
の方法により行なわれる。プライマーとなるポリＡオリ
ゴマーに連結される制限酵素（酵素Ｉ）サイトと次の工
程（３）で用いられる制限酵素（酵素II）サイトは、互
いに異なるものであれば何を用いてもよい。好ましく
は、酵素ＩとしてEcoRＩ、酵素IIとしては SacＩが用い
られる。

【００１４】工程（３）は、超音波処理によりｃＤＮＡ
長が平均３００ｂｐになるように断片化し、アガロース
電気泳動（ＡＧＥ）により２００〜５００ｂｐのｃＤＮ
Ａに分画した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑
化し、酵素IIアダプターを連結し、再度アガロース電気
泳動により２００〜５００ｂｐのＤＮＡに分画すること
により行なわれる。酵素IIは、前記したように酵素Ｉと
異なるものなら何でもよい。本工程によって、シグナル
ペプチドを含むｃＤＮＡ断片は、酵素Ｉと酵素IIによっ
て挟まれた部分に存在する可能性が高まる。

【００１５】工程（４）では、シグナルペプチドを含む
可能性のある酵素Ｉと酵素IIで挟まれた部分の存在確立
をさらに高めるためにＰＣＲに付す。ＰＣＲはよく知ら
れた方法であり、そのための自動化装置も市販されてい
る。２５〜３０回の増幅で十分である。増幅されたｃＤ
ＮＡは酵素Ｉ−酵素IIで消化し、アガロース電気泳動に
より２００〜５００ｂｐのｃＤＮＡに分画される。

【００１６】工程（５）は、真核細胞発現用プラスミド
ベクターにシグナルペプチドを削除した公知の分泌タン
白等の遺伝子（レポーター遺伝子という。）と、その上
流に（４）で得られたｃＤＮＡ断片とを組み込んで形質
転換する工程である。ここで真核細胞発現用プラスミド
ベクターとしては種々のものが知られているが、例え
ば、大腸菌内で機能するｐｃＤＬ−ＳＲαやｐｃＥＶ−
４が用いられる。また、レポーター遺伝子としては、あ
らゆる種類の可溶性分泌タン白および膜タン白の成熟タ
ン白部分の遺伝子が用いられる。さらに、これらのレポ
ーター遺伝子は、抗体法などの何らかの方法でその発現
が確認できるものでなければならない。好適にはヒトＩ
Ｌ−２レセプターα遺伝子が用いられる。形質転換のた
めの宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、
いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテ
ントセル［Gene, 96, 23 (1990) に記載］である。形質
転換体は常法により培養され、本発明のｃＤＮＡライブ
ラリーが得られる。

【００１７】本発明のｃＤＮＡライブラリー作製方法で
は、ライブラリー中にシグナルペプチドをコードする遺
伝子断片を含む可能性は高いが、すべてのクローンが該
断片を含んでいる訳ではないし、またすべてが未知の
（新規の）シグナルペプチドをコードする遺伝子断片と
は限らない。そこで、次に該ライブラリーから未知のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニン
グする必要がある。

【００１８】すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを適当な
サイズのプールに細分化し、発現系に組み込む。ポリペ
プチドを生産するための発現系としては、哺乳動物細胞
（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスタ
ーＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）が挙げられる。トラン
スフェクションは公知の方法、例えばＤＥＡＥ−デキス
トラン法によって行なわれる。培養後、レポーター遺伝
子の発現の有無を判定する。レポーター遺伝子は、シグ
ナルペプチドが他の分泌タン白に固有のものであっても
発現することが知られている。すなわち、レポーター遺
伝子が発現されたということは、ライブラリー中に何ら
かの分泌タン白のシグナルペプチドが組み込まれていた
ことを示している。陽性を示すプールについてはさらに
細分化を行ない、シングルクローンを得るまで発現と判
定を繰り返す。レポーター遺伝子の発現の判定は、レポ
ーター遺伝子の種類によって異なるが、蛍光標識抗体
法、酵素標識抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性標識抗体
法（ＲＩＡ法）などにより行なわれる。

【００１９】次に、単離した陽性クローンについて、塩
基配列を決定し、未知のタン白質をコードすることが明
らかになったｃＤＮＡについては、それをプローブとし
て全長クローンを単離し、全長の塩基配列を決定するこ
とができる。これらの操作は、当業者にとってすべて公
知の方法で行なわれる。例えば、塩基配列の決定はマキ
サム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法やジデオキシ・
ターミネーター法により行なわれる。また、全長のシー
クエンスは Molecular Cloning［Sambrook,J.,Fritsch,
E.F. および Maniatis,T.著、 Cold Spring Harbor Lab
oratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法に従っ
て行なわれる。

【００２０】本発明の２番目の主題は、１番目の主題に
示された方法によって見出された、実質的に純粋な形で
ある配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチド、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよ
びそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポ
リペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的に
は、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に
選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮ
Ａに関する。

【００２１】特に本発明は、（１） 配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２） 前記
（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３） 配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮ
Ａ、および（４） 配列番号３で示される塩基配列を有
するＤＮＡに関する。

【００２２】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般に、
生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９
８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドであることを意味する。

【００２３】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２
０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０
または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より
好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのよ
うなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記
載される。

【００２４】さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれら
のホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミ
ノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２
０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を
意味する。特に好ましいフラグメントとしては、配列番
号４で示されるアミノ酸配列中、１番目から７０番目ま
での配列からなるフラグメントまたはそのホモローグで
ある。

【００２５】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡと
は、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも
３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩
基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性
であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明の
ＤＮＡとして記載される。そのようなＤＮＡのうち、特
に好ましいものとしては、配列番号４で示される塩基配
列中、１３９番目から３４８番目までの配列からなるＤ
ＮＡまたはそのフラグメントである。

【００２６】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩
基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００２７】本発明のＤＮＡは、遺伝子組み換え法、合
成法あるいは当業者に公知の方法によって取得すること
ができる。

【００２８】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。ベクターはインビトロで、例えばＤ
ＮＡに相当するＲＮＡを調製するために、または宿主細
胞を形質転換するために用いられる。

【００２９】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複
製または発現させるためのベクターで形質転換された宿
主細胞も含まれる。細胞はベクターに適するもののなか
から選ばれ、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動
物細胞が挙げられる。

【００３０】本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ
（ＤＮＡ）を製造するために、アンチセンスの方向で前
記のベクターに挿入される。アンチセンスＲＮＡ（ＤＮ
Ａ）は、また合成法によっても製造することができる。
このようにして得られたアンチセンスＲＮＡ（ＤＮＡ）
は、細胞中での本発明のポリペプチドの産生量をコント
ロールするために用いられる。

【００３１】さらに、本発明には、本発明のポリペプチ
ドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培
養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も
含まれる。さらに好ましくは、そのような方法は本発明
のポリペプチドが発現され、続いて宿主細胞から分泌さ
れるような条件下で行なわれる。

【００３２】また、本発明には、本発明のポリペプチド
に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
が含まれる。さらに本発明には、本発明のポリペプチド
に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
の製造方法が含まれる。モノクローナル抗体は、抗原と
して本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントを用
いて、常法のハイブリドーマ技術によって製造される。
また、ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えばラット
またはウサギに本発明のポリペプチドを接種し、感作さ
れた血清を回収することからなる常法によって製造され
る。

【００３３】本発明には、本発明のポリペプチドまたは
その抗体と薬学的に許容される希釈剤または担体からな
る薬剤組成物も含まれる。

【００３４】本発明には、また本発明のポリペプチドま
たはその抗体からなるヒトまたは哺乳動物の治療方法ま
たは診断方法が含まれる。

【００３５】本発明のポリペプチドとしては、配列番号
１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一
部が欠損したもの（例えば、成熟タン白部分のみ、ある
いは成熟タン白中、生物活性の発現に必須な部分だけか
ら成るポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換
したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換した
もの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿
入されたものも含まれる。

【００３６】よく知られているように、ひとつのアミノ
酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは
１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基
配列を変えることができる。（２）で特定される本発明
のＤＮＡには、（１）の配列番号１で示されるポリペプ
チドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基
配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向
上することがある。（３）で特定されるＤＮＡは、
（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を
表わす。（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定され
るＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。

【００３７】シグナルペプチドは、翻訳開始Ｍｅｔのす
ぐ後ろの疎水性に富んだ領域である。本ポリペプチドの
場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、１番目の
Ｍｅｔから１９番目のＳｅｒまでと推定される。生物活
性を発現する本質は配列番号１で示されるアミノ酸配列
中、シグナルペプチドを除いた部分（成熟タン白部分）
にあり、シグナルペプチドは活性に関与しない。配列番
号３で示される塩基配列を有するＤＮＡは、本発明の第
１主題に記載された方法にしたがって作製することがで
きる。

【００３８】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、
あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプロー
ブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＤ
ＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有する
ベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させ
ることによって、目的とするＤＮＡを必要量得ることが
できる。

【００３９】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１） 生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２） ペプチド合成する方法、または（３） 遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するた
めの発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細
菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げ
られる。

【００４０】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟タン白部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コド
ン（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプロ
モーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、λＰ_Ｌプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の
下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して
発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形
質転換した大腸菌（例えば、E.ColiＤＨ１、E.ColiＪＭ
１０９、E.ColiＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養し
て、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることが
できる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例え
ば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリ
プラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することも
できる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプ
ロテイン（fusion protein）を生産することもできる。

【００４１】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列表３で示される塩基配列をコードする
ＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベク
ター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイル
スベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモ
ーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモ
ーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿
入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベ
クターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣＯＳ−７
細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細
胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養す
ることによって、その培養液中に目的とするポリペプチ
ドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチ
ドは、一般的な生化学的方法によって単離精製すること
ができる。

【００４２】

【発明の効果】本発明の第１の主題であるｃＤＮＡライ
ブラリーの作製方法を用いると、分泌タン白または膜タ
ン白のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを効率的に
選択することができ、ひいては未知の有用なタン白を効
率的に見出すことができる。本発明の第２の主題である
新規なポリペプチドはストローマ細胞株が生産、分泌す
るものであり、造血幹細胞の生存、増殖、およびＢ細胞
系やミエロイド細胞系の増殖、分化に関連した生物活性
を有するとともに、好中球の遊走活性も有している。従
って、本発明のポリペプチドは、それ自身で貧血、白血
球減少症、感染症等の予防あるいは治療剤として用いる
ことができる。

【００４３】また、該ポリペプチドのポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該
ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプ
チドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用
することができる。ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は、該ポリペプチドあるいはその断片を抗原
として用いて常法により作製することができる。

【００４４】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック（genomic ）ＤＮＡを分離できる。同
様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリ
ペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明
ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分
離することも可能である。

【００４５】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。

【００４６】参考例１ プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα−ｈ−Ｇ−ＣＳＦ−ｈＴａ
ｃ（ｐＳＧＴ）およびプラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα−ｈ
ＲＡＲα−ｈＴａｃ（ｐＳＲＴ）の構築と発現 ｈＧ−ＣＳＦ（ヒト顆粒球コロニー刺激因子、シグナル
ペプチドを有するタン白質の代表例）またはｈＲＡＲα
（ヒトレチノイン酸レセプターα、シグナルペプチドを
もたないタン白質の代表例）とｈＴａｃ（ヒトＩＬ−２
レセプターα、レポーター遺伝子として使用）の融合タ
ン白質をコードするｃＤＮＡをＳＲαプロモーターをも
つ真核細胞発現プラスミドベクターｐｃＤＬ−ＳＲα
（Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1988) に記載されている
が、国立予防衛生研究所の武部豊先生より供与されたも
のを使用した。）に組み込んだプラスミドを構築し、形
質転換して、レポータータン白が膜上に発現されるか否
かを検討した。

【００４７】（１） すなわち、プラスミドｐＳＰ７２
［プロメガ（Promega ）社より購入］のEcoRＩサイトに
ｈＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＳＰ
７２−ｈＧ−ＣＳＦを鋳型として、ＳＰ６プロモーター
プライマー［宝酒造（株）より購入］および SacＩサイ
トを付加したｈＧ−ＣＳＦ specificプライマー、

【００４８】

【化１】

【００４９】を用いて、９５℃で１分間、４８℃で２分
間、７２℃で２分間の条件で２５サイクルのＰＣＲを行
なった。増幅されたＤＮＡ断片を SacＩ−EcoRＩで消化
して、一旦、プラスミドｐBlue script ＳＫ(+) （ｐＢ
Ｓ）にサブクローニングした後、再度 SacＩ−EcoRＩで
消化してｈＧ−ＣＳＦのEcoRＩ− SacＩ断片を得た。一
方、ｐＢＳの HindIIIサイトにｈＴａｃのｃＤＮＡを組
み込んだプラスミド、ｐＢＳ−ｈＴａｃを SacＩ− Kpn
Ｉで消化し、シグナルシークエンスを除去したｈＴａｃ
ｃＤＮＡの SacＩ− KpnＩ断片を得た。この両断片
を、stuffer を除去したｐｃＤＬ−ＳＲα（図２）のEc
oRＩ− KpnＩサイトに組み込んで、プラスミドｐｃＤＬ
−ＳＲα−ｈＧ−ＣＳＦ−ｈＴａｃ（ｐＳＧＴ）を得た
（図３、４および５）。

【００５０】次に、プラスミドｐＧＥＭ３のEcoRＩサイ
トにｈＲＡＲα ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド、ｐ
ＧＥＭ３−ｈＲＡＲαを鋳型として、ＳＰ６プロモータ
ープライマーおよび SacＩサイトを付加したｈＲＡＲα
specificプライマー、

【００５１】

【化２】

【００５２】を用いてＰＣＲを行なった。これ以後は、
前記したＧ−ＣＳＦの場合と同様の方法でプラスミドｐ
ｃＤＬ−ＳＲα−ｈＲＡＲα−ｈＴａｃ（ｐＳＲＴ）を
得た（図６、４および５）。

【００５３】（２） （１）で得られたｐＳＧＴまたは
ｐＳＲＴをＤＥＡＥ−デキストラン法（ Current Proto
col in Molecular Biology、9.2.1 章に詳しく記載され
ている。）によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクショ
ンした。４８時間後、細胞をディッシュからはがし、マ
ウス抗Ｔａｃ IgＧ抗体と氷上で２０分間インキュベー
ションした。フリーの抗体を除去した後、ＦＩＴＣ（フ
ルオレセインイソチオシアネート）でラベルしたヤギ抗
マウス IgＧ抗体と氷上で２０分間インキュベーション
した。再度フリーの抗体を除去して、Ｇ−ＣＳＦ−Ｔａ
ｃまたはＲＡＲα−Ｔａｃの融合タン白質が膜に発現し
ているか否かを細胞自動解析分離装置（モデル：ＦＡＣ
Ｓ Ｃａｎ、ベクトン・ディキンソン（BECTON DICKINS
ON）社製、以下、ＦＡＣＳと略記する。）によって判定
した。結果を図７および図８に示す。

【００５４】図７から、Ｇ−ＣＳＦ−ＴａｃはＴａｃ同
様、膜に発現されていることがわかる。また、図８か
ら、ＲＡＲα−Ｔａｃはまったく膜には出ず、細胞内に
とどまっていることがわかる。この結果は、レポーター
遺伝子の上流にシグナルペプチドを含むｃＤＮＡ断片が
連結されていると、レポーター蛋白質は細胞膜上に発現
し、逆に、シグナルペプチドを含まないｃＤＮＡ断片が
連結されていると膜上には発現しないことを示してい
る。

【００５５】実施例１ シグナルペプチドに対して選択性のあるｃＤＮＡライブ
ラリーの作製（図９および図１０） マウスストローマ細胞株ＳＴ２（造血幹細胞の生存増殖
およびＢ細胞やミエロイド細胞系の増殖分化を支持する
細胞であって、EMBO J., 7,1337(1988) に記載されてい
る。）より、ＡＧＰＣ（アシッドグアニジン−フェノー
ル−クロロホルム）法（細胞工学実験プロトコール（秀
潤社より発刊）、２８〜３１ページに詳しく記載されて
いる。）によって全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴ（ｄ
Ｔ）−ラテックス（ Oligotex-dT30（商品名、宝酒造
（株）より販売））を用いてポリＡ−ＲＮＡを精製し
た。ランダムヘキサマーをプライマーとして、逆転写酵
素により一本鎖のｃＤＮＡを合成し、ターミナルデオキ
シトランスフェラーゼによりその３′末端にｄＴを付加
した。EcoRＩを含む制限酵素部位を連結した１７ｍｅｒ
のｄＡ、

【００５６】

【化３】

【００５７】をアニールさせ、それをプライマーとして
二本鎖のｃＤＮＡを合成した。平均長が３００ｂｐにな
るように超音波処理してｃＤＮＡを断片化した後、アガ
ロース電気泳動で２００〜５００ｂｐのｃＤＮＡを分画
した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した後、
SacＩ部位を含むローンリンカー、

【００５８】

【化４】

【００５９】（Nucleic Acids Res.,18,4293(1990)参照
のこと）を連結し、再度アガロース電気泳動により２０
０〜５００ｂｐのｃＤＮＡを分画した。EcoRＩサイトを
含むプライマー（ＮＬＣ）、

【００６０】

【化５】

【００６１】と SacＩサイトを含むプライマー（ＬＬＨ
ＥＳ）、

【００６２】

【化６】

【００６３】を用いて、９４℃で１分間、５０℃で２分
間、７２℃で２分間の条件で２５サイクルのＰＣＲを行
なった。増幅されたｃＤＮＡを SacＩとEcoRＩで消化し
て、アガロース電気泳動により２５０〜５００ｂｐのｃ
ＤＮＡを分画した。このｃＤＮＡと、ｐＳＲＴ（参考例
１で作製した。）を SacＩとEcoRＩで消化したプラスミ
ドとをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５α株
を形質転換して、シグナルペプチドに対して選択性のあ
るｃＤＮＡライブラリーを得た。

【００６４】実施例２ シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニン
グおよび解析 実施例１で作製したライブラリーで得られた約１２００
のコロニーを２４のプール（約５０コロニー／プール）
に細分化した。各プールごとに、プラスミドをミニプレ
ット法で単離し、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯ
Ｓ−７細胞にトランスフェクションした。４８〜７２時
間後、参考例１に記載した方法と同様にしてトランスフ
ェクタントのＴａｃに対する表面染色を行ない、蛍光顕
微鏡を用いて、陽性を示す６プールを選択した。そのう
ちの１プールについて、さらにコロニーを細分化し、単
一クローンを得るまで同様の方法を繰り返し、１個の陽
性クローン（ｐＳ−ＴＴ３）を得た。次に、ｐｃＤＬ−
ＳＲα−Ｔａｃベクターに特異的な２種類の合成プライ
マー、

【００６５】

【化７】

【００６６】を用いて、ＴＴ３インサートの塩基配列を
決定した。シグナルシークエンス部分を削除したＴａｃ
ｃＤＮＡにインフレーム（in-frame）でつづくオープ
ンリーディングフレームを探して、予想されるアミノ酸
配列に変換し、疎水性プロファイルを描いて、シグナル
ペプチドに特徴的な疎水性部分があることを確認した
（図１１）。さらにＤＮＡおよびアミノ酸レベルでデー
タベースとのホモロジー検索を行なった結果、ＴＴ３
は、未知のタン白質をコードすることが明らかとなっ
た。

【００６７】実施例３ 全長ｃＤＮＡのスクリーニングおよび塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーの作製は、スーパースクリプト
（Super Script、登録商標）ラムダシステム（ＢＲＬ社
より販売）を用いて行なった。次に、ｐＳ−ＴＴ３を S
acＩとEcoRＩで消化し、アガロース電気泳動でＴＴ３
ｃＤＮＡ断片を調製した。オリゴラベルしたＴＴ３ ｃ
ＤＮＡ断片をプローブとしてライブラリーのスクリーニ
ングを行ない、多数の陽性クローンを得た。その中でイ
ンサートが最も長いＴＴ３−１−６クローンについて、
λｇｔ２２Ａベクターから切り出した SalＩ− NotＩ断
片をｐＢＳにサブクローニングし、プラスミドｐＢＳ−
ＴＴ３１６を得た。Ｔ７プライマーを使ってＴＴ３−１
−６ ｃＤＮＡの５′側３００ｂｐの塩基配列を決定し
て、プローブのＴＴ３と一致する配列がＴＴ３−１−６
の最も５′側に存在することをまず確認した。

【００６８】次にExoIII／Mung Bean deletion kit（商
品名、Stratagene社より販売）を用いて、ＴＴ３−１−
６ ｃＤＮＡの５′末端または３′末端が欠失したｐＢ
Ｓ−ＴＴ３１６変異プラスミドを多数作製した。これら
の変異プラスミドを用いて全長ｃＤＮＡの塩基配列を決
定した（配列番号３）。この全長ｃＤＮＡシークエンス
データからオープンリーディングフレームを決定し、さ
らにアミノ酸配列に翻訳して配列番号１に示す配列を得
た。また、得られたアミノ酸配列のＮ末端側３０〜４０
アミノ酸について、既知のシグナルペプチドと比較する
ことにより、本ポリペプチドにおけるシグナルペプチド
部分を推定し、配列番号４に示す配列を得た。

【００６９】

【配列表】

【００７０】配列番号：１ 配列の長さ：８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ala Lys Val Val Ala Val Leu Ala Leu Val Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Cys Ile Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys 20 25 30 Arg Phe Phe Glu Ser His Ile Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys 35 40 45 Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys 85

【００７１】配列番号：２ 配列の長さ：２６７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGACGCCA AGGTCGTCGC CGTGCTGGCC CTGGTGCTGG CCGCGCTCTG CATCAGTGAC 60 GGTAAACCAG TCAGCCTGAG CTACCGATGC CCCTGCCGGT TCTTCGAGAG CCACATCGCC 120 AGAGCCAACG TCAAGCATCT GAAAATCCTC AACACTCCAA ACTGTGCCCT TCAGATTGTT 180 GCACGGCTGA AGAACAACAA CAGACAAGTG TGCATTGACC CGAAATTAAA GTGGATCCAA 240 GAGTACCTGG AGAAAGCTTT AAACAAG 267

【００７２】配列番号：３ 配列の長さ：１７９７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GACCACTTTC CCTCTCGGTC CACCTCGGTG TCCTCTTGCT GTCCAGCTCT GCAGCCTCCG 60 GCGCGCCCTC CCGCCCACGC CATGGACGCC AAGGTCGTCG CCGTGCTGGC CCTGGTGCTG 120 GCCGCGCTCT GCATCAGTGA CGGTAAACCA GTCAGCCTGA GCTACCGATG CCCCTGCCGG 180 TTCTTCGAGA GCCACATCGC CAGAGCCAAC GTCAAGCATC TGAAAATCCT CAACACTCCA 240 AACTGTGCCC TTCAGATTGT TGCACGGCTG AAGAACAACA ACAGACAAGT GTGCATTGAC 300 CCGAAATTAA AGTGGATCCA AGAGTACCTG GAGAAAGCTT TAAACAAGTA AGCACAACAG 360 CCCAAAGGAC TTTCCAGTAG ACCCCCGAGG AAGGCTGACA TCCGTGGGAG ATGCAAGGGC 420 AGTGGTGGGG AGGAGGGCCT GAACCCTGGC CAGGATGGCC GGCGGGACAG CACTGACTGG 480 GGTCATGCTA AGGTTTGCCA GCATAAAGAC ACTCCGCCAT AGCATATGGT ACGATATTGC 540 AGCTTATATT CATCCCTGCC CTCGCCCGTG CACAATGGAG CTTTTATAAC TGGGGTTTTT 600 CTAAGGAATT GTATTACCCT AACCAGTTAG CTTCATCCCC ATTCTCCTCA TCCTCATCTT 660 CATTTTAAAA AGCAGTGATT ACTTCAAGGG CTGTATTCAG TTTGCTTTGG AGCTTCTCTT 720 TGCCCTGGGG CCTCTGGGCA CAGTTATAGA CGGTGGCTTT GCAGGGAGCC CTAGAGAGAA 780 ACCTTCCACC AGAGCAGAGT CCGAGGAACG CTGCAGGGCT TGTCCTGCAG GGGGCGCTCC 840 TCGACAGATG CCTTGTCCTG AGTCAACACA AGATCCGGCA GAGGGAGGCT CCTTTATCCA 900 GTTCAGTGCC AGGGTCGGGA AGCTTCCTTT AGAAGTGATC CCTGAAGCTG TGCTCAGAGA 960 CCCTTTCCTA GCCGTTCCTG CTCTCTGCTT GCCTCCAAAC GCATGCTTCA TCTGACTTCC 1020 GCTTCTCACC TCTGTAGCCT GACGGACCAA TGCTGCAATG GAAGGGAGGA GAGTGATGTG 1080 GGGTGCCCCC TCCCTCTCTT CCCTTTGCTT TCCTCTCACT TGGGCCCTTT GTGAGATTTT 1140 TCTTTGGCCT CCTGTAGAAT GGAGCCAGAC CATCCTGGAT AATGTGAGAA CATGCCTAGA 1200 TTTACCCACA AAACACAAGT CTGAGAATTA ATCATAAACG GAAGTTTAAA TGAGGATTTG 1260 GACCTTGGTA ATTGTCCCTG AGTCCTATAT ATTTCAACAG TGGCTCTATG GGCTCTGATC 1320 GAATATCAGT GATGAAAATA ATAATAATAA TAATAATAAC GAATAAGCCA GAATCTTGCC 1380 ATGAAGCCAC AGTGGGGATT CTGGGTTCCA ATCAGAAATG GAGACAAGAT AAAACTTGCA 1440 TACATTCTTA TGATCACAGA CGGCCCTGGT GGTTTTTGGT AACTATTTAC AAGGCATTTT 1500 TTTACATATA TTTTTGTGCA CTTTTTATGT TTCTTTGGAA GACAAATGTA TTTCAGAATA 1560 TATTTGTAGT CAATTCATAT ATTTGAAGTG GAGCCATAGT AATGCCAGTA GATATCTCTA 1620 TGATCTTGAG CTACTGGCAA CTTGTAAAGA AATATATATG ACATATAAAT GTATTGTAGC 1680 TTTCCGGTGT CAGCCACGGT GTATTTTTCC ACTTGGAATG AAATTGTATC AACTGTGACA 1740 TTATATGCAC TAGCAATAAA ATGCTAATTG TTTCATGCTG TAAAAAAAAA AAAAAAA 1797

【００７３】配列番号：４ 配列の長さ：１７９７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Mouse セルライン：ＳＴ２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：82..351 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：82..138 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：139..348 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GACCACTTTC CCTCTCGGTC CACCTCGGTG TCCTCTTGCT GTCCAGCTCT GCAGCCTCCG 60 GCGCGCCCTC CCGCCCACGC C ATG GAC GCC AAG GTC GTC GCC GTG CTG GCC 111 Met Asp Ala Lys Val Val Ala Val Leu Ala -15 -10 CTG GTG CTG GCC GCG CTC TGC ATC AGT GAC GGT AAA CCA GTC AGC CTG 159 Leu Val Leu Ala Ala Leu Cys Ile Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu -5 1 5 AGC TAC CGA TGC CCC TGC CGG TTC TTC GAG AGC CAC ATC GCC AGA GCC 207 Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Ile Ala Arg Ala 10 15 20 AAC GTC AAG CAT CTG AAA ATC CTC AAC ACT CCA AAC TGT GCC CTT CAG 255 Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln 25 30 35 ATT GTT GCA CGG CTG AAG AAC AAC AAC AGA CAA GTG TGC ATT GAC CCG 303 Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro 40 45 50 55 AAA TTA AAG TGG ATC CAA GAG TAC CTG GAG AAA GCT TTA AAC AAG TAA 351 Lys leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys 60 65 70 GCACAACAGC CCAAAGGACT TTCCAGTAGA CCCCCGAGGA AGGCTGACAT CCGTGGGAGA 411 TGCAAGGGCA GTGGTGGGGA GGAGGGCCTG AACCCTGGCC AGGATGGCCG GCGGGACAGC 471 ACTGACTGGG GTCATGCTAA GGTTTGCCAG CATAAAGACA CTCCGCCATA GCATATGGTA 531 CGATATTGCA GCTTATATTC ATCCCTGCCC TCGCCCGTGC ACAATGGAGC TTTTATAACT 591 GGGGTTTTTC TAAGGAATTG TATTACCCTA ACCAGTTAGC TTCATCCCCA TTCTCCTCAT 651 CCTCATCTTC ATTTTAAAAA GCAGTGATTA CTTCAAGGGC TGTATTCAGT TTGCTTTGGA 711 GCTTCTCTTT GCCCTGGGGC CTCTGGGCAC AGTTATAGAC GGTGGCTTTG CAGGGAGCCC 771 TAGAGAGAAA CCTTCCACCA GAGCAGAGTC CGAGGAACGC TGCAGGGCTT GTCCTGCAGG 831 GGGCGCTCCT CGACAGATGC CTTGTCCTGA GTCAACACAA GATCCGGCAG AGGGAGGCTC 891 CTTTATCCAG TTCAGTGCCA GGGTCGGGAA GCTTCCTTTA GAAGTGATCC CTGAAGCTGT 951 GCTCAGAGAC CCTTTCCTAG CCGTTCCTGC TCTCTGCTTG CCTCCAAACG CATGCTTCAT 1011 CTGACTTCCG CTTCTCACCT CTGTAGCCTG ACGGACCAAT GCTGCAATGG AAGGGAGGAG 1071 AGTGATGTGG GGTGCCCCCT CCCTCTCTTC CCTTTGCTTT CCTCTCACTT GGGCCCTTTG 1131 TGAGATTTTT CTTTGGCCTC CTGTAGAATG GAGCCAGACC ATCCTGGATA ATGTGAGAAC 1191 ATGCCTAGAT TTACCCACAA AACACAAGTC TGAGAATTAA TCATAAACGG AAGTTTAAAT 1251 GAGGATTTGG ACCTTGGTAA TTGTCCCTGA GTCCTATATA TTTCAACAGT GGCTCTATGG 1311 GCTCTGATCG AATATCAGTG ATGAAAATAA TAATAATAAT AATAATAACG AATAAGCCAG 1371 AATCTTGCCA TGAAGCCACA GTGGGGATTC TGGGTTCCAA TCAGAAATGG AGACAAGATA 1431 AAACTTGCAT ACATTCTTAT GATCACAGAC GGCCCTGGTG GTTTTTGGTA ACTATTTACA 1491 AGGCATTTTT TTACATATAT TTTTGTGCAC TTTTTATGTT TCTTTGGAAG ACAAATGTAT 1551 TTCAGAATAT ATTTGTAGTC AATTCATATA TTTGAAGTGG AGCCATAGTA ATGCCAGTAG 1611 ATATCTCTAT GATCTTGAGC TACTGGCAAC TTGTAAAGAA ATATATATGA CATATAAATG 1671 TATTGTAGCT TTCCGGTGTC AGCCACGGTG TATTTTTCCA CTTGGAATGA AATTGTATCA 1731 ACTGTGACAT TATATGCACT AGCAATAAAA TGCTAATTGT TTCATGCTGT AAAAAAAAAA 1791 AAAAAA 1797

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の概
念図である。

【図２】プラスミドベクター ｐｃＤＬ−ＳＲαの構築
図である。

【図３】ｈＧ−ＣＳＦのEcoRＩ− SacＩ断片の作製方法
の概念図である。

【図４】ｈＴａｃ ｃＤＮＡの SacＩ− KpnＩ断片の作
製方法の概念図である。

【図５】ｐＳＧＴおよびｐＳＲＴの構築図である。

【図６】ｈＲＡＲαのEcoRＩ− SacＩ断片の作製方法の
概念図である。

【図７】ｈＧ−ＣＳＦ−ｈＴａｃ融合タン白質の膜への
発現を示したＦＡＣＳのヒストグラムである。

【図８】ｈＲＡＲ−ｈＴａｃ融合タン白質の膜への発現
を示したＦＡＣＳのヒストグラムである。

【図９】実施例のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の概
念図（前半）である。

【図１０】実施例のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の
概念図（後半）である。

【図１１】本発明ポリペプチド（部分）の疎水性プロフ
ァイルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＣ 8314−4Ｃ ＡＤＶ Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 多田 秀明 大阪府三島郡島本町桜井３−１−１ 小野 薬品工業株式会社水無瀬研究所内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１） 対象となる細胞より単離したｍＲ
   ＮＡに対する一本鎖ＤＮＡを、ランダムプライマーを用
   いて合成した後、得られた一本鎖ＤＮＡの３′末端にオ
   リゴｄＴを付加し、（２） （１）で得られた一本鎖Ｄ
   ＮＡに対する二本鎖ＤＮＡを、特定の制限酵素（酵素
   Ｉ）サイトを連結したポリＡオリゴマーをプライマーと
   して用いて合成し、（３） （２）で得られた二本鎖Ｄ
   ＮＡを分断し、断片のサイズで分画後、酵素Ｉとは異な
   る特定の制限酵素（酵素II）サイトを含むリンカーを連
   結し、再度分画し、（４） 酵素Ｉサイトを含むプライ
   マーと酵素IIサイトを含むプライマーを用いてポリメラ
   ーゼ連鎖反応に付し、増幅されたｃＤＮＡを酵素Ｉ−酵
   素IIで消化した後分画し、（５） 得られたｃＤＮＡ断
   片を、シグナルペプチドを削除した公知の分泌タン白ま
   たは膜タン白の遺伝子の上流に連結し、真核細胞発現プ
   ラスミドベクターに組み込んだ後形質転換する工程より
   なるｃＤＮＡライブラリーの作製方法。
2. 【請求項２】 酵素ＩとしてEcoRＩを用い、酵素IIとし
   て SacＩを用い、シグナルペプチドを削除した公知の分
   泌タン白または膜タン白の遺伝子としてヒトＩＬ−２レ
   セプターα遺伝子を用いる請求項１に記載のｃＤＮＡラ
   イブラリーの作製方法。
3. 【請求項３】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
   ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
   ローグ。
4. 【請求項４】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 実質的に純粋な形である配列番号４で示
   されるアミノ酸配列中、１番目から７０番目までの配列
   からなるポリペプチド、そのホモローグ、そのフラグメ
   ントまたはそのフラグメントのホモローグである請求項
   １記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号４で示されるアミノ酸配列中、
   １番目から７０番目までの配列からなるポリペプチドで
   ある請求項５記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項３乃至６に記載されたポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項７記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
9. 【請求項９】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項７記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
10. 【請求項１０】 配列番号４で示される塩基配列中、１
    ３９番目から３４８番目までの配列を有する請求項７記
    載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズ
    するフラグメント。
11. 【請求項１１】 配列番号４で示される塩基配列中、１
    ３９番目から３４８番目までの配列を有する請求項１０
    記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項７から１１のいずれかの項に記
    載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の複製または発現ベク
    ターで形質転換された宿主細胞。
14. 【請求項１４】 請求項３から６のいずれかの項に記載
    されたポリペプチドを発現させるための条件下で請求項
    １０記載の宿主細胞を培養することからなるポリペプチ
    ドの製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項３から６のいずれかの項に記載
    されたポリペプチドに対するモノクローナル抗体または
    ポリクローナル抗体。
16. 【請求項１６】 請求項３から６のいずれかの項に記載
    されたポリペプチドまたは請求項１５記載の抗体と薬学
    的に許容される希釈剤または担体からなる薬剤組成物。