JP3362867B2 - ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａ - Google Patents
ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞表面抗原（以
下、ＦasまたはＦas抗原と称する）およびＦａｓをコー
ドするＤＮＡに関する。
下、ＦasまたはＦas抗原と称する）およびＦａｓをコー
ドするＤＮＡに関する。
【従来技術】Ｆasは、様々な細胞表面に存在するポリペ
プチドであって、細胞の自滅（アポトーシス）に深くか
かわっていると考えられている。アポトーシスはいわゆ
る細胞の壊死（necrosis)と区別される細胞の死の１形
態であり、胚形成、変態、内分泌依存性組織萎縮症およ
び正常組織のターンオーバー等、種々の細胞の交替、死
滅に際して観察されている［ウイリーら（Wyllie et a
l.）Int. Rev. Cytol.68: 251-306(1980); ウオーカー
ら（Walker et al.）Meth. Achiev. Exp. Pathol．13:
18-54(1988)；シュミットら（Schmid, et al.）Proc. N
atl. Acad. Sci.USA 83: 1881ー1885(1986); アッカー
ら（Ucker）Nature 327:62-64(1987); スミスら（Smith
et al.）Nature 337:181-184(1989); ウイリアムスら
（Williamset al.）Nature 343:76-79(1990)］。アポト
ーシスにおける細胞の形態学的および生化学的分析の結
果、以下の特徴が指摘されている。
プチドであって、細胞の自滅（アポトーシス）に深くか
かわっていると考えられている。アポトーシスはいわゆ
る細胞の壊死（necrosis)と区別される細胞の死の１形
態であり、胚形成、変態、内分泌依存性組織萎縮症およ
び正常組織のターンオーバー等、種々の細胞の交替、死
滅に際して観察されている［ウイリーら（Wyllie et a
l.）Int. Rev. Cytol.68: 251-306(1980); ウオーカー
ら（Walker et al.）Meth. Achiev. Exp. Pathol．13:
18-54(1988)；シュミットら（Schmid, et al.）Proc. N
atl. Acad. Sci.USA 83: 1881ー1885(1986); アッカー
ら（Ucker）Nature 327:62-64(1987); スミスら（Smith
et al.）Nature 337:181-184(1989); ウイリアムスら
（Williamset al.）Nature 343:76-79(1990)］。アポト
ーシスにおける細胞の形態学的および生化学的分析の結
果、以下の特徴が指摘されている。
【０００２】例えば、細胞質の収縮、原形質膜絨毛の消
失、核分裂および広範な染色体ＤＮＡの分解（約１８０
塩基対単位のオリゴマーへ）、さらにはアポトーシス体
の形成［ウイリーら（Wyllie, et al.） 1980、前
掲］。アポトーシスが生理学的および医学的に興味深い
現象であることは、それが免疫細胞（胸腺細胞）の死や
腫瘍細胞の死滅の形態であることに関連する。通常、腫
瘍の寛解（腫瘍の軽減）に際しては、ナチュラルキラー
細胞または細胞毒性Ｔリンパ細胞と標的細胞との相互作
用［デュークら（Ｄuke et al.）Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 80: 6361ー6365(1983); シュミットら（Schmid
et al.）(1986)、前掲; アッカー（Ucker）(1987) 前
掲］、あるいは標的細胞に対する腫瘍壊死因子−α（Ｔ
ＮＦ−α）またはその近縁のサイトカインリンホトキシ
ン（ＴＮＦ−β）の作用［シュミットら（Schmid et a
l.）(1986)前掲; デールトリーら（Dealtry et al.）Eu
r.J.Immunol. 17: 689-693(1987); ラリック（Larric
k）およびライト（ Wright）FASEBJ. 4: 3215-3223(199
0)］により、アポトーシスが誘導され、標的細胞が死滅
する。
失、核分裂および広範な染色体ＤＮＡの分解（約１８０
塩基対単位のオリゴマーへ）、さらにはアポトーシス体
の形成［ウイリーら（Wyllie, et al.） 1980、前
掲］。アポトーシスが生理学的および医学的に興味深い
現象であることは、それが免疫細胞（胸腺細胞）の死や
腫瘍細胞の死滅の形態であることに関連する。通常、腫
瘍の寛解（腫瘍の軽減）に際しては、ナチュラルキラー
細胞または細胞毒性Ｔリンパ細胞と標的細胞との相互作
用［デュークら（Ｄuke et al.）Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 80: 6361ー6365(1983); シュミットら（Schmid
et al.）(1986)、前掲; アッカー（Ucker）(1987) 前
掲］、あるいは標的細胞に対する腫瘍壊死因子−α（Ｔ
ＮＦ−α）またはその近縁のサイトカインリンホトキシ
ン（ＴＮＦ−β）の作用［シュミットら（Schmid et a
l.）(1986)前掲; デールトリーら（Dealtry et al.）Eu
r.J.Immunol. 17: 689-693(1987); ラリック（Larric
k）およびライト（ Wright）FASEBJ. 4: 3215-3223(199
0)］により、アポトーシスが誘導され、標的細胞が死滅
する。
【０００３】ところで、ＴＮＦとＦas抗原とはダウンレ
ギュレーションの関係にあることから、ＴＮＦの細胞毒
性作用の発現にＦas抗原が加担している可能性が推測さ
れた。例えば、細胞表面のＴＮＦレセプターと細胞表面
のＦas抗原決定基とが密接な関係にあることが示唆され
ていた。細胞表面のＴＮＦレセプター（Ｉ型およびII
型）、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、Ｂ細胞抗原
ＣＤ４０およびＴ細胞抗原ＯＸ４０等は、すべて生理学
的に重要な細胞表面膜タンパク質群を構成しておりＮＧ
ＦＲ／ＴＮＦＲファミリーと称される。
ギュレーションの関係にあることから、ＴＮＦの細胞毒
性作用の発現にＦas抗原が加担している可能性が推測さ
れた。例えば、細胞表面のＴＮＦレセプターと細胞表面
のＦas抗原決定基とが密接な関係にあることが示唆され
ていた。細胞表面のＴＮＦレセプター（Ｉ型およびII
型）、神経成長因子（ＮＧＦ）レセプター、Ｂ細胞抗原
ＣＤ４０およびＴ細胞抗原ＯＸ４０等は、すべて生理学
的に重要な細胞表面膜タンパク質群を構成しておりＮＧ
ＦＲ／ＴＮＦＲファミリーと称される。
【０００４】Ｆas抗原とアポトーシスとの関係につい
て、本発明者らは先に、ヒトＦas抗原に対するマウスモ
ノクローナル抗体がＦas抗原を発現しているヒト細胞に
対して溶解作用を示すが、マウス細胞には作用しないこ
とを明らかにした[ヨネハラら、J. Exp. Med. 169: 174
7-1756(1989)]また、トラウスらはＦas抗体に類似した
抗体、抗Ａpo−１同様の効果をもつことを示した；[ト
ラウスら（Trauth et al.）Science 245: 301-305(198
9)］。
て、本発明者らは先に、ヒトＦas抗原に対するマウスモ
ノクローナル抗体がＦas抗原を発現しているヒト細胞に
対して溶解作用を示すが、マウス細胞には作用しないこ
とを明らかにした[ヨネハラら、J. Exp. Med. 169: 174
7-1756(1989)]また、トラウスらはＦas抗体に類似した
抗体、抗Ａpo−１同様の効果をもつことを示した；[ト
ラウスら（Trauth et al.）Science 245: 301-305(198
9)］。
【０００５】さらに本発明者らは最近の研究で、ヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞では、該抗Ｆasモノ
クローナル抗体の細胞死滅作用に対する感受性が、非感
染細胞よりも高いことを見いだした［コバヤシら（Koba
yasi et al.）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9620ー9
624(1990)］。感染細胞での優勢なＦas抗原の発現がヒ
ト免疫不全ウイルス感染により誘導されたのか、あるい
は一般的な形質転換によりもたらされたのかは不明であ
る。しかしながら、Ｆasに特異的なモノクローナル抗体
を用いればＨＩＶ感染細胞を特異的にアポトーシスに導
き死滅させることが可能であると考えられる。
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞では、該抗Ｆasモノ
クローナル抗体の細胞死滅作用に対する感受性が、非感
染細胞よりも高いことを見いだした［コバヤシら（Koba
yasi et al.）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9620ー9
624(1990)］。感染細胞での優勢なＦas抗原の発現がヒ
ト免疫不全ウイルス感染により誘導されたのか、あるい
は一般的な形質転換によりもたらされたのかは不明であ
る。しかしながら、Ｆasに特異的なモノクローナル抗体
を用いればＨＩＶ感染細胞を特異的にアポトーシスに導
き死滅させることが可能であると考えられる。
【０００６】また、本発明者らはヒト結腸がんＨＴ−２
９細胞をインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）で処理す
ると細胞表面Ｆas抗原が誘導され、該腫瘍細胞の抗Ｆas
抗体の細胞毒性作用に対する感受性がより高くなること
を見いだした（ヨネハラら、１９８９、前掲）。このよ
うに、Ｆas抗原がアポトーシスに密接な関係にあること
は指摘されているが、まだ不明な点が多く残されてい
る。従ってＦas抗原の完全な構造を明らかにし、機能を
解明することは生理学的および病理学的に意義あると言
える。また、Ｆas抗原の構造を明らかにすることで、Ｆ
asと特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることが
でき、例えばＨＩＶ感染に基づく疾患や悪性腫瘍の治療
の途が開けると考えられる。
９細胞をインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）で処理す
ると細胞表面Ｆas抗原が誘導され、該腫瘍細胞の抗Ｆas
抗体の細胞毒性作用に対する感受性がより高くなること
を見いだした（ヨネハラら、１９８９、前掲）。このよ
うに、Ｆas抗原がアポトーシスに密接な関係にあること
は指摘されているが、まだ不明な点が多く残されてい
る。従ってＦas抗原の完全な構造を明らかにし、機能を
解明することは生理学的および病理学的に意義あると言
える。また、Ｆas抗原の構造を明らかにすることで、Ｆ
asと特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることが
でき、例えばＨＩＶ感染に基づく疾患や悪性腫瘍の治療
の途が開けると考えられる。
【０００７】上記の目的を達成するためにはＦasポリペ
プチドを十分量供給し得る手段を確立することが必要で
ある。近年、生理学的に活性な物質の調製方法として、
ＤＮＡ組換え技術が利用されるようになったが、Ｆas抗
原を該技術を用いて調製するには、Ｆasタンパク質をコ
ードするＤＮＡを単離し、クローニングする必要があ
る。
プチドを十分量供給し得る手段を確立することが必要で
ある。近年、生理学的に活性な物質の調製方法として、
ＤＮＡ組換え技術が利用されるようになったが、Ｆas抗
原を該技術を用いて調製するには、Ｆasタンパク質をコ
ードするＤＮＡを単離し、クローニングする必要があ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＦａ
ｓ抗原を純粋なかたちで大量に入手し得る手段を提供す
ることに成功した。すなわち本発明者らは、ヒトＦａｓ
抗原の遺伝子を解明するとともに、そのＦａｓ抗原遺伝
子を遺伝子工学的に操作する道を始めて提供した。した
がって本発明は、ヒトＦａｓ抗原をコードするＤＮＡあ
るいはそれから誘導されるＤＮＡ、さらにはそのＤＮＡ
断片を提供する。このようなものには、そのアンチセン
ス配列を持つものも包含される。また、本発明は上記Ｆ
ａｓ抗原をコードするＤＮＡあるいはその誘導体を用い
て産生された各種蛋白質やペプチド等の産物をも提供す
る。本発明は、上記Ｆａｓ抗原をコードするＤＮＡある
いはそれから誘導されたＤＮＡ、その断片を含有するプ
ラスミドあるいはベクターをも提供する。さらに、それ
らプラスミドあるいはベクターを増殖可能にあるいは発
現可能に保持する各種形質転換体をも提供するものであ
る。本発明は、上記Ｆａｓ抗原をコードするＤＮＡの塩
基配列情報を利用して作製された各種の産物をも意図す
るものである。本発明に従えば、上記ｃＤＮＡクローン
（ｐＦ５８）の塩基配列あるいはそれから誘導される断
片あるいはその塩基配列についての情報を利用して、ヒ
ト細胞を含めた各種の細胞におけるＦａｓ遺伝子あるい
はＦａｓ遺伝子類縁体を検索することが可能となるが、
本発明は、このようにして最終的に得られたものをも意
図し得ることが理解されよう。このような検索にあたっ
ては本願明細書中に記載の方法あるいはその方法を適宜
改変して行うことができる。本発明者らは種々のヒト細
胞株をＦas抗原の発現に関してスクリーニングしてヒト
Ｔリンパ腫細胞系ＫＴ−３が他の細胞株の約２０倍のＦ
as抗原を発現することを見い出した。次いで、この細胞
株を用い、Ｆas抗原決定基をコードするｃＤＮＡの単離
とクローニングに成功した。得られた１つのｃＤＮＡク
ローン（ｐＦ５８）のヌクレオチド配列および推定のア
ミノ酸配列を図１および図２に示す。また制限酵素地図
を図３に示す。
ｓ抗原を純粋なかたちで大量に入手し得る手段を提供す
ることに成功した。すなわち本発明者らは、ヒトＦａｓ
抗原の遺伝子を解明するとともに、そのＦａｓ抗原遺伝
子を遺伝子工学的に操作する道を始めて提供した。した
がって本発明は、ヒトＦａｓ抗原をコードするＤＮＡあ
るいはそれから誘導されるＤＮＡ、さらにはそのＤＮＡ
断片を提供する。このようなものには、そのアンチセン
ス配列を持つものも包含される。また、本発明は上記Ｆ
ａｓ抗原をコードするＤＮＡあるいはその誘導体を用い
て産生された各種蛋白質やペプチド等の産物をも提供す
る。本発明は、上記Ｆａｓ抗原をコードするＤＮＡある
いはそれから誘導されたＤＮＡ、その断片を含有するプ
ラスミドあるいはベクターをも提供する。さらに、それ
らプラスミドあるいはベクターを増殖可能にあるいは発
現可能に保持する各種形質転換体をも提供するものであ
る。本発明は、上記Ｆａｓ抗原をコードするＤＮＡの塩
基配列情報を利用して作製された各種の産物をも意図す
るものである。本発明に従えば、上記ｃＤＮＡクローン
（ｐＦ５８）の塩基配列あるいはそれから誘導される断
片あるいはその塩基配列についての情報を利用して、ヒ
ト細胞を含めた各種の細胞におけるＦａｓ遺伝子あるい
はＦａｓ遺伝子類縁体を検索することが可能となるが、
本発明は、このようにして最終的に得られたものをも意
図し得ることが理解されよう。このような検索にあたっ
ては本願明細書中に記載の方法あるいはその方法を適宜
改変して行うことができる。本発明者らは種々のヒト細
胞株をＦas抗原の発現に関してスクリーニングしてヒト
Ｔリンパ腫細胞系ＫＴ−３が他の細胞株の約２０倍のＦ
as抗原を発現することを見い出した。次いで、この細胞
株を用い、Ｆas抗原決定基をコードするｃＤＮＡの単離
とクローニングに成功した。得られた１つのｃＤＮＡク
ローン（ｐＦ５８）のヌクレオチド配列および推定のア
ミノ酸配列を図１および図２に示す。また制限酵素地図
を図３に示す。
【０００９】上記のｐＦ５８ｃＤＮＡクローンは３３５
アミノ酸からなるタンパク質をコードすることができる
オープンリーディングフレームを有する。推定のアミノ
酸配列から、成熟Ｆas抗原は３１９アミノ酸からなるタ
ンパク質であり、細胞外領域、トランスメンブラン（膜
貫通）領域、および細胞質領域で構成されていると推定
される。このような構成は多くの細胞表面レセプターと
共通している。後述するように、Ｆasタンパク質のアミ
ノ酸配列を他の細胞表面タンパク質のアミノ酸配列と比
較し、該タンパク質も細胞表面膜タンパク質群の一つＮ
ＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリーに属することが確認され
た。
アミノ酸からなるタンパク質をコードすることができる
オープンリーディングフレームを有する。推定のアミノ
酸配列から、成熟Ｆas抗原は３１９アミノ酸からなるタ
ンパク質であり、細胞外領域、トランスメンブラン（膜
貫通）領域、および細胞質領域で構成されていると推定
される。このような構成は多くの細胞表面レセプターと
共通している。後述するように、Ｆasタンパク質のアミ
ノ酸配列を他の細胞表面タンパク質のアミノ酸配列と比
較し、該タンパク質も細胞表面膜タンパク質群の一つＮ
ＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリーに属することが確認され
た。
【００１０】本発明のＦas抗原をコードするｐＦ５８ｃ
ＤＮＡをヒトペプチド鎖延長因子１α遺伝子のプロモー
ターのコントロール下に含有する発現プラスミド（ｐＥ
ＦＦ−５８）を構築し、該プラスミドでマウスＴ−細胞
リンパ腫細胞ＷＲ１９Ｌおよびマウス線維芽細胞腫細胞
Ｌ９２９を形質転換した。形質転換体をフローサイトメ
トリー分析で試験した結果、いずれも表面に極めて多量
のＦas抗原を発現することが示された。また、これらの
形質転換された細胞株は抗Ｆas抗体に濃度依存性の応答
を示し死滅することが認められた。これら細胞の死滅は
細胞の形態学的な変化および染色体の断片化等の観察か
らアポトーシスによることが明らかになった。
ＤＮＡをヒトペプチド鎖延長因子１α遺伝子のプロモー
ターのコントロール下に含有する発現プラスミド（ｐＥ
ＦＦ−５８）を構築し、該プラスミドでマウスＴ−細胞
リンパ腫細胞ＷＲ１９Ｌおよびマウス線維芽細胞腫細胞
Ｌ９２９を形質転換した。形質転換体をフローサイトメ
トリー分析で試験した結果、いずれも表面に極めて多量
のＦas抗原を発現することが示された。また、これらの
形質転換された細胞株は抗Ｆas抗体に濃度依存性の応答
を示し死滅することが認められた。これら細胞の死滅は
細胞の形態学的な変化および染色体の断片化等の観察か
らアポトーシスによることが明らかになった。
【００１１】即ち、本発明はヒト細胞表面抗原Ｆasをコ
ードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを担持する発現ベクター
を提供するものである。本発明のｃＤＮＡ（ｐＦ５８）
は受託番号、微工研条寄第３８２６号の下、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているＥsc
herichia coli,ｐＦ５８から常法通り単離することがで
きる(受託日：平成３年４月１２日)
ードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを担持する発現ベクター
を提供するものである。本発明のｃＤＮＡ（ｐＦ５８）
は受託番号、微工研条寄第３８２６号の下、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているＥsc
herichia coli,ｐＦ５８から常法通り単離することがで
きる(受託日：平成３年４月１２日)
【００１２】本発明のヒトＦas抗原をコードするcＤＮ
Ａのクローニングは当該技術分野で既知の方法により行
われた。即ち、ＫＴ−３細胞から全ＲＮＡを調製し、po
ly（Ａ）ＲＮＡを選択した。次いで逆転写酵素等を用い
て２本鎖ｃＤＮＡを合成し、哺乳類発現ベクターｐＣＥ
Ｖ４（イトウら、1990)に導入してｃＤＮＡライブラリー
を調製した。約８ｘ１０5個の独立したクローンを用
い、スフェロプラスト融合法でＣＯＳ−７細胞をトラン
スフェクションした。トランスフェクションの７２時間
後、ＣＯＳ−７細胞をマウス抗Ｆas抗体（ＩｇＭ）と一
緒にインキュベーションし、Ｆas抗原を発現しているＣ
ＯＳ細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭを用いてパニング法
（Panning法）［シード（Ｓeed）およびアルフロ（Aruf
fo）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365ー3369(198
7)］で回収した。
Ａのクローニングは当該技術分野で既知の方法により行
われた。即ち、ＫＴ−３細胞から全ＲＮＡを調製し、po
ly（Ａ）ＲＮＡを選択した。次いで逆転写酵素等を用い
て２本鎖ｃＤＮＡを合成し、哺乳類発現ベクターｐＣＥ
Ｖ４（イトウら、1990)に導入してｃＤＮＡライブラリー
を調製した。約８ｘ１０5個の独立したクローンを用
い、スフェロプラスト融合法でＣＯＳ−７細胞をトラン
スフェクションした。トランスフェクションの７２時間
後、ＣＯＳ−７細胞をマウス抗Ｆas抗体（ＩｇＭ）と一
緒にインキュベーションし、Ｆas抗原を発現しているＣ
ＯＳ細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭを用いてパニング法
（Panning法）［シード（Ｓeed）およびアルフロ（Aruf
fo）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365ー3369(198
7)］で回収した。
【００１３】ハート[Hirt、 J. Biol. Chem. 264: 14929
-14934(1967)]の方法で付着ＣＯＳ細胞から細胞外ＤＮ
Ａを調製し大腸菌（Ｅscherichia coli）に導入した。
得られたコロニーを分取しＣＯＳ細胞とのスフェロプラ
スト融合に用い上記と同様にパニングした。３回の繰り
返し操作の後１４個の別個のクローンを得、その内、
３.０kbの挿入(インサート)を有するｐＦ１と１.５kbの
挿入を有するｐＦ３を用いてＣＯＳ細胞をトランススフ
ェクションした。得られた形質転換細胞を抗Ｆas抗体を
用いるフローサイトメトリーで分析した。その結果２個
のｃＤＮＡはＦaｓ抗原決定基をコードしていることが
分かった。これらｐＦ１およびｐＦ３を制限酵素マッピ
ングとＤＮＡ配列決定に付したところ５’末端の約５０
０塩基は同一配列であるが、３’末端の配列は完全に異
なることが分かった（図３Ａ参照）。
-14934(1967)]の方法で付着ＣＯＳ細胞から細胞外ＤＮ
Ａを調製し大腸菌（Ｅscherichia coli）に導入した。
得られたコロニーを分取しＣＯＳ細胞とのスフェロプラ
スト融合に用い上記と同様にパニングした。３回の繰り
返し操作の後１４個の別個のクローンを得、その内、
３.０kbの挿入(インサート)を有するｐＦ１と１.５kbの
挿入を有するｐＦ３を用いてＣＯＳ細胞をトランススフ
ェクションした。得られた形質転換細胞を抗Ｆas抗体を
用いるフローサイトメトリーで分析した。その結果２個
のｃＤＮＡはＦaｓ抗原決定基をコードしていることが
分かった。これらｐＦ１およびｐＦ３を制限酵素マッピ
ングとＤＮＡ配列決定に付したところ５’末端の約５０
０塩基は同一配列であるが、３’末端の配列は完全に異
なることが分かった（図３Ａ参照）。
【００１４】次いで元のＫＴ−３細胞のｃＤＮＡライブ
ラリーをｐＦ３の５’末端のＸhoＩ-ＢamＨＩＤＮＡ断
片を用いるコロニーハイブリダイゼーションでスクリー
ニングした。その結果、同一の制限酵素地図を持ち、互
いにオーバーラップする１.８〜２.６kbのｃＤＮＡを含
有する１０個のクローンが得られ、最長のｃＤＮＡクロ
ーン（ｐＦ５８）を選択した。該ｃＤＮＡの制限地図を
図３に、ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
図１および図２、並びに配列番号１に示す。
ラリーをｐＦ３の５’末端のＸhoＩ-ＢamＨＩＤＮＡ断
片を用いるコロニーハイブリダイゼーションでスクリー
ニングした。その結果、同一の制限酵素地図を持ち、互
いにオーバーラップする１.８〜２.６kbのｃＤＮＡを含
有する１０個のクローンが得られ、最長のｃＤＮＡクロ
ーン（ｐＦ５８）を選択した。該ｃＤＮＡの制限地図を
図３に、ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
図１および図２、並びに配列番号１に示す。
【００１５】ｐＦ５８ｃＤＮＡは３３５アミノ酸をコー
ドし得る１，００８ヌクレオチドの長いオープンリーデ
ィングフレームを有する。推定のアミノ酸配列のヒドロ
パシー分析の結果、Ｎ−末端にシグナル配列が存在して
おり（図３Ｂ）、成熟Ｆas抗原はその部分が切断され、
分子量計算値３６，０００の３１９アミノ酸からなるタ
ンパク質と推定される。このタンパク質は上記のごとく
１５７アミノ酸からなる細胞外領域、１７アミノ酸から
なる膜貫通領域および１４５アミノ酸からなる細胞質領
域で構成されている。
ドし得る１，００８ヌクレオチドの長いオープンリーデ
ィングフレームを有する。推定のアミノ酸配列のヒドロ
パシー分析の結果、Ｎ−末端にシグナル配列が存在して
おり（図３Ｂ）、成熟Ｆas抗原はその部分が切断され、
分子量計算値３６，０００の３１９アミノ酸からなるタ
ンパク質と推定される。このタンパク質は上記のごとく
１５７アミノ酸からなる細胞外領域、１７アミノ酸から
なる膜貫通領域および１４５アミノ酸からなる細胞質領
域で構成されている。
【００１６】Ｆas抗原を発現するＫＴ−３細胞、既述の
Ｆas抗原を発現するＷＲ１９Ｌ形質転換体クローンであ
るＦ５８−１２Ａの膜フラクションを、抗Ｆas抗体を用
いるウエスタンブロッティング分析に付したところ、見
掛けの分子量４３，０００に特異的なバンドが現れた。
この値は、Ｆas抗原の細胞外領域に存在する２個のＮ−
グリコシル化部位（図１）に糖鎖が結合した状態を考慮
すると、上記計算値（３６，０００）とよく一致する。
Ｆas抗原を発現するＷＲ１９Ｌ形質転換体クローンであ
るＦ５８−１２Ａの膜フラクションを、抗Ｆas抗体を用
いるウエスタンブロッティング分析に付したところ、見
掛けの分子量４３，０００に特異的なバンドが現れた。
この値は、Ｆas抗原の細胞外領域に存在する２個のＮ−
グリコシル化部位（図１）に糖鎖が結合した状態を考慮
すると、上記計算値（３６，０００）とよく一致する。
【００１７】さらに、ＫＴ−３細胞をＦasｃＤＮＡをプ
ローブとするノーザンハイブリダイゼーションに付し、
２.７および１.９kbの２個のバンドを検出した。poly
(A)テイルの存在を考慮すると、大きいｍＲＮＡは、上
記ｐＦ５８ｃＤＮＡとほぼ同一のサイズであると考えら
れる。従って、ｐＦ５８は大きいｍＲＮＡの完全長ｃＤ
ＮＡであると考えられる。なお、ヒト結腸がんＨＴ−２
９細胞を３００μl／mlのヒトＩＦＮ−γで７時間処理
してから収穫すると、Ｆas抗原の大きいｍＲＮＡと小さ
いｍＲＮＡの両方の発現が顕著に誘導された。
ローブとするノーザンハイブリダイゼーションに付し、
２.７および１.９kbの２個のバンドを検出した。poly
(A)テイルの存在を考慮すると、大きいｍＲＮＡは、上
記ｐＦ５８ｃＤＮＡとほぼ同一のサイズであると考えら
れる。従って、ｐＦ５８は大きいｍＲＮＡの完全長ｃＤ
ＮＡであると考えられる。なお、ヒト結腸がんＨＴ−２
９細胞を３００μl／mlのヒトＩＦＮ−γで７時間処理
してから収穫すると、Ｆas抗原の大きいｍＲＮＡと小さ
いｍＲＮＡの両方の発現が顕著に誘導された。
【００１８】コロニーハイブリダイゼーションでＫＴ−
３ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクロー
ンの４０％が約１，８００bpの長さであった。ｐＦ５８
ｃＤＮＡの３’非コード領域（塩基番号１．８３１〜
１．８３６）には、ポリ（Ａ）付加シグナルが存在する
ことから（図２）、ノーザンハイブリダイゼーションで
見いだされた２種のサイズのＦａｓｍＲＮＡは２個の異
なるｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを使用することで生成
すると思われる。
３ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクロー
ンの４０％が約１，８００bpの長さであった。ｐＦ５８
ｃＤＮＡの３’非コード領域（塩基番号１．８３１〜
１．８３６）には、ポリ（Ａ）付加シグナルが存在する
ことから（図２）、ノーザンハイブリダイゼーションで
見いだされた２種のサイズのＦａｓｍＲＮＡは２個の異
なるｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを使用することで生成
すると思われる。
【００１９】本発明により、ヒトＦasをコードするｃＤ
ＮＡがクローニングされ、そのヌクレオチド配列が明ら
かになったので、適当な宿主系内で組換えＦasを発現す
る発現ベクターを構築することは当業者にとって通常の
技術範囲である。次いで、構築した発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られた形質転換体をＦasをコード
するＤＮＡの発現に適した条件下で培養することによ
り、組換えヒトＦasを製造することができる。このよう
にして得られた組換えヒトＦasは、免疫細胞等、様々な
細胞のアポトーシス機構の解明、あるいは腫瘍の診断や
治療に有用な、Ｆasを発現する腫瘍細胞に特異的に作用
するモノクローナル抗体の調製、あるいはＴＮＦの細胞
溶解作用関係の究明等、研究および臨床面で有用であ
る。さらに、現在の当該化学分野の技術水準を持ってす
れば、当該蛋白質の基本的な性質（物性、活性、免疫学
的活性等）を変化させることなく、そのアミノ酸配列に
欠失、付加あるいは置換といった変異を導入することは
容易に考え得る。例えば、疎水性アミノ酸残基の他の疎
水性アミノ酸残基への置換、陽性電荷を持つアミノ酸の
他の陽性電荷を持つアミノ酸への置換、ＧｌｕとＡｓｐ
あるいはＬｙｓとＨｉｓとＡｒｇでの相互置換、または
Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕの群間、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓの群間、およびＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐ
ｈｅの群間での置換は充分に推定できる。さらに本発明
の蛋白質の精製を容易にする為に本蛋白質のＮ末端側や
Ｃ末端側に別の蛋白質、例えば大腸菌のβ−ガラクトシ
ダーゼ、マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメントを遺伝子工学
的手法等を用いて付加すること、あるいは本蛋白質の機
能をより深く解析する為に同様の方法を用いてアミノ酸
配列の一部を欠失、置換することなどは当業者にとって
極めて容易である。従って、このようなヒトＦａｓ抗原
アミノ酸変異体も本発明に包含される。例えば、アミノ
酸番号１ないし１５７で示される可溶型Ｆａｓ抗原は、
このような変異体として好適である。
ＮＡがクローニングされ、そのヌクレオチド配列が明ら
かになったので、適当な宿主系内で組換えＦasを発現す
る発現ベクターを構築することは当業者にとって通常の
技術範囲である。次いで、構築した発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られた形質転換体をＦasをコード
するＤＮＡの発現に適した条件下で培養することによ
り、組換えヒトＦasを製造することができる。このよう
にして得られた組換えヒトＦasは、免疫細胞等、様々な
細胞のアポトーシス機構の解明、あるいは腫瘍の診断や
治療に有用な、Ｆasを発現する腫瘍細胞に特異的に作用
するモノクローナル抗体の調製、あるいはＴＮＦの細胞
溶解作用関係の究明等、研究および臨床面で有用であ
る。さらに、現在の当該化学分野の技術水準を持ってす
れば、当該蛋白質の基本的な性質（物性、活性、免疫学
的活性等）を変化させることなく、そのアミノ酸配列に
欠失、付加あるいは置換といった変異を導入することは
容易に考え得る。例えば、疎水性アミノ酸残基の他の疎
水性アミノ酸残基への置換、陽性電荷を持つアミノ酸の
他の陽性電荷を持つアミノ酸への置換、ＧｌｕとＡｓｐ
あるいはＬｙｓとＨｉｓとＡｒｇでの相互置換、または
Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕの群間、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓの群間、およびＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐ
ｈｅの群間での置換は充分に推定できる。さらに本発明
の蛋白質の精製を容易にする為に本蛋白質のＮ末端側や
Ｃ末端側に別の蛋白質、例えば大腸菌のβ−ガラクトシ
ダーゼ、マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメントを遺伝子工学
的手法等を用いて付加すること、あるいは本蛋白質の機
能をより深く解析する為に同様の方法を用いてアミノ酸
配列の一部を欠失、置換することなどは当業者にとって
極めて容易である。従って、このようなヒトＦａｓ抗原
アミノ酸変異体も本発明に包含される。例えば、アミノ
酸番号１ないし１５７で示される可溶型Ｆａｓ抗原は、
このような変異体として好適である。
【００２０】本発明のヒトＦasをコードするcＤＮＡの
ヌクレオチド配列は図１および図２に記載されている
が、当業者ならば、該ＤＮＡから、ヌクレオチドの挿
入、置換または欠失により、天然のＦas抗原決定基と同
様の機能を有する誘導体を導くことができるということ
を理解するであろう。従って、そのようにして導かれる
ＤＮＡも本発明の範囲に包含されるものである。このよ
うなヌクレオチドの挿入、置換または欠失法としては、
例えば、特定部位指定突然変異誘発法（サイトディレク
ティッドミュータジェネシス）あるいは遺伝子相同組換
え法（ホモロガスリコンビネーション）や、制限酵素に
よる切断並びにリガーゼによる結合を組み合わせるなど
して行うことができる。また、合成ＤＮＡ断片をプライ
マーとしたプライマー伸長法（プライマーエクステンシ
ョン）やポリメラーゼ連鎖増幅法（ポリメラーゼチェー
ンリアクション）を上記方法に適宜組み合わせて実施す
ることもできる。これらの方法は、例えばサムブルック
等編［モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマ
ニュアル 第２版］コールドスプリングハーバーラボラ
トリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子
工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．
編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ス
トックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準
じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが
できる。さらに遺伝子工学の技術分野では、それがコー
ドするアミノ酸配列を変化させることなくその塩基配列
中の塩基を別の塩基配列と置換することが可能であるこ
とが知られている。すなわち、ほとんどのアミノ酸は複
数個の遺伝暗号でコードされており、例えばＶａｌはＧ
ＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧの何れか、ＡｌａはＧＣ
Ａ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧの何れかで各々コードされ
る。従って本発明の遺伝子塩基配列は、このような遺伝
暗号の縮重に伴う塩基配列の置換変異体も包含する。ま
た本発明が開示されれば、この塩基配列にコードされる
蛋白質の形質転換体での産生量を増大させるためにその
５’末端側にプロモーターやエンハンサーといった塩基
配列を付加することや、転写後のｍＲＮＡを安定化させ
る為に３’末端側にポリＡ付加シグナル塩基配列を付加
すること、あるいは本発明の塩基配列にコードされる蛋
白質のより深い機能解析のための部分的にそのアミノ酸
を欠失あるいは付加した変異蛋白質を得るために、本発
明の塩基配列内に塩基の欠失や挿入を行うことなどは当
業者にとっては極めて容易なことである。従って、本発
明の塩基配列の５’末端側や３’末端側および／または
それらの間に１つ以上の塩基の付加、欠失、挿入を有す
る塩基配列も本発明の塩基配列に包含される。さらに本
発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、本
発明のＤＮＡと相補的なＤＮＡにハイブリダイズするＤ
ＮＡおよびヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡ断片とハイブリダイ
ズするＤＮＡをも包含する。
ヌクレオチド配列は図１および図２に記載されている
が、当業者ならば、該ＤＮＡから、ヌクレオチドの挿
入、置換または欠失により、天然のＦas抗原決定基と同
様の機能を有する誘導体を導くことができるということ
を理解するであろう。従って、そのようにして導かれる
ＤＮＡも本発明の範囲に包含されるものである。このよ
うなヌクレオチドの挿入、置換または欠失法としては、
例えば、特定部位指定突然変異誘発法（サイトディレク
ティッドミュータジェネシス）あるいは遺伝子相同組換
え法（ホモロガスリコンビネーション）や、制限酵素に
よる切断並びにリガーゼによる結合を組み合わせるなど
して行うことができる。また、合成ＤＮＡ断片をプライ
マーとしたプライマー伸長法（プライマーエクステンシ
ョン）やポリメラーゼ連鎖増幅法（ポリメラーゼチェー
ンリアクション）を上記方法に適宜組み合わせて実施す
ることもできる。これらの方法は、例えばサムブルック
等編［モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマ
ニュアル 第２版］コールドスプリングハーバーラボラ
トリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子
工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．
編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ス
トックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準
じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが
できる。さらに遺伝子工学の技術分野では、それがコー
ドするアミノ酸配列を変化させることなくその塩基配列
中の塩基を別の塩基配列と置換することが可能であるこ
とが知られている。すなわち、ほとんどのアミノ酸は複
数個の遺伝暗号でコードされており、例えばＶａｌはＧ
ＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧの何れか、ＡｌａはＧＣ
Ａ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧの何れかで各々コードされ
る。従って本発明の遺伝子塩基配列は、このような遺伝
暗号の縮重に伴う塩基配列の置換変異体も包含する。ま
た本発明が開示されれば、この塩基配列にコードされる
蛋白質の形質転換体での産生量を増大させるためにその
５’末端側にプロモーターやエンハンサーといった塩基
配列を付加することや、転写後のｍＲＮＡを安定化させ
る為に３’末端側にポリＡ付加シグナル塩基配列を付加
すること、あるいは本発明の塩基配列にコードされる蛋
白質のより深い機能解析のための部分的にそのアミノ酸
を欠失あるいは付加した変異蛋白質を得るために、本発
明の塩基配列内に塩基の欠失や挿入を行うことなどは当
業者にとっては極めて容易なことである。従って、本発
明の塩基配列の５’末端側や３’末端側および／または
それらの間に１つ以上の塩基の付加、欠失、挿入を有す
る塩基配列も本発明の塩基配列に包含される。さらに本
発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、本
発明のＤＮＡと相補的なＤＮＡにハイブリダイズするＤ
ＮＡおよびヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡ断片とハイブリダイ
ズするＤＮＡをも包含する。
【００２１】本発明のヒトＦasをコードするＤＮＡを含
有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築すること
ができる。ヒトＦasＤＮＡの発現に適したベクターは、
該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロ
モーターを有するものであろう。適当なプロモーターも
当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に
応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウィル
ス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因ＥＦ−
１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモ
ーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウィルス
のプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメ
ラーゼのプロモーターやβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
プロモーター等を細菌、大腸菌での発現で、グリセルア
ルデヒドリン酸脱水素酵素やアルコール脱水素酵素のプ
ロモーター等を酵母での発現に用いることができる。ヒ
トＦasＤＮＡの挿入部位下流には転写終結シグナルがあ
ることが望ましい。これは動物細胞での発現においては
ヒトＦas配列から得られたものでも、他の遺伝子起源の
ものであってもよいが大腸菌のどでの発現の場合は大腸
菌の遺伝子由来のものが望ましい。
有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築すること
ができる。ヒトＦasＤＮＡの発現に適したベクターは、
該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロ
モーターを有するものであろう。適当なプロモーターも
当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に
応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウィル
ス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因ＥＦ−
１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモ
ーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウィルス
のプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメ
ラーゼのプロモーターやβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
プロモーター等を細菌、大腸菌での発現で、グリセルア
ルデヒドリン酸脱水素酵素やアルコール脱水素酵素のプ
ロモーター等を酵母での発現に用いることができる。ヒ
トＦasＤＮＡの挿入部位下流には転写終結シグナルがあ
ることが望ましい。これは動物細胞での発現においては
ヒトＦas配列から得られたものでも、他の遺伝子起源の
ものであってもよいが大腸菌のどでの発現の場合は大腸
菌の遺伝子由来のものが望ましい。
【００２２】ベクター中には薬物耐性マーカーのような
選択可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ま
しいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げるこ
とができる。あるいは、ＦasＤＮＡを含有する発現ベク
ターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラス
ミドを用いて同時に形質転換してもよい。
選択可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ま
しいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げるこ
とができる。あるいは、ＦasＤＮＡを含有する発現ベク
ターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラス
ミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００２３】発現ベクターを構築するには本発明のヒト
ＦasをコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入する。
適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、
選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既
知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを挿入し、培
養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目的に用いる
ことができるＤＮＡベクターとして、例えば動物細胞で
の発現においてはｐＫＣＲ，ｐＥＦ−ＢＯＳ，ＣＤＭ
８，ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大
腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ，ｐＵＣなど、酵母におい
てはｐＹＧ１００，ＹＣｐＡＤ１等を挙げることができ
る。
ＦasをコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入する。
適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、
選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既
知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを挿入し、培
養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目的に用いる
ことができるＤＮＡベクターとして、例えば動物細胞で
の発現においてはｐＫＣＲ，ｐＥＦ−ＢＯＳ，ＣＤＭ
８，ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大
腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ，ｐＵＣなど、酵母におい
てはｐＹＧ１００，ＹＣｐＡＤ１等を挙げることができ
る。
【００２４】本発明のヒトＦａｓ抗原の発現に用いる培
養細胞は、自己増殖が可能で、本発明のＤＮＡを発現し
得るものなら如何なるものでもよい。例えば、原核微生
物である大腸菌や真核微生物である酵母（サッカロミセ
ス セレビシエ等）、さらには真核生物由来の組織培養
細胞が使用できる。宿主として適した大腸菌株として
は、例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ１、χ１７７６、ＪＭ１
０１、ＪＭ１０９などが挙げられ、これらは薬剤耐性や
酵素活性によって容易に形質転換体を選別することがで
きるので便利である。組織培養細胞としては、昆虫由
来、トリ由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由
来、サル由来あるいはヒト由来の培養細胞が含まれる。
例えば、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＦＭ３Ａ細胞、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞あるいは
初代培養線維芽細胞等が好適である。適当な宿主−ベク
ター系の選択および使用方法等は、当業者にとっては既
知であり、それらの中から本発明のＤＮＡの発現に適し
た系を任意に選択することができる。そのような系で本
発明の蛋白質を産生させるには、その増殖に好適な条件
下で宿主（形質転換体）を培養し、その宿主が保有する
ベクターのプロモーターが機能し得るような条件を与え
てやればよい。これらも当業者にとって既知の技術から
適宜選択して実施することができる。
養細胞は、自己増殖が可能で、本発明のＤＮＡを発現し
得るものなら如何なるものでもよい。例えば、原核微生
物である大腸菌や真核微生物である酵母（サッカロミセ
ス セレビシエ等）、さらには真核生物由来の組織培養
細胞が使用できる。宿主として適した大腸菌株として
は、例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ１、χ１７７６、ＪＭ１
０１、ＪＭ１０９などが挙げられ、これらは薬剤耐性や
酵素活性によって容易に形質転換体を選別することがで
きるので便利である。組織培養細胞としては、昆虫由
来、トリ由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由
来、サル由来あるいはヒト由来の培養細胞が含まれる。
例えば、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＦＭ３Ａ細胞、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞あるいは
初代培養線維芽細胞等が好適である。適当な宿主−ベク
ター系の選択および使用方法等は、当業者にとっては既
知であり、それらの中から本発明のＤＮＡの発現に適し
た系を任意に選択することができる。そのような系で本
発明の蛋白質を産生させるには、その増殖に好適な条件
下で宿主（形質転換体）を培養し、その宿主が保有する
ベクターのプロモーターが機能し得るような条件を与え
てやればよい。これらも当業者にとって既知の技術から
適宜選択して実施することができる。
【００２５】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。なお、実施例中の学術用語、略号等は特に断
らない限り当該技術分野で一般的に使用されているもの
に従った。また、各種操作は、サムブルック等編［モレ
キュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル第
２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９
８９、今本文男等編［組換え遺伝子の細胞への導入と発
現］蛋白質核酸酵素臨時増刊２８（１４）１９８３、岡
田善男監修［細胞工学的技術総集編］実験医学臨時増刊
７（１３）１９８９等を参考として実施した。実施例１ ヒトＦａｓをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング （１）細胞および抗体 ヒトリンパ腫細胞系ＫＴ−３（金沢医科大学清水博士よ
り供与）８Ｘ１０4細胞／ｍｌを１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）と５ng／mlの組換えヒトＩＬ−６（味の素株
式会社より供与）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培
養した。総培養量は２ｌとし、５％ＣＯ2／９５％空気
下、３７℃にて２日間培養した。（以下同様） 既述の方法（ヨネハラら、(1989)前掲）と同様にしてマ
ウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を調製しヒ
ドロキシアパタイトによるカラムクロマトグラフィーで
精製した。
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。なお、実施例中の学術用語、略号等は特に断
らない限り当該技術分野で一般的に使用されているもの
に従った。また、各種操作は、サムブルック等編［モレ
キュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル第
２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９
８９、今本文男等編［組換え遺伝子の細胞への導入と発
現］蛋白質核酸酵素臨時増刊２８（１４）１９８３、岡
田善男監修［細胞工学的技術総集編］実験医学臨時増刊
７（１３）１９８９等を参考として実施した。実施例１ ヒトＦａｓをコードするｃＤＮＡのクローニ
ング （１）細胞および抗体 ヒトリンパ腫細胞系ＫＴ−３（金沢医科大学清水博士よ
り供与）８Ｘ１０4細胞／ｍｌを１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）と５ng／mlの組換えヒトＩＬ−６（味の素株
式会社より供与）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で培
養した。総培養量は２ｌとし、５％ＣＯ2／９５％空気
下、３７℃にて２日間培養した。（以下同様） 既述の方法（ヨネハラら、(1989)前掲）と同様にしてマ
ウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体（ＩｇＭ）を調製しヒ
ドロキシアパタイトによるカラムクロマトグラフィーで
精製した。
【００２６】（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
グアニジンイソチオシアナート／酸フェノール法［チョ
モジンスキー（Chomczynski）およびサッチ（Sacchi）A
nal. Biochem. 162: 156-159(1987)］により１．２Ｘ１
０9個のＫＴ−３細胞から２．７ｍｇのtotalＲＮＡを調
製し、oligo(dT)-セルロースカラムクロマトグラフィー
を用いて１３７μｇのpoly(A)ＲＮＡを選択した。その
うちの５μｇを用いて、ランダムヘキサマーオリゴヌク
レオチド（pdＮ6）またはoligo(dT)でプライムされたｃ
ＤＡＮを、ＡＭＶ逆転写酵素ではなくＭ−ＭＬＶＲＮas
eＨ-逆転写酵素を用いる外は文献記載［フクナガら（Fu
kunaga et al.）Cell 61: 341-350 (1990)］の方法と同
様にして合成した。
モジンスキー（Chomczynski）およびサッチ（Sacchi）A
nal. Biochem. 162: 156-159(1987)］により１．２Ｘ１
０9個のＫＴ−３細胞から２．７ｍｇのtotalＲＮＡを調
製し、oligo(dT)-セルロースカラムクロマトグラフィー
を用いて１３７μｇのpoly(A)ＲＮＡを選択した。その
うちの５μｇを用いて、ランダムヘキサマーオリゴヌク
レオチド（pdＮ6）またはoligo(dT)でプライムされたｃ
ＤＡＮを、ＡＭＶ逆転写酵素ではなくＭ−ＭＬＶＲＮas
eＨ-逆転写酵素を用いる外は文献記載［フクナガら（Fu
kunaga et al.）Cell 61: 341-350 (1990)］の方法と同
様にして合成した。
【００２７】この反応液にさらに２μｇのＢｓｔＸＩ非
回文性アダプター、３５０単位のＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社）および終濃度１．０ｍＭのＡＴＰを加えて４℃、
１８時間反応させることにより、合成された２本鎖ｃＤ
ＮＡの両末端にアダプターを付加した。２kb以上のｃＤ
ＮＡを常法に従ってアガロースゲルから回収し、そのう
ちの０．２５μｇを０．５μｇのＢｓｔＸＩ消化哺乳類
発現ベクターｐＣＥＶ４［イトウら（Itoh et al.）Sci
ence 247; 324-327 (1990)］に結合させてｃＤＮＡライ
ブラリーを調製した。このｃＤＮＡを用い、電気穿孔法
［ダウエルら（Dower et al.）Nucleic Acids Res. 16:
6127-6145 (1988)］でE. coli VM1100細胞を形質転換
した。oligo(dT)でプライムしたｃＤＮＡライブラリー
から得た約４.３ｘ１０5の独立クローンを、ランダムヘ
キサマーでプライムしたｃＤＮＡライブラリーから得た
約４.０ｘ１０5のクローンと混合し、以下のごとくＣＯ
Ｓ−７細胞をトランスフェクションし、ｃＤＮＡクロー
ンを回収した。
回文性アダプター、３５０単位のＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社）および終濃度１．０ｍＭのＡＴＰを加えて４℃、
１８時間反応させることにより、合成された２本鎖ｃＤ
ＮＡの両末端にアダプターを付加した。２kb以上のｃＤ
ＮＡを常法に従ってアガロースゲルから回収し、そのう
ちの０．２５μｇを０．５μｇのＢｓｔＸＩ消化哺乳類
発現ベクターｐＣＥＶ４［イトウら（Itoh et al.）Sci
ence 247; 324-327 (1990)］に結合させてｃＤＮＡライ
ブラリーを調製した。このｃＤＮＡを用い、電気穿孔法
［ダウエルら（Dower et al.）Nucleic Acids Res. 16:
6127-6145 (1988)］でE. coli VM1100細胞を形質転換
した。oligo(dT)でプライムしたｃＤＮＡライブラリー
から得た約４.３ｘ１０5の独立クローンを、ランダムヘ
キサマーでプライムしたｃＤＮＡライブラリーから得た
約４.０ｘ１０5のクローンと混合し、以下のごとくＣＯ
Ｓ−７細胞をトランスフェクションし、ｃＤＮＡクロー
ンを回収した。
【００２８】（３）パニング法によるｃＤＮＡクローン
の回収 パニング用のプレート（パニングデイッシュ）を以下の
ごとくにして調製した。細菌用６cmデイッシュ（プレー
ト）（Falcon 1007）を、１０μｇ／mlヤギ抗マウスＩg
Ｍ（Cappel）含有５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ９.５）３
mlと共に室温で９０分間インキュベーションした。プレ
ートを０.１５Ｍ ＮaＣlで３回洗浄し、りん酸緩衝化
食塩水（ＰＢＳ）３mlと共に室温で１夜インキュベーシ
ョンした。
の回収 パニング用のプレート（パニングデイッシュ）を以下の
ごとくにして調製した。細菌用６cmデイッシュ（プレー
ト）（Falcon 1007）を、１０μｇ／mlヤギ抗マウスＩg
Ｍ（Cappel）含有５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ９.５）３
mlと共に室温で９０分間インキュベーションした。プレ
ートを０.１５Ｍ ＮaＣlで３回洗浄し、りん酸緩衝化
食塩水（ＰＢＳ）３mlと共に室温で１夜インキュベーシ
ョンした。
【００２９】１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改良イーグル
培地（Dulbecco's modified Eaglemedium：ＤＭＤＭ）
を用いて全面増殖の５０％まで増殖させたサルＣＯＳ−
７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）を含有する１０８
個の６cmデイッシュを、上記の約８ｘ１０5個の独立し
たクローンから成るＫＴ３cＤＮＡライブラリーを用い
てスフェロプラスト融合法［サンドリ−ゴールドリンら
（Sandri-Goldrin et al.）Mol. Cell. Biol. 1: 743-7
52(1981)］でトランスフェクション（形質転換）した。
培地（Dulbecco's modified Eaglemedium：ＤＭＤＭ）
を用いて全面増殖の５０％まで増殖させたサルＣＯＳ−
７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）を含有する１０８
個の６cmデイッシュを、上記の約８ｘ１０5個の独立し
たクローンから成るＫＴ３cＤＮＡライブラリーを用い
てスフェロプラスト融合法［サンドリ−ゴールドリンら
（Sandri-Goldrin et al.）Mol. Cell. Biol. 1: 743-7
52(1981)］でトランスフェクション（形質転換）した。
【００３０】トランスフェクションの７２時間後、０.
５mＭ ＥＤＴＡおよび０.０２％ＮaＮ3含有ＰＢＳ（Ｐ
ＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3）中で細胞を３７℃において
３０分間インキュベーションして分散した。分散した細
胞をプールし、遠心して集めた後、抗Ｆas抗体１０μｇ
／ml含有冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 ９mlに懸濁し
た。氷上で６０分間インキュベーションした後、細胞を
等量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3で希釈し、２％Ficol
l 400含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3を通して１，００
０rpm５分間遠心した。ペレット化した細胞を５％ＦＣ
Ｓを補充したＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3２７mlに再懸
濁しナイロンメッシュ（孔径１００μｍ）でろ過して凝
集物を除いた。次いで、細胞を、各５mlのＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡ／ＮａＮ3および５％ＦＣＳを含有する５４個のパ
ニングプレートに分散させた。室温で２−３時間処理し
てＦasを発現している細胞をプレートに付着させた後、
５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3２mlで３
回、静かに洗浄して非付着細胞を除去した。
５mＭ ＥＤＴＡおよび０.０２％ＮaＮ3含有ＰＢＳ（Ｐ
ＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3）中で細胞を３７℃において
３０分間インキュベーションして分散した。分散した細
胞をプールし、遠心して集めた後、抗Ｆas抗体１０μｇ
／ml含有冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3 ９mlに懸濁し
た。氷上で６０分間インキュベーションした後、細胞を
等量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3で希釈し、２％Ficol
l 400含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3を通して１，００
０rpm５分間遠心した。ペレット化した細胞を５％ＦＣ
Ｓを補充したＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3２７mlに再懸
濁しナイロンメッシュ（孔径１００μｍ）でろ過して凝
集物を除いた。次いで、細胞を、各５mlのＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡ／ＮａＮ3および５％ＦＣＳを含有する５４個のパ
ニングプレートに分散させた。室温で２−３時間処理し
てＦasを発現している細胞をプレートに付着させた後、
５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／ＮａＮ3２mlで３
回、静かに洗浄して非付着細胞を除去した。
【００３１】次いでハート［(Hirt）(1967)、 前掲］の
方法で付着ＣＯＳ細胞から染色体外ＤＮＡを調製した。
即ち、各プレートに１０mＭＥＤＴＡ含有０.６％ＳＤＳ
溶液０.４mlを入れ、室温で２０分間インキュベーショ
ンした。ライゼートをマイクロヒュージ試験管に入れ、
ＮaＣlを１Ｍまで加え、少なくとも５時間氷上に置い
た。１３．０００rpmで５分間遠心した後、上清をフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈
澱法で回収した。第１回のパニングで回収したＤＮＡで
Ｅscherichia coli VM1100を形質転換すると、約３.２
ｘ１０5個のコロニーが得られた。これらを４８個の６c
mプレート中でＣＯＳ細胞とスフェロプラスト融合させ
た。上記と同様に２４プレートを用いてパニングし、付
着細胞からＤＮＡを調製した。回収したＤＮＡでＥ．co
li VM1100を形質転換すると、約１０，０００個のコロ
ニーが得られた。これらを用いて３回目のＣＯＳ細胞と
のスフェロプラスト融合（２４個の６cmプレート）を行
い、１２個の６cmプレートでパニングし、付着細胞から
ＤＮＡを調製した。
方法で付着ＣＯＳ細胞から染色体外ＤＮＡを調製した。
即ち、各プレートに１０mＭＥＤＴＡ含有０.６％ＳＤＳ
溶液０.４mlを入れ、室温で２０分間インキュベーショ
ンした。ライゼートをマイクロヒュージ試験管に入れ、
ＮaＣlを１Ｍまで加え、少なくとも５時間氷上に置い
た。１３．０００rpmで５分間遠心した後、上清をフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈
澱法で回収した。第１回のパニングで回収したＤＮＡで
Ｅscherichia coli VM1100を形質転換すると、約３.２
ｘ１０5個のコロニーが得られた。これらを４８個の６c
mプレート中でＣＯＳ細胞とスフェロプラスト融合させ
た。上記と同様に２４プレートを用いてパニングし、付
着細胞からＤＮＡを調製した。回収したＤＮＡでＥ．co
li VM1100を形質転換すると、約１０，０００個のコロ
ニーが得られた。これらを用いて３回目のＣＯＳ細胞と
のスフェロプラスト融合（２４個の６cmプレート）を行
い、１２個の６cmプレートでパニングし、付着細胞から
ＤＮＡを調製した。
【００３２】この３回の操作で得られたＤＮＡを用いて
大腸菌ＶＭ１１００を形質転換し、得られた２．８ｘ１
０5個のクローンのうち１４個（ｐＦ１−ｐＦ１４）に
関して解析した。これら１４個のプラスミドＤＮＡの制
限酵素消化によって、１つの群は同一の３.０kbの挿入
(インサート)を有し(ｐＦ１、２、５、１１）、他の群
は同一の１.５kbの挿入を有する（ｐＦ３、４、６、
７、９）ことが分かった。
大腸菌ＶＭ１１００を形質転換し、得られた２．８ｘ１
０5個のクローンのうち１４個（ｐＦ１−ｐＦ１４）に
関して解析した。これら１４個のプラスミドＤＮＡの制
限酵素消化によって、１つの群は同一の３.０kbの挿入
(インサート)を有し(ｐＦ１、２、５、１１）、他の群
は同一の１.５kbの挿入を有する（ｐＦ３、４、６、
７、９）ことが分かった。
【００３３】これらの内、ｐＦ１およびｐＦ３を用いて
ＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、細胞を抗Ｆas抗
体を用いるフローサイトメトリーで分析しこれら２個の
ｃＤＮＡがＦaｓ抗原決定基をコードしていることを確
認した。制限マッピングとＤＮＡ配列決定により、ｐＦ
１およびｐＦ３は、５’末端０.５７kbまでは同一配列
を有するが、３’末端の配列は完全に異なることが明ら
かになった。
ＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、細胞を抗Ｆas抗
体を用いるフローサイトメトリーで分析しこれら２個の
ｃＤＮＡがＦaｓ抗原決定基をコードしていることを確
認した。制限マッピングとＤＮＡ配列決定により、ｐＦ
１およびｐＦ３は、５’末端０.５７kbまでは同一配列
を有するが、３’末端の配列は完全に異なることが明ら
かになった。
【００３４】次いで、上記のＫＴ−３細胞のｃＤＮＡラ
イブラリーをｐＦ３の５’末端のXhoI-BamHIＤＮＡ断片
（約５２０ｂｐ）をプローブとして用いるコロニーハイ
ブリダイゼーションでスクリーニングした。その結果、
２ｘ１０5個のクローンから、同一の制限酵素 地図を持
ち、互いにオーバーラップする１.８〜２.６kbのｃＤＮ
Ａを含有する１０個のクローンを得た。最も長いｃＤＮ
Ａクローンを選択しｐＦ５８と命名した。このｐＦ５８
および上記ｐＦ１およびｐＦ３の模式図および制限地図
を図３Ａに示す。
イブラリーをｐＦ３の５’末端のXhoI-BamHIＤＮＡ断片
（約５２０ｂｐ）をプローブとして用いるコロニーハイ
ブリダイゼーションでスクリーニングした。その結果、
２ｘ１０5個のクローンから、同一の制限酵素 地図を持
ち、互いにオーバーラップする１.８〜２.６kbのｃＤＮ
Ａを含有する１０個のクローンを得た。最も長いｃＤＮ
Ａクローンを選択しｐＦ５８と命名した。このｐＦ５８
および上記ｐＦ１およびｐＦ３の模式図および制限地図
を図３Ａに示す。
【００３５】図３Ａにおいて、箱で囲んだ範囲はオープ
ンリーディングフレームを表す。斜線を引いた箱はシグ
ナル配列、黒い箱はトランスメンブラン領域を表す。ｐ
Ｆ１およびｐＦ３に関する図で、実線部分はいずれもｐ
Ｆ５８と同配列であるが点線部分は異なることを意味す
る。ただしｐＦ３ｃＤＮＡの実線部分の矢印で示した一
個所の塩基（Ｔ）が欠失されており、この点でｐＦ５８
ｃＤＮＡと異なる。なお図３Ｂはカイトおよびドーリト
ルの方法[Kite and Doolittle、 J. Mol. Biol. 157:
105-132(1982)］で得たヒトＦas抗原のヒドロパシープ
ロットであり、プロット下方の数字は前駆体タンパク質
のアミノ酸残基の位置を示唆している。次いで、ｐＦ５
８クローンのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配
列を決定した。結果を図１および図２に示す。
ンリーディングフレームを表す。斜線を引いた箱はシグ
ナル配列、黒い箱はトランスメンブラン領域を表す。ｐ
Ｆ１およびｐＦ３に関する図で、実線部分はいずれもｐ
Ｆ５８と同配列であるが点線部分は異なることを意味す
る。ただしｐＦ３ｃＤＮＡの実線部分の矢印で示した一
個所の塩基（Ｔ）が欠失されており、この点でｐＦ５８
ｃＤＮＡと異なる。なお図３Ｂはカイトおよびドーリト
ルの方法[Kite and Doolittle、 J. Mol. Biol. 157:
105-132(1982)］で得たヒトＦas抗原のヒドロパシープ
ロットであり、プロット下方の数字は前駆体タンパク質
のアミノ酸残基の位置を示唆している。次いで、ｐＦ５
８クローンのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配
列を決定した。結果を図１および図２に示す。
【００３６】このｃＤＮＡの解析により、以下の点が明
らかになった。 １）ｃＤＮＡは２，５３４ｂｐからなり３’末端にポリ
(Ａ)付加シグナル（ＡＴＴＡＡＡ）を有する。 ２）長いオープンリーディングフレーム（１，００８ヌ
クレオチド）が存在する。このオープンリーディングフ
レームはヌクレオチド位置１９５〜１９７の開始コドン
から始まり１２００〜１２０２位のＴＡＧ終止コドンに
至り、３３５アミノ酸からなるタンパク質をコードする
ことができる。
らかになった。 １）ｃＤＮＡは２，５３４ｂｐからなり３’末端にポリ
(Ａ)付加シグナル（ＡＴＴＡＡＡ）を有する。 ２）長いオープンリーディングフレーム（１，００８ヌ
クレオチド）が存在する。このオープンリーディングフ
レームはヌクレオチド位置１９５〜１９７の開始コドン
から始まり１２００〜１２０２位のＴＡＧ終止コドンに
至り、３３５アミノ酸からなるタンパク質をコードする
ことができる。
【００３７】アミノ酸配列のヒドロパシー分析の結果は
Ｎ−末端にシグナル配列が存在することを示唆するもの
である（図３Ｂ）。典型的なシグナルペプチド開裂部位
との比較で、成熟タンパク質は第１７番目のアミノ酸
（Ａrg)から始まることが示唆された。従って、成熟Ｆa
s抗原は分子量計算値３６，０００の３１９アミノ酸か
らなるタンパク質であり、leu１５８からVal１７４まで
の１７個の非電荷アミノ酸からなるトランスメンブラン
領域を有する。そして、他の膜貫通タンパク質で見られ
るように、その細胞質側には３個の塩基性アミノ酸がつ
らなっている。
Ｎ−末端にシグナル配列が存在することを示唆するもの
である（図３Ｂ）。典型的なシグナルペプチド開裂部位
との比較で、成熟タンパク質は第１７番目のアミノ酸
（Ａrg)から始まることが示唆された。従って、成熟Ｆa
s抗原は分子量計算値３６，０００の３１９アミノ酸か
らなるタンパク質であり、leu１５８からVal１７４まで
の１７個の非電荷アミノ酸からなるトランスメンブラン
領域を有する。そして、他の膜貫通タンパク質で見られ
るように、その細胞質側には３個の塩基性アミノ酸がつ
らなっている。
【００３８】以上から、このタンパク質は１５７アミノ
酸からなる細胞外領域と１７アミノ酸からなる膜貫通領
域と１４５アミノ酸からなる細胞質領域からなる。細胞
外領域はシステインに富み（１５７アミノ酸中１８残
基）、細胞質領域は電荷アミノ酸がやや多い（１４５ア
ミノ酸中、塩基性アミノ酸が２４個、酸性アミノ酸が１
９個）ことが分かった。Ｆasタンパク質のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示した図１および図２におい
て、ヌクレオチド番号は上、アミノ酸番号は下に記され
ている。アミノ酸番号は成熟Ｆasタンパク質のＡrg１を
１とする。トランスメンブラン領域には下線を、２個の
潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位（Ａsn-X-Ser/Thr)に
はアストリスクを付した。３カ所のpoly(A)付加シグナ
ル（ＡＴＴＡＡＡ）を上線で示した。ｐＦ３のヌクレオ
チド欠失箇所を矢印で示した。
酸からなる細胞外領域と１７アミノ酸からなる膜貫通領
域と１４５アミノ酸からなる細胞質領域からなる。細胞
外領域はシステインに富み（１５７アミノ酸中１８残
基）、細胞質領域は電荷アミノ酸がやや多い（１４５ア
ミノ酸中、塩基性アミノ酸が２４個、酸性アミノ酸が１
９個）ことが分かった。Ｆasタンパク質のヌクレオチド
配列およびアミノ酸配列を示した図１および図２におい
て、ヌクレオチド番号は上、アミノ酸番号は下に記され
ている。アミノ酸番号は成熟Ｆasタンパク質のＡrg１を
１とする。トランスメンブラン領域には下線を、２個の
潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位（Ａsn-X-Ser/Thr)に
はアストリスクを付した。３カ所のpoly(A)付加シグナ
ル（ＡＴＴＡＡＡ）を上線で示した。ｐＦ３のヌクレオ
チド欠失箇所を矢印で示した。
【００３９】３）Ｆas抗原と他のＮＧＦＲ／ＴＮＦＲフ
ァミリーのメンバーの配列の比較 上記のＦas抗原のア
ミノ酸配列を他のＮＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリーのメン
バーの配列と比較した。結果を図７〜９に示す。図７：
細胞外領域のシステイン豊富リピートの模式図である。
箱内にシステインを示す線が付されている。細胞質領域
の斜線を施した箱はＦas抗原、ＴＮＦレセプタータイプ
ＩおよびＣＤ４０抗原の保存領域である。この図から、
ＴＮＦレセプター、ＮＧＦレセプターおよびＣＤ４０抗
原の細胞外領域は４個のシステイン豊富サブ領域に分け
られるが、Ｆas抗原とＯＸ４０抗原は３個のサブ領域か
らなることが分かる。
ァミリーのメンバーの配列の比較 上記のＦas抗原のア
ミノ酸配列を他のＮＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリーのメン
バーの配列と比較した。結果を図７〜９に示す。図７：
細胞外領域のシステイン豊富リピートの模式図である。
箱内にシステインを示す線が付されている。細胞質領域
の斜線を施した箱はＦas抗原、ＴＮＦレセプタータイプ
ＩおよびＣＤ４０抗原の保存領域である。この図から、
ＴＮＦレセプター、ＮＧＦレセプターおよびＣＤ４０抗
原の細胞外領域は４個のシステイン豊富サブ領域に分け
られるが、Ｆas抗原とＯＸ４０抗原は３個のサブ領域か
らなることが分かる。
【００４０】図８：ヒトＦas（ｈＦas）、ヒトＴＮＦレ
セプタータイプＩ（ｈＴＮＦＲ１）［シャールら（Scha
ll et al.） 1990］、ヒトＴＮＦレセプタータイプＩＩ
（ｈＴＮＦＲ２）［スミスら(Smith et al.）Cell 61:
361-370(1990)］、ヒトＮＧＦレセプター（ｈＮＧＦ
Ｒ）［ジョンソンら(Johnson et al.）Science 248: 10
19-1023 (1986)］、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）［スタ
メンコビックら(Stamenkovic et al.）EMBO J. 8: 1403
-1410(1989)］、ラットＯＸ４０（ｒＯＸ４０）［マレ
ットら(Mallett et al.）EMBO J. 9: 1063-1068(199
0)］の細胞外領域のアミノ酸配列を示す。相同性が多く
なるようにギャップ(−)を導入した。同一のアミノ酸は
箱で囲んでいる。この図から、システイン残基の位置が
よく保存されていることが分かる。残基番号はそれぞれ
の文献による。システイン豊富リピート単位におけるア
ミノ酸残基の保存は配列の下方に記載した。
セプタータイプＩ（ｈＴＮＦＲ１）［シャールら（Scha
ll et al.） 1990］、ヒトＴＮＦレセプタータイプＩＩ
（ｈＴＮＦＲ２）［スミスら(Smith et al.）Cell 61:
361-370(1990)］、ヒトＮＧＦレセプター（ｈＮＧＦ
Ｒ）［ジョンソンら(Johnson et al.）Science 248: 10
19-1023 (1986)］、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）［スタ
メンコビックら(Stamenkovic et al.）EMBO J. 8: 1403
-1410(1989)］、ラットＯＸ４０（ｒＯＸ４０）［マレ
ットら(Mallett et al.）EMBO J. 9: 1063-1068(199
0)］の細胞外領域のアミノ酸配列を示す。相同性が多く
なるようにギャップ(−)を導入した。同一のアミノ酸は
箱で囲んでいる。この図から、システイン残基の位置が
よく保存されていることが分かる。残基番号はそれぞれ
の文献による。システイン豊富リピート単位におけるア
ミノ酸残基の保存は配列の下方に記載した。
【００４１】図９：Ｆas、ＴＮＦレセプタータイプＩお
よびＣＤ４０の細胞質領域の比較図である。ｈＣＤ４
０、ｈＦasおよびｈＴＮＦＲ１の対応する領域のアミノ
酸配列を比較し同一、および保存アミノ酸をそれぞれ、
実線および点線の箱で囲んだ。上記の各図から、本発明
のＦasがこれらの細胞表面タンパク質群に属することが
確認された。実施例２ Ｆａｓ抗原を発現する形質転換体の調製 ２μｇのプラスミドｐＦ５８からＦａｓｃＤＮＡを含有
する２．６kbＸｈｏＩ断片を調製し、それを哺乳類発現
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ［ミズシマ（Mizusima）およ
びナガタ（Nagata）Nucleic Acids Res. 18: 5322（199
0）］のＢｓｔＸＩサイトにＢｓｔＸＩアダプターを用
いて導入し、ヒトペプチド鎖延長因子１α遺伝子のプロ
モーターのコントロール下にＦasをコードするcＤＮＡ
を含有する発現ベクターｐＥＦＦ５８を構築した。
よびＣＤ４０の細胞質領域の比較図である。ｈＣＤ４
０、ｈＦasおよびｈＴＮＦＲ１の対応する領域のアミノ
酸配列を比較し同一、および保存アミノ酸をそれぞれ、
実線および点線の箱で囲んだ。上記の各図から、本発明
のＦasがこれらの細胞表面タンパク質群に属することが
確認された。実施例２ Ｆａｓ抗原を発現する形質転換体の調製 ２μｇのプラスミドｐＦ５８からＦａｓｃＤＮＡを含有
する２．６kbＸｈｏＩ断片を調製し、それを哺乳類発現
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ［ミズシマ（Mizusima）およ
びナガタ（Nagata）Nucleic Acids Res. 18: 5322（199
0）］のＢｓｔＸＩサイトにＢｓｔＸＩアダプターを用
いて導入し、ヒトペプチド鎖延長因子１α遺伝子のプロ
モーターのコントロール下にＦasをコードするcＤＮＡ
を含有する発現ベクターｐＥＦＦ５８を構築した。
【００４２】１） マウス線維芽細胞腫Ｌ９２９細胞の
形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭにて増殖させたＬ９２９細胞１ｘ１０6個を１０cm
プレート中で、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有する
ｐＳＴneoＢ ０.２μｇおよびＡpaＬ１消化ｐＥＦＦ５
８ ２０μｇを用いて、サムブルック等編 モレキュラ
ークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版
コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９
に従ってリン酸Ｃａ共沈澱法によりコトランスフェクシ
ョン（同時形質転換）し、グリセリン処理した。形質転
換１２時間後、細胞をトリプシン処理した後１０倍希釈
し、０.４mg／mlＧ−４１８含有培地でネオマイシン耐
性細胞株を選択した。それらのクローンを充分に増殖さ
せた後、細胞を５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｎａ
Ｎ3中で洗浄し、マウス抗Ｆas 抗体１０μｇ／mlを含有
する同緩衝液中、氷上で６０分間インキュベーションし
て形質転換体におけるＦas抗原の発現を、以下のように
して調べた。
形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭにて増殖させたＬ９２９細胞１ｘ１０6個を１０cm
プレート中で、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有する
ｐＳＴneoＢ ０.２μｇおよびＡpaＬ１消化ｐＥＦＦ５
８ ２０μｇを用いて、サムブルック等編 モレキュラ
ークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版
コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９
に従ってリン酸Ｃａ共沈澱法によりコトランスフェクシ
ョン（同時形質転換）し、グリセリン処理した。形質転
換１２時間後、細胞をトリプシン処理した後１０倍希釈
し、０.４mg／mlＧ−４１８含有培地でネオマイシン耐
性細胞株を選択した。それらのクローンを充分に増殖さ
せた後、細胞を５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｎａ
Ｎ3中で洗浄し、マウス抗Ｆas 抗体１０μｇ／mlを含有
する同緩衝液中、氷上で６０分間インキュベーションし
て形質転換体におけるＦas抗原の発現を、以下のように
して調べた。
【００４３】細胞を洗浄して結合しなかった抗Ｆas抗体
を除去し、氷上で３０分間、１０μｇ／mlのＦＩＴＣ−
結合ヤギ抗マウスＩgＭ（Cappel)で染色した。細胞を２
％Ｆicoll含有ＰＢＳ/ＥＤＴＡ/ＮａＮ3のクッションを
通して５分間。１，０００rpmで遠心しＦＡＣＳcan（Be
cton Dickson Instruments, USA)で分析した。
を除去し、氷上で３０分間、１０μｇ／mlのＦＩＴＣ−
結合ヤギ抗マウスＩgＭ（Cappel)で染色した。細胞を２
％Ｆicoll含有ＰＢＳ/ＥＤＴＡ/ＮａＮ3のクッションを
通して５分間。１，０００rpmで遠心しＦＡＣＳcan（Be
cton Dickson Instruments, USA)で分析した。
【００４４】２） マウスＴ−細胞リンパ腫ＷＲ１９Ｌ
細胞の形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含
有ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させたＷＲ１９Ｌ細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５２）［キネブチ（T. Kinebuchi）
Tokyo Institute for Immunopharmacology, Inc. よ
り供与］１ｘ１０7個（０．８ｍｌ中）を、ＥcoＲＩ消
化ｐＭＡＭneo（Clontech)２.５μｇ／mlおよびＶspＩ
消化ｐＥＦＦ５８ ２５μｇ／mlで、電気穿 孔法［ポ
ッターら（Potter et al.）Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 81: 7161-7165(1984)］により同時形質転換した［２
９０ボルト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene Puls
er(Bio-Rad)］。細胞を９６ウエルのマイクロタイター
プレートを用い増殖培地（０.１ml／ウエル）で２日間
培養し、最終濃度９００μｇ／mlで Ｇ−４１８を含有
する培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。９日
後、個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａｓ抗
原の発現をマウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体（前掲）
を用いてサイトフルオロメーターで分析し、Ｆａｓ陽性
細胞を限界希釈法でクローン化した。次いで、Ｆas抗原
を発現するＷＲ１９Ｌ形質転換体クローン、Ｆ５８−１
２ａをウエスタンブロッティング法で分析した。 ２） マウスＴ−細胞リンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞の形質転
換は以下の方法で行った。ＷＲ１９Ｌ細胞１ｘ１０7個
（０.８ml中）９日後、個々のＧ−４１８耐性形質転換
体におけるＦas抗原の発現をフローサイトフルオロメー
ターで分析し、Ｆas陽性細胞を制限希釈法でクローン化
した。
細胞の形質転換は以下の方法で行った。１０％ＦＣＳ含
有ＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させたＷＲ１９Ｌ細胞
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ５２）［キネブチ（T. Kinebuchi）
Tokyo Institute for Immunopharmacology, Inc. よ
り供与］１ｘ１０7個（０．８ｍｌ中）を、ＥcoＲＩ消
化ｐＭＡＭneo（Clontech)２.５μｇ／mlおよびＶspＩ
消化ｐＥＦＦ５８ ２５μｇ／mlで、電気穿 孔法［ポ
ッターら（Potter et al.）Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 81: 7161-7165(1984)］により同時形質転換した［２
９０ボルト、キャパシタンス：９５０μ Ｆ；Gene Puls
er(Bio-Rad)］。細胞を９６ウエルのマイクロタイター
プレートを用い増殖培地（０.１ml／ウエル）で２日間
培養し、最終濃度９００μｇ／mlで Ｇ−４１８を含有
する培地でネオマイシン耐性クローンを選択した。９日
後、個々のＧ−４１８耐性形質転換体におけるＦａｓ抗
原の発現をマウス抗Ｆａｓモノクローナル抗体（前掲）
を用いてサイトフルオロメーターで分析し、Ｆａｓ陽性
細胞を限界希釈法でクローン化した。次いで、Ｆas抗原
を発現するＷＲ１９Ｌ形質転換体クローン、Ｆ５８−１
２ａをウエスタンブロッティング法で分析した。 ２） マウスＴ−細胞リンパ腫ＷＲ１９Ｌ細胞の形質転
換は以下の方法で行った。ＷＲ１９Ｌ細胞１ｘ１０7個
（０.８ml中）９日後、個々のＧ−４１８耐性形質転換
体におけるＦas抗原の発現をフローサイトフルオロメー
ターで分析し、Ｆas陽性細胞を制限希釈法でクローン化
した。
【００４５】３） Ｆ５８−１２Ａのウエスタンブロッ
ティング分析。マウスＷＲ１９Ｌ細胞系、その形質転換
体であってＦas抗原を発現する形質転換体クローン（５
８−１２ａ）の膜フラクション、ヒトＫＴ−３（９０μ
ｇ）を抗Ｆas抗体または対照ＩgＭを用いて分析した結
果、５８−１２ａクローンに関して、見掛けの分子量４
３，０００に特異的なバンドが現れた。この値は、上記
図２に示したＦas抗原の細胞外領域の２個のＮ−グリコ
シル化部位に糖鎖が結合しているか否かの相違を考慮す
ると、互いによく一致した値である。
ティング分析。マウスＷＲ１９Ｌ細胞系、その形質転換
体であってＦas抗原を発現する形質転換体クローン（５
８−１２ａ）の膜フラクション、ヒトＫＴ−３（９０μ
ｇ）を抗Ｆas抗体または対照ＩgＭを用いて分析した結
果、５８−１２ａクローンに関して、見掛けの分子量４
３，０００に特異的なバンドが現れた。この値は、上記
図２に示したＦas抗原の細胞外領域の２個のＮ−グリコ
シル化部位に糖鎖が結合しているか否かの相違を考慮す
ると、互いによく一致した値である。
【００４６】実験例１ Ｆas発現細胞に対する抗Ｆas抗
体の細胞溶解作用 既述のごとくマウス抗Ｆasモノクローナル抗体はヒト細
胞（Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ａ６３７またはＦＬ細
胞）に対しては細胞溶解作用を現すが、マウス細胞には
作用しない（ヨネハラら、１９８９、前掲）。本実験例
では本発明のｐＦ５８ｃＤＮＡによってコードされてい
るポリペプチドが抗Ｆas抗体の細胞毒性作用を媒介する
か否かを試験した。実施例２記載のごとくマウスＷＲ１
９ＬおよびマウスＬ９２９を形質転換し、Ｆas抗原を発
現する形質転換細胞を調製した。これらの細胞の相違点
は、Ｌ９２９細胞はアクチノマイシンＤの存在下でＴＮ
Ｆによって死滅されるが、ＷＲ１９Ｌ細胞は代謝阻害物
質の有無にかかわらずＴＮＦの細胞溶解作用を受ける点
にある。
体の細胞溶解作用 既述のごとくマウス抗Ｆasモノクローナル抗体はヒト細
胞（Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ａ６３７またはＦＬ細
胞）に対しては細胞溶解作用を現すが、マウス細胞には
作用しない（ヨネハラら、１９８９、前掲）。本実験例
では本発明のｐＦ５８ｃＤＮＡによってコードされてい
るポリペプチドが抗Ｆas抗体の細胞毒性作用を媒介する
か否かを試験した。実施例２記載のごとくマウスＷＲ１
９ＬおよびマウスＬ９２９を形質転換し、Ｆas抗原を発
現する形質転換細胞を調製した。これらの細胞の相違点
は、Ｌ９２９細胞はアクチノマイシンＤの存在下でＴＮ
Ｆによって死滅されるが、ＷＲ１９Ｌ細胞は代謝阻害物
質の有無にかかわらずＴＮＦの細胞溶解作用を受ける点
にある。
【００４７】上記のごとく、発現プラスミドｐＥＦＦ−
５８をneo−耐性遺伝子を担持するプラスミドと一緒に
用いてＷＲ１９Ｌ細胞またはＬ９２９細胞を形質転換
し、Ｇ−４１８の存在下で選択して数個のＧ−４１８耐
性クローンを得た。次いで、親細胞ＷＲ１９ＬおよびＬ
９２９、ＷＲ１９Ｌから導かれた２個の形質転換体（５
８−１２ａおよび５８−８０ｄ）およびＬ９２９由来の
２クローン（ＬＢ１及びＬＢ１１）を抗Ｆas抗体（Ｉg
M）およびＦＩＴＣと結合した抗マウスＩgＭ抗体で染
め、フローフルオロメトリーにかけた。結果を図４に示
す。Ａ：ＷＲ１９Ｌ；Ｂ：５８−１２ａ；Ｃ：５８−８
０ｄ；Ｄ：Ｌ９２９；Ｅ：ＬＢ１；Ｆ：ＬＢ１１。
５８をneo−耐性遺伝子を担持するプラスミドと一緒に
用いてＷＲ１９Ｌ細胞またはＬ９２９細胞を形質転換
し、Ｇ−４１８の存在下で選択して数個のＧ−４１８耐
性クローンを得た。次いで、親細胞ＷＲ１９ＬおよびＬ
９２９、ＷＲ１９Ｌから導かれた２個の形質転換体（５
８−１２ａおよび５８−８０ｄ）およびＬ９２９由来の
２クローン（ＬＢ１及びＬＢ１１）を抗Ｆas抗体（Ｉg
M）およびＦＩＴＣと結合した抗マウスＩgＭ抗体で染
め、フローフルオロメトリーにかけた。結果を図４に示
す。Ａ：ＷＲ１９Ｌ；Ｂ：５８−１２ａ；Ｃ：５８−８
０ｄ；Ｄ：Ｌ９２９；Ｅ：ＬＢ１；Ｆ：ＬＢ１１。
【００４８】図から明らかなように、親細胞であるマウ
スＷＲ１９ＬおよびＬ９２９細胞はＦas抗原を発現しな
いが、ＷＲ１９Ｌ形質転換細胞（Ｆ５８−１２ａ，Ｆ５
８−８０ｄ）およびＬ９２９細胞（ＬＢ１およびＬＢ１
１）は、表面に極めて多量のＦas抗原を発現した。次い
で、Ｆas抗体の細胞溶解作用を、Ｆas抗原を発現してい
る細胞を用いて調べた。マウスＷＲ１９Ｌ細胞および形
質転換体クローン（５８−１２ａおよび５８−８０ｄ）
を種々の濃度の抗Ｆas抗体（０〜１μｇ／ml）と共に３
７℃で２４時間インキュベーションした。生存および死
滅細胞の数をトリパンブルー排除法で数え、生存細胞の
％をプロットした。結果を図５に示す。図中、白四角は
ＷＲ１９Ｌ、黒丸は５８−１２ａ、黒四角は５８−８０
ｄを表す。図から明らかなように、Ｆ５８−１２ａおよ
びＦ５８−８０ｄ細胞系は抗Ｆas抗体に濃度依存性の応
答を示した。１／２最大応答は抗Ｆas抗体濃度０.１μ
ｇ／mlで得られ、同抗体１μｇ／ml存 在下、２４時間
インキュベーションすると細胞の完全な死滅が認められ
た。
スＷＲ１９ＬおよびＬ９２９細胞はＦas抗原を発現しな
いが、ＷＲ１９Ｌ形質転換細胞（Ｆ５８−１２ａ，Ｆ５
８−８０ｄ）およびＬ９２９細胞（ＬＢ１およびＬＢ１
１）は、表面に極めて多量のＦas抗原を発現した。次い
で、Ｆas抗体の細胞溶解作用を、Ｆas抗原を発現してい
る細胞を用いて調べた。マウスＷＲ１９Ｌ細胞および形
質転換体クローン（５８−１２ａおよび５８−８０ｄ）
を種々の濃度の抗Ｆas抗体（０〜１μｇ／ml）と共に３
７℃で２４時間インキュベーションした。生存および死
滅細胞の数をトリパンブルー排除法で数え、生存細胞の
％をプロットした。結果を図５に示す。図中、白四角は
ＷＲ１９Ｌ、黒丸は５８−１２ａ、黒四角は５８−８０
ｄを表す。図から明らかなように、Ｆ５８−１２ａおよ
びＦ５８−８０ｄ細胞系は抗Ｆas抗体に濃度依存性の応
答を示した。１／２最大応答は抗Ｆas抗体濃度０.１μ
ｇ／mlで得られ、同抗体１μｇ／ml存 在下、２４時間
インキュベーションすると細胞の完全な死滅が認められ
た。
【００４９】抗Ｆas抗体のＬ９２９形質転換体クローン
に対する細胞溶解作用は以下の方法で調べた。Ｌ９２９
細胞および組換えヒトＦas抗原を発現している形質転換
体クローン（ＬＢ１およびＬＢ１１）を２５，０００細
胞／ウエルの割合で９６ウエルのマイクロタイタープレ
ートに撒き２４時間培養した。最終濃度０.５μｇ／ml
でアクチノマイシンを加え、細胞を種々の濃度の抗Ｆas
抗体（３０ng〜２μｇ／ml）と共に３７℃で１７時間イ
ンキュベーションした。次いで、５０％エタノール中で
０.７５％クリスタルバイオレット、０.２５％ＮaＣlお
よび１.７５％ホルムアルデヒドを含む溶液により室温
で２０分間染色した。染料の取り込みをMicro-ELISA オ
ートリーダーを用い、５４０nmのＯＤ値を測定して評価
した。抗Ｆas抗体を用いない場合のＯＤ測定値に対する
％で表した。結果を図６に示す。図中、白四角はＬ９２
９、黒丸はＬＢ１、黒四角はＬＢ１１を表す。図から明
らかなように、ＬＢ１１およびＬＢ１細胞系はアクチノ
マイシンＤの存在下、Ｆas抗体に対してＦasを発現して
いるＷＲ１９Ｌ細胞と同様の濃度依存性応答を示した。
いずれの場合も親細胞マウスＷＲ１９ＬおよびＬ９２９
は同一条件下、濃度１μｇ／mlの抗Ｆas抗体の影響を受
けなかった。
に対する細胞溶解作用は以下の方法で調べた。Ｌ９２９
細胞および組換えヒトＦas抗原を発現している形質転換
体クローン（ＬＢ１およびＬＢ１１）を２５，０００細
胞／ウエルの割合で９６ウエルのマイクロタイタープレ
ートに撒き２４時間培養した。最終濃度０.５μｇ／ml
でアクチノマイシンを加え、細胞を種々の濃度の抗Ｆas
抗体（３０ng〜２μｇ／ml）と共に３７℃で１７時間イ
ンキュベーションした。次いで、５０％エタノール中で
０.７５％クリスタルバイオレット、０.２５％ＮaＣlお
よび１.７５％ホルムアルデヒドを含む溶液により室温
で２０分間染色した。染料の取り込みをMicro-ELISA オ
ートリーダーを用い、５４０nmのＯＤ値を測定して評価
した。抗Ｆas抗体を用いない場合のＯＤ測定値に対する
％で表した。結果を図６に示す。図中、白四角はＬ９２
９、黒丸はＬＢ１、黒四角はＬＢ１１を表す。図から明
らかなように、ＬＢ１１およびＬＢ１細胞系はアクチノ
マイシンＤの存在下、Ｆas抗体に対してＦasを発現して
いるＷＲ１９Ｌ細胞と同様の濃度依存性応答を示した。
いずれの場合も親細胞マウスＷＲ１９ＬおよびＬ９２９
は同一条件下、濃度１μｇ／mlの抗Ｆas抗体の影響を受
けなかった。
【００５０】実験例２ 抗−Ｆas抗体により誘導される
アポプトーシス Ｆasによって誘導される細胞の自滅（アポトーシス）を
以下の方法で証明した。 １）染色体の断片化 ＷＲ１９Ｌ細胞、その形質転換体クローン５８−１２ａ
細胞および５８−８０ｄ細胞の各々を３００ng／mlの抗
Ｆas抗体の存在下またはマウスＴＮＦα６０ng／mlの存
在下でインキュベーションした。インキュベーション前
およびインキュベーション後１時間、２時間、３時間目
に、全ＤＮＡを細胞から調製し、０.５μｇ／mlの臭化
エチジウムの存在下、２％アガロースゲル電気泳動によ
り解析した。染色体ＤＮＡの断片化が認められた。断片
化ＤＮＡは階段状に分離し、その最小サイズはほぼ１８
０bpであった。この階段状ＤＮＡ断片はインキュベーシ
ョン後１時間以内に認められ、３時間後には６０％以上
の染色体ＤＮＡが断片化された。他方、親株であるＷＲ
１９Ｌ細胞からの染色体は抗Ｆas抗体と一緒にインキュ
ベーションした後も高分子のままであった。
アポプトーシス Ｆasによって誘導される細胞の自滅（アポトーシス）を
以下の方法で証明した。 １）染色体の断片化 ＷＲ１９Ｌ細胞、その形質転換体クローン５８−１２ａ
細胞および５８−８０ｄ細胞の各々を３００ng／mlの抗
Ｆas抗体の存在下またはマウスＴＮＦα６０ng／mlの存
在下でインキュベーションした。インキュベーション前
およびインキュベーション後１時間、２時間、３時間目
に、全ＤＮＡを細胞から調製し、０.５μｇ／mlの臭化
エチジウムの存在下、２％アガロースゲル電気泳動によ
り解析した。染色体ＤＮＡの断片化が認められた。断片
化ＤＮＡは階段状に分離し、その最小サイズはほぼ１８
０bpであった。この階段状ＤＮＡ断片はインキュベーシ
ョン後１時間以内に認められ、３時間後には６０％以上
の染色体ＤＮＡが断片化された。他方、親株であるＷＲ
１９Ｌ細胞からの染色体は抗Ｆas抗体と一緒にインキュ
ベーションした後も高分子のままであった。
【００５１】ＴＮＦ６０ng／mlと一緒にインキュベーシ
ョンした親株ＷＲ１９Ｌ細胞および形質転換細胞でも同
様のＤＮＡ断片化が認められた。これはＬ９２９細胞に
おいても同様であった。これらの結果は細胞表面のＦas
抗原とＦas抗体との特異的結合が染色体ＤＮＡを消化す
るエンドヌクレアーゼを誘導することを示唆している。
これは様々な系で観察されたアポトーシスの特徴と一致
する［シュミットら（Schmid, et al.）(1987); アッカ
ー（Ucker）(1987); スミスら（Smith et al.）(1989);
ウイリアムスら（Williams et al.）(1990)、いずれも
前掲］。また、マウスＷＲ１９ＬおよびＬ９２９細胞に
おけるＦas抗原の発現はＴＮＦによる細胞死滅作用にな
んら影響せず、形質転換細胞でも親細胞と全く同様の濃
度のネズミＴＮＦ−αで死滅された。
ョンした親株ＷＲ１９Ｌ細胞および形質転換細胞でも同
様のＤＮＡ断片化が認められた。これはＬ９２９細胞に
おいても同様であった。これらの結果は細胞表面のＦas
抗原とＦas抗体との特異的結合が染色体ＤＮＡを消化す
るエンドヌクレアーゼを誘導することを示唆している。
これは様々な系で観察されたアポトーシスの特徴と一致
する［シュミットら（Schmid, et al.）(1987); アッカ
ー（Ucker）(1987); スミスら（Smith et al.）(1989);
ウイリアムスら（Williams et al.）(1990)、いずれも
前掲］。また、マウスＷＲ１９ＬおよびＬ９２９細胞に
おけるＦas抗原の発現はＴＮＦによる細胞死滅作用にな
んら影響せず、形質転換細胞でも親細胞と全く同様の濃
度のネズミＴＮＦ−αで死滅された。
【００５２】２）形態学的変化
Ｆas抗原を発現するＬ９２９形質転換体の形態の変化を
追跡した。ＬＢ１細胞の形態学的変化は０.５μｇ／ml
のアクチノマイシンの存在下、１μｇ／mlの抗Ｆas抗体
の存在下、３時間インキュベーションした時点で開始さ
れ、５時間後、多くの典型的なアポトーシス体が細胞表
面に現れた。そして２４時間以内に大多数の細胞がプレ
ートから剥離した。このようなＬＢ１細胞の形態学的変
化は、アクチノマイシン存在下であってもＦas抗体の非
存在下では認められなかった。また、抗Ｆas抗体は、親
のＬ９２９細胞には何らの形態学的変化をもたらさなか
った。
追跡した。ＬＢ１細胞の形態学的変化は０.５μｇ／ml
のアクチノマイシンの存在下、１μｇ／mlの抗Ｆas抗体
の存在下、３時間インキュベーションした時点で開始さ
れ、５時間後、多くの典型的なアポトーシス体が細胞表
面に現れた。そして２４時間以内に大多数の細胞がプレ
ートから剥離した。このようなＬＢ１細胞の形態学的変
化は、アクチノマイシン存在下であってもＦas抗体の非
存在下では認められなかった。また、抗Ｆas抗体は、親
のＬ９２９細胞には何らの形態学的変化をもたらさなか
った。
【００５３】本発明で得たヒトＦas抗原は以上の実験例
に記載のごとく、細胞のアポトーシスを仲介することが
明らかとなった。本発明のｃＤＮＡを用いてＤＮＡ組換
え法により、組換えヒトＦasを製造することができる。
また、ヒトＦasに特異的に作用するモノクローナル抗体
をも組換えＦasを用いて、公知の方法により容易に製造
することができるので、Ｆas抗原を発現する細胞が関与
する疾患、異常の診断や治療手段が得られることにな
る。
に記載のごとく、細胞のアポトーシスを仲介することが
明らかとなった。本発明のｃＤＮＡを用いてＤＮＡ組換
え法により、組換えヒトＦasを製造することができる。
また、ヒトＦasに特異的に作用するモノクローナル抗体
をも組換えＦasを用いて、公知の方法により容易に製造
することができるので、Ｆas抗原を発現する細胞が関与
する疾患、異常の診断や治療手段が得られることにな
る。
【００５４】配列表
配列番号：1
配列の長さ：2534
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：ヒト（Homo sapiens）
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：195..1202
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：195..242
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：243..1199
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：1831..1836
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：2352..2357
特徴を決定した方法：S
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：2518..2523
特徴を決定した方法：S
配列
GACGCTTCTG GGGAGTGAGG GAAGCGGTTT ACGAGTGACT TGGCTGGAGC CTCAGGGGCG 60
GGCACTGGCA CGGAACACAC CCTGAGGCCA GCCCTGGCTG CCCAGGCGGA GCTGCCTCTT 120
CTCCCGCGGG TTGGTGGACC CGCTCAGTAC GGAGTTGGGG AAGCTCTTTC ACTTCGGAGG 180
ATTGCTCAAC AACC ATG CTG GGC ATC TGG ACC CTC CTA CCT CTG GTT CTT 230
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu
-15 -10 -5
ACG TCT GTT GCT AGA TTA TCG TCC AAA AGT GTT AAT GCC CAA GTG ACT 278
Thr Ser Val Ala Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr
1 5 10
GAC ATC AAC TCC AAG GGA TTG GAA TTG AGG AAG ACT GTT ACT ACA GTT 326
Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val
15 20 25
GAG ACT CAG AAC TTG GAA GGC CTG CAT CAT GAT GGC CAA TTC TGC CAT 374
Glu Thr Gln Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His
30 35 40
AAG CCC TGT CCT CCA GGT GAA AGG AAA GCT AGG GAC TGC ACA GTC AAT 422
Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn
45 50 55 60
GGG GAT GAA CCA GAC TGC GTG CCC TGC CAA GAA GGG AAG GAG TAC ACA 470
Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr
65 70 75
GAC AAA GCC CAT TTT TCT TCC AAA TGC AGA AGA TGT AGA TTG TGT GAT 518
Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp
80 85 90
GAA GGA CAT GGC TTA GAA GTG GAA ATA AAC TGC ACC CGG ACC CAG AAT 566
Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn
95 100 105
ACC AAG TGC AGA TGT AAA CCA AAC TTT TTT TGT AAC TCT ACT GTA TGT 614
Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys
110 115 120
GAA CAC TGT GAC CCT TGC ACC AAA TGT GAA CAT GGA ATC ATC AAG GAA 662
Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu
125 130 135 140
TGC ACA CTC ACC AGC AAC ACC AAG TGC AAA GAG GAA GGA TCC AGA TCT 710
Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser
145 150 155
AAC TTG GGG TGG CTT TGT CTT CTT CTT TTG CCA ATT CCA CTA ATT GTT 758
Asn Leu Gly Trp Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val
160 165 170
TGG GTG AAG AGA AAG GAA GTA CAG AAA ACA TGC AGA AAG CAC AGA AAG 806
Trp Val Lys Arg Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys
175 180 185
GAA AAC CAA GGT TCT CAT GAA TCT CCA ACC TTA AAT CCT GAA ACA GTG 854
Glu Asn Gln Gly Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val
190 195 200
GCA ATA AAT TTA TCT GAT GTT GAC TTG AGT AAA TAT ATC ACC ACT ATT 902
Ala Ile Asn Leu Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile
205 210 215 220
GCT GGA GTC ATG ACA CTA AGT CAA GTT AAA GGC TTT GTT CGA AAG AAT 950
Ala Gly Val Met Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn
225 230 235
GGT GTC AAT GAA GCC AAA ATA GAT GAG ATC AAG AAT GAC AAT GTC CAA 998
Gly Val Asn Glu Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln
240 245 250
GAC ACA GCA GAA CAG AAA GTT CAA CTG CTT CGT AAT TGG CAT CAA CTT 1046
Asp Thr Ala Glu Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu
255 260 265
CAT GGA AAG AAA GAA GCG TAT GAC ACA TTG ATT AAA GAT CTC AAA AAA 1094
His Gly Lys Lys Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys
270 275 280
GCC AAT CTT TGT ACT CTT GCA GAG AAA ATT CAG ACT ATC ATC CTC AAG 1142
Ala Asn Leu Cys Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys
285 290 295 300
GAC ATT ACT AGT GAC TCA GAA AAT TCA AAC TTC AGA AAT GAA ATC CAA 1190
Asp Ile Thr Ser Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln
305 310 315
AGC TTG GTC TAG AGTGAAAAAC AACAAATTCA GTTCTGAGTA TATGCAATTA 1242
Ser Leu Val
319
GTGTTTGAAA AGATTCTTAA TAGCTGGCTG TAAATACTGC TTGGTTTTTT ACTGGGTACA 1302
TTTTATCATT TATTAGCGCT GAAGAGCCAA CATATTTGTA GATTTTTAAT ATCTCATGAT 1362
TCTGCCTCCA AGGATGTTTA AAATCTAGTT GGGAAAACAA ACTTCATCAA GAGTAAATGC 1422
AGTGGCATGC TAAGTACCCA AATAGGAGTG TATGCAGAGG ATGAAAGATT AAGATTATGC 1482
TCTGGCATCT AACATATGAT TCTGTAGTAT GAATGTAATC AGTGTATGTT AGTACAAATG 1542
TCTATCCACA GGCTAACCCC ACTCTATGAA TCAATAGAAG AAGCTATGAC CTTTTGCTGA 1602
AATATCAGTT ACTGAACAGG CAGGCCACTT TGCCTCTAAA TTACCTCTGA TAATTCTAGA 1662
GATTTTACCA TATTTCTAAA CTTTGTTTAT AACTCTGAGA AGATCATATT TATGTAAAGT 1722
ATATGTATTT GAGTGCAGAA TTTAAATAAG GCTCTACCTC AAAGACCTTT GCACAGTTTA 1782
TTGGTGTCAT ATTATACAAT ATTTCAATTG TGAATTCACA TAGAAAACAT TAAATTATAA 1842
TGTTTGACTA TTATATATGT GTATGCATTT TACTGGCTCA AAACTACCTA CTTCTTTCTC 1902
AGGCATCAAA AGCATTTTGA GCAGGAGAGT ATTACTAGAG CTTTGCCACC TCTCCATTTT 1962
TGCCTTGGTG CTCATCTTAA TGGCCTAATG CACCCCCAAA CATGGAAATA TCACCAAAAA 2022
ATACTTAATA GTCCACCAAA AGGCAAGACT GCCCTTAGAA ATTCTAGCCT GGTTTGGAGA 2082
TACTAACTGC TCTCAGAGAA AGTAGCTTTG TGACATGTCA TGAACCCATG TTTGCAATCA 2142
AAGATGATAA AATAGATTCT TATTTTTCCC CCACCCCCGA AAATGTTCAA TAATGTCCCA 2202
TGTAAAACCT GCTACAAATG GCAGCTTATA CATAGCAATG GTAAAATCAT CATCTGGATT 2262
TAGGAATTGC TCTTGTCATA CCCTCAAGTT TCTAAGATTT AAGATTCTCC TTACTACTAT 2322
CCTACGTTTA AATATCTTTG AAAGTTTGTA TTAAATGTGA ATTTTAAGAA ATAATATTTA 2382
TATTTCTGTA AATGTAAACT GTGAAGATAG TTATAAACTG AAGCAGATAC CTGGAACCAC 2442
CTAAAGAACT TCCATTTATG GAGGATTTTT TTGCCCCTTG TGTTTGGAAT TATAAAATAT 2502
AGGTAAAAGT ACGTAATTAA ATAATGTTTT TG 2534
【図１】 ヒトＦasタンパク質をコードするｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（アミノ酸
番号２８４まで）。
ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（アミノ酸
番号２８４まで）。
【図２】 ヒトＦasタンパク質をコードするｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（アミノ酸
番号２８４以後）。
ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（アミノ酸
番号２８４以後）。
【図３】 ヒトＦasｃＤＮＡの（ｐＦ５８）の模式図お
よび制限地図。
よび制限地図。
【図４】 ヒトＦas発現ベクターで形質転換されたマウ
ス細胞におけるヒトＦas抗原の発現をフローフルオロメ
トリーで調べた結果を表すグラフ。
ス細胞におけるヒトＦas抗原の発現をフローフルオロメ
トリーで調べた結果を表すグラフ。
【図５】 抗Ｆas抗体のＷＲ１９Ｌ形質転換体クローン
への細胞溶解作用を示すグラフ。
への細胞溶解作用を示すグラフ。
【図６】 抗Ｆas抗体のＬ９２９形質転換体クローンに
対する細胞溶解作用を示すグラフ。
対する細胞溶解作用を示すグラフ。
【図７】 Ｆas抗原と他のＮＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリ
ーのメンバーのアミノ酸配列を比較した模式図。
ーのメンバーのアミノ酸配列を比較した模式図。
【図８】 ヒトＦasと他のＮＧＦＲ／ＴＮＦＲファミリ
ーのメンバーの細胞外領域のアミノ酸配列の比較図。
ーのメンバーの細胞外領域のアミノ酸配列の比較図。
【図９】 Ｆas、ＴＮＦレセプタータイプＩおよびＣＤ
４０の細胞質領域アミノ酸配列の比較図。
４０の細胞質領域アミノ酸配列の比較図。
フロントページの続き
(56)参考文献 国際公開88／7549（ＷＯ，Ａ１)
国際公開91／10448（ＷＯ，Ａ１)
欧州特許出願公開330191（ＥＰ，Ａ
２)
Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．66，Ｐ．233−243
（Ｊｕｌｙ 1991)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
C07K 14/705
C07K 16/28
C12P 21/02
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】 下記のいずれかのポリペプチドをコード
するＤＮＡ： 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号−１６〜３１９もしくはアミノ酸番号１〜３１９
のアミノ酸配列で示されるポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド、また
は前記のアミノ酸配列において１から数個のアミノ
酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されたアミノ酸配列
で示されかつ前記のポリペプチドと実質的に同一の機
能を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 下記の何れかのポリペプチドをコードす
るＤＮＡ； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号−１６〜１５７もしくはアミノ酸番号１〜１５７
のアミノ酸配列で示されるポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するヒトＦａｓ断片であ
るポリペプチド；または前記のアミノ酸配列におい
て１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿
入されたアミノ酸配列で示されかつ前記のポリペプチ
ドと実質的に同一の機能を有するポリペプチド。 - 【請求項３】 下記の何れかのポリペプチドをコードす
るＤＮＡ； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号１７５〜３１９のアミノ酸配列で示されるポリペ
プチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するヒトＦａｓ断片であ
るポリペプチド；または前記のアミノ酸配列におい
て１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿
入されたアミノ酸配列で示されかつ前記のポリペプチ
ドと実質的に同一の機能を有するポリペプチド。 - 【請求項４】 下記の何れかのポリペプチドをコードす
るＤＮＡ； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号−１６〜１７４もしくはアミノ酸番号１〜１７４
のアミノ酸配列で示されるポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するヒトＦａｓ断片であ
るポリペプチド、または前記のアミノ酸配列におい
て１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿
入されたアミノ酸配列で示されかつ前記のポリペプチ
ドと実質的に同一の機能を有するポリペプチド。 - 【請求項５】 下記の何れかのポリペプチドをコードす
るＤＮＡ； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号１５８〜３１９のアミノ酸配列で示されるポリペ
プチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するヒトＦａｓ断片であ
るポリペプチド、または前記のアミノ酸配列におい
て１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿
入されたアミノ酸配列で示されかつ前記のポリペプチ
ドと実質的に同一の機能を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 下記の何れかのポリペプチドをコードす
るＤＮＡ； 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列中、アミノ
酸番号−１６〜１５７もしくはアミノ酸番号１〜１５７
と、アミノ酸番号１７５〜３１９のアミノ酸配列からな
るアミノ酸配列で示されるポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド； 前記のポリペプチドを含有するヒトＦａｓ断片であ
るポリペプチド、または前記のアミノ酸配列におい
て１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿
入されたアミノ酸配列で示されかつ前記のポリペプチ
ドと実質的に同一の機能を有するポリペプチド。 - 【請求項７】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列
中、以下の群： 塩基番号１〜２５３４；塩基番号１９５〜１１９９；塩
基番号２４３〜１１９９；塩基番号１９５〜７１３；塩
基番号２４３〜７１３；塩基番号７６５〜１１９９；塩
基番号１９５〜７６４；塩基番号２４３〜７６４；塩基
番号７１４〜１１９９；塩基番号１９５〜７１３；塩基
番号７６５〜１１９９；および塩基番号２４３〜７１３
および塩基番号７６５〜１１９９から選択される塩基配
列で示されるＤＮＡ、該塩基配列で示されるＤＮＡを含
有するＤＮＡ、または該塩基配列において１から数個の
塩基が欠失、置換、付加あるいは挿入された塩基配列で
示されるＤＮＡである請求項１〜６の何れかに記載のＤ
ＮＡ。 - 【請求項８】 下記のいずれかのＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ請求項１〜６の
に記載のいずれかのポリペプチドと実質的に同一の機
能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ： 配列表の配列番号１に記載の塩基配列中、塩基番号１
〜２５３４；塩基番号１９５〜１１９９；塩基番号２４
３〜１１９９；塩基番号１９５〜７１３；塩基番号２４
３〜７１３；塩基番号７６５〜１１９９；塩基番号１９
５〜７６４；塩基番号２４３〜７６４；塩基番号７１４
〜１１９９；塩基番号１９５〜７１３；塩基番号７６５
〜１１９９；および塩基番号２４３〜７１３および塩基
番号７６５〜１１９９から選択される塩基配列で示され
るＤＮＡ、 前記のＤＮＡを含有するＤＮＡ、および前記お
よびに記載のいずれかのＤＮＡの相補鎖からなるＤＮ
Ａ。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ
を含有するベクター。 - 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターによって形
質転換された形質転換体。 - 【請求項１１】 形質転換体が、大腸菌、酵母、昆虫細
胞または哺乳動物培養細胞であることを特徴とする請求
項１０に記載の形質転換体。 - 【請求項１２】 請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド。 - 【請求項１３】 請求項１０または１１に記載の形質転
換体を適当な条件下で培養することからなる請求項１２
に記載のポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法によって得ら
れたポリペプチド。 - 【請求項１５】 請求項１２若しくは１４に記載のポリ
ペプチド又は請求項１０若しくは１１に記載の形質転換
体又はその培養物を抗原として用いることを特徴とす
る、請求項１２に記載のポリペプチドに特異的な抗体の
製造方法。 - 【請求項１６】 請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ
を細胞に導入する工程を含むことを特徴とする、細胞に
アポトーシスを誘導する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10732392A JP3362867B2 (ja) | 1991-04-26 | 1992-04-27 | ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-125234 | 1991-04-26 | ||
| JP12523491 | 1991-04-26 | ||
| JP10732392A JP3362867B2 (ja) | 1991-04-26 | 1992-04-27 | ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184368A JPH05184368A (ja) | 1993-07-27 |
| JP3362867B2 true JP3362867B2 (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=26447369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10732392A Expired - Lifetime JP3362867B2 (ja) | 1991-04-26 | 1992-04-27 | ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3362867B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6579697B1 (en) | 1995-05-11 | 2003-06-17 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Modulator of TNF/NGF superfamily receptors and soluble oligomeric TNF/NGF superfamily receptors |
| SG10201912171PA (en) * | 2014-04-18 | 2020-02-27 | Editas Medicine Inc | Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy |
-
1992
- 1992-04-27 JP JP10732392A patent/JP3362867B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６６，Ｐ．２３３−２４３（Ｊｕｌｙ １９９１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05184368A (ja) | 1993-07-27 |
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