JPH11503007A - ヒト腫瘍壊死因子受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＴＮＦ受容体およびそのような受容体をコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのような受容体を組換え技術により製造する方法を開示する。そのような受容体を、該受容体に対するアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングするために、および受容体のリガンドをスクリーニングするために利用する方法をもまた開示する。また腫瘍の増殖を阻害するために、細胞分裂を刺激するために、免疫応答および抗ウイルス応答を媒介するために、増殖を制御するために、およびある感染に対する耐性を付与するそのようなアゴニストを利用する方法をも開示する。自己免疫疾患、炎症、敗血症性ショックを処置し、アポトーシスを妨げる治療剤としてのアンタゴニストをもまた開示する。また該受容体をコードする核酸配列中の変異を検出し、および宿主由来のサンプル中の可溶性受容体のレベルの変化を検出するための診断方法をもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍壊死因子受容体 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの 製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、腫瘍壊死因子受容体として 推定的に同定され、特に２型腫瘍壊死因子受容体として同定されている。本発明 のポリペプチドを、以下で「ＴＮＦ受容体」と呼ぶ。本発明はまた、該受容体を 阻害することにも関する。 ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンフォトキ シン）はサイトカインと総称される、インターフェロン、インターロイキンおよ び増殖因子が含まれる、ポリペプチドメディエーターの広範にわたるクラスの関 係するメンバーである（ボートラー（Ｂeutler,Ｂ.）およびセラミ（Ｃerami,Ａ .）、Ａnnu．Ｒev．Ｉmmunol.、７：６２５−６５５（１９８９））。 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、元来、その抗腫瘍活性の結 果として発見されたが、今や、生物学的プロセスおよび病理の宿主において重要 な役割を担う多面的サイトカインとして認められている。現在まで、ＴＮＦ関連 サイトカインファミリーの８つの既知メンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リン フォトキシン−α）、ＬＴ−β、ならびにＦas、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０ および４−１ＢＢ受容体に対するリガンドがある。これらのタンパク質は、ＴＮ Ｆ−βを除き、膜アンカーとして使用されることの多い、保存されたＣ末端配列 、および可変性のＮ末端配列を有する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは両方とも 、それらがＴＮＦ受容体に結合する場合、ホモトリマーとして機能する。 ＴＮＦは、単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含め 、多くの細胞の種類により、また、主として活性化マクロファージにより産生さ れる。ＴＮＦ−αは、腫瘍の急速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶 、抗ウイルス応答を引き起こすこと、敗血症性ショック、大脳マラリア、細胞毒 性、酵素の変性、脂質の過酸化およびＤＮＡの損傷（ナタ（Ｎata）ら、Ｊ．Ｉm munol. １３６（７）：２４８３（１９８７））などの化学療法の間に産生される電離放 射線の欠失効果に対する保護、増殖調節、血管内皮効果および代謝効果において 役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１ 、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含め、様々な因子を分泌するよう、内皮細胞を 誘発して、細胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣ ＡＭ−１およびＶＣＡＮ−１といったような、様々な細胞接着分子を上方調節す る。ＴＮＦ−αおよびＦasリガンドはまた、プログラムされた細胞死を誘起する ことも示されている。 関連分子であるリンフォトキシン（ＬＴ、ＴＮＦ−βともいわれる）は、活性 化されたリンパ球により産生され、ＴＮＦと同一ではないが類似した生物学的活 性を示す。ＬＴの２つの異なるタイプが見いだされており、ＬＴ−αおよびＬＴ −βである。ＬＴ−αは腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘発、ポリ単核白血球の活 性化、内皮細胞上のクラスＩ主要組織適合性複合体抗原の誘発、内皮細胞上の接 着分子の誘発および成長ホルモン刺激の誘発などを含む多数の活性を有する（ラ ドル（Ｒuddle，Ｎ.）およびホーマー（Ｈomer，Ｒ.）Ｐrog．Ａllergy、４０： １６２−１８２（１９８８））。 ＴＮＦまたはＬＴにより媒介される様々な細胞応答の誘発における第一段階は 、それらが特異的な細胞表面受容体または可溶性受容体に結合することである。 約５５ＫＤa（ＴＮＦ−Ｒ１）および７５ＫＤa（ＴＮＦ−Ｒ２）の２つの異なっ たＴＮＦ受容体が同定されており（ホーマン（Ｈohman，Ｈ．Ｐ.）ら、Ｊ．Ｂio l.Ｃhem.、２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９））、また両方の受容体 型に対応するヒトおよびマウスcＤＮＡが単離されて特徴付けられている（ロー チェスター（Ｌoetschcher，Ｈ.）ら、Ｃell、６１：３５１（１９９０））。両 方のＴＮＦ−Ｒとも、細胞外、膜貫通および細胞内領域を含め、典型的な細胞表 面受容体構造を共有する。 これらの分子は細胞接着形態にて存在するだけでなく、可溶性形態でも存在し 、完全な受容体の開裂した細胞外ドメインを含む（ノファー（Ｎophar）ら、Ｅ ＭＢＯ Ｊournal、９（１０）：３２６９−７６（１９９０））。ＴＮＦ−Ｒ１ お よびＴＮＦ−Ｒ２の細胞外ドメインは２８％の同一性を有し、重要なインターサ ブユニット配列ホモロジーを有する４つの反復したシステインに富んだモチーフ によって特徴付けられる。細胞のタイプおよび組織の多数はＴＮＦ受容体とシグ ナルトランスダクションにおいて活性である受容体の両方を発現するようである が、しかし、それらは別個の細胞の応答を媒介する。さらにＴＮＦ−Ｒ２はＰＣ Ｔ ＷＯ９４／０９１３７に示されるようにＴＮＦによって、もっぱらヒトのＴ 細胞の増殖のみを媒介することを示す。 ＴＮＦ−Ｒ１に依存する応答にはＣ−ＦＯＳ、ＩＬ−６およびマンガンスーパ ーオキシドジスムターゼmＲＮＡの蓄積、プロスタグランジンＥ２合成、ＩＬ− ２受容体およびＭＨＣクラスＩおよびIIの細胞表面抗原の発現、増殖阻害および 細胞毒性の蓄積を含む。ＴＮＦ−Ｒ１はまた、ホスホリパーゼＡ₂、プロテイン キナーゼＣ、ホスファチジルクロリン−特異的ホスホリパーゼＣおよびスフィン ゴミエリナーゼ（フェッファーク（Ｐfefferk）ら、Ｃell.７３：４５７−４６ ７（１９９３））を誘発する。 本発明の受容体ポリペプチドはＴＮＦに結合し、特にＴＮＦ−βに結合する。 さらに、ＴＮＦ受容体はまた、重要な生物学的なプロセスに関与する受容体およ び抗原のファミリーへのホモロジーによって、他のリガンド、例えば神経増殖因 子（これに限るわけではない）などを含むリガンドに結合する。このファミリー はよく保存されたシステイン残基を示し、神経細胞の増殖および分化の制御に重 要な役割を果たしている低アフィニティーＮＧＦ受容体、ＡＰＯとも呼ばれる受 容体でその機能が欠損しているマウスでの研究に基づいているアポトーシスのシ グナリングに関与するＦas受容体を含み、狼瘡様疾患の病因である、ＴＮＦ−Ｒ １、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０およびＴ細胞活性化抗原ＣＤ２７に重要な役割を果たし ている。 本発明の一つの態様により、推定ＴＮＦ受容体である新規な成熟ポリペプチド ならびにその断片、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは ヒト起源のものである。 本発明の別の態様により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め 、 本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのア ンチセンスアナログ、ならびに生物学的に活性であって、診断上または治療上有 用なその断片を提供する。 本発明のまたさらなる態様により、組換え技術によるそのようなポリペプチド の製造方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質の 回収を促進する条件下、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換 え原核および／または真核宿主細胞を提供する。 本発明のさらに別の態様により、そのようなポリペプチド、またはそのような ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、受容体アンタゴニストおよび／ またはアゴニストおよび／または受容体リガンドに関してスクリーニングするた めに利用する方法を提供する。 本発明のさらに別の態様により、本発明のポリペプチドに特異的にハイブリダ イズする十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。 本発明のさらに別の態様により、ＴＮＦ受容体活性の不足に関連した治療条件 、例えば腫瘍の増殖の抑制、ヒト細胞増殖、例えばＴ細胞増殖などを刺激する、 免疫応答および抗ウイルス応答の制御、電離放射線の影響に対する保護、クラミ ジア感染に対する保護、増殖の制御およびＨＩＶにおいて見られるような免疫不 全疾患を治療することに関連した状態を治療するためにそのようなアゴニストを 利用する方法を提供する。 本発明の別の態様により、ＴＮＦ受容体の過剰発現に関連した病状、例えば、 ＡＩＤＳ、敗血性ショック、大脳マラリア、移植片拒絶、細胞毒性、悪液質、ア ポトーシスおよび炎症などのＴ細胞媒介の自己免疫疾患を治療するために使用す るようなアンタゴニストを使用する方法を提供する。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら かであろう。 以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含 される本発明の範囲を限定しようとするものではない。 図１は、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配 列を説明する。最初の２１アミノ酸は推定リーダー配列（下線を記す）を表わす 。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。シークエンシングは、３７ ３自動化ＤＮＡシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ、インク(Ａppli ed Ｂiosystems,Ｉnc.))を使用して行った。シークエンシングの正確さは、９７ ％以上であると予想される。 図２は、本発明のポリペプチドのアミノ酸アラインメント（上段）とヒト２型 ＴＮＦ受容体のアミノ酸アラインメント（下段）を説明する。 「遺伝子」または「シストロン」なる語はポリペプチド鎖の製造に関与するＤ ＮＡセグメントを意図している；コーディング領域の前および後の領域（リーダ ーおよびトレイラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）の 間の配列（イントロン）も含む。 本発明の一つの態様により、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有す る成熟ポリペプチド、または１９９４年９月２８日にＡＴＣＣ受託番号第７５８ ９９号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチ ドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト肺組織、海馬お よび成人心臓から得られる。ヒト初期継代線維芽細胞（ＨＳＡ１７２細胞）由来 のcＤＮＡライブラリーにおいて本発明のポリヌクレオチドは発見された。該ポ リヌクレオチドはヒトＴＮＦ−Ｒ２受容体に構造的に関連している。該ポリヌク レオチドは３９０アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディング フレームを含み、そのうち最初の２１アミノ酸残基は、成熟タンパク質が３６９ アミノ酸を含むような推定リーダー配列である。そのタンパク質はヒト２型ＴＮ Ｆ受容体と最も高いホモロジーを示し、３９％の同一性および４６％の類似性が ８８アミノ酸長にわたる。すべてのＴＮＦ受容体中の４０残基のモジュールの中 に存在する６つの保存されたシステインはこの受容体に保存されている。 本発明のＴＮＦ受容体は可溶性の受容体であって、分泌されるが、しかしなが ら膜貫通領域と細胞内および細胞外領域を有する膜結合受容体としても存在する 。本発明のポリペプチドはＴＮＦおよびリンフォトキシンリガンドに結合する。 本発明の一つの態様により、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、ま たはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合 成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で あるなら、コーディング鎖または非コーディング（アンチ−センス）鎖であり得 る。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１（配列番号：１） に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じで あってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として図１（配列番号 ：１）のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする 異なったコーディング配列であってもよい。 図１（配列番号：２）の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコ ードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが 含まれ得る：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコ ーディング配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列と いったような付加的コーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列( また場合により、付加的コーディング配列)、および成熟ポリペプチドのコーデ ィング配列のイントロンまたは非コーディング配列５'および／または３'といっ たような非コーディング配列。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリ ペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、 付加的コーディングおよび／または非コーディング配列が含まれるポリヌクレオ チドを包含する。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断 片、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関 する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル 変異体、またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。 従って、本発明には、図１（配列番号：２）に示すのと同じ成熟ポリペプチド または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの 変異体が含まれ、これらの変異体は、図１（配列番号：２）のポリペプチドまた は寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、誘導 体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異 体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。 先に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）に示すコー ディング配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコーデ ィング配列の天然に存在するアレル変異体であるコーディング配列を有し得る。 当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオ チドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、 これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。 本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、宿主細胞からのポ リペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞から のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に 、同じリーディングフレームで融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダ ー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断 されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該 ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であ るプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタン パク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると 、活性成熟タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ 配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方 を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする マーカー配列にイン・フレームで融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場 合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提 供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ（t ag）であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を 使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい 。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープ に対応する(ウイルソン（Ｗilson,Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）) 。該コーディング配列はまた、ＩgＧ Ｆc融合タンパク質などの融合タンパク質 をコードする配列に融合する。 本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性 がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本 発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイ ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくと も９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう ことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズ するポリヌクレオチドは、図１（配列番号：１）のcＤＮＡもしくは寄託されたc ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能もしく は活性を保持するポリペプチドをコードする。 本明細書中でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダ ペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への 便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求 されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオ チドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾す る事象を制御している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには 、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。 本発明はさらに、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有する、または 寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、さ らにはまた、そのようなポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体に関する。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドを示す場合、「断片」、「誘導体」および「アナログ」とい う用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能もしくは活性を 保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分 を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することがで きるプロプロテインが含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。 図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード されるポリペプチドの断片、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以 上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸 残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードにより コードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの 、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば 、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または （iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される 配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペ プチドに融合しているものであり得る。そのような断片、誘導体およびアナログ は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供される のが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。 「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存 在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きて いる動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され ていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同 じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌク レオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチ ドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは 組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベク ターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術 による製造にも関する。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本 発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス フォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラ スミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プ ロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、または本発明の核酸配 列を増幅するのに適するよう修飾された従来の栄養培地で培養することができる 。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に 使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用 することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発 現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。その ようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４ ０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラス ミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニ ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡ が含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であっ て、生存可能である限り、使用することができる。 適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般 には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部 位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思わ れる。 発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能 に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、 以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ.col i.） lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真 核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている 他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位 および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も 含み得る。 さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼ またはネオマイシン耐性といったような、または大腸菌ではテトラサイクリンま たはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択 のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー 遺伝子を含むのが好ましい。 上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制 御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、 その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。 適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトマ イセス（Ｓtreptomyces） 、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓalmonella typhi murium） といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ドロソフィラ（Ｄro sophila） Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓpodoptera） Ｓf９といったような昆虫 細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノ ウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範 囲内であると思われる。 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含む 組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入 されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む 。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動 可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターお よびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベク ターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９（キアゲン (Ｑiagen)）、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４ 、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６ Ａ（ストラタジーン(Ｓtratagene)）；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３ ３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア(Ｐharmacia)）。真核生物用： pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーン)、p ＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファルマシア)。しかし、他のいずれの プラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能で ある限り、使用することができる。 プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝 子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およ びＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、 Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには 、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後 期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレ ベルの範囲内である。 さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿 主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞 であり得て、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築 物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ− デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行 うことができる。(デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッ ティー（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオ ロジー（Ｂasic Ｍethods in Molecular Ｂiology）（１９８６）)。 宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、 従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発 明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系も また使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・ク ローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌab oratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本 明細書の一部を構成する。 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エン ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロ モーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡ のシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側 にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル スエンハンサーが含まれる。 通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォ ーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン 耐性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae） ＴＲＰ１遺伝 子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から 得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわ け、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸 性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得る ことができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好まし くは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせる ことができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により 、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安 定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク 質 をコードすることができる。 細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構 造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と共に、機能的なプロモーター を有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベク ターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内で の増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよ び複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿 主には、大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）、サルモネラ・テ ィフィムリウム 、ならびにシュードモナス（Ｐseudomonas）属、ストレプトマイ セス属、およびスタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種 が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。 代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは 、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素 を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の 複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhemica ls）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオ テク(Ｐromega Ｂiotec)、マディソン、ウィスコンシン、米国)が含まれる。こ れらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造 配列と組み合わせる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度 まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により 破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理 、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊 でき、そのような方法は、当業者に周知である。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用 することができる。哺乳動物発現系の例には、ガルツマン（Ｇluzman）、Ｃell 、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣ ＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、 例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺 乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、 またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド ナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列 もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列 、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与える ことができる。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、 陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ ラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製すること ができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置 を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物 であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造するこ とができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、 グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチ ドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。 本発明のＴＮＦ受容体のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに結合する能力をアッセ イするが、しかしながら本発明はまた他のＴＮＦ様タンパク質に結合する受容体 の能力も考慮する。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに特異的であるモノクローナル 抗体を調製する。これらのモノクローナル抗体をＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに 結合させ、コントロールＥＬＩＳＡアッセイを存在するモノクローナル抗体の量 を定量するように行う。ついで該ＴＮＦ受容体を該モノクローナル抗体を結合さ えて他のＥＬＩＳＡアッセイを行うのと同様にしてＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β に結合させる。該ＴＮＦ受容体を該モノクローナル抗体とちょうど同じくらい強 くＴＮＦ−βに結合することが見いだされている。 全長の本発明のポリヌクレオチド配列のフラググメントをｃＤＮＡライブラリ ーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して他の遺伝子を単離し、これ らの遺伝子は本発明のポリヌクレオチド配列と高い配列類似性または同様の生物 学的活性を有する。一般的にこのタイプのプローブは少なくとも５０塩基を有す るが、しかしながら、一層多数の塩基を有していてよい。該プローブはまた、全 長の転写物に対応するcＤＮＡクローン、および制御領域およびプロモーター領 域、エキソンおよびイントロンを含む完全な本発明のポリヌクレオチド配列を含 む単一または複数のゲノムクローンを同定するのに使用してよい。スクリーニン グの例にはオリゴヌクレオチドプローブを合成するため公知のＤＮＡ配列を使用 することによる本発明の遺伝子のコーディング領域の単離を含む。本発明の遺伝 子の配列と相補的な配列を有している標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラ リーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを決定するため、ヒト ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするの に使用する。 本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードおよび発現させる単離したＤＮ Ａを含む哺乳動物細胞を多数の化合物と接触させること、該受容体の活性化を促 進させるかまたは阻害するものを決定し、それによって特に相互作用する化合物 を同定すること、ついで本発明のポリペプチドの活性化を促進させるかまたは阻 害する。 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドの診断上の使用を考慮する。例えば、 突然変異が存在するならば、病状はＴＮＦ受容体の活性の欠如から生じているで あろう。さらにＴＮＦ受容体活性を増強する変異は例えばエンドトキシンショッ クなどの受容体の過剰発現に関連する疾患へと導くであろう。変異のある遺伝子 の配列を正常な遺伝子の配列との比較によって検出されることができる。続いて 変異遺伝子が病状または疾患条件へのかかり易さに関連していると確認すること ができる。すなわち、ＴＮＦ受容体を過少発現する変異遺伝子は腫瘍の増殖を抑 制することができないＴＮＦに関連している。 本発明のポリヌクレオチドにおける変異を有する個体は、多様な技術によって ＤＮＡレベルで検出される。診断に使用する核酸は血液、尿、唾液および生検を 含む（これらに限られることはない）患者の細胞から得る。ゲノムＤＮＡを検出 のため直接使用するかまたはＰＣＲ（サイキ（Ｓaiki）ら、Ｎature、３２４： １６３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅して、分析する。ＲＮＡ またはcＤＮＡはまた同様の目的のために使用する。例としては、本発明の核酸 に相補的なＰＣＲプライマーを遺伝子変異を同定および分析するために使用する ことができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型に比較して増幅産物 の大きさにおける変化によって検出することができる。点突然変異は増幅したＤ ＮＡを放射線標識したＲＮＡまたは別に、標識したＴＮＦ受容体アンチセンスＤ ＮＡ配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマ ッチした配列をＲＮＡアーゼＡ消化または融点の相違によってマッチしない二本 鎖から区別することができる。このような診断は特に親または新生児試験でさえ 利用することができる。 参照遺伝子と「変異体」の間の配列の相違は直接のＤＮＡシークエンシニグ方 法によって明らかになる。さらに、クローニングしたＤＮＡセグメントは特異的 なＤＮＡセグメントを検出するプローブとして使用する。この方法の感度はＰＣ Ｒと組み合わされる場合に非常に増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または 一本鎖鋳型分子とともに使用したシークエンシング法は修飾したＰＣＲ産物によ って産生される。配列決定は放射線標識したヌクレオチドを使用する従来の方法 によって、または蛍光標識タグを有する自動シークエンシング方法によって行わ れる。 特定の位置での配列の変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＮアーゼおよびＳ １保護または化学的開裂法（例えば、コットン（Ｃotton）ら、ＰＮＡＳ、８５ ：４３９７−４４０１（１９８５））などによって明らかである。 本発明はさらに、宿主由来のサンプルにおいてレベルが上昇することがある疾 患の指標であるところの本発明のポリペプチドの可溶性形態のレベルが変化して いることを検出する診断アッセイに関する。可溶性受容体の検出に利用すること ができるアッセイは当業者によく知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ 、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析および好ましくはＥＬＩＳＡアッ セイが使用される。 ＥＬＩＳＡアッセイは最初に本発明のポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好 ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにリポーター抗体をモ ノクローナル抗体に対して調製する。該リポーター抗体に放射能、蛍光または本 実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素といったような検出可能な薬 剤を結合させる。サンプルを直ちに宿主から取り除いて、サンプル中のタンパク 質と結合する固相支持体、例えばポリスチレンの皿の上でインキュベートする。 ついでウシ血清アルブミンのような非特異的なタンパク質と共にインキュベート することにより、その皿の空いているタンパク質結合部位を全て覆う。つぎに、 モノクローナル抗体を皿においてインキュベートするが、その間に、そのモノク ローナル抗体はポリスチレン皿に結合したの本発明のタンパク質に結合する。結 合しなかったモノクローナル抗体を全てバッファーで洗い流す。西洋ワサビペル オキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に直ちに置くと、リポーター抗体の 、本発明のポリペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体への結合が起こる 。ついで結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。ついでペルオキシダーゼ基 質を皿に加え、一定時間の発色量を標準曲線に対して比較する場合、患者のサン プルの一定体積中に存在する本発明のタンパク質の量の測定値である。 競合アッセイを利用することができ、ここでは、本発明のポリペプチドに特異 的な抗体を固相支持体に結合させて標識したＴＮＦ受容体ポリペプチドおよび宿 主から得られたサンプルを固相支持体上に通過させる。該受容体の可溶性形態も またアゴニストおよびアンタゴニストを同定するように使用する。 胸腺細胞分裂アッセイを使用して、本発明のポリペプチドのリガンドおよび可 能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストの両者を同定する。例えば、胸腺細 胞を組織から採取して、培養培地中で増殖させる。³Ｈ−チミジンまたは５−ブ ロモ−２'−デオキシウリジン（ＢrdＵ）などのＤＮＡ前駆体の取り込みをＤＮ Ａ合成および細胞分裂のパラメーターとしてモニターする。ＤＮＡにＢrdＵを取 り込んだ細胞をＢrdＵに対するモノクローナル抗体を使用して検出することがで き、ついで酵素または蛍光コンジュゲートした第二抗体によって測定する。反応 を蛍光分光計または分光計によって定量化する。２つのコントロールウエルおよ び実験ウエルを用意する。ＴＮＦ−βを全てのウエルに加え、一方、本発明の可 溶性受容体を実験ウエルに加える。また実験ウエルにはスクリーニングする化合 物を加える。スクリーニングされるべき化合物のＴＮＦ−βと本発明の受容体ポ リペプチドとの相互作用を抑制する能力をついで定量化する。アゴニストの場合 は、この相互作用を増強する化合物の能力が定量化される。 本発明のポリペプチドに結合することができると知られていないリガンドが本 発明のポリペプチドに結合することができるか否かの決定を、本発明のポリペプ チドをコードする単離した分子を含む哺乳動物細胞を該ポリペプチドへ結合する と知られているリガンドの結合を可能にする条件下でリガンドと接触させ、かか るリガンドが本発明のポリペプチドに結合するか否かを決定することにより行う ことができる。また、該受容体の可溶性形態を上記アッセイに利用することがで き、その際、該受容体は細胞外培地に分泌され、リガンドと接触されて、該受容 体の可溶性形態に結合するか否かを決定する。 他のアゴニストおよびアンタゴニストスクリーニング方法はその表面に受容体 が発現する適当な細胞を提供することに関する。特に、本発明のポリペプチドを コードするポリヌクレオチドは該ポリペプチドを発現する細胞をトランスフェク トするのに使用する。そのようなトランスフェクションを本明細書に記載する方 法によって行う。 従って、例えば、そのようなアッセイは本発明のポリペプチドをコードする細 胞を受容体リガンドおよびスクリーニングされるべき化合物の両方に接触するこ とによって受容体アンタゴニストをスクリーニングするのに使用する。リガンド によって産生されたシグナルの抑制は、化合物が該受容体の可能性のあるアンタ ゴニストであって、すなわち受容体の活性を阻害することを示す。 該スクリーニングはそのような細胞をスクリーニングされるべき化合物と接触 させることによってアゴニストを決定するように使用され、ついでそのような化 合物がシグナルを産生する、すなわち受容体を活性化させるかどうかを決定する のに使用する。 他のスクリーニング技術には受容体の活性化によって引き起こされる細胞外の ｐＨの変化を測定する系において本発明のポリペプチドを発現する細胞（例えば トランスフェクションしたＣＨＯ細胞）の使用を含む（例えば、Ｓcience、２４ ６巻、１８１−２９６頁（１９８９））。他の例において、可能性のあるアゴニ ストまたはアンタゴニストは本発明のポリペプチドを発現する細胞と接触させ、 ついで、第二メッセンジャー応答、例えばシグナルトランスダクションを可能性 のあるアンタゴニストまたはアゴニストが有効であるかどうかを決定するように 測定される。 他のスクリーニング技術はホスホリパーゼＣまたはＤに結合する受容体ポリペ プチドを発現することに関する。そのような細胞の代表例には、内皮細胞、平滑 筋細胞、胎生腎臓細胞などがある。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリー ニングは、ホスホリパーゼ第二シグナルからの受容体の活性化または阻害によっ て本明細書に記載されるように行う。 抗体は、抗体が結合する本発明のポリペプチドの一部に依存してアゴニストお よびアンタゴニストの両方として利用される。一つの例における抗体は活性化部 位に結合し、リガンドアクセスを阻害する。しかしながら、あるＴＮＦ受容体に 直接対するモノクローナル抗体が該受容体の細胞外ドメインに結合する場合、特 異的なアゴニストとして機能することができることが観察されている。 上記に同定されたアンタゴニストに加えて、ＴＮＦ受容体に結合するオリゴヌ クレオチドもまた、ＴＮＦ受容体アンタゴニストとして機能する。かわりに、可 能性のあるＴＮＦ受容体アンタゴニストはＴＮＦ受容体の完全な細胞外領域を含 み、その生物学的活性を抑制するリガンドに結合するＴＮＦ受容体の可溶性形態 である。 別の可能性のあるアンタゴニストにはまた、アンチセンス技術の利用によって 調製されたアンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重 らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御 することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ への結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌク レオチド配列の５'コーディング部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のア ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを 、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−リ ー（Ｌee）ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃ ooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan ）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによって、 転写およびＴＮＦ受容体の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ ドは、イン・ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＫＧＦ −２ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ（Ｏkano）、 Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチドズ・ アズ・アンチセンス・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏigodeoxynucleoti des asＡntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス（ＣＲ Ｃ Ｐress）、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８８）)。上記 のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡま たはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＴＮＦ受容体の産生を阻害すること ができる。 ＴＮＦ受容体アンタゴニストにはまた、ＴＮＦ受容体に結合する、および該受 容体の結合部位を占め、それによってＴＮＦ受容体に近づき難くして正常な生物 学的活性を妨げる小分子が含まれる。小分子の例には、これらに限定されるもの ではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。 ＴＮＦ受容体アゴニストをある移植可能な腫瘍中の腫瘍の増殖の抑制および壊 死などのリガンド活性を刺激するのに使用する。該アゴニストもまた、細胞分化 、例えばＴ細胞、線維芽細胞および造血幹細胞の分化を刺激するのに使用する。 ＴＮＦ受容体のアゴニストはまた、微生物に対する宿主の防御および関連疾患（ リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．monocytogenes）などによる感染）および クラミジアを妨害することにおいてのＴＮＦの役割を増大させる。該アゴニスト はまた、酵素の変性、脂質過酸化およびＤＮＡ損傷などの放射線療法の経過間に 産生された電離放射線の効果の欠失に対して保護するのに使用される。 該アゴニストはまた、抗ウイルス応答を媒介し、増殖を制御し、免疫応答を媒 介し、ついでＨＩＶなどの疾患に関連する免疫不全を処置するために使用されて よい。 ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニストは自己免疫疾患、例えば移植片対宿主拒 絶および同種移植拒絶およびＡＩＤＳなどのＴ細胞媒介自己免疫疾患を処置する のに使用してよい。Ｔ細胞増殖は２型ＴＮＦ受容体を介して刺激されることが示 されている。従って、受容体と拮抗させることによりＴ細胞増殖を妨げ、Ｔ細胞 媒介自己免疫疾患を処置することができる。 アンタゴニストはまた、アポトーシスを妨げるために使用されてよく、ウイル ス感染、慢性関節リウマチ、全身性狼癒、紅斑発疹（erythematosus）、インシ ュリン依存性糖尿病および移植片拒絶などの疾患の基礎となるものである。同様 に、アンタゴニストは細胞毒性を妨害するのに使用される。 ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニストはまた、ＴＮＦにより刺激されるＢ細胞 癌を治療するために使用される。 ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニストはまた、敗血症性ショック（重要な臨床 状態である）を処置および／または予防するのに使用される。敗血症性ショック は多大な宿主応答、病原から直接というよりはＴＮＦおよびＩＬ−１などのタン パク質因子によって媒介されるものである。例えば、リポポリサッカリドは血清 濃度の強くそして位置時的な増加へと導くＴＮＦの放出を引き出すと示されてい る。ＴＮＦはショックおよび過剰量を投与されると組織の傷害を引き起こす。従 って、ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニストはＴＮＦの作用を阻害し、ついで敗 血 症性ショックを処置／予防する。これらのアンタゴニストはまた、ＴＮＦの高い 血清レベルと相関する子供における髄膜炎菌血を処置するために使用されてもよ い。 ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニストによって処置される他の障害にはＴＮＦ 受容体リガンドによって媒介される炎症、細菌感染性悪液質および大脳マラリア が含まれる。ＴＮＦ受容体アンタゴニストはまたＴＮＦなどの受容体に対するリ ガンドによって媒介される炎症を処置するために使用してよい。 可溶性のＴＮＦ受容体およびアゴニストおよびアンタゴニストは適切な製薬学 的担体と組み合わせて使用してよい。そのような組成物は、治療上有効な量の可 溶性受容体またはアゴニストまたはアンタゴニストおよび薬学上許容され得る担 体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものでは ないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、 エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適 合すべきである。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１ つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ のような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を 規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト への投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに 、本発明の受容体の可溶性形態、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療 化合物と共に使用することができる。 該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経 路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体 的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、そ れらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、そ れらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多 くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k g〜約１mg／kg(体重)である。 ＴＮＦ受容体およびポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストまた はアゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペ プチドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる 。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボにおいてポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を 該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である 。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子 の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。 同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにお ける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当業界で 知られているように、細胞をイン・ビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン ・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを 含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができ る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法 および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を 操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運 搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボにおいて操作するために使用す ることができるアデノウイルスであってもよい。 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色 体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。実際の 配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置 をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマ ッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階 である。 簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'の翻訳さ れていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上の エキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程 を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む 体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応する ヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであ ろう。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい ゲノムクローンのプール由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成すること ができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピ ング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド (flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤ ＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクシ ョンが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ ーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ る。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することが できる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分な信号 強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが 得られたクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２, ０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、おそ らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の概説には、 ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromosomes）： ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニックス（a Ｍanual of Ｂasic Ｔec hniques）、パーガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８ ８）を参照。 ある配列が正確な染色体位置に一度マッピングされると、染色体上の配列の物 理的位置を遺伝マッピングデータと関連付けることができる。そのようなデータ は、例えば、マクジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・ イン・マン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）ジョーンズ・ホプキンス・ユ ニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibrary)を介してオンラインで利用できる)に見い出 される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係 を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認す る。 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノ ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全 てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ の変異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する 染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺 伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析およ び２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。 ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ 、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を 製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノク ローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、 さらにはまた、Ｆab断片、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当 業界で既知の様々な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用することが できる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチ ドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒ トでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして 得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポ リペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結 合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使 用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することがで きる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗 体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(コ ーラー（Ｋohler）およびミルスタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２ ５６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技 術(コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、およ びヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(コー ル（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャ ンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン ・アール・リス・インク（Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.）、７７−９６頁中)が含まれ る。 単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し 得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプ チド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。 本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのよ うな実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこ とわらない限り、重量単位である。 以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および ／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限 定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手 可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触 媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており 、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているよう に 使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミド またはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤ ＮＡ断片を単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μ gを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および 基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーショ ン時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後 、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離 する。 切断した断片のサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミ ドゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そ のような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナ ーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレ オチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ れていない断片にライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を 形成する過程をいう(マニアチスら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、 ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg 当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知のバッファー および条件を用いて成し遂げることができる。 特にことわりない限り、トランスフォーメーションはグラハム（Ｇraham，Ｌ. ）およびバン・デア・エブ（Ｖan der Ｅb，Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６− ４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。 実施例 １ ＴＮＦ受容体の細菌発現および精製 最初に、ＴＮＦ受容体をコードするＤＮＡ配列(ＡＴＣＣ受託番号第７５８９ ９号)を、プロセシングしたＴＮＦ受容体核酸配列（シグナルペプチド配列を含 む）配列の５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを 利用して増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、ＢamＨＩ制限酵素部位を、続いて、推定開始コドンの後に続くコドンか ら始まるＴＮＦ受容体コーディング配列の２１ヌクレオチドを含む。３'配列： は、Ｈind III部位（太字）に対する相補的配列、および続くＴＮＦ受容体の１ ８ヌクレオチドを含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−９（キ アゲン、インク）、チャタワース（Ｃhatsworth）、カリフォルニア)上の制限酵 素部位に一致する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製開始点（or i）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム 結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位部位をコードする。ついで pＱＥ−９をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化する。増幅した配列をpＱＥ−９にライ ゲーションし、ついでヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共にイン ・フレームで挿入する。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｍ１５ ／rep４（キアゲン、インク）である大腸菌株をサンブルックら、モレキュラー ・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ラボ ラトリー・プレス、（１９８９）に記載された方法によってトランスフォームし た。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lacＩ リプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランスフ ォーマントを、それらが、ＬＢプレートで増殖する能力により同定しついでアン ピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。所望の構築物を含むクローン を、Ａmp(１００μg／ml)およびＫan(２５μg／ml)の両方を補った、ＬＢ培地中 での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな 培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の間 の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロ ピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加え た。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、 遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３−４時間増殖させ た。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤 である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６− ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケ ル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＴＮＦ受容体を 精製する(ホチュリ（Ｈochuli,Ｅ.）ら、Ｊ．Ｃhromatography ４１１：１７７ −１８４（１９８４）)。６モルのグアニジンＨＣl（ｐＨ５.０）中、ＴＮＦ受 容体（純度９０％）をカラムから溶出し、また再生を目的として３モルのグアニ ジンＨＣｌに合わせ、１００mＭのリン酸ナトリウム、１０モルのグルタチオン （還元された）および２ミリモルのグルタチオン（酸化された）で調節する。こ の溶液中で１２時間インキュベートした後、該タンパク質を１０ミリモルのリン 酸ナトリウムにて合わせる。 実施例 ２ バキュロウイルス発現システムを用いてのＴＮＦ受容体および 細胞外（可溶性）ＴＮＦ受容体のクローニングおよび発現 完全な長さのＴＮＦ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ受託 番号第７５８９９号を遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレ オチドプライマーを利用して増幅する。その５'プライマーは、配列： を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位（太字）、続いて２１ヌクレオチドのＴＮＦ 受容体遺伝子を含む（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く）。 その３'プライマーは配列、 を有し、また制限エンドヌクレアーゼＸbaＩの開裂部位、およびＴＮＦ受容体遺 伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な２１ヌクレオチドを含む。増幅された配 列を市販のキット（「ジーンクリーン」“Ｇeneclean”、バイオ１０１インク（ ＢＩＯ １０１ Ｉnc.）、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）を使用し て１％アガロースゲルから単離する。ついで、その断片をエンドヌクレアーゼＢ amＨＩおよびＸbaIで消化した後、１％アガロースゲル上で次に再度精製する。 この断片をＦ２と名付ける。 ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる）をバキュロ ウイルス発現システムを用いてのＴＮＦ受容体タンパク質の発現に使用した（概 説には、サマーズ（Ｓummers，Ｍ．Ｄ.）およびスミス（Ｓmith，Ｇ．Ｅ.）、１ ９８７、ア・マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・バキュロウイルス・ベクタ ーズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロシーデュアーズ（Ａ manua l of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures ）、テキサス・アグリカルチュラル・エクスパーリメンタル・ステーション・ブ レティン（Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin）第１５ ５５号を参照）。この発現ベクターは、オートグラファ（Ａutographa）カリフ ォルニアヌクレアーポリヘドロシスウイルス（ＡcＭＮＰＶ）の強力なポリヘド リンプロモーター続いて制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＸbaＩの認識部 位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を有効なポリア デニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、大腸菌由来のβ− ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く ポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。共トランスフェクトした野生 型ウイルスＤＮＡの、最尾部により媒介される相同の組換えのためのウイルス配 列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクタ ーは、例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１をｐＲＧ１の代 わりに使用することができるであろう。（ラッコウ （Ｌuckow，Ｖ．Ａ.）およびサマーズ、Ｖirology，１７０：３１−３９。 プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＸbaＩで消化する。そのＤＮＡを市販の キット（「ジーンクリーン」、バイオ１０１インク、ラ・ホラ、カリフォルニア ）を使用して１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と名 付ける。 断片Ｆ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーシ ョンする。ついで、大腸菌ＨＢ１０１細胞をトランスフォームし、プラスミド酵 素ＢamＨＩおよびＸbaＩを用いて（ｐＢaＣ ＴＮＦ受容体）を含むよう同定す る。そのクローニングされた断片の配列はＤＮＡシークエンシングにより確認さ れる。 リポフェクション法を利用して、プラスミドｐＢac ＴＮＦ受容体５μgを市販 の線形化したバキュロウイルス（「バキュロゴールド^TM・バキュロウイルスＤＮ Ａ」“ＢaculoＧold^TM baculovirus ＤＮＡ”、ファーミンゲン、サンディエゴ 、カリフォルニア）１.０μgと共に共トランスフェクションする（フェルグナー （Ｆelgner）ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４ １７（１９８７））。 バキュロゴールド^TM・ウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドｐＢacＴＮＦ受 容体５μgを無血清グレイス（Ｇrace's）培地（ライフ・テクノロジーズ・イン ク（Ｌife Ｔechnologies，Ｉnc.）、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メ リーランド）５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウエル中で混合し た。その後、リポフェクチン１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、 室温で1５分間インキュベートした。ついで、トランスフェクション混合物を無 血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫 細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）に滴加する。そのプレートを前後に揺り動か して、新たに加えた溶液を混合する。ついでそのプレートを２７℃で５時間イン キュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去 して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレー トをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続けた。 ４日後、上清を回収して、サマーズおよびスミス（上記）により記載されたよ うにして、プラークアッセイを行った。変法として「ブルー・ガル」（“Ｂlue Ｇal”）（ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ）を含むアガロ ースゲルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単 離することが可能となる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細 胞培養に関する利用者のガイド、およびライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイ ザーズバーグにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見い出すこ とができる）。 連続希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークを エッペンドルフピペットの先端で採取する。ついで、組換えウイルスを含む寒天 を２００μlのグレイス培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。そ の寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清 を、３５mmの皿に播種したＳｆ９細胞を感染させるのに使用した。４日後、これ らの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存した。 Ｓｆ９細胞を１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させた。そ の細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＴＮＦを感染 させた。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まな いＳＦ９００II培地（ライフ・テクノロジーズ・インク、ゲイザーズバーグ）に 替えた。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓシステイ ン（アマシャム（Ａmersham）を加えた。その細胞をさらに１６時間インキベー トした後、それらを遠心分離により収集して標識化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。 実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＴＮＦ受容体の発現 プラスミド、ＴＮＦ受容体ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０ 複製開始点、２）ア ンピリシン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４ ０ イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベ クター pcＤＮＡＩ／Ａmp(インビトロゲン(Ｉnvitrogen)）から得られる。完全 なＴＮＦ受容体の前駆体およびその３'末端にイン・フレームで融合したＨＡタ グをコードするＤＮＡ断片を、そのベクターのポリリンカー領域にクローニング することから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される 。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られ るエピトープに対応する(ウィルソン（Ｉ．Ｗilson）、ニマン（Ｈ.Ｎiman）、 ハイテン（Ｒ.Ｈeighten）、チェレンソン（Ａ.Ｃherenson）、コノリー（Ｍ.Ｃ onnolly）、およびラーナー（Ｒ.Ｌerner）、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。 ＨＡタグを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を 、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。 プラスミド構築方法を以下に記載する： ＴＮＦ受容体をコードするＡＴＣＣ受託番号第７５８９９号のＤＮＡ配列を、 ２つのプライマーを用いてのＰＣＲにより構築する： ５'プライマー配列： はＢamＨＩ部位（太字）、続いて開始コドンから出発するＴＮＦ受容体のコーデ ィング配列の２１ヌクレオチドを含む； ３'配列： は、ＸbaＩ部位（太字）に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およ びＴＮＦ受容体コーディング配列の最後の１８ヌクレオチド(終止コドンは含ま れていない)を含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＢamＨＩ部位、ＴＮＦ受容体コー ディング配列、続いて、イン・フレームで融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣 の翻訳終結コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断 片およびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＢamＨＩおよびＸbaＩ制限酵素で消化 して、ライゲーションする。そのライゲーション混合物を大腸菌株ＳＵＲＥ(ス トラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems） 、ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア)にトランスフォームし、そのトラ ン スフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニー を選択する。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しい 断片の存在に関してＰＣＲおよび制限分析により試験する。組換えＴＮＦ受容体 の発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクタ ーでトランスフェクションする。(サンブルック、フリッチ（Ｅ.Ｆritsch）、マ ニアチス（Ｔ.Ｍaniatis）、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・ マニュアル、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８９）)。 ＴＮＦ受容体ＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出 する(ハーロゥ（Ｅ.Ｈarlow）、レーン（Ｄ.Ｌane）、アンチボディーズ（Ａnti bodies）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、コール ド・スプリング・ラボラトリー・プレス、（１９８８）)。トランスフェクショ ンから２日後、タンパク質を³⁵Ｓ−システインで８時間標識化する。次いで、細 胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡバッファー(１５０mＭ ＮaＣl、１ ％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))で溶菌する(ウィルソンら、同上 ３７：７６７（１９８４ ）)。ＣＯＳ細胞ライゼートおよび上清から得られた³⁵Ｓ−システイン標識化タ ンパク質を、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降させる。沈降したタンパ ク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。 先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後 記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 16/24 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該 ポリペプチドの断片、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第７５８９９号に含まれるcＤＮＡによりコードされる アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、アナログも しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド； よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。 ２．該ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ３．該ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ４．該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレ オチド。 ５．該ポリヌクレオチドが、配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペ プチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ６．該ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号第７５８９９号のcＤＮＡによ りコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド 。 ７．配列番号：２に示すポリペプチドのコーディング配列を有する、請求項１ に記載のポリヌクレオチド。 ８．ＡＴＣＣ受託番号第７５８９９号として寄託されたポリペプチドのコーデ ィング配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。 １０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。 １１．該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞 から発現させることを含むポリペプチドを製造する方法。 １２．細胞を請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作することを含む、ポリペ プチドを発現させることが可能な細胞を製造する方法。 １３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であって、ＴＮ Ｆ受容体活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ。 １４．（ｉ）配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および該 ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体；および （ii）ＡＴＣＣ受託番号第７５８９９号のcＤＮＡによりコードされるポリペプ チド、および該ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体； よりなる群から選択されるポリペプチド。 １５．該ポリペプチドが配列番号：２の推定アミノ酸配列を有する請求項１４に 記載のポリペプチド。 １６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。 １７．請求項１４に記載のポリペプチドを活性化する化合物。 １８．請求項１４に記載のポリペプチドを活性化する化合物。 １９．ＴＮＦ受容体を活性化する必要がある患者の処置方法であって、請求項１ ８に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 ２０．ＴＮＦ受容体を阻害する必要がある患者の処置方法であって、請求項１７ に記載の化合物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。 ２１．該化合物の治療上有効な量を該化合物をコードするＤＮＡを該患者に与え て、該化合物をイン・ビボで発現させることによって投与する、請求項１９に記 載の方法。 ２２．該化合物の治療上有効な量を該化合物をコードするＤＮＡを該患者に与え て、該化合物をイン・ビボで発現させることによって投与する、請求項２０に記 載の方法。 ２３．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニス トを同定する方法であって、 （ａ）ＴＮＦ受容体、ＴＮＦ受容体に結合すると知られているリガンドに応じて 増殖する細胞を含む反応混合物およびスクリーニングされるべき化合物を、該リ ガンドがＴＮＦ受容体ポリペプチドに結合する条件下で混合し； （ｂ）該化合物がＴＮＦ受容体およびリガンドの相互作用を阻害または増強する かどうかを決定する ことを含む請求項１４に記載の方法。 ２４．請求項１４に記載のポリペプチドの過小発現に関連のある疾患または該疾 患の罹患し易さを診断する方法であって、 該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異を決定する ことを含む方法。 ２５．該ポリペプチドがＴＮＦ受容体の可溶性断片であり、該受容体のリガンド に結合することができる請求項１４に記載のポリペプチド。 ２６．宿主由来のサンプル中の請求項２５に記載のポリペプチドの存在を分析す ることを含む診断方法。 ２７．請求項１４に記載のポリペプチドに結合することができると知られていな いリガンドが該ポリペプチドに結合することができるかどうかを決定する方法で あって、 該受容体を発現する哺乳動物細胞を可能性のあるリガンドに接触させ、 該受容体に結合するリガンドの存在を検出し、ついで 該リガンドが該受容体に結合するかどうかを決定する ことを含む方法。