JPS63123386A - 植物ウイルス阻害物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はオシロイバナ属の植物から、植物ウィルス阻害
作用を示す塩基性蛋白質を高収率で製造する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

本件出願人は、オシロイバナ属の植物から１ｎＮな抗植
物ウィルス作用を示す物質を単離した。そして、これが
下記の物理的性質で特定される新規な塩基性蛋白質であ
ることを確認しく以下、単にウィルス阻害物質という）
、該ウィルス阻害物質について既に特許出願を行なった
（特開昭６０−２４３１００号）。

・波長２８０　ｎｍに極大吸収を有する紫外線吸収スペ
クトル ・ニンヒドリン反応陽性、且つフェノール硫酸反応陰性 ・等電点：　ｐＨ９〜１０ ・ＳＯ３／ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定し
た分子量が２．４２Ｘ　１Ｑ　Ａ・超遠心分離法による
沈降係数が Ｓ２０　ｗ　＝２．５ このウィルス阻害物質の詳細な作用機序は明らかでない
が、例えばアルギン酸ナトリウム等の従来のウィルス防
除剤とは全く異なった作用であることは確かである。即
ち、アルギン酸゛ナトリウム等は葉の表面に保護膜を形
成し、ウィルスの接触伝染を防止するものである。この
ため作用が局部的である。これに対して上記ウィルス阻
害物質はシステミックな作用を有し、例えば葉の裏側に
塗布した場合でも葉の表面で効果を生じる。

更に、組織培養の手法を用いて上記ウィルス阻害物質を
製造する方法についても先に特許出願を行なった（特開
昭６１−５７９０号）。この方法はオシロイバナ属の植
物から誘導したカルスを大量培養し、この培養細胞から
上記ウィルス阻害物質を抽出するもので、栽培植物から
抽出する方法に比較して種々の利点が得られる。即ち、
植物体自体から抽出製造する場合には原料植物体の栽培
に広大な作付は面積を要し、且つ原料の入手が自然環境
や天候等の栽培条件に大きく左右されると共に、栽培し
た植物の収穫にも多大の時間と労力を要する問題がある
が、組織培養によればこのような問題は生じない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

出願人の提案になる上記従来の製造方法においては、そ
の生産効率向上を阻害する要因として次のような問題が
ある。

即ち、オシロイバナ植物から誘導されたカルス細胞は、
ウィルス阻害物質生産能にかなりのバラツキがあり、生
産能の高い細胞だけでなく生産能の著しく低い細胞も含
まれている。単一の植物体から誘導された同−遺伝子型
のカルス細胞でありながらこのような差があるのは、遺
伝子の発現が夫々異なるためと考えられる。

上記事情に鑑み、本発明はオシロイバナ属の植物から誘
導したカルス細胞を原料としてウィルス阻害物質を製造
する方法を改良し、その製造効率を向上することを目的
とする。

ｃ問題点を解決するための手段〕 」Ｌ 本発明による製造方法は、前記ウィルス阻害物質を産生
ずるオシロイバナ属の植物からカルスを誘導して培養す
る工程と、この培養細胞の中から標識イムノアッセイ法
を用いて前記植物ウィルス阻害物質生産能の高い細胞を
選抜し、この選抜細胞の中から更に生産能の高い細胞を
選抜する操作を繰返し行なうことにより、前記植物ウィ
ルス阻害物質に関する安定した高生産能細胞を得る工程
と、この高生産能細胞を大量培養する工程と、その大量
培養した細胞から前記植物ウィルス阻害物質を抽出分離
する工程とを具備したことを特徴とするものである。

上記から明らかなように、本発明にはオシロイバナのカ
ルス細胞から目的とするウィルス阻害物質生産能の高い
細胞をクローンカルス化する工程が含まれている。植物
の組織培養において、特定の代謝生成物生産能の高い細
胞をクローン化することに成功した例としては、例えば
シコニン類について赤色色素高生産能株の育成（ミズカ
ミ等。

フィトケミストリー、　１７．９５〜９７　（１９７８
）（Ｍ　ｉｚｕｋａｍｉＪｌ　、ｅｔ　ａｔ、、Ｐｈｙ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７．９５〜９７　（１９７
８）　、ニチニチソウ培養細胞からアジュマリシン及び
セルベンチン島生産能株の育成くゼンク等、プラント・
ティッシュ・カルチャー・アンド・イツツ・バイオテク
ノロジカル・アプリケーション、　ｐ、２７〜４３．１
９７７　　（Ｚｅｎｋ、Ｍ、　Ｈ，、ｅｔａｌ。Ｐｌａ
ｎｔ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　ａｎｄ　Ｉ
ｔｓＢ　１ｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｏｉｃａｌ　　Ａ　ｐ
ｐｌｉｃａＮｏｎ、　ｐ、２７〜４３．１９７７　＞　
、タバコ培養細胞からユビキノン−１０高生産能様の育
成（マツモト等、アグリカルチュラル・バイオロジカル
・ケミストリー、　４５．１６２７〜１６３３（１９８
１）　　（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　王、、ｅｔ　ａｔ、
。

Ａｇｒｉｃ、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　４５．１６
２７〜１６３３（１９８１）が知られている。しかし、
これら成功例は何れも低分子量の二次代謝物産生能を対
象としており、特定蛋白質の高生産能様をクローンカル
ス化した例は知られていない。発明者等は、蛋白質高生
産能様のりＯ−ン化としては初めての例として、前記ウ
ィルス阻害物質高生産能様のりＯ−ン化に成功し、これ
を既述した従来の製造方法と組合せることによって本発
明に至ったものである。

且１ヱ」Ｐｌ まずカルスの誘導および培養工程について説明すると、
ウィルス阻害物質を含有するオシロイバナ民の植物、例
えばオシロイバナ（Ｍ　１ｒａｂｉｌｉｓＪａｌａｐａ
　Ｌ、　）の種子、葉、茎、根、その他の組織をイオン
交換水で充分に洗浄し、適当な大きさの組織片に切断す
る。この組織片を、例えば次亜塩素酸ソーダやエタノー
ル等の適当な殺菌剤で殺菌処理し、更に滅菌水でよく洗
った後、寒天培地上に静置する。これを暗所もしくは照
明下で２３〜３２℃の温度条件下に培養することにより
、１〜３週間後にカルスが誘導される。こうして誘導さ
れたカルスは、寒天培地、液体培地の如何を問わず良好
な細胞増殖を示す。

培養に用いる培地は、各種ビタミン、無機塩類、糖から
なる既知の植物組織培養に使用されているものでよい。

例えばムラシゲ・スクーグ（ＭｕｒａＳｈｉ！１ｌｅ−
Ｓｋｏｏｇ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、ボー
ト’ｖ　−（Ｇａｕｔｈｒｅｔ　）培地、ツレツケ（Ｔ
　ｕｌｅｃｋｅ）培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌ
　ｉｎｓｍａｉｅｒ−３ｋｏｏｇ）培地、ヒルデブラン
ド（Ｈｉ　１ｄｅｂｒａｎｄｔ）培地およびこれらの修
正培地等が挙げられる。糖としてはスクロース、グルコ
ース、フラクトース、マルトース、糖蜜、、ｙｌ粉等を
単独もしくは混合して使用することかできる。これらの
培地にココナツツミルク、駆出エキス、麦芽エキス、カ
ザミノ酸、ペプトン、肉エキス等を添加して用いれば更
に有効である。また、植物成長調節物質として、例えば
β−インドール酢酸。

α−ナフタレン酢りｎ、２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸等のオーキシン類０，０１〜２０　ｐｐｍ、例えばカ
イネチン、ゼアチン、６−ベンジルアデニン等のサイト
カイニン類０．０１〜１００ｒＨＡを、夫々単独または
組合わせて用いることにより効果的にカルスを誘導する
ことができる。このようにして誘導されたカルスは、特
に２．４−ジクロロフェノキシ酢１１０，１〜１０ｐｐ
ｍ及びスクロース３０（］／Ｊ２を含むムラシゲ・スク
ーグ培地を用いた液体培養において最も良好な細胞増殖
が認められた。その場合、培地のｐＨは４．０〜１．０
１培Ｍｉｆｆ１度は２５〜３２℃が好適で、７〜１４日
の培養により約１５Ｍ［の乾燥重曾に達する。

次に、こうして得られた培養細胞から目的とするウィル
ス阻害物質の高生産能様を選抜する方法を説明する。ま
ず、上記培養細胞を篩やチーズクロスで無菌的に濾過し
、単細胞または少数の細胞からなる細胞塊を含んだ濾液
を得る。この濾液をピペットを用いて寒天培地上にブレ
ーティングし、２３〜３２℃の温度条件で暗所もしくは
照明下に培養してコロニーを生成させる。こうして生成
させた略単一細胞起源のコロニーを一個づつ試験管の寒
天培地上に移植し、更に同一条件下で培養してクローン
カルス化を確立する。なお、寒天培地としては細胞の培
養に用いたと同じ培地またはその修正培地、或いはこれ
らの培地に培養濾液１０〜５０％添加した培地等に寒天
０．５〜１．０％を添加したものを用いる。

続いて、上記のようにして得たクローン化カルス細胞の
中から、次のようにしてウィルス阻害物質の高生産能様
を選抜する。

まず、上記クローンカルス株の一部を、夫々その培養に
用いた培地もしくは修正培地を入れた試験管または三角
フラスコに移植して液体培養する（残りは保存株とする
）。生育が定常期に至った段階で各クローンカルスの培
養物を濾過し、これを凍結乾燥してウィルス阻害物質の
定量用サンプルとする。次に、このサンプル１０〜５０
ＩＩｔｇをホモジナイザーに採取し、抽出用バッファー
１〜２ｄを加えてホモジナイザー撹拌別で１〜３分間摩
砕した後、１０００〜１０，０００Ｇで１０分間遠心分
離を行なう。

この上澄み液を抽出用バッファーで適宜稀釈して試験液
とする。得られた試験液について、標識イムノアッセイ
法を用いてその中に含まれるウィルス阻害物質の定量を
行なう。標識イムノアッセイ法としては、標識抗体法（
蛍光抗体法、酵素標識抗体法）またはラジオイムノアッ
セイ法の何れを用いてもよい。例えば、クラークとアダ
ムスによる酵素標識抗体法（Ｃ１ａｒｋ　　Ｍ　Ｆ　ａ
ｎｄ　　Ａ　ｄａｍｓＡＮ　；　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、　３４，４７５〜４８３　　（１９７７）　）
を用いる場合について説明すれば次の通りである。

この方法では、まず家兎にウィルス阻害物質の標品を注
射し、免疫して得た血清からγ−グロブリン（以下、抗
体という）を精製する。このウィルス阻害物質に対する
抗体をコーティングバッファーで稀釈してイムノプレー
トのウェルに入れ、プレートに抗体を付着させる。この
各ウェルに前記試験液を入れ、プレートに付着している
抗体に対して試験液中に含まれるウィルス阻害物質を結
合させる。次いで、グルタルアルデにドを用いた縮合反
応でアルカリホスファターゼを結合した抗体（酵素標識
抗体）を加え、既にプレート上の抗体に結合されている
ウィルス阻害物質番に対してサンドインチ型に結合させ
る。この結果、各プレートには試験液中のウィルス阻害
物質濃度に比例した酵素標識抗体が固定される。従って
、最後にアルカリホスファターゼの基質となるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートのサブストレートバッファー溶
液を加え、１．５〜２時間反応させると、標識酵素の量
に比例したｐ−ニトロフェノールが遊離される。当然な
がら、この量は試験液中のウィルス阻害物質濃度に比例
している。そこで、ｐ−ニトロフェノールの特性吸収波
長である４０５　ｎｍの吸収光度を測定すれば、既知濃
度のウィルス阻害物質を含む溶液を用いて同様の試験で
作成しておいた検量線から、試験液中のウィルス阻害物
質濃度を求めることができる。

上記の測定結果に基づき、ウィルス阻害物質含最の高い
クローンカルス株の数珠（例えば３株捏度）を選抜し、
これらを寒天培地上の保存株から液体培地に接種し培養
する。この＠養細胞について、再度上記と同様の方法で
ウィルス阻害物質の高生産能様を選抜する。この選抜操
作を数回繰返すことにより、目的とするウィルス阻害物
質の高生産能様を得ることができる。なお、こうして得
られた高生産株は、少なくとも８〜１０世代までは安定
した高生産能を保持することが確認されている。

次に、上記のようにして選抜し、培養したＩＩＩ胞から
ウィルス阻害物質を抽出、採取する方法について説明す
れば次の通りである。

まず、培養細胞に２−メルカプトエタノールを０．１％
含む０，０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，０〜７．４）を加
え、ミキサー又はホモジナイザー等で摩砕する。得られ
た摩砕物を遠心分離し、上澄部分と沈澱部分に分ける。

その上澄部分を、抽出に用いたと同一のａｉ雨液で平衡
化した陽イオン交換体（例えばカルボキシメチルセファ
ロースカラムして活性成分を吸着させる。続いて、０〜
０．５Ｍの直線的濃度勾配を有し且つ塩化ナトリウムを
含む０，０１Ｍリン′Ｍ緩衝液（ｐＨ６．０）で吸着し
た活性成分を溶出させる。その活性分画を分取し、０、
０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同ｍ＊
液で平衡化した陰イオン交換体（例えばジエチルアミノ
エチルセファロースカラム）に通し、カラムから流出す
る分画を集める。この分画について、再度上記陰イオン
交換体によるクロマ１〜グラフイーを行なうことにより
抗ウィルス活性を示す単一のピークを示す物質が得られ
る。これを集めて脱イオン水に透析後、凍結乾燥して精
製物を得る。こうして得られた抗ウイルス活性物質は既
述した（ａ）〜（ｅ　）の物理的特性を有し、目的とす
るウィルス阻害物質であることが確認されている。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明の内容をより詳細に説明
する。

実施例 オシロイバナ（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　　Ｊａｌａｐａ　
Ｌ．　）の葉をイオン交換水で充分に洗浄し、約１　ｃ
ｍ四方の大きさに切断し、９５％エタノールで３０秒、
１０％次亜塩素酸ソーダで１０分間殺菌した後、滅菌水
でよく洗浄した。この組織片を寒天培地上に置く。培地
としては、ムラシゲ・スクーグ無機培地に２，４−ジク
ロロフェノキシ酢酸を０．５η／２、サイアミン塩酸塩
をｉｍｇ／λ、スクロースを２０ｇ／λ、ココナツツミ
ルク２００ｍ／λ、寒天粉末を８！１１／Ｒ加え、ｐＨ
を６．０にｍ！ＩＬ、た寒天培地を用いた。

これを暗所下、２８℃の温度条件下で培養することによ
り、３週間後にカルスが誘導された。このようにして誘
導したカルスを前記の寒天培地で二代継代培養した後、
前記寒天培地から寒天を除いた液体培地で三代継代培養
した。更に、前記ムラシゲ・スクーグ無機塩培地に２．
４−ジクロロフェノキシ酢酸を０．５η／２、サイアミ
ン塩酸塩を１ｒＩｒｇ／ｆｆ１１スクロ、スヲ３０　ｏ
／ｇ加え、ｐＨＨＯ２Ｏｆ、：１整した液体培地で継代
培養を行なった。約８ケ月の継代培養によって、カルス
の性質は安定化した。

上記の培養細胞を５００威容の三角フラスコに分注した
基本培地１００　ｄ内に移植し、振盪数１００回／分、
振幅４ｃＩＲの往復振盪礪を用いて２８℃、暗黒下に培
養した。使用した基本培地は、ムラシゲ・スクーグの無
機塩培地に燐酸二水素カリウム３４０η／２、サイアミ
ン塩酸塩ｌｌ１１９／ｎ、スクロース３０ｇ／ｎ、２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸０．５　Ｒｇ／２を添加し
、ｐ）−１６，０に調整したものである。次いで、対数
増殖期後期の培養細胞を２層のステンレス篩（メツシュ
１６と２４）で無菌的に濾過した。

この濾液中の細胞数は１０４個／ｘｉ！程度である。

該濾液を滅菌したピペットで１ａｉｔづつ採取し、直径
９１ｆｆのシャーレ−の寒天培地上に均一になるように
ブレーティングした。余分な水を除去した後、シャーレ
−の盗をし、且つビニールテープを巻いて培地中の水分
の蒸発を防ぎ、暗黒下において２８℃で７日間培養した
。シャーレ−の寒天培地としては、ムラシゲ・スクーグ
無機塩培地にサイアミン塩酸塩１■／（２，スクロース
１０　Ｑ／　ｎ　、２．４−ジクロロフェノキシ酢ｉ！
０．５　ｔｎｙ／　（１、寒天８　（］／λを添加し、
ｐ）−１６，０に調整した後、１２０℃で１５分間オー
トクレーブで滅菌した培地を１０ｍ１づつ分注したもの
を用いた。

ブレーティングして７日後、シャーレ−の寒天培地上に
形成された植物綿１泡コロニー（直径１〜２ａｓ＋）を
試験管の寒天斜面培地上に一個づつ移植した。この斜面
培地は、前記の基本培地に寒天８ｇ／（ｌを添加したも
のである。移植したコロニーを暗黒下、２８℃で２５日
間培養してクローンカルスを確立した。

上記クローンカルスを新鮮重囲で約３５０　ｍｇとり、
前記の基本培地１５ｄを分注したシリコ栓付試験管（直
径２５Ｍ、長さ２００＃ＩＩｍ）内に接種し、暗黒下、
２８℃において定常期になるまで約１２日間、試験管振
盪培養機で培養した。振盪数は２００回／分、振幅は２
ｃＩＲである。

培養後、ブフナーロートを用いて細胞を濾紙上に濾別収
穫し、これを２０ｄ容のスクリュー管（予め重量を秤量
したもの）にとり、−２０℃で凍結した後に凍結乾燥し
た。凍結乾燥後、乾燥重量を測定して生育量を求めた。

凍結乾燥したサンプル５０ηづつを１０成容のスビッチ
型ガラスホモジナイザーにとり、抽出液として２−メル
カプトエタノールを０．１％添加したＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ
ｗｅｅｎ　（塩化ナトリウム８．ｈ／ｎ、　燐ｍ−カリ
ウム０．２ｇ／　ｎ　、燐酸二ナトリウム１２水塩２．
９＋３／　Ｑ　、塩化カリウム０．２Ω／λ、アジ化ナ
トリウムｏ、２Ｑ／Ｉｔ、　　ｔ’ウィー：／２００．
５＃！ｉ！／ｎ、　　ｐＨ７，４）２ｄを加え、ホモジ
ナイザー撹拌装置により１分間摩砕抽出した。摩砕後、
１５００　ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液を抽
出液で稀釈し、これを試験液として次の酵素？！識抗体
法によるウィルス阻害物質の定量試験を行なった。

まずイムノプレートの各ウェルに、コーティングバッフ
ァー（炭酸ナトリウム１，５９　ａ／　Ｑ　、炭酸水素
ナトリウム２．９３　ａ／β、アジ化ナトリウム０．２
ａ／β、　ｐＨ９，８＞に溶かしたγ−グロブリン液（
ウィルス阻害物質の抗体で、既述の方法で、精製したも
の）５μ９／ｒｒｄｌを０．２　ｄを加えた。２５℃で
６時間放置した後、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎで５分置きに
３回洗浄し、先にＵＡ製した試験液０．２−を加えた。

４℃で１夜反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ冑ｅｅｎで３回洗
浄し、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ中に溶解した酵素標識抗体
（標識酵素はアルカリホスファターゼ）０．２　ｍを加
えた。２５℃で４時間反応させた後、Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄し、ジェタノールアミンバッファー（
１０％ジェタノールアミン溶液を塩酸でｐＨ９，８に調
製したもの）中に溶解したｐ−二トロフェニル燐１’ｉ
！２ナトリウム０，２５Ｉｄを加えた。

２５℃で１．５時間反応させた後、４０５　ｎｍの吸光
度を測定した。

以上のようにして、−回目の選抜で親株からクローン化
した夫々のクローンカルスについて行なったウィルス阻
害物質の定り結果を第１図のヒストグラムに示した。図
から明らかなように、目的とするウィルス阻害蛋白の生
産能については個々の細胞から育成したクローンカルス
間に非常に広範なバラツキが存在することが判明し、本
発明における選抜方法が有効であることが示された。こ
の結果に基づいて選抜した生産能の高いクローンカルス
について、更に上記と同様な選抜を繰返したところ、第
２図に示すように選抜を繰返す毎により高い生産能の株
が得られ、第６回目の選抜では下記第１表に示すような
高生産能様が多数１ｑられた。これらの生産能は親株の
８〜１０倍にも達しており、本発明の有効性が実証され
た。

第１表 クローンカルス　　含ｆｆｉ（ｍＭ　　）Ｈ６−３４４
，８ Ｈ６−５６５，６ １−１５−８３４，４ Ｈ６−９３４，９ （但し、Ｈ６−３４等は６回目の選抜細胞を液体培養し
、これを１００分割して得たサンプル番号を意味する。

） 上記６回目の選抜で得られた高生産能のクローンカルス
）−１６−８３を、ムラシゲ・スクーグ培地に２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸を０．５Ｒｇ／λ、サイアミン
塩酸塩を１１Ｆ！ｊ／℃、スクロースを３０ｇ／ｆｆｉ
加え、ＤＨを６．０に調製した液体培地１℃を入れた３
℃容積のヘソ付三角フラスコで１０日間、暗黒下２８℃
、１１０　ｒｐＨｌの回転振盪培養を行ない、１０８９
の新鮮細胞を収穫した。これに２−メルカプトエタノー
ルを０．１％含む０．ＯＩＭ燐酸燐酸液（ｐＨ７，２）
５０Ｊ２を加え、ホモジナイザーで摩砕した。（ｑられ
た摩砕液を５０００Ｇで１５分間遠心分離し、上澄部分
と沈澱部分に分けた。沈澱部分には上記抽出媒を更に２
５４２加えてよく撹拌し、５０００Ｇで１５分間遠心分
離した。両遠心分離で得られた上澄を合わせ、０、ＯＩ
Ｍ燐酸Ｍｌｉ液（ｐＨ６，０）で平衡化したカルボキシ
メチルセファ０−スＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社商品名
）カラムに通して活性成分を吸着させた。吸着した活性
成分は０〜０．５Ｍの直線的濃度勾配をつけた塩化ナト
リウムを含む０　、０１１ｖ１燐酸緩衝液ｐＨ６，０で
溶出した結果、０．１５〜０．１８Ｍ塩化ナトリウム溶
出分画に活性が認められた。該活性分画を分取し、０．
ＯＩＭ燐酸級函液（ｐＨ７，０）に透析後、同緩衝液で
平衡化したジエチルアミノセファロース（ファルマシア
社商品名）カラムに通してカラムから流出する分画を集
め、それを１）８６．０に調製後、再度上記カルボキシ
メチルセファロースカラムクロマトグラフィーを行なっ
た。本カラムクロマトグラフィーにより、抗ウィルス活
性を示す単一のピークが得られたので、これを集めて脱
イオン水に透析後、凍結乾燥し、Ｍ贋物とした。本精製
物は原料に用いた培養細胞の乾燥重１１　Ｋｇ当り１．
２ｇで、高生産能様の選抜を行なわない従来の製造方法
（培養細胞の乾燥重ｆｉｌ　１　Ｋｇ当り１２５　ｍｇ
）の８〜１０倍であった。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明ではオシロイバナのカルス
細胞から目的とするウィルス阻害物質生産能の高いクロ
ーンカルス細胞を選抜し、この高生産能様を培養して原
料としているため、従来の製造方法に比べて生産効率を
著しく向上できる等、顕著な効果が得られるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は酵素標識抗体法を用いた選抜法に
よりウィルス阻害物質生産能の高いクローンカルスを選
抜した結果を示す図で、第１図は一回目の選抜における
各クローンカルス株のウィルス阻害物質含量分布を示す
ヒストグラム、第２図は同様の選抜を繰返すことで更に
高生産能の株が得られることを示す図である。 出願人　日本たばこ産業株式会社 第１　図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記（ａ）〜（ｅ）の物理的性質で特定される塩
   基性蛋白質からなる植物ウィルス阻害物質を産生するオ
   シロイバナ属の植物からカルスを誘導して培養する工程
   と、この培養細胞の中から標識イムノアッセイ法を用い
   て前記植物ウィルス阻害物質生産能の高い細胞を選抜し
   、この選抜細胞の中から更に生産能の高い細胞を選抜す
   る操作を繰返し行なうことにより、前記植物ウィルス阻
   害物質に関する安定した高生産能細胞を得る工程と、こ
   の高生産能細胞を大量培養する工程と、その大量培養し
   た細胞から前記植物ウィルス阻害物質を抽出分離する工
   程とを具備したことを特徴とする植物ウィルス阻害物質
   の製造方法。 （ａ）波長２８０ｎｍに極大吸収を有する紫外線吸収ス
   ペクトル （ｂ）ニンヒドリン反応陽性、且つフェノール硫酸反応
   陰性 （ｃ）等電点：ｐＨ９〜１０ （ｄ）ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測
   定した分子量が２．４２×１０＾４（ｅ）超遠心分離法
   による沈降係数が Ｓ＿２＿０＿ｗ＝２．５
2. （２）前記標識イムノアッセイ法として、酵素標識抗体
   法を用いることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   記載の植物ウィルス阻害物質の製造方法。