HU197939B - Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor - Google Patents
Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor Download PDFInfo
- Publication number
- HU197939B HU197939B HU842618A HU261884A HU197939B HU 197939 B HU197939 B HU 197939B HU 842618 A HU842618 A HU 842618A HU 261884 A HU261884 A HU 261884A HU 197939 B HU197939 B HU 197939B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- leu
- arg
- gln
- ser
- ala
- Prior art date
Links
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 title description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims abstract 3
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims description 72
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 101800000736 Growth hormone-releasing factor Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 9
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 9
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 6
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- IVNJKQPHHPMONX-WCCKRBBISA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical group NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N IVNJKQPHHPMONX-WCCKRBBISA-N 0.000 description 2
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- OFYVKOXTTDCUIL-FXQIFTODSA-N Asp-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N OFYVKOXTTDCUIL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- IEESWNWYUOETOT-BVSLBCMMSA-N Trp-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O IEESWNWYUOETOT-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101710191093 A' protein Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- OFIYLHVAAJYRBC-HJWJTTGWSA-N Arg-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O OFIYLHVAAJYRBC-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N Arg-Met-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OMKZPCPZEFMBIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AASLOGQZZKZWKH-SRVKXCTJSA-N His-Cys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N AASLOGQZZKZWKH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101500024559 Homo sapiens Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N Ile-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N Lys-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PGLGNCVOWIORQE-SRVKXCTJSA-N Lys-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PGLGNCVOWIORQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ILZAUMFXKSIUEF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány a preproGRF-nek jelölt, a humán növekedési hormont felszabadító faktor (GRF) eredeti prekurzor peptidjére, a preproGRF-et meghatározó dezoxi-ribonukleinsavra és a preproGRF és a GRF rekombinációs dezoxi-ribonukleinsav technikával való előállítására vonatkozik.
Az emlős hipotalamuszban és a hipofízis elülső lebenyében több fontos hormon termelődik, ezek közül az egyik fontos hormon az emlős növekedését elősegítő növekedési hormon (GH). Bebizonyították, hogy a hipofízis által termelt növekedési hormon felszabadulása egy, a hipotalamuszban képződő peptid regulációja alatt áll. Egy idő óta ismeretes, ' hogy a hipotalamuszban képződő peptid, a szomatosztatin gátolja a növekedési hormon felszabadulását. Ugyanakkor, megalapozott eredmények mutatnak arra, hogy a hipotalamuszban képződő egyik anyag, amit GRF-nek vagy szomatokrininnek neveznek, a szomatosztatinnal ellentétes irányban hat, azaz elősegíti a növekedési hormon felszabadulását a hipofízisből.
Bár a GRF általában a hipotalamuszban. képződik, más sejtek is termelik, például a hasnyálmirigy tumorsejtek. Tény, hogy az első, teljes mértékben jellemzett GRF-aktivitással rendelkező peptidet egy humán hasnyálmirigy tumorból izolálták [Guillemin és munkatársai, Science, 218, 585—587 (1982)]. Valószínű, hogy a humán hasnyálmirigy GRF azonos a humán hipotalamusz GRF-jével, bár ez még nem bizonyított. Mindenesetre a pankreázból származó GRF igen aktívan elősegíti a növekedési hormon felszabadulását, és a humán szervezet növekedésének regulálása szempontjából igen előnyös lenne jelentős mennyiségű pankreázból származó humán GRF előállítása
A Guillemin és munkatársai által jellemzett GRF 44 aminosavból áll, karboxilcsoportot hordozó végén pedig amidálva van. Ugyancsak leírtak egy olyan GRF molekulát, amely csak 40 aminosavból áll, biológiailag aktívnak találtak ugyanakkor egy mindössze 27 aminosavból álló GRF fragmenst is, bár ez utóbbi kevésbé aktív, mint a 44 aminosavat tartalmazó peptid. A 44 aminosavból álló hasnyálmirigy eredetű GRF peptidet kémiailag szintetizálták, és ez a szintetikus GRF, a szintetikus GRF-fragmensek és szintetikus analógjaik potenciális szabályozó anyagokat reprezentálnak. Ugyanakkor ilyen hoszúságú peptidláncok kémiai szintézise igen költséges.
Az olcsó GRF előállításának legreményteljesebb módja valószínűleg az a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technika, amellyel a humán GRF dezoxi-ribonukleinsavat sejtbe juttatjuk, és ott kifejezzük. A GRF molekulát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav előállításának egyik módja az, hogy visszafelé olvasva meghatározzák a genetikai kódot, majd olyan oligo-dezoxi-nukleotidot szintetizálunk, amely leírja a GRF aminosav-szekvenciáját (lásd 4293652 sz. USA szabadalmi leírást). Ilyen 2 szintetikus géneket vagy dezoxi-ribonkuleinsavat leírtak. Ezen szintetikus gének bejuttatása sejtekbe mindeddig azonban nem eredményezett olyan transzformánsokat, amelyek jelentős mennyiségű GRF-et termelnek.
A génkifejeződés szempontjából jobb eredményeket kapunk a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiával, ha természetes forrásból izolált dezoxi-ribonukleinsavat használunk az aminosav-szekvenciából meghatározott nukleotid-szekvencia alapján szintetizált oligo-dezoxi-nukleotidok helyett. Ennek egyik oka az lehet, hogy — bár a genetikai kód redundáns (degenerált) abból a szempontból, hogy egyetlen aminosavat általában több kodon — három egymást követő nukleotid adott sorrendje — határozhat meg, a természetes nukleotid-szekvencia egy adott kodon szelekciója miatt előnyösebb. Továbbá gyakran megfigyelték, hogy a természetes gén nemcsak az izolált peptidet határozza meg, de leír olyan prekurzor molekulát, amely egy feltételezhető szignáljelet és más, meghatározó és kódoló szekvenciát is meghatároz, amelynek később az érett és aktív peptid termeléséhez szükséges lépések során módosulnak.
A találmány kivitelezése során izoláljuk a GRF molekulát meghatározó mRNS-t, és ezt felhasználjuk reakombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákat alkalmazva a GRF előállítására. Ahogy azt a későbbiekben részletesebben leírjuk, az izolált mRNS molekula olyan prekurzor GRF molekulát határoz meg, amely, tartalmazza a humán hasnyálmirigy eredetű GRF-teljes 44 aminosavból álló szekvenciáját, és hordozza a karboxil-terminális és amino-terminális szekvenciákat is.
Humán GRF molekulát termelő hasnyálmirigy tumorból előállított ribonukleinsavból kiindulva reverz transzkripcióval cDNS molekulát készítünk, és a GRF-et meghatározó cDNS kiónokat cDNS klónbankból azonosítjuk. A cDNS kiónok szekvenálásával bizonyítjuk, hogy ezek a humán GRF molekula két, szorosan rokon prekurzor molekuláját határozzák meg. Mindegyik GRF prekurzor tartalmazza a humán hasnyálmirigy GRF 44 aminosavból álló teljes szekvenciáját, és tartalmazza azt a szignáljelet is, amely szükséges a prekurzor GRF-vé alakulásához, tartalmazza a karboxil-terminális végen az amidált csoportot is. A cDNS klónokkal sejteket transzformálunk, és a transzformált sejtekből kimutatjuk a GRF prekurzorok közvetlen szintézisét. Ha a transzformált sejtekben jelen vannak az átalakító enzimek, a prekurzor GRF molekulává alakul.
A találmány szerint úgy járunk el, hogy — GRF-et tartalmazó humán hasnyálmirigy szövetből mRNS-t, majd ennek dúsításával poli-A+ mRNS-t izolálunk, — ebből komplementer DNS-t (cDNS) szintetizálunk, és a cDNS-eket valamely plazmidba beépítjük,
-2197939 — ezekkel a plazmidokkal E. coli sejteket transzformálunk, — a transzormánsok telepeit a GRF szekvenciának részletével komplementer hibridizációs vizsgáló mintával hibridizálva átvizsgáljuk, — a vizsgáló mintával hibridizálódó telepekből a plazmidot izoláljuk, ezeket a plazmidokat linearizáljuk, és a linearizált plazmidokat a fenti vizsgáló mintával újra átvizsgáljuk — a hibridizáló kiónokat kiválasztjuk, a hibridizáló kiónokból a kifejezett termékek aminosav -szekvencia -elemzése alapján a preproGRF aminosav-szekvenciáját magában foglaló kiónokat kiválasztjuk, — és kívánt esetben további kiónok kiválasztásához valamely ilyen kiónt vizsgáló mintaként felhasználva hibridizációs átvizsgáláshoz felhasználjuk, — és bármely, fentiekben nyert kiónból a DNS-t kinyerjük.
A találmány szerinti eljárás során a humán növekedési hormont felszabadító prepro hormon faktor izolálása érdekében előállítunk és szekvenálunk géneket, amelyek a humán has nyálmirigy növekedési hormon felszabadító faktor (hpGRF) két prekurzorát határozzák meg. A humán hasnyálmirigy hormont felszabadító faktor 44 aminosavból álló peptid, és hpGRF-44 jellel jelöljük. A hpGRF-44 biológiai, immunológiai és fiziko-kémiai evidenciák szerint azonos a humán hipotalamusz növekedési hormont felszabadító faktorral (hhGRF). A két cDNS egyike 107 aminosavból álló prekurzort ír le, ezt preproGRF-107 jellel jelöljük; a másik, 108 aminosavból álló prekurzort határoz meg, jele: preproGRF-108. A preproGRF molekulák mindegyike tartalmazza a hpGRF teljes aminosav-szekvenciáját, és tartalmaznak az amino-terminális és a karboxil-terminális végen peptid fragmenseket is. Mindegyik terminális peptid tartalmazza azokat az alapjeleket, amelyek szükségesek enzimes eltávolításukhoz. Az érett GRF karboxil-terminális végének amidálását a karboxil-terminális peptid glicin-arginin-szekvenciája szabályozza.
A hírvivő ribonukleinsav (mRNA·) humán hasnyálmirigy tumorból való izolálását végezzük el először. Ezek a sejtek igen magas humán, pankreatikus növekedési hormon felszabadító aktivitással rendelkeznek. Ezután reverz transzkripcióval előállítjuk az mRNS-ből a cDNS-t. A komplementer dezoxi-ribonukleinsavat (cDNS) olyan plazmidhoz kapcsoljuk, amely E. coli sejtekbe tarnszformálható, a transzformált sejteket egyenként tenyésztjük, így komplementer dezoxi-ribonukleinsavbankot kozunk létre. A cDNS bankból hibridizációs szűréssel kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek hpGRF-szekvenciát tartalmazó pepiidet meghatározó cDNS molekulával transzformálódtak. A hibridizációt a GRF aminosav-szekvencia egyes részeinek megfelelő oligo-dezoxi-nukleotidokkal végezzük. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavból kihasítjuk a hibridizációkor pozitív eredményeket adó kiónok cDNS részét, és szekvenáljuk; amiután bizonyítjuk, hogy az adott nukleotid-szekvencia megfelel a GRF aminosav-szekvenciájának, illetve egy nagyobb prekurzor protein részének. Ezt preproGRF jellel jelöljük. Az izolált komplementer dezoxi-ribonukleinsavak 3’- és 5’-végeiken nem-kódoló szegmenseket is hordoznak.
Az izolált komplementer dezoxi-ribonukleinsavak, ha megfelelően épülnek be a szabályozó dezoxi-ribonukleinsav-szegmensekbe, a transzformált sejtekbe a preproGRF szintézisét határozzák meg. A preproGRF molekulát hasító enzimeket tartalmazó transzformált sejtekből preproGRF molekulát tartalmazó polipeptideket izolálunk és tisztítunk. A preproGRF molekulát hasítani képes enzimekkel rendelkező sejteket az idegen preproGRF komplementer dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó hibrid génekkel transzformálva GRF-et állítunk elő. A következőkben részletesen leírjuk a találmány szerinti eljárást.
A preproGRF molekulát meghatározó mRNS-t izoláljuk, majd szekvenáljuk. Az izolálást hasnyálmirigy tumorból kiindulva kezdjük [lásd Guillemin és munkatársai, mint fent] amelyek magas belső hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító aktivitással rendelkeznek.
g folyékony nitrogénben vagy —80°C hőmérsékleten ellátott tumorból 3 pg poli-A+-ribonukleinsavat izolálunk Chirgwin és munkatársai guanidin-tiocianátos módszerével [Biochemistry, 18, 5294—5295 (1979)], valamint Norgard és munkatársai szerint végzett oligo-dT-cellulózos kromatográfiával [J. Bio’. Chem., 225, 7665—7672 (1980)]. 3 pg poli-A+-ribonukleinsavból 1 pg kétszálú komplementer dezoxi-ribonukleinsavat szintetizálunk Gubler és munkatársai módosított módszerével (Proc. Natl. Sci. USA 1983, 80(14) 4311 —14), amit Okayama és munkatársai írtak le alapjaiban [Mól. Cell. Biok, 2, 161 —170 (1982)].
A komplementer dezoxi-ribonukleinsavval komplementer dezoxi-ribonukleinsav-bán kot állítunk elő. Peacock és munkatársai módszerének [B. B. A., 655, 243—250 (1981)] módosított változatát használjuk. A cDNS molekulát poli-dGTP-vel kapcsoljuk, és poli-dCTP-vel kapcsolt EcoRV restrikciós enzimmel hasított pBR322 plazmidhoz kötjük. A kimer plazmiddal ezután E. coli RR1 sejteket transzformálunk, és a transzformánsokat szilárd halmazállapotú táptalajon szélesztjük ki. így 300000 független transzformánst kapunk.
A telepeket ezután vizsgáljuk annak érdekében, hogy kiválaszthassuk azokat, amelyek olyan cDNS-t tartalmaznak, amely a hpGRF-szekvenciát meghatározó génfrakciók előre meghatározott nukleotid-szekvenciájának megfelelő nukleotid-szakaszokat tartalmaznak. Olyan oligo-dezoxi-nukleotidokat szintetizá3
-3197939 lünk, amelyek előreláthatóan komplementerek a természetes GRF gén egy szegmensével, majd ezeket az oligo-dezoxi-nukleotidokat használjuk fel a telepek kiválasztása érdekében végzett hibridizációkor próbaként. Két kevert nukleotid próbát szintetizálunk Miyoshy és munkatársai szerint [Nucleic Acids Rés., 8, 5507—5517 (1980)], ezt a szilárd fázisban foszfo-triészteres módszerrel kapott terméket
5’-végein P32-ATP-vel jelezzük Maxam és munkatársai szerint [Methods in Enzymology, Grossman és munkatársai szerkesztésében,
65. kötet, 499—560. oldal, Academic Pess, New
York (1980)]. Az egyik kevert oligo-dezoxi-nukleotid-próbát A-jellel jelöljük, ez 20 bázis hosszúságú, és megfelel a hpGRF-szekvencia alábbi 1—7. aminosavának:
H-Tyr-Ala-Asp
Ala-Ile7
Phe-Thr
5’-ATG CGN CTG/A CGN TAT/G/A AAA TG-3
A másik, 14 bázis hosszúságú próbát B-jellel jelöljük, ez megfelel a hGRF 35—39. aminosavának:
39
Asn- Gin- Glu- Arg- Gly
5’-TTA/G GTT/C CTT/C GCN vagy TCT/C CC-3’.
(A fentiekben N a négy nukleotid bármelyikét jelentheti).
A B-jelű tetradekamer-próbát a telepek 30 vizsgálatakor Hanahan és 'munkatársai szerint használjuk [Gene, 10, 63—67 (1978)]. A hibridizációt az alábbi összetételű pufferben végezzük: „
0,75 mól nátrium-klorid,
0,075 mól nátrium-cifrát,
0,1 százalék nátrium-dodecil-szulfát,
100 pg/ml részlegesen hidrolizált élesztő ribonukleinsav, 4Q
0,2 százalék borjú szérum albumin,
0,2 százalék polivinil-pirrolidon és
0,2 százalék Ficoll.
A reakciót 30°C hőmérsékleten végezzük 2 órán át, 1 pmól jelzett próbát használunk milliliterenként. A szűrőket az alábbi összetéte- 45 lü mosófolyadékban gyorsan kiöblítjük:
0,3 mól nátrium-klorid,
0,03 mól nátrium-cifrát.
A mosást szobahőmérsékleten végezzük. Ezután a mosást nagyobb ionkoncentrációjú oldattal ismételjük meg, ennek összetétele:
0,6 mól nátrium-klorid,
0,06 mól nátrium-citrát.
A mosást 60 percen át végezzük 40°C hőmérsékleten, majd a szűrőket X-sugárzásra érzékeny filmre helyezzük egy éjszakán át. 11 000 cDNS klón B-próbával való vizsgálata során kiderült, hogy a kiónok közül kilenc beépített dezoxi-ribonukleinsav fragmense hibridizálódik a B-próbához. A kilenc rekombináns közül hét dezoxi-ribonukleinsava a Southern-analízis szerint hibridizálódik az A-próbához is.
Az A- és B-próbához egyaránt hibridizálódó plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó teranszformánsokból izoláljuk a plazmidot, és HindlII enzimmel linearizáljuk, majd Smith láncterminációs módszerével részlegesen szekvenáljuk [Methods of Enzymology, 65, 560—580. oldal], Primerként a B-próbát használjuk, fgy négy kiónt azonosítunk, ezek hpGRF szekvenciákat határoznak meg, közülük a 21. számmal jelzett tartalmazza a legnagyobb cDNS beépült szakaszt, ennek hossza 520 bázispár.
A 21. számmal jelzett klón beépített cDNS részét Maxam és munkatársai (lásd fent) módszerével teljesen szekvenáljuk, és az eredményt az alábbi táblázaton mutatjuk be.
-4197939
δ.klón: TGGGAAGGCCAGGCGGCTGCCAGAGCAAACACCCAGCCCAGGGCCCCTGGATTTGAGCAGTGCCT 21.klón: AGGGCCCCTGGATTTGAGCAGTGCCT
100
CGGAGCAGAGGGATATCTGCCGCATCAGGTGCCACCCCGGGTGAAGG 'CGGAGCAGAGGGATATCTGCCGCATCAGGTGCCACCCCGGGTGAAGG preproGRF-108 preproGRF-107 150
| TTC | TTT | GTG | ATC | CTC | ACC | CTC | AGC | AAC | AGG | TCC |
| TTC | TTT | GTG | ATC | CTC | ACC | CTC | AGC | AAC | AGC | TCC |
| Phe | Phe | Val | Ile | Leu | Thr | Léu | Ser Asn | Ser | Ser | |
| Phe | Phe | Val | Ile 1 0 | Leu | Thr | Leu | Ser | Asn | Ser | |
| 200 | ||||||||||
| TTG | ACC | CTC | AGG | ATG | CGG | CGG | TAT | GGA | GAT | GGC |
| TTG | ACC | CTC | AGG | ATG | CGG | CGG | TAT | GCA | GAT | GCC |
| Leu | Thr | Leu | Arg | Met | 'Arg | Arg | Tyr | Alá | Asp | Alá |
| Leu | Thr | Leu | Arg | Met | Arg | Arg | Tyr | Alá | Asp | Alá |
| 30 | ||||||||||
| 250 | ||||||||||
| AAG | GTG | CTG | GCC | CAG | CTG | TCC | GCC | CGC | AAG | CTG |
| AAG | GTG | CTG | GGC | GAG | GTG | TCC | GCC | CGC | AAG | CTG |
| Lys | Val | Leu | Gly | Gin | Lep | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu |
| Lys | Val | Leu | Gly | Gin | Leu | Ser | Alá | Arg | Lys | Leu |
| 50 | ||||||||||
| 300 | ||||||||||
| CAG | CAG | GGA | CAG | AGC | AAC | CAA | GAG | CGA | GGA | GCA |
| CAG | CAG | CGA | GAG | AGG | AAC | CAA | GAG | CGA | GGA | GCA |
| Gin | Gin | Gly | Glu | Ser | Asn | Gin | Glu | Arg | Gi y | Alá |
| Gin | Gin | Gly | Glu | Ser | Asn | Gin | Glu | Arg | Gly | Alá |
| 350 | ||||||||||
| GTA | GAC | AGC | ATG | TGG | GCA | GAA | CAA | AAC | GAA | ATG |
| GTA | GAC | AGC | ATG | TGG | GCA | GAA | CAA | AAC | CAA | ATG |
| Val | Asp | Ser | Met | Trp | Alá | Glu | Gin | Lys | Gin | Met |
| Val | Asp | Ser | Met | Trp | Alá | Glu | Gin | Lys | Gin | Met |
| 80 | ||||||||||
| GCC | CTG | CTG | CAG | AAG | CAC | AGC | AGG | AAC | TCC | CAG |
| GCC | CTG | CTG | CAG | AAG | CAC- | AGG | AAC | TCC | CAG | |
| Alá | Leu | Leu | Gin | Lys | His | Ser | Arg | Asr | Ser | Gin |
| Alá | Leu | Leu | Gin | Lys | His | 1 | Arg | Asr | Ser | Gl n |
| 100 | ||||||||||
| 500 |
ATG
ATG
Met
Met
CAC TGC CAC TGC His Cys His Cys
CCA CTC CCA CTC Pro Leu Pro Leu
TCC CCA TCC CCA Ser Pro Ser Pro 20
TGG GTG TTC TGG GTG TTC Trp Val Phe Trp Val Phe
CCT CCC CCT CCT CCC CCT Pro Pro Pro Pro Pro Pro
ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG ATC TTC AGC AAC AGC TAC CGG
Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG let Ser Arg
Gly
C-ly
| Gly | Arg |
| Gly | Arg |
| *· | |
| ATC | CTG |
| ATC | CTG |
| Ile | Leu |
| Ile | Leu |
| 450 |
Gin
Gin
400 ctacctgtagccaaaatggaactggatccagttaatcctctcaittctgacccactttttcctttgaaaat
CTACCTGTAGCCAAAATGCAACTGGATCCAGTTAATCCTGTCATTTGTGACCCACTTTTTCCTTTGAAAAT
550 570
ACAATAAAATTCCCCCATÁCCGGTGTGCATTTAAATGTTAA.AAAAAAAAAAAAAA ACAATAAAATTCCCCCATACCGGTGTGGATTTAAA | AAAAAAAAAAAAAAAA
A 21. jellel jelzett klón nukleotid-szekvenciája szerint ez olyan polipeptidet ír le, amely tartalmazza a hpGRF-44 teljes aminosav-szekvencláját, amit előzőleg protein mikroszekvenálással határoztuk meg. A hpGRF molekula leolvadási sémájában az iniciáló és termináló kodonok a hpGRF-44 kódoló szekvenciájától balra, illetve jobbra, a 31. és 32. kodonoknál helyzekednek el. így ez a cDNS olyan preproGRF molekulát ír le, amely 107 aminosav hosszúságú, és rendelkezik a prepro hormon tipikus jellemzőivel [Steiner és munkatársai, Annals of New York Acad. of Sci., 243, 1 —16 (1980)].
Annak bizonyítására, hogy a cDNS fragmens szekvenálása után dedukcióval meghatározott preproGRF aminosav-szekvencia valóban megfelel az adott génterméknek, és nem a reverz transzkripció során keletkezett hibás termék, felhasználtuk a hasnyálmirigy tumorsejtekből kapott hírvivő ribonukleinsavat transzlációs termékek előállítására. A transzlációs termék molekulatömegét összehasonlítjuk az előre meghatározott preproGRF termék molekulatömegével. A hpGRF-44 mRNS transzlációját sejtmentes patkány retikulocita-rendszerben végezzük.
A terméket specifikus antitestekkel immuncsapadékot képezve kicsapjuk. Az antitesteket szintetikus GRF termékkel állítjuk elő, és poliakril-amid gélen nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében elektroforézissel különítjük el. A legnagyobb transzlációs termék dublettként mozdul el, molekulatömege 13 000, ami jól egyezik a 21. számmal jelzett klón nukleotid-szekvenciájából dedukcióval megállapított preproGRF-107 molekulatömegével (12 361). Egy kisebb transzlációs termék szintén kettős termékként mozdul el (molekulasúlya 8 000), és a nagyobb termékhez hasonlóan, reagál a GRF specifikus antitestekkel. A kisebb molekulatömegü termék egy éretlen transzlációs termináció során jöhet létre, vagy a nagyobb peptid hasítási terméke. A kettős csík megjelenésének oka ismeretlen. A fenti eredmények jelzik, hogy a nukleotid-szekvencia pontos, és és a 21. jellel jelzett klón cDNS fragmense tartalmazza a preproGRF-44 teljes kódoló szakaszát.
Mivel bizonyítottuk, hogy a 21. jellel jelzett klón tartalmazza a preproGRF-44 teljes kódoló szekvenciáját, lehetségessé válik a rekombináns szegmens felhasználása abból a célból, hogy lokalizáljuk a hpGRF-44 mRNS-t a poli-A -RNS-ből. A 21. jellel jelzett kiónból izolált jelzett plazmidot használva hibridizációs próbaként a Northern analízis során, a poli-A+-ríbonukleinsavbóI, olyan csíkot izolálunk, amely megfelel 820 nukleotidból álló mRNS'nek. Mivel a 21. rekombináns tartalmazza a teljes 3’-nem kódoló szakaszt és a poli-A+-részt, úgy tűnik, hogy a kiónba transzformáit, 520 bázispárból álló cDNA-szegmens nem tartalmazza a preproGRF molekulának megfelelő dezoxi-ribonukleinsav teljes 5’-nem kódoló szakászát.
Ii
A 21. számmal jelzett klón tartalmazza beépült dezoxi-ribonukleinsav szegmensében a teljes GRF-44 kódoló szakaszt, a klónból kapott cDNS így hosszabb, és specifikusabb hibridizációs próbaként használható fel hasonló dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket tartalmazó kiónok izolálására. Az eredeti cDNS bankot ezért újra megvizsgáltuk egy olyan próbával, amely a 21. számmal jelzett klón cDNS beépült szakaszának 5’-végéről származik (lásd az előzőekben ismertetett táblázatban a 82—149. nukleotidokat).
Az egyik klón, a 8. számmal jelzett, olyan beépült dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst tartalmaz, amely 5’-végén 40 nukleotiddal hoszszabb, tartalmaz továbbá egy trinukleotidot a kódoló szakaszban, és egy további tetranukleotidot a 3’-nem kódoló szakaszban. Ahogy azt a táblázatból kiderítjük, a trinukleotid egy további szerint ír le (103), a 108 aminosavból álló pepiidben, a preproGRF-108-ban. Az analizált további négy klón közül három a preproGRF-108-at meghatározó nukleotid-szek1 venciát tartalmaz, egy pedig a preproGRF- 107-et leíró szekvenciát hordoz. Ez azt jelenti, hogy legalább két különböző hpGRF mRNS van jelen.
Jelzésekkel rendelkezünk arra vonatkozóan, hogy a 8. jellel jelzett kiónban levő dezoxi- ribonukleinsav-szegmens gyakorlatilag a teljes preproGRF cDNS, ez gyakorlatilag az öszszes GRF-44 mRNS molekulát reprezentálja. További jelzéseink vannak arra vonatkozóan, hogy a hpGRP hírvivő ribonukleinsavának egy kis része 80 nukleotiddal hosszabb.
A preproGRF-107 és 108 molekulákat leíró két cDNS primer szerkezetét meghatározva szerkezetére vonatkozóan bizonyos megfigyeléseket tettünk. A preproGRF-107 és a preproGRF-108 első 20 aminosava (a táblázatban aláhúztuk), valószínűleg a hidrofób szignál pepiidet reprezentálja, amely a proGRF-hez kapcsolódik, és 87—88 aminosav hosszúságú. A proGRF-87 és a proGRF-88 hasítási helyeket tartalmaz ( a táblázatban ezeket a helyeket bekereteztük), az enzimes hasítás után létrejön a hpGRF-44. Az amino-terminális vég előtt helyzekedik el két arginin (30—31), míg a karboxil-terminális vég után közvetlenül elhelyezkedő arginin (77) jelenti a másik hasítási helyet. A hpGRF-44 karboxil-terminális leucinját követő glicin -arginin -szekvencia (76—77) jelenti azt a helyet, ahol az érett termék amidálása bekövetkezik.
A cDNS bank kiónjai közül a hibridizációs kísérletben pozitív eredményt adókból izolált cDNS-szegmensek felhasználhatók a GRF kifejezésére mind eukarióta, mind pedig prokaríóta sejtekben. A 21. és 8. számmal jelzett klónokból kapott plazmid DNS-t használjuk. A plazmidot HindlII endonukleázzal hasítjuk a beépült cDNS fragmens 5’-végének felnyitására. A preproGRF szekvenciának 5’-része Bal31 exonukleázzal hasítható olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmens sorozatok előállítására, ame-6197939 lyek különböző hosszúságú amino-terminális szekvenciát tartalmaznak, és amelyek felhasználhatók egy sor expressziós (kifejeződő) vektorhoz. Így például a gtll vagy pCQV2 használatához el kell távolítanunk a preproGRF iniciációs kodonjának teljes 5’-szekvenciáját. Ezután kémiailag szintetizált oligo-nukleotidokat kapcsolunk az emésztett dezoxi-ribonukleinsav-szegmens 5’-végéhez, amit a vektorok specifikációja szerint végzünk annak érdekében, hogy optimalizáljuk vagy egy hibrid, vagy egy fúziós géntermék termelését a tiszta preproGRF, proGRF vagy GRF fehérjék kifejezésének maximális szintjére. Az emésztett dezoxi-ribonukleinsav-szegmens reklónozása után linkereket kapcsolhatunk a 3’-véghez, és az így végtermékként kapott fragmenseket megfelelő endonukleázokkal emészthetjük, és izolálhatjuk a nagyobb plazmid dezoxi-ribonukleinsav elegyből poliakril-amid vagy agaróz-gélen végzett elektroforézissel. A hasított cDNS szegmensek mindegyike beépíthető a megfelelő kifejeződő vektor restrikciós helyére. Ilyenek például a következők: gtll [Young és Davis, PNA. Sci., 80, 1194— 1198), pCQV2 [Queen, J. Mól. and Appl. Genetics, 2, 1 —10 (1980)], pMB9-származék vektorok [Roberts és munkatársai, PNA. Sci., 76, 760—764 (1979)] vagy pBR322-ből származó vektorok [Jay és munkatársai, PNA. Sci., 785543—5548 (1981)] Arekombinánsexpresz-sziós vektorokat E. coli RRI sejtekbe juttatjuk Peacock és munkatársai (lásd fent) szerint eljárva. A preproGRF-rokon cDNS-szegmenseket tartalmazó baktérium-telepeket dezoxi-ribonukleinsav hibridizációval szelektáljuk, a hibridizációt a B-próbával végezzük, de végezhetünk antitestekkel kivitelezett szűrést is {Young és Davis, lásd előbb]. A preproGRF géneket tartalmazó hibridizációs vizsgálatkor pozitív eredményt adó telepek közül 50-et kiválasztunk és tenyésztünk, A cDNS-vektor pontos szerkezetét restrikciós enzimmel kivitelezett analízissel határozzuk meg.
Az E. coli-ban lévő bakteriális expressziós vektorok által meghatározott preproGRF-rokon peptidek termelését az egyes baktériumokban oly módon vizsgáljuk, hogy'radioimmun-méréssel megmérjük a sejtekben levő GRF fehérje-szekvenciákat. Sejtlizátumot állítunk elő, a fehérjéket polivinil-klorid mikrotiter lyukakba helyezzük, GRF-specifikus antitesttel kezeljük, és az antitest-antigén komplexet 1125 jelzett A’-proteinnel mennyiségileg mérjük Kohierés munkatársai szerint [Hybridoma Techniques, Cold Sprtng Harbor Láb., Cold Spring Harbor, N. Y. (1980)]. Hét preproGRF -107 izolátum és tizenkét preproGRF-108 izolátum és tizenkét preproGRF-108 izolátum közül néhány lizátumában kimutattuk a GRF peptid-szekvenciát, ez jelzi, hogy a cDNS-molekulák kifejezik ezekben a sejtekben a genetikai információt, és protein jön létre.
Egy preproGRF-107 génnel transzformált E. coli törzs jelentős mennyiségű pepiidet ter12 mel, amely reagál a megfelelő specifikus antitesttel. Ezt további tenyésztésre elkülönítjük. Ugyanezt tesszük egy preproGRF-108-rokon génnel teranszformált E. coli törzzsel is. A törzsek tenyészetéből lizátumot állítunk elő, és mindegyik lizátumot kromatográfiával és ezt követően polialkil-amid gél-elektroforézíssel frakcionáijuk. A kromatográfia után kapott protein-tartalmú frakciók közül azokat, amelyek 12 000 és 13 000 közötti molekulatömegű fehérjét tartalmaznak, affinitás-kromatográfiával tisztítunk Sepharose-oszlopot használva. A gyantát anti-GRF antitestekkel kapcsoltuk. Végezhetjük a tisztítást ioncserés kromatográfiával is, vagy bármely más, általánosan ismert módszerrel. Végül a tisztítást nagynyomású folyadékkromatográíiával fejezhetjük be (Guillemin és munkatársai, lásd előbb).
Az egyes frakciókban levő preproGRF mennyiségét radioimmun-méréssel határozzuk meg, ennek során először különböző hígításokban inkubáljuk a frakciókat GRF-reaktív antiszérummal, és ezután I125-jelzett GRF-44 termékkel kezeljük. A különböző hígításokban levő preproGRF koncentrációkat úgy számoljuk ki, hogy összehasonlítjuk az antitesthez kötődő és nem kötődő jelzett GRF koncentrációkat kontrolokból származó standard görbékkel. A kontrolokban a GRF antiszérumot ismert koncentrációjú, nem jelzett GRF termékkel kezeljük, és ezután a kezelést ismert koncentrációjú jelzett GRF termékkel ismételjük meg. Az eredmények szerint a tisztított frakciók mindegyike preproGRF terméket tartalmaz, a koncentráció teljes protein-tartalomra számítva 75—80 százalék.
Bár a nem hasított preproGRF két alakja és a hibrid proteinek sem tartalmaznak bakteriális eredetű szekvenciákat, továbbá a GRF szekvenciák GRF-aktivitással rendelkeznek, ezek az anyagok mégsem értékes vegyületek. Egyébként, ha a prekurzor molekulákat állatoknak adagoljuk, úgy ezek in vivő GRF molekulákká hasadnak. Mindenesetre a preproGRF terméket in vitro hasítanunk kell úgy, hogy a preproGRF molekulákat humán hipotalamusz-kivonattal kezeljük, a kivonat hasító enzimeket tartalmaz. Valószínű, hogy található olyan nem humán eredetű hipoíalamusz-kivonat, amely hasítja a humán preproGRF molekulákat és a GRF keletkezik. Mind in vivő, mind in vitro végzett enzimatikus preproGRF hasításkor a GRF-44 karboxil-terminális csoportja amidálódik. Ez megkülönböztető előnye a természetes génnek a kizárólag GRF aminosav-szekvenciát meghatározó szintetikus oligo-dezoxi-nukleotiddal szemben, ez utóbbi ugyanis nem tartalmazza a preproGRF-ben levő hasítható szekvenciákat. A hasítás végezhető részlegesen tisztított frakciókkal is, ezeket azután a fentiek szerint tisztíthatjuk tovább. Abban az esetben, ha a bakteriális kifejeződéskor az amino-terminális végen bakteriális szekvenciákat tartalmazó hibrid protein termék jön létre, úgy egy reagenssel, például cián7
-7197939
-bromiddal kivitelezett parciális hidrolízist kell végeznünk a preproGRF felszabadítására, és csak ez után végezünk in vitro hasítást a szövet-kivonatokkal.
A baktériumokban való kifejezésre alkalmas preproGRF gén-fragmensek kifejezhetők eukarióta rendszerekben is, élesztőkben vagy emlős sejtekben. Élesztősejtek esetén az emlős interferonok szekretálódnak és hasadnak, ha a kifejezést élesztő-vektorral, az ΥΕρ,ΡΤ vektorral érjük el [Hitzeman és munkatársai, Science, 219, 620—625 (1983)]. A preproGRF hasonlóképpen előállítható és szekretálható, a szekretálódás könnyebbé teszi a tisztítást. Az izolált preproGRF ezután a fentiek szerint eljárva in vitro hasítható. A preproGRF terméket meghatározó cDNS-szegmenseket bejut' tathatjuk humán hipotalamusz sejtekbe vagy patkány hipofízis sejtvonalakba, ahol a jelenlevő enzimek képesek a preproGRF-107 és a prepro!08 hasítására. A cDNS klónozható olyan expressziós vektorokba, mint például a pSV2 vektorok, amelyek S V40-ből származnak [Mulligan és Berg, Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman szerkesztése, Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring Harbor, New York]. Klónozható a cDNS a legújabb retrovírus vektorokba is [Mulligan, Science, 209, 1422—1427 (1980)].
A cDNS bejuttatható a hipotalamusz sejtekbe m i kroin jekció va 1, dezoxi-ribonukleinsav-transzfekcióval vagy vírusfertőzéssel. A bejuttatott cDNS-t stabilan beépített sejteket szelekciós protokollal szelektálhatjuk, a szelekciót végezhetjük a vektor redszer által biztosított két domináns markerrel, a gpt vagy neo gének segítségével. A sejtvonalak által termelt GRF megfelelő antitestekkel az előzőekben megadottak szerint mérhető. Több sejtnek több GRF-et kell termelnie, mint a nem-transzformált sejteknek. így az izolált preproGRF cDNS alkalmas eukarióta sejtek transzformálására, és a kifejezett termék — legalábbis egyes esetekben — GRF termékké hasad a gazdasejt normális működése révén.
Bár a találmány szerinti eljárást bizonyos előnyös kivitelezési módok alapján ismertettük, a témában jártas szakemberek számára nyilvánvaló módosítások végezhetők anélkül azonban, hogy kilépnénk a találmány oltalmi köréből. Érthető például, hogy az itt leírt preproGRF cDNS molekulák a természetben előforduló gén-szegmensek közül csak kettőnek a teljes szerkezetét reprezentálják. Nyilvánvaló, hogy kissé módosult allélek találhatók, amelyek hasonlóan működő proteineket határoznak meg. Ezeket a génszegmenseket és proteineket a találmány oltalmi köréhez tartozónak vesszük. Ugyancsak ismeretes, hogy a proteinek kissé módosított homológjai szintetizálhatok, és számtalan ilyen módosított homológ preproGRF-aktivitással rendelkezik. Ezek szintén a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Ekvivalens kodonokkal rendelkező dezoxi-ribonukleinsav ugyancsak a találmány oltalmi köréhez tartozik, mint ahogy pre8 proGRF-aktivitással rendelkező peptideket leíró szintetikus génszegmensek is.
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás humán hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító faktor (hrGRF) prekurzort kódoló DNS — amely tartalmazza a teljes hpGRF peptid-szekvenciát, tartalmaz egy, az adott hpGRF peptid amino-terminális végéhez kapcsolódó peptid-szegmenst, és egy, az adott hpGRF peptid karboxil-terminális végéhez kapcsolódó peptid-szegmenst kódoló nukleotid-szekvenciát, ahol a fenti terminális szegmensek tartalmaznak egy adott hpGRF peptidről enzimes lehasadásukat és a hpGRF karboxil-terminális végének enzimes amidálását irányító szignál-szegmenseket — előállítására, azzal jellemezve, hogy — GRF-et tartalmazó humán hasnyálmirigy szövetből mRNS-t, majd ennek dúsításával poli-A+ mRNS-t izolálunk, — ebből komplementer DNS-t (cDNS) szintetizálunk, és a cDNS-eket valamely plazmidba beépítjük, — ezekkel a plazmidokkal E. coli sejteket transzformálunk, — a transzformánsok telepeit a GRF szekvenciának részletével komplementer hibridizációs vizsgáló mintával hibridizálva átvizsgáljuk, — a vizsgáló mintával hibridizáló telepekből plazmidot izoláljuk, ezeket a plazmidokat linearizáljuk, és a linearizált plazmidokat a fenti vizsgáló mintával újra átvizsgáljuk, — a hibridizáló kiónokat kiválasztjuk, a hibridizáló klónokból a kifejezett termékek aminosav-szekvencia-elemzése alapján a preproGRF aminosav-szekvenciáját magában foglaló kiónokat kiválasztjuk, — és kívánt esetben további kiónok kiválasztásához valamely ilyen kiónt vizsgáló mintaként felhasználva hibridizációs átvizsgáláshoz felhasználjuk, — és bármely, fentiekben nyert kiónból a DNS-t kinyerjük.
- 2. Az I. igénypont szerinti eljárás Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-ArgGly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg aminosav-szekvenciát kódoló DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott DNS-t tartalmazó hibridizáló kiónt választjuk ki.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-IleLeu-Thr-Leu-SeT-Asn-Ser-Ser-His-Cys-SerPro -Pro -Pro -Pro -Leu -Thr -Leu -Arg -Met Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Qln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-IJe-Met-SerArg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-ArgGly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg-GIn-ValAsp-Ser-Met-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Met-8197939-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-R-Arg-Asn-Ser-Gin-Gly aminosav-szekvenciát — ahol R jelentése Ser vagy kémiai kötés — kódoló DNS előállítására azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott DNS-t tartalmazó hibridizáló kiónt választjuk ki.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárásCGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT bázis frekvenciájú DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott DNS-t tartalmazó hibridizáló klórit választjuk ki.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárásATG CCA CTC TGG GTG TTC TTC TTT GTG ATC CTC ACC CTC AGC AAC AGC TCC CAC TGC TCC CCA CCT CCC CCT TTG ACC CTC AGG ATG CGGCCGTATGCACATGCCATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA CAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT CAG GTA GAC AGC ATG TGG GCA GAA CAA AAG CAA ATG GAA TTG GAG AGC ATC CTG GTG GCC CTG CTG CAG AAG CAC NNN AGG AAC TCC CAG GGA —ahol NNN jelentése AGC vagy kémiai kötés — bázis szekvenciájú DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott DNS-t tartalmazó hibridizáló kiónt választjuk ki.
- 6. Eljárás humán hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító faktor (hpGRF) prekurzort kódoló DNS-t tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti előállított, megfelelően hasított DNS-t valamely megfelelően hasított kifejező vektorral ligálunk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított DNS-t ligáljuk.
- 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint előállított DNS-t ligáljuk.
- 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított DNS-t ligáljuk.
- 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerint előállított DNS-t ligáljuk.
- 11. Eljárás humán hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító faktor (hpGRF) prekurzort kifejezni képes baktérium, élesztő vagy állati sejt transzformánsok előállítására,5 azzal jellemezve, hogy valamely 6. igénypont szel int előállított vektorral valamely baktériumot, élesztőt vagy állati sejtet transzformálunk.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal10 jellemezve, hogy valamely 7. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
- 13. A ll. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
- 15 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerint elő20 állított vektorral transzformálunk.
- 16. Eljárás humán hasnyálmirigy növekedési hormont felszabadító faktor- (hpGRF) prekurzor peptid és enzimesen hasított, hpGRF aktivitású fragmenseinek előállítására, azzal25 jellemezve, hogy valamely 11. igénypont szerinti transzformánst megfelelő tápközegben tenyésztünk, és a keletkezett hpGRF prekurzort és/vagy gazdasejt enzimaktivitása révén hasított hpGRF aktivitású fragmenseit a tápközeg30 bő! kinyerjük.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás Arg-Arg-Tyr-Ala-Asp-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-A-g-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-IIe-Met-Ser-Arg35 -Gin-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg aminosav-frekvenciájú peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 12. igénypont szerint előállított transzformánst tenyésztünk.
- 18. A 16. igénypont szerinti eljárás Met-Pro-Leu-Trp-Val-Phe-Phe-Phe-Val-Ile-Leu-Thr-Leu-Ser-Asn-Ser-Ser-His-Cys-SerPro-Pro-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Arg-Met-Arg4g -Arg-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp50 -Ser-Met-Trp-Ala-Glu-Gln-Lys-Gln-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-Lys-His-R-Arg-Asn-Ser-Gin-Gly aminosav-szekvenciájú peptid előállítására, ahol R jelentése Ser vagy kémiai kötés, azzal55 jeilemezve, hogy valamely 12. igénypont szerint előállított transzformánst tenyésztünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51093583A | 1983-07-05 | 1983-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT35009A HUT35009A (en) | 1985-05-28 |
| HU197939B true HU197939B (en) | 1989-06-28 |
Family
ID=24032800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU842618A HU197939B (en) | 1983-07-05 | 1984-07-04 | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0134085A1 (hu) |
| JP (1) | JP2506322B2 (hu) |
| KR (1) | KR850001281A (hu) |
| AU (1) | AU571542B2 (hu) |
| CA (1) | CA1299119C (hu) |
| DK (1) | DK313784A (hu) |
| ES (1) | ES8506092A1 (hu) |
| FI (1) | FI81378C (hu) |
| GR (1) | GR82239B (hu) |
| HU (1) | HU197939B (hu) |
| IL (1) | IL72299A (hu) |
| MX (1) | MX167047B (hu) |
| NO (1) | NO842682L (hu) |
| NZ (1) | NZ208633A (hu) |
| PH (1) | PH22584A (hu) |
| PT (1) | PT78833B (hu) |
| ZA (1) | ZA844380B (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3327007A1 (de) * | 1983-07-27 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus |
| NZ213759A (en) * | 1984-10-19 | 1989-01-27 | Genentech Inc | Lhrh-ctp protein conjugates influencing prolactin fsh and lh release |
| US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
| JPS63123386A (ja) * | 1986-11-14 | 1988-05-27 | Japan Tobacco Inc | 植物ウイルス阻害物質の製造方法 |
| CS111292A3 (en) * | 1991-04-19 | 1992-11-18 | Lilly Co Eli | Dna compound encoding factor releasing growth-hormone of cattle and apharmaceutical composition containing said compound |
| US5512459A (en) * | 1993-07-20 | 1996-04-30 | Bionebraska, Inc. | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides |
| WO1999005300A2 (en) * | 1997-07-24 | 1999-02-04 | Valentis, Inc. | Ghrh expression system and methods of use |
| DE602005027661D1 (de) * | 2004-01-20 | 2011-06-09 | VGX Pharmaceuticals LLC | Isetzendem hormon (ghrh) aus muskelzellen durch speziesspezifisches signalpeptid |
| KR102461139B1 (ko) * | 2020-01-22 | 2022-11-01 | 태경에코 주식회사 | 대기오염물질의 배출저감 연탄 및 그의 제조방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| EP0108387B1 (en) * | 1982-11-04 | 1990-05-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Preparation of recombinant growth releasing factors |
-
1984
- 1984-06-08 ZA ZA844380A patent/ZA844380B/xx unknown
- 1984-06-21 AU AU29733/84A patent/AU571542B2/en not_active Ceased
- 1984-06-22 NZ NZ208633A patent/NZ208633A/en unknown
- 1984-06-22 CA CA000457226A patent/CA1299119C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-06-27 DK DK313784A patent/DK313784A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-07-02 FI FI842664A patent/FI81378C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-07-02 PT PT78833A patent/PT78833B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 PH PH30909A patent/PH22584A/en unknown
- 1984-07-03 GR GR75175A patent/GR82239B/el unknown
- 1984-07-03 NO NO842682A patent/NO842682L/no unknown
- 1984-07-04 ES ES534002A patent/ES8506092A1/es not_active Expired
- 1984-07-04 EP EP84304581A patent/EP0134085A1/en not_active Withdrawn
- 1984-07-04 HU HU842618A patent/HU197939B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-07-04 KR KR1019840003859A patent/KR850001281A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-07-04 IL IL72299A patent/IL72299A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-05 JP JP59139738A patent/JP2506322B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-05 MX MX026446A patent/MX167047B/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0134085A1 (en) | 1985-03-13 |
| NO842682L (no) | 1985-01-07 |
| PT78833B (en) | 1986-06-02 |
| JPS6037990A (ja) | 1985-02-27 |
| GR82239B (hu) | 1984-12-13 |
| FI842664A (fi) | 1985-01-06 |
| FI842664A0 (fi) | 1984-07-02 |
| FI81378C (fi) | 1990-10-10 |
| PH22584A (en) | 1988-10-17 |
| AU2973384A (en) | 1985-01-10 |
| AU571542B2 (en) | 1988-04-21 |
| CA1299119C (en) | 1992-04-21 |
| DK313784A (da) | 1985-01-06 |
| NZ208633A (en) | 1987-09-30 |
| MX167047B (es) | 1993-02-26 |
| ZA844380B (en) | 1985-01-30 |
| JP2506322B2 (ja) | 1996-06-12 |
| PT78833A (en) | 1984-08-01 |
| HUT35009A (en) | 1985-05-28 |
| IL72299A (en) | 1990-12-23 |
| FI81378B (fi) | 1990-06-29 |
| DK313784D0 (da) | 1984-06-27 |
| IL72299A0 (en) | 1984-11-30 |
| ES534002A0 (es) | 1985-06-16 |
| ES8506092A1 (es) | 1985-06-16 |
| KR850001281A (ko) | 1985-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Noegel et al. | Complete sequence and transcript regulation of a cell adhesion protein from aggregating Dictyostelium cells | |
| EP0285448B1 (en) | Leukaemia inhibitory factor | |
| KR910002692B1 (ko) | 수정 호르몬의 제조방법 | |
| Dalbøge et al. | A novel enzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli produced hGH–precursor | |
| JP2740417B2 (ja) | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 | |
| CA1214739A (en) | Manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof | |
| HU204563B (en) | Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them | |
| Sakajo et al. | Molecular cloning and nucleotide sequence of full‐length cDNA for sweet potato catalase mRNA | |
| Himeno et al. | Isolation and sequencing of a cDNA clone encoding 107 kDa sialoglycoprotein in rat liver lysosomal membranes | |
| HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
| AU617999B2 (en) | A genetic engineering process for the preparation of angiogenins | |
| Hartl et al. | The N terminus of laminin A chain is homologous to the B chains | |
| EP0259891B1 (en) | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| AU609128B2 (en) | Leukaemia-inhibitory factor | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| US4764593A (en) | Manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof | |
| US5420113A (en) | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| US5695952A (en) | Method for producing Leu13 !motilin | |
| JPH06306100A (ja) | Ｖｉｐアナログ調製用融合蛋白、ｖｉｐアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物 | |
| JP3144097B2 (ja) | 新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子 | |
| JPH09295945A (ja) | 成熟型骨誘導因子の製造方法 | |
| JPH0683670B2 (ja) | デオキシリボ核酸 | |
| JPH0556785A (ja) | ヒト表皮トランスグルタミナーゼをコードするｄｎａ配列 | |
| KR100284036B1 (ko) | 재조합 인간 형질전환 성장인자-베타 유전자, 그의 발현벡터 및 인간 형질전환 성장인자-베타의 제조방법 | |
| Honda et al. | DNAs coding for LCU 13! motilin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |