PT78833B

PT78833B - Dna encoding a grf precursor

Info

Publication number: PT78833B
Application number: PT78833A
Authority: PT
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1983-07-05
Filing date: 1984-07-02
Publication date: 1986-06-02
Also published as: HU197939B; FI842664A0; MX167047B; KR850001281A; ES8506092A1; EP0134085A1; CA1299119C; FI81378C; FI81378B; IL72299A; DK313784A; NZ208633A; ZA844380B; HUT35009A; AU2973384A; NO842682L; DK313784D0; GR82239B; PT78833A; PH22584A

Description

DESCRIÇÃO DQ INVENTO

O presente invento diz respeito a um páptido, designado prê-pró-GRF, o qual á um precursor não transformado de factor de libertação de hormona de crescimento humana (GRF), ADN que codifica pré-pró-GRF e a produção de pré-pró-GRF e GRF utilizando tecnologia de ADN recombinante.

Diversas hormonas importantes são produzidas no hipotálamo e no lobulo anterior da glândula pituitária de mamíferos, sen do uma hormona importante a hormona de crescimento (GH) a qual promove o crescimento nos mamíferos. Verificou-se que a liberta ção de hormona do crescimento pela pituitária está sujeita a regulaçães por um páptido hipotalâmico. Sabe-se já há algum tempo que um páptido hipotalâmico, somatostatina, inibe a libertação de GH. Foi já bem estabelecido o conceito de que uma substância produzida no hipotálamo, referida como GRF ou somatocrinina, á a contraparte de somatostatina, promovendo a libertação de GH da pituitária.

Embora o GRF esteja geralmente associado com o hipotálamo, ele pode ser produzido por outras cálulas, tais como cálulas de tumor pancreático. De facto, o primeiro páptido possuindo actividade GRF que foi completamente caracterizado foi obtido a partir de um ilhéu de um tumor pancreático humano (Guillemin et al. Science 218 pp. 585-587 (1982)). Pensa-se que o GRF pancreático humano é idêntico ao GRF hipotalâmico humano, embora isto não .te nha sido mostrado conclusivamente. De qualquer forma, o GRF pari creático ê altamente eficaz em promover a libertação de hormona do crescimento, e tendo em vista, o seu potencial na regulação do crescimento humano, seria altamente desejável ser possível obter GRF pancreático humano em quantidades substanciais.

0 GRF caracterizado por Guille^min et al. tem 44 resíduos aminoácidos e á amidado na sua extremidade carboxilo. Foi também descrito uma forma de GRF possuindo somente 40 resíduos aminoácidos e fragmentos de GRF possuindo cerca de 27 resíduos aminoácidos, e verificou-se serem biologicamente activos, embora menos eficazes que o páptido de 44 resíduos aminoácidos. 0 páptido de GRF pancreático completo de 44 resíduos aminoácidos foi

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sintetizado quimicamente, e GRF sintático, fragmentos de GRF siri tático, e seus análogos sintáticos, representam uma fonte pontejn ciai de substâncias reguladoras altamente potentes; contudo, a síntese química de cadeias de pêptidos tão longas á bastante dis pendiosa.

Pensa-se que as tácnicas de ADN recombinante atravás dos quais o ADN de GRF humano á introduzido numa cálula para exprimir GRF, representam a melhor hipótese de produzir GRF barato.

Um mátodo de obter ADN que codifique GRF ê de ler o código genético inversamente e sintetizar um oligodeoxinucleótido que deve codificar a sequência aminoácida do GRF. Foram já assinalados tais "genes" sintáticos ou ADN. As tentativas para introduzir tais "genes" sintáticos em células, nâo resultaram ainda em transformantes que produzam quantidades significativas de GRF.

Resultados superiores em expressão de genes obtidos utili. zando tecnologia de ADN recombinante são frequentemente obtidos se se utiliza ADN isolado de fontes naturais em vez de oligodeoxinucleótidos sintetizados de acordo com uma sequência nucleótida deduzida a partir da sequência aminoácida. Uma razão para is to pode ser que, embora o código genático seja redundante pelo facto de vários codons (uma sequência definida de três nucleótidos sucessivos) codificarem geralmente um só aminoácido, a sequência nucleótida natural pode ser superior a uma selecção ao aca so de codons aparentemente apropriados. Alám disso, observa-se frequentemente que um gene natural não codifica somente o pêptido observado, mas codifica antes um precursor que contém o sinal putativo e outras sequências crípticas e de codificação que suportam e/ou obrigam directamente etapas de transformação necessárias para a produção do páptido maduro e activo.

Este invento está dirigido para o isolamento do mARN cod_i ficando GRF e a sua aplicação para produzir GRF através de tácni cas de ADN recombinante. Como descrito de forma mais completa daqui em diante, o mARN foi isolado codificando precursores do GRF os quais incluem a sequência total de resíduo de 44 aminoácidos de GRF pancreático humano bem como sequências flanqueadas no terminus-carboxilo e terminus-amino do GRF.

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-4Começando com ARN obtido a partir de um tumor pancreático produtor de GRF, produziu-se cADN através de transcrição inversa, e clones de cADN codificando precursores do GRF foram identifica dos a partir de uma biblioteca de cADN. A colocação em sequência destes clones de cADN revelou quf/eles codificavam dois precursores de GRF humano proximamente relacionados. Cada precursor GRF inclui a sequência total de 44 aminoácidos de GRF pancreâtico humano bem como sinais de transformação para dirigir a conversão dos precursores para GRF, incluindo a amidação do seu terminus-carboxilo. Os clones de cADN têm sido utilizados para transformar células e têm mostrado dirigir a síntese dos precursores de GRF nas células transformadas. Quando estão presentes enzimas transformadoras nas células transformadas, o precursor é convertido em GRF.

De acordo com o presente invento, a procura do factor de libertação da pre-pro-hormona da hormona do crescimento humana levou ao isolamento e colocação em sequência de genes que codifi cam dois precursores do factor de libertação de hormona do crescimento pancreática humana (hpGRF). 0 factor de libertação da hormona pancreática humana ê um resíduo péptido de quarenta e quatro aminoácidos e é designado por hpGRF-44. Baseado em prova biológica, imunológica e físico-química, o hpGRF-44 é idêntico ao factor de libertação da hormona do crescimento hipotalâmico huma no (hhGRF). Um dos dois cADN codifica um precursor possuindo 107 resíduos aminoácidos, designado pré-pró-GRF-107, e o outro codifica um precursor possuindo 108 resíduos aminoácidos, designado pré-pró-GRF-108. Os pré-pró-GRFs contêm cada um a sequê_n cia aminoácida total de hpGRF em adição a fragmentos péptidos li gados a ambos o terminus amino e o terminus carboxilo. Cada pêjq tido terminal contêm locais de transformação básicos os quais di. rigem a sua remoção através de acção enzimática. A amidação do terminus-carboxilo de GRF maduro é dirigida pela sequência Gli-Arg no péptido terminal-carboxilo.

Primeiro efectua-se o isolamento do ARN mensageiro (mARN) a partir de um tumor pancreático humano que possui uma actividade de factor de libertação de hormona do crescimento pancreática

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-5humana muito elevada, e depois o cADN é sintetizado a partir do mARN por transcrição inversa. 0 cADN foi anelado a plasmideos que foram transformados em células E. coli, e as células foram cultivadas como colónias individuais, criando uma biblioteca de cADN. A partir da biblioteca de cADN, colónias de células trans formadas com cADN codificando péptidos que contêm sequências hp GRF foram seleccionadas através de hibridização selectiva utilizando oligodeoxinucleótidos sintetizados para corresponder a po£ çães da sequência aminoácida GRF. 0 cADN dos clones de hibridização positiva foram excisados do ADN do plasmídeo e sequenciado, e a sequência nucleótida revelou que a sequência aminoácida de GRF é derivada de uma porção de uma proteína precursora maior que ê designada por prê-pró-GRF. Os cADN's isolados incluem tam bém segmentos não codificantes nas suas extremidades 3' e 5*.

Os cADN’s isolados, quando correotamente inseridos em sejg mentos de ADN controladores, dirigem a síntese de prê-pró-GRF em células transformadas. A partir de linhas de células transforma das que carecem as enzimas transformadoras de prê-pró-GRF, são isolados e purificados polipêptidos contendo prê-pró-GRF, Linhas de células possuindo as enzimas transformando prê-pró-GRF, quando transformadas cora genes híbridos contendo o cADN prê-pró-GRF estranho, produzem GRF adicional. 0 invento será agora de_s crito mais detalhadamente através de exemplos.

0 isolamento e colocação em sequência de prê-pró-GRF cod_i ficando mARN é auxiliado pela disponibilidade de um tumor pancre ático descrito por Guillemin et al. supra, possuindo actividade de libertação de hormona do crescimento pancreática intrínseca elevada.

5 de Poli (A ⁺ )-ARN são obtidos a partir de 15 g de tu mor (armazenado em azoto líquido ou a -802C) utilizando o proces. so tiocianato de guanidina de Chirguin et al., Biochemistry 18 5294-5294 (1979) e cromatografia em oligo dt-celulose, Norgard ^{et a1}·» Biol. Chem, 225, 7665-7672 (1980). Das 3 de Poli (A ⁺ )-ARN, 1 yz g de cADN de cadeia-dupla ê sintetizado utilizando uma modificação de Gubler et al. (manuscrito em preparação) do método Okayama et al., Mol. Cell. Biol, 2 161-170 (1982).

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0 cADN ê utilizado para construir uma biblioteca de cADN, utilizando uma modificação do método de Peacock et al., Biochem Biophys. Acta. 655, 243-250 (1981). 0 cADN é marcado com poli

dGTP e anelado a EcoRV-cut plasmídeo pBR322 marcado com poli dCTP. Os plasmídeos quiméricos são então transformados em E« coli RR1, e as células transformadas são colocadas em placas fornecendo 300.000 transformantes independentes.

As colónias são então seleccionadas para localizar colónias contendo cADN que incluem sequências nucleótidas correspondendo à sequência nucleótida prevista de fracções de genes que codificam sequências hpGRF. São sintetizados oligodeoxinucleótidos os quais se prevê serem complementares a um segmento do qe ne natural GRF, e estes oligodeoxinucleótidos são utilizados como sonda de hibridização para a selecção de colónias. Dois conjuntos de sondas de nucleótidos misturados são sintetizados pelo método de fosfotriester de fase sólida de Miyoshi et al., Nucleic Acids Res. 8 5507-5517 (1980) e marcados nas suas extremidade^' com /^z P-ATP de acordo com o método de Maxam et al., em Methods in Enzymoloqy, eds. Grossman et al. Vol. 65, pp 499-560, Academic Press, Nova Iorque (1980). Uma das sondas de oligodeoxinuç leótido misturada, designada sonda A, tem 20 bases de comprimento e corresponde aos resíduos aminoácidos 1-7 da sequência hpGRF.

1 7

H-Tyr-Ala-Asp- Ala-Ileu- Fen-Tre

5'-ATG CGN CTG/A CGN TAT/g/A AAA TG - 3'.

A outra sonda B misturada tem 14 bases de comprimento e corresponde aos 35-39 resíduos aminoácidos de hGRF,

35 39

Asp(NH₂)- Glu(NH^- Glu- Arg- Gly

5'-TTA/G GTT/C CTT/C GCN ou TCT/C CC -3'

0 tetradecêmero sonda B é inicialmente utilizado para selecção de colónias através do método de Hanahan et al. Gene 10, 63-67 (1978). As hibridizaçães são efectuadas num tampão constituído por 0,75 M cloreto de sódio, 0,075 M citrato de sódio, 0,1% de dodecilsulfsto de sódio, levedura de ARN parcialmente h-idrolizada (100 ttg/ml), 0,2% de albumina de soro bovina (BSA),

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0,2% de polivinilpirrolidona e 0,2% de ficol a 302C durante 2 hr utilizando 1 pmole de sonda marcada por ml. Os filtros são rapi damente enxaguados numa solução de 0,3 M de cloreto de sódio, 0,03 M de citrato, à temperatura ambiente, e após uma lavagem muito rigorosa numa solução de 0,6 M de cloreto de sódio, 0,06 M de citrato de sódio durante 60 min a 402C, os filtros são expostos a película de raios-X durante a noite. Selecção de alta e baixa densidade de 11.000 clones-cADN com a sonda B revela que os fragmentos de ADN inseridos de nove destes clones hibridizam para sonda Β. A análise de borrão Southern mostra que as inserções de sete destes nove recombinantes também hibridizam para sonda A.

0s ADNs de plasmideo dos transformantes que hibridizam para ambas sonda A e sonda B são linearizados com Hind III e submetidos a sequenciação parcial pelo método de terminação de cadeia de Smith, Methods of Enzymoloqy 63 pp, 560-580, utilizando sonda B como um escorvador. Quatro clones codificando sequên cias hpGRF são deste modo identificados dos quais o clone nS. 21 contêm a maior inserção de cADN (520 bp).

A inserção de cADN do clone nS. 21 ê completamente seque_n ciada pelo método de Maxam et al. Supra, e a sua sequência ê apre sentada no Quadro abaixo.

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iJUADRO

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50

Clone 8: TGGGAACGCCAGGCGGCTGCCAGAGCAAACACCCAGCCCAGGGCCCCTGGATTTGAGCAGTGCCT Clone 21: AGGGCCCCTGGATTTGAGCAGTGCCT

100

preproGRF-108

preproGRF-107

TTC TTT GTG TTC TTT GTG Fen Fen Vai

ATG	GCA	CTC	TGG	GTG	TTC
ATG	CCA	CTC	TGG	GTG	TTC
Met	Pro	Leu	T re	Vai	Fen
Met	Pro	Leu	T re	Vai	Fen

TGC	TCC	CCA	CCT	CCC	CCT
TGC	TCC	CCA	CCT	CCC	CCT

150

ATC CTC ACC CfC AGC AAC AGC TCC CAC ATC CTC ACC CTC AGC AAC AGC TCC CAC

Ileu Leu Tre Leu Ser Asp(NU?) Ser Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro Ser Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro 20

Feη Fen Vai Ileu Leu Tre Leu Ser Asp(NH_?) Ser

"X			10
					200
TTG	ACC	CTC	AGG	ATG	CGG
TTG	ACC	CTC	AGG	ATG	CGG
Leu	Tre	Leu	Arg	Met	Arg
Leu	T re	Leu	Arg	Met	Arq
				30
			250
AAG	GTG	CTG	GGC	CAG	CTG
AAG	GTG	CTG	GGC	CAG	CTG
Lys	Vai	Leu	Gly	Glu!	JJIL
Lys	Vai	Leu	Gly	GluÇNHÍ;
		300
CAG	CAG	GGA	GAG	AGC	AAC
CAG	CAG	GGA	GAG	AGC	AAC
Glu-	Glu-
(w	) (NHj	Gly	Glu	Ser
Glú-· Glu-
(NH.	) (r	JIL,)	Gly	Glu	Ser
z	550
GTA	ÊAC	AGC	ATG	TGG	GCA
GTA	GAC	AGC	ATG	TGG	GCA
Vai	Asp	Ser	Met	T re	Ala
Vai	Asp	Ser	Met	T re	Ala
	80
GCC	CTG	CTG	CAG	AAG	CAC
GCC	CTG	CTG	CAG	AAG	CAC
Ala	Leu	Leu	Glu(	NHJ	Ly
Ala	Leu	Leu	Glu(	Nllf	Ly
			100

yr Ala Asp Ala Ileu Fen Tre Asp(NH„) Ser Tyr Arg

Fyr Ala Asp Ala Ileu Fen Tre Asp(NHÍ) Ser Tyr Arq ^z 40

nh;

50

Glu70

;) Asp Ileu Met Ser Arq

60

V
Gly	Arg
Gly	Arq

Glu(NH_) Glu^z(NH )

400

uxu^uu^y ι ic υ uxu l-gu uxu uci xj.au uouuai

Glu(NH ) Lys Glu(NH„) Met Glu Leu Glu Ser Ileu Leu Vai ^{z z} 90

450

AGG AAC TCC CAG GGATGAAGATTCCTCCTGTGACCCGGG,

AGG AAC TCC CAG GGATGAAGATTCCTCCTGTGACCCGGG > Ser Arg Asp(MH„) Ser Glu(NH„) Gly 3 f Arg AspÍNHÍp Ser Glu(NH^z) Gly

500

CTACCTGTAGCCAAAATGCAACTGGATCCAGTTAATCCTÔTCATTTCTGACCCACTTTTTCCTTTGAAAAT

CTACCTGTAGCCAAAATGCAACTGGATCCAGTTAATCCTCTCATTTCTGACCCACTTTTTCCTTTGAAAAT

550 570

ACAATAAAATTCCCCCATACCGGTGTGCATTTAAATGTTftAAAAAAAAAAAAAAA

ACAATAAAATTCCCCCATACCGGTGTGCATTTAAA f ΑΑΑΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

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9-2.JUI.

A sequência nucleótida do clone n9. 21 indica que ele codifica um polipêptido que contêm a sequência aminoácida completa do hpGRF-44, previamente caracterizado pela microsequenciação da proteína. No quadro de leitura do hpGRF, os codons iniciador e finalizador presumidos estão localizadas 31 e 32 codons a montante e a juzante, respectivamente, da sequência codificada do hp GRF-44. Portanto, este cADN codifica um pré-pró-GRF que tem 107 aminoácidos de comprimento e tem as características típicas de uma prê-pró-hormona (Steiner et al,, Annals of Neui York Acad» of Sei., 243:1-16 (1980)).

Para confirmar que a sequência aminoácida do pré-pró-GRF que ê deduzida do fragmento de cADN sequenciado corresponde de facto agfcroduto de gene actual e não ê um artefacto de transcrição invertida, o mARN obtido da célula tumoral pancreática é uti lizado para produzir produtos de transcrição e o peso molecular do produto traduzido é comparado com o peso molecular do produto de prô-pró-GRF previsto. A tradução do mARN do hpGRF ê efectuada no sistema reticulocito de coelho isento de células. Os produtos são imunoprecipitados com um anticorpo específico produzido contra GRF produzido sinteticamente e depois são separados por electroforese num gel de poliacrilamida contendo sulfato de dodecilo de sódio. 0 produto maior de tradução corre como um dupleto com um peso molecular de cerca de 13.000 o que está de acordo cem o tamanho de prê-pró-GRF-107 previsto da sequência nucleótida do clone n9. 21 (MW 12,361). Um produto de tradução mais pequeno corre também como um dupleto (MW 8000) e, como um produto maior, ê reactivo com anticorpo GRF-específico. 0 produto de baixo peso molecular pode representar terminações de tradução prematura ou um baixo nível de transformação do pêptido maior. A razão p.a ra o aparecimento de bandas de dupletos não está clara. Estes resultados demonstram que a sequência nucleótida está correcta e que o fragmento de cADN do clone 21 contêm toda a região de codi. ficação de prê-pró-GRF-44.

Tendo confirmado que o clone n9, 21 contêm a sequência de codificação total para o pré-pró-GRF-44, S agora possível utili-

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-10zar o segmento recombinante para localizar o ARN mensageiro de hpGRF-44 de poli (A⁺)-ARN. Utilizando ADN de plasmldeo traduzido por entalhe do clone n2. 21 como uma sonda de hibridização para análise de borrão Northern de poli (A⁺)-ARN, detecta-se uma banda proeminente correspondendo a um ARN mensageiro de aproxima damente 820 nucleótidos. Porque o recombinante n2. 21 contêm uma região 3*-não codificante completa e o tracto poli (A ⁺ ), parece que o segmento cADN 520 bp transformado em clone n^. 21 não contém a região 5’ não codificante completa da mensagem prê-pró-GRF.

Tendo reconhecido que o clone n^s. 21 contém um segmento de gene ADN inserido correspondendo ao total da região codifica_n do GRF-44, o cADN deste clone fornece mais e maiores sondas de hibridização especifica, úteis para localizar clones contendo segmentos de ADN semelhantes. A biblioteca de cADN original ê re-escolhida com uma sonda derivada da extremidade 5'- da inserção de cADN do clone nS, 21 (nucleotidos nS. 82-149), em relação ao Quadro.

Um clone nS, 8, contêm um segmento de ADN inserido, de 40 nucleótidos mais compridos na extremidade 5*, um trinucleétido adicional'na região de codificação, e um tetranucleétido adicional na região 3'-não-codificante. Como se pode ver no Quadro, o trinucleétido codifica uma serina adicional, resíduo 105, do resíduo pêptido de 108 aminoácidos, prê-pró-GRF-108. De quatro cljç nes analizados, três contêm a sequência nucleétida codificando prê-pró-GRF-108 e um contêm a sequência codificando prê-pró-GRF-107, confirmando a presença de pelo menos dois mARNs hpGRF dife rentes.

As indicações são que o segmento de ADN no clone 8 é um cADN prê-pró-GRF substancialmente completo, representando a trans crição inversa de substancialmente todo o ARN mensageiro de um GRF-44. Outras indicações são que uma porção menor de mARN hpGRF pode ser cerca de 80 nucleótidos mais comprida.

Tendo estabelecido as estruturas primárias dos dois cADN’s codificando prê-pró-GRF 107 e 108, fazem-se, de seguida, algumas ohservações acerca da sua estrutura. Os primeiros 20 resíduos ami

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noâcidos (sublinhados no Quadro) do prê-pró-GRF 107 e do prê-pró-GRF 108, constituem o pêptido de sinal putativo hidrofóbico que está ligado a pró-GRF, de 87-88 aminoácidos de ccmprimej} to. Pró-GRF 87 e pró-GRF88 contêm locais de transformação (em cai xas no Quadro) para produção enzimática de hpGRF-44, i.e», dois resíduos arginina (30-31) precedendo o terminus-amino e um só re síduo arginina (77) imediatamente a seguir ao terminus carboxilo.

A sequência Gli-Arg (76-77) imediatamente a seguir ao terminus leucina-carboxilo de hpGRF-44 está de acordo com um sinal para amidação do produto maduro.

Os segmentos de cADN obtidos da hibridização de cloneq^positivos da biblioteca de cADN são úteis para a introdução em células hospedeiro quer eucarióticos quer prócarióticas para a finalidade de expressão de GRF. 0 ADN do plasmideo é obtido a pa_r tir de cada um dos clones 21 e 8. 0 plasmideo ê cortado com Hind III endonuclease para expor a extremidade 5’ do fragmento de cADN inserido. As sequências 5’ de prê-pró-GRF podem ser digeridas com Bal 31 exonuclease de forma a produzir uma série de segmentos de ADN que incluem comprimentos variáveis de sequências amino terminais para utilização numa variedade de vectores de expressão. Por exemplo, para utilização em /gtll ou pCQV2 será necessário remover todas as sequências 5’ para o códon de inicia ção para pre-pró-GRF. Serão então adicionados oligonucleótidos quimicamente sintetizados à extremidade 5' do segmento de ADN dj. gerido de acordo com a especificação dos vectores de forma a optimizar a produção de um produto de gene ou hibrido ou de fusão para níveis máximos de expressão de prê-pró-GRF puro, pró-GRF ou as proteínas GRF. Serão anelados ligantes ao terminus 3* (após reclonação subsequente do segmento de ADN digerido) e os fragmentos construídos finais podem ser digeridos com endonucleases apropriados e isolados do maior ADN do plasmideo através de electroforese em poliacrilamida ou agarose gel. Cada um dos segmentos de cADN transformado ê anelado dentro dc local de restrição apropriado de um vector de expressão, tal como /gtll (Young e Davis, Proc. Natl. Acad. of Sei, 80, 1194-1198), pCQV2 (Queen, C., 3, Mol. and Appl, Genetics 2:1-10, 1983), vectores derivados-pMB9 (Roberts, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 760-

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-12-764, 1979) ou vectores derivados-pBR322 (Oay et al., Proc, Natl. Acad, Sei. 78, 5543-5548, 198l). 0 vector de expressão de recom

binação é introduzido em E» coli RR1 através do método de Peacock et al, supra. Colónias de bactérias contendo os segmentos de cADN prê-pró-GRF-relacionados, são seleccionadas através de hibri dização de ADN com sonda B ou através de selecção com anticorpo (Young & Davis supra) e 50 colónias de hibridização positiva cori tendo cada um dos genes pré-pró-GRF, são seleccionadas para nova cultura, A estrutura correcta do vector-cADN putativo é confir mada por análise de restrição enzimática.

Para examinar colónias bacterianas para a produção de pê£ tidos pré-pró-GRF- relacionados dirigidos pelo vector de expressão bacteriano em E. coli, a presença de sequências de proteína GRF nas colónias é determinada através de radioimunoensaic. Os lisados celulares são preparados, ligados a poços de microtitula ção de cloreto de polivinilo, expostos a anticorpo específico-GRF, e o complexo anticorpo-antigénio é quantificado através de 125

nova ligação de Proteína A I-marcada através do método descrito por Kohler, G. Y., em Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Ν. Y. 1980. A identificação de s_e quências pêptidas GRF nos lisados de algumas das sete colónias de pré-pró-GRF-107 e algumas das doze colónias de pré-pró-GRF-108, indica que os cADNs exprimem os seus produtos de proteína respectivos nestas colónias.

Uma colónia de E. coli transformada com genes prê-pró-GRF-107-relacionados e produzindo quantidades razoáveis de pêptido que ê reactivo com um anticorpo específico apropriado, é seleccionada para nova cultura, como é uma colónia de E» coli transformada da mesma forma com genes prê-pró-GRF-108-relacionados, São preparados lisados a partir de cada uma das colónias, e cada lisado é fraccionado por cromatografia de exclusão seguido de electroforese em poliacrilamida geles. As fracções da cromatografia de exclusão que contém proteínas com pesos moleculares da ordem de 12.000 a 13.000 são purificadas por cromatografia de afinidade em colunas de esferas de Sepharose ligadas com anticorpos anti-GRF, e/ou por cromatografia de troca iônica, sendo todos estes métodos de purificação conhecidos na arte. A purifi

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-13cação final pode ser obtida atravás de cromatografia de liquido de elevada pressão (Guillemin, et al. supra).

A quantidade dos respectivos prá-pró-GRF ’s nas fracções

recuperadas é estimada atravás de radioimunoensaios nos quais ajn

ti-soro reactivo-GRF á em primeiro lugar incubado com diversas 125

diluições das fracções e depois exposto a GRF-44 sintético I-marcado. As concentrações de prá-pró-GRF nas diversas diluições são calculadas comparando as concentrações de GRF marcado ligado ou não ligado a anticorpo, cóm curvas padrão derivadas de controles, nos quais o anti-soro GRF é inicialmente exposto a concentrações conhecidas de GRF não marcado e depois a concentra ções conhecidas de GRF marcado. Os resultados indicam que as fracções purificadas contêm cada uma prá-pró-GRF dentro da gama de 75 a cerca de 80 por cento da proteína total.

Embora nenhuma das duas formas de prá-pró-GRF não transfoj? mado de proteínas híbridas contendo sequências bactérianas bem c_o mo sequências GRF têm mostrado possuir actividade GRF, estas subs tSncias representam contudo compostos de valor. Pode-se dar o caso de, se os precursores forem administrados a um animal, o precursor seja subsequentemente transformado in vivo em GRF. De qualquer forma, o prá-pró-GRF pode ser transformado in vitro expondo o prá-pró-GRF a um extracto hipotalâmico humano contendo enzimas transformadoras. E provável que um extracto hipotalamico de uma espécie não humana possa ser encontrada que transforme prá-pró-GRF humano em GRF. Seria de esperar que a transformação enzimática quer in vivo quer in vitro de prê-pró-GRF fizesse a amidação do grupo carboxilo terminal de GRF-44, Isto é uma vantagem distinta do gene natural sobre um oligodeoxinucleótido sin têtico que codifica somente a sequência aminoácida GRF sem as s_e quências transformantes encontradas em prá-pró-GRF. A transformação pode também proceder em fracções parcialmente purificadas que são dspois purificadas como acima descrito. Nos casos em que uma proteína híbrida contendo sequências bactérianas no terminus-amino á o produto de expressão bacteriana, a hidrólise paj? ciai com um reagente, tal como brometo de cianogênio, pode ser necessária para libertar o prê-pró-GRF para nova transformação in vitro pelos extractos de tecido.

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-14Os fragmentos de gene pré-pró-GRF construídos para expres. são em bactérias podem também ser utilizados para expressão em sistemas eucarióticos, quer em leveduras quer em células de mamí feros. No caso de levedura verificou-se que interferães de mamí feros eram eorrectamente segregados e transformados quando expres. sos utilizando um vector levedura YEplPT (Hitzeman et al. Science 219, 620-625, 1985), Prê-pró-GRF pode ser transformado e segregado de forma semelhante, o que auxiliaria no processo de purifi cação, podendo então o prê-pré-GRF servir como um subtracto para transformação in vitro, como acima descrito. Alternativamente, os fragmentos de cADN que se verificou codificarem para pré-pró-GRF podem também ser introduzidos numa linha de células hipotalâmicas humana ou numa linha de células pituitárias de ratazana, onde os enzimas estão disponíveis para transformar pré-pró-GRF-107 e prê-pró-GRF-108. 0 cADN pode ser cionado em tal vector de expressão como a família pSU2 de vectores derivados de 5V40 (Mulliqan, R. C. e Berq, P. em Eukaryotic Virai Vectors, Y. Gluz man, ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) ou nos vectores retrovirais mais recentes, Mulligan, P. Science 209: 1422-1427 (1980). 0 cADN pode então ser conduzido para dentro das

células hipotalâmicas através de microinjecção, transferência de ADN, ou infecção virai. As células que integram de forma estável o cADN introduzido, podem ser seleccionadas por um protocolo de selecção para quer qtp quer neo, os 2 marcadores dominantes fornecidos pelo sistema vector. A produção de GRF pelas colónias seria ensaiada pelo método geral acima descrito utilizando anticorpos apropriados. Algumas das colónias deveriam produzir GRF a níveis bem acima do nível de GRF produzido pelas linhas de células não-transformadas. Assim, o cADN de prê-pró-GRF isolado é considerado adequado para transformação em células hospedeiras eucarióticas, e o produto expresso será, pelo menos nalguns casos, transformado em GRF por enzimas dentro da célula hospedeira da forma usual.

Embora o invento tenha sido descrito em termos de certas concretizaçães preferidas, podem ser feitas modificaçães óbvias pelo entendido na arte sem se afastar do objectivo do invento.

Por exemplo, entende-se que os cADN’s prê-pró-GRF aqui descritos

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representam só a estructura precisa de dois segmentos de gene que ocorrem naturalmente. Pensa-se que se encontrarão alelos ligeiramente modificados codificando proteínas de funcionamento semelhante, e tais segmentos de gene e proteínas são considerados como sendo equivalentes para fins do invento. Sabe-se também que homólogos ligeiramente modificados das proteínas poderi am ser sintetizados e que muitos desses homólogos modificados p_o deriam apresentar actividade prê-pró-GRF, e estes são do mesmo modo considerados como abrangidos pelo objectivo do invento. ADN possuindo codons equivalentes é considerado como abrangido pelo objectivo do invento, bem como segmentos de gene sintético que codifica péptidos homólogos que apresenta actividade pré-pró-GRF.

Diversos aspectos do invento estão apresentados nas reivindicações seguintes.

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de ADN codificando um precursor do hpGRF o qual inclui uma sequência nucleótida que codifica toda a sequência pêptida do hpGRF, um segmento de pêptido ligado aos terminais amino do dito pêptido hpGRF e um segmento pêptido li gado ao terminus-carboxilo do dito pêptido hpGRF, incluindo os ditos segmentos terminais segmentos sinal para dirigir a sua remoção enzimática do dito pêptido hpGRF e para dirigir a amidação enzimática do terminus carboxilo do hpGRF.

2 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza, do pelo facto da sequência nucleótida codificar para a sequência aminoácida:

Arg-Arg-T ir-Ala-Asp-Ala-Ileu-Fen-T re-Asp(NH₂ )-Ser-Tir-Arg-Lis-Val -Leu-Gli-Glu(NH₂)-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Lsu-Glu(NH₂)-Asp-Ileu-Met-5er-Arg-Glu(NH₂)-Glu(NH₂)-Gli-Glu-Ser-Asp(l\IH₂)-Glu(NH₂)-Glu-Arg-Gli-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gli-Arg.

3 - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza do pelo facto da dita sequência nucleótida codificar para a .sequência aminoácida:

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Met-Pro-Leu-T ri-Val-Fen-F en-Fen-Val-Ileu-Leu-Tre-Leu-Ser-Asp(NH₂)-Ser-Ser-His-Cis-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Tre-Leu-Arg-Met-Arg-Arg-Tir-Ala~Asp-Ala-Ileu-Fen-Tre-Asp(NH₂)-Ser-Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Glu(NH₂)-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-Glu(NH₂)-Asp-Ileu-Met-Ser-Arg-Glu(NH₂)-Glu(NH₂)-Gli-Glu-Ser-Asp(NH₂)-Glu(NH₂)-Glu-Arg-Gli-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-Gli-Arg-Glu(NH₂)-Val-Asp-5er-Met-Tri-Ala-Glu-Glu(NH₂)-Lis-Glu(NH₂)-Met-Glu-Leu-Glu-Ser-Ileu-Leu-Val-Ala-Leu~Leu-Glu(NH₂)-Lis-His-R-Arg-Asp(NH₂)-Ser-Glu(NH₂)-Gli, na qual R ê seleccionado a partir do grupo constituido por Ser e das-R.

4 - Processo de acordo com qualquer uma das

Claims

Reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo facto da dita sequência nucleótida conter a seguinte sequência:

CGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC GGC AAG CTG CTG CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT.

5 - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações

de 1 a 3, caracterizado pelo facto da dita sequência nucleótida conter a seguinte sequência:

ATG CCA CTG TGG GTG TTC TTC TTT GTG ATC CTC ACC CTC AGC AAC AGC TCC CAC TGC TCC CCA CCT CCC CCT TTG ACC CTC AGG ATG CGG CGG TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACG AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC CAG CTG TCC GCC CGG AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA CGA GCA AGG GCA CGG CTT GGT CGT CAG GTA GAC AGC ATG TGG GCA GAA CAA AAG CAA ATG GAA TTG GAG AGC ATC CTG GTG GCC CTG CTG CAG AAG CAC NNN AGG AAC TCC CAG GGA, na t gual NNN ê seleccionado ε i partir do ι grupo constituido ι por • AGi

e des-NNN.

6 - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo facto da sequência de ADN estar inserida dentro de um vector de expressõo capaz de, num microrganismo transf ormante· ou cultura de células, exprimir a sequência aminoácida codificada pela dita sequência de ADN.

7 - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracteriza

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-17do pelo facto do vector de expressão estar inserido dentro de um microrganismo transformante ou cultura de células, no qual o pro duto da dita sequência de ADN é expresso como ura polipéptido pos. suindo a sequência aminoácida codificada.

8 - Processo de acordo com a Reivindicação 7, caracteriza do pelo facto do polipéptido expresso no microrganismo ou cultura de células possuir a sequência aminoácida codificada ou um seu fragmento enzimaticamente transformado.