KR960007604B1 - 인체 렐락신 또는 그 유사체를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 인체 인슐린 및 돼지(P) 및 쥐(R) 렐락신과 인체 렐락신 H1 및 H2 사이에 동일성이 없음을 나타낸 것임. 번호는 H2 렐락신에 대하여 상대적인 것이고, 렐락신의 이황산염은 A10-A15, A11-B11 및 A24-B23임.
제2(a)도는 시험관 내 사슬 결합 반응에 있어서 H2(B33 A24) BLys4BAla25프로필의 HPLC 시간 경로를, 제2(b)도는 H2(B33 A24) 프로필의 HPLC 시간 경로를 나타낸 것임. 이 결합 반응의 시간경로는 인체 랠락신 유사체 또는 인체 렐락신 및 잠재적으로 중요한 A 사슬의 분자내 산화 중간체의 형성을 나타냄. 또한 유전자 2 A- 및 B-사슬 펜티드의 H2 인체 렐락신 유사체 및 H2 인체 렐락신에로의 전환을 나타내었음. Synchropak PR-C4(4.6×250mm ; 300Å)을 사용하여 크로마토그래피하였고, 0.05% TFA, H2O 완충액에 용해된 아세토니트릴을 선형 구배(500분 동안 15-60%)로 하여 1ml/min의 속도로 용출시킴.
제3도는 인체 유전자 2렐락신 H2(B2-33 A24) BLys)(4BAla25와 천연 인체 렉락신이 결합된 사슬의 생체 활성(MPS)을 나타낸 것임.
제4도는 다양한 용량의 인체 렐락신 유사체, H2(B2-33HA24) BLYST4BAla25및 H2(B33 A24) BLYS4BAla25가 투여된 후 영장류에서 변형된 비숍 스코어를 나타낸 것임.
본 발명은 생물학적으로 활성이 있는 인체 렐락신 또는 인체 렐락신 유사체를 유용한 수율로 제조하기 위하여 인체 렐락신 A 및 B 사슬 또는 인쳬 렐락신 A 및 B 사슬 유사체를 결합시키는 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 인체 렐락신 A 및 B 사슬 또는 그의 유도체들을 pH가 약 7.0 이상이고 인체 렐락신 B 사슬이 온화하게 변성되는 조건 하에서 결합시키는 것으로 된다. 이들 조건은 반응 진행도중 생물학적 활성 인체 렐락신 또는 그의 유사체의 혼합물을 대기 산소에 노출시키면서 온도를 약 15℃-30℃로 유지시켜 생물학적 활성 인체 렐락신 또는 그의 유사체가 형성되는 환경을 제공한다. 또한, 본 발명은 인체 렐락신의 생물학적 활성 유사체를 제공한다. 더우기 본 발명은 단일 활성제로서 인체 렐락신 또는 그의 유사체를 사용하여 분만을 촉진시키는 방법을 제공한다.
인체 렐락신은 분만전 생식관을 리모델링(remodelling)하는데 관여하는 난소 펩티드이므로, 분만 과정을 촉진시킨다.「하이소(Hisaw, F.L.)의 Pros, Soc. Exp. Biol. Med. 23, 661-663(1926) ; 슈바베(Schwabe, c). 등의 Biochem. Biophys. Res. Comm. 75, 503-570(1977) ; 제임스(James, R.) 등의 Nature 267, 544-546(1977) 참조」. 주된 임신 호르몬이지만 렐락신은 또한 비임신 여성 및 남성에게서도 검출되었다「브리안트-그린우드(Bryant-Greenwood, G.D.)의 Endocrine Reviews 3, 62-90(1982) 및 바이스(Weiss, G)의 Ann. Rew. Physiol. 46, 43-52(1984) 참조」.
돼지, 쥐, 호랑이, 상어, 작은 상어 및 인체로부터 얻은 렐락신의 아미노산 서열이 밝혀졌다. 상기 호르몬은 A 및 B라고 하는 2개의 펩티드 사슬로 구성되며, 이 사슬은 인슐린에 있어서와 유사한 방법으로 A사슬에 사슬내 이황화 루프(loop)를 가지며 이황화 결합에 의해서 결합된다. 그러나, 렐락산과 대부분의 다른 펩티드 호르몬(인슐린 포함) 사이의 놀랍고도 중요한 상이점은 종간에 상당한 구조적인 변이가 있다는 점이다. 예를 들면, 돼지, 쥐 및 인체 렐락신은 아미노산 위치가 50% 이상 상이하다. 이들 차이점은 상이한 종의 렐락신들 간에 면학적인 교차 반응성이 나쁘고 또한 이들의 특이한 생물학적 활성에 있어서 관찰된 다수의 상이함을 설명해 준다.
재조합 DAN 기술을 이용하여 인체 렐락신을 부호화하는 유전자를 단리시키고 특정화 하였다「허드슨(Hudson, P.) 등의 Nature 301, 628-631(1984) 및 허드슨 등의 The EMBO Journal 3, 2333-2339(1984)참조」. cDNA 및 게놈 클론으로부터 뉴클레오티드 서열을 분석한 결과, 인체 렐락신의 구조체에는 25개의 잔기를 갖는 신호 펩티드, 이어서 약 32 내지 33개의 아미노산으로 이루어진 B 사슬, 약 105개의 아미노산을 갖는 C 펩티드 및 24개의 아미노산으로 이루어진 A 사슬이 포함되어 있음이 밝혀졌다. 인체 렐락신의 경우, 인트론(intron)은 C 펩티드의 코팅 영역내에 삽입된다. 인슐린 C 펩티드 보다 훨씬 긴 인체 렐락신 C 펩티드의 생리학적 역할 및 A 및 B 사슬로부터 C 펩티드를 제거하는 효소의 성상은 해결되지 않은 문제점들이다.
인체 렐락신의 경우, 2개의 분리된 유전자 서열이 확인되었다. 즉, 이들 유전자 중 하나 (H2)만이 임신중 난소에서 발현되었으며, 다른 유전자가 또 다른 조직 부위에서 발현되는지 또는 의사 유전자(pseu-dogene)인지는 분명하지 않다. 이들 2개의 인체 렐락신 유전자는 특히 B 및 C 펩티드에 있어서 뉴클레오티드 및 아미노산이 서로 매우 동일하였다. 그러나, 특히 A 및 B 사슬의 아미노 말단 부위에 있어서와 같이 서열이 현저하게 상이한 부위가 있다(제1도 참조). H2 렐락신이 난소 중에서 합성 및 발현된다는 사실은 이것이 임신 생리학에 관여하는 서열임을 암시한다. 존스톤(Johnston, P.D.) 등은 문헌 Peptide에 기재된 최근의 논문Structure and Function, Proc. Ninth Ameican Peptide Symposium, Deber, C.M., Hruby, V.I. 및 Kopple, F.D.(eds.)(피어스 케미칼 코, 1985년)에서 합성 인체 렐락신(Hw) 및 임의의 인체 렐락신 유사체의 생물학적 활성을 시험하였다. 그들은 생물학적 활성에 필요한 렐락신 코어 뿐만 아니라 생물학적 활성에 영향을 미치지 않은 메티오닌을 임의의 아미노산으로의 치환하는 것도 정의하였다.
제1도에서는 상이한 종으로부터 얻은 공지된 렐락신의 아미노산 서열을 비교하였다. 6개의 시스테인 잔기 및 측면 글리신 잔기 이외에 B 사슬 중 제7지점의 이소로이신, 제12 및 16지점의 아르기닌 및 제32지점의 로이신만이 보존되었다. 시스테인 잔기는 전체 이황화 결합 배열을 유지시키기에 필수적임이 명백하였다「불룬델(Blundell, T.)등, 비가지(Bigazzi, M), 그린우드(Greenwood, F.C.), 가스파리(Gaspari. F.)(eds.) Biology of Relaxin and its Role in the Human, (엑서프타 메디카, 암스테르담, 1983) 제14-21 페이지 참조」. 렐락신 분자 즉, 렐락신 단백질의 활성 부위를 포함하는 A 및 B 사슬중의 대부분의 부위에 있어서 종간의 아미노산 서열의 변화가 뚜렷하다. 이러한 사실은 인슐린을 비롯하여 사실상 모든 다른 펩티드 호르몬류의 경우와는 뚜렷히 대조된다. 렐락신 구조의 또다른 특성은 B 사슬의 아미노 및 카르복실 말단 부위 더 적은 정도이긴 하나, A 사슬의 아미노 말단 부위에서 나타나는 길이의 차이이다.
대체적으로 렐락신의 화학적 합성 방법은 주로 단리된 B 사슬의 특이한 용해도 및 구조적 특성으로 인하여 특히 어렵다「트레기어(Tregear, G.W.)등 Biology of Relaxin and its Role in the Human, 비가지(Bigazzi, M.), 그린우드(Greenwood, F.C.) 및 가스파리(Gaspari, F.)(eds.), (엑서프타 메디카, 암스테르담, 1983) 제42-55페이지 참조」.
상기한 바와 같이 일반적으로 인체 렐락신 및 포유류 렐락신은 인슐린과 약간의 구조적 유사점을 갖고 있다. 인슐린 및 렐락신 모두는 2개의 사슬 사이에 사슬간 및 사슬내 이황화 결합을 갖고 있다「제임스(James, R.)등의 Nature 267:544(1977) 및 슈바베(Schwabe, C.) 및 맥도날드(McDonald, J.R.)의 J.R. Science 197, 914(1977) 참조」. 인슐린에 있어서 성공적으로 이용된 합성 방법「부세(Busse, W.D.) 및 카펜터(Carpenter, F.H.)의 Biochemistry 15, 1649(1976), 캇소 야니스(Katsoyannis, P.G.) 등의 Biochemistry 6, 2656(1967) 및 쿵(Kung, Y.T.) 등의 Scientia Sinica 15, 544(1966) 참조」이 렐락신에도 적용될 수 있을 것으로 추측되었다. 트레기어(Tregear, G.)등은 Relaxin[브리얀트-그린우드(G.D.Bryant-Greenwood), 니알(Niall, H.D.) 및 그린우드(Greenwood. F.C.)(eds), 엘세비어, 뉴욕, 1981」에서 시스테인 술포히드릴을 선택적으로 보호시키는 분리된 사슬 방법을 사용하여 렐락신 합성을 시도하였다. 이들은 인슐린법에 의하여 제조된 합성 펩티드가 검출될 수 있는 정도의 렐락신 유사 생체반응성을 갖지만 특정 활성 및 결합 수율은 매우 낮음을 발견하였다「상기 문헌 151 참조」. 돼지 렐락신에 있어서 결합 수율이 낮은 한가지 이유는 돼지 B 사슬 전체 길이가 pH 10.5의 용액에서 불용성이기 때문이다. 상기 트레기어 등은 선행 인슐린 결합법을 2가지 면에서 변형시켰다. 즉, 혼합된 돼지 렐락신 펩티드 사슬을 아세톤으로 침전시켜 환원제를 제거하고, 산화 단계 동안에 0.5M NaCl을 첨가하였다. 그 결과 돼지 렐락신의 수율이 개선되었다「유럽 특허출원 제833046672.6호 및 유럽 특허 출원 제83307553.4호 참조」.
1983년 12월 20일 등록된 챈스(Chance) 등의미합중국 제4,421,685호에는 일 단계로 환원 및 산화 반응을 행하기 위해 인슐린 A 및 B 사슬의 S 술폰화 형태를 조절된 pH 및 온도 하에 배지 수용액 중에서 티올 환원제와 결합시켜 인슐린 또는 그의 유사체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 전술한 인슐린 합성법에 비하여 개선된 방법이긴 하나 인체 렐락신 합성에는 적용될 수 없는 것으로 나타났다.
현재, 특정 반응 조건 하에서 인체 렐락신 또는 그의 유사체는 조절된 조건 하에서 환원된 인체 렐락신 사슬을 결합시킴으로써 유용한 수준으로 제조할 수 있음이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 화학적 합성에 의하건 또는 재조합 DNA 기술에 의하건 그 출처에 관계없이 제조된 인체 렐락신의 A 사슬과 B 사슬을 결합시켜 생물학적 활성 인체 렐락신을 유용한 수율로 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일면은 생물학적으로 활성인 인체 렐락신 유사체를 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일면은 분단을 촉진시키기 위한 인체 렉락신 또는 그의 유사체의 용도이다.
본 발명은 인체 렐락신 A 사슬 또는 그의 유사체를 인체 렐락신 B 사슬 또는 그의 유사체와 결합시켜 생물학적 활성 렐락신 또는 인체 렐락신 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 환원된 인체 렐락신 A 사슬 또는 그의 유사체와 환원된 인체 렐락신 B 사슬 또는 그의 유사체를 인체 렐락신 B 사슬을 온화하게 변성시키는 pH가 약 7.0 이상인 조건하에서 결합시키고, 반응중에 대기 산소에 점차적으로 노출시켜 반응을 행하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 인체 렐락신 또는 인체 렐락신 유사체는 생식관을 리모델링(remodelling)시켜 분만 과정을 촉진시키는 것으로 알려진 기능성 단백질을 말한다. 생식관의 리모델링에는 임신한 자궁의 자궁 내막을 두텁게 할 뿐만 아니라 자궁 부위의 혈관을 증가시켜 경부를 성숙시키는 것과 같은 생리작용 및, 콜라겐 합성에 영향을 주는 것이 포함되는 것으로 이해된다. 또한 인체 렐락신은 여성의 유방에서 발견되었으므로 유즙 분비와 관련된다. 또한 인체 렐락신은 인체 정액에서도 발견되었으며 인체 정자의 운동성을 증가시킨다. 경부에 대한 렐락신의 영향으로 인하여 인체 렐락신은 정자의 인체 경부 통과능을 증대시킬 수 있다. 연결 조직에 대한 영향으로 인하여 인체 렐락신은 피부 탄성을 개선시킬 수 있다.
전술한 구조적 정의 이외에도 인체 렐락신 유사체는 다수의 단백질을 가지며, 이들 단백질은 각각 A 및 B 사슬을 포함하는 인체 렐락신의 기본 구조를 갖는다. 인체 렐락신 유사체는 렐락신 유사 생물학적 활성을 보유하고 있는 카비트(caveat)를 가지나 인체 렐락신의 A 및(또는) B 사슬 중 어느 하나에 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 첨가 또는 변형된 점에서 천연 인체 렐락신과 상이하다. 이와 같은 인체 렐락신 유사체의 예로는 전장 A 사슬 및 카르복시 말단이 짧아진 B 사슬, H1(B2-27 A25)BAla25, A24)Apyro-GIuIBLys4BAla25및 H2(B33 A24)Apyro-GIuIBLys4BAla25를 들 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 이들의 명칭은 다음과 같다. 즉, H1, H2는 인체 렐락신을 부호화한 2개의 인체 유전자를 말한다. H2는 인체 난소에서 발현되는 반면 H1은 게놈 클론으로서만 발견디었다. A 및 B는 인체 렐락신 각각의 사슬을 나타낸다. A 또는 B 다음의 숫자는 사슬의 길이 즉, A 또는 B 사슬을 구성하는 아미노산의 수를 나타낸다. 아미노산은 통상의 3자 표시법으로 나타낸다. 아미노산 앞의 밑수는 그 아미노산이 위치하는 A 또는 B 사슬을 나타내며 아미노산 다음의 위 첨자는 사슬내에서 그 아미노산의 위치를 나타낸다.
렐락신 A 및 B 사슬 또는 유사체 사슬은 책상 또는 고상 기술을 비롯한 고전적인 단백질 합성법에 의하여, 또한 제조법 DNA 기술을 사용하거나, 또는 천연 인체 렐락신으로부터 제조하거나, 상기한 바와 같이 하나의 사슬을 화학적으로 합성하고 다른 사슬을 재조합 DNA 기술에 의하여 제조하는 방법에 의하여 수득될 수 있다. 개개의 펩티드 사슬이 고상 합성법에 의하여 합성되었다「바라니(Barany, G) 및 메리필드(Merrifield, R.B.)의 the Peptides 2, 1-284(1980), 그로스(Gross, E.) 및 마이엔호퍼(Meienhofer, J.) 편집, 아카데미 프레스, 뉴욕, 참조」. 보호된 N-t-부틸옥시카르보닐 아미노산은 페닌슐라 래보러토리스인크.(Peninsula Laboratories Inc.)에서 시판된다. 다음과 같은 측쇄 보호 방법이 사용되었다. 즉, Arg, 토실 ; Asn, 크산틸 ; Asp, 벤질 에스테르 ; Cys, 메톡시벤질 ; Gln, 크산틸 ; Glu, 벤질 에스테르, His, 토실 ; Lys, O-클로로벤질옥시카르보닐 ; Ser, 벤질 ; Thr, 벤질 ; Tyr, 2,6-디클로로벤질. 최초의 아미노산을 디메틸 포름아미드 중의 불화 칼륨으로 클로로메틸폴리스티렌(1% 디비닐벤젠)상에 에스테르화 시켰다. 치환 농도는 0.6meq/mg이었다. 아미노산을 디클로로메탄 중의 디시클로헥실카르보디이미드(증류)와 커플링시켰다. 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 루이신 및 시스테인 잔기를 50/50 메틸렌글로라이드/디메틸포름아미드 중에 거플링시켰다. 3급-부틸옥시카르보닐기를 45% 트리플루오로아세트산, 5% 아니솔, 5% 에탄디티올 및 45% 메틸렌클로라이드를 사용하여 제거하였다. 커플링시키기 전에 메틸렌클로이드 중의 10% 트리에틸아민으로 중화시켰다. 0℃ C에서 아니솔 및 메틸에틸술피드(20: 3:1v/v/v)의 존재하에 1시간 동안 무수 액체 불화 수소로 처리하여 모든 보호기를 수지로부터 절단하고 제거하였다. 조악한 A 사슬을 10% 아세트산 수용액을 사용하여 수지로부터 제거하고 동결건조시켰다. 조악한 B 사슬을 먼저 80% 아세토니트릴 수용액으로 세척하고 이어서 30% 아세트산 수용액으로 세척하여 수지로부터 제거한 후 물로 희석하고 동결건조시켰다. 조 펩티드를 100밀리몰 디티오트레이톨 중에 용해시키고 이어서 큰 용적의 10% 아세토니트릴 수용액 및 0.1% 트리플루오로아세트산 중에 희석시켰다. 이들 용액을 Vydac C18(300Å 15-20 미크론)로 충전시킨 5×55cm 컬럼에 걸고 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액으로 세척하고 아세토니트릴 구배 용리액으로 용리시켰다. 펩티드 분획물을 모으고, 동결건조시키고 아미노산의 조성, 서열 및 역상 HPLC 분석법에 의하여 분석하였다. 종전의 인슐린 또는 돼지 렐락신 방법을 사용한 경우와 마찬가지로 일치하였다. 시스테인 잔기는 술폰화 또는 기타 유도체화에 의하여 보호되지 않았다「민스(Means, G.E.) 및 피니(Feeney, R.E.) 등의 Chemical Modification of Proteins(1971)참조」, 본 발명의 방법에 따라 인체 렐락신 A 및 B 사슬을 환원된 형태로 유지시킴으로써 개선된 수율 및 펩티드 용해도를 얻었다. 환원 및 동결 건조된 A 및 B 사슬을 술폰화된 유도체로 전환되거나 또는 기타 시스테인 티올차단제를 사용하지 않고 제조합 반응 모두에 직접 사용되었다.
본 발명의 방법을 행함에 있어서, 하나의 사슬에 대한 하나의 사슬의 비율을 광범위하게 변화시키면서 인체 렐락신 A와 B 사슬 또는 A와 B 사슬 유사체를 결합시켜 인체 렐락신 유사체를 형성시킬 수 있다. 물론, 상기 결합법은 A 또는 B 중 보다 적은 양으로 존재하는 사슬에 의하여 고유하게 한정된다. 과량의 B 사슬은 사슬 조합을 억제하므로, B 사슬에 대하여 약간 과몰량 또는 등몰량의 A 사슬을 사용하는 것이 바람직하다. 어쨌든, 필수적인 것은 아니다. A 사슬 대 B 사슬의 통상의 중량비는 약 1:0.5 내지 약 3.0;1이다. 본 발명의 방법을 행함에 있어서, A 사슬 대 B 사슬을 중량비로 약 1:1 내지 약 2.5:1로 사용하는 것이 매우 바람직하다. 또한, 이 바람직한 범위 내에서도 특정 범위가 특정 렐락신 유사체의 제조에 특히 유리하다는 것이 발견되었다. 따라서, 인체 렐락신 A 및 B 사슬을 결합시켜 데스메티오닌 렐락신을 제조할 경우, A 사슬 대 B 사슬의 비를 약 1.2:1 내지 약 2:1의 범위로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법을 적정 수준으로 행함에 있어서 중요한 또 다른 파라미터는 반응 배지 중의 단백질 농도이다. 이 방법은 광범위한 단백질 농도에 대하여 성공적으로 행할 수 있다. 그러나, 일반적으로 단백질 농도는 반응 배지 1ml당 약 0.1 내지 10mg이다. 바람직하게는, 단백질 농도는 배지 1ml당 약 0.5 내지 5mg이다. 또한, 후자의 단백질 농도 범위 내에서 최적 단백질 농도는 생성된 인체 렐락신에 따라 변화되는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법은 배지 수용액 중에서 행한다. 실온에서 측정한 배지의 pH는 약 7.0 내지 약 12이며, 바람직하게는, 약 7.5 내지 약 11.0이며, 더욱 바람직하게는 약 8.0 내지 더욱 약 10.6에서 유지된다. 배지의 pH는 적합한 완충제를 첨가하여 목적하는 범위로 유지시킬 수 있다. 전형적인 완충제는 글리시네이트, 탄산염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 피로인산염 및 전술한 범위 내에서 pH를 조절하는 기타 유사 시약이다. 통상의 적절한 완충제는 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(pH 8-9) 및 글리시네이트(pH 9.5-11.0)이다.
혼합 반응은 약 15℃-30℃ C, 바람직하게는 약 20℃-25℃, 가장 바람직하게는 실온에서 행한다. 일반적으로 완충제의 농도는 약 0.25-0.2M이며, 바람직하게는 약 0.05-0.15M, 가장 바람직하게는 0.1M이다.
본 발명에 따른 방법의 조건 중 하나는 본 발명을 대기 산소에 대한 노출이 조절될 수 있는 환경에서 행하여야 한다는 점이다. 모든 용액을 초기에 N2로 퍼지시킴으로써 산화가 조절될 수 있음이 발견되었으며, 반응 초기에 닫힌 용기 중에서 반응물을 N2로 퍼지시키고, 닫힌 용기 내에서 용기를 열어 반응물을 대기에 직접 노출시키거나 또는 배지를 통하여 버블링(bubbling)시켜 반응물을 산소에 노출시킨다.
본 발명의 방법의 또 다른 조건은 인체 렐락신 B 사슬을 온화하게 변성시키는 조건 하에서 반응을 행하는 것이다. 이와 같은 변성제로서 우레아, 구아니딘 염산염 및 기타 카오트로픽제(chaotropic agant), 염류, 세제 및 유기 용매(아세토니트릴, 알코올, 디메틸포름아미드 등)와 같이 당 업계의 숙력자들에게 공지된 것이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 우레아, 아세토니트릴 및 수 용적 %(10% 미만)의 유기 용매가 인체 렐락신 B 사슬을 온화하게 변성시키는 반응 조건을 형성시킨다.
인체 렐락신 A 및 B 사슬을 함께 유리 시스테인 환원 형태로 적절한 배지 수용액 중에 넣는다. 먼저 A 사슬을 첨가하고 이어서, H2O(pH2) 중의 신선한 5mg/ml 원액으로부터 나온 B 사슬을 첨가하여 반응을 「스나이더(Snyder, L.R.) 및 키르클랜드(Kirkland, J.J.)의 Introduction to Modern Liquid Chromato-graphy(1979) 참조」재조합 렐락신을 최대로 형성시키고 이어서, pH 4가 될 때까지 빙초산을 가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 혼합물 16.318g에서 30분 동안 원심 분리시키고 상징액을 제조용 역상 HPLC로 정제하였다. 인체 렐락신을 유용한 수율로 얻기 위하여 결합 반응을 실온에서 행하는 것이 중요한 것으로 나타났다. Synchropak RP-4(4.6×250mm, 300Å) 또는 Vydac RP-4 또는 PR-18(5×50cm, 300Å) 역상 컬럼을 사용하였다. 워터계(water's System)를 사용하여 분석 HPLC르 행하였다. 워터계 또는 Prep 500을 사용하여 제조용 HPLC를 행하였다.
일단 반응 기간이 완료되면, 인체 렐락신 또는 렐락신 유사체 생성물을 단백질 단리 분야에서 인식되고 있는 모든 임의의 다양한 단백질 단리 방법에 의하여 단리시킬 수 있다. 렐락신 정제에 가장 보편적으로 사용되는 기술은 크로마토그래피법이다. 이들은 본 발명의 방법으로부터 인체 렐락신을 회수하는데 용이하게 사용될 수 있다. 이들 기술에는 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC가 포함될 수 있다. 정제 방법의 하나의 예로서, 렐락신 펩티드가 총 0.5-1g인 반응 상층액을 (15-20미크론) Vydac C4 300Å(5×50cm) 컬럼에 넣었다. H2O, 0.1% TFA 중의 20-40%아세토니트릴 구배 용액 (0.5% 양/min)을 사용하여 정제를 행하였다. 유속은 20ml/min이고 1.0분 마다 분획물을 모았다. 이들을 분석용 (5미크로온) Vydac C4 300Å(4.6×250mm) 컬럼 상에 균등 용액 H2O, 0.1% TFA중의 25% 아세토니트릴을 사용하여 모니터하였다. 주생성물을 함유한 분획물을 모으고 다음 분석을 위하여 동결 건조시켰다.
인체 렐락신 및 인체 렐락신 유사체를 생물 정량법으로 시험하였다. 쥐의 치골 유착 분석법(MPS)에서는 찰스 리버 알비노(Charles River albino) CFW 암컷 생주(18-20g)을 사용하였다「J. St. Louis, Can. J. Physiol. Pharmacol., 59, 507-512(1981) 참조」. 에스트라디올 프라이밍(priming)용액은 땅콩유 0.1ml중의 에스트라디올 17β-시클로펜틸 프로피오네이트 5μg이다. 인체 렐락신 투여용액의 농도는 벤조푸르푸린 4B의 1% 수용액 중에서 2.5, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0 및 80.0μg/ml이다. 체중 18-20g의 생쥐를 적어도 6일 동안 격리시키고, 생쥐 각각에서 에스트라디올 프라이밍 용액을 피하내 주사하였다. 만 7일 경과후 생주에게 적합한 인체 렐락신 투여용액 0.2ml를 피하 주사하였다. 인체 렐락신을 주사한지 18 내지 20시간 경과후, 경부 전위에 의하여 생쥐를 치사하였다. 치골간 인대를 노출시키고 마이크로미터를 사용하여 측정하였다.
암컷 쥐(200-300g)로부터 얻은 찰스 리버 알비노 스프라그 돌리(Sprague-Dawley)를 쥐의 자궁 수축분석(RUC)에 사용하였다. 에스트라디올 프라이밍 용액은 땅콩유 0.1ml 중의 에스트라디올 17β-시클로펜틸프로피오네이트 200μg이다. 무균 주사수(Inveddex) 중의 인체 렐락신 원액의 농도는 0.1mg/ml이다. 쥐를 적어도 6일 동안 격리시키고 에스티라디올 프라이밍(priming)을 용액을 피하 주사한다. 에스트라디올 주사 후 16 내지 20시간 사이에 쥐를 이산화탄소로 질식사시켰다. 자궁을 절개 제거하고 각양구조를 쪼개고 1마리당 4조간으로 자궁 측면을 분할하였다. 각각의 조직을 통기시킨 홀만즈 링커(Holmans Rnger) 용액 35ml를 함유한 37℃의 수욕조에 현탁시켰다. 상기 링거 용액을 20%의 염화나트륨이 동물량의 염화칼륨으로 치환된 링거 용액으로 대체하여 조직을 수축시켰다. 일정한 평형에 도달한 후 조에 렐락신 농축액을 첨가한다. 표준 곡선에 있어서, 욕조에 첨가된 돼지 렐락신의 복용량을 욕조 35ml당 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 및 12.8μg이다.
비인간 영장류 임신에 있어서 인체 렐락신에 의한 경부 성숙 유도 작용을 시험하였다. 인체 렐락신을 임신 연령이 130 내지 160일인 레서스 원숭에 대하여 시험하였다. 콜로니 중에서의만기 임신은 168±6일 동안이었다. 이들 동물에게 밧줄 자켓을 입혀 적응시켰다. 밧줄 자켓은 대퇴골 혈관 또는 경동맥 및 내부 경정맥 혈관에 내재하는 카테르와 지속적으로 접촉되었다. 대부분의 동물에 있어서 압력 변환기를 유양막낭 내부에 장치하고 전극을 자궁 표면에 연결하여 자궁 수축 활성을 측정하였다. 앞서 얻은 혈액 시료와 함께 렐락신을 1시간 동안 지속 주입(IV)하고, 상기 주입 도중 및 주입 후 처음 1시간 동안은 15분 간격으로 주입한 다음 24시간 동안 규칙적으로 주입하였다. 렐락신 10μg 내지 100μg을 복용시키고, 경부의 조직, 소멸, 위치, 팽창 및 경부에 대한 태아 위치 및 자궁 저부의 질을 기록하였다. 대부분의 경부에 있어서, 두관찰자들은 각각의 경부를 시험하고 이들을 독립적으로 기록하였다. 대조 동물은 상기와 유사한 방법으로 처리하고 염수를 주입한 원숭이나 군락 중에 유지시켰으나 1주 간격으로 경부 시험을 행하지 않은 원숭이였다.
단백질을 단리시키기 위하여 웨스턴 블로트 및 우레아 폴리아크릴아미드겔 전기영동법을 행하였다. 베테스다 리서치 래보러토리스(Bethesda Research Laboratories)의 분자량 기준에 관한 소책자에 기재된 방법에 의하여 저 분자량 15% 폴리아크릴아미드, 요소, 슬랩(slab)겔을 사용하였다. 상기 방법은 약간 변형시켜 사용하였다. 겔을 4℃의 냉방에서 일정한 100V의 전압에서 15시간 동안 진행시켰다. 시료를 100mM 인산나트륨, pH 7.2, 7M 우레아 0.01% 브로모페놀 블루중에서 제조하여 환원된 샘플 50mM을 신선하게 제조한 DTT 중에서 제조하였다. 펩티드 전량 1-10μg을 사용하기 전에 2-3분 동안 90℃에서 항온 배양시켰다. 겔을 사용하기 전에 90℃에서 2-3분 동안 배양시켰다. 겔을 쿠마시 블루「Coomassie Blue : 겔을 아세트산 10ml 및 25% 에탄올 중의 쿠마시 블루 R-250 90ml(0.25중량%/용적)중에 함침시킴」, 실버 스테인「silver stain : 오클리(Oakley, B.R.)등의 Analytical Biochem. (1980) 105, 361-363 참조」에 의하여 보이게 하고, 0.2% 포름알데히드, 20% 에탄올 및 6.2% 아세트산(이상 모두 용적비임)의 용액 중에서 15-30분 동안 고정 및 탈색시키고 웨스턴 분석법을 행하였다「토우빈(Towbin, H.) 등의 PNAS(1979) 79 : 4350-4354 참조」.
A 및 B 사슬에 대하여 특이적인 항체를 뉴질랜드 화이트 토끼를 황산 알루미늄으로 침전시킨 유리 펩티드 또는 프로인트 보조제「에디(Eddie, L.W.)등의 The Lancet 1, 1344-1346(1986) 참조」중의 유리 펩티드로 면역시켜 제조하였다. 역가는 서로 같았으며 각 면역물로부터 A 사슬에 대하여 bb 역가를 갖고 B 사슬에 대하여 ccc 역가를 갖는 항혈청을 모았다. 이들을 500배로 희석하여 니트로 셀룰로오스 필터에 대하여 2시간 내지 철야 배양시키는데 사용하였다 이어서 세척된 필터를 125-단백질 A에 대하여 2시간 동안 배양시키고 건조시킨 후 X선 필름에 대하여 장치하였다.
본 발명을 설명하기 위해 실시예를 제공한다. 이 실시예는 단지 예시를 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
천연 인체 렐락신 H2(B33 A24)
환원된 렐락신 A 사슬 10mg을 환원된 동결 건조 고상 분말 형태로 반응 혼합물에 첨가하였다. 또, 환원된 렐락신 B 사슬 5.63mg도 동결건조 고상 분말 형태로 첨가하였다.
A 및 B 렐락신 사슬 용액을 상기와 같이 동결 건조 고상 분말 형태로 먼저 렐락신 A 사슬을, 이어서 렐락신 B 사슬을 첨가하여 실온(약 25℃C)에서 10ml 바이알(vial) 중에 결합시켰다. NaOH를 사용하여 pH를 10.5로 조절하였다. 반응을 RP-4 역상 분석용 HPLC로 모니터하여 재조합 렐락신을 최대로 형성시켰다. 천연 H2 B 사슬 형태의 불용성으로 인하여 B 사슬을 A 사슬과 재조합시킬 경우 본 발명의 최종 반응에 따라 다음 조건들을 필요로 하였다. 즉, 0.1M 클리신, pH 10.5, 1mM EDTA, 2.5mM DTT, 3% 1-프로판올, 3% 아세토니트릴 및 1M 우레아, 반응물을 실온에서 28시간 동안 대기에 노출시키면서 교반시켰다. 렐락신 형성반응을 분석용 역상 크로마토그래피로 모니터하고 전술한 바와 같이 종결시켰다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과 렐락신 수율이 1.87mg이거나 B 사슬 혼입이 19.5% 이었다.
혼합물을 제조용 RP-4 역상 HPLC(1×25cm) RP-4 Synchropak 300Å으로 정체하였다. 피이크를 모으고 HPLC 용매로부터 직접 분리하여 사용하였다. 인체 렐락신은 폴리아크릴아미드겔 전기영동법, 아미노산 분석용 HPLC, 아미노 말단 서열화 및 생물정량법에 의하여 분석한 결과 매우 순수한 것으로 나타났다.
실시예 2
인체 렐락신 유사체 H2(B33 A24)BLys4BAla25
환원된 인체 렐락신 A 사슬 200mg을 H2O(pH 2.0) 40ml 중에 용해시켰다. 환원된 인체 렐락신 B 사슬(B33 BLys4BAla25) 100mg을 H2O(pH 2) 20ml 중에 용해시켰다.
A 및 B 사슬 유사체 용액을 먼저 A 사슬을 첨가하고 잉서 전술한 H2O(pH 2)중에 들어있는 신선한 원액으로부터 얻은 변형된 B 사슬을 첨가하여 실온(약 25℃)에서 165ml 바이알 중에 결합시켰다. NaOH을 사용하여 pH를 8.0으로 조절하였다. 반응을 RP-4 역상 HPLC로 모니터하여 결합된 인체 렐락신 유사체를 최대로 형성시켰다. 상기 인체 렐락신을 제조하기 위하여 본 발명에 따른 다음 조건들이 사용되었다. 즉, 반응물 B 0.1M 드리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 2mM DTT, 24℃. 반응물을 대기에 노출시키면서 격렬하게 교반시켰다. 빙초산을 pH 4가 될때까지 첨가하여 결합 반응을 종지시켰다. 혼합물을 제조용 HPLC Vydac C4 300Å(5×50cm)으로 정제하였다. 인체 렐락신 유사체 피이크(용리 용적 : 약 140ml)를 모으고 동결 건조시켜 렐락신 35mg을 회수하거나, B 사슬 20.3%를 혼입시켰다. 인체 렐락신 유사체를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 아미노산 분석법, 아미노 말단 시팍싱, HPLC(제2a도 참조) 및 생물 정량법에 분석한 결과 매우 순수하다는 결론을 얻었다.
실시예 3
인체 렐락신 유사체 H2(B2-33 A24)BLys4BAla25
환원된 인체 렐락신 A 사슬 41.5mg을 H2O(pH 2.0) 8ml 중에 용해시켰다. 아미노 말단부에서 최초 아미노산이 결실된 환원된 인체 렐락신 B 사슬(B2-33 BLys4BAla25) 23mg을 H2O(pH 2) 4ml 중에 용해시켰다.
A 및 B 사슬 유사체 용액을 먼저 A 사슬을 첨가하고 이어서 H2O(pH 2)중애 내재된 상기 신선한 원액으로부터 얻은 변형된 B 사슬을 첨가하여 실온(약 25℃)에서 33ml 바이알 내에서 결합시켰다. NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조절하였다. 반응을 RP-4 역상 HPLC로 모니터하여 결합된 인체 렐락신 유사체를 최대로 형성시켰다. 상기 인체 렐락신을 제조하기 위하여 본 발명에 따른 다음 조건들을 사용하였다. 즉, 반응물 D 0.1M 트리스, pH 8, 25℃, N2로 퍼지시키고 N2분위기 하에서 처음 1-2시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응물을 대기에 노출시키면서 직렬하게 교반시켰다. 빙초산을 pH 4가 될 때까지 첨가하여 결합 반응을 종결시켰다.
혼합물을 제조용 HPLC Vydac C4 300Å(5×80cm)에 의하여 정제하였다. 렐락신 유사체 피이크(용리 용적 : 약 140ml)를 모으고 동결 건조시켜 인체 렐락신 유사체 16mg을 회수하거나, B 사슬 40.3%를 혼입시켰다. 인체 렐락신 유사체를 폴리아미드 겔 전기영동법, 아미노산 분석법, 아미노 말단 시퀀싱, HPLC(제2a도 참조) 및 생체 분석법에 의하여 분석한 결과 매우 순수한 것으로 판단되었다.
실시예 4
인체 렐락신 유사체 H2(B2-33 A24)Apyro-GIuIBLys4BAla25
환원된 인체 렐락신 A 사슬 41.5mg을 H2O(pH 2.0) 8ml 중에 용해시켰다. 아미노 말단부에서 최초 아미노산이 제거된 환원된 인체 렐락신 B 사슬(B2-33 BLys4BAla25) 23mg을 H2O(pH 2) 4ml 중에 용해시켰다.
A 및 B 사슬 유사체 용액을 먼저 A 사슬을 첨가하고 이어서 전술한 H2O(pH 2)중에 내재된 상기 신선한 원액으로부터 얻은 변형된 B 사슬을 첨가하여 실온(약 25℃)에서 33ml 바이알 내에서 결합시켰다. NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조절하였다. 반응을 RP-4 역상 HPLC로 모니터하여 결합된 인체 렐락신 유사체를 최대로 형성시켰다. 상기 인체 렐락신 유사체를 제조하기 위하여 본 발명에 따른 다음 조건들을 사용하였다. 즉, 반응물 D 0.1M 트리스, pH8, 25℃, N2로 퍼지하고 N2분위기 하에서 처음 1-2시간동안 교반시켰다. 이어서, 반응물을 대기에 노출시키면서 격렬하게 교반시켰다. 빙초산을 pH가 4가 될 때까지 첨가하여 결합 반응을 종결시켰다.
혼합물을 제조용 HPLC Vydac C4 300Å(5×80cm)에 의하여 정제하였다. 렐락신 유사체 피이크(용리 용적 : 약 140ml)를 모으고 동결 건조시켜 인체 렐락신 유사체 7.5mg을 회수하거나, B 사슬 18.9%를 혼입시켰다. 인체 렐락신 유사체를 폴리아미드 겔 전기영동법, 아미노산 분석법, 아미노 말단 시팍싱, HPLC(제2a도 참조) 및 생물 정량법에 분석한 결과 매우 순수하다는결론을 얻었다.
실시예 5
인체 렐락신 유사체 H2(B2-33 A24)Apyro-GIuIBLys4BAla25
환원된 인체 렐락신 A 사슬 200mg을 H2O(pH 2.0) 40ml 중에 용해시켰다. 환원된 인체 렐락신 B 사슬(B33 BLys4BAla25) 100mg을 H2O(pH 2) 20ml 중에 용해시켰다.
A 및 B 사슬 유사체 용액을 먼저 A 사슬을 첨가하고 이어서 H2O(pH 2)중에 내재된 상기 신선한 원액으로부터 얻은 변형된 B 사슬을 첨가하여 실온(약 25℃)에서 165ml 바이알 중에 결합시켰다. NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조절하였다. 반응을 RP-4 역상 HPLC로 모니터하여 결합된 인체 렐락신 유사체를 최대로 형성시켰다. 상기 인체 렐락신을 제조하기 위하여 본 발명에 따른 다음 조건들을 사용하였다. 즉, 반응물 B 0.1M 소듐 글리시네이트, pH 8.0, 1mM EDTA, 2mM DTT, 24℃. 반응물을 대기에 노출시키면서 격렬하게 교반시켰다. 빙초산을 pH 4가 될때까지 첨가하여 조합 반응을 종결시켰다.
혼합물을 제조용 HPLC Vydac C4 300Å(5×50cm)으로 정제하였다. 인체 렐락신 유사체 피이크(용리 용적 : 약 140ml)를 모으고 동결 건조시켜 렐락신 16mg을 회수하거나, B 사슬 9.3%를 혼입시켰다. 인체 렐락신 유사체를 폴리아미드 겔 전기영동법, 아미노산 분석법, 아미노 말단 시팍싱, HPLC(제2a도 참조) 및 샘물 정량법에 의하여 분석한 결과 매우 순수한 것으로 판단 되었다.
실시예 6
생물학적 정량법
시험관 내에서 쥐의 자궁 수축성을 생물 분석하여, 전기 자극 수축의 존재하에 인체 렐락신의 평활근 이완능을 측정하였다「J. St. Louis, (1981) Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512 참조」. 쥐의 치골 유착 인대 생체내 분석법에 의하여 렐락신의 연결 조직에 대한 리모델링 효과를 측정하였다「스타이네쯔(Steinetz, B.G.) 등의 Endocrinology 67, 102(1960) 참조」. H2(B2-33 A24), H2(B32 A24)BLys4BAla25, H2(B32 A24)BLys4BAla25, 및 상기 H2(B2-32 A24)BLys4BAla15Apyro-GIuI와 H2(B33 A24)BLys4BAla25Apyro-GIuI의 pryo-Glu 형태의 생물학적 투여 반응을 비교한 결과 MPS 및 RUC 분석법 모두에 있어서 생물학적 활성을 나타내었다. 인체 렐락신 유사체 및 인체 렐락신의 MPS 데이타를 제3도에 나타내었다.
MPS 투여 반응은 천연 인체 렐락신 및 H2(B2-33 A24)BLys4BAla25에 대하여 동등한 효력을 나타내었다. 그러나, 돼지 렐락신은 기타 렐락신과 상이한 반응을 갖는 것으로 나타났다. 인체 렐락신 유사체 및 인체 렐락신 천연 서열 모두는 MPS 생물 분석에 있어서 본질적으로 구별할 수 없다.
허용 가능한 정체된 H2(B33 A24)의 양으로 인하여, 이는 최대 투여량 범위에서 만이 비교될 수 있다. 이러한 결과는 천연 인체 렐락신과 인체 렐락신 유사체 형태의 활성이 유사한 것을 나타낸다. 인체 렐락신 투여 반응 고선의 기울기는 유사체의 것과 상이할 수 있다.
RUC 생물 분석에 있어서 인체 렐락신과 인체 렐락신 유사체의 기울기는 동일하였다.
실시예 7
영장류 임신에 있어서의 인체 렐락신
전술한 방법을 사용하여 임신 연령이 130 내지 160일인 시기 적절한 레서스 원숭이에게 2개의 인체 렐락신 유사체 H2(B33 A24)BLys4BAla25및 H2(B2-33 A24)BLys4BAla25를 시험하였다.
관찰된 파라미터를 변형한 비숍 스코어법에 의하여 각종 투여량을 7회 개별 주입하여 측정한 평균 경부변화량은 3.7 단위였다. 이들 데이타를 제4도에 나타내었으며 여기에서는, 100, 50 및 10μg에서의 개개 주입량의 대한 결과 및 다른 모든 10μg 주입량에 대한 평균치 및 두 종류의 대조 샘플에 대한 결과를 나타내었다. 비주입 대조 원숭이는 포인트 당 2-15의 측정치를 나타내었으며(적어도 4마리의 원숭이를 대표하는 2개의 포인트는 예외임), 평균치를 도시하였다. 일반적으로, 경부는 분만이 진행됨에 따라 낮은 투여량의 렐락신에 대하여 더욱 민감하거나, 또는 이 기간 초기에 렐락신의 반복 투여에 대하여 민감하였다. 높은 투여량(100 또는 50μg)의 렐락신을 투여한 결과 비교적 분만 초기(130-140일)에 있어서도 경부 성숙을 현저하게 변화시킬 수 있었다(1-10 스코어의 변화를 포함함). 경부 변화는 자궁 전기근 수축 활성 또는 자극내 압력의 일정한 임의의 변화와도 무관하게 일어나는 것으로 나타났다. 이들 결과는 결합된 인체 렐락신이 분만의 나머지 1/3기간 동안 경부 성숙에 있어서 매우 효과적인 것임을 나타낸다.
본 발명의 인체 렐락신 및 인체 렐락신 유사체는 인체 렐락신 또는 그의 유사체가 제약상 허용되는 담체와 결합될 수 있도록 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 의하여 체계화 될 수 있다. 인혈청 알부민과 같은 다른 필요한 인체 단백질을 비롯한 적절한 담체 및 그들의 제제는 표준 제제법 논문에 기재되어 있다「마틴(E.W. Martin)의 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조.」
Claims (14)
- A 사슬의 유리된 환원 형태 및 B 사슬의 유리된 환원 형태를 pH 7.0 내지 12의 배지 수용액 중에서 렐락신 B 사슬을 온화하게 변성시키는 조건 하에 혼합하여 인체 렐락신 또는 인체 렐락신 유사체를 형성시키는 것을 특징으로 하는, 인체 렐락신 A 사슬 또는 그의 원사체와 인체 렐락신 B 사슬 또는 그의 유사체를 결합시켜 인체 렐락신 또는 인체 렐락신 유사체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 A 사슬의 유리된 환원 형태 및 인체 렐락신 B 사슬의 유리된 환원 형태 각각이 천연 인체 렐락신(H2)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 A 사슬의 유리된 환원 형태 및 인체 렐락신 B 사슬의 유리된 환원 형태의 각각이 천연 인체 렐락신 (H1)으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 A 사슬의 유리된 환원 형태가 상기 A 사슬의 유사체인 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 B 사슬의 유리된 환원 형태가 상기 B 사슬의 유사체인 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 B 사슬의 유리된 환원 형태가 25개 이상, 초대로 33개의 아미노산을 가지며 사슬 중에서 하나 이상의 메티오닌이 치환된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 B 사슬의 유리된 환원 형태가 사슬의 제4지점에 리신을 가지며 제25지점에 알라닌을 갖는 32개의 아미노산으로 줄어든 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 약 15℃-30℃의 온도에서 혼합시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 실온에서 혼합시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 인체 렐락신 A 사슬의 유리된 환원 형태가 사슬의 제1지점에서 pyro-Glu를 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 변성제의 존재하에 혼합이 일어나는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 변성제가 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 유기 용매 또는 그들의 혼합물인 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 카오트로픽제가 요소 또는 구아니딘 염산염이고 유기 용매가 아세토니트릴, 알콜 또는 디메틸포름아미드인 방법.
- 제13항에 있어서, 카오트로픽제가 요소이고 유기용매가 10용적% 미만인 아세토니트릴 또는 1-프로판올 또는 양자 모두인 방법.
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