JP6289937B2 - リラキシンの製造方法 - Google Patents
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Description
<1> (1)リラキシンの還元型ペプチドA鎖のシステイン残基のスルファニル基(SH)の一部を酸化剤によりジスルフィド結合(S-S)に変換する工程、及び
(2)上記工程(1)で得られたリラキシンのペプチドA鎖と、リラキシンの還元型ペプチドB鎖とを用いて酸化反応を行うことにより、リラキシンペプチドA鎖とリラキシンペプチドB鎖の間のジスルフィド結合を形成する工程
を含む、リラキシンの製造方法。
<2> 工程(1)において、ペプチドA鎖1分子当たり平均0.5〜1.5個のジスルフィド結合(S-S)が分子内に形成される、<1>に記載のリラキシンの製造方法。
<3> 工程(1)で使用する酸化剤が、セレノキシド化合物、ジスルフィド化合物、又は酸素であり、工程(2)で使用する酸化剤が、ジスルフィド化合物又は酸素である、<1>又は<2>に記載のリラキシンの製造方法。
<4> リラキシンがヒト2型リラキシンである、<1>から<3>の何れかに記載のリラキシンの製造方法。
<リラキシン>
本発明で用いるリラキシンの由来は、哺乳類、魚類、鳥類など特に限定されず、例えば、ラット、サメ、鯨、ウシ、ヒツジ、サル又はヒトなどを挙げることができ、好ましくは哺乳類であり、特に好ましくはヒトである。
ヒトリラキシンとしては、ヒト1型(H1)リラキシン、ヒト2型(H2)リラキシン及びヒト3型(H3)リラキシンの何れでもよい。
本発明で言うリラキシンは、リラキシンの生物学的活性を保持する限り、天然に存在するリラキシンの変異体でもよい。
A鎖:Gln-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys(配列番号1)
B鎖:
Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala- Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser(配列番号2)
ペプチドA鎖とペプチドB鎖との間のジスルフィド結合は、A鎖のアミノ酸番号11番目のCys残基のスルファニル基(SH)と、B鎖のアミノ酸番号11番目のCys残基のスルファニル基(SH)との間で形成され、かつA鎖のアミノ酸番号24番目のCys残基のスルファニル基(SH)と、B鎖のアミノ酸番号23番目のCys残基のスルファニル基(SH)との間で形成される。
本発明においては、先ず、リラキシンの還元型ペプチドA鎖のシステイン残基のスルファニル基(SH)の一部を酸化剤によりジスルフィド結合(S-S)に変換する。この工程により、リラキシンA鎖が部分酸化され、リラキシンA鎖に分子内ジスルフィド結合が形成される。本発明においては、溶液中のA鎖に、酸化剤を適量添加し適切な時間放置する。これにより、好ましくは、A鎖1分子当たり平均0.5〜1.5個のジスルフィド結合(S-S)を有する部分酸化A鎖を形成することができる。
上記のようにして得られた部分酸化A鎖を含んだ溶液は、精製することなく、そのままB鎖との反応に用いることができる。
本発明においては、上記した部分酸化A鎖の合成において得られたリラキシンのペプチドA鎖と、リラキシンの還元型ペプチドB鎖とを用いて酸化反応を行うことにより、リラキシンペプチドA鎖とリラキシンペプチドB鎖の間のジスルフィド結合を形成する。部分酸化A鎖溶液とB鎖溶液を混合し、スルファニル基の酸化反応によりジスルフィド結合を形成させることができる。この反応の酸化剤としては、本明細書中上記した一般式R1SSR2と表されるジスルフィド、又は空気(O2)等の弱い酸化剤を用いることができる。
酸化剤としてジチオスレイトール酸化体(DTTox)を用いる場合は、酸化剤を約100当量用い、窒素気流下、上記の空気酸化と同様の反応条件を適用できる。
本発明の製造方法で得られた粗リラキシンは、反応停止剤(スルファニル基ブロック試剤)を加えて酸化反応を停止させた後、弱酸性として、逆相カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により分離精製することができる。本明細書の実施例で精製したヒトリラキシンは、ESI-TOF-MS分析の結果、分子イオンピーク(M+4H+)がm/z1496.1に観測された。この値は、ヒト2型リラキシンの理論分子量5980.6と一致しており、ヒトリラキシンA鎖とB鎖が1:1で結合した生成物であることが確認された。また、リラキシンの同定は、市販品を標準物質として、HPLCによる溶出時間の比較(図3)により行うことができる。
略語の定義を下に示す。
HBTU: ヘキサフルオロリン酸o-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’N’-テトラメチルウロニウム
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
MALDI TOF-MS: マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法
ESI-TOF-MS:エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法
リラキシンA鎖ならびにリラキシンB鎖はペプチド固相合成法により、ポリスチレンビーズ上に合成した。これを担体から切り出すために、切り出し試薬のトリフルオロ酢酸を用いて、すべてのアミノ酸の保護基をはずし、逆相液体グロマトグラフィーで精製し、下記のヒト2型リラキシンのペプチド配列を有するA鎖ならびにB鎖を得た。本実施例ではすべての保護基を同時に簡便に脱離できるトリチル基(Trt基)を使用した。この方法で製造される保護基を取り除いたリラキシンA鎖及びリラキシンB鎖を、それぞれリラキシンA鎖還元体、リラキシンB鎖還元体と呼ぶ。
B鎖:Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala- Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser(配列番号2)
合成はバイオタージ社のSyrowaveペプチド自動固相合成装置を用いて、0.20mmol スケールで合成した。アミノ酸はFmoc-アミノ酸[Fmoc-Gln(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Val−OH, Fmoc-Gly−OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH]を使用し、樹脂としてH-Cys(Trt)-Trt(2-Cl) -Alko-PEG -Resinを使用し、20% ピペリジン/N-メチル-2-ピロリドンを脱Fmoc試薬として、HBTU/HOBt(N,N-ジメチルホルムアミド溶液で溶解した)を活性縮合剤として用いて、カップリングを繰り返し合成した。手動固相合成容器に移し、ジクロロメタンで数回洗浄後、デシケーターにて一晩減圧乾燥させた。乾燥後、樹脂よりペプチドの切断および側鎖の最終脱保護のために、切り出し試薬 [トリフルオロ酢酸 (8.25ml ) / 水 (0.5ml ) / 1,2-エタンジチオール (0.25ml) /フェノール (0.75g) / チオアニソール (0.5ml ) ] を加えて2時間撹拌した。溶液をろ過し、ろ液をナスフラスコに移して、窒素ガスで濃縮した。冷ジエチルエーテルを用いて結晶化させ、10回のデカンデーション後にこれを濾取し、粗ペプチドを得た(240 mg)。上記操作は、文献(非特許文献6)に記載の方法を参考にして行った。
B鎖の合成はアプライドバイオシステム社モデル433Aペプチド自動固相合成装置を用いて、0.25mmol スケールで合成した。アミノ酸はFmoc-アミノ酸[Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH]を使用し、樹脂としてFmoc-Ser(tBu) -Alko-PEG-Resinを使用し、20% ピペリジン/N-メチル-2-ピロリドンを脱Fmoc試薬として、HBTU/HOBt (N,N-ジメチルホルムアミド溶液で溶解した)を活性縮合剤として用いて、カップリングを繰り返し合成した。手動固相合成容器に移し、ジクロロメタンで数回洗浄後、デシケーターにて一晩減圧乾燥させた。乾燥後、樹脂よりペプチドの切断および側鎖の最終脱保護のために、切り出し試薬 [トリフルオロ酢酸 (8.25ml ) / 水 (0.5ml ) / 1, 2-エタンジチオール (0.25ml) /フェノール (0.75g) / チオアニソール (0.5ml ) ]を加えて2時間撹拌した。溶液をろ過し、ろ液をナスフラスコに移して、窒素ガスで濃縮した。冷ジエチルエーテルを用いて結晶化させ、10回のデカンデーション後にこれを濾取し、粗ペプチドを得た(294 mg)。
リラキシン合成条件:pH 10, 温度-7℃ , DHSox 1当量, 尿素濃度0.9 M, A鎖濃度154μM, B鎖濃度154μM
緩衝溶液は全て、あらかじめ窒素ガスで十分にパージしたものを用いた。
参考例1で合成したヒトリラキシンA鎖還元体約0.6 mgを、pHを10に調整した3 M尿素を含有する25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液70 μLに加え、完全に溶解させた。これにpH 10の25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液350 μLを加えて6倍に希釈した。この溶液中のヒトリラキシンA鎖還元体の濃度を、ヒトリラキシンA鎖還元体のモル吸光係数ε275 (1650 cm-1M-1)を用いて、次のようにして決定した。すなわち、6倍に希釈した溶液から正確に10 μLを分け取り、これに0.5 M尿素を含有するpH 10の25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液990 μLを加え、紫外可視分光光度計(島津製作所、UV-1700)を用いて波長275 nmにおける吸光度を測定したところ、その値は0.0089であった。これより、溶液中のヒトリラキシンA鎖還元体の濃度は540 μMと決定された。
リラキシン合成条件: pH 10, 温度15℃, DHSox 1当量, 尿素濃度0.9 M, A鎖濃度156 μM, B鎖濃度132 μM
緩衝溶液は全て、あらかじめ窒素ガスで十分にパージしたものを用いた。
参考例1で合成したヒトリラキシンA鎖還元体約0.2 mgを、pHを10に調整した3 M尿素を含有する25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液15 μLに加え、完全に溶解させた。これにpH 10の25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液75 μLを加えて6倍に希釈した。この溶液中のヒトリラキシンA鎖還元体の濃度を、実施例1と同様の方法で求めたところ、ヒトリラキシンA鎖還元体の濃度は715 μMであった。
一方、参考例1で合成したヒトリラキシンB鎖還元体約0.1 mgを、pHを10に調整した6 M尿素を含有する25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液30 μLに加え、完全に溶解させた。これにpH 10の25 mM炭酸水素ナトリウム緩衝溶液30 μLを加えて2倍に希釈した。この溶液中のヒトリラキシンB鎖還元体の濃度を、実施例1と同様の方法で求めたところ、ヒトリラキシンB鎖還元体の濃度は527 μMと決定された。
リラキシン合成条件:pH 10, 温度4℃, 空気あるいはジチオスレイトールによる酸化条件, 尿素濃度0.88 M, A鎖濃度85 μM, B鎖濃度22 μM
緩衝溶液は全て、あらかじめ窒素ガスで十分にパージしたものを用いた。
Claims (4)
- (1)リラキシンの還元型ペプチドA鎖のシステイン残基のスルファニル基(SH)の一部を酸化剤によりジスルフィド結合(S-S)に変換する工程、及び
(2)上記工程(1)で得られたリラキシンのペプチドA鎖と、リラキシンの還元型ペプチドB鎖とを用いて酸化反応を行うことにより、リラキシンペプチドA鎖とリラキシンペプチドB鎖の間のジスルフィド結合を形成する工程
を含む、リラキシンの製造方法。 - 工程(1)において、ペプチドA鎖1分子当たり平均0.5〜1.5個のジスルフィド結合(S-S)が分子内に形成される、請求項1に記載のリラキシンの製造方法。
- 工程(1)で使用する酸化剤が、セレノキシド化合物、ジスルフィド化合物、又は酸素であり、工程(2)で使用する酸化剤が、ジスルフィド化合物又は酸素である、請求項1又は2に記載のリラキシンの製造方法。
- リラキシンがヒト2型リラキシンである、請求項1から3の何れか1項に記載のリラキシンの製造方法。
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