CN104428314A - 使用侧链锚接赖氨酸的胰岛素的固相肽合成 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了使用用于固相和液相肽合成的有效方法来制备包括胰岛素和胰岛素衍生物在内的肽。
Description
背景技术
胰岛素以及胰岛素的衍生物和类似物是通过A-链和B-链的固相合成以及双氧化的A-链与线性B-链的随机氧化而高效地合成的。赖氨酸与含赖氨酸的肽通过赖氨酸侧链而附着在酸不稳定的树脂和热不稳定的树脂上。这种方法允许进行多种肽和修饰肽的固相合成。
胰岛素是小型蛋白质，其由2条肽链(A-链和B-链)组成，这2条肽链通过2个分子间二硫键连接在一起。此外，A-链包含其他的分子内二硫键。胰岛素及其衍生物是用于治疗糖尿病的最重要的药品。胰岛素的药物性质可以通过2条肽链的微小修饰而被改变。因此，已经研发多种胰岛素衍生物(图1)，并商业化，例如地特胰岛素(Levemir)、甘精胰岛素(Lantus)、门冬胰岛素(Novolog)、赖脯胰岛素(Humalog)和赖谷胰岛素(Apidra)。
使用仿生方法制备胰岛素是本领域已知的。P.E.Oyer,S.Cho,J.D.Peterson,D.F.Steiner,J.Biol.Chem.1971,246,1375-1386；W.Kemmler,J.D.Peterson,D.F.Steiner,J.Biol.Chem.1971,246,6786-6791。这些方法通过重组DNA技术来制备胰岛素，并且线性的胰岛素原(proinsulin)产物通过氧化而折叠。最终，使用酶除去胰岛素原的中间C-肽，并释放最终的胰岛素。
到目前为止，尽管Zahn,Katsogiannis,Kisho,Kent,the ShanghaiInstitute,Ciba Geigy,Eli Lilly,Novo Nordisc,Sanofi-Aventis等的研究作了很多努力，但是对于胰岛素而言，仍未研发出化学的经济可行的途径。这些努力均不能以合理的产率和成本生产合成的胰岛素。
目前使用的4种方法为：1)将线性A和B链随机混合，并将它们空气氧化；2)将在半胱氨酸残基的巯基位置处包含磺酸基的A链与磺化的B-链混合；3)在A链和B链之间定点构建3个二硫键；以及4)其中胰岛素原中束缚C肽的功能被Glu(A14)和Thr(B30)的侧链之间的酯键置换的合成方法。该方法需要使用液体氟化氢进行2次反应，以及9次层析纯化，但是该方法是目前被认为最有效的化学合成方法。
在胰岛素及其类似物的化学合成中遭遇的主要困难是：a)A-链和中间保护肽的不溶性，这阻碍了有效的逐步固相合成和纯化；b)使用Fmoc-氨基酸难以合成胰岛素B-链与位置His(BlO)、Leu(Bl1)和Val(B12)处难以进行偶联反应有关[B.Due Larsen和A.Holm J.Peptide Res.1998,52,470-476]；以及c)在链的结合时获得的产率低。例如方法2(上述)仅得到产率为7％的结合的A和B链。
发明内容
在一个实施方案中，本申请公开了有效方法来克服上述问题，由此能够化学合成胰岛素、其衍生物和其类似物。本申请公开了：1)A链的合成；2)B链的合成；以及3)双氧化的A链与B链的结合。
在一个实施方案中，提供了式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物，其中：
W为对于赖氨酸或赖氨酸衍生物由树脂上的切割，酸敏感或热敏感的树脂或对于酸和热均敏感的树脂；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
其中Pr1为-OH保护基，Pr2和PR3各自独立地为氢或胍保护基；以及
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；以及包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基时，则P并非为氢或氨基保护基。
如本文所用，短语“包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基”是指在肽残基包含一个或多个氨基酸的情况下，氨基酸的每条侧链都可以独立地是无保护的，或者可以独立地被保护基保护，并且羧基可以为游离羧基(-COOH)或受保护的羧基。
在上述的一个方面中，树脂选自：2-氯三苯甲基树脂、4-甲氧基三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂、三-烷氧二苯基树脂、四-烷氧二苯基树脂、苄基树脂、甲氧苄基树脂、二甲氧苄基树脂和三甲氧苄基树脂。在另一个方面中，树脂W-具有式IIIa、IIIb、IIIc和IIId：
其中：n为0、1、2或3；R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组中，前体条件是在式Ib、Ic和Id的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；R2为所述的树脂的固相；并且Z为键或-C(＝O)-。
在另一个方面中，具有本文所述的SEQ ID NO的赖氨酸-树脂缀合物包含含有赖氨酸或赖氨酸衍生物(其附着在树脂上)的肽残基，并且赖氨酸或赖氨酸衍生物可以位于肽残基的C-末端、N-末端或内部位置中。在上述缀合物的另一个方面中，P选自由以下构成的组：叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基-羰基(羧基苄基或Z)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-l-亚基)-乙基(Dde)、2-硝基苯基硫基(Nps)和烯丙氧基羰基(alloc)。在一个方面中，P选自：乙酰基(Ac)、Fmoc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-l-羧基、苄氧基羰基、氧蒽基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、三甲苯基-2-磺酰基(Mts)、4,4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(McBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶磺酸苯基(Npys)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-亚基)乙基(Dde)、2,6-二氯苄基(2,6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、叔丁氧基羰基(tBoc)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
如本文所用，“肽残基”或“肽片段”为具有一个或多个氨基酸的肽。附着在羧基末端(例如式I所示的赖氨酸-树脂缀合物的末端)上的肽残基可以为具有α-氨基保护基和/或羧基保护基(即，保护的或部分保护的)的单一氨基酸，或者所述的氨基酸缺乏氨基保护基或缺乏羧基保护基(即，未保护的或部分保护的)，或者所述的肽残基可以是二肽或多肽，其中在所述的肽中的每个氨基酸可以是保护的、部分保护的或未保护的。
在上述的一个方面中，R为-OH或者为选自由以下构成的组中的肽残基：脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)和苏氨酸-精氨酸-精氨酸(Thr-Arg-Arg)，其中每个氨基酸是保护的、部分保护的或未保护的。在上述的一个方面中，-OH保护基Pr1为烷基或苄基类型的保护基，例如叔丁基、4-甲氧基苄基等。在另一个方面中，Pr2和Pr3独立地为胍保护基、C1-6烷氧基羰基或芳基磺酰基类型，例如Pbf、Pmc等。
一种用于固相合成保护的、部分保护的或未保护的包含1至200个氨基酸的肽残基的方法，该方法包括：
a)制备式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物，其中：
W为对于赖氨酸或赖氨酸衍生物由树脂上的切割，酸敏感或热敏感的树脂或对酸和热均敏感的树脂；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
其中Pr1为-OH保护基，Pr2和PR3各自独立地为氢或胍保护基；以及
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；以及包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基时，则P并非为氢或氨基保护基；
b)将式I所示的其中R为-OH的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的C-末端肽偶联，从而形成式Ia所示的缀合物：
其中R1选自由以下构成的组：-Pro-OH，-Pro-NH2，-Pro-O-C1-6烷基，-Pro-O-C2-6烯基，-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，Thr(Pr1)，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，-Thr(Pr1)-OH，-Thr(Prl)-NH2，-Thr(Prl)-O-C1-6烷基，-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，或者包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；或者
b')将下列式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸的N-末端肽偶联，从而形成式Ia所示的缀合物，在所述式I中，P为H并且R1为羧基保护基或包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的羧基的氨基酸的C-末端肽残基，其中该肽残基在赖氨酸或赖氨酸残基的α-氨基包含C-末端和N-末端，其中所述的N-末端肽包含C-末端和N-末端，
其中R1和P如上文所定义；以及
c)任选地除去保护基Pr1、Pr2或Pr3，或者所述的C-末端肽残基处的保护基，从而形成其中Pr1、Pr2和Pr3为氢，或者其中所述的C-末端为游离的羧基的式Ia所示的脱保护的缀合物；以及
d)任选地由所述的树脂W上切割肽残基。
在上述的一个方面中，1至200个氨基酸(其包含任选地保护的侧链，例如Fmoc)的氨基保护基通过使用仲胺(例如哌啶类或二乙胺)处理而被除去，并且游离胺使用诸如DCC、DIG或EDAC之类的偶联剂，任选地在添加剂(选自：HOBt、HOSu、苯硫酚或五氟苯酚)存在下，与任选地保护的氨基酸或包含1至200个氨基酸的任选地保护的肽进一步偶联。
在上述方法的另一个方面中，树脂W具有式IIIa、IIIb、IIIc和IIId，其中变量n、R1、R2、R3和Z如上文所定义。
在上述的另一个方面中，赖氨酸或赖氨酸衍生物选自：SEQ IDNO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
在上述方法的另一个方面中，
对于其中式I的R为-OH的步骤b)而言，通过活化所述的C-末端游离的羧基并将所述的活化的羧基与C-末端肽缩合将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个氨基酸的C-末端肽偶联，从而形成所述的式Ia所示的缀合物，其中R1为包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的C-末端肽残基；或者
对于其中将所述的赖氨酸或赖氨酸衍生物的α-氨基偶联的步骤b')而言，通过使用下列活化基团来活化N-末端游离的羧基从而形成活化的羧基，并缩合N-末端肽的活化羧基将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个氨基酸的N-末端肽残基偶联，从而形成所述的式Ia所示的缀合物，其中P为包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的N-末端肽残基，其中所述活化基团选自由DCC、PFPOH、DMAP、PFP-三氟乙酸酯、吡啶、PFPOH、EDC、DMA、EDC、HOBt、FDPP、DIEA、DMF、EDC、HOAt、HBTU、HATU、HATU、HOAt、Ac20、DMAP、Ac2O、吡啶、DPPA、FDPP、DCC、HOAt、DCC、HOBt、DIC、HOBt和EDC-HC1构成的组。
如式I所示的化合物中所用，短语“R为包含1-200个氨基酸的C-末端肽残基”是指1-200个氨基酸附着在赖氨酸或赖氨酸衍生物的C-末端上。相似地，短语“包含1-200个氨基酸的N-末端肽残基”是指1-200个氨基酸附着在赖氨酸或赖氨酸衍生物的N-末端(或α-氨基)上。在一个方面中，C-末端游离羧基的活化是在选自由DCM、DMF、NMP、DMSO或它们的混合物构成的组中的溶剂来进行的。
在上述方法的另一个方面中，其中在步骤b)或b')之后，所述方法还包括：d)通过下列步骤将所述的肽残基由所述的树脂W上切下：使用有机酸和溶剂的混合物在弱酸性条件下与式Ia所示的树脂结合的肽缀合物接触，或者将所述的树脂结合的肽加热至升高的温度，或者既使用所述的有机酸与溶剂的混合物又将所述的树脂结合的肽在升高的温度下加热足以将包含具有游离氨基的赖氨酸的肽由所述的树脂W上切下的时间；e)使用R'CO-X将所述的包含赖氨酸的肽的游离氨基酰化，从而形成N-酰化的肽衍生物，其中X为Cl、Br、CH3CO-，并且R'选自CH3CO-或包含1至200个氨基酸的C-末端羧基活化的肽残基；以及h)分离式II所示的N-酰化的肽衍生物：
在上述方法的另一方面中，所述的酰基(R'CO-)衍生自：肉豆蔻酸的卤化物或酸酐、编码或非编码的氨基酸卤化物、Fmoc-Glu-OtBu和tBuO-CO-(CH2)14-CO-NH-Glu-OtBu。在上述方法的另一方面中，通过下列步骤将包含C-末端游离羧基的式Ia所示的赖氨酸-树脂缀合物进一步转化成相应的烷基羧基酯：在碱存在的条件下将所述的羧基与选自由二苯基甲基氯化物、4-甲氧基二苯基甲基氯化物、4-甲基二苯基甲基氯化物、三苯甲基氯化物、2-氯三苯甲基氯化物、4-甲基三苯甲基氯化物、三甲基甲硅烷基氯化物和三乙基甲硅烷基氯化物构成的组中的烷基卤化物接触，或者活化所述的C-末端羧基并与选自Rink-酰胺MBHA或Rink-酰胺AM树脂中的氨基树脂反应。在上述方法的一方面中，包含1至200个氨基酸的C-末端肽或所述的包含1至200个氨基酸的N-末端肽残基选自保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物，或者为选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36中的肽残基。
在所述方法的另一个方面中，酰基(R'CO-)衍生自：肉豆蔻酸的卤化物或酸酐、编码或非编码的氨基酸卤化物、Fmoc-Glu-OtBu和tBuO-CO-(CH2)14-CO-NH-Glu-OtBu。在上述的另一个方面中，通过下列步骤将包含C-末端游离羧基的式Ia所示的赖氨酸-树脂缀合物进一步转化成相应的烷基羧基酯：在碱存在的条件下将羧基与选自由二苯基甲基氯化物、4-甲氧基二苯基甲基氯化物、4-甲基二苯基甲基氯化物、三苯甲基氯化物、2-氯三苯甲基氯化物、4-甲基三苯甲基氯化物、三甲基甲硅烷基氯化物和三乙基甲硅烷基氯化物构成的组中的烷基卤化物接触，或者活化C-末端羧基并与选自Rink-酰胺MBHA或Rink-酰胺AM树脂中的氨基树脂反。在一个变型中，所述的碱为二异丙基乙胺。Rink-酰胺MBHA或Rink-酰胺AM树脂是本领域已知的。参见Boussard,Cyrille et al.European Journal of MedicinalChemistry,37(11),2002,pp.883-890；Rink-酰胺AM树脂还称为4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基氨基甲基树脂。
在上述的另一个方面中，所述的方法还包括：同时将肽氧化以及将肽由SEQ ID NO:9所示的A-链肽-树脂的树脂上切割下来，然后脱保护，从而形成SEQ ID NO:14所示的双氧化的脱保护的双氧化胰岛素A-链；以及将SEQ ID NO:14所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ ID NO:27所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:6所示的胰岛素类似物；或者将SEQ ID NO:14所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ ID NO:29所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:8所示的胰岛素类似物；或者将SEQ ID NO:36所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ ID NO:23所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:4所示的胰岛素类似物。
在另一个方面中，提供了固相合成保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物的方法，该方法包括：
制备包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物的式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其中：
W为式IIIa、IIIb、IIIc或IIId所示的树脂：
其中n、R1、R2、R3和Z如上文所示；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；
其中Pr1为氢或-OH保护基，并且Pr2和Pr3各自独立地为胍或胍保护基；
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基构成的组时，则P并非为氢或氨基保护基；
将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与保护的、部分保护的或未保护的肽残基Ib偶联，从而形成所述的保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物，其中在式I中，R选自-OH、羧基保护基和包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基，并且其中包含1至200个氨基酸的肽残基与所述的肽残基Ib一起包含胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物。
在所述的方法的一个方面中，肽残基Ib为本申请(所公开的肽残基序列特征，其包含保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物的序列特征。在另一个方面中，保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自：des-Thr(30)胰岛素B-链类似物、地特胰岛素的B-链(insulin levemir)、门冬胰岛素、赖脯胰岛素(Humalog)、甘精胰岛素(Lantus)、门冬胰岛素(Novolog)以及它们的类似物或衍生物。
在上述方法的一个方面中，所述的树脂为2-氯三苯甲基树脂。在上述的另一个方面中，P选自：叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基-羰基(羧基苄基或Z)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧亚环己-l-基)-乙基(Dde)、2-硝基苯基硫基(Nps)和烯丙氧基羰基(alloc)。在所述的方法的另一个方面中，部分保护的、未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自SEQ ID NO:4、5、6、7和8、以及它们的类似物或衍生物；以及通过下列步骤进一步切割树脂结合的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物：使用有机酸和醇溶剂的混合物在弱酸性条件下，与树脂结合的肽接触，或者通过将树脂结合的肽加热至升高的温度，或者既使用有机酸与醇溶剂的混合物又将树脂结合的肽在升高的温度下加热足以将包含胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物由树脂上切下的时间。在所述的方法的另一个方面中，有机酸选自三氟乙酸、乙酸和它们的混合物，醇溶剂选自三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇和它们的混合物，并使用微波来加热树脂结合的肽。在所述的方法的另一个方面中，部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自：N-酰化的衍生物、聚乙二醇化的衍生物、生物素化的衍生物、包含发色团的衍生物、以及包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基和它们的混合物的肽残基。
在另一个实施方案中，提供了固相合成保护的、部分保护的或未保护的胰岛素A-链或胰岛素A-链衍生物的方法，该方法包括：
制备包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物的赖氨酸-树脂缀合物，其中所述的肽-树脂缀合物具有下式I，其中：
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；
其中树脂W具有式IIIa、IIIb、IIIc或IIId：
其中：N、R1、R2、R3和Z如上所定义；并且其中所述的肽残基是保护的、部分保护的或未保护的胰岛素A-链或胰岛素A-链衍生物，或者为选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15或它们的混合物中的肽残基；
所述的方法包括：将所述的肽-树脂缀合物与氧化剂接触，从而同时氧化所述的胰岛素A-链并将所述的肽残基由所述的树脂上切割下来；将保护的双氧化胰岛素A-链整体脱保护；以及纯化未保护的双氧化胰岛素A-链。在一个方面中，所述方法还包括将所述的未保护的双氧化胰岛素A-链与选自SEQ ID NO:3、23、27、29和34中的胰岛素B-链肽接触，从而形成动物或人的胰岛素或胰岛素类似物。在所述方法的另一个方面中，所述的动物或人的胰岛素或胰岛素类似物选自：SEQ ID NO:1、4、5、6、7和8，以及赖谷胰岛素(Adipra)。
在另一个实施方案中，还提供了一种用于制备选自SEQ ID NO:3、23、27、29和34中的胰岛素B-链肽的方法，包括：
通过下列步骤由式IV所示的肽-树脂缀合物上切割肽：
W—AA1—AAm IV
将所述肽-树脂缀合物与有机酸和溶剂的混合物接触；或者将所述的肽-树脂加热至升高的温度；或者既使用有机酸和溶剂的混合物又将所述的树脂结合的肽在升高的温度下加热至足以将肽残基由树脂W上切下的时间，
其中：
W为式IIIa、IIIb、IIIc或IIId所示的树脂，
其中：n、R1、R2、R3和Z如上所定义，其中
AA1为：
A)通过下列基团附着在W上的包含赖氨酸残基或其衍生物的第一肽残基：
i)赖氨酸或赖氨酸衍生物的氨基侧链；
ii)赖氨酸或赖氨酸衍生物的羧基；或
iii)N-末端氨基；或者
B)通过下列基团附着在W上的非赖氨酸肽残基：
i)非赖氨酸肽残基的羧基；
ii)非赖氨酸肽残基的N-末端氨基；并且
AAm为第二至第m残基，其中m为1-200的整数。在所述的方法的一个方面中，肽-树脂缀合物选自SEQ ID NO:16、17、18、20、22和24。在所述的方法的另一个方面中，肽-树脂缀合物选自SEQ ID NO.16或17，其进一步脱保护从而形成SEQ ID NO:3所示的人B-链。在上述方法的另一个方面中，有机酸选自三氟乙酸、乙酸和它们的混合物，醇溶剂选自三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇和它们的混合物，并在大约30℃至50℃下加热肽-树脂缀合物。在上述方法的另一个方面中，通过在醇溶剂中，间断地加入大约0.01重量/重量％、0.02重量/重量％、0.03重量/重量％、0.05重量/重量％、0.1重量/重量％、0.2重量/重量％、0.5重量/重量％、1.0重量/重量％、2.0重量/重量％、3.0重量/重量％、4.0重量/重量％或大约5.0重量/重量％有机酸的条件下，在升高的温度下加热树脂结合的肽来切割该树脂结合的肽。可以按照大约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或大约1小时的间隔加入酸。在所述的方法的另一个方面中，在大约25-30℃、30-35℃或35-40℃的升高的温度下加热树脂结合的肽。在所述的方法的另一个方面中，可以使用肽合成中可加速偶联反应的添加剂来增强切割，其中所述的添加剂选自羟基苯并三唑、羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚和苯硫酚。在另一个方面中，部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自：N-酰化的衍生物、聚乙二醇化的衍生物、生物素化的衍生物、包含发色团的衍生物，以及包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基和它们的混合物的肽残基。在上述的另一个方面中，所述的衍生物为胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物的变体。
通常，当由树脂上切割肽时，可以通过液相肽合成、固相肽合成或者液相与固相肽合成的组合(也称为相变合成)来实施进一步的肽合成。此外，由于赖氨酸具有胺侧链、α-氨基和羧基，可以利用赖氨酸(其可以通过侧链或羧基附着在树脂上)进行肽偶联反应，所以对于肽合成(固相或液相)可以具有多种排列，从而制备线性和/或枝化的肽。换言之，当包含赖氨酸的肽由树脂上切下时，进一步的液相肽合成可以包括以下步骤的多种组合：1)保护赖氨酸侧链的游离氨基；2)脱保护C-末端羧基，并将游离的羧基与氨基酸或肽片段或其衍生物偶联；3)脱保护C-末端羧基，将游离的羧基附着在树脂上，并通过与N-末端形成肽偶联或与赖氨酸的氨基侧链形成肽偶联(制备枝化的肽)来进一步实施固相肽合成；4)脱保护N-末端氨基(α-氨基)，并将游离的胺与氨基酸或肽片段偶联；以及5)它们的组合。
定义：
如本文所用，“酸敏感的”树脂、“热敏感的”树脂或“对酸和热均敏感的”树脂是指在弱酸性条件下、在相对低的温度下或在弱酸性且相对低的温度下由赖氨酸或赖氨酸衍生物上解离的树脂，如赖氨酸树脂-缀合物中的树脂，并且该树脂在以下条件下解离：不会产生不期望的副反应，所选保护基发生不期望的脱保护，整体脱保护，或者赖氨酸、赖氨酸衍生物或肽的外消旋化。
如本文所用，“枝化的肽”是指可以根据本发明所述的方法来制备的肽，其中氨基酸或肽残基可以附着在1)赖氨酸基团的氨基侧链上、2)C-末端羧基上和3)N-末端氨基上。
如本文所用，“整体脱保护”是指在某些脱保护的条件下，例如强酸性条件下，所述的条件使得赖氨酸衍生物或肽的所有保护基由树脂上脱保护。在一个方面中，包含1至200个任选地保护的氨基酸的肽残基包含氨基酸上的氨基保护基P，其中氨基酸残基上的每个P均为氢(即，未保护的)，或者独立地选自：叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基-羰基(羧基苄基或Z)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-l-亚基)-乙基(Dde)、2-硝基苯基硫基(Nps)和烯丙氧基羰基(alloc)。
如本文所用，“任选地保护的”是指肽残基包含单一氨基酸或肽残基，并且其中肽残基的每个氨基和每个羧基都可以独立地被保护或脱保护。在一个方面中，所述的肽残基或肽片段包含至少2个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基或至少20个氨基酸残基。
如本文所用，“羧基保护基”(例如如式I所示的化合物所代表)是指附着在-C(O)-基上的基团，包含-C(O)-基的氧，并且还包括本领域已知的及本文所述的保护基。合适的保护基的综合性列表在T.W.Greene,Protecting Groups in Organic Synthesis,3rd edition,JohnWiley & Sons,Inc.1999中找到。
如本文所用，“变体”是指与天然肽或衍生物基本同源的、但是具有一个或多个不同于(例如一个或多个删除、插入或置换)天然肽或肽衍生物(作为基础)的氨基酸序列的肽。氨基酸序列的插入包含长度为1个残基至包含10个、20个、30个或更多残基的肽的氨基-和/或羧基-末端的融合，以及在序列内插入单一的或多个氨基酸残基。序列内插入(即，在所需的多肽序列内插入)通常可以为大约1至10个残基、1至5个或者1至3个残基。变体可以包含保守取代的序列，其是指给定的氨基酸残基被具有相似的生理化学特征的残基所置换。参见Zubay,Biochemistry,Addison-Wesley Pub.Co.,(1983)。已被大家接受的是，在不改变蛋白质或肽的确认或功能的条件下，通常可以在蛋白质或肽中进行某些氨基酸的置换，即，“保守”氨基酸置换。此类改变包含异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一者置换其他这些氨基酸的任何氨基酸；天冬氨酸(D)置换谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)置换天冬酰氨(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)置换苏氨酸(T)，反之亦然。变体具有与参照序列至少90％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，至少95％、至少97％、至少98％、或者至少99％的氨基酸序列一致性。变体将保留衍生该变体的母体的主要功能。
附图简要说明
图1示出了人胰岛素和多种衍生物的序列。
图2为用于固相合成双氧化人胰岛素A-链异构体的代表性方法的示意图。
图3为示出使用CTC-树脂逐步固相合成胰岛素B-链的代表性示意图。
图4为示出使用通过Lys侧链附着在MMT-树脂上的Fmoc-Lys-Thr(tBu)-OH来合成胰岛素B-链的代表性示意图。
图5为固相合成用于甘精胰岛素B-链的Fmoc-Lys-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH(SEQ ID NO:19)的代表性示意图。
图6为使用通过Lys侧链附着在MMT-树脂上的Fmoc-Lys-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH来合成甘精胰岛素B-链的代表性示意图。
图7为使用N-末端保护并且使用通过侧链附着在MMT-树脂上的Fmoc-Lys来合成地特胰岛素B-链的代表性示意图。
图8使用通过侧链附着在MMT-树脂上的Fmoc-Lys来合成德谷胰岛素B-链的代表性示意图。
图9为使用N-末端保护来合成德谷胰岛素B-链的代表性示意图。
图10为合成生物素化的胰岛素B-链的代表性示意图。
图11为通过链结合来合成胰岛素和胰岛素类似物(赖脯胰岛素和门冬胰岛素)的代表性示意图。
图12为胰岛素类似物(地特胰岛素和德谷胰岛素)的链结合的代表性示意图。
图13为甘精胰岛素类似物的链结合的代表性示意图。
具体实施方式
A链的合成
在一个实施方案中，提供了用于固相合成胰岛素双氧化A-链的方法，其中保护的肽由树脂上的切割及其氧化同时并在短时间内进行。在这种方法中，克服了由于A-链的不溶解性所产生的合成问题。在一个方面中，通过使用酸不稳定的树脂来实施固相合成而达到上述目的。此类树脂包含三苯甲基、二苯基甲基和苄基类型。使用肽的固相合成的标准方案(例如使用Fmoc-氨基酸)来组装肽链(图2)。可以在弱酸性条件下，例如在卤化烃条件下，使用碘来进行树脂结合的肽的氧化。在这些条件下，保护的肽由树脂上切下与氧化反应同时进行，并且A-链的沉淀被避免。在一个方面中，三氟乙酸或乙酸在二氯甲烷中形成的溶液(其中混合有醇，例如三氟乙醇或甲醇)用作用于同时氧化和由树脂上切割的溶剂。在一个实施方案中，2-氯三苯甲基树脂用于保护的A-链的固相链组装。通过将A-链与多种酸性溶剂溶液(包含DCM、TFA、TES、硫醚和它们的混合物)接触将所得的双氧化的保护的线性A-链脱保护。在一个方面中，本申请公开了双氧化的胰岛素A-链的3种预期的异构体(图2)。该异构体可以通过HPLC分离，但是还可以作为异构体的混合物分离和纯化。
B链的合成
在一个实施方案中，本申请公开了在三苯甲基类型的酸敏感的树脂(例如2-氯三苯甲基树脂)上以逐步的方式合成胰岛素B-链(图3)。此外，还使用了在侧链上具有酸敏感的基团的适当保护的Fmoc-氨基酸。
此外，本申请还公开了胰岛素B-链肽及其衍生物(例如des-Thr(B30)胰岛素B-链)的合成，所述的胰岛素B-链肽及其衍生物可以在Lys(B29)的侧链附着在树脂上(而非链的羧基附着在树脂上)的情况下制备(图4)。类似地，可以通过羧基来固相附着保护的精氨酸(图5)或者利用通过赖氨酸的侧基来附着(图6)而合成甘精胰岛素的B-链。此外，可以使用附着在树脂上的赖氨酸的侧链来制备地特胰岛素B-链(图7)和德谷胰岛素B链(图8、9)。
本申请进一步公开，如果用于Lys的侧链附着的树脂是相对不稳定的，例如2-氯三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂，则可以通过弱酸或热处理树脂结合的肽而容易地获得部分保护的胰岛素B-链，其中所述的肽由具有选择性脱保护的Lys侧链氨基官能的树脂上切割下来。部分脱保护的胰岛素B-链、它们的较短或较长的片段和衍生物可以在溶液中在赖氨酸的侧链上选择性地酰化，从而提供多种重要的B-链衍生物。
本申请进一步公开了Lys(15-肉豆蔻酰基)-des-Thr(30)人胰岛素B-链的合成、Lys(15-羧基十五烷酰基-y-谷氨酰基)B(29)-des-Thr(B30)人胰岛素B-链的合成、Lys(B29)的侧链的选择性聚乙二醇化和生物素化(图11)、以及在Lys(B29)侧链枝化的胰岛素B-链肽的选择性固相合成。
此外，本申请还公开了Lys(B29)人胰岛素B-链、其较短或较长的肽类似物及其衍生物的侧链上的选择性酰化。这可以通过制备并奋力在氨基末端官能处受到Fmoc基或Z型基团保护的胰岛素B-链来进行。在除去胰岛素B-链衍生物的侧链保护基之后，Lys(B30)胰岛素的游离氨基官能团可以被酰化。
双氧化的链A与链B的结合
本申请进一步公开了使用人或动物胰岛素的双氧化A-链及其衍生物与人或动物胰岛素的B-链及其衍生物在加入多种盐(例如钠盐、钙盐、锌盐、铁盐等)缓冲的水性溶液中平稳地进行的胰岛素链的结合。此外，所述的溶液在各种pH(包含pH>7)和不同的温度(包括大约0-5℃、2-6℃和5-10℃)下可以包含有机溶剂，例如醇、DMSO、乙腈等。双氧化的A-链与B-链可以以不同的比例反应，例如其中A-链/B-链的比例>1的比例，例如1.05:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.5:1和2:1。在一个方面中，所述的反应提供了单氧化的A-链、氧化的B-链、B-链二聚体、A-链二聚体和它们的混合的混合物。所得的产物混合物可以通过HPLC分离，并在单氧化的和二氧化的A-链的混合物被氧化后再次循环，或者通过使用氧化还原系统(例如半胱氨酸-半胱氨酸、或者氧化的和还原的谷胱甘肽等)来平衡而被转化成不同的胰岛素产物。使用本方法可以获得>60％的结合率。或者，向结合混合物中加入温和的氧化剂，例如DMSO或氧化还原混合物氧化的和还原的谷胱甘肽，从而再次氧化A-链。在所得的混合物中，可以加入温和的还原剂，例如硫醇，包含硫胺、二硫苏糖醇或氧化还原系统。使用本方法，胰岛素和胰岛素类似物的总产率可以改善5-25％(图11-13)。
以下实施例中描述了胰岛素、胰岛素类似物和酰化胰岛素类似物的制备。所描述的反应和纯化设计通常用于制备多种不同的胰岛素衍生物，但是反应条件和顺序可能不适用于所有的肽，包括某些胰岛素类似物和衍生物，本领域的那些技术人员可以容易地意识到这一点。在这些情况下，可以通过肽合成领域中那些技术人员已知的通常的修改来成功地实施反应，即，干扰基团的适当的保护、改变成其他的传统的试剂、或者反应条件和反应顺序的常规修改。
实施例
实施例1
固相合成胰岛素A链、B链及它们被保护的片段
一般过程
A1.负载的2-氯三苯甲基树脂的制备
将CBL-Patras的2-氯三苯甲基氯化物树脂(CTC-C1)(100g；负载量：1.6mmol/g)放置于2L肽合成反应器中，并在25℃下使用700mL二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟。过滤树脂，并加入100mmol Fmoc-氨基酸和300mmol二异丙基乙胺(DIEA)在500mL DCM中形成的溶液。在25℃下，将混合物在氮气下搅拌2小时。通过加入10mL甲醇(MeOH)并且反应1小时来中和2-CTC树脂上剩余的活性位点。过滤树脂，并使用400mL DMF洗涤2次。过滤树脂，并使用哌啶在DMF中形成的25体积％的500mL溶液处理2次，时间为30分钟。使用500mL DMF将树脂洗涤4次。使用500mL异丙醇(IPA)洗涤3次，使所述的树脂解除溶胀；并干燥直至恒重。使用的氨基酸中有70-95毫摩尔％(mmol％)结合在树脂上。
A2.负载的MBH-树脂的制备，一般方法
将MBH-Br树脂(100g；190mmol)放置于2L肽合成器中，并在25℃下使用700mL DCM溶胀30分钟。过滤树脂，然后加入Fmoc-氨基酸和DIEA在500mL DCM中形成的溶液。在25℃下，将混合物在氮气下搅拌6小时。通过加入10mL MeOH并搅拌24小时结合MBH树脂上剩余的活性位点。过滤树脂，并使用400mL DMF洗涤2次。过滤树脂，并使用哌啶在DMF中形成的25体积％的500mL溶液反应2次，时间为30分钟。使用500mL DMF将树脂洗涤4次。使用500mL IPA洗涤3次，使得所述的树脂解除溶胀。将树脂在真空下干燥，直至恒重(15托，25℃)。使用的氨基酸中有60-90mmol％结合在树脂上。
B.固相合成，一般方案
在24℃下进行固相合成，并如实施例1中的部分A所述，将1.0g氨基酸酯化到CTC或MBH树脂。在整个合成过程中，使用以下方案。
B1.树脂的溶胀
将树脂放置于15ml反应器中，并使用7mL NMP处理2次，然后过滤。
B2.氨基酸的活化
将氨基酸(3.0当量)和1-羟基苯并三唑(4.0当量)溶解于反应器中的2.5倍体积的NMP中，并冷却至0℃。然后加入DIC(3.0当量)，并将混合物搅拌15分钟。
B3.偶联反应
然后，将在B2中制备的溶液加入到B1反应器中。使用1体积的DCM将反应器洗涤1次，并加入到反应器中，在25-30℃下将其搅拌1-3h。实施Kaiser测试以测定反应的完成情况。如果在3h后偶联反应未完全(Kaiser测试阳性)，则过滤反应混合物并与新鲜的活化的氨基酸溶液再次偶联。在偶联完全后，过滤反应混合物，并使用NMP(5体积/次洗涤)洗涤4次。
B4.Fmoc基团的除去
将B3中所得的树脂过滤，然后使用5mL包含25体积％哌啶的溶液处理30分钟。将该树脂用5mL NMP洗涤3次。
B5.肽链的延长
在引入各氨基酸之后，重复步骤B1-B5，直至形成所需的肽链。
使用以下Fmoc-氨基酸来偶联单独的氨基酸或氨基酸片段：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Mmt)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Clt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH；以及以下Boc-氨基酸：Boc-Phe-OH和Boc-Gly-OH。
C.在N-末端包含Fmoc-或Boc-基团的部分保护的胰岛素肽及其保护的片段由CTC-树脂上切除并在赖氨酸侧链处选择性脱保护的一般方法。
将如上述B1-B5中所述制备的并使用Mmt或Mtt在特定的赖氨酸侧链保护的树脂结合的肽或肽片段用5mL NMP洗涤4次、5mLIPA洗涤3次、并最终用7mL DCM洗涤5次，从而完全除去任何残余的NMP或其他碱性成分。然后，将树脂冷却至0℃，由DCM中过滤，并在5℃下使用10mL 1.0-1.5％TFA在DCM/TES(95:5)中形成的溶液处理6次。然后，将混合物在0℃下搅拌20分钟并过滤。接着用10mL DCM将树脂洗涤3次。然后将吡啶加入到滤液(相对于TFA而言为1.3当量)中，从而中和TFA。随后，将在DCM中形成的切割溶液与等体积的水混合。将所得混合物在减压下蒸馏从而除去DCM(350托；28℃)。在除去DCM之后，肽或肽片段沉淀。将所得的肽用水和醚洗涤，并在30-35℃下在15托真空下干燥。或者，在真空中除去DCM并通过加入醚，沉淀部分保护的肽。
D.由CTC-树脂上的切割并同时使用碘对保护的肽进行单氧化。双氧化胰岛素A-链的制备。一般过程。
将上述所得的结合在保护肽的N-和侧链上的树脂用5mL NMP洗涤4次，用5mL IPA洗涤3次，并最终用7mL DCM洗涤5次，从而完全除去NMP和其他碱性成分。然后，将树脂冷却至0℃。在过滤DCM之后，在5℃下使用10mL 1％TFA在DCM(包含20当量的碘，相对于树脂结合的肽而言)中形成的溶液将树脂处理2次。将所得的混合物在0℃下搅拌15分钟并过滤(不使用1％TFA，可以使用相同体积的二氯甲烷/乙酸/三氟乙醇的混合物，并具有相似的结果)。接着用10mL DCM将树脂洗涤3次。将合并的滤液加热至15℃，并再搅拌30分钟。然后将吡啶加入到滤液(相对于TFA而言为1.3当量)中，从而中和TFA。随后，将在DCM中形成的切割溶液与等体积的3％硫代硫酸钠水溶液混合，从而除去过量的碘。这可以通过混合物变色而表明。将所得混合物在低压下蒸馏从而除去DCM(350托；28℃)。在除去DCM之后，所得的肽或肽片段沉淀出来。将所得的肽用水洗涤，并在30-35℃下在15托真空下干燥。
实施例2
图2所述的双氧化的胰岛素A-链的脱保护。一般方法：
在5℃下将如上文实施例1所述而获得的保护的胰岛素链A(0.01mmol)用10mL TFA/TES/苯硫基甲烷/水(85:5:5:5)处理3h，并在15℃下处理1h。将所得的溶液在真空下浓缩，然后通过加入二异丙醚来沉淀脱保护的肽，并使用10mL二异丙醚洗涤3次。将所得的固体在真空下干燥(25℃，15托)，直至恒重。
实施例3
双氧化的胰岛素B-链的脱保护。一般方法：
在5℃下使用10mL TFA/DTT/水(90:5:5)处理如上述实施例1中所述而获得的保护的胰岛素链B(0.01mmol)处理3h，并在15℃下处理1h。将所得的溶液在真空下浓缩，然后通过加入二异丙醚沉淀脱保护的肽，并使用10mL二异丙醚洗涤3次。将所得的固体在真空下干燥(25℃，15托)，直至恒重。
实施例4
通过赖氨酸侧链附着在树脂上的肽的合成
将1mmol Lys侧链脱保护的氨基酸或肽(其可以如实施例1C中所述而获得)溶解于15ml DCM中。然后，加入1.5mmol DIPEA和1g 4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂(1.2mmol/g)，并将混合物过夜搅拌。加入1ml甲醇并在RT下将混合物再搅拌4h。然后过滤树脂，使用DCM洗涤3次、DMF洗涤3次、iPrOH洗涤3次、再使用己烷洗涤3次，并在真空下干燥直至恒重。
实施例5
在赖氨酸侧链酰化的肽的选择性合成。一般过程。
将1mmol Lys侧链脱保护的氨基酸或肽(其可以如实施例1C中所述而获得)溶解于15ml DMF中。然后，加入1.2mmol DIPEA和1当量的亲电活化剂，并将混合物在RT下搅拌1-12h。然后，将混合物倒入冰冷的水中，并将所得的沉淀用水和醚洗涤，根据实施例3所述的方法进行脱保护，并根据以下实施例6所述来纯化。
实施例6
脱保护的肽的纯化。一般过程。
将胰岛素链和双环链A衍生物的脱保护三氟乙酸盐粗品溶解于15％乙腈水溶液中，并加载于半制备型柱10x25mm上，所述的半制备型柱加载有Chromasil：相A＝1％的TFA乙腈溶液，相B＝1％的TFA水溶液；线性梯度由25％-A至65％-A，时间为30分钟。纯化产率为30％至90％。
实施例7
通过胰岛素双环A-链及其衍生物与胰岛素线性B-链及其衍生物的线性结合来合成类胰岛素肽及其衍生物：一般过程。
将类胰岛素肽或其衍生物的脱保护双环A-链(0.006mmol)与类胰岛素肽线性链-B或其衍生物(0.005mmol)溶解于4ml甘氨酸钠/6-N盐酸胍(4:1)的缓冲剂(pH＝10.5)中。然后，在12小时内逐渐加入1ml DMSO，接着将混合物在15℃下再搅拌4h。通过如实施例4中所述而进行的纯化由所得的溶液分离类胰岛素肽。根据所使用的B-链，在3个试验中计算类胰岛素肽的平均产率为5-80％。
尽管本发明提供了许多示例性实施方案、方面和变体，但是本领域的那些技术人员将意识到一些实施方案、方面和变体的某些修改、排列、加入、结合和某些亚结合。希望所附的权利要求书被解释为包括所述的实施方案、方面和变体的所有此类修改、排列、加入、结合和某些亚结合。在整个申请中所引用的所有文件的全部公开内容均以引用方式并入本文。
Claims (25)
1.一种式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物，其中：
W为对于赖氨酸或赖氨酸衍生物由树脂上的切割，酸敏感或热敏感的树脂或对于酸和热均敏感的树脂；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
其中Pr1为-OH保护基，Pr2和PR3各自独立地为氢或胍保护基；以及
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；以及包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基时，则P并非为氢或氨基保护基。
2.权利要求1所述的赖氨酸-树脂缀合物，其中所述的树脂W-具有式IIIa、IIIb、IIIc或IIId，
其中：
n为0、1、2或3；
R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组中，前体条件是在式Ib、Ic和Id的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；
R2为所述的树脂的固相；并且
Z为键或-C(＝O)-。
3.权利要求1或2所述的赖氨酸-树脂缀合物，其中P选自由以下构成的组：叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基-羰基(羧基苄基或Z)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-l-亚基)-乙基(Dde)、2-硝基苯基硫基(Nps)和烯丙氧基羰基(alloc)。
4.一种用于固相合成保护的、部分保护的或未保护的包含1至200个氨基酸的肽残基的方法，该方法包括：
a)制备式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物，其中：
W为对于赖氨酸或赖氨酸衍生物由树脂上的切割，酸敏感或热敏感的树脂或对酸和热均敏感的树脂；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
其中Pr1为-OH保护基，Pr2和PR3各自独立地为氢或胍保护基；以及
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；以及选自由SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36构成的组中的肽残基；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；以及包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基时，则P并非为氢或氨基保护基；
b)将式I所示的其中R为-OH的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的C-末端肽偶联，从而形成式Ia所示的缀合物：
其中R1选自由以下构成的组：-Pro-OH，-Pro-NH2，-Pro-O-C1-6烷基，-Pro-O-C2-6烯基，-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，Thr(Pr1)，-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH，
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2，
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基，
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基，
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，-Thr(Pr1)-OH，-Thr(Prl)-NH2，-Thr(Prl)-O-C1-6烷基，-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基，或者包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；或者
b')将下列式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸的N-末端肽偶联，从而形成式Ia所示的缀合物，在所述式I中，P为H并且R1为羧基保护基或包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的羧基的氨基酸的C-末端肽残基，其中该肽残基在赖氨酸或赖氨酸残基的α-氨基包含C-末端和N-末端，其中所述的N-末端肽包含C-末端和N-末端，
其中R1和P如上文所定义；以及
c)任选地除去保护基Pr1、Pr2或Pr3，或者所述的C-末端肽残基处的保护基，从而形成其中Pr1、Pr2和Pr3为氢，或者其中所述的C-末端为游离的羧基的式Ia所示的脱保护的缀合物；以及
d)任选地由所述的树脂W上切割肽残基。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的树脂W-具有式IIIa、IIIb、IIIc或IIId，
其中：
n为0、1、2或3；
R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组，前体条件是在式IIIb、IIIc和IIId的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；
R2为所述的树脂的固相；并且
Z为键或-C(＝O)-。
6.权利要求4或5所述的方法，其中所述的赖氨酸或赖氨酸衍生物选自由以下构成的组：SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
7.权利要求4、5或6中任意一项所述的方法，其中
对于其中式I的R为-OH的步骤b)而言，通过活化所述的C-末端游离的羧基并将所述的活化的羧基与C-末端肽缩合将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个氨基酸的C-末端肽偶联，从而形成所述的式Ia所示的缀合物，其中R1为包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的C-末端肽残基；或者
对于其中将所述的赖氨酸或赖氨酸衍生物的α-氨基偶联的步骤b')而言，通过使用下列活化基团来活化N-末端游离的羧基从而形成活化的羧基，并缩合N-末端肽的活化羧基将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与包含1至200个氨基酸的N-末端肽残基偶联，从而形成所述的式Ia所示的缀合物，其中P为包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的N-末端肽残基，其中所述活化基团选自由DCC、PFPOH、DMAP、PFP-三氟乙酸酯、吡啶、PFPOH、EDC、DMA、EDC、HOBt、FDPP、DIEA、DMF、EDC、HOAt、HBTU、HATU、HATU、HOAt、Ac20、DMAP、Ac2O、吡啶、DPPA、FDPP、DCC、HOAt、DCC、HOBt、DIC、HOBt和EDC-HC1构成的组。
8.权利要求7所述的方法，其中在所述的步骤b)或b')之后，所述的方法还包括：
d)通过下列步骤将所述的肽残基由所述的树脂W上切下：使用有机酸和溶剂的混合物在弱酸性条件下与式Ia所示的树脂结合的肽缀合物接触，或者将所述的树脂结合的肽加热至升高的温度，或者既使用所述的有机酸与溶剂的混合物又将所述的树脂结合的肽在升高的温度下加热足以将包含具有游离氨基的赖氨酸的肽由所述的树脂W上切下的时间；
e)使用R'CO-X将所述的包含赖氨酸的肽的游离氨基酰化，从而形成N-酰化的肽衍生物，其中X为Cl、Br、CH3CO-，并且R'选自CH3CO-或包含1至200个氨基酸的C-末端羧基活化的肽残基；以及
h)分离式II所示的N-酰化的肽衍生物：
9.权利要求8所述的方法，其中所述的酰基(R'CO-)衍生自：肉豆蔻酸的卤化物或酸酐、编码或非编码的氨基酸卤化物、Fmoc-Glu-OtBu和tBuO-CO-(CH2)14-CO-NH-Glu-OtBu。
10.权利要求4所述的方法，其中通过下列步骤将包含C-末端游离羧基的式Ia所示的赖氨酸-树脂缀合物进一步转化成相应的烷基羧基酯：在碱存在的条件下将所述的羧基与选自由二苯基甲基氯化物、4-甲氧基二苯基甲基氯化物、4-甲基二苯基甲基氯化物、三苯甲基氯化物、2-氯三苯甲基氯化物、4-甲基三苯甲基氯化物、三甲基甲硅烷基氯化物和三乙基甲硅烷基氯化物构成的组中的烷基卤化物接触，或者活化所述的C-末端羧基并与选自Rink-酰胺MBHA或Rink-酰胺AM树脂中的氨基树脂反应。
11.权利要求4至10中任意一项所述的方法，其中所述的包含1至200个氨基酸的C-末端肽或所述的包含1至200个氨基酸的N-末端肽残基选自保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物，或者为选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36中的肽残基。
12.权利要求11所述的方法，还包括：
同时氧化所述的肽以及由SEQ ID NO:9所示的A-链肽-树脂的树脂上切割所述的肽，然后脱保护，从而形成SEQ ID NO:14所示的双氧化的脱保护的双氧化胰岛素A-链；以及
将SEQ ID NO:14所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ ID NO:27所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:6所示的胰岛素类似物；或者
将所述的SEQ ID NO:14所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ IDNO:29所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:8所示的胰岛素类似物；或者
将所述的SEQ ID NO:36所示的双氧化的胰岛素A-链与SEQ IDNO:23所示的B-链结合，从而形成SEQ ID NO:4所示的胰岛素类似物。
13.一种固相合成保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物的方法，该方法包括：
制备包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物的式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其中：
W为式IIIa、IIIb、IIIc或IIId所示的树脂：
其中：
n为0、1、2或3；
R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组，前体条件是在式IIIb、IIIc和IIId的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；
R2为所述的树脂的固相；并且Z为键或-C(＝O)-；
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；
其中Pr1为氢或-OH保护基，并且Pr2和Pr3各自独立地为胍或胍保护基；
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；
前提条件是当R选自由-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Prl)-NH2、-Thr(Prl)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基构成的组时，则P并非为氢或氨基保护基；
将式I所示的赖氨酸-树脂缀合物与保护的、部分保护的或未保护的肽残基Ib偶联，从而形成所述的保护的、部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物，其中在式I中，R选自-OH、羧基保护基和包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基，并且其中包含1至200个氨基酸的肽残基与所述的肽残基Ib一起包含胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的树脂为2-氯三苯甲基树脂。
15.权利要求13-14中任意一项所述的方法，其中P选自由以下构成的组：叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基-羰基(羧基苄基或Z)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-l-亚基)-乙基(Dde)、2-硝基苯基硫基(Nps)和烯丙氧基羰基(alloc)。
16.权利要求13-15中任意一项所述的方法，其中所述的部分保护的、未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自由SEQ ID NO:4,5,6,7和8、以及它们的类似物或衍生物构成的组；并且
通过以下步骤进一步切割树脂结合的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物：使用有机酸和醇溶剂的混合物在弱酸性条件下与所述的树脂结合的肽接触，或者将所述的树脂结合的肽加热至升高的温度，或者既使用有机酸与醇溶剂的混合物又将所述的树脂结合的肽在升高的温度下加热足以将所述的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物由所述的树脂上切下的时间。
17.权利要求16所述的方法，其中所述的有机酸选自由三氟乙酸、乙酸和它们的混合物构成的组，所述的醇溶剂选自由三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇和它们的混合物构成的组，并使用微波来加热所述的树脂结合的肽。
18.权利要求16所述的方法，其中所述的部分保护的或未保护的胰岛素B-链或胰岛素B-链衍生物选自由以下构成的组：N-酰化的衍生物、聚乙二醇化的衍生物、生物素化的衍生物、包含发色团的衍生物、以及包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基和它们的混合物的肽残基。
19.一种固相合成保护的、部分保护的或未保护的胰岛素A-链或胰岛素A-链衍生物的方法，该方法包括：
制备包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物的赖氨酸-树脂缀合物，其中所述的肽-树脂缀合物具有下式I，其中：
R选自由以下构成的组：-OH；羧基保护基；-NH2；-O-C1-6烷基；-O-C2-6烯基；-O-三-C1-3烷基甲硅烷基；选自由-Pro-OH、-Pro-NH2、-Pro-O-C1-6烷基、-Pro-O-C2-6烯基、-Pro-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、Thr(Pr1)、-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-Cl-6烷基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-C2-6烯基、
-Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基、-Thr(Pr1)-OH、-Thr(Pr1)-NH2、-Thr(Pr1)-O-C1-6烷基、-Thr(Pr1)-O-C2-6烯基和-Thr(Pr1)-O-三-C1-3烷基甲硅烷基构成的组中的肽残基；包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端羧基的氨基酸的肽残基；
P为氢；氨基保护基；N-末端肽残基，该N-末端肽残基包含1至200个具有任选地保护的侧链和任选地保护的末端氨基的氨基酸，其中所述的N-末端肽残基包含C-末端和N-末端；
其中树脂W具有式IIIa、IIIb、IIIc或IIId：
其中：
n为0、1、2或3；
R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组，前体条件是在式IIIb、IIIc和IIId的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；
R2为所述的树脂的固相；并且Z为键或-C(＝O)-；以及
其中所述的肽残基是保护的、部分保护的或未保护的胰岛素A-链或胰岛素A-链衍生物，或者为选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15或它们的混合物中的肽残基；
所述的方法包括：将所述的肽-树脂缀合物与氧化剂接触，从而同时氧化所述的胰岛素A-链并将所述的肽残基由所述的树脂上切割下来；
将保护的双氧化胰岛素A-链整体脱保护；以及
纯化未保护的双氧化胰岛素A-链。
20.权利要求19所述的方法，其还包括将所述的未保护的双氧化胰岛素A-链与选自SEQ ID NO:3、23、27、29和34中的胰岛素B-链肽接触，从而形成动物或人的胰岛素或胰岛素类似物。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的动物或人的胰岛素或胰岛素类似物选自：SEQ ID NO:1、4、5、6、7和8，以及赖谷胰岛素(Adipra)。
22.一种用于制备选自SEQ ID NO:3、23、27、29和34中的胰岛素B-链肽的方法，包括：
通过下列步骤由式IV所示的肽-树脂缀合物上切割肽：
W—AA1—AAm IV
将所述肽-树脂缀合物与有机酸和溶剂的混合物接触；或者将所述的肽-树脂加热至升高的温度；或者既使用有机酸和溶剂的混合物又将所述的树脂结合的肽在升高的温度下加热至足以将肽残基由树脂W上切下的时间，
其中：
W为式IIIa、IIIb、IIIc或IIId所示的树脂，
其中：
n为0、1、2或3；
R1和R3各自独立地选自H，或者独立地选自由2-Cl、2-C1-3烷基、2-C1-3烷氧基、4-C1-3烷基和4-C1-3烷氧基构成的组，前体条件是在式IIIb、IIIc和IIId的每个式中，R1和R3中仅一者为2-Cl，并且R1和R3中仅一者为H；
R2为所述的树脂的固相；并且Z为键或-C(＝O)-；以及
AA1为：
A)通过下列基团附着在W上的包含赖氨酸残基或其衍生物的第一肽残基：
i)赖氨酸或赖氨酸衍生物的氨基侧链；
ii)赖氨酸或赖氨酸衍生物的羧基；或
iii)N-末端氨基；或者
B)通过下列基团附着在W上的非赖氨酸肽残基：
i)非赖氨酸肽残基的羧基；
ii)非赖氨酸肽残基的N-末端氨基；并且
AAm为第二至第m残基，其中m为1-200的整数。
23.权利要求22所述的方法，其中所述的肽-树脂缀合物选自由SEQ ID NO:16、17、18、20、22和24构成的组。
24.权利要求23所述的方法，其中所述的肽-树脂缀合物选自SEQ ID NO:16或17，其进一步脱保护从而形成SEQ ID NO:3所示的人B-链。
25.权利要求22-24中任意一项所述的方法，其中所述的有机酸选自由三氟乙酸、乙酸和它们的混合物构成的组，所述的醇溶剂选自由三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇和它们的混合物构成的组，并在大约30℃至50℃下加热所述的肽-树脂缀合物。
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