ES2928207T3 - Síntesis de lixisenatida con encapuchado - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la síntesis de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada. El método de acuerdo con la invención comprende ciclos de acoplamiento de un bloque de construcción de aminoácido N-terminal protegido C-terminalmente en un grupo amino N-terminal desprotegido de una cadena de aminoácidos, en el que al menos un ciclo de acoplamiento comprende un paso de acoplamiento (a) , un paso de tapado (b) y un paso de desprotección (c). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis de lixisenatida con encapuchado

La presente invención se refiere a un método para la síntesis en fase sólida de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada. El método según la invención comprende ciclos de acoplamiento de acoplamiento de un elemento estructural de aminoácido aminoterminalmente protegido en el extremo carboxi en un grupo amino aminoterminal sin proteger de una cadena de aminoácidos, en donde al menos un ciclo de acoplamiento comprende una etapa de acoplamiento (a), una etapa de encapuchado (b) y una etapa de desprotección (c).

La invención se refiere además al uso de una composición que comprende 0,5-5 % v/v de anhídrido acético y 0,2-2 % v/v de diisopropiletilamina como reactivo de encapuchado para la acetilación de un grupo amino sin proteger en la síntesis de polipéptidos.

Los métodos establecidos de síntesis en fase sólida de péptidos enseñan el acoplamiento del aminoácido carboxiterminal predeterminado de la cadena de aminoácidos a sintetizar con un vehículo de polímero mediante un conector. El aminoácido usado para el acoplamiento es un elemento estructural de aminoácido que tiene un grupo amino aminoterminalmente protegido, siendo dicho grupo protector un grupo Fmoc unido temporalmente. Después del acoplamiento satisfactorio, el grupo protector Fmoc se escinde y el siguiente elemento estructural de aminoácido protegido con Fmoc se acopla con la función amino libre amino del elemento estructural de aminoácido previo. Cuando se sintetiza la cadena de aminoácidos deseada, se escinde de la fase sólida. La Figura 1 da una visión general del enfoque descrito.

Como la reacción de acoplamiento no es siempre completa, los restantes grupos amino libres pueden ser acetilados con anhídrido acético (véase Figura 1). Esta reacción se denomina encapuchado. El objetivo del encapuchado es prevenir la aparición de impurezas (N-1) (es decir, productos que carecen de un elemento estructural de aminoácido en una posición), que son probablemente difíciles de separar del producto final deseado.

En la bibliografía, se describen numerosas mezclas de encapuchado para la síntesis en fase sólida de péptidos. Fields et al. (PNAS 85, 1384-1388, 1988) usan anhídrido acético y diisopropiletilamina (DIPEA) en cloruro de metileno para la síntesis de gramicidina A. En primer lugar, se añade 1 equivalente de DIPEA en 20 ml de cloruro de metileno. Después de cinco minutos, se añaden 4 equivalentes de anhídrido acético. El tiempo de incubación total es 20 minutos. Eritja et al. (Tetrahedron 43, 2675-2680, 1987) enseñan el uso de aproximadamente 9 % de anhídrido acético y aproximadamente 16 % de DIPEA en DMF combinado con un tiempo de incubación de 30 minutos para el proceso de encapuchado. Echner et al. desvelan una mezcla de anhídrido acético, piridina y cloruro de metileno para el proceso de encapuchado (Liebigs Ann. Chem. 1988, 1095-1097).

En "In troducto to Fmoc solid-phase peptide synthesis" por Protein Technologies, Inc. (www.peptideinstruments.com; Documento N.° 9040019 Rev 02; 2006), se describe la síntesis en fase sólida de péptidos (SPPS) y las diferentes etapas de este proceso, por ejemplo, la etapa de encapuchado. Según el documento, las composiciones de disolución de encapuchado típicas incluyen 1:1:3 de ácido acético anhídrido/base/DMF, donde se pueden usar piridina o DIPEA como base.

El documento de patente US 2013/0289241 A1 se refiere a un método de preparación de exenatida por síntesis en fase sólida, que incluye 1) mezclar una Fmoc-resina de amida Rink AM con un agente desprotector para obtener una resina de amida Rink AM; 2) condensar Fmoc-Ser(tBu)-OH con la resina de amida Rink AM para obtener Fmoc-Ser(tBu)-resina de amida Rink AM; 3) repetir la desprotección de Fmoc y la condensación entre un aminoácido y un polipéptido sobre la resina, y condensar un aminoácido con un polipéptido en la resina desde el extremo carboxi hasta el extremo amino para formar una resina de polipéptido; y 4) separar el polipéptido y la resina en la resina de polipéptido.

El documento de patente WO 2017/162650 A1 se refiere a un método de preparación de un péptido de tipo glucagón, que comprende la precipitación del péptido o de un péptido precursor por medio de mezcla con un antidisolvente que comprende diisopropil éter y acetonitrilo. Además, la invención también se refiere a un péptido conjugado con una fase sólida y a una composición farmacéutica que comprende un péptido de liraglutida obtenible a partir de un método como se describe.

El documento de patente US 2015/0291682 A1 se refiere a péptidos miméticos de epítope(s) de inmunoensayos de diagnóstico de apolipoproteína A-I que comprenden dichos péptidos miméticos, así como a métodos de diagnóstico y métodos de prevención y/o tratamiento de una enfermedad cardiovascular. En la sección de materiales y métodos del presente documento, se describe un método de SPPS para la síntesis de péptidos.

El documento de patente US 7.431.685 B2 tiene como objetivo investigar la unión de sustancias a moléculas diana lograda por medio de un dispositivo densamente compacto en donde diversas moléculas diana están unidas en un gran número de áreas de muestra.

El documento de patente EP 1107969 A2 se refiere a conjuntos de pirrolobenzodiacepinas, a métodos de síntesis de estos compuestos sobre soportes sólidos y a compuestos de utilidad. La síntesis en fase sólida de la lixisenatida (también conocida como AVE0010 o ZP-10) descrita en el documento de patente WO 01/04156 A1 comprende el acoplamiento de los elementos estructurales de aminoácido protegidos con Fmoc individuales en cada uno de ellos de la misma manera, sin reacción de encapuchado.

La lixisenatida tiene la secuencia desPro36exendina-4(1 -39)-Lys6-NH2. Esta sustancia se desvela en el documento de patente WO 01/04156, SEQ ID NO:93 (véase SEQ ID NO:1 y la Figura 2 de la presente solicitud). Las exendinas son un grupo de péptidos que pueden reducir la concentración de glucosa en sangre. Las exendinas tienen una cierta similitud con la secuencia de GLP-1(7-36) (53 %, Goke et al., J. Biol. Chem. 268, 19650-55). La exendina-3 y la exendina-4 estimulan la producción cada vez mayor de AMPc celular en células acinares pancreáticas de cobayas por interacción con los receptores de exendina (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61:1 -18). A diferencia de la exendina-4, la exendina-3 efectúa un aumento de la liberación de amilasa en células acinares pancreáticas. Las exendinas actúan de antagonistas de GLP-1.

El péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1) es una hormona endocrina que potencia la respuesta de insulina después de la captación oral de glucosa o grasa. El GLP-1 reduce, en general, las concentraciones de glucagón, ralentiza el vaciamiento gástrico, estimula la biosíntesis de (pro-)insulina, aumenta la sensibilidad a la insulina y estimula la biosíntesis de glucógeno independiente de insulina (Holst (1999), Curr. Med. Chem. 6:1005, Nauck et al. (1997), Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 105:187, Lopez-Delgado et al. (1998), Endocrinology 139:2811). EL GLP-1 humano tiene 37 restos de aminoácidos (Heinrich et al., Endocrinol. 115:2176 (1984), Uttenthal et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. (1985), 61:472). Los fragmentos activos de GLP-1 incluyen GLP-1 (7-36) y GLP-1 (7-37).

Se sugirió que los agonistas de exendina-3, exendina-4 y exendina se podían usar para el tratamiento de diabetes mellitus y la prevención de hiperglucemia, ya que reducen el vaciamiento gástrico y la motilidad (documentos de patente US 5.424.286 y WO 98/0535 A1).

Los análogos de exendina se pueden caracterizar por sustituciones de aminoácidos y/o truncaciones carboxiterminales de la secuencia nativa de exendina-4. Dichos análogos de exendina se describen en los documentos de patente WO 99/07404, WO 99/25727 y WO 99/25728.

Los inventores han descubierto que el producto en bruto de una síntesis en fase sólida común de lixisenatida con elementos estructurales de aminoácido protegidos con Fmoc presenta ciertas secuencias erróneas acetiladas en elevadas cantidades con respecto a otras secuencias erróneas acetiladas. Estas impurezas inesperadamente pronunciadas son en particular Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) y Ac(4-44).

El problema a resolver por la presente invención es reducir la cantidad de secuencias erróneas acetiladas que ocurren en la síntesis de péptidos y, por lo tanto, potenciar el rendimiento de la síntesis de péptidos. En particular, se debe reducir la cantidad de secuencias erróneas acetiladas que tienen una elevada cantidad en el producto en bruto.

Se ha descubierto que durante la etapa de encapuchado de la síntesis de lixisenatida en fase sólida, el grupo protector Fmoc se escinde no deseablemente de algunos de los elementos estructurales de aminoácido que se acaban de acoplar. Esta escisión no deseable era solo detectada para el encapuchado en ciertas posiciones de aminoácidos durante el ciclo de síntesis. Cinco de estas posiciones son:

• encapuchado después del acoplamiento de Arg(20),

• encapuchado después del acoplamiento de Glu(17),

• encapuchado después del acoplamiento de Gln(13),

• encapuchado después del acoplamiento de Leu(10),

• encapuchado después del acoplamiento de Gly(4).

Un problema adicional a resolver por la presente solicitud es, por lo tanto, proporcionar condiciones de encapuchado en las que los productos acetilados no deseados ya no están presentes en dichas cantidades elevadas.

Sorprendentemente, se descubrió que la aplicación de condiciones de encapuchado suaves conduce a menores concentraciones de subproducto en el producto en bruto o incluso a su completa erradicación. Reduciendo o eliminando completamente los subproductos Ac(17-44), Ac(13-44) y Ac(10-44), cuyos picos cromatográficos son próximos a los del producto previsto, se facilita mucho la purificación del producto previsto del producto en bruto. Ya que se producen menos fracciones mixtas, aumenta el rendimiento de lixisenatida purificada. El rendimiento aumenta más ya que la concentración de subproductos Ac(20-44) y Ac(4-44), cuyos picos están más lejos del pico de producto previsto, también se minimiza por las suaves condiciones de encapuchado.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la síntesis en fase sólida de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada, comprendiendo el método ciclos de acoplamiento de elementos estructurales de aminoácido con una cadena de aminoácidos, en donde dichos elementos estructurales de aminoácido comprenden un grupo carboxilo carboxiterminal sin proteger y un grupo amino aminoterminal protegido, y en donde dicha cadena de aminoácidos comprende un grupo amino aminoterminal sin proteger, en donde al menos un ciclo de acoplamiento comprende las etapas:

(a) acoplar el elemento estructural de aminoácido carboxiterminalmente en el grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos, de manera que se forme un enlace amida entre la cadena de aminoácidos y el elemento estructural de aminoácido,

(b) poner en contacto el producto obtenido en la etapa (a) con un reactivo de encapuchado que comprende un compuesto de encapuchado, en donde el compuesto de encapuchado se une a un grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos con la que no se ha acoplado el elemento estructural en la etapa (a) y en donde el compuesto de encapuchado es anhídrido acético, y

(c) desproteger el grupo amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido, en donde el reactivo de encapuchado comprende 0,5-5 % v/v de anhídrido acético y 0,2-2 % v/v de DIPEA.

En la presente invención, "reactivo de encapuchado", "composición de encapuchado" o "mezcla de encapuchado" se usan indistintamente. El reactivo se puede preparar antes de la etapa (b), o los componentes del reactivo de encapuchado se añaden durante la etapa (b).

Una cadena de aminoácidos, encapuchada en la etapa (b), no es capaz de acoplar un elemento estructural de aminoácido adicional, de manera que se termina la elongación de cadena de esta molécula.

Durante la síntesis en fase sólida del polipéptido, los ciclos de acoplamiento de elementos estructurales de aminoácido se realizan de forma que la cadena de aminoácidos del polipéptido forme elemento estructural a elemento estructural. Para la etapa de acoplamiento, se pueden usar las técnicas del estado de la técnica, en particular una síntesis en fase sólida que se basa en elementos estructurales de aminoácido protegidos con Fmoc. Se pueden usar todos los tipos de fases sólidas adecuadas para la síntesis en fase sólida de péptidos. En particular, se puede usar una fase sólida que comprende una resina. La resina puede ser una resina de Rink (resina de amida Rink) o una resina Tentagel®. En un aspecto preferido, la resina en fase sólida es una resina de Rink o resina de amida de Rink.

Los ciclos que comprenden las etapas (a), (b) y (c) según la invención se pueden repetir una vez o varias veces. Para cada elemento estructural de aminoácido a acoplar se realiza un ciclo. El elemento estructural de aminoácido respectivo se selecciona independientemente para cada ciclo dependiendo de la secuencia de aminoácidos predeterminada. Se pueden usar todos los tipos de elementos estructurales de aminoácido, como se describe en el presente documento.

El método según la invención puede combinar ciclos de acoplamiento que son iguales o diferentes en relación con las condiciones de la etapa de encapuchado, tales como la temperatura de encapuchado, la composición del reactivo de encapuchado o/y la duración del encapuchado. En un aspecto, todos los ciclos de acoplamiento según la invención se realizan en las mismas condiciones de encapuchado. En otro aspecto, al menos una etapa de encapuchado se diferencia de las otras etapas de encapuchado según la invención, por ejemplo, por una temperatura de encapuchado modificada, la composición del reactivo de encapuchado o/y la duración del encapuchado. En un aspecto, el método según la invención comprende más de una condición de etapa de encapuchado, por ejemplo dos, tres, cuatro o cinco condiciones de etapa de encapuchado diferentes durante toda la síntesis de polipéptidos.

En un aspecto, el método según la invención comprende al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento que comprenden una etapa de encapuchado (b).

El compuesto de encapuchado es anhídrido acético.

El reactivo de encapuchado comprende anhídrido acético en una concentración del 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de anhídrido acético es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender homólogos de anhídrido acético en una concentración del 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de los homólogos de anhídrido acético es 1 -3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender cloruro de benzoílo en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de cloruro de benzoílo es 1 -3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender W-(benciloxicarboniloxi)succinimida en una concentración de 0,5­ 5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de N-(benciloxicarboniloxi)succinimida es 1 -3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender cloroformiato de bencilo en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de cloroformiato de bencilo es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender ésteres de ácido clorofórmico, en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de los ésteres de ácido clorofórmico es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender 1-acetilimidazol, en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de 1-acetilimidazol es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender ésteres de dicarbonato de di-ferc-butilo, en una concentración de 0,5­ 5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de dicarbonato de di-ferc-butilo es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado puede comprender ésteres de N-(ferc-butoxicarboniloxi)succinimida en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de N-(ferc-butoxicarboniloxi)succinimida es 1-3 % v/v, más preferida 2 % v/v.

El reactivo de encapuchado comprende diisopropiletilamina (también llamada DIPEA, N-etildiisopropilamina o N,N-diisopropiletilamina), en donde la concentración de diisopropiletilamina es 0,2-2 % v/v y preferentemente es 0,5­ 2 % v/v. Una concentración preferida de diisopropiletilamina es 1 % v/v.

Por consiguiente, el reactivo de encapuchado comprende diisopropiletilamina y anhídrido acético, en donde la concentración de diisopropiletilamina es 0,2-2 % v/v y preferentemente es 0,5-2 % v/v, y la concentración de anhídrido acético es 0,5-5 % v/v y preferentemente es 1 -3 % v/v.

En un aspecto, la composición de encapuchado o reactivo de encapuchado comprende diisopropiletilamina en una concentración de aproximadamente 1 % v/v, y anhídrido acético en una concentración de aproximadamente 2 % v/v.

En el método de la invención, el grupo amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido es preferentemente un gripo protector lábil a bases, más preferentemente Fmoc.

El disolvente usado en la etapa de encapuchado es preferentemente un disolvente polar no acuoso, tal como acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo (DMSO), metanol, cloruro de metileno, N,N-dimetilacetamida (DMA), N,N-dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona, o mezclas de los mismos. En un aspecto preferido, el disolvente usado en la etapa de encapuchado es DMF.

En la presente invención, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa un intervalo de ±10 %, ±5 % o ±1 %.

La reacción de encapuchado (b) según la invención se puede realizar a temperatura ambiente. La temperatura ambiente según la invención está relacionada con una temperatura entre aproximadamente 15-25 °C, una temperatura que varía desde aproximadamente 20-23 °C, una temperatura que varía desde aproximadamente 19-21 °C o una temperatura de aproximadamente 20 °C.

En el método de la invención, la etapa (b) se realiza preferentemente durante 5 a 15 min, preferentemente durante 10 min.

En un aspecto preferido, la etapa (b) se realiza durante 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende 2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de DIPEA.

En otro aspecto preferido, la etapa (b) se realiza durante 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende 2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de DIPEA en DMF en las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4.

En otro aspecto más preferido, la etapa (b) se realiza durante 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende ^{2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de} DⁱPEA ^{en DMF en las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) y Gly(4)} de la secuencia de lixisenatida o exendina-4 a temperatura ambiente, como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento o al menos cinco ciclos de acoplamiento sin una etapa de encapuchado, en particular en posiciones diferentes de Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4.

En otro aspecto, el método según la invención comprende el encapuchado según la etapa (b) después del acoplamiento del elemento estructural de aminoácido Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4, en particular durante aproximadamente 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende 2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de diisopropiletilamina. La etapa (b) se puede realizar después del acoplamiento de un residuo de Arg, Glu, Gin, Leu o/y Gly en la etapa (a), en particular Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4. Preferentemente, en otras posiciones de aminoácidos, no se realiza etapa de encapuchado, o/y el encapuchado se realiza durante 20 min con 10 % de anhídrido acético y 5 % v/v de DIPEA en DMF. En particular, el encapuchado se realiza a temperatura ambiente, como se describe en el presente documento.

En otro aspecto más de la invención, el método según la invención comprende el encapuchado según la etapa (b) después del acoplamiento de todos los elementos estructurales de aminoácido de la secuencia de lixisenatida o exendina-4, en particular durante aproximadamente 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende 2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de diisopropiletilamina. La etapa (b) se puede realizar después del acoplamiento de todos los restos de aminoácidos de la secuencia de lixisenatida o exendina-4 en la etapa (a). En etapas de acoplamiento de aminoácidos individuales, el encapuchado puede ser omitido. La etapa (b) se puede realizar después del acoplamiento de al menos 30 o al menos de 35 restos de aminoácidos de la secuencia de lixisenatida o exendina-4 en la etapa (a).

En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento sin una etapa de encapuchado (b) y al menos un ciclo de acoplamiento que comprende una etapa de encapuchado (b) como se describe en el presente documento. En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento sin una etapa de encapuchado (b) y al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento que comprenden una etapa de encapuchado (b) como se describe en el presente documento. No se realiza encapuchado en particular en posiciones diferentes de Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4.

En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento que comprenden las etapas (a), (b') y (c), en donde la etapa de encapuchado (b') se realiza en diferentes condiciones a la etapa de encapuchado (b). Un ciclo de acoplamiento que comprende la etapa (b') se aplica particularmente para el acoplamiento de un elemento estructural de aminoácido, diferente de Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de la secuencia de lixisenatida o exendina-4. En un aspecto, la etapa (b') puede usar un reactivo de encapuchado que comprende aproximadamente 10 % v/v de anhídrido acético y aproximadamente 5 % v/v de diisopropiletilamina en DMF, por ejemplo, realizado durante aproximadamente 20 min.

En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento que comprende una etapa de encapuchado (b) según la invención y al menos un ciclo de acoplamiento que comprende una etapa de encapuchado (b') como se describe en el presente documento. En un aspecto, el método según la invención puede comprender al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento que comprenden una etapa de encapuchado (b) según la invención y al menos un ciclo de acoplamiento, al menos dos ciclos de acoplamiento, al menos tres ciclos de acoplamiento, al menos cuatro ciclos de acoplamiento, o al menos cinco ciclos de acoplamiento que comprenden una etapa de encapuchado (b') como se describe en el presente documento.

Para el acoplamiento de un elemento estructural de aminoácido como se describe en el presente documento, que comprende el acoplamiento de más de un aminoácido en un único ciclo, se usa preferentemente un ciclo de acoplamiento que comprende la etapa (b'), por ejemplo, para el acoplamiento de dipéptidos tales como Pro-Pro o His-Gly usando los elementos estructurales de aminoácido Fmoc-Pro-Pro-OH y Fmoc-His(Trt)-Gly-OH, respectivamente.

El experto en la técnica conoce los métodos para la realización de una etapa de acoplamiento según la etapa (a) y una etapa de desprotección según la etapa (c). La síntesis de péptidos se realiza en forma de una síntesis en fase sólida. En un aspecto preferido, los ciclos de acoplamiento se realizan desde el extremo C hasta el extremo N de la secuencia a sintetizar. El experto en la técnica conoce las condiciones de reacción para las etapas (a) y (c) aplicadas en una síntesis en fase sólida de péptidos desde el extremo C hasta el extremo N por elementos estructurales de aminoácido.

Un elemento estructural de aminoácido usado en la invención es un compuesto que está prolongando la cadena de aminoácidos a sintetizar por uno o más aminoácidos en un ciclo de la síntesis de péptidos. En un aspecto preferido, un elemento estructural de aminoácido usado en la invención prolonga la cadena de aminoácidos a sintetizar en 1,2, 3, o 4 aminoácidos. En un aspecto particularmente preferido, el elemento estructural de aminoácido usado en la invención prolonga la cadena de aminoácidos a sintetizar por uno o dos aminoácidos.

El elemento estructural de aminoácido usado en la invención comprende preferentemente un aminoácido (elemento estructural de monoaminoácido) o un oligopéptido que comprende 2, 3, 4 o más aminoácidos. En un aspecto preferido, el elemento estructural de aminoácido usado en la invención comprende un aminoácido o un péptido, que comprende dos aminoácidos, tales como, por ejemplo, Pro-Pro o His-Gly. Los aminoácidos de un elemento estructural de aminoácido que comprenden más de un aminoácido se unen preferentemente por enlaces peptídicos. Los elementos estructurales de aminoácido particularmente preferidos que comprenden dos aminoácidos son Fmoc-Pro-Pro-OH y Fmoc-His(Trt)-Gly-OH.

Se encontró que el uso de Fmoc-His(Trt)-Gly-OH en lugar de elementos estructurales de aminoácido para His y Gly en las posiciones 1 y 2 en la síntesis de lixisenatida y exendina-4 permite la prevención de DesGly(2)-lixisenatida no deseada.

Además, la lixisenatida obtenida no mostró valores potenciados de D-His resultantes de la racemización.

Fmoc-His(Trt)-Gly-OH se pueden formar, por ejemplo, por un método que comprende las etapas de:

i) hacer reaccionar Fmoc-His(Trt)-OH y tosilato de H-Gly-OBzl, y

ii) escindir el grupo bencilo del producto obtenido en la etapa i) para obtener Fmoc-His(Trt)-Gly-OH.

Las condiciones de reacción a modo de ejemplo se exponen en el Ejemplo 3.

Los elementos estructurales de aminoácido usados en la invención pueden comprender modificaciones adecuadas para prolongar selectivamente la cadena de aminoácidos en las posiciones deseadas solo. Las modificaciones del elemento estructural de aminoácido se pueden realizar en el extremo N, en el extremo C o/y en las cadenas laterales de los aminoácidos.

Para proteger la función amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido (es decir, el grupo amino que es, después del satisfactorio acoplamiento, el extremo N de la cadena amino), se pueden usar todos los tipos de grupos protectores comúnmente usados para la síntesis de péptidos, especialmente para la síntesis en fase sólida de polipéptidos. El experto en la técnica conoce los tipos de grupos protectores temporales adecuados. En un aspecto preferido, se pueden usar los grupos protectores que son inestables en un entorno alcalino. En un aspecto preferido, el grupo amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido se protege por un grupo protector.

El grupo carboxi carboxiterminal del elemento estructural de aminoácido permanece preferentemente sin proteger.

El elemento estructural de aminoácido usado en la invención puede comprender, independientemente entre sí, D-aminoácidos Fmoc y glicina, L-aminoácidos y glicina o/y combinaciones de los mismos. En un aspecto preferido, los aminoácidos del elemento estructural de aminoácido usado en la invención se seleccionan independientemente de entre sí de L-aminoácidos y glicina. En un aspecto preferido, los aminoácidos se pueden seleccionar de a-aminoácidos. En un aspecto adicional, los aminoácidos se pueden seleccionar de aminoácidos que existen de forma natural, tales como aminoácidos que existen de forma natural en polipéptidos. En otro aspecto, el elemento estructural de aminoácido usado en la invención puede comprender aminoácidos artificiales, tales como Met(O) (sulfóxido de metionina o metionina sulfona), Trp(O²) (N-formilquinurenina) o/y isoAsp (p-aspartato o isoaspartato). En todavía un aspecto preferido, los aminoácidos se seleccionan de Ser, Thr, Trp, Lys, Ala, Asn, Asp, Val, Met, Phe, lie, Pro, Arg, Glu, Gin, Leu, en particular cada uno en la forma D o cada uno en la forma L, y Gly. En un aspecto particularmente preferido el elemento estructural de aminoácido usado en la invención comprende aminoácidos seleccionados de Arg, Glu, Gin, Leu, en particular cada uno en la forma D o cada uno en la forma L, y Gly.

En particular, los aminoácidos se seleccionan independientemente entre sí, por ejemplo, independientemente de Ser, Thr, Trp, Lys, Ala, Asn, Asp, Val, Met, Phe, lie, Pro, Arg, Glu, Gln, Leu, en particular cada uno en la forma D o cada uno en la forma L, y Gly.

En un aspecto, al menos una cadena lateral del elemento estructural de aminoácido usado en la invención se puede proteger por un grupo protector adicional. El grupo protector adicional es preferentemente ortogonal al grupo protector aminoterminal. Los grupos protectores adecuados para dichas cadenas laterales se conocen por el experto en la técnica. Los ejemplos de grupos protectores adecuados son, por ejemplo, T rt, Boc, Bzl, Pdf, tBu y OtBu, que se pueden usar para la protección de cadenas laterales específicas. El experto en la técnica conoce qué cadena lateral necesita ser protegida por qué tipo de grupo protector. En un aspecto, se pueden usar los elementos estructurales de aminoácido como se mencionaron en el Ejemplo 1.4. En caso de que el elemento estructural de aminoácido comprenda más de una cadena lateral, una o más de estas cadenas laterales se puede proteger por grupos protectores, independientemente seleccionados de grupos protectores adecuados como son conocidos por el experto en la técnica.

El polipéptido a sintetizar puede ser cada péptido posible con una secuencia predeterminada. En un aspecto preferido, el polipéptido a sintetizar es un agonista de GLP-1. El polipéptido puede ser un agonista de GLP-1, en donde el agonista de GLP-1 se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 y análogos y derivados del mismo, exendina-3 y análogos y derivados de la misma, exendina-4 y análogos y derivados de la misma. En un aspecto preferido, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en exendina-4 y lixisenatida. La lixisenatida es la más preferida. En un aspecto preferido adicional, el polipéptido se selecciona de albiglutida, dulaglutida y semaglutida.

La exendina-3, análogos y derivados de exendina-3, exendina-4 y análogos y derivados de exendina-4 se describen en los documentos de patente WO 01/04156, WO 98/30231, US 5.424.286, EP 99610043.4 y WO 2004/005342. La exendina-3, exendina-4 y los análogos y derivados de las mismas descritos en estos documentos se pueden sintetizar por el método según la invención, mientras que las modificaciones adicionales se pueden realizar después de finalizar la síntesis.

La lixisenatida (SEQ ID NO:1, Figura 2), exendina-4 (SEQ ID NO:2, Figura 2) y exendina-3 (SEQ ID NO:3, Figura 2) tienen un alto grado de identidad de secuencia. Las secuencias de lixisenatida y exendina-4 son idénticas en las posiciones 1 -37. La secuencia 1 -39 de exendina-4 es idéntica a la exendina-3 en 37 de 39 posiciones (94 %) (J. Biol. Chem. 267, 1992, 7402-7405). Las posiciones de secuencia se dan en el presente documento con respecto a la secuencia de lixisenatida o exendina-4. A partir de estas secuencias, el experto en la técnica puede determinar fácilmente posiciones correspondientes en otras secuencias.

Los análogos y derivados de exendina-3 o/y exendina-4 comprenden particularmente una secuencia de aminoácidos modificada. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos se modifica por deleción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, desPro³⁶, desPro³⁷, desAsp²⁸, desMet(O¹⁴) en la exendina-4 y las posiciones respectivas en la exendina-3). En un aspecto, se pueden sustituir uno o más aminoácidos (por ejemplo, Met(O¹⁴), Trp(O²)²⁵, isoAsp²⁸, Asp²⁸, Pro³⁸ en la exendina-4 y las posiciones respectivas en la exendina-3), en donde se pueden introducir aminoácidos que existen de forma natural o artificiales, tales como, por ejemplo, Met(O) (sulfóxido de metionina o metionina sulfona), Trp(O²) (N-formilquinurenina) o/y isoAsp (p-aspartato o isoaspartato). Los aminoácidos artificiales se pueden introducir fácilmente en la secuencia usando los elementos estructurales de aminoácido respectivos en el ciclo de síntesis. En un aspecto, el extremo C o/y el extremo N del polipéptido se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de secuencias, tales como -(Lys)-, -(Lys)²-, -(Lys)³-, -(Lys)⁴-, -(Lys)⁵-, -(Lys)⁶- y -Asn-(Glu)⁵-. En un aspecto preferido, secuencias de aminoácidos adicionales son, por ejemplo, -(Lys)⁴-, -(Lys)⁵-, -(Lys)⁶- y -Asn-(Glu)⁵-. El grupo carboxi carboxiterminal es preferentemente un grupo amina ácido (-NH²). Opcionalmente, la modificación del extremo C o/y el extremo N se realiza una etapa separada después de finalizar los ciclos de síntesis del método según la invención. Después de finalizar los ciclos de síntesis del método según la invención, las sales farmacéuticamente aceptables de los polipéptidos sintetizados se pueden formar opcionalmente en una etapa adicional. El experto en la técnica conoce los métodos de formación de sales farmacéuticamente aceptables de polipéptidos. Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas son, por ejemplo, sales de acetato.

En un aspecto de la divulgación, el agonista de GLP-1 se selecciona preferentemente del grupo que consiste en exendina-4, análogos y derivados de la misma y sales farmacéuticamente aceptables de la misma. En la invención, el agonista de GLP-1 se define en la reivindicación 10.

Un agonista de GLP-1 preferido adicional es un análogo de exendina-4 seleccionado del grupo que consiste en:

H-desPro³⁶-exendina-4-Lys⁶-NH² ,

H-des(Pro³⁶³⁷)-exendina-4-Lys⁴-NH² ,

H-des(Pro³⁶³⁷)-exendina-4-Lys⁵-NH² ,

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Un agonista de GLP-1 preferido adicional es un análogo de exendina-4 seleccionado del grupo que consiste en desPro³⁶[Asp²⁸]exendina-4 (1 -39),

desPro³⁶[IsoAsp²⁸]exendina-4 (1 -39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴,Asp²⁸]exendina-4 (1 -39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴, IsoAsp²⁸]exendina-4 (1-39),

desPro³⁶[Trp(O²)²⁵,Asp²⁸]exendina-4 (1-39),

desPro³⁶[Trp(O²)²⁵,IsoAsp²⁸]exendina-4 (1-39),

desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O²)²⁵,Asp²⁸]exendina-4 (1-39), desPro³⁶[Met(O)¹⁴Trp(O²)²⁵,IsoAsp²⁸]exendina-4(1-39),

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Un agonista de GLP-1 preferido adicional es un análogo de exendina-4 seleccionado de los grupos que se han descrito anteriormente, modificados adicionalmente con un péptido -Lys⁶-NH² en el extremo C.

Un agonista de GLP-1 preferido adicional es un análogo de exendina-4 seleccionado del grupo que consiste en:

H-(Lys)⁶-desPro³⁶[Asp²⁸]exendina-4(1-39)-Lys⁶-NH² ,

desAsp²⁸Pro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸exendina-4(1-39)-NH² ,

H-(Lys)⁶-desPro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendina-4(1-39)-NH² ,

H-Asn-(Glu)⁵desPro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendina-4(1-39)-NH² , desPro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendina-4(1-39)-(Lys)⁶-NH² ,

H-(Lys)⁶-desPro³⁶,Pro³⁷,Pro³⁸[Asp²⁸]exendina-4(1-39)-(Lys)⁶-NH² ,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36[T rp(O2)25,Asp28]exendina-4(1 -39)-Lys6-NH2,

H-desAsp28 Pro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25]exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,

desMet(O)14 Asp28 Pro36, Pro37, Pro38exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28] exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, desAsp28Pro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25]exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En un aspecto adicional, un agonista de GLP-1 preferido se selecciona del grupo que consiste en GLP-1 (en particular GLP-1(7-36) amida, SEQ ID NO:4), Arg34,Lys26(NE(Y-glutamil(Nahexadecanoil)))GLP-1(7-37) (liraglutida), albiglutida, dulaglutida, semaglutida y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. En particular, un agonista de GLP-1 preferido se selecciona del grupo que consiste en albiglutida, dulaglutida, semaglutida y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.

Un agonista de GLP-1 preferido adicional es lixisenatida (SEQ ID NO:1), así como sus sales farmacéuticamente aceptables.

En un aspecto, el polipéptido a sintetizar es preferentemente lixisenatida o exendina-4, en donde, después del acoplamiento del elemento estructural de aminoácido Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4), la etapa (b) se realiza durante aproximadamente 10 min con un reactivo de encapuchado que comprende 2 % v/v de anhídrido acético y 1 % v/v de diisopropiletilamina.

En un aspecto, el método según la invención comprende la síntesis de un polipéptido en forma de una síntesis en fase sólida. El método según la invención comprende opcionalmente una etapa adicional de:

(d) escindir el polipéptido unido a la fase sólida.

La etapa (d) se realiza particularmente cuando se completa la síntesis de la cadena de aminoácidos. La etapa (d) se puede realizar por escisión de un polipéptido unido a fase sólida de la fase sólida, que comprende poner en contacto la fase sólida, con la que el polipéptido está unido, con una composición que consiste esencialmente en ácido trifluoroacético y 1,2-etanoditiol, a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 23 °C a aproximadamente 29 °C.

La escisión se puede realizar con una composición que comprende ácido trifluoroacético en una cantidad de aproximadamente 95 a aproximadamente 99 % v/v.

La escisión también se puede realizar con una composición que comprende 1,2-etanoditiol en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 % v/v.

Preferentemente, la escisión se realiza con una composición que consiste esencialmente en ácido trifluoroacético en una cantidad de aproximadamente 97 % v/v, y 1,2-etanoditiol en una cantidad de aproximadamente 3 % v/v.

La escisión se puede realizar poniendo en contacto la composición con la fase sólida con la que está unido el polipéptido, a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 27 °C.

Preferentemente, la escisión se realiza poniendo en contacto la composición con la fase sólida con la que está unido el polipéptido, a una temperatura de aproximadamente 26 °C.

Lo más preferentemente, la escisión se realiza con una composición que consiste esencialmente en ácido trifluoroacético en una cantidad de aproximadamente 97 % v/v, y 1,2-etanoditiol en una cantidad de aproximadamente 3 % v/v, a una temperatura de aproximadamente 26 °C.

Lo más preferentemente, la escisión se realiza con una composición que consiste esencialmente en ácido trifluoroacético en una cantidad de aproximadamente 97 % v/v, y 1,2-etanoditiol en una cantidad de aproximadamente 3 % v/v, a una temperatura de aproximadamente 26 °C durante aproximadamente 4 h.

Un aspecto preferido de la invención se refiere a un método para la síntesis en fase sólida de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada, comprendiendo el método ciclos de acoplamiento de elementos estructurales de aminoácido con una cadena de aminoácidos,

en donde dichos elementos estructurales de aminoácido comprenden un grupo carboxilo carboxiterminal sin proteger y un grupo amino aminoterminal protegido,

y en donde dicha cadena de aminoácidos comprende un grupo amino aminoterminal sin proteger,

en donde al menos un ciclo de acoplamiento comprende las etapas:

(a) acoplar el elemento estructural de aminoácido carboxiterminalmente en el grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos, de manera que se forme un enlace amida entre la cadena de aminoácidos y el elemento estructural de aminoácido,

(b) poner en contacto el producto obtenido en la etapa (a) con un reactivo de encapuchado que comprende anhídrido acético, en donde el anhídrido acético se une a un grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos con la que no se ha acoplado elemento estructural en la etapa (a), y

(c) desproteger el grupo amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido,

en donde el reactivo de encapuchado comprende 0,5-5 % v/v de anhídrido acético, y 0,2-2 % v/v de diisopropiletilamina.

Una realización no cubierta por la invención reivindicada se refiere a una composición que comprende 0,5-5 % v/v de anhídrido acético y 0,2-2 % v/v de diisopropiletilamina en DMF, o que comprende 1-3 % v/v de anhídrido acético y 0­ 5-2 % v/v de diisopropiletilamina en DMF, o aproximadamente 2 % v/v de anhídrido acético y aproximadamente 1 %v/v de diisopropiletilamina en DMF.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición que comprende N-(benciloxicarboniloxi)succinimida en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de W-(benciloxicarboniloxi)succinimida es 1-3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición que comprende cloroformiato de bencilo en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de cloroformiato de bencilo es 1 -3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición que comprende un éster de ácido clorofórmico en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración del éster de ácido clorofórmico es 1­ 3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición que comprende 1-acetilimidazol en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de 1-acetilimidazol es 1-3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición que comprende dicarbonato de di-ferc-butilo en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de dicarbonato de di-ferc-butilo es 1­ 3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

Se describe además (pero no es parte de la invención) una composición de encapuchado que comprende N-(ferc-butoxicarboniloxi)succinimida en una concentración de 0,5-5 % v/v. En un aspecto preferido, la concentración de N-(ferc-butoxicarboniloxi)succinimida es 1-3 % v/v, más preferentemente aproximadamente 2 % v/v. La composición puede comprender DIPEA, como se describe en el presente documento.

La composición se puede usar para el encapuchado de grupos amino libres en la síntesis de un polipéptido, en particular en la síntesis de un polipéptido como se describe en el presente documento. Además, la composición se puede usar para la acetilación de un grupo amino unido a carbono libre como se describe en el presente documento. La composición se puede aplicar en la etapa (b) del método según la invención, por ejemplo durante un periodo de 10 min, después de la etapa de acoplamiento (a) de las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) de lixisenatida, exendina-3 o exendina-4, o las posiciones respectivas del análogo de GLP-1 adicional.

Otro aspecto más de la invención es el uso de la composición, como se reivindica para la acetilación de un grupo amino sin proteger en la síntesis de polipéptidos en fase sólida.

Abreviaturas

Ac(N1-N2): Fragmento aminoterminalmente acetilado de un polipéptido de la posición N1 a N2.

H(N1-N2) o (N1-N2): Fragmento de un polipéptido de la posición N1 a N2 que comprende una función amino aminoterminal libre.

Fmoc(N1-N2): Fragmento de un polipéptido de la posición N1 a N2 que comprende una función amino aminoterminal protegida, en donde el grupo protector es Fmoc.

Impureza (N-1): Se refiere a la aparición de un péptido no previsto durante la síntesis de péptidos, que carece de un elemento estructural en una cierta posición. En caso de que el polipéptido previsto tenga una longitud N, la impureza tiene una longitud de N-1. La aparición de impurezas (N-1) se previene por encapuchado.

Fmoc fluorenilmetoxicarbonilo

Boc terc-butoxicarbonilo

Bzl bencilo

Pbf 2,2,5,7,8-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo

tBu terc-butilo

OtBu O-terc-butilo

Trt tritilo

DIPE diisopropil éter

La invención se caracteriza además por las siguientes Figuras y Ejemplos.

Figuras

Figura 1: Síntesis en fase sólida de péptidos.

Figura 2: Secuencia de lixisenatida (SEQ ID NO:1), exendina-4 (SEQ ID NO:2), exendina-3 (SEQ ID NO:3) y GLP-1 (GLP-1 (7-36) amida, SEQ ID NO:4).

Figura 3: Aparición de secuencias erróneas acetiladas durante la síntesis de lixisenatida. Acoplamiento de Fmoc-Arg(20)-OH y posterior encapuchado/escisión de Fmoc. Se debe observar que la posición 21 (Leu) se omitió de la síntesis. (1) Fmoc-(22-44)+Arg, (2) (22-44)+Arg, (3) Ac(22-44)+Arg, (4) Fmoc-(22-44)+Arg+Val. Los datos muestran que los fragmentos acetilados ya se han formado durante la etapa de encapuchado, sin embargo, la posición errónea está acetilada [Ac(22-24)+Arg ya está ocurriendo durante el encapuchado de Arg].

Figura 4: Aparición de secuencias erróneas acetiladas durante la síntesis de lixisenatida. Acoplamiento de Fmoc-Gln(13)-OH y posterior encapuchado/escisión de Fmoc. (1) Ac(14-44), (2) Fmoc(13-44), (3) Ac(13-44), (4) (13­ 44), (5) (14-44). Los datos muestran que los fragmentos acetilados ya se han formado durante la etapa de encapuchado, sin embargo, la posición errónea está acetilada (Ac(13-44)).

Figura 5: Aparición de secuencias erróneas acetiladas durante la síntesis de lixisenatida. Acoplamiento de Fmoc-Lys(12)-OH y posterior encapuchado/escisión de Fmoc. (1) Ac(13-44), (2) Fmoc(12-44), (3) Ac(12-44), (4) (12­ 44). Los datos muestran que los fragmentos acetilados ya se han formado durante la etapa de encapuchado, sin embargo, la posición errónea está acetilada (Ac(12-44)).

Figura 6: Comparación de la síntesis de lixisenatida usando el método de encapuchado según la invención (B) en comparación con el encapuchado con 10 % de anhídrido acético y 5 % v/v de DIPEA en DMF durante 20 min (A) por medio de cromatografía HPLC. (C) Solapamiento de cromatogramas de HPLC de (A) y (B).

Figura 7: HPLC de lixisenatida (producto en bruto). Rojo: subproductos acetilados no deseados.

Figura 8: Formación de Ac(36-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 9: Formación de Ac(23-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 10: Formación de Ac(21-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 11: Formación de Ac(19-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 12: Formación de Ac(18-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 13: Formación de Ac(15-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 14: Formación de Ac(12-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 15: Formación de Ac(8-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 16: Formación de Ac(6-44), que depende de la mezcla y la temperatura de encapuchado.

Figura 17: Comparación del contenido de Ac(X-44) en el encapuchado en 9 posiciones diferentes en la síntesis de lixisenatida a 15 °C, temperatura ambiente (TA) y 30 °C.

Figura 18: Comparación del contenido de Ac[(X-1)-44] en el encapuchado en 9 posiciones diferentes en la síntesis de lixisenatida a 15 °C, temperatura ambiente (TA) y 30 °C.

Figura 19: Comparación del contenido de Ac(X-44) en el encapuchado en condiciones diferentes, o sin encapuchado, en 9 posiciones diferentes en la síntesis de lixisenatida en diferentes condiciones de encapuchado.

Figura 20: Comparación del contenido de Ac[(X-1)-44] en el encapuchado en condiciones diferentes, o sin encapuchado, en 9 posiciones diferentes en la síntesis de lixisenatida en diferentes condiciones de encapuchado.

Ejemplo 1

Síntesis de lixisenatida

La sustancia activa lixisenatida es una amida de polipéptido compuesta de 44 aminoácidos; el acetato hace de contraion.

En el código unilítero, la secuencia de aminoácidos de la lixisenatida es la siguiente: H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2

La cadena peptídica se construyó por medio de síntesis lineal en fase sólida, a partir del extremo C, Lys-44.

El método de síntesis es la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, en la que una resina de amida Rink se usó para obtener una amida de péptido. Las reacciones se llevaron a cabo en DMF a temperatura ambiente. Entre las reacciones, el lavado se llevó a cabo repetidamente, principalmente con DMF, siendo llevada a cabo una de las etapas centrales de lavado con isopropanol.

La síntesis de lixisenatida sobre el soporte polimérico puede ser dividida en las siguientes etapas:

• Acoplamiento del primer Fmoc-aminoácido (Fmoc-Lys(Boc)-OH) con la resina de Rink

• Encapuchado del grupo amino sin reaccionar

• Escisión del grupo protector Fmoc temporal

• Acoplamiento de los Fmoc-aminoácidos o Fmoc-dipéptidos adicionales

• Encapuchado del grupo amino sin reaccionar

• Escisión de Fmoc final

• Escisión de lixisenatida de la resina y retirada simultánea de los grupos protectores de cadena lateral El ciclo de síntesis se ilustra en la Figura 1.

1.1 Acoplamiento del primer Fmoc-aminoácido (Fmoc-Lys(Boc)-OH) con la resina de Rink

Antes de que empiece la síntesis, la resina de amida Rink se hinchó en DMF. El hinchamiento se llevó a cabo durante 2-15 h. Posteriormente, el grupo protector Fmoc temporal se escindió de la resina de amida Rink usando 25 % de piperidina en DMF. Esta escisión se realizó dos veces; tiempo de escisión de 5 minutos y 20 minutos. Tras la escisión de Fmoc, la resina se lavó repetidamente con DMF y una vez con isopropanol.

El acoplamiento del primer Fmoc-aminoácido, Fmoc-Lys(Boc)-OH, se llevó a cabo en un exceso de 2,4 eq, para cargar la resina. El hidrato de HOBt, HBTU y DIPEA sirvieron de reactivos de acoplamiento. El tiempo de acoplamiento fue 60-120 min.

Para cargar completamente la resina de Rink con Fmoc-Lys(Boc)-OH, se llevó a cabo una carga adicional con los reactivos de acoplamiento hidrato de HOBt y DIC. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. La mezcla se agitó mientras se llevó a cabo la etapa 1.1. Posteriormente se llevó a cabo el encapuchado.

1.2 Encapuchado del grupo amino sin reaccionar

La consecuencia de la carga incompleta de la resina es que hasta ahora los grupos amino sin reaccionar se encontraban sobre la resina. Estos se inactivaron y, por lo tanto, no estuvieron disponibles para el acoplamiento adicional, añadiendo una mezcla de anhídrido acético/DIPEA/DMF (10:5:85). La mezcla de encapuchado siguió sobre la resina durante 20 minutos mientras se agitaba. El grupo amino libre restante está acilado. Posteriormente, la resina se lavó repetidamente con DMF y una vez con isopropanol.

En los Ejemplos 4 y 5 se describe un método de encapuchado según la invención al menos en 5 posiciones de una síntesis de lixisenatida.

1.3. Escisión del grupo protector Fmoc temporal

El grupo protector Fmoc temporal se escindió usando 25 % de piperidina en DMF. Esta escisión se realizó dos veces; tiempo de escisión de 5 minutos y 20 minutos. Tras la escisión de Fmoc, la resina se lavó repetidamente con DMF y una vez con isopropanol.

1.4 Acoplamiento de Fmoc-aminoácidos o Fmoc-dipéptidos adicionales

Se acopló el siguiente Fmoc-aminoácido con el grupo amino desprotegido sobre la resina. El acoplamiento se llevó a cabo en DMF en diferentes equivalentes. Los tiempos de acoplamiento estuvieron entre 2 h y 18 h. Se usaron HOBt/DIC, y también HBTU/DIPEA, como reactivos de acoplamiento.

Se usaron los siguientes derivados como Fmoc-aminoácidos:

• Fmoc-Lys(Boc)-OH

• Fmoc-Ser(tBu)-OH

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-Ala-OH x H²O

Fmoc-Gly-OH

Fmoc-Asn(Trt)-OH

Fmoc-Leu-OH

Fmoc-T rp(Boc)-OH

Fmoc-Glu(OtBu)-OH x H²O

Fmoc-Ile-OH

Fmoc-Phe-OH

Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-Val-OH

Fmoc-Met-OH

Fmoc-Gln(Trt)-OH

Fmoc-Asp(OtBu)-OH

Fmoc-Thr(tBu)-OH

Fmoc-His(Trt)-OH

Alternativamente, también fue posible usar Fmoc-dipéptidos (método según la invención):

Fmoc-Pro-Pro-OH (CAS 129223-22-9)

Fmoc-Ala-Pro-OH (CAS 186023-44-9)

Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH (CAS 113247-80-6)

Fmoc-Gly-Pro-OH (CAS 212651-48-4)

Fmoc-Gly-Gly-OH (CAS 35665-38-4)

Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH (de Bachem B-3630)

Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH (CAS 866044-63-5)

Fmoc-His(Trt)-Gly-OH

Si se encontró que el acoplamiento era incompleto según la prueba de Kaiser (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 1970, 595), fue posible acoplamiento adicional. Para este fin, el Fmoc-aminoácido se acopló otra vez, junto con HBTU/DIPEA/hidrato de HOBt.

1.5 Encapuchado del grupo amino sin reaccionar

Véase la descripción en el punto 1.2.

1.6 Escisión de Fmoc final

La escisión de Fmoc final se llevó a cabo como se describe en el punto 1.3. La resina se lavó finalmente nuevamente con diisopropil éter y se secó a presión reducida.

1.7 Escisión de lixisenatida de la resina y retirada simultánea de los grupos protectores de la cadena lateral La escisión de lixisenatida de la amida de Rink se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 6.

1.8 Síntesis de lixisenatida con uso inventivo de dipéptidos

El acoplamiento del primer Fmoc-Lys(Boc)-OH con la resina se llevó a cabo con HBTU/DIPEA/hidrato de HOBt. Después del acoplamiento del primer aminoácido Fmoc-Lys(Boc)-OH con la amina libre de la resina de amida Rink, las siguientes etapas de proceso se realizaron en un ciclo que se repite infinitamente (véanse también las etapas 1.3 a 1.6):

• Escisión de Fmoc escisión

• Acoplamiento

• Acoplamiento adicional, si fuera necesario

• Encapuchado

• Después del acoplamiento de la unidad de aminoácido final, se escinde el grupo Fmoc aminoterminal.

Los aminoácidos protegidos con Fmoc habituales se acoplaron con DIC/HOBt, siendo el exceso de aminoácidos y reactivos de acoplamiento entre 2 y 4 equivalentes.

En las posiciones Pro(36) y Pro(37), en lugar de dos derivados de aminoácidos Fmoc-Pro-OH, el dipéptido Fmoc-Pro-Pro-OH se acopló con h BTu /DIPeA.

En la posición Pro(31), el acoplamiento se llevó a cabo con HBTU/DIPEA/hidrato de HOBt.

En las posiciones His(1) y Gly(2), en lugar de los derivados de aminoácido Fmoc-His(Boc)-OH y Fmoc-Gly-OH, se acopló el dipéptido Fmoc-His(Trt)-Gly-OH.

Después de los acoplamientos, el encapuchado se llevó a cabo en cada caso con Ac²O/DIPEA, como se describe en los Ejemplos 4 y 5.

La escisión de Fmoc se realizó con 25 % de piperidina en DMF, en cada caso sucesivamente primero con 5 minutos de tiempo de reacción, luego con 20-40 minutos de tiempo de reacción.

La integridad del acoplamiento se comprobó por medio de una prueba de Kaiser.

Después del último acoplamiento y la última escisión del grupo Fmoc, la resina se lavó, en primer lugar repetidamente con DMF, luego con isopropanol y finalmente con diisopropil éter, y se secó posteriormente a 35 °C a presión reducida. La escisión del péptido en bruto de la resina se llevó a cabo en ácido trifluoroacético con secuestrantes, tales como 1.2- etanoditiol.

El péptido en bruto se purificó en un proceso de HPLC de dos etapas con gel de sílice C18 RP como fase sólida. En la primera etapa de purificación, se usó un sistema de tampón con acetonitrilo/agua con 0,1 % de TFA; en la segunda etapa, se usó un sistema tampón con acetonitrilo/agua con AcOH. Después de la concentración de las disoluciones reunidas, el péptido puro se obtuvo por liofilización.

El uso de 3500 g de resina de amida Rink con una carga de 0,3 mmoles/g (es decir, un lote de 1,05 moles) dio 9970 g de péptido sobre resina. De la misma se obtuvieron 4636 g de péptido en bruto.

Después de la purificación, se obtuvieron 576 g de péptido puro de la misma. EM: 4855,5 (masa molar monoisotópica); hallada 4855,6. Secuenciación de aminoácidos: secuencia correcta hallada. Ensayo: 89,0 % (tal cual).

1.9 Síntesis de lixisenatida sin uso de dipéptidos

La cadena peptídica se construyó por medio de síntesis lineal en fase sólida, a partir del extremo C, Lys-44.

Los aminoácidos protegidos con Fmoc se acoplaron con DIC/HOBt, siendo el exceso de aminoácidos y reactivos de acoplamiento entre 2 y 4 equivalentes.

En las posiciones Pro(37), Pro(36), Pro(31), el acoplamiento se llevó a cabo con HBTU/DIPEA/hidrato de HOBt. Cada acoplamiento fue seguido de encapuchado con Ac²O/DIPEA. La escisión de Fmoc se realizó con 25 % de piperidina en DMF, en cada caso sucesivamente primero con 5 minutos de tiempo de reacción, luego con 20 minutos de tiempo de reacción.

La integridad del acoplamiento se comprobó por medio de una prueba de Kaiser. Después del último acoplamiento y la última escisión del grupo Fmoc, la resina se lavó, en primer lugar repetidamente con DMF, luego con isopropanol y finalmente con diisopropil éter, y se secó posteriormente a 35 °C a presión reducida.

La escisión del péptido en bruto de la resina se llevó a cabo en ácido trifluoroacético con secuestrantes, tales como 1.2- etanoditiol, tioanisol, fenol y agua.

El péptido en bruto se purificó en un proceso de HPLC de dos etapas con gel de sílice C18 RP como fase sólida. Después de la concentración de las disoluciones reunidas, el péptido puro se obtuvo por liofilización. La Tabla 1 compara el contenido de D-His-lixisenatida racemizada y el contenido de algunas impurezas en el péptido puro entre las síntesis usando los dipéptidos y sin los dipéptidos.

Tabla 1

Los datos muestran que el uso del dipéptido Fmoc-His(Trt)-Gly-OH da una lixisenatida que no contiene elevados valores de D-His procedentes de la racemización. Además, cuando se usa Fmoc-His(Trt)-Gly-OH, la desGly(2)-lixisenatida ya no se encuentra. Además, no aparecieron los péptidos N-1 y N+1 en la proximidad de la posición de cadena Pro(36) y Pro(37) (por ejemplo, desPro(36)-lixisenatida o diPro(36)lixisenatida).

Ejemplo 2

Síntesis, purificación y caracterización de exendina-4 (según la invención)

La sustancia activa exendina-4 es una amida de polipéptido compuesta de 39 aminoácidos; el acetato hace de contraion.

En el código unilítero, la secuencia de aminoácidos es del siguiente modo:

H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2

MW 4186,66 g/mol; MW (monoisotópico) = 4184,03 g/mol.

La síntesis de exendina-4 se llevó a cabo exactamente a como se describe en la síntesis de lixisenatida, según la secuencia mencionada anteriormente. En las posiciones 1 y 2, el acoplamiento se llevó a cabo en un ciclo con Fmoc-His(Trt)-Gly-OH. En las posiciones 37 y 38, el acoplamiento se llevó a cabo en un ciclo con Fmoc-Pro-Pro-OH. En las otras posiciones, el acoplamiento se llevó a cabo con Fmoc-aminoácidos (unidades de monoaminoácido).

El uso de 26,666 g de resina de amida Rink con una carga de 0,42 mmol/g (es decir, un lote de 11,2 mmoles) dio 74 g de péptido sobre la resina. A partir de éste, se escindieron 65 g de péptido sobre la resina, y se obtuvieron 28 g de péptido en bruto. Para la purificación, a partir de este, se usaron 21,3 g de péptido en bruto, y se obtuvieron 4,01 g de péptido puro. EM: 4184,03 (masa molar monoisotópica): hallada 4185,1 [M+H]. Pureza 98,25 % de líq.

El uso de los dipéptidos confirma los resultados que se obtuvieron para la lixisenatida. El uso del dipéptido Fmoc-His(Trt)-Gly-OH da una exendina-4 que no contiene valores elevados de D-His procedentes de la racemización. Además, cuando se usa Fmoc-His(Trt)-Gly-OH, ya no se encuentra desGly(2)-exendina-4. Además, no aparecieron los péptidos N-1 y N+1 en la proximidad de la posición de cadena Pro(36) y Pro(37) (por ejemplo, desPro(36)-exendina-4 o diPro(36)exendina-4).

Ejemplo 3

Síntesis de Fmoc-His(Trt)-Gly-OH

3.1 Fmoc-His(Trt)-Gly-Obzl

Se disolvieron 40 g de Fmoc-His(Trt)-OH junto con 32,7 g de tosilato de H-Gly-OBzl y 29,37 g de HBTU en 400 ml de acetato de etilo. A partir de aquí, se añadieron 33,32 ml de N-etilmorfolina. La reacción se agitó durante 4 h a 30 °C.

A partir de aquí, la extracción se llevó a cabo tres veces con 256 g de una disolución al 8 % de bicarbonato sódico cada vez, y luego se lavó una vez con 250 ml de agua. La mitad de la disolución resultante de acetato de etilo se evaporó y se procesó adicionalmente en la siguiente etapa.

3.2 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH

Fmoc-HisfF rt}-Gly-OBzl

Fmoc-HisfT rtj-Gly-OH

Se añadieron THF y metanol a la fase de acetato de etilo, de manera que se formara una mezcla 5:2:2 (p/p/p) de THF/acetato de etilo/MeOH. Posteriormente, se añadieron 10 g de catalizador de paladio sobre carbono (5 %), y esta mezcla se hidrogenó a 30 °C y a presión de hidrógeno de 1,1 bares durante 2,5 h.

A partir de aquí, el catalizador se separó por filtración y la disolución resultante se evaporó hasta que empezó a formarse un precipitado. La posterior agitación se llevó a cabo durante 1 h y la disolución se dejó reposar a temperatura ambiente durante 4 días. El producto se separó por filtración y posteriormente se extrajo agitando en 2-butanona a 80 °C durante 4 h. Rendimiento: 32,9 g de Fmoc-His(Trt)-Gly-OH (75 %).

Ejemplo 4

Secuencias erróneas acetiladas durante la síntesis de lixisenatida

4.1 Determinación del contenido de secuencias erróneas acetiladas durante la síntesis de lixisenatida

Algunas secuencias erróneas acetiladas se pueden observar en el perfil de HPLC del producto de lixisenatida en bruto. Estas surgen normalmente de grupos amino sin reaccionar sobre la resina que se encapucha. Lo que se logra por el encapuchado es que no puedan ocurrir impurezas (N-1), que se diferencian solo ligeramente del producto deseado y son, por lo tanto, difíciles de eliminar por purificación.

La integridad y también la cinética de acoplamiento en posiciones seleccionadas se monitorizaron por degradación de Edman. Se tomó una muestra de resina de la síntesis de lixisenatida y se escindió el grupo Fmoc de la misma. Esta muestra de resina se sometió entonces a degradación de Edman y de esta forma fue posible determinar la relación entre el aminoácido acoplado con el aminoácido (N-1), del cual se pudo deducir directamente el rendimiento de acoplamiento. Los resultados de la degradación de Edman (Tabla 2) muestran altos valores de acoplamiento. Estos valores son tan altos que no pueden explicar las cantidades de secuencias erróneas acetiladas (datos de HPLC en la Tabla 2). Esto significa que debe haber una forma alternativa de formar estos subproductos. La elucidación de esta situación se describirá en las siguientes secciones.

Tabla 2: Rendimientos de acoplamiento y contenidos de fragmentos acetilados durante la síntesis de lixisenatida. Se comparan entre sí el porcentaje de contenidos de secuencias erróneas acetiladas de datos de HPLC y los resultados de Edman (elución conjunta de Ac(6-44), Ac(5-44) y Ac(4-44)).

4.2 Formación de secuencias erróneas acetiladas

Para investigar los momentos en el ciclo de síntesis en los que se forman las secuencias erróneas acetiladas, se tomaron muestras de resina durante un ciclo de acoplamiento, y el péptido se escindió y se investigó usando CL-EM. Estas investigaciones se llevaron a cabo en las posiciones de acoplamiento de Fmoc-Arg(20)-OH y acoplamiento de Fmoc-Gln(13)-OH.

En el acoplamiento de Fmoc-Arg(20)-OH con el péptido unido en la fase sólida de la secuencia parcial de lixisenatida H(22-24), se tomaron muestras después de tiempos de acoplamiento de 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 24 h y también después del encapuchado, la posterior escisión de Fmoc y el acoplamiento de valina(19). Como se puede apreciar en la Figura 3, la secuencia errónea Ac(22-44)+Arg apareció por primera vez durante la etapa de encapuchado (3,1 %). Durante el encapuchado, por lo tanto, se escindió (perdió) una porción pequeña del grupo Fmoc y se aciló inmediatamente. Para explicar la designación Ac(22-24)+Arg, se debe indica que la posición 21 (Leu) se omitió de la síntesis.

El mismo experimento se realizó para el acoplamiento de Fmoc-Gln(13)-OH durante la síntesis de lixisenatida (Figura 4). En este caso, la secuencia errónea Ac(13-44) se observó (4,6 %) por primera vez durante la escisión de Fmoc después del acoplamiento y el encapuchado de glutamina(13). En el transcurso restante de la síntesis después del acoplamiento de Fmoc-Lys(12)-OH, se puede observar que también se formó Ac(12-44) (4,1 %) durante el encapuchado (véase la Figura 5).

El experimento muestra que es necesario buscar condiciones de encapuchado en las cuales se previene la formación no deseada de la secuencia errónea acetilada del aminoácido N° (el último acoplado), sin ser reducida la capacidad de encapuchado de la mezcla usada hasta un grado significativo, tal que ya no se encapuche una posible impureza (N-1).

4.3 Variación en las condiciones de encapuchado

Se investigaron los acoplamientos de Fmoc-Arg(20)-OH, Fmoc-Leu(10)-OH, Fmoc-Gly(4)-OH y Fmoc-Thr(5)-OH. Se compararon entre sí diversas condiciones de encapuchado.

Las condiciones de encapuchado se variaron en una síntesis de laboratorio de lixisenatida. Se prestó atención particular al contenido de Ac(N-44) no deseado y Ac([N-1]-44) deseado. Las condiciones probadas son las siguientes:

• 10 % de anhídrido acético/5 % de DIPEA en DMF durante 20 minutos (comparación)

• 10 % de anhídrido acético/5 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos (comparación)

• 2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 20 minutos

• 2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos

Las investigaciones se llevaron a cabo en las posiciones Arg(20), Leu(10), Thr(5) y Gly(4). Los resultados se compilan en las Tablas 3-6.

Los datos también se compararon con el resultado de una síntesis de GMP de lixisenatida ("encapuchado de GMP" en las Tablas 3-6). Las condiciones de encapuchado correspondieron con las condiciones 10 % de anhídrido acético/5 % de DIPEA en DMF. El tiempo de contacto de la resina con la mezcla de encapuchado en el lote de GMP fue 7-8 minutos más largo, y fue, por lo tanto, 27-28 minutos. Esto surgió del tiempo más largo necesario para bombear la mezcla de encapuchado.

4.3.1 Acoplamiento en la posición Arg(20)

Se acopló Fmoc-Arg(Pbf)-OH a Leu(21). En aquellas cadenas en las que no tuvo lugar el acoplamiento (producto H(21-44)), el producto Ac(21-44) se formó por el posterior encapuchado. Ambos productos Ac(20-44) y H(20-44) se forman cuando, durante el encapuchado, el grupo Fmoc se escinde de forma no deseable (formación de H(20-44)) y la acetilación (formación de Ac(2044)).

Puede observarse claramente en la Tabla 3 que el grado de formación de los productos no deseados H(20-44) y Ac(20-44) depende de tanto el tiempo de encapuchado como de la cantidad de anhídrido acético y DIPEA (véase la columna % de Ac(20-44)). El mayor valor en porcentaje se puede observar en el encapuchado de GMP. El menor contenido de Ac(20-44) se encuentra en las condiciones "2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos".

La potencia de encapuchado de las diversas mezclas de encapuchado (y por tanto, el uso original previsto) es aproximadamente el mismo (véase la columna Ac(21-44)), es decir, todas las mezclas de encapuchado convierten H(21-44)). La mezcla "2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos" también cumple el fin deseado de evitar las impurezas (N-1).

Tabla 3: Resultados del acoplamiento de Fmoc-Arg(Pbf)-OH en la posición 20. La tabla muestra el contenido de fragmentos acetilados y no acetilados dependiendo de las condiciones de encapuchado. Los resultados se obtuvieron por medio de CL-EM. Los datos se compararon con los resultados de una síntesis de GMP ("encapuchado de GMP").

4.3.2 Acoplamiento en las posiciones Leu(10), Gly(4) y Thr(5)

Los resultados para Leu(10) se dan en la Tabla 4 y confirman los resultados que se obtuvieron para la posición Arg(20). El contenido de productos no deseados Ac(10-44) y H(10-44), que se forman durante el encapuchado de los grupos amino libres del producto H(11 -44), es más bajo en las condiciones "2 % de anhídrido acético, 1 % de DIPEA durante 10 minutos". La potencia de encapuchado es comparable en las diferentes mezclas de encapuchado.

Tabla 4: Resultados del acoplamiento de Fmoc-Leu-OH en la posición 10. La tabla muestra el contenido de fragmentos acetilados y no acetilados dependiendo de las condiciones de encapuchado. Los resultados se obtuvieron por medio de CL-EM.

Para el acoplamiento de Gly(4) también, el contenido de los productos no deseados Ac(4-44) depende de la mezcla de encapuchado y el tiempo de reacción. La potencia de encapuchado es la misma en las diferentes mezclas (Tabla 5).

Tabla 5: Resultados del acoplamiento de Fmoc-Gly-OH en la posición 4. La tabla muestra el contenido de fragmentos acetilados y no acetilados dependiendo de las condiciones de encapuchado. Los resultados se obtuvieron por medio de LC-MS.

Además de las posiciones Arg(20), Leu(10) y Gly(4), también se investigó la posición Thr(5). A diferencia de las tres posiciones anteriores, el contenido del producto no deseado Ac(N-44) (Ac(5-44) en la posición 5) es aproximadamente el mismo en las diversas condiciones de encapuchado. Sin embargo, la potencia de encapuchado de las diferentes mezclas también es comparable aquí (Tabla 6).

Tabla 6: Resultados del acoplamiento de Fmoc-Thr(tBu)-OH en la posición 5. La tabla muestra el contenido de fragmentos acetilados y no acetilados dependiendo de las condiciones de encapuchado. Los resultados se obtuvieron por medio de CL-EM.

4.3.3 Resumen

En las posiciones Arg(20), Leu(10) y Gly(4), la mezcla de encapuchado suave (2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos) es suficiente para mantener el efecto deseado de evitar impurezas (N-1) por acilación. Sin embargo, en estos tres casos, la formación respectiva de Ac(20-44), Ac(10-44) y Ac(4-44) depende del tiempo de encapuchado y también de la mezcla de encapuchado. Esto no aplica a la posición Thr(5).

Ejemplo 5

Síntesis de lixisenatida

El ejemplo se refiere a la síntesis de lixisenatida (véase SEQ ID NO:1). Al comienzo de la síntesis, el conector unido a la fase sólida lleva un grupo protector Fmoc. Las unidades de aminoácidos individuales se acoplaron a partir del extremo C (posición 44) hacia el extremo N en ciclos de acoplamiento, que consisten en las etapas de

• Escisión de Fmoc

• Acoplamiento de la unidad de aminoácidos protegida con Fmoc y

• Encapuchado.

En las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) y Gly(4), se usó el método de encapuchado según la invención (2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos). Para estas posiciones, las instrucciones para un ciclo de acoplamiento se describen a continuación. En las otras posiciones, el encapuchado se llevó a cabo con 10 % de anhídrido acético/5 % de DIPEA en DMF durante 20 minutos. Este encapuchado se describe, a modo de ejemplo, en la posición Thr(5). El método de encapuchado según la invención comprende condiciones más suaves.

El tamaño de lote fue 1050 mmoles de resina Rink.

5.1. Acoplamiento de Fmoc-Arg(Pbf)-OH en la posición 20

5.1.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 l de DMF al reactor, seguido de una mezcla de 7,9 l de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, luego se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 30 minutos; entonces el filtrado con aspiración se llevó a cabo otra vez. Después de la escisión de Fmoc, la resina se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 l), DMF (31,1 l), isopropanol (31,1 l), DMF (31,1 l), DMF (8 l), DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor se llenó aquí cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego la agitación se llevó a cabo durante 3 minutos y el filtrado con aspiración se llevó a cabo otra vez.

5.1.2 Acoplamiento de Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 2,125 kg de FmocArg(Pbf)-OH y se añadieron 5,3 l de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 502 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 l de DMF. Finalmente, se añadieron 413 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y el encapuchado continuó inmediatamente.

5.1.3 Encapuchado (según la invención)

El reactor se llenó con 26,3 I de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 1,2 I de DMF, 0,53 I de anhídrido acético y 0,26 I de diisopropiletilamina (DIPEA) en una botella de 2 l de Schott y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 10 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 veces en la siguiente secuencia: DMF (24 I), isopropanol (31,1 l), DMF (8 I), DMF (31,5 I), DMF (31,5 I). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.2. Acoplamiento de hidrato de Fmoc-Glu(OtBu)-OH en la posición 17

5.2.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 I de DMF al reactor, seguido por una mezcla de 7,9 I de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, luego se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 30 min; entonces se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración. Después de la escisión de Fmoc, la resina se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 I), DMF (31,1 I), isopropanol (31,1 I), DMF (31,1 l), DMF (8 I), DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.2.2 Acoplamiento de hidrato de Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 1,453 kg de hidrato de FmocGlu(OtBu)-OH y se añadieron 5,3 I de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 502 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 I de DMF. Finalmente, se añadieron 413 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y continuó inmediatamente el encapuchado.

5.2.3 Encapuchado (según la invención)

El reactor se llenó con 26,3 I de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 1,2 I de DMF, 0,53 I de anhídrido acético y 0,26 I de diisopropiletilamina (DIPEA) en una botella de 2 l de Schott y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 10 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 veces en la siguiente secuencia: DMF (24 I), isopropanol (31,1 l), DMF (8 I), DMF (31,5 I), DMF (31,5 I). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.3 Acoplamiento de Fmoc-Gln(Trt)-OH en la posición 13

5.3.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 I de DMF al reactor, seguido por una mezcla de 7,9 I de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, a continuación se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 35 minutos; luego se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración. Después de la escisión de Fmoc, la resina se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 l), DMF (31,1 l), isopropanol (31,1 l), DMF (31,1 l), DMF (8 I), DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor se llenó aquí cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.3.2 Acoplamiento de Fmoc-Gln(Trt)-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 2,001 kg de FmocGln(Trt)-OH y se añadieron 5,3 I de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 502 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 I de DMF. Finalmente, se añadieron 413 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y continuó inmediatamente el encapuchado.

5.3.3 Encapuchado (según la invención)

El reactor se llenó con 26,3 I de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 1,2 I de DMF, 0,53 I de anhídrido acético y 0,26 I de diisopropiletilamina (DIPEA) en una botella de 2 l de Shott y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 10 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 veces en la siguiente secuencia: DMF (24 I), isopropanol (31,1 l), DMF (8 I), DMF (31,5 I), DMF (31,5 I). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.4 Acoplamiento de Fmoc-Leu-OH en la posición 10

5.4.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 I de DMF al reactor, seguido por una mezcla de 7,9 I de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, luego se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 35 minutos; entonces se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración. Después de la escisión de Fmoc, la resina ^{se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 l), DMF (31,1 l), isopropanol (31,1 l), DMF (31,1 l),} D^mF ^{(8 I),} DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, luego se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.4.2 Acoplamiento de Fmoc-Leu-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 1,158 kg de Fmoc-Leu-OH y se añadieron 5,3 I de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 502 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 I de DMF. Finalmente, se añadieron 413 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y continuó inmediatamente el encapuchado.

5.4.3 Encapuchado (según la invención)

El reactor se llenó con 26,3 l de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 1,2 l de DMF, 0,53 l de anhídrido acético y 0,26 l de diisopropiletilamina (DIPEA) en una botella de 2 l de Shott y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 10 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 veces en la siguiente secuencia: DMF (24 l), isopropanol (31,1 l), DMF (8 l), DMF (31,5 l), DMF (31,5 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, entonces se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.5 Acoplamiento de Fmoc-Gly-OH en la posición 4

5.5.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 I de DMF al reactor, seguido por una mezcla de 7,9 I de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, luego se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 35 minutos; entonces se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración. Después de la escisión de Fmoc, la resina ^{se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 l), DMF (31,1 l), isopropanol (31,1 l), DMF (31,1 l),} D^mF ^{(8 I),} DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, entonces se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.5.2 Acoplamiento de Fmoc-Gly-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 1,217 kg de Fmoc-Gly-OH y se añadieron 5,3 I de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 627 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 I de DMF. Finalmente, se añadieron 517 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y continuó inmediatamente el encapuchado.

5.5.3 Encapuchado (según la invención)

El reactor se llenó con 26,3 l de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 1,2 l de DMF, 0,53 l de anhídrido acético y 0,26 l de diisopropiletilamina (DIPEA) en una botella de Shott de 2 l y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 10 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 veces en la siguiente secuencia: DMF (24 l), isopropanol (31,1 l), DMF (8 l), DMF (31,5 l), DMF (31,5 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, entonces se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.6 Acoplamiento de Fmoc-Thr(tBu)-OH en la posición 5

5.6.1 Escisión de Fmoc

Se añadieron 7 I de DMF al reactor, seguido por una mezcla de 7,9 I de piperidina en 16,6 l de DMF. Esta mezcla se agitó durante 5 minutos, luego se filtró con aspiración. Este proceso se repitió y la agitación se llevó a cabo durante 35 minutos; entonces se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración. Después de la escisión de Fmoc, la resina ^{se lavó 7 veces en la siguiente secuencia: DMF (31,1 l), DMF (31,1 l), isopropanol (31,1 l), DMF (31,1 l),} D^mF ^{(8 I),} DMF (31,1 l), DMF (31,1 l). El reactor aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, entonces se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.6.2 Acoplamiento de Fmoc-Thr(tBu)-OH

Se añadieron 21 l de DMF al reactor. A partir de aquí, se pesaron 1,628 kg de FmocThr(tBu)-OH y se añadieron 5,3 I de DMF. Después de la disolución completa, esta disolución se vació en el reactor, seguido por una disolución de 627 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) en 2,2 I de DMF. Finalmente, se añadieron 517 g de N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) al reactor. El tiempo de acoplamiento fue 6-18 h. Después del acoplamiento, el disolvente se separó por filtración de la resina por aspiración y continuó inmediatamente el encapuchado.

5.6.3 Encapuchado

El reactor se llenó con 10,5 I de DMF. Al mismo tiempo, se mezclaron 15,8 I de DMF, 3,2 I de anhídrido acético y 1,6I de diisopropiletilamina (DIPEA) en un recipiente de mezcla y se añadió a la resina en el reactor. El reactor se agitó durante 20 minutos, luego se llevó a cabo el filtrado con aspiración. Después del encapuchado, la resina se lavó 5 ^{veces en la siguiente secuencia: DMF (24 I), isopropanol (31,1 I), DMT (8 I), DMF (31,5 I),} D^mF ^{(31,5 I). El reactor} aquí se llenó cada vez con el disolvente de lavado respectivo, entonces se llevó a cabo la agitación durante 3 minutos y se llevó a cabo nuevamente el filtrado con aspiración.

5.7 Resultados

El cromatograma de HPLC del producto en bruto de la síntesis de lixisenatida con el método de encapuchado según la invención en las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) y Gly(4), y el encapuchado en los otros acoplamientos como se describe en 5.6.3, se muestra en la Figura 6. Se indican los picos con las impurezas acetil(20-44), acetil(17-44), acetil(13-44), acetil(10-44) y acetil(4-44)/acetil(6-44).

5.8 Comparación

Se llevaron a cabo las etapas de encapuchado de todos los acoplamientos, como se describe en 5.6.3, conduciendo a la elevada formación de secuencias erróneas no deseadas Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) y Ac(4-^{44)/Ac(6-44). El cromatograma de HPLC de una lixisenatida en bruto de esta prueba se muestra en la Figura} 6^a. La Figura 6B muestra un cromatograma de HPLC de lixisenatida en bruto, sintetizada con el método de encapuchado según la invención en las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) y Gly(4).

La Figura 6C muestra la superposición de los cromatogramas de HPLC cromatogramas de la Figura 6A y B. Es evidente que la síntesis de lixisenatida usando el método de encapuchado según la invención en la operación en lotes condujo a una reducción distinta en las secuencias erróneas Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) y Ac(4-44)/Ac(6-44).

Usando una mezcla de encapuchado más suave (2 % de anhídrido acético/1 % de DIPEA en DMF durante 10 minutos), fue posible reducir el nivel de secuencias erróneas acetiladas de Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) y Ac(4-44) en el producto en bruto de lixisenatida o eliminarlas de ésta. Puesto que un producto en bruto de lixisenatida que se preparó por el encapuchado según la invención incluyó los subproductos acetilados Ac(17-44), Ac(13-44) y Ac(10-44), en particular en cantidades considerablemente reducidas, se simplificó la purificación de lixisenatida. Como resultado, la reunión de las fracciones después de la primera serie de cromatografía preparativa de lixisenatida dio más fracciones que cumplieron los criterios de especificación y así no tuvieron que ser desechadas. Esto condujo a un rendimiento mejorado.

Ejemplo 6

Encapuchado en 9 posiciones específicas en la síntesis de lixisenatida

Como se trata en el Ejemplo 5, el uso de condiciones de encapuchado "suaves" en la síntesis de lixisenatida en las posiciones Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) o/y Gly(4) podría mejorar el perfil de subproductos no deseados.

Este ejemplo describe la influencia de las condiciones de encapuchado tras la formación de subproductos acetilados y no acetilados. Se realizaron variaciones en la temperatura (15 °C, temperatura ambiente [20 °C-23 °C], 30 °C), duración del encapuchado y los componentes de la composición de encapuchado:

• sin encapuchado,

• condiciones suaves de encapuchado: 10 min de encapuchado con 2 % de anhídrido acético y 1 % de DIPEA (diisopropiletilamina)

• condiciones "normales" de encapuchado: 20 min de encapuchado con 10 % de anhídrido acético y 5 % de DIPEA (comparación)

• 40 min de encapuchado con 10 % de anhídrido acético y 5 % de DIPEA (comparación)

Las condiciones de encapuchado de la presente invención son las "condiciones suaves". Estas condiciones se usaron en el Ejemplo 5. Se encontró que estas condiciones eran ventajosas.

En las 9 posiciones seleccionadas en este ejemplo, se obtienen secuencias acetiladas en el encapuchado de la posición (N-1) (Figura 7). Además, la retirada no deseada del grupo Fmoc en el elemento estructural de aminoácido puede ocurrir durante la etapa de encapuchado. El grupo amino sin proteger puede estar acetilado por el reactivo de encapuchado o la composición de encapuchado. A este respecto, condiciones de encapuchado mejoradas pueden evitar la escisión no deseada del grupo Fmoc.

6.1 Encapuchado en la posición 36/35, después del acoplamiento del elemento estructural de dipéptido Pro­ Pro, (36-44)

Se produjo el péptido Fmoc-(36-44)-AVE0010 por síntesis en fase sólida. La resina se dividió en seco en 4 porciones. Cada porción se sometió a uno de cuatro procedimientos de encapuchado descritos anteriormente a temperatura ambiente (20 °C-23 °C). Las muestras se secaron, y el péptido se escindió de la resina. Este procedimiento se repitió, en donde el encapuchado se realizó a 15 °C o 30 °C.

Se obtuvieron un total de 12 muestras de péptido. Las 12 muestras de péptido se analizaron con LCMS. Los pesos moleculares se determinaron a partir de la TIC (corriente iónica total). Se determinaron los pesos moleculares de los siguientes compuestos:

Tabla 7

Tabla 8 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento Fmoc-ProPro y encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total).

Los resultados se describen en la Figura 8. No se encontraron los compuestos (36-44), (38-44) y Ac(38-44), o se encontraron en pequeñas cantidades. La cantidad del producto no deseado Ac(36-44) aumenta con la concentración de la mezcla de encapuchado y la duración del encapuchado en la mayoría de los casos. La cantidad de este producto aumenta con la temperatura.

6.2 Encapuchado en la posición 23, después del acoplamiento de la Ile estructural, (23-44)

La síntesis de Fmoc(23-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Se realizaron experimentos a 15 °C/30 °C y a temperatura ambiente con diferentes lotes.

La Tabla 9 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento de Fmoc-Ile y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 9. Dependiendo del reactivo de encapuchado a TA y 30 °C, el contenido de compuesto no deseado Ac(23-44) aumenta. El encapuchado "normal" a 20 °C resulta en 0,26 % de Ac(23-44). La prolongación del encapuchado (40 min en lugar de 20 min) tiene un impacto negativo sobre el contenido de Ac(23-44).

La formación del producto deseado Ac(24-44) es independiente de la composición de encapuchado.

6.3 Encapuchado en la posición 21, después del acoplamiento de la Leu del elemento estructural, (21-44) La síntesis de Fmoc(21-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C/30 °C y a temperatura ambiente se realizaron con diferentes lotes.

La Tabla 10 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento de Fmoc-Leu y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptidos total)

Los resultados se describen en la Figura 10. El contenido de compuesto no deseado Ac(21 -44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(21-44) aumenta con la temperatura. La formación del compuesto deseado Ac(22-44) es independiente de la composición de encapuchado. Incluso sin encapuchado, este compuesto se forma.

6-4 Encapuchado en la posición 19, después del acoplamiento de la Val del elemento estructural, (19-44) La síntesis de Fmoc(19-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Experimentos a 15 °C/30°C y a temperatura ambiente se realizaron con diferentes lotes.

La Tabla 11 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento de Fmoc-Val y la subsecuencia de encapuchado (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 11. El contenido de compuesto Ac(19-44) en el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30°C. El contenido de compuesto Ac(19-44) aumenta con la temperatura. Formación del compuesto deseado Ac(20-44) aumenta con la concentración de la composición de encapuchado. El contenido de (20-44) no deseado disminuye al aumentar la concentración de la composición de encapuchado.

6.5 Encapuchado en la posición 18, después del acoplamiento de la Ala del elemento estructural, (18-44) La síntesis de Fmoc(18-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C/30 °C y a temperatura ambiente se realizaron con diferentes lotes.

La Tabla 12 muestra el contenido de productos obtenido después del acoplamiento de Fmoc-Ala y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 12. El contenido de compuesto no deseado Ac(18-44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(18-44) aumenta al aumentar la temperatura desde 15 °C hasta 30 °C.

La formación del compuesto deseado Ac(19-44) aumenta a 15 °C y 30 °C con la concentración de la composición de encapuchado.

6.6 Encapuchado en la posición 15, después del acoplamiento de la Glu del elemento estructural, (15-44) La síntesis de Fmoc(15-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C/30 °C y a temperatura ambiente se realizaron con diferentes lotes.

La Tabla 13 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento de Fmoc-Glu y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 13. El contenido de compuesto no deseado Ac(15-44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(15-44) aumenta con la temperatura. La formación del compuesto deseado Ac(16-44) es independiente de la composición de encapuchado. Incluso sin encapuchado, este compuesto se forma.

6.7 Encapuchado en la posición 12, después del acoplamiento de la Lys del elemento estructural, (12-44) La síntesis de Fmoc(12-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C/30 °C y a temperatura ambiente se realizaron con diferentes lotes.

La Tabla 14 muestra el contenido de productos obtenidos después del acoplamiento de Fmoc-Lys y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 14. El contenido de compuesto no deseado Ac(12-44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(12-44) aumenta con la temperatura. La formación del compuesto deseado Ac(13-44) es independiente de la composición de encapuchado. Incluso sin encapuchado, este compuesto se forma.

6.8 Encapuchado en la posición 8, después del acoplamiento de la Ser del elemento estructural, (8-44) La síntesis de Fmoc(8-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C, TA y 30 °C se realizaron con el mismo lote.

La Tabla 15 muestra el contenido de productos obtenido después del acoplamiento Fmoc-Ser y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 15. El contenido de compuesto no deseado Ac(8-44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(8-44) aumenta con la temperatura.

6.9 Encapuchado en la posición 6, después del acoplamiento de la Phe del elemento estructural, (6-44) La síntesis de Fmoc(86-44) se realizó como se describe en la sección 6.1. Los experimentos a 15 °C, TA y 30 °C se realizaron con el mismo lote.

La Tabla 16 muestra el contenido de productos obtenido después del acoplamiento Fmoc-Phe y el encapuchado de subsecuencias (% de contenido de péptido total)

Los resultados se describen en la Figura 16. El contenido de compuesto no deseado Ac(6-44) es el mayor a "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" a 15 °C, TA y 30 °C. El contenido de compuesto Ac(6-44) aumenta con la temperatura.

La formación del compuesto deseado Ac(7-44) es independiente de la composición de encapuchado. Incluso sin encapuchado, este compuesto se forma.

La temperatura tiene solo una ligera influencia sobre la formación del compuesto deseado Ac(7-44). El contenido de (7-44) no deseado disminuye al aumentar la resistencia de la composición de encapuchado.

6.10 Sumario

La formación no deseada del compuesto Ac(X-44) depende fuertemente de la duración del encapuchado, la composición de encapuchado y la temperatura de encapuchado. Al aumentar la duración del encapuchado, aumentar la temperatura de encapuchado y un elevado contenido de anhídrido acético y DIPEA en la composición de encapuchado, aumenta el contenido del compuesto Ac(X-44) no deseado.

6.11 Encapuchado en condiciones "normales", dependiendo de la temperatura.

Las Figuras 17 y 18 resumen los datos obtenidos en el encapuchado a diferentes temperaturas en las 9 posiciones en la síntesis de lixisenatida en condiciones "normales", 20 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA", como se describe en este ejemplo.

La Figura 17 muestra una comparación del encapuchado de GMP de Ac(X-44), dependiendo de la temperatura de reacción. Los valores dados para 15 °C y 30 °C son desviaciones positivas y negativas de los valores de "temperatura ambiente" (área gris).

La formación de producto no deseado Ac(X-44) es < 0,5 % en 5 de las 9 posiciones, en 3 posiciones entre 0,5 % y 1 %, y en solo una posición > 1 %. Se observa un gran aumento a 30 °C, mientras que a 15 °C disminuye ligeramente la formación de Ac(X-44).

Esto significa que el encapuchado de GMP "20 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" se puede realizar en diferentes posiciones entre 15 °C y temperatura ambiente, que puede ser 20-23 °C.

La Figura 18 muestra una comparación de encapuchado de GMP de Ac[(X-1)-44], dependiendo de la temperatura de reacción. Los valores dados para 15 °C y 30 °C so desviaciones positivas y negativas de los valores de "temperatura ambiente" (área gris).

Con respecto a la formación deseada de los compuestos Ac[(X-1)-44] a TA, la desviación a 15 °C es entre 0,23 y -0,25 %. A 30 °C, la desviación es entre 0,29 y -0,33 %. La formación del producto de encapuchado deseado Ac[(X-1 )-44] es así menos dependiente de la temperatura que la formación no deseada de Ac(X-44).

A 15 °C y 30 °C, las desviaciones negativas del contenido de compuesto deseado Ac[(X-1)-44] se observan en vista del encapuchado a temperatura ambiente. Esto significa que el encapuchado con condiciones "normales" se debe realizar a temperatura ambiente.

6.12 Encapuchado con diferentes composiciones de encapuchado a temperatura ambiente.

Las Figuras 19 y 20 resumen los datos obtenidos en el encapuchado con diferentes composiciones de encapuchado a temperatura ambiente en las 9 posiciones en la síntesis de lixisenatida, como se describe en este ejemplo.

La Figura 19 muestra una comparación del contenido de Ac(X-44), que depende de la composición de encapuchado a temperatura ambiente. Los valores dados para las condiciones de "sin encapuchado", "suave" y "40 min" son desviaciones positivas y negativas de los valores de "encapuchado normal" (área gris).

La formación de producto no deseado Ac(X-44) bajo "20 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" y "40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA" es la mayor. La formación de Ac(X-44) en condiciones "normales" (40 min, 10 % de Ac2O, 5 % de DIPEA) es entre 0,2 % y 1,12 %. Se observa una fuerte disminución en las condiciones suaves de encapuchado.

La Figura 20 muestra una comparación del contenido de Ac[(X-1 )-44], que depende de la composición de encapuchado a temperatura ambiente. Los valores dados para "sin encapuchado", "suave" y "40 min" son desviaciones positivas y negativas de los valores de "encapuchado normal" (área gris).

La formación del producto deseado Ac[(X-1)-44] en las condiciones "sin encapuchado", "suave" y "40 min" está dentro de -0,14 % y 0,16 % en vista de las condiciones "normales".

En particular, en condiciones "suaves" (10 min, 2 % de Ac2O, 1 % de DIPEA) de la invención, se puede lograr un encapuchado suficiente en la síntesis de lixisenatida.

En resumen, las condiciones de encapuchado suave, en particular el encapuchado durante 10 min con 2 % de Ac2O y 1 % de DIPEA en un disolvente, son ventajosas en la síntesis en fase sólida de lixisenatida, como se describe en el presente documento.

Si se omite el encapuchado después del acoplamiento en ciertas posiciones de aminoácidos, puede ser que sea difícil de retirar durante el proceso de purificación los subproductos no deseados que comprenden una secuencia de aminoácidos incompleta y que está presente en pequeña cantidad.

Ejemplo 7

Escisión de lixisenatida de la fase sólida

Este ejemplo se refiere a la escisión según la invención de lixisenatida de una fase sólida. Se proporcionó una fase sólida (resina Rink), a la que se unió el péptido lixisenatida. El péptido se sintetizó en la resina por acoplamiento escalonado de unidades de aminoácido.

Como prueba comparativa, se llevó a cabo una escisión según el estado de la técnica (King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36: 255-266).

El método de escisión según la invención se distingue del método del estado de la técnica por los siguientes cambios:

• Temperatura de reacción de 20 °C a 26 °C

• El número de componentes en la mezcla de escisión se redujo de 5 a 2 constituyentes, combinado con un aumento en la relación entre resina y mezcla de escisión usada.

Tabla 17: Comparación del método de escisión según la invención y la escisión según el estado de la técnica. Las diferencias se indican en negrita/subrayado.

Usando la escisión según la invención, en comparación con la escisión según el estado de la técnica, fue posible aumentar los rendimientos de la lixisenatida en bruto en aproximadamente 5 % (desde el 20 % hasta el 25 %), mientras que el perfil de impurezas solo se alteró ligeramente.

El método de este ejemplo es adecuado para el aumento de escala hasta planta piloto y escala de producción. La Tabla 18 resume los resultados obtenidos en el proceso comparativo (véase la Tabla 17). Se usaron tres lotes diferentes lotes 2E002, 2B008 y 2B006 de lixisenatida-resina (1-44). Las medias y la desviación estándar se calculan para cada lote por separado. La comparación entre diferentes condiciones de escisión se debe hacer en pruebas usando el mismo lote de lixisenatida-resina (1 -44). En diferentes lotes, la síntesis en fase sólida puede tener un impacto sobre el rendimiento. Si no se indica de otro modo, se usaron 10 g de lixisenatida-resina(1-44) como material de partida.

Tabla 18: Contenido de lixisenatida en la resina, y rendimiento de lixisenatida después de la escisión de lixisenatida a partir de la resina en condiciones normales (proceso comparativo, véase la Tabla 17).

7.1 Rendimiento de escisión dependiente de la temperatura de escisión entre 20 °C y 35 °C

La escisión de la lixisenatida-resina(1-44) se realizó en condiciones normales (proceso comparativo, véase la Tabla 17) durante 4 h.

Tabla 19: Rendimiento de escisión dependiente de la temperatura

Resultados: El rendimiento de lixisenatida después de la escisión en condiciones normales aumenta al aumentar la temperatura hasta el óptimo de aproximadamente 26 °C. Sorprendentemente, un aumento de temperatura desde 23 °C hasta 26 °C produce un aumento significativo en el rendimiento.

7.2 Rendimiento de escisión dependiente de la duración de la escisión

La escisión de la lixisenatida-resina(1-44) se realizó en condiciones normales (proceso comparativo, véase la Tabla 17) a 20 °C.

Tabla 20: Rendimiento de escisión dependiente de la duración de la escisión

Resultados: El rendimiento de lixisenatida aumenta al aumentar la duración de la escisión. Se alcanza un rendimiento máximo después de aproximadamente 8 h de escisión.

7.3 Rendimiento de la escisión que depende de la temperatura en la duración de la escisión de 12 h

La escisión de lixisenatida-resina(1-44) se realizó en condiciones normales (proceso comparativo, véase la Tabla 17) durante 4 h.

Tabla 21: Rendimiento de la escisión que depende de la temperatura en la duración de la escisión de 12 h

Resultados: El rendimiento aumenta en una duración de la escisión de 12 h si la temperatura de reacción es elevada. Se obtiene un máximo rendimiento a 26 °C, como se describe en el Ejemplo 7.1 durante la escisión de 4 h. Pruebas 70586-044 (4 h, 26 °C, Ejemplo 7) y 70586-045 (12 h, 26 °C) produjeron rendimientos similares (14,8 % frente a 14,0 %).

7.4 Rendimiento de la escisión que depende de la temperatura de escisión hasta 20 °C

La escisión de la lixisenatida-resina(1-44) se realizó en condiciones normales (proceso comparativo, véase la Tabla 17) durante 4 h.

Tabla 22: Rendimiento de la escisión que depende de la temperatura de escisión hasta 20 °C

Resultados: La escisión a una temperatura inferior a 20 °C requiere duraciones de la escisión más largas, como es de esperar, para alcanzar el rendimiento obtenido por escisión a 20 °C durante 4 h (condiciones normales, proceso comparativo, Tabla 17).

7.5 Mezcla de escisión modificada

El proceso normal usa una mezcla de escisión que contiene cinco componentes: fenol, tioanisol, 1,2-etanoditiol, agua y TFA. El sujeto del ejemplo son mezclas de escisión simplificadas, omitiendo uno a tres de tioanisol, fenol y agua. Se determina el rendimiento de la escisión de lixisenatida de lixisenatida-resina(1 -44). La mezcla de "no modificación" se describe en la Tabla 17, "Proceso comparativo".

Tabla 23: Mezcla de escisión modificada

Resultados: La omisión de uno o más componentes produce un aumento del rendimiento, excepto la prueba 71002­ 010 (omisión de tioanisol).

Una mezcla de escisión simplificada (mezcla de escisión) tiene varias ventajas:

(a) simplificación de la analítica y el control de calidad,

(b) costes reducidos,

(c) manipulación facilitada en el proceso de producción.

7.6 Contenido de TFA y 1,2-etanoditiol en la mezcla de escisión

A partir de la prueba 71002-042, se investigó la influencia de la relación TFA:1,2-etanoditiol sobre el rendimiento de la escisión:

Tabla 24: Diferente relación de TFA y 1,2-etanoditiol en la mezcla de escisión

Resultados: Un aumento en el contenido de 1,2-etanoditiol produce una disminución significativa del rendimiento de lixisenatida. Se encontró que la relación TFA:1,2-etanoditiol de 8,25:0,25 era la relación con mayor rendimiento (lote 2E002). Este resultado se confirmó por los experimentos usando el lote 2B008.

7.7 Volumen de la mezcla de escisión

Se investigó la influencia del volumen (y así la concentración) de la mezcla de escisión.

Tabla 25: Rendimiento de la escisión, que depende del volumen de la mezcla de escisión.

Resultados: La reducción de hasta el 30 % no tiene influencia sobre el rendimiento de la escisión. Mayores reducciones de volumen conducen a una reducción del rendimiento.

7.8 Hinchamiento del "péptido sobre resina" con un codisolvente (tolueno o CH ² CI ² ) antes de la escisión El fundamento tras este experimento es el resultado de que la escisión de lixisenatida de la resina puede producir un aumento en la temperatura de hasta 5-8 °C, que puede conducir a la formación de subproductos no deseados y posiblemente tiene un impacto negativo sobre la estabilidad y así el rendimiento de la escisión. El hinchamiento del "péptido sobre resina" en un disolvente orgánico puede reducir la exotermia y así puede aumentar el rendimiento.

T a b la 26: R e nd im ie n to de la e sc is ió n , que d e p e n d e de la p re se n c ia de un co d iso lve n te .

Resultados: El hinchamiento con un codisolvente orgánico no aumenta el rendimiento de la escisión.

7.9 Concentración en presencia de un codisolvente

La presencia de un codisolvente, que tiene un mayor punto de ebullición que TFA, y en el que la lixisenatida es insoluble, puede aumentar el rendimiento después de la escisión de la resina, debido a que durante la destilación de TFA del filtrado, la presencia del codisolvente puede conducir a la precipitación de la lixisenatida y, por lo tanto, puede prevenir la degradación de la lixisenatida durante la escisión en mezcla de King.

Tabla 27: Rendimiento de la escisión, que depende de la presencia de un codisolvente durante la destilación de

TFA.

Resultados: La presencia de tolueno en la destilación del filtrado después de la escisión de lixisenatida de la resina conduce a un rendimiento ligeramente elevado.

7.10 Procedimiento de escisión optimizada de la invención

Basándose en los resultados anteriormente descritos obtenidos en este ejemplo, se seleccionaron y probaron condiciones de escisión optimizadas del siguiente modo:

(a) temperatura de reacción de 26 °C,

(b) la mezcla de escisión consiste en TFA y 1,2-etanoditiol. La mezcla contuvo aproximadamente 97 % de TFA y aproximadamente 3 % de 1,2-etanoditiol. Se usó una cantidad de 8,25 ml/g de "péptido sobre resina" de TFA y 0,25 ml/g de "péptido sobre resina" de 1,2-etanoditiol.

El rendimiento de la escisión de esta mezcla, en comparación con la mezcla comparativa normal, se probó en los lotes 2E002 y 2B008.

T a b la 28 : P ro ce d im ie n to de e sc is ió n o p tim iza d a de la in ven c ión

Resultados: En ambos lotes, el rendimiento aumentó en aproximadamente 5 %, que indica una mejora significativa de la escisión de péptidos de la fase sólida por el método de la invención.

7.11 Segunda escisión (posterior)

Después de la escisión, usando la mezcla comparativa (mezcla de King) o la mezcla de escisión de la invención, se realizó una segunda escisión (posterior) (véase la Tabla 17).

La primera escisión se realizó, se obtuvo un filtrado. El TFA se añadió a la resina húmeda de TFA. Después de 1 h de agitación, la resina se filtró. Los filtrados se combinaron y se concentraron.

Se investigó el efecto de la segunda escisión posterior sobre el rendimiento de lixisenatida.

Tabla 29: Influencia de una segunda escisión (posterior) del rendimiento de lixisenatida. EDT: 1,2-etanoditiol.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la síntesis en fase sólida de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada, comprendiendo el método ciclos de acoplamiento de elementos estructurales de aminoácido a una cadena de aminoácidos,

en donde dichos elementos estructurales de aminoácido comprenden un grupo carboxilo carboxiterminal sin proteger y un grupo amino aminoterminal protegido,

y en donde dicha cadena de aminoácidos comprende un grupo amino aminoterminal sin proteger,

en donde al menos un ciclo de acoplamiento comprende las etapas:

(a) acoplar el elemento estructural de aminoácido carboxiterminalmente en el grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos, de manera que se forme un enlace amida entre la cadena de aminoácidos y el elemento estructural de aminoácido,

(b) poner en contacto el producto obtenido en la etapa (a) con un reactivo de encapuchado que comprende un compuesto de encapuchado, en donde el compuesto de encapuchado se une a un grupo amino aminoterminal sin proteger de la cadena de aminoácidos al que no se ha acoplado ningún elemento estructural en la etapa (a), y en donde el compuesto de encapuchado es anhídrido acético, y

(c) desproteger el grupo amino aminoterminal del elemento estructural de aminoácido, en donde el reactivo de encapuchado comprende 0,5-5 % v/v de anhídrido acético y 0,2-2 % v/v de diisopropiletilamina.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el reactivo de encapuchado comprende 1 -3 % v/v de anhídrido acético, preferentemente 2 % v/v de anhídrido acético.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reactivo de encapuchado comprende 0,5-2 % v/v de diisopropiletilamina, preferentemente 1 % v/v de diisopropiletilamina.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reactivo de encapuchado comprende 1 % v/v de diisopropiletilamina y 2 % v/v de anhídrido acético.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reactivo de encapuchado comprende DMF.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (b) se realiza a una temperatura de 15-25 °C.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (b) se realiza durante 5 a 15 min.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el elemento estructural de aminoácido comprende un a-aminoácido.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el elemento estructural de aminoácido se selecciona de Arg, Glu, Gln, Leu y Gly.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido es un agonista de GLP-1 seleccionado de GLP-1, exendina-3, exendina-4 y análogos de exendina-4 seleccionados del grupo que consiste en:.

H-desPro36-exendina-4-Lys6-NH2,

H-des(Pro36’37)-exendina-4-LyS4-NH2,

H-des(Pro36’37)-exendina-4-LyS5-NH2,

desPro36[Asp28]exendina-4 (1 -39),

desPro36[IsoAsp28]exendina-4 (1 -39),

desPro36[Met(O)10 *4,Asp28]exendina-4 (1 -39),

desPro36[Met(O)14, IsoAsp28]exendina-4 (1-39),

desPro36[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4 (1-39),

desPro36[Trp(O²)25, IsoAsp28]exendina-4 (1-39),

desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,Asp28]exendina-4 (1-39), desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,IsoAsp28]exendina-4(1-39) desPro36[Asp28]exendina-4 (1 -39)-Lys6-NH2,

desPro36[IsoAsp28]exendina-4 (1 -39)-Lys6-NH2, desPro36[Met(O)14,Asp28]exendina-4 (1 -39)-Lys6-NH2, desPro36[Met(O)14,IsoAsp28]exendina-4 (1 -39)-Lys6-NH2, desPro36[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4 (1-39)-Lys6-NH2, desPro36[Trp(O2)25,IsoAsp28]exendina-4 (1-39)-Lys6-NH2, desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,Asp28]exendina-4 (1-39)-Lys6-NH2, desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,IsoAsp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36[Asp28]exendina-4(1-39)-LyS6-NH2, desAsp28Pro36,Pro37,Pro38exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-NH2,

H-Asn-(Glu)5desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36[T rp(O2)25,Asp28]exendina-4(1 -39)-Lys6-NH2,

H-desAsp28 Pro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25]exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36, Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro31, Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36, Pro37, Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-Asn-(Glu)5-desPro36, Pro37, Pro38[T rp(O2)25,Asp28]exendina-4(1 -39)-(Lys)6-NH2, H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, desMet(O)14 Asp28 Pro36 Pro37, Pro38exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2,

H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36, Pro37, Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1 -39)-(Lys)6-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14, T rp(O2)25,Asp28]exendina-4(1 -39)-Lys6-NH2, desAsp28Pro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25]exendina-4(1-39)-NH2,

H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]exendina-4(1-39)-NH2, desPro36 Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido se selecciona de exendina-4, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida y semaglutida.

12. Uso de una composición para la acetilación de un grupo amino sin proteger en la síntesis de polipéptidos en fase sólida, comprendiendo dicha composición 0,5-5 % v/v de anhídrido acético y 0,2-2 % v/v de diisopropiletilamina en DMF.

13. El uso de la reivindicación 12, en el presente documento la composición comprende 1 % v/v de diisopropiletilamina y 2 % v/v de anhídrido acético en DMF.