KR20200142032A - 캡핑을 사용한 릭시세나티드 합성 - Google Patents

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토비아스 메첸틴
만프레드 게르켄
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사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 N-말단 보호된 아미노산 빌딩 블록을 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시키는 커플링 사이클을 포함하며, 적어도 하나의 커플링 사이클은 커플링 단계 (a), 캡핑 단계 (b) 및 탈보호 단계 (c)를 포함한다.

Description

캡핑을 사용한 릭시세나티드 합성
본 발명은 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 N-말단 보호된 아미노산 빌딩 블록을 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시키는 커플링 사이클을 포함하며, 적어도 하나의 커플링 사이클은 커플링 단계 (a), 캡핑 단계 (b) 및 탈보호 단계 (c)를 포함한다.
본 발명은 추가로 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물 및 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 조성물, 및 폴리펩타이드 합성에서 비보호된 아미노 기의 아세틸화를 위한 캡핑 시약으로서의 그의 용도에 관한 것이다.
확립된 고체상 펩타이드 합성 방법은 합성할 아미노산 사슬의 사전 결정된 C-말단 아미노산을 링커를 통해 폴리머 운반체로 커플링시키는 것을 교시한다. 커플링을 위해 사용되는 아미노산은 N-말단 보호된 아미노 기를 갖는 아미노산 빌딩 블록이며, 상기 보호기는 일시적으로 연결된 Fmoc 기이다. 성공적인 커플링 후에, Fmoc 보호기를 절단하며, 다음의 Fmoc-보호된 아미노산 빌딩 블록을 이전의 아미노산 빌딩 블록의 자유 아미노 작용기와 커플링시킨다. 원하는 아미노산 사슬이 합성되는 경우, 그것은 고체상으로부터 절단된다. 도 1은 기재된 접근법의 개요를 제공하고 있다.
커플링 반응이 항상 완전한 것은 아니기 때문에, 남아 있는 자유 아미노 기는 아세트산 무수물로 아세틸화될 수 있다(도 1 참조). 이 반응은 캡핑으로 지칭된다. 캡핑의 목적은 아마도 원하는 최종 산물로부터 분리하기 어려울 (N-1) 불순물(즉, 하나의 위치에서 아미노산 빌딩 블록이 결여된 산물)의 발생을 방지하는 것이다.
문헌에는, 펩타이드의 고체상 합성을 위한 수많은 캡핑 혼합물이 기재되어 있다. 필즈(Fields) 등(문헌[PNAS 85, 1384-1388, 1988])은 그라미시딘 A(gramicidine A)의 합성을 위하여, 염화메틸렌 중 아세트산 무수물 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하였다. 먼저, 20 ㎖의 염화메틸렌 중 1 당량의 DIPEA를 첨가한다. 5분 후에, 4 당량의 아세트산 무수물을 첨가한다. 총 인큐베이션 시간은 20분이다. 에리차(Eritja) 등(문헌[Tetrahetron 43, 2675-2680, 1987])은 캡핑 과정을 위한, 30분의 인큐베이션 시간과 조합된 DMF 중 대략 9%의 아세트산 무수물 및 대략 16%의 DIPEA의 용도를 교시한다. 에흐너(Echner) 등은 캡핑 과정을 위한 아세트산 무수물, 피리딘 및 염화메틸렌의 혼합물을 개시한다(문헌[Liebigs Ann. Chem. 1988, 1095-1097]).
본원에 참조로 포함된 WO 01/04156 A1호에 기재된 릭시세나티드(lixisenatide)(AVE0010 또는 ZP-10으로도 알려져 있음)의 고체상 합성은 임의의 캡핑 반응 없이 각각 동일한 방식으로 개별 Fmoc-보호된 아미노산 빌딩 블록의 커플링을 포함한다.
릭시세나티드는 서열 desPro36엑센딘(exendin)-4(1-39)-Lys6-NH2를 갖는다. 이 물질은 WO 01/04156호, SEQ ID NO:93(본 출원의 SEQ ID NO:1 및 도 2 참조)에 개시된다. 엑센딘은 혈당 농도를 낮출 수 있는 펩타이드의 군이다. 엑센딘은 GLP-1(7-36)의 서열과 소정의 유사성을 갖는다(53%, 문헌[G
Figure pct00001
ke et al., J. Biol. Chem. 268, 19650-55]). 엑센딘-3 및 엑센딘-4는 엑센딘 수용체와의 상호작용에 의해 기니피그의 췌장 샘 세포에서 증가하는 세포 cAMP 생성을 자극한다(문헌[Raufman, 1996, Reg. Peptides 61:1-18]). 엑센딘-3은 엑센딘-4와 대조적으로, 췌장 샘 세포에서 아밀라제 방출의 증가를 초래한다. 엑센딘은 GLP-1 길항제로서 작용한다.
글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1)은 글루코스 또는 지방의 경구 섭취 후에 인슐린 반응을 향상시키는 내분비 호르몬이다. GLP-1은 일반적으로 글루카곤 농도를 낮추고, 위 배출을 둔화시키고, (프로-)인슐린 생합성을 자극하고, 인슐린에 대한 감수성을 증가시키고, 인슐린-독립적인 글리코겐 생합성을 자극한다(문헌[Holst (1999), Curr. Med. Chem. 6:1005], 문헌[Nauck et al. (1997), Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 105:187], 문헌[Lopez-Delgado et al. (1998), Endocrinology 139:2811]). 인간 GLP-1은 37개의 아미노산 잔기를 갖는다(문헌[Heinrich et al., Endocrinol. 115:2176 (1984)], 문헌[Uttenthal et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. (1985), 61:472]). GLP-1의 활성 단편은 GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-37)을 포함한다.
엑센딘-3, 엑센딘-4 및 엑센딘 효능제가 위 배출 및 운동성을 감소시키기 때문에, 그들이 진성 당뇨병의 치료 및 고혈당증의 예방을 위해 사용될 수 있다는 점이 제안되었다(US 5,424,286호 및 WO 98/0535 A1호).
엑센딘 유사체는 고유 엑센딘-4 서열의 아미노산 치환 및/또는 C-말단 절두를 특징으로 할 수 있다. 이러한 엑센딘 유사체는 WO 99/07404호, WO 99/25727호 및 WO 99/25728호에 기재되어 있다.
본 발명자들은 Fmoc-보호된 아미노산 빌딩 블록을 사용한 릭시세나티드의 일반적인 고체상 합성의 미정제 산물이 다른 아세틸화된 오류 서열에 관하여 증가된 양의 소정의 아세틸화된 오류 서열을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 예상치 않게 확연한 불순물들은 특히 Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) 및 Ac(4-44)이다.
본 발명이 해결할 문제는 펩타이드 합성에서 발생하는 아세틸화된 오류 서열의 양을 감소시키고, 이에 따라, 펩타이드 합성의 수율을 향상시키는 것이다. 특히, 미정제 산물에서 증가된 양을 갖는 아세틸화된 오류 서열의 양을 감소시켜야 한다.
릭시세나티드 고체상 합성의 캡핑 단계 동안, 이제 막 커플링된 아미노산 빌딩 블록의 일부로부터 Fmoc-보호기가 바람직하지 않게 절단된다는 것이 관찰되었다. 이 바람직하지 않은 절단은 합성 사이클 동안 소정의 아미노산 위치에서의 캡핑에 대해서만 검출되었다. 이들 위치 중 5개는 하기와 같다:
● Arg(20)의 커플링 후의 캡핑,
● Glu(17)의 커플링 후의 캡핑,
● Gln(13)의 커플링 후의 캡핑,
● Leu(10)의 커플링 후의 캡핑,
● Gly(4)의 커플링 후의 캡핑.
이에 따라, 본 출원이 해결할 추가의 문제는 원하지 않는 아세틸화된 산물이 더 이상 이러한 증가된 양으로 존재하지 않는 캡핑 조건을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 더욱 온건한 캡핑 조건의 적용이 미정제 산물에서 더 낮은 부산물 농도를 야기하거나, 심지어 그들의 완전한 소거를 야기한다는 것이 관찰되었다. 부산물 Ac(17-44), Ac(13-44) 및 Ac(10-44)(이들의 크로마토그래피 피크는 의도된 산물의 크로마토그래피 피크와 가까움)를 감소시키거나 완전히 제거함으로써, 미정제 산물로부터 의도된 산물의 정제가 매우 용이하게 된다. 덜 혼합된 분획이 발생하기 때문에, 정제된 릭시세나티드의 수율은 증가한다. 부산물 Ac(20-44) 및 Ac(4-44)(이들의 피크는 의도된 산물 피크로부터 더 멀리 있음)의 농도 또한 온건한 캡핑 조건에 의해 최소화되기 때문에, 수율은 추가로 증가한다.
본 발명의 일 양태는 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 합성 방법에 관한 것이며, 본 방법은 아미노산 사슬로의 아미노산 빌딩 블록의 커플링 사이클을 포함하며, 상기 아미노산 빌딩 블록은 비보호된 C-말단 카복실 기 및 보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며, 상기 아미노산 사슬은 비보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며, 적어도 하나의 커플링 사이클은
(a) 아미노산 빌딩 블록을 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시켜, 아미노산 사슬과 아미노산 빌딩 블록 사이에 아미드 결합이 형성되도록 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 산물을 캡핑 화합물을 포함하는 캡핑 시약과 접촉시키는 단계로서, 캡핑 화합물은 단계 (a)에서 빌딩 블록이 커플링되지 않은 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에 결합하는 단계, 및
(c) 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기를 탈보호시키는 단계
를 포함한다.
본 발명에서, "캡핑 시약", "캡핑 조성물" 또는 "캡핑 혼합물"은 상호교환 가능하게 사용된다. 시약은 단계 (b) 이전에 제조될 수 있거나, 캡핑 시약의 성분이 단계 (b) 동안 첨가된다.
단계 (b)에서 캡핑된 아미노산 사슬은 추가의 아미노산 빌딩 블록을 커플링시킬 수 없으며, 그에 따라 이 분자의 사슬 연장은 종결된다.
폴리펩타이드의 합성 동안, 폴리펩타이드의 아미노산 사슬이 빌딩 블록 당 빌딩 블록으로 형성되도록 아미노산 빌딩 블록의 커플링 사이클이 수행된다. 커플링 단계를 위하여, 최신 기법, 특히 Fmoc-보호된 아미노산 빌딩 블록에 기초한 고체상 합성이 사용될 수 있다. 펩타이드의 고체상 합성에 적합한 모든 종류의 고체상이 사용될 수 있다. 특히, 수지를 포함하는 고체상이 사용될 수 있다. 수지는 Rink 수지(Rink 아미드 수지) 또는 Tentagel® 수지일 수 있다. 바람직한 양태에서, 고체상 수지는 Rink 수지 또는 Rink 아미드 수지이다.
본 발명에 따른 단계 (a), (b) 및 (c)를 포함하는 사이클은 1회 또는 수회 반복될 수 있다. 커플링될 각각의 아미노산 빌딩 블록에 있어서, 하나의 사이클이 수행된다. 각각의 아미노산 빌딩 블록은 사전 결정된 아미노산 서열에 따라, 각각의 사이클에 대하여 독립적으로 선택된다. 본원에 기재된 바와 같은 모든 종류의 아미노산 빌딩 블록이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 캡핑 단계 조건, 예컨대 캡핑 온도, 캡핑 시약 조성물 또는/및 캡핑 기간과 관련하여 동일하거나 상이한 커플링 사이클을 조합할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 모든 커플링 사이클은 동일한 캡핑 조건 하에서 수행된다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 캡핑 단계는 본 발명에 따른 다른 캡핑 단계와 예를 들어, 변형된 캡핑 온도, 캡핑 시약 조성물 또는/및 캡핑 기간이 상이하다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 전체 폴리펩타이드 합성에 걸친 1개 초과의 캡핑 단계 조건, 예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 캡핑 단계 조건을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 캡핑 단계 (b)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클을 포함한다.
캡핑 화합물은 바람직하게는 아세트산 무수물(CAS 108-24-7), 아세트산 무수물의 동족체, 염화벤조일(CAS 98-88-4), N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-17-8), 벤질 클로로포르메이트(CAS 501-53-1), 클로로포름산의 에스테르, 1-아세틸이미다졸(CAS 2466-76-4), 디-tert-부틸 디카보네이트(CAS 24424-99-5) 및 N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-12-3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 캡핑 화합물은 아세트산 무수물 및 아세트산 무수물의 동족체로부터 선택되며, 바람직하게는 아세트산 무수물이다.
일 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 아세트산 무수물을 포함한다. 바람직한 양태에서, 아세트산 무수물의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 아세트산 무수물의 동족체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 아세트산 무수물의 동족체의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 염화벤조일을 포함한다. 바람직한 양태에서, 염화벤조일의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드를 포함한다. 바람직한 양태에서, N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 벤질 클로로포르메이트를 포함한다. 바람직한 양태에서, 벤질 클로로포르메이트의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 클로로포름산의 에스테르를 포함한다. 바람직한 양태에서, 클로로포름산의 에스테르의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 1-아세틸이미다졸을 포함한다. 바람직한 양태에서, 1-아세틸이미다졸의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 디-tert-부틸 디카보네이트의 에스테르를 포함한다. 바람직한 양태에서, 디-tert-부틸 디카보네이트의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
또 다른 양태에서, 캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드의 에스테르를 포함한다. 바람직한 양태에서, N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 2 v/v%이다.
캡핑 시약은 디이소프로필에틸아민(DIPEA, N-에틸디이소프로필아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민으로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 캡핑 시약은 디이소프로필에틸아민을 포함하며, 디이소프로필에틸아민의 농도는 0.2 내지 2 v/v%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2 v/v%이다. 디이소프로필에틸아민의 바람직한 농도는 1 v/v%이다.
일 양태에서, 캡핑 시약은 디이소프로필에틸아민 및 아세트산 무수물을 포함하며, 디이소프로필에틸아민의 농도는 0.2 내지 2 v/v%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 2 v/v%이며, 아세트산 무수물의 농도는 0.5 내지 5 v/v%일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3 v/v%이다.
일 양태에서, 캡핑 조성물 또는 캡핑 시약은 약 1 v/v%의 농도의 디이소프로필에틸아민 및 약 2 v/v%의 농도의 아세트산 무수물을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기는 바람직하게는 염기-불안정 보호기, 더욱 바람직하게는 Fmoc이다.
캡핑 단계에서 사용되는 용매는 바람직하게는 극성 비-수성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드(DMSO), 메탄올, 염화메틸렌, N,N-디메틸아세트아미드(DMA), N,N-디메틸포름아미드(DMF), N-메틸피롤리돈 또는 그들의 혼합물이다. 바람직한 양태에서, 캡핑 단계에서 사용되는 용매는 DMF이다.
본 발명에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 ±10%, ±5% 또는 ±1%의 범위를 의미한다.
본 발명에 따른 캡핑 반응 (b)는 실온에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 실온은 약 15 내지 25℃의 온도, 약 20 내지 23℃의 범위의 온도, 약 19 내지 21℃의 범위의 온도 또는 약 20℃의 온도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서, 단계 (b)는 바람직하게는 5 내지 15분 동안, 바람직하게는 10분 동안 수행된다.
바람직한 양태에서, 단계 (b)는 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 DIPEA를 포함하는 캡핑 시약을 사용하여 10분 동안 수행된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 단계 (b)는 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)에서 DMF 중 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 DIPEA를 포함하는 캡핑 시약을 사용하여 10분 동안 수행된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 단계 (b)는 본원에 기재된 바와 같이, 실온에서 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 및 Gly(4)에서 DMF 중 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 DIPEA를 포함하는 캡핑 시약을 사용하여 10분 동안 수행된다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 특히 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)와 상이한 위치에서, 캡핑 단계가 없는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 아미노산 빌딩 블록 Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)의 커플링 후에, 특히 약 10분 동안 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 캡핑 시약을 사용하는 단계 (b)에 따른 캡핑을 포함한다. 단계 (b)는 단계 (a)에서 Arg, Glu, Gln, Leu 또는/및 Gly 잔기, 특히 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)의 커플링 후에 수행될 수 있다. 바람직하게는, 다른 아미노산 위치에서, 캡핑 단계가 수행되지 않거나/않고, 캡핑이 DMF 중 10%의 아세트산 무수물 및 5 v/v%의 DIPEA를 사용하여 20분 동안 수행된다. 특히, 캡핑은 본원에 기재된 바와 같이 실온에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 모든 아미노산 빌딩 블록의 커플링 후에, 특히 약 10분 동안 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 캡핑 시약을 사용하는 단계 (b)에 따른 캡핑을 포함한다. 단계 (b)는 단계 (a)에서의 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 모든 아미노산 잔기의 커플링 후에 수행될 수 있다. 단일의 아미노산 커플링 단계에서, 캡핑이 생략될 수 있다. 단계 (b)는 단계 (a)에서의 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 적어도 30개 또는 적어도 35개의 아미노산 잔기의 커플링 후에 수행될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 캡핑 단계 (b)가 없는 적어도 1개의 커플링 사이클 및 본원에 기재된 바와 같은 캡핑 단계 (b)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 캡핑 단계 (b)가 없는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클, 및 본원에 기재된 바와 같은 캡핑 단계 (b)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클을 포함할 수 있다. 캡핑은 특히 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)와 상이한 위치에서 수행되지 않는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 (a), (b') 및 (c)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클을 포함할 수 있으며, 캡핑 단계 (b')는 캡핑 단계 (b)와 상이한 조건 하에서 수행된다. 단계 (b')를 포함하는 커플링 사이클은 특히 릭시세나티드 또는 엑센딘-4 서열의 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)와 상이한 아미노산 빌딩 블록의 커플링을 위해 적용된다. 일 양태에서, 단계 (b')는 DMF 중 약 10 v/v%의 아세트산 무수물 및 약 5 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 캡핑 시약을 사용할 수 있고, 예를 들어, 약 20분 동안 수행된다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 캡핑 단계 (b)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클 및 본원에 기재된 바와 같은 캡핑 단계 (b')를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 캡핑 단계 (b)를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클, 및 본원에 기재된 바와 같은 캡핑 단계 (b')를 포함하는 적어도 1개의 커플링 사이클, 적어도 2개의 커플링 사이클, 적어도 3개의 커플링 사이클, 적어도 4개의 커플링 사이클 또는 적어도 5개의 커플링 사이클을 포함할 수 있다.
하나의 단일의 사이클에서 1개 초과의 아미노산의 커플링을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 빌딩 블록의 커플링을 위하여, 단계 (b')를 포함하는 커플링 사이클이 바람직하게 예를 들어, 디펩타이드, 예컨대 Pro-Pro 또는 His-Gly의 커플링을 위하여, 각각 아미노산 빌딩 블록 Fmoc-Pro-Pro-OH 및 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 사용함으로써 사용된다.
단계 (a)에 따른 커플링 단계 및 단계 (c)에 따른 탈보호 단계의 수행 방법은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 펩타이드 합성은 바람직하게는 고체상 합성의 형태로 수행된다. 바람직한 양태에서, 커플링 사이클은 합성될 서열의 C-말단으로부터의 N-말단으로 수행된다. 아미노산 빌딩 블록에 의한 C-말단으로부터 N-말단으로의 고체상 펩타이드 합성에 적용되는 단계 (a) 및 (c)에 대한 반응 조건은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있다.
본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 펩타이드 합성의 하나의 사이클에서 하나 이상의 아미노산에 의해 합성될 아미노산 사슬을 연장시키는 화합물이다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산에 의해 합성될 아미노산 사슬을 연장시킨다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 1 또는 2개의 아미노산에 의해 합성될 아미노산 사슬을 연장시킨다.
본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 바람직하게는 하나의 아미노산(모노 아미노산 빌딩 블록), 또는 2, 3, 4개 또는 그 초과의 아미노산을 포함하는 올리고펩타이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 하나의 아미노산, 또는 2개의 아미노산, 예를 들어 Pro-Pro 또는 His-Gly 등을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 1개 초과의 아미노산을 포함하는 아미노산 빌딩 블록의 아미노산은 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해 연결된다. 2개의 아미노산을 포함하는 특히 바람직한 아미노산 빌딩 블록은 Fmoc-Pro-Pro-OH 및 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH이다.
릭시세나티드와 엑센딘-4의 합성에서 위치 1 및 2에서 His 및 Gly에 대한 아미노산 빌딩 블록 대신에 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 사용하는 것은 원하지 않는 DesGly(2)-릭시세나티드의 방지를 가능하게 한다는 것이 관찰되었다. 더욱이, 수득되는 릭시세나티드는 라세미화로부터 초래되는 D-His의 값의 향상을 보이지 않았다.
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH는 예를 들어, 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 형성될 수 있다:
i) Fmoc-His(Trt)-OH와 H-Gly-OBzl 토실레이트를 반응시키는 단계, 및
ii) 단계 i)에서 수득되는 산물의 벤질 기를 절단하여
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 수득하는 단계.
예시적인 반응 조건은 실시예 3에 제시된다.
본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 원하는 위치에서만 아미노산 사슬을 선택적으로 연장시키기 위하여 적합한 변형을 포함할 수 있다. 아미노산 빌딩 블록의 변형은 아미노산의 N-말단에서, C-말단에서 또는/및 측쇄에서 수행될 수 있다.
펩타이드의 합성을 위해, 특히 폴리펩타이드의 고체상 합성을 위해 흔히 사용되는 모든 종류의 보호기가 사용되어, 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 작용기(즉, 성공적인 커플링 후에 아미노 사슬의 N-말단인 아미노 기)를 보호할 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 적합한 일시적인 보호기의 종류를 알고 있다. 바람직한 양태에서, 알칼리성 환경에서 불안정한 보호기가 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기는 Fmoc 보호기에 의해 보호된다.
아미노산 빌딩 블록의 C-말단 카복시 기는 바람직하게는 계속 비보호된다.
본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 서로 독립적으로, D-아미노산 및 글리신, L-아미노산 및 글리신 또는/및 그의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록의 아미노산은 서로 독립적으로 L-아미노산 및 글리신으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 아미노산은 α-아미노산으로부터 선택될 수 있다. 추가의 양태에서, 아미노산은 천연 발생 아미노산, 예컨대 폴리펩타이드에서 천연적으로 발생하는 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 인공 아미노산, 예컨대 Met(O)(메티오닌 술폭시드 또는 메티오닌 술폰), Trp(O2)(N-포르밀키뉴레닌) 또는/및 isoAsp(β-아스파르트산염 또는 이소아스파르트산염)를 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서, 아미노산은 특히 각각 D-형태 또는 각각 L-형태의 Ser, Thr, Trp, Lys, Ala, Asn, Asp, Val, Met, Phe, Ile, Pro, Arg, Glu, Gln, Leu, 및 Gly로부터 선택된다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록은 특히 각각 D-형태 또는 각각 L-형태의 Arg, Glu, Gln, Leu, 및 Gly로부터 선택되는 아미노산을 포함한다.
특히, 아미노산은 서로 독립적으로, 예를 들어, 특히 각각 D-형태 또는 각각 L-형태의 Ser, Thr, Trp, Lys, Ala, Asn, Asp, Val, Met, Phe, Ile, Pro, Arg, Glu, Gln, Leu, 및 Gly로부터 독립적으로 선택된다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 아미노산 빌딩 블록의 적어도 하나의 측쇄는 추가의 보호기에 의해 보호될 수 있다. 추가의 보호기는 바람직하게는 N-말단 보호기에 대하여 직교이다. 상기 측쇄에 적합한 보호기는 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 적합한 보호기에 대한 예는 예를 들어, Trt, Boc, Bzl, Pdf, tBu 및 OtBu이며, 이는 특정 측쇄의 보호를 위해 사용될 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 어떤 측쇄가 어떤 종류의 보호기에 의해 보호될 필요가 있는지를 알고 있다. 일 양태에서, 실시예 1.4에 언급된 바와 같은 아미노산 빌딩 블록이 사용될 수 있다. 아미노산 빌딩 블록이 1개 초과의 측쇄를 포함하는 경우에, 이들 측쇄 중 하나 이상은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 바와 같은 적합한 보호기로부터 독립적으로 선택되는 보호기에 의해 보호될 수 있다.
합성될 폴리펩타이드는 사전 결정된 서열을 갖는 각각의 가능한 펩타이드일 수 있다. 바람직한 양태에서, 합성될 폴리펩타이드는 GLP-1 효능제이다. 폴리펩타이드는 GLP-1 효능제일 수 있으며, GLP-1 효능제는 GLP-1 및 그의 유사체 및 유도체, 엑센딘-3 및 그의 유사체 및 유도체, 엑센딘-4 및 그의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 엑센딘-4 및 릭시세나티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 릭시세나티드가 가장 바람직하다. 추가의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 알비글루티드(albiglutide), 둘라글루티드(dulaglutide) 및 세마글루티드(semaglutide)로부터 선택된다.
엑센딘-3, 엑센딘-3의 유사체 및 유도체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4의 유사체 및 유도체는 WO 01/04156호, WO 98/30231호, US 5,424,286호, EP 99610043.4호 및 WO 2004/005342호에 기재되어 있다. 이들 문헌은 본원에 참조로 포함된다. 이들 문헌에 기재된 엑센딘-3, 엑센딘-4 및 그의 유사체 및 유도체는 본 발명에 따른 방법에 의해 합성될 수 있는 한편, 추가의 변형은 합성의 완료 후에 수행될 수 있다.
릭시세나티드(SEQ ID NO:1, 도 2), 엑센딘-4(SEQ ID NO:2, 도 2) 및 엑센딘-3(SEQ ID NO:3, 도 2)은 고도의 서열 동일성을 갖는다. 릭시세나티드 및 엑센딘-4의 서열은 위치 1 내지 37에서 동일하다. 엑센딘-4의 서열 1 내지 39는 39개 중 37개의 위치에서 엑센딘-3과 동일하다(94%)(문헌[J. Biol. Chem. 267, 1992, 7402-7405]). 릭시세나티드 또는 엑센딘-4의 서열에 대하여, 서열 위치가 본원에 제공된다. 이들 서열로부터 시작하여, 해당 분야의 숙련자는 다른 서열에서 상응하는 위치를 용이하게 결정할 수 있다.
특히 엑센딘-3 또는/및 엑센딘-4의 유사체 및 유도체는 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 변형된다(예를 들어, 엑센딘-4에서 desPro36, desPro37, desAsp28, desMet(O14) 및 엑센딘-3에서 각각의 위치). 일 양태에서, 하나 이상의 아미노산은 대체될 수 있으며(예를 들어, 엑센딘-4에서 Met(O14), Trp(O2)25, isoAsp28, Asp28, Pro38 및 엑센딘-3에서 각각의 위치), 천연 발생 또는 인공 아미노산, 예를 들어 Met(O)(메티오닌 술폭시드 또는 메티오닌 술폰), Trp(O2)(N-포르밀키뉴레닌) 또는/및 isoAsp(β-아스파르트산염 또는 이소아스파르트산염) 등이 도입될 수 있다. 인공 아미노산은 합성 사이클에서 각각의 아미노산 빌딩 블록을 사용함으로써 서열에 용이하게 도입될 수 있다.
일 양태에서, 폴리펩타이드의 C-말단 또는/및 N-말단은 예를 들어 서열, 예컨대 -(Lys)-, -(Lys)2-, -(Lys)3-, -(Lys)4-, -(Lys)5-, -(Lys)6- 및 -Asn-(Glu)5-의 부가에 의해 변형될 수 있다. 바람직한 양태에서, 추가의 아미노산 서열은 예를 들어, -(Lys)4-, -(Lys)5-, -(Lys)6- 및 -Asn-(Glu)5-이다. C-말단 카복시 기는 바람직하게는 산 아민 기(-NH2)이다. 선택적으로, C-말단 또는/및 N-말단의 변형은 본 발명에 따른 방법의 합성 사이클의 완료 후에 개별 단계에서 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 합성 사이클의 완료 후에, 합성된 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용 가능한 염이 선택적으로 추가의 단계에서 형성될 수 있다. 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용 가능한 염의 형성 방법은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 약제학적으로 허용 가능한 바람직한 염은 예를 들어, 아세트산염이다.
일 양태에서, GLP-1 효능제는 바람직하게는 엑센딘-4, 그의 유사체 및 유도체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 GLP-1 효능제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 엑센딘-4의 유사체이다:
H-desPro36-엑센딘-4-Lys6-NH2,
H-des(Pro36,37)-엑센딘-4-Lys4-NH2,
H-des(Pro36,37)-엑센딘-4-Lys5-NH2 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
추가의 바람직한 GLP-1 효능제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 엑센딘-4의 유사체이다:
desPro36[Asp28]엑센딘-4(1-39),
desPro36[IsoAsp28]엑센딘-4(1-39),
desPro36[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39),
desPro36[Met(O)14,IsoAsp28]엑센딘-4(1-39),
desPro36[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-2(1-39),
desPro36[Trp(O2)25,IsoAsp28]엑센딘-2(1-39),
desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39),
desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,IsoAsp28]엑센딘-4(1-39) 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
추가의 바람직한 GLP-1 효능제는 C-말단에서 -Lys6-NH2 펩타이드로 추가로 변형되는 상기 기재된 바와 같은 군으로부터 선택되는 엑센딘-4의 유사체이다.
추가의 바람직한 GLP-1 효능제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 엑센딘-4의 유사체이다:
H-(Lys)6-desPro36[Asp28]엑센딘-4(1-39)-Lys6-NH2,
desAsp28Pro36,Pro37,Pro38엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-Asn-(Glu)5desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-Lys6-NH2,
H-desAsp28 Pro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39)-Lys6-NH2,
desMet(O)14 Asp28 Pro36, Pro37, Pro38엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28] 엑센딘-4(1-39)-NH2,
desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39)-Lys6-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28] 엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-Lys6-NH2,
desAsp28Pro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]엑센딘-4(1-39)-NH2,
desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14, Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]엑센딘-4(1-39)-(Lys)6-NH2 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염.
추가의 양태에서, 바람직한 GLP-1 효능제는 GLP-1(특히 GLP-1(7-36) 아미드, SEQ ID NO:4), Arg34,Lys26(Nε(γ-글루타밀(Nα헥사데카노일)))GLP-1(7-37)(리라글루티드), 알비글루티드, 둘라글루티드, 세마글루티드 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 바람직한 GLP-1 효능제는 알비글루티드, 둘라글루티드, 세마글루티드 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 GLP-1 효능제는 릭시세나티드(SEQ ID NO:1) 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
일 양태에서, 합성될 폴리펩타이드는 바람직하게는 릭시세나티드 또는 엑센딘-4이며, 아미노산 빌딩 블록 Arg(20), Glu (17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)의 커플링 후에, 단계 (b)는 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 캡핑 시약을 사용하여 약 10분 동안 수행된다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 고체상 합성의 형태의 폴리펩타이드의 합성을 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 선택적으로 하기 추가의 단계를 포함한다:
(d) 고체상에 연결된 폴리펩타이드를 절단하는 단계.
단계 (d)는 특히 아미노산 사슬의 합성이 완료될 때 수행된다. 단계 (d)는 폴리펩타이드가 결합된 고체상을 본질적으로 트리플루오로아세트산 및 1,2-에탄디티올로 이루어진 조성물과 약 23℃ 내지 약 29℃의 범위의 온도에서 접촉시키는 것을 포함하는, 고체상으로부터 고체상-결합된 폴리펩타이드의 절단에 의해 수행될 수 있다.
절단은 약 95 내지 약 99 v/v%의 양의 트리플루오로아세트산을 포함하는 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
절단은 또한 약 1 내지 약 5 v/v%의 양의 1,2-에탄디티올을 포함하는 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, 절단은 본질적으로 약 97 v/v%의 양의 트리플루오로아세트산 및 약 3 v/v%의 양의 1,2-에탄디티올로 이루어진 조성물을 사용하여 수행된다.
절단은 조성물을 폴리펩타이드가 결합된 고체상과 약 25℃ 내지 약 27℃의 온도에서 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
바람직하게는, 절단은 조성물을 폴리펩타이드가 결합된 고체상과 약 26℃의 온도에서 접촉시킴으로써 수행된다.
가장 바람직하게는, 절단은 약 26℃의 온도에서 본질적으로 약 97 v/v%의 양의 트리플루오로아세트산 및 약 3 v/v%의 양의 1,2-에탄디티올로 이루어진 조성물을 사용하여 수행된다.
가장 바람직하게는, 절단은 약 26℃의 온도에서 약 4시간 동안 본질적으로 약 97 v/v%의 양의 트리플루오로아세트산 및 약 3 v/v%의 양의 1,2-에탄디티올로 이루어진 조성물을 사용하여 수행된다.
본 발명의 바람직한 양태는 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 고체상 합성 방법에 관한 것이며, 본 방법은 아미노산 사슬로의 아미노산 빌딩 블록의 커플링 사이클을 포함하고,
상기 아미노산 빌딩 블록은 비보호된 C-말단 카복실 기 및 보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
상기 아미노산 사슬은 비보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
적어도 하나의 커플링 사이클은
(a) 아미노산 빌딩 블록을 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시켜, 아미노산 사슬과 아미노산 빌딩 블록 사이에 아미드 결합이 형성되도록 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 산물을 아세트산 무수물을 포함하는 캡핑 시약과 접촉시키는 단계로서, 아세트산 무수물은 단계 (a)에서 빌딩 블록이 커플링되지 않은 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에 결합하는 단계, 및
(c) 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기를 탈보호시키는 단계
를 포함하며,
캡핑 시약은 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물 및 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 DMF 중 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물 및 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 DMF 중 1 내지 3 v/v%의 아세트산 무수물 및 0-5 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민, 바람직하게는 DMF 중 약 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 약 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 약 1 v/v%의 농도의 디이소프로필에틸아민 및 약 2 v/v%의 농도의 아세트산 무수물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 아세트산 무수물의 동족체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 아세트산 무수물 동족체의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 염화벤조일을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 염화벤조일의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 벤질 클로로포르메이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 벤질 클로로포르메이트의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 클로로포름산의 에스테르를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 클로로포름산의 에스테르의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 1-아세틸이미다졸을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 1-아세틸이미다졸의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 디-tert-부틸 디카보네이트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 디-tert-부틸 디카보네이트의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 0.5 내지 5 v/v%의 농도의 N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드를 포함하는 캡핑 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드의 농도는 1 내지 3 v/v%, 더욱 바람직하게는 약 2 v/v%이다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 DIPEA를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 폴리펩타이드의 합성에서, 특히 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 합성에서 자유 아미노 기의 캡핑을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 자유 탄소-결합 아미노 기의 아세틸화를 위해 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 릭시세나티드, 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4) 또는 추가의 GLP-1 유사체의 각 위치의 커플링 단계 (a) 후에 예를 들어, 10분의 기간 동안 본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에서 적용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 폴리펩타이드 합성에서 비보호된 아미노 기의 아세틸화를 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 용도이다.
약어
Ac(N1-N2): 위치 N1 내지 N2의 폴리펩타이드의 N-말단 아세틸화된 단편.
H(N1-N2) 또는 (N1-N2): 자유 N-말단 아미노 작용기를 포함하는 위치 N1 내지 N2의 폴리펩타이드의 단편.
Fmoc(N1-N2): 보호된 N-말단 아미노 작용기를 포함하는 위치 N1 내지 N2의 폴리펩타이드의 단편(여기서 보호기는 Fmoc임).
(N-1)-불순물: 특정 위치에서 빌딩 블록이 결여된, 펩타이드 합성 동안 의도되지 않은 펩타이드의 발생과 관련된 것임. 의도되는 합성된 폴리펩타이드가 길이 N을 갖는 경우에, 불순물은 N-1의 길이를 갖는다. (N-1) 불순물의 발생은 캡핑에 의해 방지된다.
Fmoc 플루오레닐메톡시카보닐
Boc tert-부톡시카보닐
Bzl 벤질
Pbf 2,2,5,7,8-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-술포닐
tBu tert-부틸
OtBu O-tert-부틸
Trt 트리틸
DIPE 디이소프로필에테르
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 더욱 특성규명된다.
도 1: 펩타이드의 고체상 합성.
도 2: 릭시세나티드(SEQ ID NO:1), 엑센딘-4(SEQ ID NO:2), 엑센딘-3(SEQ ID NO:3) 및 GLP-1(GLP-1(7-36) 아미드, SEQ ID NO:4)의 서열.
도 3: 릭시세나티드의 합성 동안 아세틸화된 오류 서열의 발생. Fmoc-Arg(20)-OH의 커플링 및 후속 캡핑/Fmoc 절단. 위치 21(Leu)이 합성에서 생략되었음을 주의해야 한다. (1) Fmoc-(22-44)+Arg, (2) (22-44)+Arg, (3) Ac(22-44)+Arg, (4) Fmoc-(22-44)+Arg+Val. 데이터는 아세틸화된 단편이 캡핑 단계 동안 이미 형성되었으나, 잘못된 위치가 아세틸화된다는 것을 보여준다[Ac(22-24)+Arg가 Arg의 캡핑 동안 이미 발생함].
도 4: 릭시세나티드의 합성 동안 아세틸화된 오류 서열의 발생. Fmoc-Gln(13)-OH의 커플링 및 후속 캡핑/Fmoc 절단. (1) Ac(14-44), (2) Fmoc(13-44), (3) Ac(13-44), (4) (13-44), (5) (14-44). 데이터는 아세틸화된 단편이 캡핑 단계 동안 이미 형성되었으나, 잘못된 위치가 아세틸화된다는 것을 보여준다(Ac(13-44)).
도 5: 릭시세나티드의 합성 동안 아세틸화된 오류 서열의 발생. Fmoc-Lys(12)-OH의 커플링 및 후속 캡핑/Fmoc 절단. (1) Ac(13-44), (2) Fmoc(12-44), (3) Ac(12-44), (4) (12-44). 데이터는 아세틸화된 단편이 캡핑 단계 동안 이미 형성되었으나, 잘못된 위치가 아세틸화된다는 것을 보여준다(Ac(12-44)).
도 6: HPLC 크로마토그래피에 의한, 20분 동안 DMF 중 10% 아세트산 무수물 및 5 v/v% DIPEA를 사용한 캡핑(A)에 비하여, 본 발명에 따른 캡핑 방법(B)을 사용한 릭시세나티드의 합성의 비교. (C) (A) 및 (B)의 HPLC 크로마토그램의 오버랩.
도 7: 릭시세나티드(미가공 산물)의 HPLC. 적색: 원하지 않는 아세틸화된 부산물.
도 8: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(36-44) 형성.
도 9: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(23-44) 형성.
도 10: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(21-44) 형성.
도 11: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(19-44) 형성.
도 12: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(18-44) 형성.
도 13: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(15-44) 형성.
도 14: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(12-44) 형성.
도 15: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(8-44) 형성.
도 16: 캡핑 칵테일 및 온도에 따른 Ac(6-44) 형성.
도 17: 15℃, 실온(RT) 및 30℃에서의 릭시세나티드 합성에서, 9개의 상이한 위치에서의 캡핑에서 Ac(X-44) 함량의 비교.
도 18: 15℃, 실온(RT) 및 30℃에서의 릭시세나티드 합성에서, 9개의 상이한 위치에서의 캡핑에서 Ac[(X-1)-44] 함량의 비교.
도 19: 상이한 캡핑 조건 하의 릭시세나티드 합성시 9개의 상이한 위치에서, 상이한 조건 하의 캡핑에서의 또는 캡핑 부재 하의 Ac(X-44) 함량의 비교.
도 20: 상이한 캡핑 조건 하의 릭시세나티드 합성시 9개의 상이한 위치에서, 상이한 조건 하의 캡핑에서의 또는 캡핑 부재 하의 Ac[(X-1)-44] 함량의 비교.
실시예 1
릭시세나티드의 합성
활성 물질 릭시세나티드는 44개 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 아미드이며; 아세트산염이 반대이온으로서 작용한다.
1-문자 코드에서, 릭시세나티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-l-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
펩타이드 사슬을 C-말단, Lys-44로부터 출발하여, 선형 고체상 합성에 의해 구축하였다.
합성 방법은 Fmoc 고체상 펩타이드 합성이며, Rink 아미드 수지를 사용하여 펩타이드 아미드를 수득하였다. 반응을 실온에서 DMF 중에서 수행하였다. 반응 사이에, 세척을 반복적으로 대부분 DMF를 사용하여 수행하였으며, 중간 세척 단계 중 하나를 이소프로판올로 수행하였다.
고분자 지지체 상의 릭시세나티드의 합성을 하기의 단계로 나눌 수 있다:
● Rink 수지로의 제1 Fmoc-아미노산(Fmoc-Lys(Boc)-OH)의 커플링
● 미반응 아미노 기의 캡핑
● 일시적인 보호기 Fmoc의 절단
● 추가의 Fmoc-아미노산 또는 Fmoc-디펩타이드의 커플링
● 미반응 아미노 기의 캡핑
● 최종 Fmoc 절단
● 수지로부터의 릭시세나티드의 절단 및 측쇄 보호기의 동시 제거
합성 사이클은 도 1에 예시되어 있다.
1.1 Rink 수지로의 제1 Fmoc-아미노산(Fmoc-Lys(Boc)-OH)의 커플링
합성을 시작하기 이전에, Rink 아미드 수지를 DMF 중에 팽윤시켰다. 팽윤을 2 내지 15시간 동안 수행하였다. 이후에, 일시적인 보호기 Fmoc를 DMF 중 25% 피페리딘을 사용하여 Rink 아미드 수지로부터 절단하였다. 이 절단을 2회 수행하였다: 5분 및 20분의 절단 시간. Fmoc 절단 후에, 수지를 반복적으로 DMF로, 그리고 이소프로판올로 1회 세척하였다.
제1 Fmoc-아미노산, Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링을 2.4 당량 과잉으로 수행하여, 수지에 로딩하였다. HOBt 수화물, HBTU 및 DIPEA를 커플링 시약으로서 제공하였다. 커플링 시간은 60 내지 120분이었다.
Rink 수지에 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 완전히 로딩하기 위하여, 추가의 로딩을 커플링 시약 HOBt 수화물 및 DIC를 사용하여 수행하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 단계 1.1을 수행하는 동안, 혼합물을 교반하였다. 이후에 캡핑을 수행하였다.
1.2 미반응 아미노 기의 캡핑
수지의 불완전한 로딩의 결과는 아직 반응하지 않은 아미노 기가 수지 상에서 발견된다는 것이다. 아세트산 무수물/DIPEA/DMF(10:5:85)의 혼합물을 첨가함으로써 이들을 불활성화시켰으며, 이에 따라 이들은 추가의 커플링을 위해 이용 가능하지 않게 되었다. 캡핑 혼합물을 교반하면서 20분 동안 수지 상에 유지하였다. 남아 있는 자유 아미노 기가 아실화된다. 이후에, 수지를 반복적으로 DMF로, 그리고 이소프로판올로 1회 세척하였다.
적어도 5개 위치의 릭시세나티드 합성에서 본 발명에 따른 캡핑 방법은 실시예 4 및 5에 기재되어 있다.
1.3. 일시적인 보호기 Fmoc의 절단
일시적인 보호기 Fmoc를 DMF 중 25% 피페리딘을 사용하여 절단하였다. 이 절단을 2회 수행하였다: 5분 및 20분의 절단 시간. Fmoc 절단 후에, 수지를 반복적으로 DMF로, 그리고 이소프로판올로 1회 세척하였다.
1.4 추가의 Fmoc-아미노산 또는 Fmoc-디펩타이드의 커플링
다음의 Fmoc-아미노산을 수지 상의 탈보호된 아미노 기에 커플링시켰다. 커플링을 상이한 당량으로 DMF 중에서 수행하였다. 커플링 시간은 2시간 내지 18시간이었다. HOBt/DIC 및 또한, HBTU/DIPEA를 커플링 시약으로서 사용하였다.
하기의 유도체를 Fmoc-아미노산으로서 사용하였다:
● Fmoc-Lys(Boc)-OH
● Fmoc-Ser(tBu)-OH
● Fmoc-Pro-OH
● Fmoc-Ala-OH x H2O
● Fmoc-Gly-OH
● Fmoc-Asn(Trt)-OH
● Fmoc-Leu-OH
● Fmoc-Trp(Boc)-OH
● Fmoc-Glu(OtBu)-OH x H2O
● Fmoc-lle-OH
● Fmoc-Phe-OH
● Fmoc-Arg(Pbf)-OH
● Fmoc-Val-OH
● Fmoc-Met-OH
● Fmoc-Gln(Trt)-OH
● Fmoc-Asp(OtBu)-OH
● Fmoc-Thr(tBu)-OH
● Fmoc-His(Trt)-OH
대안적으로, Fmoc-디펩타이드를 사용하는 것도 가능하였다(본 발명에 따른 방법):
● Fmoc-Pro-Pro-OH(CAS 129223-22-9)
● Fmoc-Ala-Pro-OH(CAS 186023-44-9)
● Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH(CAS 113247-80-6)
● Fmoc-Gly-Pro-OH(CAS 212651-48-4)
● Fmoc-Gly-Gly-OH(CAS 35665-38-4)
● Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH(바켐(Bachem) B-3630으로부터)
● Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH(CAS 866044-63-5)
● Fmoc-His(Trt)-Gly-OH
커플링이 카이저 시험(문헌[E. Kaiser et al, Anal. Biochem. 34, 1970, 595])에 따라 불완전한 것으로 관찰되면, 추가의 커플링이 가능하였다. 이 목적을 위하여, Fmoc-아미노산을 다시 HBTU/DIPEA/HOBt 수화물과 함께 커플링시켰다.
1.5 미반응 아미노 기의 캡핑
세목 1.2 하의 설명 참조.
1.6 최종 Fmoc 절단
최종 Fmoc 절단을 세목 1.3 하에 기재된 바와 같이 수행하였다. 수지를 마지막으로 디이소프로필 에테르로 다시 세척하고, 감압 하에 건조시켰다.
1.7 수지로부터의 릭시세나티드의 절단 및 측쇄 보호기의 동시 제거
Rink 수지로부터의 릭시세나티드의 절단을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
1.8 본 발명의 디펩타이드를 사용한 릭시세나티드의 합성
수지로의 제1 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링을 HBTU/DIPEA/HOBt 수화물을 사용하여 수행하였다. Rink 아미드 수지의 자유 아민으로의 제1 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH의 커플링 후에, 하기의 처리 단계를 무한 반복 사이클에서 행하였다(또한 단계 1.3 내지 1.6 참조):
● Fmoc 절단
● 커플링
● 필요하다면, 추가의 커플링
● 캡핑
● 마지막 아미노산 유닛의 커플링 후에, N-말단 Fmoc 기를 절단한다.
표준 Fmoc-보호된 아미노산을 과잉의 아미노산 및 2 내지 4 당량인 커플링 시약과 함께 DIC/HOBt를 사용하여 커플링시켰다.
위치 Pro(36) 및 Pro(37)에서, 2개의 Fmoc-Pro-OH 아미노산 유도체 대신에, 디펩타이드 Fmoc-Pro-Pro-OH를 HBTU/DIPEA를 사용하여 커플링시켰다.
위치 Pro(31)에서, 커플링을 HBTU/DIPEA/HOBt 수화물을 사용하여 수행하였다.
위치 His(1) 및 Gly(2)에서, 아미노산 유도체 Fmoc-His(Boc)-OH 및 Fmoc-Gly-OH 대신에, 디펩타이드 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 커플링시켰다.
커플링 후에, 캡핑을 실시예 4 및 5에 기재된 바와 같이, 각각의 경우에 Ac2O/DIPEA를 사용하여 수행하였다.
Fmoc 절단을 각각의 경우에 먼저 5분의 반응 시간에 이어서 20 내지 40분의 반응 시간으로 연속적으로 DMF 중 25% 피페리딘을 사용하여 수행하였다.
커플링의 완전성을 카이저 시험에 의해 점검하였다.
마지막 커플링, 및 Fmoc 기의 마지막 절단 후에, 수지를 먼저 DMF로 반복적으로, 그 후에 이소프로판올로, 그리고 마지막으로 디이소프로필 에테르로 세척하고, 그것을 이후에 35℃에서 감압 하에 건조시켰다.
수지로부터의 미가공 펩타이드의 절단을 스캐빈저, 예컨대 1,2-에탄디티올을 사용하여 트리플루오로아세트산 중에서 수행하였다.
미가공 펩타이드를 고체상으로서 C18 RP 실리카 겔을 사용하여 2-단계 HPLC 과정에서 정제하였다. 제1 정제 단계에서, 0.1% TFA와 함께 아세토니트릴/물이 있는 완충계를 사용하였으며; 제2 단계에서, AcOH와 함께 아세토니트릴/물이 있는 완충계를 사용하였다. 풀링된 용액의 농축 후에, 순수 펩타이드를 동결-건조에 의해 수득하였다.
0.3 mmol/g(즉, 1.05 mol 뱃치(batch))의 로딩과 함께 3500 g의 Rink 아미드 수지를 사용하여, 9970 g의 수지상 펩타이드를 제공하였다. 그로부터 4636 g의 미가공 펩타이드를 수득하였다.
정제 후에, 그로부터 576 g의 순수 펩타이드를 수득하였다. MS: 4855.5(단일동위원소 몰 질량); 실측치 4855.6. 아미노산 시퀀싱: 올바른 서열 발견. 검정: 89.0%(그대로).
1.9 디펩타이드를 사용하지 않은 릭시세나티드의 합성
펩타이드 사슬을 C-말단, Lys-44로부터 출발하여, 선형 고체상 합성에 의해 구축하였다.
표준 Fmoc-보호된 아미노산을 과잉의 아미노산 및 2 내지 4 당량인 커플링 시약과 함께 DIC/HOBt를 사용하여 커플링시켰다.
위치 Pro(37), Pro(36), Pro(31)에서, 커플링을 HBTU/DIPEA/HOBt 수화물을 사용하여 수행하였다.
각 커플링은 Ac2O/DIPEA를 사용한 캡핑으로 이어졌다. Fmoc 절단을 각각의 경우에 먼저 5분의 반응 시간에 이어서 20분의 반응 시간으로 연속적으로 DMF 중 25% 피페리딘을 사용하여 수행하였다.
커플링의 완전성을 카이저 시험에 의해 점검하였다. 마지막 커플링, 및 Fmoc 기의 마지막 절단 후에, 수지를 먼저 DMF로 반복적으로, 그 후에 이소프로판올로, 그리고 마지막으로 디이소프로필 에테르로 세척하고, 그것을 이후에 35℃에서 감압 하에 건조시켰다.
수지로부터의 미가공 펩타이드의 절단을 스캐빈저, 예컨대 1,2-에탄디티올, 티오아니솔, 페놀 및 물을 사용하여 트리플루오로아세트산 중에서 수행하였다.
미가공 펩타이드를 고체상으로서 C18 RP 실리카 겔을 사용하여 2-단계 HPLC 과정에서 정제하였다. 풀링된 용액의 농축 후에, 순수 펩타이드를 동결-건조에 의해 수득하였다. 표 1은 디펩타이드를 사용한 합성과 디펩타이드 부재의 합성 간의 순수 펩타이드 내의 라세미화된 D-His-릭시세나티드의 함량 및 일부 불순물의 함량을 비교한 것이다.
[표 1]
Figure pct00002
데이터는 디펩타이드 Fmoc-His(Trt)-GIy-OH의 이용이 라세미화로 인해 야기되는 상승된 값의 D-His를 함유하지 않는 릭시세나티드를 제공한다는 것을 보여준다. 더욱이, Fmoc-His(Trt)-GIy-OH를 사용하는 경우, desGly(2)-릭시세나티드는 더 이상 관찰되지 않는다. 추가로, 사슬 위치 Pro(36) 및 Pro(37)의 부근에서 N-1 및 N+1 펩타이드(예를 들어, desPro(36)-릭시세나티드 또는 diPro(36)릭시세나티드)는 발생하지 않았다.
실시예 2
(본 발명에 따른) 엑센딘-4의 합성, 정제 및 특성규명
활성 물질 엑센딘-4는 39개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 아미드이며; 아세트산염이 반대이온으로서 기능한다.
1-문자 코드에서, 아미노산 서열은 하기와 같다:
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
MW 4186.66 g/mol; MW(단일동위원소) = 4184.03 g/mol.
엑센딘-4의 합성을 상기 언급된 서열에 따라, 정확하게 릭시세나티드의 합성에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 위치 1 및 2에서, Fmoc-His(Trt)-Gly-OH를 사용하여 1개의 사이클에서 커플링을 수행하였다. 위치 37 및 38에서, Fmoc-Pro-Pro-OH를 사용하여 1개의 사이클에서 커플링을 수행하였다. 다른 위치에서, Fmoc-아미노산(단일 아미노산 유닛)을 사용하여 커플링을 수행하였다.
0.42 mmol/g(즉, 11.2 mmol 뱃치)의 로딩과 함께 26.666 g의 Rink 아미드 수지를 사용하여 74 g의 수지상 펩타이드를 제공하였다. 이로부터, 65 g의 수지상 펩타이드를 절단하고, 28 g의 미가공 펩타이드를 수득하였다. 정제를 위하여, 이로부터 21.3 g의 미가공 펩타이드를 사용하였으며, 4.01 g의 순수 펩타이드를 수득하였다. MS: 4184.03(단일동위원소 몰 질량): 실측치: 4185.1 [M+H]. 순도: 98.25 FI%.
디펩타이드의 사용에 의해, 릭시세나티드에 대하여 수득한 결과가 확인된다. 디펩타이드 Fmoc-His(Trt)-GIy-OH의 이용은 라세미화로 인해 야기되는 상승된 값의 D-His를 함유하지 않는 엑센딘-4를 제공한다. 더욱이, Fmoc-His(Trt)-GIy-OH를 사용하는 경우, desGly(2)-엑센딘-4는 더 이상 관찰되지 않는다. 추가로, 사슬 위치 Pro(36) 및 Pro(37)의 부근에서 N-1 및 N+1 펩타이드(예를 들어, desPro(36)-엑센딘-4 또는 diPro(36)엑센딘-4)는 발생하지 않았다.
실시예 3
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH의 합성
3.1 Fmoc-His(Trt)-Gly-OBzl
Figure pct00003
40 g의 Fmoc-His(Trt)-OH를 32.7 g의 H-Gly-OBzl 토실레이트 및 29.37 g의 HBTU와 함께 400 ㎖의 에틸 아세테이트 중에 용해하였다. 이후에, 33.32 ㎖의 N-에틸모르폴린을 첨가하였다. 반응물을 30℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후에, 추출을 매회 256 g의 8% 중탄산나트륨 용액을 사용하여 3회 수행한 다음, 세척을 250 ㎖의 물을 사용하여 1회 수행하였다. 생성된 에틸 아세테이트 용액의 절반을 증발시키고, 다음 단계에서 추가로 처리하였다.
3.2 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH
Figure pct00004
THF 및 메탄올을 에틸 아세테이트 상에 첨가하여, 5:2:2(w/w/w) THF/에틸 아세테이트/MeOH 혼합물이 형성되게 하였다. 이후에, 10 g의 탄소상 팔라듐 촉매(5%)를 첨가하고, 이 혼합물을 30℃ 및 1.1 bar의 수소 압력에서 2.5시간 동안 수소화시켰다. 그 후에, 촉매를 여과해내고, 침전물이 형성되기 시작할 때까지, 생성된 용액을 증발시켰다. 이후의 교반을 1시간 동안 수행하였으며, 용액을 실온에서 4일 동안 정치시켰다. 산물을 여과해낸 후에, 80℃에서 4시간 동안 2-부탄온 중에서 교반함으로써 추출하였다. 수율: 32.9 g의 Fmoc-His(Trt)-Gly-OH(75%).
실시예 4
릭시세나티드의 합성 동안 아세틸화된 오류 서열
4.1 릭시세나티드의 합성 동안 아세틸화된 오류 서열의 함량의 결정
일부 아세틸화된 오류 서열이 미정제 릭시세나티드 산물의 HPLC 프로파일에서 관찰될 수 있다. 이들은 보통 캡핑되는 수지상 미반응 아미노 기로부터 발생한다. 캡핑에 의해 달성되는 것은, 원하는 산물과 오직 약간만 상이하므로 정제에 의해 제거하기 어려운 (N-1) 불순물이 발생할 수 없다는 것이다.
선택된 위치에서의 완전성 및 또한 커플링 역학을 에드만(Edman) 분해에 의해 모니터링하였다. 수지 시료를 릭시세나티드의 합성으로부터 취하였으며, Fmoc 기를 그로부터 절단하였다. 그 다음, 이 수지 시료를 에드만 분해로 처리하였으며, 이 방식으로 커플링된 아미노산 대 (N-1) 아미노산의 비를 결정하는 것이 가능하였으며, 이로부터 커플링 수율을 직접 추론할 수 있었다. 에드만 분해의 결과(표 2)는 높은 커플링 값을 보여준다. 이들 값은 너무 높아서, 그것들은 아세틸화된 오류 서열의 양을 설명할 수 없다(표 2의 HPLC 데이터). 이는 이들 부산물을 형성하는 대안적인 방식이 존재해야 함을 의미한다. 이 상황의 설명은 하기의 섹션에서 기재될 것이다.
[표 2]
Figure pct00005
4.2 아세틸화된 오류 서열의 형성
아세틸화된 오류 서열이 형성되는 합성 사이클 내의 지점을 조사하기 위하여, 수지 시료를 커플링 사이클에 걸쳐 취하였으며, 펩타이드를 절단하고, LC-MS를 사용하여 조사하였다. 이들 조사를 Fmoc-Arg(20)-OH의 커플링 및 Fmoc-Gln(13)-OH의 커플링의 위치에서 수행하였다.
릭시세나티드 부분 서열 H(22-24)의 고체상-결합된 펩타이드로의 Fmoc-Arg(20)-OH의 커플링에서, 시료를 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간의 커플링 시간 후에, 및 또한, 캡핑, 후속 Fmoc 절단, 및 발린(19)의 커플링 후에 취하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 오류 서열 Ac(22-44)+Arg는 캡핑 단계 동안 처음으로 발생하였다(3.1%). 이에 따라, 캡핑 동안, 소량의 Fmoc 기를 절단하고(소실시키고), 즉시 아실화시켰다. 명칭 Ac(22-24)+Arg를 설명하기 위하여, 위치 21(Leu)을 합성으로부터 생략하였음을 주의해야 한다.
릭시세나티드 합성 동안 Fmoc-Gln(13)-OH의 커플링을 위하여, 동일한 실험을 행하였다(도 4). 이 경우에, 오류 서열 Ac(13-44)가 커플링 및 글루타민(13)의 캡핑 이후 Fmoc 절단 동안 처음으로 관찰되었다(4.6%). Fmoc-Lys(12)-OH의 커플링 이후 나머지 합성 과정에서, 캡핑 동안 Ac(12-44)도 형성되었음(4.1%)을 알 수 있다(도 5 참조).
실험은 잠재적인 (N-1) 불순물이 더 이상 캡핑되지 않는 유의미한 정도로, 사용되는 혼합물의 캡핑 능력이 감소되지 않으면서, N번째 아미노산(커플링된 마지막 아미노산)의 아세틸화된 오류 서열의 원하지 않는 형성이 방지되는 캡핑 조건을 검색할 필요가 있음을 보여준다.
4.3 캡핑 조건의 변화
Fmoc-Arg(20)-OH, Fmoc-Leu(10)-OH, Fmoc-Gly(4)-OH 및 Fmoc-Thr(5)-OH의 커플링을 조사하였다. 다양한 캡핑 조건을 서로 비교하였다.
캡핑 조건을 릭시세나티드의 실험실 합성에서 변화시켰다. 원하지 않는 Ac(N-44) 및 원하는 Ac([N-1]-44)의 함량에 특히 주의를 기울였다. 시험되는 조건은 하기와 같다:
● 20분 동안 DMF 중 10% 아세트산 무수물/5% DIPEA
● 10분 동안 DMF 중 10% 아세트산 무수물/5% DIPEA
● 20분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA
● 10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA
조사를 위치 Arg(20), Leu(10), Thr(5) 및 Gly(4)에서 수행하였다. 결과는 표 3 내지 6에 취합되어 있다.
데이터를 또한, 릭시세나티드의 GMP 합성의 결과(표 3 내지 6에서 "GMP 캡핑")와 비교하였다. 캡핑 조건은 조건 DMF 중 10% 아세트산 무수물/5% DIPEA에 상응하였다. GMP 뱃치에서 수지와 캡핑 혼합물의 접촉 시간은 7 내지 8분 더 길었으므로, 27 내지 28분이었다. 이는 캡핑 혼합물을 멀리 펌핑하는 데 걸리는 시간이 더 긴 것에 기인하였다.
4.3.1 위치 Arg(20)에서의 커플링
Fmoc-Arg(Pbf)-OH를 Leu(21)에 커플링시켰다. 커플링이 일어나지 않은 사슬(산물 H(21-44)) 상에서, 산물 Ac(21-44)를 후속 캡핑에 의해 형성하였다. 캡핑 동안 Fmoc 기가 바람직하지 않게 절단되고(H(20-44)의 형성), 아세틸화가 발생하는 경우(Ac(2044)의 형성)에 산물 Ac(20-44) 및 H(20-44) 둘 모두가 형성된다.
원하지 않는 산물 H(20-44) 및 Ac(20-44)의 형성의 정도가 캡핑 시간, 및 아세트산 무수물 및 DIPEA의 양 둘 모두에 의해 좌우된다는 것을 표 3에서 명백하게 알 수 있다(Ac(20-44)% 열 참조). 가장 높은 백분율 값이 GMP 캡핑에서 관찰될 수 있다. Ac(20-44)의 가장 낮은 함량이 조건 "10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA" 하에서 관찰된다.
다양한 캡핑 혼합물의 캡핑 능력(및 따라서 원래의 의도된 용도)은 대략 동일하며(열 Ac(21-44) 참조), 즉, 모든 캡핑 혼합물은 H(21-44))를 전환시킨다. 혼합물 "10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA"는 또한 (N-1) 불순물을 회피하려는 원하는 목적을 충족한다.
[표 3]
Figure pct00006
Figure pct00007
4.3.2 위치 Leu(10), Gly(4) 및 Thr(5)에서의 커플링
Leu(10)에 대한 결과는 표 4에 제공되어 있으며, 위치 Arg(20)에 대하여 수득하였던 결과가 확인된다. 산물 H(11-44)의 자유 아미노 기의 캡핑 동안 형성되는 원하지 않는 산물 Ac(10-44) 및 H(10-44)의 함량은 조건 "10분 동안 2% 아세트산 무수물, 1% DIPEA" 하에서 가장 낮다. 캡핑 능력은 상이한 캡핑 혼합물에서 유사하다.
[표 4]
Figure pct00008
또한, Gly(4)의 커플링을 위하여, 원하지 않는 산물 Ac(4-44)의 함량은 캡핑 혼합물 및 반응 시간에 의해 좌우된다. 캡핑 능력은 상이한 혼합물에서 동일하다(표 5).
[표 5]
Figure pct00009
위치 4에서의 Fmoc-Gly-OH의 커플링의 결과 표는 캡핑 조건에 따른 아세틸화된 및 비-아세틸화된 단편의 함량을 보여준다. 결과를 LC-MS에 의해 수득하였다.
위치 Arg(20), Leu(10) 및 Gly(4)에 더하여, 위치 Thr(5) 또한 조사하였다. 3개의 이전의 위치와 대조적으로, 원하지 않는 산물 Ac(N-44)(위치 5에서 Ac(5-44))의 함량은 다양한 캡핑 조건 하에서 대략 동일하다. 그러나, 여기서 상이한 혼합물의 캡핑 능력 또한 유사하다(표 6).
[표 6]
Figure pct00010
4.3.3 요약
위치 Arg(20), Leu(10) 및 Gly(4)에서, 온건한 캡핑 혼합물(10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA)은 아실화에 의해 (N-1) 불순물을 회피하려는 원하는 효과를 유지하기에 충분하다. 그러나, 이들 3개의 경우에, Ac(20-44), Ac(10-44) 및 Ac(4-44)의 각각의 형성은 캡핑 시간 및 또한 캡핑 혼합물에 의해 좌우된다. 이는 위치 Thr(5)에 적용되지 않는다.
실시예 5
릭시세나티드의 합성
본 실시예는 릭시세나티드(SEQ ID NO:1 참조)의 합성에 관한 것이다. 합성의 시작 시에, 고체상-결합된 링커는 Fmoc 보호기를 보유한다. 하기의 단계로 이루어진 커플링 사이클에서 C-말단(위치 44)으로부터 N-말단을 향해 출발하여, 개별 아미노산 유닛을 커플링시켰다:
● Fmoc 절단
● Fmoc-보호된 아미노산 유닛의 커플링, 및
● 캡핑.
위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 및 Gly(4)에서, 본 발명에 따른 캡핑 방법(10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA)을 사용하였다. 이들 위치에 있어서, 커플링 사이클에 대한 설명이 하기에 기재된다. 다른 위치에서, 캡핑을 20분 동안 DMF 중 10% 아세트산 무수물/5% DIPEA를 사용하여 수행하였다. 이 캡핑은 예를 들면, 위치 Thr(5)에서 기재된다. 본 발명에 따른 캡핑 방법은 더욱 온건한 조건을 포함한다.
뱃치 크기는 1050 mmol의 Rink 수지였다.
5.1. 위치 20에서 Fmoc-Arg(Pbf)-OH의 커플링
5.1.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 30분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.1.2 Fmoc-Arg(Pbf)-OH의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 2.125 ㎏의 FmocArg(Pbf)-OH를 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 502 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 413 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.1.3 (본 발명에 따른) 캡핑
반응기를 26.3 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 1.2 ℓ의 DMF, 0.53 ℓ의 아세트산 무수물 및 0.26 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 2 ℓ 쇼트(Schott) 병에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 10분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.2. 위치 17에서 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 수화물의 커플링
5.2.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 30분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.2.2 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 수화물의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 1.453 ㎏의 FmocGlu(OtBu)-OH 수화물을 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 502 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 413 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.2.3 (본 발명에 따른) 캡핑
반응기를 26.3 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 1.2 ℓ의 DMF, 0.53 ℓ의 아세트산 무수물 및 0.26 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 2 ℓ 쇼트 병에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 10분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.3. 위치 13에서 Fmoc-Gln(Trt)-OH의 커플링
5.3.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 35분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.3.2 Fmoc-Gln(Trt)-OH의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 2.001 ㎏의 FmocGln(Trt)-OH를 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 502 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 413 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.3.3 (본 발명에 따른) 캡핑
반응기를 26.3 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 1.2 ℓ의 DMF, 0.53 ℓ의 아세트산 무수물 및 0.26 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 2 ℓ 쇼트 병에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 10분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.4. 위치 10에서 Fmoc-Leu-OH의 커플링
5.4.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 35분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.4.2 Fmoc-Leu-OH의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 1.158 ㎏의 Fmoc-Leu-OH를 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 502 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 413 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.4.3 (본 발명에 따른) 캡핑
반응기를 26.3 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 1.2 ℓ의 DMF, 0.53 ℓ의 아세트산 무수물 및 0.26 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 2 ℓ 쇼트 병에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 10분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.5. 위치 4에서 Fmoc-Gly-OH의 커플링
5.5.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 35분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.5.2 Fmoc-Gly-OH의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 1.217 ㎏의 Fmoc-Gly-OH를 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 627 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 517 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.5.3 (본 발명에 따른) 캡핑
반응기를 26.3 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 1.2 ℓ의 DMF, 0.53 ℓ의 아세트산 무수물 및 0.26 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 2 ℓ 쇼트 병에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 10분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.6. 위치 5에서 Fmoc-Thr(tBu)-OH의 커플링
5.6.1 Fmoc 절단
7 ℓ의 DMF에 이어서 16.6 ℓ의 DMF 중 7.9 ℓ의 피페리딘의 혼합물을 반응기에 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 교반한 다음, 흡인으로 여과하였다. 이 과정을 반복하였으며, 교반을 35분 동안 수행한 다음; 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다. Fmoc 절단 후에, 수지를 하기의 순서로 7회 세척하였다: DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(8 ℓ), DMF(31.1 ℓ), DMF(31.1 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.6.2 Fmoc-Thr(tBu)-OH의 커플링
21 ℓ의 DMF를 반응기에 첨가하였다. 그 후에, 1.628 ㎏의 FmocThr(tBu)-OH를 칭량하여 넣고, 5.3 ℓ의 DMF를 첨가하였다. 완전한 용해 후에, 이 용액에 이어서, 2.2 ℓ의 DMF 중 627 g의 하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt 수화물)의 용액을 반응기 내로 쏟았다. 마지막으로, 517 g의 N,N-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 반응기에 첨가하였다. 커플링 시간은 6 내지 18시간이었다. 커플링 후에, 용매를 흡인에 의해 수지로부터 여과해내고, 캡핑을 즉시 계속하였다.
5.6.3 캡핑
반응기를 10.5 ℓ의 DMF로 채웠다. 동시에, 15.8 ℓ의 DMF, 3.2 ℓ의 아세트산 무수물 및 1.6 ℓ의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 혼합 용기 내에서 혼합하고, 반응기 내의 수지에 첨가하였다. 반응기를 20분 동안 교반한 다음, 흡인을 사용한 여과를 수행하였다. 캡핑 후에, 수지를 하기의 순서로 5회 세척하였다: DMF(24 ℓ), 이소프로판올(31.1 ℓ), DMT(8 ℓ), DMF(31.5 ℓ), DMF(31.5 ℓ). 여기서, 반응기를 매번 각각의 세척 용매로 채운 다음, 교반을 3분 동안 수행하고, 흡인을 사용한 여과를 다시 수행하였다.
5.7 결과
위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 및 Gly(4)에서의 본 발명에 따른 캡핑 방법 및 5.6.3 하에 기재된 바와 같은 다른 커플링에서의 캡핑을 사용한 릭시세나티드 합성의 미정제 산물의 HPLC 크로마토그램은 도 6에 나타나 있다. 불순물 아세틸(20-44), 아세틸(17-44), 아세틸(13-44), 아세틸(10-44) 및 아세틸(4-44)/아세틸(6-44)을 갖는 피크가 표시되어 있다.
5.8 비교
5.6.3 하에 기재된 바와 같은 모든 커플링의 캡핑 단계를 수행하여, 원하지 않는 오류 서열 Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) 및 Ac(4-44)/Ac(6-44)의 형성의 증가를 야기하였다. 이 시험으로부터의 미정제 릭시세나티드의 HPLC 크로마토그램은 도 6의 A에 나타나 있다.
도 6의 B는 위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 및 Gly(4)에서 본 발명에 따른 캡핑 방법으로 합성된 미정제 릭시세나티드의 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 6의 C는 도 6의 A 및 B로부터의 HPLC 크로마토그램의 중첩을 보여준다. 뱃치 운영에서 본 발명에 따른 캡핑 방법을 사용한 릭시세나티드의 합성이 오류 서열 Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) 및 Ac(4-44)/Ac(6-44)의 분명한 감소를 야기하였음이 명백하다.
더욱 온건한 캡핑 혼합물(10분 동안 DMF 중 2% 아세트산 무수물/1% DIPEA)을 사용함으로써, 릭시세나티드의 미정제 산물에서 Ac(20-44), Ac(17-44), Ac(13-44), Ac(10-44) 및 Ac(4-44)의 아세틸화된 오류 서열들의 수준을 감소시키거나, 그로부터 그들을 제거하는 것이 가능하였다. 본 발명에 따른 캡핑에 의해 제조된 릭시세나티드 미정제 산물이, 아세틸화된 부산물 Ac(17-44), Ac(13-44) 및 Ac(10-44)를 특히 상당히 감소된 양으로 포함하였기 때문에, 릭시세나티드의 정제가 단순화되었다. 결과적으로, 릭시세나티드의 첫 분취용 크로마토그래피 시행 이후 분획의 풀링에 의해, 사양 기준을 만족하고, 이에 따라 폐기되지 않아도 될 더 많은 분획을 제공한다. 이는 개선된 수율을 야기한다.
실시예 6
릭시세나티드의 합성에서 9개의 특정 위치에서의 캡핑
실시예 5에 논의된 바와 같이, 위치 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)에서 릭시세나티드의 합성에서의 "온건한" 캡핑 조건의 이용은 원하지 않는 부산물의 프로파일을 개선시킬 수 있다.
이 실시예에는 아세틸화된 및 비-아세틸화된 부산물의 형성에 대한 캡핑 조건의 영향이 기재된다. 온도(15℃, 실온[20℃ 내지 23℃], 30℃), 캡핑 기간, 및 캡핑 조성물의 성분의 변화를 수행하였다:
● 캡핑 부재,
● 온건한 캡핑 조건: 2%의 아세트산 무수물 및 1%의 DIPEA(디이소프로필에틸아민)을 사용한 10분 캡핑
● "보통"의 캡핑 조건: 10%의 아세트산 무수물 및 5%의 DIPEA를 사용한 20분 캡핑
● 10%의 아세트산 무수물 및 5%의 DIPEA를 사용한 40분 캡핑
본 발명의 캡핑 조건은 "온건한 조건"이다. 이들 조건을 실시예 5에서 사용하였다. 이들 조건이 유리한 것으로 관찰되었다.
이 실시예에서 선택된 9개의 위치에서, 아세틸화된 서열이 (N-1) 위치의 캡핑에서 수득된다(도 7). 추가로, 아미노산 빌딩 블록에서의 Fmoc 기의 원하지 않는 제거는 캡핑 단계 동안 발생할 수 있다. 보호되지 않은 아미노 기는 캡핑 시약 또는 캡핑 조성물에 의해 아세틸화될 수 있다. 이 양태에서, 개선된 캡핑 조건은 Fmoc 기의 원하지 않는 절단을 회피할 수 있다.
6.1 디펩타이드 빌딩 블록 Pro-Pro의 커플링 이후 위치 36/35에서의 캡핑, (36-44)
펩타이드 Fmoc-(36-44)-AVE0010을 고체상 합성에 의해 생성하였다. 수지를 4 부분으로 나누어 건조시켰다. 각 부분은 실온(20℃ 내지 23℃)에서 상기 기재된 4개의 캡핑 절차 중 하나를 거쳤다. 시료를 건조시키고, 펩타이드를 수지로부터 절단하였다. 이 절차를 반복하였으며, 여기서 캡핑을 15℃ 또는 30℃에서 수행하였다.
총 12개의 펩타이드 시료를 수득하였다. 12개의 펩타이드 시료를 LCMS로 분석하였다. 분자량을 TIC(총 이온 전류)로부터 결정하였다. 하기의 화합물의 분자량을 결정하였다:
[표 7]
Figure pct00011
표 8은 Fmoc-ProPro 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 8]
Figure pct00012
Figure pct00013
결과는 도 8에 기재되어 있다. 화합물 (36-44), (38-44) 및 Ac(38-44)가 관찰되지 않거나, 소량으로 관찰되었다. 원하지 않는 산물 Ac(36-44)의 양은 대부분의 경우에 캡핑 칵테일의 세기 및 캡핑 기간에 따라 증가한다. 이 산물의 양은 온도에 따라 증가한다.
6.2 빌딩 Ile의 커플링 후의 위치 23에서의 캡핑, (23-44)
Fmoc(23-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 9는 Fmoc-Ile 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 9]
Figure pct00014
Figure pct00015
결과는 도 9에 기재되어 있다. RT 및 30℃에서 캡핑 시약에 따라, 원하지 않는 화합물 Ac(23-44)의 함량이 증가한다. 20℃에서 "보통"의 캡핑은 0.26%의 Ac(23-44)를 초래한다. 캡핑의 연장(20분 대신에 40분)은 Ac(23-44) 함량에 대해 부정적인 영향을 미친다.
원하는 산물 Ac(24-44)의 형성은 캡핑 조성물과 독립적이다.
6.3 빌딩 블록 Leu의 커플링 후의 위치 21에서의 캡핑, (21-44)
Fmoc(21-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 10은 Fmoc-Leu 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 10]
Figure pct00016
Figure pct00017
결과는 도 10에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(21-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(21-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(22-44)의 형성은 캡핑 조성물과 독립적이다. 캡핑 없이도, 이 화합물이 형성된다.
6.4 빌딩 블록 Val의 커플링 후의 위치 19에서의 캡핑, (19-44)
Fmoc(19-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 11은 Fmoc-Val 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 11]
Figure pct00018
Figure pct00019
결과는 도 11에 기재되어 있다. 화합물 Ac(19-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(19-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(20-44)의 형성은 캡핑 조성물의 세기에 따라 증가한다. 원하지 않는 (20-44)의 함량은 캡핑 조성물의 세기의 증가에 따라 감소한다.
6.5 빌딩 블록 Ala의 커플링 후의 위치 18에서의 캡핑, (18-44)
Fmoc(18-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 12는 Fmoc-Ala 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 12]
Figure pct00020
결과는 도 12에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(18-44)의 함량은 15℃ 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(18-44)의 함량은 15℃로부터 30℃까지의 온도 증가에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(19-44)의 형성은 15℃ 및 30℃에서 캡핑 조성물의 세기에 따라 증가한다.
6.6 빌딩 블록 Glu의 커플링 후의 위치 15에서의 캡핑(15-44)
Fmoc(15-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 13은 Fmoc-Glu 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 13]
Figure pct00021
결과는 도 13에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(15-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(15-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(16-44)의 형성은 캡핑 조성물과 독립적이다. 캡핑 없이도, 이 화합물이 형성된다.
6.7 빌딩 블록 Lys의 커플링 후의 위치 12에서의 캡핑(12-44)
Fmoc(12-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃/30℃ 및 실온에서의 실험을 상이한 뱃치로 수행하였다.
표 14는 Fmoc-Lys 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 14]
Figure pct00022
Figure pct00023
결과는 도 14에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(12-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(12-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(13-44)의 형성은 캡핑 조성물과 독립적이다. 캡핑 없이도, 이 화합물이 형성된다.
6.8 빌딩 블록 Ser의 커플링 후의 위치 8에서의 캡핑(8-44)
Fmoc(8-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃, RT 및 30℃에서의 실험을 동일한 뱃치로 수행하였다.
표 15는 Fmoc-Ser 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 15]
Figure pct00024
Figure pct00025
결과는 도 15에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(8-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(8-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
6.9 빌딩 블록 Phe의 커플링 후의 위치 6에서의 캡핑(6-44)
Fmoc(86-44)의 합성을 섹션 6.1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 15℃, RT 및 30℃에서의 실험을 동일한 뱃치로 수행하였다.
표 16은 Fmoc-Phe 커플링 및 후속 캡핑 후에 수득되는 산물의 함량을 보여준다(총 펩타이드 함량의 %).
[표 16]
Figure pct00026
Figure pct00027
결과는 도 16에 기재되어 있다. 원하지 않는 화합물 Ac(6-44)의 함량은 15℃, RT 및 30℃에서 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서 최대이다. 화합물 Ac(6-44)의 함량은 온도에 따라 증가한다.
원하는 화합물 Ac(7-44)의 형성은 캡핑 조성물과 독립적이다. 캡핑 없이도, 이 화합물이 형성된다.
온도는 원하는 화합물 Ac(7-44)의 형성에 오직 약간의 영향만을 미친다. 원하지 않는 (7-44)의 함량은 캡핑 조성물의 세기의 증가에 따라 감소한다.
6.10 요약
Ac(X-44)-화합물의 원하지 않는 형성은 캡핑 기간, 캡핑 조성물 및 캡핑 온도에 의해 강하게 좌우된다. 캡핑 기간의 증가, 캡핑 온도의 증가, 및 캡핑 조성물 중 아세트산 무수물 및 DIPEA의 함량의 증가에 따라, 원하지 않는 Ac(X-44) 화합물의 함량이 증가한다.
6.11 온도에 따른 "보통"의 조건 하의 캡핑.
도 17 및 도 18에는 본 실시예에 기재된 바와 같이 "보통"의 조건, "20분, 10% Ac2O, 5% DIPEA" 하의 릭시세나티드의 합성에 있어서 9개의 위치에서 상이한 온도에서의 캡핑에서 수득된 데이터가 요약되어 있다.
도 17은 반응 온도에 따른 Ac(X-44)의 GMP 캡핑의 비교를 보여준다. 15℃ 및 30℃에 대하여 제공되는 값은 "실온" 값(회색 영역)으로부터의 양의 편차 및 음의 편차이다.
원하지 않는 산물 Ac(X-44)의 형성은 9개 중 5개 위치에서 0.5% 이하이며, 3개의 위치에서 0.5% 내지 1%이며, 오직 하나의 위치에서만 1% 초과이다. 30℃에서 큰 증가가 관찰되지만, 15℃에서 Ac(X-44)의 형성은 약간 감소한다.
이는 "20분, 10% Ac2O, 5% DIPEA"에서의 GMP 캡핑이 15℃ 내지 실온에서 상이한 위치에서 수행될 수 있는 것을 의미하며, 실온은 20 내지 23℃일 수 있다.
도 18은 반응 온도에 따른 Ac[(X-1)-44]의 GMP 캡핑의 비교를 보여준다. 15℃ 및 30℃에 대하여 제공되는 값은 "실온" 값(회색 영역)으로부터의 양의 편차 및 음의 편차이다.
RT에서 원하는 Ac[(X-1)-44] 화합물의 형성에 관하여, 15℃에서의 편차는 +0.23 내지 -0.25%이다. 30℃에서, 편차는 +0.29 내지 -0.33%이다. 이에 따라, 원하는 캡핑 산물 Ac[(X-1)-44]의 형성은 원하지 않는 Ac(X-44)의 형성보다 온도에 덜 의존적이다.
실온에서의 캡핑을 고려해보면, 15℃ 및 30℃에서, 원하는 화합물 Ac[(X-1)-44]의 함량의 음의 편차가 관찰된다. 이는 "보통"의 조건을 사용한 캡핑이 실온에서 수행되어야 함을 의미한다.
6.12 실온에서 상이한 캡핑 조성물을 사용한 캡핑
도 19 및 도 20에는 본 실시예에 기재된 바와 같이, 릭시세나티드의 합성에 있어서 9개의 위치에서 실온에서 상이한 캡핑 조성물을 사용한 캡핑에서 수득되는 데이터가 요약되어 있다.
도 19는 실온에서 캡핑 조성물에 따른, Ac(X-44) 함량의 비교를 보여준다. "캡핑 부재", "온건" 및 "40분" 조건에 대하여 제공되는 값은 "보통의 캡핑" 값(회색 영역)으로부터의 양의 편차 및 음의 편차이다.
원하지 않는 산물 Ac(X-44)의 형성은 "20분, 10% Ac2O, 5% DIPEA" 및 "40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA" 하에서 최대이다. "보통"의 조건(40분, 10% Ac2O, 5% DIPEA) 하의 Ac(X-44)의 형성은 0.2% 내지 1.12%이다. 온건한 캡핑 조건에서 강력한 감소가 관찰된다.
도 20은 실온에서 캡핑 조성물에 따른 Ac[(X-1)-44] 함량의 비교를 보여준다. "캡핑 부재", "온건" 및 "40분"에 대하여 제공되는 값은 "보통의 캡핑" 값(회색 영역)으로부터의 양의 편차 및 음의 편차이다.
조건 "캡핑 부재", "온건" 및 "40분"에서의 원하는 산물 Ac[(X-1)-44]의 형성은 "보통"의 조건을 고려해보면 -0.14% 및 +0.16% 이내이다.
특히, 본 발명의 "온건"한 조건(10분, 2% Ac2O, 1% DIPEA) 하에, 릭시세나티드의 합성에서 충분한 캡핑이 달성될 수 있다.
요약하면, 온건한 캡핑 조건, 특히 용매 중 2% Ac2O 및 1% DIPEA를 사용한 10분 동안의 캡핑이 본원에 기재된 바와 같은 릭시세나티드의 고체상 합성에서 유리하다.
특정 아미노산 위치에서의 커플링 이후에 캡핑이 생략되면, 불완전한 아미노산 서열을 포함하는, 소량으로 존재하는 원하지 않는 부산물을 정제 과정 동안 제거하기 어려울 수 있다.
실시예 7
고체상으로부터의 릭시세나티드의 절단
본 실시예는 고체상으로부터 릭시세나티드를 본 발명에 따라 절단하는 것에 관한 것이다. 펩타이드 릭시세나티드가 결합된 고체상(Rink 수지)을 제공하였다. 펩타이드를 아미노산 유닛의 단계적 커플링에 의해 수지 상에서 합성하였다.
비교 시험으로서, 종래 기술(문헌[King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36: 255-266])에 따른 절단을 수행하였다.
본 발명에 따른 절단 방법은 하기의 변화에 의해 종래 기술의 방법과 구별된다:
● 20℃ 내지 26℃의 반응 온도
● 수지 대 사용되는 절단 혼합물의 비의 증가와 조합하여, 5개에서 2개의 구성요소로 감소된 절단 혼합물 중 성분의 수.
[표 17]
Figure pct00028
Figure pct00029
본 발명에 따른 절단을 사용함으로써, 종래 기술에 따른 절단에 비하여, 불순물 프로파일을 오직 약간만 변경시키면서, 미정제 릭시세나티드의 수율을 대략 5%(20%로부터 25%까지) 증가시키는 것이 가능하였다.
본 실시예의 방법은 파일럿-플랜트 및 생산 규모로의 규모 확대에 적합하다.
표 18에는 비교 과정에서 수득된 결과가 요약되어 있다(표 17 참조). 릭시세나티드-수지(1-44)의 3개의 상이한 뱃치 2E002, 2B008 및 2B006을 사용하였다. 평균 및 표준 편차를 각 뱃치에 대하여 개별적으로 계산한다. 상이한 절단 조건 간의 비교는 동일한 뱃치의 릭시세나티드-수지(1-44)를 사용하는 시험에서 이루어져야 한다. 상이한 뱃치에서, 고체상 합성은 수율에 영향을 미칠 수 있다. 다르게 나타나 있지 않다면, 10 g의 릭시세나티드-수지(1-44)를 출발 물질로서 사용하였다.
[표 18]
Figure pct00030
Figure pct00031
7.1 20℃ 내지 35℃의 절단 온도에 따른 절단 수율
릭시세나티드-수지(1-44)로부터의 절단을 표준 조건(비교 과정, 표 17 참조) 하에서 4시간 동안 수행하였다.
[표 19]
Figure pct00032
Figure pct00033
결과: 표준 조건 하의 절단 이후의 릭시세나티드의 수율은 최적의 약 26℃까지 온도의 증가에 따라 증가한다. 놀랍게도, 23℃로부터 26℃까지의 온도의 증가는 수율의 유의미한 증가를 초래한다.
7.2 절단 기간에 따른 절단 수율
릭시세나티드-수지(1-44)로부터의 절단을 표준 조건(비교 과정, 표 17 참조) 하에서 20℃에서 수행하였다.
[표 20]
Figure pct00034
결과: 릭시세나티드의 수율은 절단 기간의 증가에 따라 증가한다. 약 8시간 절단 후, 최대 수율에 도달된다.
7.3 12시간의 절단 기간에서 온도에 따른 절단 수율
릭시세나티드-수지(1-44)로부터의 절단을 표준 조건(비교 과정, 표 17 참조) 하에서 4시간 동안 수행하였다.
[표 21]
Figure pct00035
결과: 반응 온도가 증가하면, 12시간의 절단 기간에 수율이 증가한다. 최대 수율은 4시간 절단에 대하여 실시예 7.1에 기재된 바와 같이 26℃에서 수득된다. 시험 70586-044(4시간, 26℃, 실시예 7) 및 70586-045(12시간, 26℃)는 유사한 수율을 초래하였다(14,8% 대 14,0%).
7.4 최대 20℃의 절단 온도에 따른 절단 수율
릭시세나티드-수지(1-44)로부터의 절단을 표준 조건(비교 과정, 표 17 참조) 하에서 4시간 동안 수행하였다.
[표 22]
Figure pct00036
결과: 20℃ 미만의 온도에서의 절단은 예상되는 바와 같이 20℃에서 4시간 동안의 절단(표준 조건, 비교 과정, 표 17)에 의해 수득되는 수율에 도달하기 위하여 더 긴 절단 기간을 필요로 한다.
7.5 변형된 절단 칵테일
표준 과정은 다음의 5개의 성분을 함유하는 절단 칵테일을 이용한다: 페놀, 티오아니솔, 1,2-에탄디티올, 물 및 TFA. 실시예의 대상은 티오아니솔, 페놀 및 물 중 1개 내지 3개를 생략한 단순화된 절단 칵테일이다. 릭시세나티드-수지(1-44)로부터의 릭시세나티드 절단의 수율을 결정한다. "변형이 없는" 칵테일은 표 17 "비교 과정"에 기재되어 있다.
[표 23]
Figure pct00037
결과: 하나 이상의 성분의 생략은 시험 71002-010(티오아니솔의 생략)을 제외하고, 증가된 수율을 초래한다.
단순화된 절단 혼합물(절단 칵테일)은 몇몇의 이점을 갖는다:
(a) 분석론의 단순화 및 품질 제어,
(b) 비용 감소,
(c) 생산 과정에서의 취급 용이성.
7.6 절단 칵테일 중 TFA 및 1,2-에탄디티올 함량
시험 71002-042로부터 출발하여, 절단 수율에 대한 TFA:1,2-에탄디티올 비의 영향을 조사하였다:
[표 24]
Figure pct00038
결과: 1,2-에탄디티올 함량의 증가는 릭시세나티드 수율의 유의미한 감소를 초래한다. 8.25:0.25의 TFA:1,2-에탄디티올 비는 최대 수율을 갖는 비인 것으로 관찰되었다(뱃치 2E002). 이 관찰을 뱃치 2B008을 사용하는 실험에 의해 확인하였다.
7.7 절단 칵테일의 부피
절단 칵테일의 부피(및 이에 따른 농도)의 영향을 조사하였다.
[표 25]
Figure pct00039
결과: 최대 30%의 감소는 절단 수율에 영향을 미치지 않는다. 더 큰 부피 감소는 수율 감소를 야기한다.
7.8 절단 이전의 공용매(톨루올 또는 CH 2 Cl 2 )를 사용한 "수지 상 펩타이드"의 팽윤
이 실험을 뒷받침하는 근거는 수지로부터 릭시세나티드의 절단이 최대 5 내지 8℃의 온도의 증가를 초래할 수 있다는 것을 발견한 것이며, 이는 원하지 않는 부산물의 형성을 야기할 수 있으며, 잠재적으로 안정성 및 이에 따른 절단 수율에 부정적인 영향을 미친다. 유기 용매 중 "수지 상 펩타이드"의 팽윤은 발열을 감소시킬 수 있으며, 이에 따라 수율을 증가시킬 수 있다.
[표 26]
Figure pct00040
Figure pct00041
결과: 유기 공용매를 사용한 팽윤은 절단 수율을 증가시키지 않는다.
7.9 공용매의 존재 하의 농축
TFA보다 더 높은 비점을 갖고 릭시세나티드가 불용성인 공용매의 존재 하에서, 수지로부터의 절단 후에 수율을 증가시킬 수 있는데, 이는 여액으로부터 TFA를 증류하는 동안, 공용매의 존재가 릭시세나티드의 침전을 야기할 수 있으며, 이에 따라 킹 칵테일 중에서의 절단 동안 릭시세나티드의 분해를 방지할 수 있기 때문이다.
[표 27]
Figure pct00042
결과: 수지로부터 릭시세나티드의 절단 이후 여액의 증류에서 톨루올의 존재는 약간 증가된 수율을 야기한다.
7.10 본 발명의 최적화된 절단 절차
본 실시예에서 수득된 상기-기재된 결과에 기초하여, 하기와 같은 최적화된 절단 조건을 선택하고 시험하였다:
(a) 26℃의 반응 온도,
(b) 절단 칵테일은 TFA 및 1,2-에탄디티올로 이루어진다. 칵테일은 약 97%의 TFA 및 약 3%의 1,2-에탄디티올을 함유하였다. 8.25 ㎖/g("수지 상 펩타이드")의 TFA 및 0.25 ㎖/g("수지 상 펩타이드")의 1,2-에탄디티올의 양을 사용하였다.
표준 비교 칵테일과 비교하여, 이 칵테일의 절단 수율을 뱃치 2E002 및 2B008에서 시험하였다.
[표 28]
Figure pct00043
Figure pct00044
결과: 두 뱃치 모두에서, 수율은 약 5% 증가하였으며, 이는 본 발명의 방법에 의한 고체상으로부터 펩타이드 절단의 유의미한 개선을 나타낸다.
7.11 제2(후속) 절단
비교 칵테일(킹 칵테일) 또는 본 발명의 절단 칵테일을 사용한 절단 후에, 제2(후속) 절단을 수행하였다(표 17 참조).
제1 절단을 수행하였으며, 여액을 수득하였다. TFA를 TFA-습윤 수지에 첨가하였다. 1시간 교반 후에, 수지를 여과하였다. 여액을 조합하고, 농축시켰다.
릭시세나티드 수율에 대한 제2의 후속 절단의 영향을 조사하였다.
[표 29]
Figure pct00045
Figure pct00046
결과: 후속 절단은 오직 약 0.7%의 수율의 증가를 초래한다. 이 증가는 출발 물질(TFA)에 대한 비용의 유의미한 증가, 및 펩타이드 제제로부터 TFA를 제거하기 위한 추가의 노력과 연관된다. 제1 및 제2 절단 단계의 여액의 조합에 의해, TFA의 양이 유의미하게 증가한다는 것을 고려해야 한다.
수율의 적은 증가를 고려해보면, 제2 절단의 생략은 비용 감소를 야기하며, 생산 과정 동안 취급이 용이해지는 것으로 결론지었다. TFA의 제거가 용이해지도록 TFA의 양은 감소된다.
7.12 분석론
2개의 뱃치, 71001-016(비교 뱃치, 표준 방법에 따른 킹 칵테일을 사용한 절단) 및 71001-013(본 발명에 따른 릭시세나티드 절단)을 제조하였다.
[표 30]
Figure pct00047
결과: 뱃치는 거의 동일한 순도를 보였다. 본 발명에 따라 생산된 뱃치에서 함량이 약간 감소된다. 본 발명의 뱃치에서, 산물 중량이 증가하여, 수율 증가를 초래한다.
7.13 요약
본 발명의 절단 방법은 하기의 이점을 갖는다:
(a) 릭시세나티드 수율이 약 5% 증가하여, 비용 감소 및 생산 능력의 증가를 초래함.
(b) (비교 킹 칵테일 중 5개의 성분을 고려해보면) 오직 2개의 성분만이 절단 칵테일 중에 존재하므로, 분석적 품질 제어가 개선되며, 비용이 감소함,
(c) 제2 절단의 생략은 비용 감소를 야기하며, 생산 과정 동안 취급이 용이해짐. TFA의 양이 감소하여, TFA의 제거가 용이해짐.
하기의 양태 또한 본 발명의 대상이다:
1. 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 합성 방법으로서, 상기 방법이 아미노산 사슬로의 아미노산 빌딩 블록의 커플링 사이클을 포함하며,
상기 아미노산 빌딩 블록이 비보호된 C-말단 카복실 기 및 보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
상기 아미노산 사슬이 비보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
적어도 하나의 커플링 사이클이
(a) 아미노산 빌딩 블록을 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시켜, 아미노산 사슬과 아미노산 빌딩 블록 사이에 아미드 결합이 형성되도록 하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 수득된 산물을 캡핑 화합물을 포함하는 캡핑 시약과 접촉시키는 단계로서, 캡핑 화합물은 단계 (a)에서 빌딩 블록이 커플링되지 않은 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에 결합하는 단계, 및
(c) 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기를 탈보호시키는 단계
를 포함하는 방법.
2. 항목 1에 있어서, 캡핑 화합물이 아세트산 무수물(CAS 108-24-7), 아세트산 무수물의 동족체, 염화벤조일(CAS 98-88-4), N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-17-8), 벤질 클로로포르메이트(CAS 501-53-1), 클로로포름산의 에스테르, 1-아세틸이미다졸(CAS 2466-76-4), 디-tert-부틸 디카보네이트(CAS 24424-99-5) 및 N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-12-3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 캡핑 시약이 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 1 내지 3 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 방법.
7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 0.5 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 방법.
8. 항목 1 내지 항목 7 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 방법.
9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민 및 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
10. 항목 1 내지 항목 9 중 어느 한 항목에 있어서, 캡핑 시약이 DMF를 포함하는 방법.
11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (b)가 15 내지 25℃의 온도에서 수행되는 방법.
12. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 (b)가 5 내지 15분 동안 수행되는 방법.
13. 항목 1 내지 항목 12 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록이 α-아미노산을 포함하는 방법.
14. 항목 1 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록이 Ser, Thr, Trp, Lys, Ala, Asn, Asp, Val, Met, Phe, Ile, Pro, Arg, Glu, Gln, Leu 및 Gly로부터 선택되는 방법.
15. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록이 Arg, Glu, Gln, Leu 및 Gly로부터 선택되는 방법.
16. 항목 1 내지 항목 15 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록의 측쇄가 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 보호기에 대하여 직교인 보호기를 포함하는 방법.
17. 항목 1 내지 항목 16 중 어느 한 항목에 있어서, 고체상 합성을 포함하는 방법.
18. 항목 1 내지 항목 17 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록에서 N-말단 아미노 기가 염기-불안정 보호기에 의해 보호되는 방법.
19. 항목 1 내지 항목 18 중 어느 한 항목에 있어서, 아미노산 빌딩 블록에서 N-말단 아미노 기가 Fmoc에 의해 보호되는 방법.
20. 항목 1 내지 항목 19 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩타이드가 GLP-1 효능제인 방법.
21. 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩타이드가 GLP-1, 그의 유사체 및 유도체, 엑센딘-3, 그의 유사체 및 유도체, 및 엑센딘-4, 그의 유사체 및 유도체로부터 선택되는 방법.
22. 항목 1 내지 항목 21 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩타이드가 엑센딘-4 및 릭시세나티드로부터 선택되는 방법.
23. 항목 1 내지 항목 22 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩타이드가 릭시세나티드인 방법.
24. 항목 1 내지 항목 21 중 어느 한 항목에 있어서, 폴리펩타이드가 알비글루티드, 둘라글루티드 및 세마글루티드로부터 선택되는 방법.
25. 항목 1에 있어서, 폴리펩타이드가 릭시세나티드 또는 엑센딘-4이며, 아미노산 빌딩 블록 Arg(20), Glu(17), Gln(13), Leu(10) 또는/및 Gly(4)의 커플링 후에 단계 (b)가 2 v/v%의 아세트산 무수물 및 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 캡핑 시약을 사용하여 약 10분 동안 수행되는 방법.
26. DMF 중 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물 및 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 항목 26에 있어서, 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민 및 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 조성물.
28. 폴리펩타이드 합성에서 비보호된 아미노 기의 아세틸화를 위한 항목 26 또는 항목 27의 조성물의 용도.
29. 폴리펩타이드가 릭시세나티드인, 항목 28의 조성물의 용도.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Capping of unprotected amino groups during peptide synthesis <130> 65946PEP <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lixisenatide <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <223> exendin-4 <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma horridum <220> <223> exendin-3 <400> 3 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> human <220> <223> GLP-1(7-36) <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30

Claims (15)

  1. 사전 결정된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 합성 방법으로서, 상기 방법이 아미노산 사슬로의 아미노산 빌딩 블록의 커플링 사이클을 포함하며,
    상기 아미노산 빌딩 블록이 비보호된 C-말단 카복실 기 및 보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
    상기 아미노산 사슬이 비보호된 N-말단 아미노 기를 포함하며,
    적어도 하나의 커플링 사이클이
    (a) 상기 아미노산 빌딩 블록을 상기 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에서 C-말단으로 커플링시켜, 상기 아미노산 사슬과 상기 아미노산 빌딩 블록 사이에 아미드 결합이 형성되도록 하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서 수득된 산물을 캡핑 화합물을 포함하는 캡핑 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 캡핑 화합물은 단계 (a)에서 빌딩 블록이 커플링되지 않은 아미노산 사슬의 비보호된 N-말단 아미노 기에 결합하는 단계, 및
    (c) 상기 아미노산 빌딩 블록의 N-말단 아미노 기를 탈보호시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡핑 화합물이 아세트산 무수물(CAS 108-24-7), 아세트산 무수물의 동족체, 염화벤조일(CAS 98-88-4), N-(벤질옥시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-17-8), 벤질 클로로포르메이트(CAS 501-53-1), 클로로포름산의 에스테르, 1-아세틸이미다졸(CAS 2466-76-4), 디-tert-부틸 디카보네이트(CAS 24424-99-5) 및 N-(tert-부톡시카보닐옥시)숙신이미드(CAS 13139-12-3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캡핑 시약이 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물, 바람직하게는 1 내지 3 v/v%의 아세트산 무수물, 더욱 바람직하게는 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡핑 시약이 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민, 바람직하게는 0.5 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민, 더욱 바람직하게는 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡핑 시약이 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민 및 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡핑 시약이 DMF를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)가 15 내지 25℃의 온도에서 수행되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)가 5 내지 15분 동안 수행되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 빌딩 블록이 α-아미노산을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 빌딩 블록이 Arg, Glu, Gln, Leu 및 Gly로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 고체상 합성을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 GLP-1, 그의 유사체 및 유도체, 엑센딘(exendin)-3, 그의 유사체 및 유도체, 및 엑센딘-4, 그의 유사체 및 유도체로부터 선택되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 엑센딘-4, 릭시세나티드(lixisenatide), 알비글루티드(albiglutide), 둘라글루티드(dulaglutide) 및 세마글루티드(semaglutide)로부터 선택되는 방법.
  14. DMF 중 0.5 내지 5 v/v%의 아세트산 무수물 및 0.2 내지 2 v/v%의 디이소프로필에틸아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물로서, 상기 조성물이 특히 1 v/v%의 디이소프로필에틸아민 및 2 v/v%의 아세트산 무수물을 포함하는 조성물.
  15. 폴리펩타이드 합성에서 비보호된 아미노 기의 아세틸화를 위한 제14항의 조성물의 용도.
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