JP2021521144A - キャップ付加を伴うリキシセナチドの合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成方法に関する。本発明による方法は、Ｎ末端が保護されたアミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングするカップリングサイクルを含み、少なくとも１つのカップリングサイクルは、カップリング工程（ａ）、キャップ付加工程（ｂ）、および脱保護工程（ｃ）を含む。

Description

本発明は、予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成方法に関する。本発明による方法は、Ｎ末端が保護されたアミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングするカップリングサイクルを含み、少なくとも１つのカップリングサイクルは、カップリング工程（ａ）、キャップ付加工程（ｂ）、および脱保護工程（ｃ）を含む。

本発明はさらに、０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸および０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む組成物の他に、ポリペプチド合成における保護されていないアミノ基のアセチル化のためのキャップ付加試薬としてのその使用に関する。

固相ペプチド合成の確立された方法は、合成されるアミノ酸鎖の予め決定されたＣ末端アミノ酸の、リンカーを介したポリマー担体へのカップリングを教示する。カップリングのために使用されるアミノ酸は、Ｎ末端が保護されたアミノ基を有するアミノ酸ビルディングブロックであり、前記保護基は一時的に連結されたＦｍｏｃ基である。カップリングの成功後、Ｆｍｏｃ保護基は切断され、次のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸ビルディングブロックが、先行するアミノ酸ビルディングブロックの遊離アミノ官能基とカップリングされる。所望のアミノ酸鎖が合成された場合、それは固相から切断される。図１は、記載したアプローチの概要を与える。

カップリング反応は常に完全なわけではないので、残留遊離アミノ基を無水酢酸を用いてアセチル化することができる（図１を参照）。この反応はキャップ付加と呼ばれる。キャップ付加の目的は、恐らくは所望の最終生成物から分離することが難しい（Ｎ−１）不純物（すなわち、１つの位置においてアミノ酸ビルディングブロックを欠いた生成物）の出現を防止することである。

文献において、ペプチドの固相合成用の多数のキャップ付加混合物が記載されている。非特許文献１は、グラミシジンＡの合成のために塩化メチレン中の無水酢酸およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を使用する。最初に、塩化メチレン２０ｍｌ中のＤＩＰＥＡ １当量を加える。５分後、無水酢酸４当量を加える。総インキュベーション時間は２０分である。非特許文献２は、キャップ付加処理のための３０分のインキュベーション時間と組み合わせたＤＭＦ中のおおよそ９％の無水酢酸およびおおよそ１６％のＤＩＰＥＡの使用を教示する。非特許文献３は、キャップ付加処理用の無水酢酸、ピリジンおよび塩化メチレンの混合物を開示する。

参照によって本明細書に組み入れる特許文献１に記載のリキシセナチド（ＡＶＥ００１０またはＺＰ−１０としても公知）の固相合成は、いかなるキャップ付加反応も伴わない、それぞれ同じ様式での個々のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸ビルディングブロックのカップリングを含む。

リキシセナチドは、配列ｄｅｓＰｒｏ^３６エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２を有する。この物質は、特許文献１の配列番号９３に開示されている（本出願の配列番号１および図２を参照）。エキセンジンは、血中グルコース濃度を低下させることができるペプチドの群である。エキセンジンは、ＧＬＰ−１（７〜３６）の配列とある特定の類似性を有する（５３％、非特許文献４）。エキセンジン−３およびエキセンジン−４は、エキセンジン受容体との相互作用によりモルモットの膵腺房細胞において細胞ｃＡＭＰ産生の増加を刺激する（非特許文献５）。エキセンジン−４とは対照的に、エキセンジン−３は、膵腺房細胞におけるアミラーゼ放出の増加をもたらす。エキセンジンはＧＬＰ−１アンタゴニストとして作用する。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、グルコースまたは脂肪の経口摂取後のインスリン応答を増進する内分泌ホルモンである。ＧＬＰ−１は、概しては、グルカゴン濃度を低下させ、胃内容排出を減速させ、（プロ）インスリン生合成を刺激し、インスリンへの感受性を増加させ、インスリン非依存性グリコーゲン生合成を刺激する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ヒトＧＬＰ−１は３７のアミノ酸残基を有する（非特許文献９、非特許文献１０）。ＧＬＰ−１の活性断片としては、ＧＬＰ−１（７〜３６）およびＧＬＰ−１（７〜３７）が挙げられる。

エキセンジン−３、エキセンジン−４およびエキセンジンアゴニストは胃内容排出および運動性を低減するので、糖尿病の治療および高血糖症の予防のためにそれらを使用できることが示唆された（特許文献２および特許文献３）。

エキセンジンアナログは、天然エキセンジン−４配列のアミノ酸置換および／またはＣ末端切断により特徴付けることができる。そのようなエキセンジンアナログは、特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。

ＷＯ０１／０４１５６Ａ１ 米国特許第５，４２４，２８６号 ＷＯ９８／０５３５Ａ１ ＷＯ９９／０７４０４ ＷＯ９９／２５７２７ ＷＯ９９／２５７２８

Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ８５、１３８４〜１３８８頁、１９８８年 Ｅｒｉｔｊａ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｔｒｏｎ ４３、２６７５〜２６８０頁、１９８７年 Ｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． １９８８年、１０９５〜１０９７頁 Ｇｏｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、１９６５０〜５５頁 Ｒａｕｆｍａｎ、１９９６年、Ｒｅｇ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ６１：１〜１８頁 Ｈｏｌｓｔ（１９９９年）、Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６：１００５頁 Ｎａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７年）、Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ １０５：１８７頁 Ｌｏｐｅｚ−Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：２８１１頁 Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１５：２１７６頁（１９８４年） Ｕｔｔｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂｏｌ．（１９８５年）、６１：４７２頁

本発明者らは、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸ビルディングブロックを用いるリキシセナチドの一般的な固相合成の粗生成物は、他のアセチル化された誤った配列に対して増加した量のある特定のアセチル化された誤った配列を呈することを見出した。これらの予想外に顕著な不純物は、特に、Ａｃ（２０〜４４）、Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）、Ａｃ（１０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）である。

本発明により解決される課題は、ペプチド合成において出現するアセチル化された誤った配列の量を低減し、したがって、ペプチド合成の収率を増進することである。特に、粗生成物中で増加した量を有するそれらのアセチル化された誤った配列の量は低減されるべきである。

リキシセナチド固相合成のキャップ付加工程の間に、カップリングしたばかりのアミノ酸ビルディングブロックの一部からＦｍｏｃ保護基が望ましくないことに切断されることが見出された。この望ましくない切断は、合成サイクルの間にある特定のアミノ酸位置におけるキャップ付加についてのみ検出された。これらの位置の５つは：
・Ａｒｇ（２０）のカップリング後のキャップ付加、
・Ｇｌｕ（１７）のカップリング後のキャップ付加、
・Ｇｌｎ（１３）のカップリング後のキャップ付加、
・Ｌｅｕ（１０）のカップリング後のキャップ付加、
・Ｇｌｙ（４）のカップリング後のキャップ付加
である。

本出願により解決されるさらなる問題は、そのため、望ましくないアセチル化された生成物がそのような増加した量でもはや存在しないキャップ付加条件を提供することである。

驚くべきことに、より穏やかなキャップ付加条件の適用は、粗生成物中のより低い副生成物濃度またはさらにはその完全な根絶に繋がることが見出された。そのクロマトグラフィーピークが意図する生成物のそれに近い、副生成物Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）、およびＡｃ（１０〜４４）を低減または完全に除去することにより、粗生成物からの意図する生成物の精製が強く促進される。より混合度の低い画分が出現するので、精製されたリキシセナチドの収率は増加する。そのピークが意図する生成物のピークからさらに離れている副生成物Ａｃ（２０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）の濃度もまた、穏やかなキャップ付加条件により最小化されるので、収率はさらに増加する。

本発明の一態様は、予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成方法であって、該方法は、アミノ酸鎖へのアミノ酸ビルディングブロックのカップリングサイクルを含み、前記アミノ酸ビルディングブロックは、保護されていないＣ末端カルボキシル基および保護されたＮ末端アミノ基を含み、かつ、前記アミノ酸鎖は、保護されていないＮ末端アミノ基を含み、少なくとも１つのカップリングサイクルは：
（ａ）アミノ酸鎖とアミノ酸ビルディングブロックとの間にアミド結合が形成されるように、アミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングする工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた生成物を、キャップ付加化合物を含むキャップ付加試薬と接触させ、キャップ付加化合物が、工程（ａ）においてビルディングブロックがカップリングされなかったアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基に結合する工程、および
（ｃ）アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基を脱保護する工程
を含む、前記方法に関する。

本発明において、「キャップ付加試薬」、「キャップ付加組成物」または「キャップ付加混合物」は交換可能に使用される。試薬は、工程（ｂ）の前に製造することができ、またはキャップ付加試薬の成分は工程（ｂ）の間に加えられる。

工程（ｂ）においてキャップ付加されるアミノ酸鎖は、さらなるアミノ酸ビルディングブロックにカップリングすることができないため、この分子の鎖伸長は終了される。

ポリペプチドの合成の間に、アミノ酸ビルディングブロックのカップリングサイクルは、ポリペプチドのアミノ酸鎖がビルディングブロック毎に形成されるように行われる。カップリング工程のために、当該技術分野の現行技術、特に、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸ビルディングブロックに基づく固相合成を使用することができる。ペプチドの固相合成のために好適な全ての種類の固相を使用することができる。特に、樹脂を含む固相を使用することができる。樹脂は、Ｒｉｎｋ樹脂（Ｒｉｎｋアミド樹脂）またはＴｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）樹脂であり得る。好ましい態様では、固相樹脂はＲｉｎｋ樹脂またはＲｉｎｋアミド樹脂である。

本発明による工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むサイクルは、１回または数回繰り返すことができる。各アミノ酸ビルディングブロックがカップリングされるために１つのサイクルが行われる。各々のアミノ酸ビルディングブロックは、予め決定されたアミノ酸配列に依存して、各サイクルのために独立して選択される。本明細書に記載されるような全ての種類のアミノ酸ビルディングブロックを使用することができる。

本発明による方法は、キャップ付加温度、キャップ付加試薬組成物または／およびキャップ付加期間などのキャップ付加工程の条件に関して同じまたは異なるカップリングサイクルを組み合わせることができる。一態様では、本発明による全てのカップリングサイクルは、同じキャップ付加条件下で行われる。別の態様では、少なくとも１つのキャップ付加工程は、例えば、改変されたキャップ付加温度、キャップ付加試薬組成物または／およびキャップ付加期間により、本発明による他のキャップ付加工程とは異なる。一態様では、本発明による方法は、１つより多くのキャップ付加工程の条件、例えば、ポリペプチド全体の合成にわたり２、３、４または５つの異なるキャップ付加工程の条件を含む。

一態様では、本発明による方法は、キャップ付加工程（ｂ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルを含む。

キャップ付加化合物は、好ましくは、無水酢酸（ＣＡＳ １０８−２４−７）、無水酢酸のホモログ、塩化ベンゾイル（ＣＡＳ ９８−８８−４）、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１７−８）、クロロギ酸ベンジル（ＣＡＳ ５０１−５３−１）、クロロギ酸のエステル、１−アセチルイミダゾール（ＣＡＳ ２４６６−７６−４）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＣＡＳ ２４４２４−９９−５）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１２−３）からなる群から選択される。好ましい態様では、キャップ付加化合物は、無水酢酸および無水酢酸のホモログから選択され、好ましくは無水酢酸である。

一態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の無水酢酸を含む。好ましい態様では、無水酢酸の濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の無水酢酸のホモログを含む。好ましい態様では、無水酢酸のホモログの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の塩化ベンゾイルを含む。好ましい態様では、塩化ベンゾイルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミドを含む。好ましい態様では、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミドの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のクロロギ酸ベンジルを含む。好ましい態様では、クロロギ酸ベンジルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のクロロギ酸のエステルを含む。好ましい態様では、クロロギ酸のエステルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の１−アセチルイミダゾールを含む。好ましい態様では、１−アセチルイミダゾールの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルのエステルを含む。好ましい態様では、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

別の態様では、キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドのエステルを含む。好ましい態様では、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは２％ｖ／ｖである。

キャップ付加試薬は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとも称される）を含むことができる。一態様では、キャップ付加試薬はジイソプロピルエチルアミンを含み、ジイソプロピルエチルアミンの濃度は０．２〜２％ｖ／ｖであり得、好ましくは０．５〜２％ｖ／ｖである。ジイソプロピルエチルアミンの好ましい濃度は１％ｖ／ｖである。

一態様では、キャップ付加試薬はジイソプロピルエチルアミンおよび無水酢酸を含み、ジイソプロピルエチルアミンの濃度は０．２〜２％ｖ／ｖであり得、好ましくは０．５〜２％ｖ／ｖであり、かつ、無水酢酸の濃度は０．５〜５％ｖ／ｖであり得、好ましくは１〜３％ｖ／ｖである。

一態様では、キャップ付加組成物またはキャップ付加試薬は、約１％ｖ／ｖの濃度のジイソプロピルエチルアミンおよび約２％ｖ／ｖの濃度の無水酢酸を含む。

本発明の方法において、アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基は、好ましくは塩基不安定性保護基、より好ましくはＦｍｏｃである。

キャップ付加工程において使用される溶媒は、好ましくは、極性非水性溶媒、例えば、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、塩化メチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン、またはこれらの混合物である。好ましい態様では、キャップ付加工程において使用される溶媒はＤＭＦである。

本発明において、「約」または「おおよそ」という用語は、±１０％、±５％または±１％の範囲を意味する。

本発明によるキャップ付加反応（ｂ）は、室温で行うことができる。本発明による室温は、約１５〜２５℃の温度、約２０〜２３℃の範囲内の温度、約１９〜２１℃の範囲内の温度または約２０℃の温度に関する。

本発明の方法において、工程（ｂ）は、好ましくは、５〜１５分間、好ましくは１０分間行われる。

好ましい態様では、工程（ｂ）は、２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのＤＩＰＥＡを含むキャップ付加試薬を用いて１０分間行われる。

別の好ましい態様では、工程（ｂ）は、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列の位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）においてＤＭＦ中の２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのＤＩＰＥＡを含むキャップ付加試薬を用いて１０分間行われる。

さらに別の好ましい態様では、工程（ｂ）は、本明細書に記載されるように、室温でリキシセナチドまたはエキセンジン−４配列の位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）においてＤＭＦ中の２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのＤＩＰＥＡを含むキャップ付加試薬を用いて１０分間行われる。

一態様では、本発明による方法は、特に、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列のＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）とは異なる位置において、キャップ付加工程を有しない少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクルまたは少なくとも５つのカップリングサイクルを含むことができる。

別の態様では、本発明による方法は、特に、２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むキャップ付加試薬を用いる約１０分間の、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列のアミノ酸ビルディングブロックＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）のカップリング後の工程（ｂ）によるキャップ付加を含む。工程（ｂ）は、工程（ａ）におけるＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは／およびＧｌｙ残基、特に、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列のＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）のカップリング後に行うことができる。好ましくは、他のアミノ酸位置において、キャップ付加工程は行われず、または／かつ、キャップ付加は、ＤＭＦ中の１０％の無水酢酸および５％ｖ／ｖのＤＩＰＥＡを用いて２０分間行われる。特に、キャップ付加は、本明細書に記載されるように、室温で行われる。

本発明のさらに別の態様では、本発明による方法は、特に、２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むキャップ付加試薬を用いる約１０分間の、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列の全てのアミノ酸ビルディングブロックのカップリング後の工程（ｂ）によるキャップ付加を含む。工程（ｂ）は、工程（ａ）におけるリキシセナチドまたはエキセンジン−４配列の全てのアミノ酸残基のカップリング後に行うことができる。単一のアミノ酸カップリング工程において、キャップ付加を省略することができる。工程（ｂ）は、工程（ａ）におけるリキシセナチドまたはエキセンジン−４配列の少なくとも３０または少なくとも３５アミノ酸残基のカップリング後に行うことができる。

一態様では、本発明による方法は、キャップ付加工程（ｂ）を含まない少なくとも１つのカップリングサイクルおよび本明細書に記載されるようなキャップ付加工程（ｂ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクルを含むことができる。一態様では、本発明による方法は、キャップ付加工程（ｂ）を含まない少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルおよび本明細書に記載されるようなキャップ付加工程（ｂ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルを含むことができる。特に、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列のＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）とは異なる位置において、キャップ付加は行われない。

一態様では、本発明による方法は、工程（ａ）、（ｂ’）および（ｃ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルを含むことができ、キャップ付加工程（ｂ’）は、キャップ付加工程（ｂ）とは異なる条件下で行われる。工程（ｂ’）を含むカップリングサイクルは、リキシセナチドまたはエキセンジン−４配列のＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）とは異なるアミノ酸ビルディングブロックのカップリングのために特に適用される。一態様では、工程（ｂ’）は、ＤＭＦ中の約１０％ｖ／ｖの無水酢酸および約５％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むキャップ付加試薬を使用することができ、例えば、約２０分間行われる。

一態様では、本発明による方法は、本発明によるキャップ付加工程（ｂ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクルおよび本明細書に記載されるようなキャップ付加工程（ｂ’）を含む少なくとも１つのカップリングサイクルを含むことができる。一態様では、本発明による方法は、本発明によるキャップ付加工程（ｂ）を含む少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルおよび本明細書に記載されるようなキャップ付加工程（ｂ’）を含む少なくとも１つのカップリングサイクル、少なくとも２つのカップリングサイクル、少なくとも３つのカップリングサイクル、少なくとも４つのカップリングサイクル、または少なくとも５つのカップリングサイクルを含むことができる。

１つの単一のサイクルにおいて１つより多くのアミノ酸のカップリングを含む、本明細書に記載されるようなアミノ酸ビルディングブロックのカップリングのために、例えば、アミノ酸ビルディングブロックＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨをそれぞれ使用することによるＰｒｏ−ＰｒｏまたはＨｉｓ−Ｇｌｙなどのジペプチドのカップリングのために、工程（ｂ’）を含むカップリングサイクルが好ましくは使用される。

工程（ａ）によるカップリング工程および工程（ｃ）による脱保護工程を行う方法は当業者に公知である。ペプチド合成は、好ましくは、固相合成の形態で行われる。好ましい態様では、カップリングサイクルは、合成される配列のＣ末端からＮ末端へと行われる。アミノ酸ビルディングブロックによるＣ末端からＮ末端への固相ペプチド合成において適用される工程（ａ）および（ｃ）のための反応条件は当業者に公知である。

本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、ペプチド合成の１つのサイクルにおいて１つまたはそれ以上のアミノ酸により合成されるアミノ酸鎖を伸長させる化合物である。好ましい態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、１、２、３、または４つのアミノ酸により合成されるアミノ酸鎖を伸長させる。特に好ましい態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、１または２つのアミノ酸により合成されるアミノ酸鎖を伸長させる。

本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、好ましくは、１つのアミノ酸（モノアミノ酸ビルディングブロック）または２、３、４もしくはより多くのアミノ酸を含むオリゴペプチドを含む。好ましい態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、１つのアミノ酸、または、例えばＰｒｏ−ＰｒｏもしくはＨｉｓ−Ｇｌｙなどの２つのアミノ酸を含むペプチドを含む。１つより多くのアミノ酸を含むアミノ酸ビルディングブロックのアミノ酸は、好ましくは、ペプチド結合により連結される。２つのアミノ酸を含む特に好ましいアミノ酸ビルディングブロックはＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨである。

リキシセナチドおよびエキセンジン−４の合成において位置１および２におけるＨｉｓおよびＧｌｙ用のアミノ酸ビルディングブロックの代わりにＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨを使用することにより望ましくないＤｅｓＧｌｙ（２）−リキシセナチドの防止が可能となることが見出された。さらに、得られたリキシセナチドは、ラセミ化の結果としてもたらされるＤ−Ｈｉｓの値の増進を示さなかった。

Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨは、例えば、
ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＨ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌトシレートを反応させる工程、および
ｉｉ）工程ｉ）において得られた生成物のベンジル基を切断してＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨを得る工程
を含む方法により形成させることができる。

例示的な反応条件は実施例３に示される。

本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、所望の位置においてのみアミノ酸鎖を選択的に伸長させるために好適な改変を含むことができる。アミノ酸ビルディングブロックの改変は、Ｎ末端、Ｃ末端または／およびアミノ酸の側鎖において行うことができる。

アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ官能基（すなわち、カップリングの成功後にアミノ酸鎖のＮ末端にあるアミノ基）を保護するために、ペプチドの合成、特にポリペプチドの固相合成のために一般的に使用される全ての種類の保護基を使用することができる。それらの種類の好適な一時的な保護基は当業者に公知である。好ましい態様では、アルカリ性環境中で不安定な保護基を使用することができる。好ましい態様では、アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基はＦｍｏｃ保護基により保護される。

アミノ酸ビルディングブロックのＣ末端カルボキシ基は、好ましくは、保護されないままである。

本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、互いに独立して、Ｄ−アミノ酸およびグリシン、Ｌ−アミノ酸およびグリシンまたは／ならびにこれらの組合せを含むことができる。好ましい態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックのアミノ酸は、互いに独立してＬ−アミノ酸およびグリシンから選択される。好ましい態様では、アミノ酸は、α−アミノ酸から選択することができる。さらなる態様では、アミノ酸は、ポリペプチド中に天然に存在するアミノ酸などの天然に存在するアミノ酸から選択することができる。別の態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、Ｍｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシドもしくはメチオニンスルホン）、Ｔｒｐ（Ｏ_２）（Ｎ−ホルミルキヌレニン）または／およびｉｓｏＡｓｐ（β−アスパラギン酸もしくはイソアスパラギン酸）などの人工アミノ酸を含むことができる。いっそうさらなる好ましい態様では、アミノ酸は、特にそれぞれＤ型またはそれぞれＬ型の、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙから選択される。特に好ましい態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックは、特にそれぞれＤ型またはそれぞれＬ型の、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙから選択されるアミノ酸を含む。

特に、アミノ酸は、互いに独立して選択され、例えば、特にそれぞれＤ型またはそれぞれＬ型の、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙから独立して選択される。

一態様では、本発明によるアミノ酸ビルディングブロックの少なくとも１つの側鎖は、さらなる保護基により保護することができる。さらなる保護基は、好ましくは、Ｎ末端保護基に対して直交性である。前記側鎖のための好適な保護基は当業者に公知である。好適な保護基の例は、例えば、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、Ｂｚｌ、Ｐｄｆ、ｔＢｕおよびＯｔＢｕであり、これらは特定の側鎖の保護のために使用することができる。当業者は、いずれの側鎖がいずれの種類の保護基により保護される必要があるかを認識している。一態様では、実施例１．４に記載されるようなアミノ酸ビルディングブロックを使用することができる。アミノ酸ビルディングブロックが１つより多くの側鎖を含む場合、これらの側鎖の１つまたはそれ以上を、当業者に公知であるような好適な保護基から独立して選択される保護基により保護することができる。

合成されるポリペプチドは、予め決定された配列を有するそれぞれ可能なペプチドであってもよい。好ましい態様では、合成されるポリペプチドはＧＬＰ−１アゴニストである。ポリペプチドはＧＬＰ−１アゴニストであり得、ＧＬＰ−１アゴニストは、ＧＬＰ−１ならびにそのアナログおよび誘導体、エキセンジン−３ならびにそのアナログおよび誘導体、エキセンジン−４ならびにそのアナログおよび誘導体からなる群から選択される。好ましい態様では、ポリペプチドは、エキセンジン−４およびリキシセナチドからなる群から選択される。最も好ましいのはリキシセナチドである。さらなる好ましい態様では、ポリペプチドは、アルビグルチド、デュラグルチドおよびセマグルチドから選択される。

エキセンジン−３、エキセンジン−３のアナログおよび誘導体、エキセンジン−４ならびにエキセンジン−４のアナログおよび誘導体は、ＷＯ０１／０４１５６、ＷＯ９８／３０２３１、米国特許第５，４２４，２８６号、ＥＰ第９９６１００４３．４号およびＷＯ２００４／００５３４２に記載されている。これらの文献を参照によって本明細書に組み入れる。これらの文献に記載のエキセンジン−３、エキセンジン−４ならびにこれらのアナログおよび誘導体は、本発明による方法により合成することができる一方、追加の改変を合成の完了後に行うことができる。

リキシセナチド（配列番号１、図２）、エキセンジン−４（配列番号２、図２）およびエキセンジン−３（配列番号３、図２）は、高い程度の配列同一性を有する。リキシセナチドおよびエキセンジン−４の配列は位置１〜３７において同一である。エキセンジン−４の配列１〜３９は３９の位置のうちの３７（９４％）においてエキセンジン−３と同一である（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７、１９９２年、７４０２〜７４０５頁）。配列位置は、本明細書においてリキシセナチドまたはエキセンジン−４の配列に関して与えられる。これらの配列から開始して、当業者は、他の配列中の対応する位置を容易に決定することができる。

エキセンジン−３または／ならびにエキセンジン−４のアナログおよび誘導体は、特に、改変されたアミノ酸配列を含む。一態様では、アミノ酸配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、エキセンジン−４中のｄｅｓＰｒｏ^３６、ｄｅｓＰｒｏ^３７、ｄｅｓＡｓｐ^２８、ｄｅｓＭｅｔ（Ｏ^１４）およびエキセンジン−３中の各々の位置）の欠失により改変される。一態様では、１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換することができる一方（例えば、エキセンジン−４中のＭｅｔ（Ｏ^１４）、Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５、ｉｓｏＡｓｐ^２８、Ａｓｐ^２８、Ｐｒｏ^３８およびエキセンジン−３中の各々の位置）、天然に存在するまたは人工アミノ酸、例えば、Ｍｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシドもしくはメチオニンスルホン）、Ｔｒｐ（Ｏ_２）（Ｎ−ホルミルキヌレニン）または／およびｉｓｏＡｓｐ（β−アスパラギン酸もしくはイソアスパラギン酸）などを導入することができる。人工アミノ酸は、合成サイクルにおいて各々のアミノ酸ビルディングブロックを使用することにより配列に容易に導入することができる。

一態様では、ポリペプチドのＣ末端または／およびＮ末端は、例えば、−（Ｌｙｓ）−、−（Ｌｙｓ）_２−、−（Ｌｙｓ）_３−、−（Ｌｙｓ）_４−、−（Ｌｙｓ）_５−、−（Ｌｙｓ）_６−、および−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−などの配列の付加により、改変することができる。好ましい態様では、追加のアミノ酸配列は、例えば、−（Ｌｙｓ）_４−、−（Ｌｙｓ）_５−、−（Ｌｙｓ）_６−および−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−である。Ｃ末端カルボキシ基は、好ましくは、酸アミン基（−ＮＨ_２）である。場合により、Ｃ末端または／およびＮ末端の改変は、本発明による方法の合成サイクルの完了後に別々の工程において行われる。

本発明による方法の合成サイクルの完了後、合成されたポリペプチドの薬学的に許容される塩を、場合により追加の工程において形成することができる。ポリペプチドの薬学的に許容される塩の形成方法は当業者に公知である。好ましい薬学的に許容される塩は、例えば、酢酸塩である。

一態様では、ＧＬＰ−１アゴニストは、好ましくは、エキセンジン−４、そのアナログおよび誘導体ならびにこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

さらなる好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、
Ｈ−ｄｅｓＰｒｏ^３６−エキセンジン−４−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
Ｈ−ｄｅｓ（Ｐｒｏ^{３６，３７}）−エキセンジン−４−Ｌｙｓ_４−ＮＨ_２、
Ｈ−ｄｅｓ（Ｐｒｏ^{３６，３７}）−エキセンジン−４−Ｌｙｓ_５−ＮＨ_２、およびこれらの薬学的に許容される塩
からなる群から選択されるエキセンジン−４のアナログである。

さらなる好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［ＩｓｏＡｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９），
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，ＩｓｏＡｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−２（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，ＩｓｏＡｓｐ^２８］エキセンジン−２（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）、
ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，ＩｓｏＡｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）、およびこれらの薬学的に許容される塩
からなる群から選択されるエキセンジン−４のアナログである。

さらなる好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、Ｃ末端において−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２ペプチドでさらに改変された、上記のような群から選択されるエキセンジン−４のアナログである。

さらなる好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
ｄｅｓＡｓｐ^２８Ｐｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
Ｈ−ｄｅｓＡｓｐ^２８ Ｐｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
ｄｅｓＭｅｔ（Ｏ）^１４ Ａｓｐ^２８ Ｐｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４、Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−Ｌｙｓ_６−ＮＨ_２、
ｄｅｓＡｓｐ^２８Ｐｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４、Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４、Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−ＮＨ_２、
ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４、Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−（Ｌｙｓ）_６−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）_５−ｄｅｓＰｒｏ^３６，Ｐｒｏ^３７，Ｐｒｏ^３８［Ｍｅｔ（Ｏ）^１４，Ｔｒｐ（Ｏ_２）^２５，Ａｓｐ^２８］エキセンジン−４（１〜３９）−（Ｌｙｓ）_６−ＮＨ_２、およびこれらの薬学的に許容される塩
からなる群から選択されるエキセンジン−４のアナログである。

さらなる態様では、好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、ＧＬＰ−１（特に、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、配列番号４）、Ａｒｇ^３４，Ｌｙｓ^２６（Ｎ^ε（γ−グルタミル（Ｎ^αヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７〜３７）（リラグルチド）、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチドおよびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。特に、好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチドおよびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

さらなる好ましいＧＬＰ−１アゴニストは、リキシセナチド（配列番号１）の他に、その薬学的に許容される塩である。

一態様では、合成されるポリペプチドは、好ましくは、リキシセナチドまたはエキセンジン−４であり、アミノ酸ビルディングブロックＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）のカップリング後、工程（ｂ）は、２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むキャップ付加試薬を用いて約１０分間行われる。

一態様では、本発明による方法は、固相合成の形態のポリペプチドの合成を含む。本発明による方法は、場合により：
（ｄ）固相に連結したポリペプチドを切断する
さらなる工程を含む。

工程（ｄ）は、特に、アミノ酸鎖の合成が完了した時に行われる。工程（ｄ）は、ポリペプチドが結合した固相を、トリフルオロ酢酸および１，２−エタンジチオールから本質的になる組成物と約２３℃〜約２９℃の範囲内の温度で接触させることを含む、固相からの固相結合ポリペプチドの切断により行うことができる。

切断は、約９５〜約９９％ｖ／ｖの量のトリフルオロ酢酸を含む組成物を用いて行うことができる。

切断はまた、約１〜約５％ｖ／ｖの量の１，２−エタンジチオールを含む組成物を用いて行うことができる。

好ましくは、切断は、約９７％ｖ／ｖの量のトリフルオロ酢酸および約３％ｖ／ｖの量の１，２−エタンジチオールから本質的になる組成物を用いて行われる。

切断は、組成物をポリペプチドが結合した固相と約２５℃〜約２７℃の温度で接触させることにより行うことができる。

好ましくは、切断は、組成物をポリペプチドが結合した固相と約２６℃の温度で接触させることにより行われる。

最も好ましくは、切断は、約９７％ｖ／ｖの量のトリフルオロ酢酸および約３％ｖ／ｖの量の１，２−エタンジチオールから本質的になる組成物を用いて約２６℃の温度で行われる。

最も好ましくは、切断は、約９７％ｖ／ｖの量のトリフルオロ酢酸および約３％ｖ／ｖの量の１，２−エタンジチオールから本質的になる組成物を用いて約２６℃の温度で約４時間行われる。

本発明の好ましい態様は、予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの固相合成の方法であって、該方法は、アミノ酸鎖へのアミノ酸ビルディングブロックのカップリングサイクルを含み、
前記アミノ酸ビルディングブロックは、保護されていないＣ末端カルボキシル基および保護されたＮ末端アミノ基を含み、
かつ、前記アミノ酸鎖は、保護されていないＮ末端アミノ基を含み、
少なくとも１つのカップリングサイクルは：
（ａ）アミノ酸鎖とアミノ酸ビルディングブロックとの間にアミド結合が形成されるように、アミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングする工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた生成物を、無水酢酸を含むキャップ付加試薬と接触させ、無水酢酸が、工程（ａ）においてビルディングブロックがカップリングされなかったアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基に結合する工程、および
（ｃ）アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基を脱保護する工程
を含み、
キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸および０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む、
前記方法に関する。

本発明のさらなる態様は、ＤＭＦ中の０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸および０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む組成物に関する。好ましい態様では、本発明による組成物は、ＤＭＦ中の１〜３％ｖ／ｖの無水酢酸および０〜５〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミン、好ましくは、ＤＭＦ中の約２％ｖ／ｖの無水酢酸および約１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む。

本発明のさらに別の態様は、約１％ｖ／ｖの濃度のジイソプロピルエチルアミンおよび約２％ｖ／ｖの濃度の無水酢酸を含む組成物に関する。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の無水酢酸のホモログを含む組成物に関する。好ましい態様では、無水酢酸ホモログの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の塩化ベンゾイルを含む組成物に関する。好ましい態様では、塩化ベンゾイルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミドを含む組成物に関する。好ましい態様では、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミドの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のクロロギ酸ベンジルを含む組成物に関する。好ましい態様では、クロロギ酸ベンジルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のクロロギ酸のエステルを含む組成物に関する。好ましい態様では、クロロギ酸のエステルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の１−アセチルイミダゾールを含む組成物に関する。好ましい態様では、１−アセチルイミダゾールの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを含む組成物に関する。好ましい態様では、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明のさらに別の態様は、０．５〜５％ｖ／ｖの濃度のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドを含むキャップ付加組成物に関する。好ましい態様では、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドの濃度は、１〜３％ｖ／ｖ、より好ましくは約２％ｖ／ｖである。組成物は、本明細書に記載されるようにＤＩＰＥＡを含むことができる。

本発明による組成物は、ポリペプチドの合成、特に、本明細書に記載されるようなポリペプチドの合成における遊離アミノ基のキャップ付加のために使用することができる。さらに、本発明による組成物は、本明細書に記載されるような遊離炭素結合アミノ基のアセチル化のために使用することができる。

好ましい態様では、本発明による組成物は、リキシセナチド、エキセンジン−３もしくはエキセンジン−４の位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）もしくは／およびＧｌｙ（４）、またはさらなるＧＬＰ−１アナログの各々の位置のカップリング工程（ａ）の後に、例えば、１０分の期間にわたり、本発明による方法の工程（ｂ）において適用される。

本発明のさらに別の態様は、ポリペプチド合成における保護されていないアミノ基のアセチル化のための、本明細書に記載されるような組成物の使用である。

略語
Ａｃ（Ｎ１〜Ｎ２）：位置Ｎ１〜Ｎ２のポリペプチドのＮ末端がアセチル化された断片。
Ｈ（Ｎ１〜Ｎ２）または（Ｎ１〜Ｎ２）：遊離のＮ末端アミノ官能基を含む位置Ｎ１〜Ｎ２のポリペプチドの断片。
Ｆｍｏｃ（Ｎ１〜Ｎ２）：保護基がＦｍｏｃである、保護されたＮ末端アミノ官能基を含む位置Ｎ１〜Ｎ２のポリペプチドの断片。
（Ｎ−１）不純物：ある特定の位置においてビルディングブロックを欠いている、ペプチド合成の間の意図しないペプチドの出現に関する。意図する合成ポリペプチドが長さＮを有する場合、不純物はＮ−１の長さを有する。（Ｎ−１）不純物の出現はキャップ付加により防止される。
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｚｌ ベンジル
Ｐｂｆ ２，２，５，７，８−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＯｔＢｕ Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル
Ｔｒｔ トリチル
ＤＩＰＥ ジイソプロピルエーテル

本発明は、以下の図面および実施例によりさらに特徴付けられる。

ペプチドの固相合成。 リキシセナチド（配列番号１）、エキセンジン−４（配列番号２）、エキセンジン−３（配列番号３）およびＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド、配列番号４）の配列。 リキシセナチドの合成の間のアセチル化された誤った配列の出現。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（２０）−ＯＨのカップリングおよびその後のキャップ付加／Ｆｍｏｃの切断。位置２１（Ｌｅｕ）を合成から省略したことに留意すべきである。（１）Ｆｍｏｃ−（２２〜４４）＋Ａｒｇ、（２）（２２〜４４）＋Ａｒｇ、（３）Ａｃ（２２〜４４）＋Ａｒｇ、（４）Ｆｍｏｃ−（２２〜４４）＋Ａｒｇ＋Ｖａｌ。データは、アセチル化された断片がキャップ付加工程の間に既に形成されているが、誤った位置がアセチル化されている［Ａｃ（２２〜２４）＋ＡｒｇがＡｒｇのキャップ付加の間に既に出現している］ことを示す。 リキシセナチドの合成の間のアセチル化された誤った配列の出現。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（１３）−ＯＨのカップリングおよびその後のキャップ付加／Ｆｍｏｃの切断。（１）Ａｃ（１４〜４４）、（２）Ｆｍｏｃ（１３〜４４）、（３）Ａｃ（１３〜４４）、（４）（１３〜４４）、（５）（１４〜４４）。データは、アセチル化された断片がキャップ付加工程の間に既に形成されているが、誤った位置がアセチル化されている（Ａｃ（１３〜４４））ことを示す。 リキシセナチドの合成の間のアセチル化された誤った配列の出現。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（１２）−ＯＨのカップリングおよびその後のキャップ付加／Ｆｍｏｃの切断。（１）Ａｃ（１３〜４４）、（２）Ｆｍｏｃ（１２〜４４）、（３）Ａｃ（１２〜４４）、（４）（１２〜４４）。データは、アセチル化された断片がキャップ付加工程の間に既に形成されているが、誤った位置がアセチル化されている（Ａｃ（１２〜４４））ことを示す。 ＨＰＬＣクロマトグラフィーによるＤＭＦ中の１０％の無水酢酸および５％ｖ／ｖのＤＩＰＥＡを用いた２０分間のキャップ付加（Ａ）と比較した本発明によるキャップ付加の方法（Ｂ）を使用したリキシセナチドの合成の比較。（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）のＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーラップ。 リキシセナチド（未加工生成物）のＨＰＬＣ。赤：望ましくないアセチル化された副生成物。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（３６〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（２３〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（２１〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（１９〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（１８〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（１５〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（１２〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（８〜４４）の形成。 キャップ付加カクテルおよび温度に依存したＡｃ（６〜４４）の形成。 １５℃、室温（ＲＴ）および３０℃でのリキシセナチド合成における９つの異なる位置でのキャップ付加におけるＡｃ（Ｘ〜４４）含有量の比較。 １５℃、室温（ＲＴ）および３０℃でのリキシセナチド合成における９つの異なる位置でのキャップ付加におけるＡｃ［（Ｘ−１）〜４４］含有量の比較。 異なるキャップ付加条件下でのリキシセナチド合成における９つの異なる位置での異なる条件下でのキャップ付加、またはキャップ付加なしでのＡｃ（Ｘ〜４４）含有量の比較。 異なるキャップ付加条件下でのリキシセナチド合成における９つの異なる位置での異なる条件下でのキャップ付加、またはキャップ付加なしでのＡｃ［（Ｘ−１）〜４４］含有量の比較。

リキシセナチドの合成
活性物質リキシセナチドは、４４アミノ酸から構成されるポリペプチドアミドであり、酢酸塩は対イオンとして機能する。

１文字表記において、リキシセナチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−ＮＨ_２

Ｃ末端、Ｌｙｓ−４４から開始する直鎖固相合成によりペプチド鎖を構築した。

合成の方法はＦｍｏｃ固相ペプチド合成であり、ペプチドアミドを得るためにＲｉｎｋアミド樹脂を使用した。反応はＤＭＦ中で室温で実行した。反応の間に、主にＤＭＦを用いて、洗浄を繰り返し実行し、中間洗浄工程の１つはイソプロパノールを用いて実行した。

ポリマー支持体上のリキシセナチドの合成は、以下の工程に分けることができる：
・Ｒｉｎｋ樹脂への第１のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）のカップリング
・未反応アミノ基のキャップ付加
・一時的な保護基Ｆｍｏｃの切断
・さらなるＦｍｏｃ−アミノ酸またはＦｍｏｃ−ジペプチドのカップリング
・未反応アミノ基のキャップ付加
・最終のＦｍｏｃの切断
・樹脂からのリキシセナチドの切断および側鎖保護基の同時の除去

合成サイクルを図１に示す。

１．１ Ｒｉｎｋ樹脂への第１のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）のカップリング
合成を開始する前に、Ｒｉｎｋアミド樹脂をＤＭＦ中で膨潤させた。膨潤は、２〜１５時間実行した。その後に、ＤＭＦ中の２５％のピペリジンを使用して一時的な保護基ＦｍｏｃをＲｉｎｋアミド樹脂から切断した。この切断は、５分および２０分の切断時間で２回行った。Ｆｍｏｃの切断後、ＤＭＦを用いて繰り返しでおよびイソプロパノールを用いて１回、樹脂を洗浄した。

樹脂をロードするために、第１のＦｍｏｃ−アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングを過剰量の２．４当量において実行した。ＨＯＢｔ水和物、ＨＢＴＵおよびＤＩＰＥＡはカップリング試薬として働いた。カップリング時間は６０〜１２０分であった。

Ｒｉｎｋ樹脂をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと完全にロードするために、カップリング試薬ＨＯＢｔ水和物およびＤＩＣを用いてさらなるローディングを実行した。カップリング時間は６〜１８時間であった。工程１．１を実行しながら混合物を撹拌した。キャップ付加をその後に実行した。

１．２ 未反応アミノ基のキャップ付加
樹脂の不完全なローディングの帰結は、まだ未反応のアミノ基が樹脂上に見出されることである。無水酢酸／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５）の混合物を加えることにより、これらを不活性化し、それゆえさらなるカップリングのために利用不可能とした。撹拌しながらキャップ付加混合物を樹脂上に２０分間残留させた。残留する遊離アミノ基をアシル化した。その後に、ＤＭＦを用いて繰り返しでおよびイソプロパノールを用いて１回、樹脂を洗浄した。

リキシセナチド合成の少なくとも５つの位置における本発明によるキャップ付加方法は実施例４および５に記載される。

１．３．一時的な保護基Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ中の２５％のピペリジンを使用して一時的な保護基Ｆｍｏｃを切断した。この切断は、５分および２０分の切断時間で２回行った。Ｆｍｏｃの切断後、ＤＭＦを用いて繰り返しでおよびイソプロパノールを用いて１回、樹脂を洗浄した。

１．４ さらなるＦｍｏｃ−アミノ酸またはＦｍｏｃ−ジペプチドのカップリング
次のＦｍｏｃ−アミノ酸を樹脂上の脱保護されたアミノ基にカップリングした。カップリングは、異なる当量においてＤＭＦ中で実行した。カップリング時間は２時間〜１８時間であった。ＨＯＢｔ／ＤＩＣ、そしてまたＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡをカップリング試薬として使用した。

以下の誘導体をＦｍｏｃ−アミノ酸として使用した：
・Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ×Ｈ_２Ｏ
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ×Ｈ_２Ｏ
・Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ
・Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ

代替的に、Ｆｍｏｃ−ジペプチドを使用することも可能であった（本発明による方法）：
・Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨ（ＣＡＳ １２９２２３−２２−９）
・Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ（ＣＡＳ １８６０２３−４４−９）
・Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＣＡＳ １１３２４７−８０−６）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ（ＣＡＳ ２１２６５１−４８−４）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＣＡＳ ３５６６５−３８−４）
・Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂ−３６３０より）
・Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＣＡＳ ８６６０４４−６３−５）
・Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨ

カップリングがカイザー試験にしたがって不完全であると見出された場合（Ｅ． Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４、１９７０年、５９５頁）、さらなるカップリングが可能であった。この目的のために、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔ水和物と共に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を再びカップリングさせた。

１．５ 未反応アミノ基のキャップ付加
要点１．２の記載を参照。

１．６ 最終のＦｍｏｃの切断
最終のＦｍｏｃの切断を要点１．３に記載したように実行した。ジイソプロピルエーテルを用いて樹脂を最後に再び洗浄し、減圧下で乾燥させた。

１．７ 樹脂からのリキシセナチドの切断および側鎖保護基の同時の除去
実施例６に記載したようにＲｉｎｋ樹脂からのリキシセナチドの切断を実行した。

１．８ ジペプチドの本発明の使用を用いたリキシセナチドの合成
ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔ水和物を用いて樹脂への第１のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングを実行した。Ｒｉｎｋアミド樹脂の遊離アミンへの第１のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリング後、以下の処理工程を際限なしの繰り返しのサイクルで実行した（工程１．３〜１．６も参照）：
・Ｆｍｏｃの切断
・カップリング
・必要な場合、さらなるカップリング
・キャップ付加
・最終のアミノ酸単位のカップリング後、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を切断する。

ＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いて標準的なＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をカップリングし、過剰量のアミノ酸およびカップリング試薬は２〜４当量であった。

位置Ｐｒｏ（３６）およびＰｒｏ（３７）において、２つのＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨアミノ酸誘導体の代わりにＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いてジペプチドＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨをカップリングした。

位置Ｐｒｏ（３１）において、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔ水和物を用いてカップリングを実行した。

位置Ｈｉｓ（１）およびＧｌｙ（２）において、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりにジペプチドＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨをカップリングした。

カップリング後に、実施例４および５に記載されるように、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡを用いて各場合においてキャップ付加を実行した。

ＤＭＦ中の２５％のピペリジンを用いてＦｍｏｃの切断を行い、各場合において連続的に最初に５分の反応時間、次に２０〜４０分の反応時間とした。

カップリングの完了はカイザー試験により確認した。

最後のカップリングおよびＦｍｏｃ基の最後の切断後、最初にＤＭＦを用いて繰り返しで、次にイソプロパノールを用いておよび最後にジイソプロピルエーテルを用いて樹脂を洗浄し、その後に減圧下３５℃で乾燥させた。

１，２−エタンジチオールなどのスカベンジャーを用いて樹脂からの生ペプチドの切断をトリフルオロ酢酸中で実行した。

固相としてＣ１８ ＲＰシリカゲルを用いて２工程ＨＰＬＣ処理において生ペプチドを精製した。第１の精製工程において、０．１％のＴＦＡと共にアセトニトリル／水を含む緩衝系を使用し；第２の工程において、ＡｃＯＨと共にアセトニトリル／水を含む緩衝系を使用した。プールした溶液の濃縮後、純粋なペプチドをフリーズドライにより得た。

０．３ｍｍｏｌ／ｇのローディングを伴うＲｉｎｋアミド樹脂３５００ｇ（すなわち、１．０５ｍｏｌバッチ）の使用は樹脂上のペプチド９９７０ｇを与えた。生ペプチド４６３６ｇをそこから得た。

精製後、純粋なペプチド５７６ｇをそこから得た。ＭＳ：４８５５．５（モノアイソトピックモル質量）；測定値４８５５．６。アミノ酸シークエンシング：正しい配列が見出された。アッセイ：８９．０％（そのまま）。

１．９ ジペプチドを使用しないリキシセナチドの合成
Ｃ末端、Ｌｙｓ−４４から開始して、直鎖固相合成によりペプチド鎖を構築した。

ＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いて標準的なＦｍｏｃ保護されたアミノ酸をカップリングし、過剰量のアミノ酸およびカップリング試薬は２〜４当量であった。

位置Ｐｒｏ（３７）、Ｐｒｏ（３６）、Ｐｒｏ（３１）において、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＨＯＢｔ水和物を用いてカップリングを実行した。

各カップリングに続いてＡｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡを用いてキャップ付加を行った。ＤＭＦ中の２５％のピペリジンを用いてＦｍｏｃの切断を行い、各場合において連続的に最初に５分の反応時間、次に２０分の反応時間とした。

カップリングの完了はカイザー試験により確認した。最後のカップリングおよびＦｍｏｃ基の最後の切断後、最初にＤＭＦを用いて繰り返しで、次にイソプロパノールを用いておよび最後にジイソプロピルエーテルを用いて樹脂を洗浄し、その後に減圧下３５℃で乾燥させた。

１，２−エタンジチオール、チオアニソール、フェノールおよび水などのスカベンジャーを用いて樹脂からの生ペプチドの切断をトリフルオロ酢酸中で実行した。

固相としてＣ１８ ＲＰシリカゲルを用いて２工程ＨＰＬＣ処理において生ペプチドを精製した。プールした溶液の濃縮後、純粋なペプチドをフリーズドライにより得た。表１は、ジペプチドを使用した合成とジペプチドなしの合成との間のラセミ化Ｄ−Ｈｉｓ−リキシセナチドの含有量および純粋なペプチド中の何らかの不純物の含有量を比較する。

データは、ジペプチドＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＧＩｙ−ＯＨの使用は、ラセミ化から生じるＤ−Ｈｉｓの上昇した値を含有しないリキシセナチドを与えることを示す。さらに、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＧＩｙ−ＯＨを使用した場合、ｄｅｓＧｌｙ（２）−リキシセナチドはもはや見出されない。さらには、鎖位置Ｐｒｏ（３６）およびＰｒｏ（３７）の付近のＮ−１およびＮ＋１ペプチド（例えば、ｄｅｓＰｒｏ（３６）−リキシセナチドまたはｄｉＰｒｏ（３６）リキシセナチド）は出現しなかった。

（本発明による）エキセンジン−４の合成、精製および特徴付け
活性物質エキセンジン−４は３９アミノ酸から構成されるポリペプチドアミドであり、酢酸塩は対イオンとして機能する。

１文字表記において、アミノ酸配列は以下の通りである：
Ｈ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｑ−Ｍ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｖ−Ｒ−Ｌ−Ｆ−Ｉ−Ｅ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−ＮＨ_２
ＭＷ ４１８６．６６ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（モノアイソトピック）＝４１８４．０３ｇ／ｍｏｌ。

上記の配列にしたがって、リキシセナチドの合成において詳細に記載したようにエキセンジン−４の合成を実行した。位置１および２において、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨを用いて１サイクルでカップリングを実行した。位置３７および３８において、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＯＨを用いて１サイクルでカップリングを実行した。他の位置において、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（モノアミノ酸単位）を用いてカップリングを実行した。

０．４２ｍｍｏｌ／ｇのローディングを伴うＲｉｎｋアミド樹脂２６．６６６ｇ（すなわち、１１．２ｍｍｏｌバッチ）の使用は樹脂上のペプチド７４ｇを与えた。これから、樹脂上のペプチド６５ｇを切断し、生ペプチド２８ｇを得た。精製のために、これから、生ペプチド２１．３ｇを使用し、純粋なペプチド４．０１ｇを得た。ＭＳ：４１８４．０３（モノアイソトピックモル質量）：測定値４１８５．１［Ｍ＋Ｈ］。純度９８．２５ ＦＩ％。

ジペプチドの使用は、リキシセナチドについて得られた結果を裏付けた。ジペプチドＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＧＩｙ−ＯＨの使用は、ラセミ化から生じるＤ−Ｈｉｓの上昇した値を含有しないエキセンジン−４を与える。さらに、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＧＩｙ−ＯＨを使用した場合、ｄｅｓＧｌｙ（２）−エキセンジン−４はもはや見出されない。さらには、鎖位置Ｐｒｏ（３６）およびＰｒｏ（３７）の付近のＮ−１およびＮ＋１ペプチド（例えば、ｄｅｓＰｒｏ（３６）−エキセンジン−４またはｄｉＰｒｏ（３６）エキセンジン−４）は出現しなかった。

Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨの合成
３．１ Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ

酢酸エチル４００ｍｌ中のＨ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌトシレート３２．７ｇおよびＨＢＴＵ ２９．３７ｇと共にＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ ４０ｇを溶解した。その後、Ｎ−エチルモルホリン３３．３２ｍｌを加えた。反応混合物を３０℃で４時間撹拌した。その後、各回に８％の重炭酸ナトリウム溶液２５６ｇを用いて抽出を３回実行し、次に水２５０ｍｌを用いて洗浄を１回実行した。結果として得られた酢酸エチル溶液の半分を蒸発させ、次の工程においてさらに処理した。

３．２ Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨ

５：２：２（ｗ／ｗ／ｗ）のＴＨＦ／酢酸エチル／ＭｅＯＨ混合物が形成されるようにＴＨＦおよびメタノールを酢酸エチル相に加えた。その後に、炭素触媒（５％）上のパラジウム１０ｇを加え、この混合物を３０℃および１．１ｂａｒの水素圧力において２．５時間水素化した。その後、触媒を濾過し、結果として得られた溶液を沈殿物の形成が始まるまで蒸発させた。その後の撹拌を１時間実行し、溶液を室温で４日間静置した。生成物を濾過した後、２−ブタノン中８０℃で４時間撹拌することにより抽出した。収率：Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−ＯＨ ３２．９ｇ（７５％）。

リキシセナチドの合成の間のアセチル化された誤った配列
４．１ リキシセナチドの合成の間のアセチル化された誤った配列の含有量の決定
ある程度のアセチル化された誤った配列を粗リキシセナチド生成物のＨＰＬＣプロファイル中に見ることができる。これらは、通常、キャップ付加されている樹脂上の未反応アミノ基から生じる。キャップ付加により達成されるのは、（Ｎ−１）不純物が出現し得ないということであり、（Ｎ−１）不純物は所望の生成物からわずかにのみ異なり、それゆえ精製による除去が困難である。

完了および選択された位置におけるカップリング速度論をエドマン分解によりモニターした。樹脂試料をリキシセナチドの合成から取り、Ｆｍｏｃ基をそれから切断した。この樹脂試料を次にエドマン分解に供し、このようにして（Ｎ−１）アミノ酸に対するカップリングされたアミノ酸の比を決定することができ、それからカップリング収率を直接的に推定することができた。エドマン分解の結果（表２）は高いカップリング値を示す。これらの値は非常に高いため、アセチル化された誤った配列の量を説明し得ない（表２中のＨＰＬＣデータ）。これは、これらの副生成物を形成する代替的な様式があるに違いないことを意味する。この状況の解明は以下のセクションに記載される。

４．２ アセチル化された誤った配列の形成
アセチル化された誤った配列が形成される合成サイクル中の時点を調べるために、樹脂試料をカップリングサイクルにわたり採取し、ペプチドを切断し、ＬＣ−ＭＳを使用して調べた。これらの調査は、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（２０）−ＯＨのカップリングおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（１３）−ＯＨのカップリングの位置において実行した。

リキシセナチド部分配列Ｈ（２２〜２４）の固相結合ペプチドへのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（２０）−ＯＨのカップリングにおいて、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間のカップリング時点の後、ならびにキャップ付加、その後のＦｍｏｃの切断およびバリン（１９）のカップリングの後にも試料を採取した。図３に見ることができるように、誤った配列Ａｃ（２２〜４４）＋Ａｒｇはキャップ付加工程の間に初めて出現した（３．１％）。したがって、キャップ付加の間に、小部分のＦｍｏｃ基は切断（損失）され、直ちにアシル化される。呼称Ａｃ（２２〜２４）＋Ａｒｇを説明するために、位置２１（Ｌｅｕ）は合成から省略したことを留意すべきである。

リキシセナチド合成の間のＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（１３）−ＯＨのカップリングについて同じ実験を実行した（図４）。この場合、誤った配列Ａｃ（１３〜４４）は、グルタミン（１３）のカップリングおよびキャップ付加の後のＦｍｏｃの切断の間に初めて観察された（４．６％）。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（１２）−ＯＨのカップリング後の合成の残りの経過中に、キャップ付加の間にＡｃ（１２〜４４）もまた形成された（４．１％）ことを見ることができる（図５を参照）。

実験は、使用される混合物のキャップ付加能力が、潜在的な（Ｎ−１）不純物がもはやキャップ付加されないような顕著な程度まで低減されることなく、Ｎ個目のアミノ酸（カップリングされる最後のもの）のアセチル化された誤った配列の望ましくない形成が防止されるキャップ付加条件をサーチすることが必要であることを示す。

４．３ キャップ付加条件におけるバリエーション
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（２０）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１０）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（４）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（５）−ＯＨのカップリングを調べた。様々なキャップ付加条件を互いに比較した。

キャップ付加条件をリキシセナチドの実験室合成において変化させた。望ましくないＡｃ（Ｎ〜４４）および所望のＡｃ（［Ｎ−１］〜４４）の含有量に特に注目した。試験した条件は以下の通りである：
・２０分間のＤＭＦ中の１０％の無水酢酸／５％のＤＩＰＥＡ
・１０分間のＤＭＦ中の１０％の無水酢酸／５％のＤＩＰＥＡ
・２０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ
・１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ。

調査は、位置Ａｒｇ（２０）、Ｌｅｕ（１０）、Ｔｈｒ（５）およびＧｌｙ（４）において実行した。結果を表３〜６にまとめている。

データをまた、リキシセナチドのＧＭＰ合成の結果（表３〜６における「ＧＭＰキャップ付加」）と比較した。キャップ付加条件は、ＤＭＦ中の１０％の無水酢酸／５％のＤＩＰＥＡの条件に対応した。ＧＭＰバッチにおけるキャップ付加混合物との樹脂の接触時間はさらに７〜８分長く、したがって２７〜２８分であった。これは、キャップ付加混合物を排出するためにより長い時間を要したことから生じた。

４．３．１ 位置Ａｒｇ（２０）におけるカップリング
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨをＬｅｕ（２１）にカップリングした。カップリングが起こらなかった鎖（生成物Ｈ（２１〜４４））において、生成物Ａｃ（２１〜４４）をその後のキャップ付加により形成した。生成物Ａｃ（２０〜４４）およびＨ（２０〜４４）の両方は、キャップ付加の間にＦｍｏｃ基が望ましくなく切断される場合（Ｈ（２０〜４４）の形成）およびアセチル化が起こる場合（Ａｃ（２０〜４４）の形成）に形成される。

望ましくない生成物Ｈ（２０〜４４）およびＡｃ（２０〜４４）の形成の程度はキャップ付加時間ならびに無水酢酸およびＤＩＰＥＡの量の両方に依存することを表３において明確に見ることができる（Ａｃ（２０〜４４）％の列を参照）。最も高いパーセンテージ値はＧＭＰキャップ付加において見ることができる。Ａｃ（２０〜４４）の最も低い含有量は、「１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ」の条件下で見出される。

様々なキャップ付加混合物（およびそれゆえ元々の意図した使用）のキャップ付加能力はおおよそ同じであり（列Ａｃ（２１〜４４）を参照）、すなわち、全てのキャップ付加混合物はＨ（２１〜４４）を変換する。「１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ」の混合物はまた、（Ｎ−１）不純物を回避するという所望の目的を達成する。

４．３．２ 位置Ｌｅｕ（１０）、Ｇｌｙ（４）およびＴｈｒ（５）におけるカップリング
Ｌｅｕ（１０）についての結果を表４に与え、これは、位置Ａｒｇ（２０）について得られた結果を裏付ける。生成物Ｈ（１１〜４４）の遊離アミノ基のキャップ付加の間に形成される望ましくない生成物Ａｃ（１０〜４４）およびＨ（１０〜４４）の含有量は、「１０分間の２％の無水酢酸、１％のＤＩＰＥＡ」の条件下で最も低い。キャップ付加能力は異なるキャップ付加混合物において同等である。

Ｇｌｙ（４）のカップリングについても、望ましくない生成物Ａｃ（４〜４４）の含有量はキャップ付加混合物および反応時間に依存している。キャップ付加能力は異なる混合物において同じである（表５）。

位置Ａｒｇ（２０）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）に加えて、位置Ｔｈｒ（５）もまた調べた。３つの以前の位置とは対照的に、望ましくない生成物Ａｃ（Ｎ〜４４）（位置５におけるＡｃ（５〜４４））の含有量は様々なキャップ付加条件下でおおよそ同じである。しかしながら、異なる混合物のキャップ付加能力もまたここでは同等である（表６）。

４．３．３ 要約
位置Ａｒｇ（２０）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）において、穏やかなキャップ付加混合物（１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ）は、アシル化による（Ｎ−１）不純物を回避するという所望の効果を維持するために充分である。しかしながら、これらの３つの場合において、Ａｃ（２０〜４４）、Ａｃ（１０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）の各々の形成は、キャップ付加時間、そしてまたキャップ付加混合物に依存している。これは位置Ｔｈｒ（５）には当てはまらない。

リキシセナチドの合成
本実施例は、リキシセナチド（配列番号１を参照）の合成に関する。合成の開始時に、固相結合リンカーはＦｍｏｃ保護基を有する。カップリングサイクルにおいてＣ末端（位置４４）から開始してＮ末端へと個々のアミノ酸単位をカップリングさせた。カップリングサイクルは、
・Ｆｍｏｃの切断
・Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸単位のカップリングおよび
・キャップ付加
の工程からなる。

位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）において、本発明によるキャップ付加方法（１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ）を使用した。これらの位置について、カップリングサイクルについての指示は以下に記載される。他の位置において、２０分間のＤＭＦ中の１０％の無水酢酸／５％のＤＩＰＥＡを用いてキャップ付加を実行した。このキャップ付加は、例として、位置Ｔｈｒ（５）において記載される。本発明によるキャップ付加方法は、より穏やかな条件を含む。

バッチサイズはＲｉｎｋ樹脂１０５０ｍｍｏｌであった。

５．１ 位置２０におけるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨのカップリング
５．１．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３０分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．１．２ Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、ＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ ２．１２５ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）５０２ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４１３ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．１．３ キャップ付加（本発明による）
反応器をＤＭＦ ２６．３ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １．２ｌ、無水酢酸０．５３ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．２６ｌを２ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトル中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を１０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．２．位置１７におけるＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ水和物のカップリング
５．２．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３０分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．２．２ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ水和物のカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ水和物１．４５３ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）５０２ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４１３ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．２．３ キャップ付加（本発明による）
反応器をＤＭＦ ２６．３ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １．２ｌ、無水酢酸０．５３ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．２６ｌを２ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトル中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を１０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．３ 位置１３におけるＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
５．３．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３５分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．３．２ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、ＦｍｏｃＧｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ ２．００１ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）５０２ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４１３ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．３．３ キャップ付加（本発明による）
反応器をＤＭＦ ２６．３ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １．２ｌ、無水酢酸０．５３ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．２６ｌを２ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトル中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を１０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．４ 位置１０におけるＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨのカップリング
５．４．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３５分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．４．２ Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ １．１５８ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）５０２ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４１３ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．４．３ キャップ付加（本発明による）
反応器をＤＭＦ ２６．３ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １．２ｌ、無水酢酸０．５３ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．２６ｌを２ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトル中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を１０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．５ 位置４におけるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨのカップリング
５．５．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３５分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．５．２ Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ １．２１７ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）６２７ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）５１７ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．５．３ キャップ付加（本発明による）
反応器をＤＭＦ ２６．３ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １．２ｌ、無水酢酸０．５３ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．２６ｌを２ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトル中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を１０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．６ 位置５におけるＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨのカップリング
５．６．１ Ｆｍｏｃの切断
ＤＭＦ ７ｌ、続いてＤＭＦ １６．６ｌ中のピペリジン７．９ｌの混合物を反応器に加えた。この混合物を５分間撹拌し、次に吸引を用いて濾過した。この処理を繰り返し、撹拌を３５分間実行し；次に吸引を用いる濾過を再び実行した。Ｆｍｏｃの切断後、以下の順序で樹脂を７回洗浄した：ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（３１．１ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．６．２ Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ ２１ｌを反応器に加えた。その後、ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ １．６２８ｋｇを秤量して入れ、ＤＭＦ ５．３ｌを加えた。完全な溶解後、この溶液を全て、続いてＤＭＦ ２．２ｌ中のヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）６２７ｇの溶液を反応器に注いだ。最後に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）５１７ｇを反応器に加えた。カップリング時間は６〜１８時間であった。カップリング後、溶媒を吸引により樹脂から濾過し、キャップ付加を直ちに続けた。

５．６．３ キャップ付加
反応器をＤＭＦ １０．５ｌで満たした。同時に、ＤＭＦ １５．８ｌ、無水酢酸３．２ｌおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１．６ｌを混合容器中で混合し、反応器中の樹脂に加えた。反応器を２０分間撹拌し、次に吸引を用いる濾過を実行した。キャップ付加後、以下の順序で樹脂を５回洗浄した：ＤＭＦ（２４ｌ）、イソプロパノール（３１．１ｌ）、ＤＭＦ（８ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）、ＤＭＦ（３１．５ｌ）。ここで反応器を各回に各々の洗浄溶媒で満たし、次に撹拌を３分間実行し、吸引を用いる濾過を再び実行した。

５．７ 結果
位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）における発明によるキャップ付加方法、ならびに５．６．３に記載されるような他のカップリングにおけるキャップ付加を用いたリキシセナチド合成の粗生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。不純物アセチル（２０〜４４）、アセチル（１７〜４４）、アセチル（１３〜４４）、アセチル（１０〜４４）およびアセチル（４〜４４）／アセチル（６〜４４）を有するピークを指し示す。

５．８ 比較
５．６．３に記載されるような全てのカップリングのキャップ付加工程を実行したところ、望ましくない誤った配列Ａｃ（２０〜４４）、Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）、Ａｃ（１０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）／Ａｃ（６〜４４）の形成の増加に繋がった。この試験からの粗リキシセナチドのＨＰＬＣクロマトグラムを図６Ａに示す。

図６Ｂは、位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）およびＧｌｙ（４）において本発明によるキャップ付加方法を用いて合成された粗リキシセナチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

図６Ｃは、図６ＡおよびＢからのＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。バッチ操作での本発明によるキャップ付加方法を使用したリキシセナチドの合成は、誤った配列Ａｃ（２０〜４４）、Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）、Ａｃ（１０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）／Ａｃ（６〜４４）の明白な低減に繋がったことが明らかである。

より穏やかなキャップ付加混合物（１０分間のＤＭＦ中の２％の無水酢酸／１％のＤＩＰＥＡ）を使用することにより、リキシセナチドの粗生成物中のＡｃ（２０〜４４）、Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）、Ａｃ（１０〜４４）およびＡｃ（４〜４４）というアセチル化された誤った配列のレベルを低減することまたはそれらを粗生成物から除去することが可能であった。本発明によるキャップ付加により製造されたリキシセナチド粗生成物は、特にかなり低減された量で、アセチル化された副生成物Ａｃ（１７〜４４）、Ａｃ（１３〜４４）およびＡｃ（１０〜４４）を含むので、リキシセナチドの精製が単純化された。結果として、リキシセナチドの第１の分取クロマトグラフィーの実行後の画分のプールは、仕様基準を満たすより多くの画分を与え、そのため廃棄される必要はなかった。これは、収率の向上に繋がった。

リキシセナチドの合成における９つの特定の位置におけるキャップ付加
実施例５において議論したように、位置Ａｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）でのリキシセナチドの合成における「穏やか」なキャップ付加条件の使用は、望ましくない副生成物のプロファイルを向上させることができた。

この実施例は、アセチル化されたおよびアセチル化されていない副生成物の形成に対するキャップ付加条件の影響を記載する。温度（１５℃、室温［２０℃〜２３℃］、３０℃）、キャップ付加期間およびキャップ付加組成物の成分のバリエーションを行った：
・キャップ付加なし
・穏やかなキャップ付加条件：２％の無水酢酸および１％のＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を用いる１０分のキャップ付加
・「通常」のキャップ付加条件：１０％の無水酢酸および５％のＤＩＰＥＡを用いる２０分のキャップ付加
・１０％の無水酢酸および５％のＤＩＰＥＡを用いる４０分のキャップ付加

本発明のキャップ付加条件は、「穏やかな条件」である。これらの条件を実施例５において使用した。これらの条件は有利であることが見出された。

この実施例において選択された９つの位置において、アセチル化された配列が（Ｎ−１）位置のキャップ付加において得られた（図７）。追加的に、アミノ酸ビルディングブロックにおけるＦｍｏｃ基の望ましくない除去がキャップ付加工程の間に起こることがある。保護されていないアミノ基は、キャップ付加試薬またはキャップ付加組成物によりアセチル化されることがある。これに関して、向上したキャップ付加条件はＦｍｏｃ基の望ましくない切断を回避し得る。

６．１ ジペプチドビルディングブロックＰｒｏ−Ｐｒｏのカップリング後（３６〜４４）の位置３６／３５におけるキャップ付加
ペプチドＦｍｏｃ−（３６〜４４）−ＡＶＥ００１０を固相合成により製造した。樹脂を４つの部分に分割して乾燥させた。室温（２０℃〜２３℃）で上記の４つのキャップ付加手順の１つを各部分に行った。試料を乾燥させ、ペプチドを樹脂から切断した。この手順を繰り返し、キャップ付加を１５℃または３０℃で行った。

計１２のペプチド試料を得た。ＬＣＭＳを用いて１２のペプチド試料を分析した。分子量をＴＩＣ（総イオン電流）から決定した。以下の化合物の分子量を決定した：

結果を図８に記載する。化合物（３６〜４４）、（３８〜４４）およびＡｃ（３８〜４４）は見出されなかったか、または小量で見出された。望ましくない生成物Ａｃ（３６〜４４）の量は、ほとんどの場合、キャップ付加カクテルの強度およびキャップ付加期間と共に増加する。この生成物の量は温度と共に増加する。

６．２ ビルディングＩｌｅのカップリング後（２３〜４４）の位置２３におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（２３〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図９に記載する。ＲＴおよび３０℃でのキャップ付加試薬に依存して、望ましくない化合物Ａｃ（２３〜４４）の含有量は増加する。２０℃での「通常」のキャップ付加は０．２６％のＡｃ（２３〜４４）を結果としてもたらす。キャップ付加の延長（２０分の代わりに４０分）はＡｃ（２３〜４４）含有量に負の影響力を有する。

所望の生成物Ａｃ（２４〜４４）の形成はキャップ付加組成物から独立している。

６．３ ビルディングブロックＬｅｕのカップリング後（２１〜４４）の位置２１におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（２１〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図１０に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（２１〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（２１〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（２２〜４４）の形成はキャップ付加組成物から独立している。キャップ付加なしでさえ、この化合物が形成される。

６．４ ビルディングブロックＶａｌのカップリング後（１９〜４４）の位置１９におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（１９〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図１１に記載する。化合物Ａｃ（１９〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（１９〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（２０〜４４）の形成はキャップ付加組成物の強度と共に増加する。望ましくない化合物（２０〜４４）の含有量はキャップ付加組成物の強度の増加と共に減少する。

６．５ ビルディングブロックＡｌａのカップリング後（１８〜４４）の位置１８におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（１８〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図１２に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（１８〜４４）の含有量は、１５℃および３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（１８〜４４）の含有量は１５℃から３０℃への温度の増加と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（１９〜４４）の形成はキャップ付加組成物の強度と共に１５℃および３０℃において増加する。

６．６ ビルディングブロックＧｌｕのカップリング後（１５〜４４）の位置１５におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（１５〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図１３に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（１５〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（１５〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（１６〜４４）の形成はキャップ付加組成物から独立している。キャップ付加なしでさえ、この化合物が形成される。

６．７ ビルディングブロックＬｙｓのカップリング後（１２〜４４）の位置１２におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（１２〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃／３０℃および室温での実験を異なるバッチで行った。

結果を図１４に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（１２〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（１２〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（１３〜４４）の形成はキャップ付加組成物から独立している。キャップ付加なしでさえ、この化合物が形成される。

６．８ ビルディングブロックＳｅｒのカップリング後（８〜４４）の位置８におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（８〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃、ＲＴおよび３０℃での実験を同じバッチで行った。

結果を図１５に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（８〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（８〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

６．９ ビルディングブロックＰｈｅのカップリング後（６〜４４）の位置６におけるキャップ付加
Ｆｍｏｃ（６〜４４）の合成をセクション６．１に記載したように行った。１５℃、ＲＴおよび３０℃での実験を同じバッチで行った。

結果を図１６に記載する。望ましくない化合物Ａｃ（６〜４４）の含有量は、１５℃、ＲＴおよび３０℃において「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」で最大である。化合物Ａｃ（６〜４４）の含有量は温度と共に増加する。

所望の化合物Ａｃ（７〜４４）の形成はキャップ付加組成物から独立している。キャップ付加なしでさえ、この化合物が形成される。

温度は、所望の化合物Ａｃ（７〜４４）の形成に対してわずかな影響のみを有する。望ましくない化合物Ａｃ（７〜４４）の含有量はキャップ付加組成物の強度の増加と共に減少する。

６．１０ 要約
Ａｃ（Ｘ〜４４）化合物の望ましくない形成は、キャップ付加期間、キャップ付加組成物およびキャップ付加温度に強く依存する。キャップ付加期間の増加、キャップ付加温度の増加、ならびにキャップ付加組成物中の無水酢酸およびＤＩＰＥＡの含有量の増加と共に、望ましくないＡｃ（Ｘ〜４４）化合物の含有量は増加する。

６．１１ 温度に依存する、「通常」の条件下でのキャップ付加
図１７および１８は、この実施例に記載されるような、「通常」の条件「２０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」の下でのリキシセナチドの合成における９つの位置での異なる温度でのキャップ付加において得られたデータを要約する。

図１７は、反応温度に依存した、Ａｃ（Ｘ〜４４）のＧＭＰキャップ付加の比較を示す。１５℃および３０℃について与えた値は、「室温」値（灰色区画）からの正および負の偏差である。

望ましくない生成物Ａｃ（Ｘ〜４４）の形成は、９つの位置のうちの５つにおいて≦０．５％、３つの位置において０．５％〜１％、１つの位置のみにおいて＞１％である。大きい増加が３０℃において観察され、１５℃においてＡｃ（Ｘ〜４４）の形成はわずかに減少する。

これは、１５℃〜室温（２０〜２３℃であり得る）で異なる位置においてＧＭＰキャップ付加「２０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」を行うことができることを意味する。

図１８は、反応温度に依存した、Ａｃ［（Ｘ−１）〜４４］のＧＭＰキャップ付加の比較を示す。１５℃および３０℃について与えた値は、「室温」値（灰色区画）からの正および負の偏差である。

ＲＴでのＡｃ［（Ｘ−１）〜４４］化合物の所望の形成に関して、１５℃での偏差は＋０．２３〜−０．２５％である。３０℃での偏差は＋０．２９〜−０．３３％である。所望のキャップ付加生成物Ａｃ［（Ｘ−１）〜４４］の形成は、そのため、Ａｃ（Ｘ〜４４）の望ましくない形成よりも温度に依存しない。

１５℃および３０℃において、室温でのキャップ付加を考慮して所望の化合物Ａｃ［（Ｘ−１）〜４４］の含有量の負の偏差が観察される。これは、「通常」の条件を用いるキャップ付加は室温で行うべきであることを意味する。

６．１２ 室温での異なるキャップ付加組成物を用いたキャップ付加
図１９および２０は、この実施例に記載されるような、リキシセナチドの合成における９つの位置での室温での異なるキャップ付加組成物を用いたキャップ付加において得られたデータを要約する。

図１９は、室温でのキャップ付加組成物に依存したＡｃ（Ｘ〜４４）含有量の比較を示す。「キャップ付加なし」、「穏やか」および「４０分」の条件について与えた値は、「通常のキャップ付加」の値（灰色区画）からの正および負の偏差である。

「２０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」および「４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ」の下での望ましくない生成物Ａｃ（Ｘ〜４４）の形成は最大である。「通常」の条件（４０分、１０％のＡｃ２Ｏ、５％のＤＩＰＥＡ）下のＡｃ（Ｘ〜４４）の形成は０．２％〜１．１２％である。強い減少が穏やかなキャップ付加条件において観察される。

図２０は、室温でのキャップ付加組成物に依存したＡｃ［（Ｘ−１）〜４４］含有量の比較を示す。「キャップ付加なし」、「穏やか」および「４０分」について与えた値は、「通常のキャップ付加」の値（灰色区画）からの正および負の偏差である。

「キャップ付加なし」、「穏やか」および「４０分」の条件における所望の生成物Ａｃ［（Ｘ−１）〜４４］の形成は、「通常」の条件を考慮して−０．１４％〜＋０．１６％である。

特に、本発明の「穏やか」な条件（１０分、２％のＡｃ２Ｏ、１％のＤＩＰＥＡ）下で、リキシセナチドの合成において充分なキャップ付加を達成することができる。

要約すると、穏やかなキャップ付加条件、特に、溶媒中の２％のＡｃ２Ｏおよび１％のＤＩＰＥＡを用いた１０分間のキャップ付加は、本明細書に記載されるように、リキシセナチドの固相合成において有利である。

ある特定のアミノ酸位置においてカップリング後のキャップ付加を省略した場合、小量で存在する不完全なアミノ酸配列を含む望ましくない副生成物は、精製処理の間に除去することが困難であり得る。

固相からのリキシセナチドの切断
この実施例は、固相からのリキシセナチドの本発明による切断に関する。ペプチドリキシセナチドが結合した固相（Ｒｉｎｋ樹脂）を用意した。アミノ酸単位の段階的なカップリングにより樹脂上でペプチドを合成した。

比較用試験として、先行技術（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １９９０年、３６：２５５〜２６６頁）による切断を実行した。

本発明による切断方法は、以下の変更により先行技術の方法から区別される：
・２０℃〜２６℃の反応温度
・使用される切断混合物に対する樹脂の比の増加と組み合わせた、５つの成分から２つの成分への切断混合物中の成分の数の低減。

本発明による切断を使用することにより、先行技術による切断と比較して、粗リキシセナチドの収率をおおよそ５％増加させることが可能であり（２０％から２５％へ）、不純物プロファイルはわずかにのみ変化した。

この実施例の方法は、パイロットプラントおよび製造スケールへのスケールアップのために好適である。

表１８は、比較用の方法（表１７を参照）において得られた結果を要約する。リキシセナチド−樹脂（１〜４４）の３つの異なるバッチ２Ｅ００２、２Ｂ００８および２Ｂ００６を使用した。平均および標準偏差を各バッチについて別々に算出した。異なる切断条件間の比較は、リキシセナチド−樹脂（１〜４４）の同じバッチを使用した試験において為されるべきである。異なるバッチにおいて、固相合成が収率に影響力を有する可能性がある。指し示されなければ、リキシセナチド−樹脂（１〜４４）１０ｇを出発材料として使用した。

７．１ ２０℃〜３５℃の切断温度に依存した切断収率
リキシセナチド−樹脂（１〜４４）からの切断を標準条件（比較用の方法、表１７を参照）下で４時間行った。

結果：標準条件下での切断後のリキシセナチドの収率は、約２６℃の最適条件までの温度の増加と共に増加する。驚くべきことに、２３℃から２６℃への温度の増加は収率の有意な増加を結果としてもたらす。

７．２ 切断期間に依存した切断収率
リキシセナチド−樹脂（１〜４４）からの切断を２０℃での標準条件（比較用の方法、表１７を参照）下で行った。

結果：リキシセナチドの収率は切断期間の増加と共に増加する。最大収率は約８時間の切断後に到達される。

７．３ １２時間の切断期間での温度に依存した切断収率
リキシセナチド−樹脂（１〜４４）からの切断を標準条件（比較用の方法、表１７を参照）下で４時間行った。

結果：反応温度を増加させた場合に収率は１２時間の切断期間において増加する。実施例７．１において４時間の切断について記載されるように、最大収率は２６℃において得られる。試験７０５８６−０４４（４時間、２６℃、実施例７）および７０５８６−０４５（１２時間、２６℃）は類似した収率を結果としてもたらす（１４．８％対１４．０％）。

７．４ ２０℃までの切断温度に依存した切断収率
リキシセナチド−樹脂（１〜４４）からの切断を標準条件（比較用の方法、表１７を参照）下で４時間行った。

結果：２０℃より低い温度での切断は、予期されたように、２０℃での４時間の切断（標準条件、比較用の方法、表１７）により得られた収率に達するためにより長い切断期間を必要とする。

７．５ 改変された切断カクテル
標準的な方法は、５つの成分：フェノール、チオアニソール、１，２−エタンジチオール、水およびＴＦＡを含有する切断カクテルを使用する。実施例の対象は、チオアニソール、フェノールおよび水の１〜３つを省略した簡略された切断カクテルである。リキシセナチド−樹脂（１〜４４）からのリキシセナチド切断の収率を決定した。「改変なし」のカクテルは、表１７「比較用の方法」において記載される。

結果：１つまたはそれ以上の成分の省略は、試験７１００２−０１０（チオアニソールの省略）を除いて、収率の増加を結果としてもたらす。

簡略化された切断混合物（切断カクテル）はいくつかの利点を有する：
（ａ）分析および品質管理の簡略化、
（ｂ）コストの低減、
（ｃ）製造方法の取扱いの促進。

７．６ 切断カクテル中のＴＦＡおよび１，２−エタンジチオールの含有量
試験７１００２−０４２から開始して、切断収率に対するＴＦＡ：１，２−エタンジチオール比の影響を調べた：

結果：１，２−エタンジチオール含有量の増加は、リキシセナチド収率の有意な減少を結果としてもたらす。８．２５：０．２５のＴＦＡ：１，２−エタンジチオール比は、最大収率を有する比であることが見出された（バッチ２Ｅ００２）。この発見は、バッチ２Ｂ００８を使用する実験により確認された。

７．７ 切断カクテルの体積
切断カクテルの体積（およびそのため濃縮）の影響を調べた。

結果：３０％までの低減は切断収率に影響を有しない。より大きい体積低減は収率の低減に繋がる。

７．８ 切断前の共溶媒（トルオールまたはＣＨ_２Ｃｌ_２）を用いた「樹脂上のペプチド」の膨潤
この実験の根拠は、樹脂からのリキシセナチドの切断は、５〜８℃までの温度の増加を結果としてもたらすことがあり、それが望ましくない副生成物の形成に繋がることがあり、安定性およびそのため切断収率に負の影響力を潜在的に有するという発見である。有機溶媒中の「樹脂上のペプチド」の膨潤は、発熱を低減する可能性があり、そのため収率を増加させる可能性がある。

結果：有機共溶媒を用いた膨潤は切断収率を増加させない。

７．９ 共溶媒の存在下での濃縮
ＴＦＡより高い沸点を有し、リキシセナチドが不溶性である共溶媒の存在は、樹脂からの切断後の収率を増加させる可能性があり、その理由は、濾液からのＴＦＡの蒸留の間に、共溶媒の存在がリキシセナチドの沈殿に繋がる可能性があり、したがって、Ｋｉｎｇのカクテル中での切断の間にリキシセナチドの分解を防止し得るからである。

結果：樹脂からのリキシセナチドの切断後の濾液の蒸留におけるトルオールの存在は収率のわずかな増加に繋がる。

７．１０ 本発明の最適化された切断手順
この実施例において得られた上記の結果に基づいて、以下のような最適化された切断条件を選択し、試験した：
（ａ）２６℃の反応温度、
（ｂ）ＴＦＡおよび１，２−エタンジチオールからなる切断カクテル。カクテルは、約９７％のＴＦＡおよび約３％の１，２−エタンジチオールを含有した。「樹脂上のペプチド」１ｇ当たり８．２５ｍｌの量のＴＦＡおよび「樹脂上のペプチド」１ｇ当たり０．２５ｍｌの量の１，２−エタンジチオールを使用した。

標準的な比較用カクテルと比較してこのカクテルの切断収率をバッチ２Ｅ００２および２Ｂ００８において試験した。

結果：両方のバッチにおいて、収率は約５％増加し、本発明の方法による固相からのペプチド切断の有意な向上を指し示した。

７．１１ 第２（その後）の切断
切断後、比較用カクテル（Ｋｉｎｇのカクテル）または本発明の切断カクテルを使用して、第２（その後）の切断を行った（表１７を参照）。

第１の切断を行い、濾液を得た。ＴＦＡをＴＦＡ湿潤樹脂に加えた。１時間の撹拌後、樹脂を濾過した。濾液を合わせ、濃縮した。

リキシセナチド収率に対する第２の、その後の切断の効果を調べた。

結果：その後の切断は、約０．７％のみの収率の増加を結果としてもたらす。この増加は、出発材料（ＴＦＡ）のためのコストの顕著な増加、およびペプチド製造物からＴＦＡを除去するための追加の努力と関連付けられる。第１および第２の切断工程の濾液の組合せにより、ＴＦＡの量は顕著に増加することを考慮しなければならない。

収率の小さい増加を考慮して、第２の切断の省略はコストの低減に繋がり、製造処理の間の取扱いが促進されることが結論される。ＴＦＡの量が低減され、それにより、ＴＦＡの除去が促進される。

７．１２ 分析
２つのバッチ、７１００１−０１６（比較用バッチ、標準的な方法によるＫｉｎｇのカクテルを用いた切断）、および７１００１−０１３（本発明によるリキシセナチドの切断）を製造した。

結果：バッチはほぼ同一の純度を示した。本発明にしたがって製造されたバッチの含有量はわずかに減少した。本発明のバッチにおいて、出力重量は増加し、収率の増加を結果としてもたらす。

７．１３ 要約
本発明の切断方法は以下の利点を有する：
（ａ）コストの低減および製造能力の増加を結果としてもたらす、リキシセナチド収率の約５％の増加、
（ｂ）２つの成分のみが切断カクテル中に存在するため（比較用のＫｉｎｇのカクテルにおける５つの成分を考慮して）、分析的品質管理が向上し、コストが低減される、
（ｃ）第２の切断の省略はコストの低減に繋がり、製造処理の間の取扱いが促進される。ＴＦＡの量が低減され、それにより、ＴＦＡの除去が促進される。

以下の態様もまた本発明の対象である：
１．予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成方法であって、該方法は、アミノ酸鎖へのアミノ酸ビルディングブロックのカップリングサイクルを含み、
前記アミノ酸ビルディングブロックは、保護されていないＣ末端カルボキシル基および保護されたＮ末端アミノ基を含み、
かつ、前記アミノ酸鎖は、保護されていないＮ末端アミノ基を含み、
少なくとも１つのカップリングサイクルは：
（ａ）アミノ酸鎖とアミノ酸ビルディングブロックとの間にアミド結合が形成されるように、アミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングする工程、
（ｂ）工程（ａ）において得られた生成物を、キャップ付加化合物を含むキャップ付加試薬と接触させ、キャップ付加化合物が、工程（ａ）においてビルディングブロックがカップリングされなかったアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基に結合する工程、および
（ｃ）アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基を脱保護する工程
を含む、前記方法。
２．キャップ付加化合物は、無水酢酸（ＣＡＳ １０８−２４−７）、無水酢酸のホモログ、塩化ベンゾイル（ＣＡＳ ９８−８８−４）、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１７−８）、クロロギ酸ベンジル（ＣＡＳ ５０１−５３−１）、クロロギ酸のエステル、１−アセチルイミダゾール（ＣＡＳ ２４６６−７６−４）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＣＡＳ ２４４２４−９９−５）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１２−３）からなる群から選択される、項目１の方法。
３．キャップ付加試薬は０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、項目１または２の方法。
４．キャップ付加試薬は１〜３％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、項目１〜３のいずれか１つの方法。
５．キャップ付加試薬は２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、項目１〜４のいずれか１つの方法。
６．キャップ付加試薬は０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む、項目１〜５のいずれか１つの方法。
７．キャップ付加試薬は０．５〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む、項目１〜６のいずれか１つの方法。
８．キャップ付加試薬は１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む、項目１〜７のいずれか１つの方法。
９．キャップ付加試薬は１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンおよび２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、項目１〜８のいずれか１つの方法。
１０．キャップ付加試薬はＤＭＦを含む、項目１〜９のいずれか１つの方法。
１１．工程（ｂ）は１５〜２５℃の温度で行われる、項目１〜１０のいずれか１つの方法。
１２．工程（ｂ）は５〜１５分間行われる、項目１〜１１のいずれか１つの方法。
１３．アミノ酸ビルディングブロックはα−アミノ酸を含む、項目１〜１２のいずれか１つの方法。
１４．アミノ酸ビルディングブロックは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、項目１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．アミノ酸ビルディングブロックは、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、項目１〜１４のいずれか１つの方法。
１６．アミノ酸ビルディングブロックの側鎖は、アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端保護基に対して直交性の保護基を含む、項目１〜１５のいずれか１つの方法。
１７．固相合成を含む、項目１〜１６のいずれか１つの方法。
１８．アミノ酸ビルディングブロックにおけるＮ末端アミノ基は塩基不安定性保護基により保護される、項目１〜１７のいずれか１つの方法。
１９．アミノ酸ビルディングブロックにおけるＮ末端アミノ基はＦｍｏｃにより保護される、項目１〜１８のいずれか１つの方法。
２０．ポリペプチドはＧＬＰ−１アゴニストである、項目１〜１９のいずれか１つの方法。
２１．ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、そのアナログおよび誘導体、エキセンジン−３、そのアナログおよび誘導体、ならびにエキセンジン−４、そのアナログおよび誘導体から選択される、項目１〜２０のいずれか１つの方法。
２２．ポリペプチドは、エキセンジン−４およびリキシセナチドから選択される項目１〜２１のいずれか１つの方法。
２３．ポリペプチドはリキシセナチドである、項目１〜２２のいずれか１つの方法。
２４．ポリペプチドは、アルビグルチド、デュラグルチドおよびセマグルチドから選択される、項目１〜２１のいずれか１つの方法。
２５．ポリペプチドはリキシセナチドまたはエキセンジン−４であり、アミノ酸ビルディングブロックＡｒｇ（２０）、Ｇｌｕ（１７）、Ｇｌｎ（１３）、Ｌｅｕ（１０）または／およびＧｌｙ（４）のカップリング後、工程（ｂ）は、２％ｖ／ｖの無水酢酸および１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むキャップ付加試薬を用いて約１０分間行われる、項目１の方法。
２６．組成物であって、ＤＭＦ中の０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸および０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むことを特徴とする、前記組成物。
２７．１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンおよび２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、項目２６の組成物。
２８．ポリペプチド合成における保護されていないアミノ基のアセチル化のための、項目２６または２７の組成物の使用。
２９．ポリペプチドはリキシセナチドである、項目２８の組成物の使用。

Claims (15)

1. 予め決定されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの合成方法であって、該方法は、アミノ酸鎖へのアミノ酸ビルディングブロックのカップリングサイクルを含み、
   前記アミノ酸ビルディングブロックは、保護されていないＣ末端カルボキシル基および保護されたＮ末端アミノ基を含み、
   かつ、前記アミノ酸鎖は、保護されていないＮ末端アミノ基を含み、
   少なくとも１つのカップリングサイクルは：
   （ａ）アミノ酸鎖とアミノ酸ビルディングブロックとの間にアミド結合が形成されるように、アミノ酸ビルディングブロックのＣ末端をアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基にカップリングする工程、
   （ｂ）工程（ａ）において得られた生成物を、キャップ付加化合物を含むキャップ付加試薬と接触させ、キャップ付加化合物が、工程（ａ）においてビルディングブロックがカップリングされなかったアミノ酸鎖の保護されていないＮ末端アミノ基に結合する工程、および
   （ｃ）アミノ酸ビルディングブロックのＮ末端アミノ基を脱保護する工程
   を含む、前記方法。
2. キャップ付加化合物は、無水酢酸（ＣＡＳ １０８−２４−７）、無水酢酸のホモログ、塩化ベンゾイル（ＣＡＳ ９８−８８−４）、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１７−８）、クロロギ酸ベンジル（ＣＡＳ ５０１−５３−１）、クロロギ酸のエステル、１−アセチルイミダゾール（ＣＡＳ ２４６６−７６−４）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＣＡＳ ２４４２４−９９−５）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＡＳ １３１３９−１２−３）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. キャップ付加試薬は、０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸、好ましくは１〜３％ｖ／ｖの無水酢酸、より好ましくは２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. キャップ付加試薬は、０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミン、好ましくは０．５〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミン、より好ましくは１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. キャップ付加試薬は、１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンおよび２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. キャップ付加試薬はＤＭＦを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（ｂ）は１５〜２５℃の温度で行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程（ｂ）は５〜１５分間行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. アミノ酸ビルディングブロックはα−アミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. アミノ酸ビルディングブロックは、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 固相合成を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、そのアナログおよび誘導体、エキセンジン−３、そのアナログおよび誘導体、ならびにエキセンジン−４、そのアナログおよび誘導体から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ポリペプチドは、エキセンジン−４、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドおよびセマグルチドから選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 組成物であって、ＤＭＦ中の０．５〜５％ｖ／ｖの無水酢酸および０．２〜２％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンを含むことを特徴とし、特に、１％ｖ／ｖのジイソプロピルエチルアミンおよび２％ｖ／ｖの無水酢酸を含む、前記組成物。
15. ポリペプチド合成における保護されていないアミノ基のアセチル化のための、請求項１４に記載の組成物の使用。

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