CN106432472A - 一种胰岛素的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种胰岛素的固相合成方法，包括以下步骤：以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用不同侧链保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到裸肽肽链；然后采用液相环化法分别形成胰岛素的第一对二硫键、第二对二硫键和第三对二硫键，得到胰岛素纯品多肽。本发明通过工艺优化，胰岛素纯品纯度到达90％，纯品收率达到10％以上，大大提高了胰岛素的得率；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，产品收率高，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种胰岛素的固相合成方法。
背景技术
中文名：胰岛素
英文名：Insulin
分子式：C257H383N65O77S6
分子量：5807.69
结构式：A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；B链:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
胰岛素(Insulin)是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性生物合成人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素)其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同，主要用来糖尿病治疗，具有有效控制血糖，保护胰岛β细胞功能，预防、延缓糖尿病并发症的发生，提高患者生活质量，都具有极其重要的意义。
胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共16种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。
目前市场上现有的胰岛素合成制备方法较少，且收率极低(不足5％)，不能满足市场需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纯度高，收率高，工艺简单的胰岛素固相合成方法，合成制备得到的胰岛素纯品纯度达到90％，纯品收率达到10％以上，适用于胰岛素的规模化生产。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种胰岛素的固相合成方法，该方法包括以下顺序的合成制备步骤：
(1)、采用Fmoc固相合成法，将溶胀、脱保护并洗涤后的树脂载体与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，其中，半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，依次接入肽链序列中相对应的保护氨基酸，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链如下；
A链片段一：LYQLENYC(Trt)N
A链片段二：GIVEQC(Mmt)C(Acm)TSIC(Mmt)S
B链裸肽：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；
(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；
(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品。
步骤(1)中所述的树脂载体，片段一采用Wang Resin，片段二和B链采用2-Cl(Trt)-Cl Resin，所述保护氨基酸的活化方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解；所述半胱氨酸的保护基，其中形成胰岛素第一对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(mmt)-OH，形成胰岛素第二对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(acm)-OH，形成胰岛素第三对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(trt)-OH。
步骤(2)中所述的液相环化法，首先以特有的切割试剂配方7％TFA+87％DCM+2.5％Tis+2.5％H2O+1％EDT，洗脱除去半胱氨酸的mmt保护基，然后采用过氧化氢环化法反应，形成胰岛素的第一对二硫键。
步骤(3)中所述的液相环化法，方法为将DTNP加入到纯化后的B链溶液中，于25℃条件下反应30min，然后将完成片段缩合并纯化后的A链加入到上述反应液中，搅拌反应30min，形成胰岛素的第二对二硫键。
步骤(4)中所述的液相环化法，方法为将胰岛素的形成第二对二硫键的胰岛素多肽纯化，取冻干后的样品溶解，加入到饱和的碘溶液中，避光条件下反应30min，然后将Vc溶液加入反应体系中至溶液无色，反应终止，形成胰岛素的第三对二硫键，将样品纯化并冻干，得到胰岛素纯品多肽。
本发明的有益效果：本发明通过工艺优化，胰岛素纯品纯度到达90％，纯品收率达到10％以上，大大提高了胰岛素的得率；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，产品收率高，利于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明合成制备胰岛素，通过固相合成法依次缩合胰岛素肽链序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到胰岛素裸肽肽链，缩合反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应温度为20-40℃。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为20-50min；脱保护剂为20％哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。通过采用特殊的半胱氨酸原料，以特有的环化方法分别形成胰岛素的三对二硫键，样品纯化并冻干，到胰岛素纯品多肽。
实施例一胰岛素裸肽肽链的合成
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
树脂的脱保护以及洗涤方法
将树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
1、A链片段一的合成
A链片段一肽链为：L(D10)YQL(D10)ENYC(Trt)N
称量取代度为0.96mmol/g的Wang Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。
(1)Fmoc-Asn(trt)-Wang Resin的合成
秤取50mg Fmoc-Asn(trt)-OH用10ml DMF溶解均匀，将溶液加入到反应器中，再依次加入0.488ml DIC，1mg DMAP，60mg HOBT和0.06ml DIEA，反应器置于恒温振荡器中中反应1h，反应温度30℃。
(2)Fmoc-Asn(trt)-Wang Resin的封头反应
配制醋酐：DIEA＝1:1(体积比)的混合液6ml，将其加入到抽干的反应器中，置于恒温振荡器中反应30min。
(3)脱除Fmoc保护基
用DMF洗涤树脂，然后加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(4)保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Cys(Trt)-Asn(trt)-Wang Resin的缩合为例，称取65mg Fmoc-Cys(Trt)-OH和60mg HOBT用10ml DMF溶解，再用滴管向溶液中加0.4ml DIC活化，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(5)A链片段一的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应40-50min，洗涤，脱保护，洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-9个Fmoc-保护氨基酸，即得到A链片段一。
2、A链片段二的合成
A链片段二肽链为：GIVEQC(Mmt)C(Acm)TSIC(Mmt)S
称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。
(1)Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Resin的合成
称取110mg Fmoc-Ser(tBu)-OH和115mg HOBT放于10ml离心管中，加3ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应50min。
(2)Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Resin的封头反应
配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
(3)脱除Fmoc保护基
用DMF洗涤树脂，然后加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(4)保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Cys(Mmt)-Ser(tBu)-2-Cl-Resin的缩合为例，称取572mg Fmoc-Cys(Mmt)-OH和115mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(5)A链片段二的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应20-30min，洗涤，脱保护，洗涤。采用上述同样方法，依次缩合肽链中的后续Fmoc-保护氨基酸，即得到A链片段二。
3、B链裸肽的合成
采用上述“2、A链片段二的合成”的方法，按照Fmoc固相合成原理，依次进行氨基酸的缩合反应，得到B链裸肽：FVNQHL(D10)CGSHL(D10)VEAL(D10)YL(D10)VCGERGFFYTPKT。
实施例二胰岛素第一对二硫键的合成
以特有的切割试剂配方7％TFA+87％DCM+2.5％Tis+2.5％H2O+1％EDT，配置切割液20ml，切割反应30min以去掉半胱氨酸的mmt保护基；然后配置环化液-水溶液含0.03％H2O2，溶解纯化后的A链片段二使其多肽浓度为0.6mg/ml，用(NH4)2CO3调节pH为6.5，反应1h，然后用醋酸水溶液调节pH到5终止反应，形成胰岛素的第一对二硫键。
实施例三胰岛素第二对二硫键的合成
按照Fmoc固相合成法，将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链。将DTNP加入到纯化后的B链溶液中，于25℃条件下搅拌反应30min，然后上述A链溶解并加入到反应液中，搅拌反应30min，形成胰岛素的第二对二硫键。
实施例四胰岛素第三对二硫键的合成
取固体碘单质用1.5ml醋酸:水＝1:1溶解，使碘溶液达到饱和；取纯化后的第二对二硫键胰岛素多肽样品，用醋酸:水＝1:1溶液溶解，然后加入到饱和碘溶液中，避光条件下搅拌反应30min，然后将Vc溶液加入反应体系中至溶液无色，反应终止，形成胰岛素的第三对二硫键，将样品纯化并冻干，得到胰岛素纯品多肽。
胰岛素及其中间体，采用反相高效液相色谱法纯化制备除杂，制备条件为：C18、5um制备柱，流动相为A(0.1％乙酸/水)/B(0.1％乙酸/乙腈)，流速9ml/min，制备梯度程序为
将上述纯化后的胰岛素样品冻干并称重，经分析计算，其纯度达到90％以上，纯品收率为10.3％，比现有技术仅3-5％的收率有大幅度的提高。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，该方法包括以下顺序的步骤：
(1)、以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链；
(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；
(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；
(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述的A链片段缩合中，片段一指C端1-9个氨基酸组成的肽链片段，片段一指C端10-21个氨基酸组成的肽链片段；片段一的合成固相载体选用Wang Resin，片段二和B链的合成固相载体选用2-Cl(Trt)-Cl Resin。
3.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中Fmoc固相合成法中活化的保护氨基酸溶液方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述的半胱氨酸保护基，其中形成胰岛素第一对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(mmt)-OH，形成胰岛素第二对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(acm)-OH，形成胰岛素第三对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(trt)-OH。
5.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述液相环化，配置切割试剂7％TFA+87％DCM+2.5％Tis+2.5％H2O+1％EDT，切割除去半胱氨酸的mmt保护基，然后采用过氧化氢环化法反应，形成胰岛素的第一对二硫键。
6.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)中所述的液相环化法为：将DTNP加入到纯化后的B链溶液中，于25℃条件下反应30min，然后将纯化后的A链溶解加入到上述反应液中，搅拌反应30min，形成胰岛素的第二对二硫键。
7.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，步骤(4)中所述的液相环化法为：将胰岛素的形成第二对二硫键的胰岛素多肽纯化，取冻干后的样品溶解，加入到饱和的碘溶液中，避光条件下反应30min，然后将Vc溶液加入反应体系中至溶液无色，反应终止，形成胰岛素的第三对二硫键，将样品纯化并冻干，得到胰岛素纯品多肽。
8.一种权利要求1-10所述的方法合成制备胰岛素纯品多肽。
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