CN107141350A - 一种胰岛素类似物及其合成方法 - Google Patents

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CN107141350A CN201710484866.8A CN201710484866A CN107141350A CN 107141350 A CN107141350 A CN 107141350A CN 201710484866 A CN201710484866 A CN 201710484866A CN 107141350 A CN107141350 A CN 107141350A
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insulin analog
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insulin
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田长麟
张隆华
黄栋梁
郭晓奇
周莉
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Hefei, Jing peptide Biological Technology Co. Ltd.
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Institute of Advanced Technology University of Science and Technology of China
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Abstract

本发明公开了一种胰岛素类似物，其A链和B链序列及结构如下：本发明胰岛素类似物具有非常稳定的结构，通过在肽片段的合成中引入S‑C键替换容易断裂S‑S键，不仅可以起到稳固蛋白空间构象的作用，也可以促进复性过程的剩余二硫键的配对提高整体复性效率。另外本发明方法操作简便，收率高，获得的胰岛素类似物具有更好的稳定性，得到热力学更加稳定的胰岛素。

Description

一种胰岛素类似物及其合成方法
技术领域
本发明涉及蛋白质多肽领域，具体地说涉及一种胰岛素类似物及其合成方法。
背景技术
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。
胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。显微镜下的胰岛β细胞显微镜下的胰岛β细胞。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。中国科学院肾病检测研究所主治直至80年代初，用于临床的胰岛素几乎都是从猪、牛胰脏中提取的，这就是第一代胰岛素-动物胰岛素。不同动物的胰岛素组成均有所差异，猪的与人的胰岛素结构最为相似，只有B链羧基端的一个氨基酸不同。动物胰岛素是最早应用于糖尿病治疗的胰岛素注射制剂一般是猪胰岛素，猪胰岛素与人胰岛素存在1至4个氨基酸的不同，因此容易发生免疫反应，注射部位皮下脂肪萎缩或增生，胰岛素过敏反应，并且由于其免疫原性高，容易反复发生高血糖和低血糖，容易出现胰岛素抵抗。
80年代初已成功地运用遗传工程技术由微生物大量生产人的胰岛素，并已用于临床，这就是第二代胰岛素-人胰岛素。虽然人胰岛素相比于动物胰岛素有很多优点，但是，在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。
20世纪90年代末，在对人胰岛素结构和成分的深入研究中发现，对肽链进行修饰：利用基因工程技术，改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合；改变等电点；增加六聚体强度；以钴离子替代锌离子；在分子中增加脂肪酸链，加大与白蛋白的结合，均有可能改变其理化和生物学特征，从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)，也就是第三代胰岛素。胰岛素类似物可紧临餐使用，也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性高的胰岛素类似物。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种胰岛素类似物，其A链和B链序列及结构如下：
本发明还提供上述胰岛素类似物的合成方法，包括以下步骤：
采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照权利要求1所示的序列分别将A链和B链氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中A链第11位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，待A链第11位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至A链第7位，待A链第7位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令A链第11位二氨基二酸构件单元与A链第7位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合A链第5位以及余下的氨基酸；
最后经切割液处理以及连接后，获得所述胰岛素类似物；
进一步地，合成A链所用的树脂为Rink AM amide resin，合成B链所用的树脂为2-Cl-Trt-Cl-resin。
进一步地，所述缩合剂选自HATU、HOAT、PyAOP中的任意一种或任意几种。
进一步地，合成温度为25℃。
进一步地，A链第21位氨基酸为Fmoc-Asp-OtBu、第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH；B链第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH。
进一步地，Alloc保护基团的脱除试剂为四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物。
进一步地，Fmoc保护基团的脱除试剂为含有20vt％哌啶的DMF溶液。
进一步地，A链所用的切割液为三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液；B链所用的切割液为三氟乙酸、水、TIPS、DTNP的混合液。
本发明的有益效果体现在：
本发明胰岛素类似物具有非常稳定的结构，通过在肽片段的合成中引入S-C键替换容易断裂S-S键，不仅可以起到稳固蛋白空间构象的作用，也可以促进复性过程的剩余二硫键的配对提高整体复性效率。另外本发明方法操作简便，收率高，获得的胰岛素类似物具有更好的稳定性。
附图说明
图1是本发明胰岛素类似物的A链HPLC色谱图。
图2是本发明胰岛素类似物的B链HPLC色谱图。
图3是本发明胰岛素类似物的A链和B链两步连接反应HPLC色谱图。
图4是本发明胰岛素类似物的A链和B链第一步连接产物HPLC色谱图。
图5是本发明胰岛素类似物的A链和B链最终连接产物HPLC色谱图。
图6是本发明胰岛素类似物的A链质谱图。
图7是本发明胰岛素类似物的B链质谱图。
图8是本发明胰岛素类似物的A链和B链第一步连接产物质谱图。
图9是本发明胰岛素类似物的A链和B链最终连接产物质谱图。
图10是本发明胰岛素类似物与天然胰岛素的稳定性比较图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
二氨基二酸构件单元的制备
反应式为：
具体步骤为：
化合物2：取6.01mg(25.0mmol)胱氨酸溶于10mL 70％高氯酸中，然后缓慢加入62.5mL乙酸叔丁酯。反应过夜。反应结束后，加入水50mL，并将反应冰浴降温。监测反应结束后，用10M氢氧化钠调节反应体系的pH到10，然后使用乙酸乙酯萃取有机相，再使用无水硫酸钠干燥，最后将有机溶剂旋转蒸发，得到白色颜色固体粉末。将固体粉末溶解于85mL四氢呋喃中，加入3.85mL(34.9mmol)N-甲基吗啉。将反应体系置于冰水中降温处理，缓慢加入11.75g(34.9mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)。反应恢复至室温过夜。结束反应后，首先使用旋转蒸发仪旋除溶剂，然后加入乙酸乙酯，并用水和饱和食盐水清洗，再用无水硫酸钠干燥有机相，然后使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并使用硅胶柱分离纯化。洗脱剂为7：3的正己烷：乙酸乙酯，得到10.69g(13.4mmol)白色固体产物2，产率为79％。比移值0.55(2：1的正己烷：乙酸乙酯)。
化合物3：在氮气保护下将产物2溶解于45mL四氢呋喃溶液中,然后加入1.37mL(5.5mmol)三丁基膦。反应30分钟后，加入4.5mL水，反应过夜处理。反应结束后使用旋转蒸发仪旋除溶剂，再加入40mL*3乙酸乙酯，并用10％的柠檬酸和饱和食盐水分别清洗有机相，最后使用无水硫酸钠干燥后旋除溶剂。粗产品使用硅胶柱纯化，洗脱剂为4:1的正己烷:乙酸乙酯，得到2.53g(6.33mmol)的无色油状产物3，产率为86％。比移值0.45(4:1的正己烷:乙酸乙酯)。
化合物4：称取1.01g(8.48mmol)高丝氨酸和0.90g(8.48mmol)碳酸氢钠在氮气保护下溶解于10mL水和5mL乙腈中，使用冰浴冷却反应体系。再缓慢加入0.9mL(8.48mmol)氯甲酸烯丙酯。等反应体系恢复室温继续反应过夜。反应结束后旋除溶剂，得到的粗产品无需后处理纯化。将粗产品溶解于DMF中，随后加入0.71g(8.48mmol)的碳酸钠，缓慢加入0.81mL(9.33mmol)的烯丙基溴，反应过夜。反应结束后使用乙酸乙酯萃取有机相，并使用水和饱和食盐水清洗有机相，最后旋除有机相，并使用硅胶柱纯化产物，洗脱剂1:1的正己烷:乙酸乙酯。比移值为0.39(1:1的正己烷:乙酸乙酯)。得到1.58g(6.50mmol)的无色油状产物4，产率为77％。
化合物5：在氮气保护下取4.00g(16.4mmol)化合物4和6.53g(19.7mmol)四溴化碳溶解于45mL二氯甲烷中，并将反应体系置于冰浴中降温冷却。然后将溶解于20mL的二氯甲烷中的5.17g(19.7mmol)的三苯基膦缓慢滴加。然后将反应体系恢复至室温并继续反应1小时。反应结束后，加入20mL二氯甲烷稀释，并使用水和饱和食盐水清洗有机相，然后使用无水硫酸钠干燥有机相，之后再旋干有机溶剂。之后加入过量1:1的正己烷:乙酸乙酯使副产物三苯氧膦重结晶析出，滤除固体。液体有机相旋除并使用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为2:1的正己烷:乙酸乙酯。分离得到4.02g(13.1mmol)无色油状液体5，产率为80％。
化合物6：在氮气保护下将1.60g(4.01mmol)化合物3和1.29g(4.21mmol)化合物5溶解于20mL乙酸乙酯中，再加入5.17g(16.0mmol)的四丁基溴化胺溶解于0.5M碳酸氢钠的水溶液，然后反应过夜。反应结束后加入乙酸乙酯稀释，并加入水和饱和食盐水清洗有机相，然后使用无水硫酸钠干燥有机相，再将有机相旋干，并使用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为2:1的正己烷:乙酸乙酯。分离得到2.01g(3.36mmol)的无色油状液体产物6，比移值为0.20(3:1的正己烷:乙酸乙酯)。
化合物1：取2.00g(3.20mmol)的化合物6溶解于16mL的二氯甲烷中，然后加入0.44mL(3.52mmol)的苯硅烷，随后加入16mL三氟乙酸，反应在室温下搅拌两小时后旋除溶剂，然后溶解于1:1的苯:乙腈中，液氮冷却并冻干得到1.72g(3.03mmol)的白色固体产物1，即为二氨基二酸构件单元，产率为95％。
化合物2核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：7.75(d,4H,J＝7.6Hz,CH),7.60(d,H,J＝7.6Hz,CH),7.41-7.36(m,4H),7.30(t,4H,J＝7.2Hz,CH),5.75(d,2H,J＝7.6Hz,NH),4.59(dd,2H,J＝13.2Hz,5.6Hz,Hα),4.38(app.q,4H,J＝18.0Hz,10.4Hz,OCH2),4.21(t,2H,J＝7.2Hz,CH),3.27-3.17(m,4H,SCH2),1.50(s,18H,tBu)。高分辨质谱：HRMS(ES)Calcdfor C44H48N2O8S2Na 819.2746,found 819.2744。
化合物3核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：7.77(d,2H,J＝7.5Hz,Ar-CH),7.62(d,2H,J＝7.0Hz,Ar-CH),7.41(t,2H,J＝7.5Hz,Ar-CH),7.33(m,2H,Ar-CH),5.68(d,1H,J＝7.0Hz,NH),4.58-4.52(m,1H,Hα),4.46-4.38(m,2H,CH2),4.24(t,1H,J＝7.0Hz,CH),3.05-2.88(m,2H,SCH2),1.51(s,9H,tBu),1.35(t,1H,J＝9.0Hz,SH)。高分辨质谱：HRMS(ES)Calcd for C22H25NO4SNa 422.1396,found 422.1396。
化合物4核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：5.94-5.86(m,2H),5.67(d,J＝7.3Hz,1H),5.35-5.21(m,4H),4.65(d,J＝6.0Hz,2H),4.60-4.53(m,3H),3.76-3.65(m,2H),2.64(bs,1H),2.20-2.14(m,1H),1.77-1.71(m,1H)。高分辨质谱：calc.for C11H17NO5Na266.1004,found266.1008。
化合物5核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：5.95-5.85(m,2H),5.37-5.21(m,5H),4.65(dt,J＝5.6Hz,1.2Hz,2H),4.58(d,J＝5.6Hz,2H),4.52(m,1H),3.44(t,J＝7.0Hz,2H),2.48-2.41(m,1H),2.29-2.22(m,1H).高分辨质谱：HRMS(ESI):calc.forC11H17BrNO4306.0341,found 306.0339.
化合物6核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.61(d,J＝7.5Hz,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.32(t,J＝7.5Hz,2H),5.94-5.85(m,2H),5.69(d,J＝7.3Hz,1H),5.40(d,J＝7.1Hz,1H),5.34-5.17(m,4H),4.63(d,J＝6.0Hz,2H),4.59-4.46(m,4H),4.39(d,J＝7.0Hz,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.97(dq,J＝13.4Hz,4.9Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.15-1.96(m,2H),1.49(s,9H).高分辨质谱：HRMS(ESI):calc.forC33H41N2O8S 625.2584,found 625.2582.
化合物1核磁共振-氢谱(CDCl3,400MHz)：7.81(d,J＝7.5Hz,2H),7.70(d,J＝7.5Hz,2H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.35-7.30(m,2H),5.98-5.90(m,2H),5.36-5.17(m,4H),4.63(m,2H),4.55(m,2H),4.43-4.33(m,4H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),3.12-2.86(m,2H),2.74-2.60(m,2H),2.14-1.97(m,2H).高分辨质谱：HRMS(ESI):calc.for C29H33N2O8S569.1958,found569.1957.
以上化合物已经有人在文献中有过报导，故其具体核磁及质谱数据参照文献：ACSChem.Biol.2011,6,753–760。
实施例2
胰岛素类似物的合成
所述胰岛素类似物的A链和B链序列及结构如下：
其中，A链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；B链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
具体合成步骤为：
(1)A链和B链的合成
采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照序列分别将A链和B链氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上；
其中A链的反应式为：
A链的合成：称取Rink AM amide Resin(0.1mmol)于固相合成管中，使用DMF/DCM混合溶剂(体积比为1:1)溶胀15min后，抽干，然后按照常温的Fmoc固相合成法合成上述胰岛素类似物(0.4mmol氨基酸，0.38mmol HATU，0.4mmol HOAT，0.8mmol DIPEA；反应时间为45min，反应温度为25℃)，其中A链第11位Cys由由化合物1，也即二氨基二酸构件单元所替换，待A链第11位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至A链第7位，待A链第7位耦合完后，先采用四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物(摩尔比1:5)作为脱除试剂脱除Alloc保护基团，采用含有20vt％哌啶的DMF溶液作为脱除试剂脱除Fmoc保护基团，再令A链第11位二氨基二酸构件单元与A链第7位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合A链第5位以及余下的氨基酸，其中，A链第21位氨基酸为Fmoc-Asp-OtBu、第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH，除二氨基二酸构件单元及上述特殊氨基酸外，其他所用氨基酸均为普通Fmoc保护的氨基酸。
B链的合成：称取2-Cl-Trt-Cl-resin(0.1mmol)于固相合成管中，使用DMF/DCM混合溶剂(体积比为1:1)溶胀15min后，抽干，然后按照常温的Fmoc固相合成法合成上述胰岛素类似物(0.4mmol氨基酸，0.38mmol HATU，0.4mmol HOAT，0.8mmol DIPEA；反应时间为45min，反应温度为25℃)，其中B链按照序列将氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，B链第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH，其他所用氨基酸均为普通Fmoc保护的氨基酸。
待所有的氨基酸耦合完后，用DMF，DCM，DMF各洗5次，加入含有哌啶(体积分数20％)的DMF溶液反应2次(2min，10min各一次)，脱除Fmoc保护基。
肽链连接完成后，加入8mL切割试剂于多肽合成管内，A链所述切割液为[V(TFA):V(苯酚):V(水):V(茴香硫醚):V(乙二硫醇)＝82.5:5:5:5:2.5]，B链所述切割液为[V(TFA):V(水):V(三异丙基硅烷,TIPS)＝93:5:2，400mg DTNP]反应2h，将多肽从树脂上切下，并脱除侧链保护基团，将切割液聚集于离心管中，用N2鼓泡，浓缩溶液，最后用冰乙醚沉淀，离心，得到粗肽(A链粗肽220mg，B链粗肽180mg)，使用半制备型HPLC分离得到纯肽(A链纯肽32mg，B链纯肽41mg)。
(2)A链和B链的连接
A链和B链的连接反应式如下：
具体步骤为：
分别取合成得到的6mg胰岛素A-Chain和9mg B-Chain，混合溶解于3mL 8M GnHCl,0.1M Tris buffer。PH为8以上。监测反应，15min反应即结束，待其反应完全之后加入5mL20mg碘的AcOH溶液，30min后加入1mL 0.1M的抗坏血酸淬灭反应。然后使用RP-HPLC分离纯化即可得到胰岛素类似物6mg(两步反应的分离产率40％)。
本发明胰岛素类似物的A链和B链的色谱图分别参见图1和图2，连接反应色谱图参见图3，第一步连接反应产物色谱图参见图4，最终产物胰岛素类似物的色谱图参见图5，胰岛素类似物的A-Chain【HRMS(ESI):calc.for 2434.74,found 2433.70】、B-Chain【HRMS(ESI):calc.for 3655.19,found 3654.82】、第一步连接反应产物A-B dimer【HRMS(ESI):calc.for 5933.77,found 5933.40】和最终产物胰岛素类似物A(CH2-S)Insulin【HRMS(ESI):calc.for 5788.77,found 5788.98】的质谱图分别参见图6、图7、图8和图9。
色谱图1、图2、图4、图5对应的物质结构分别对应A链和B链的连接反应式中的四个物质结构，即A-Chain、B-Chain、A-B dimer、A(CH2-S)Insulin。
色谱图3为A链和B链的连接反应的反应物和产物色谱检测对比图。
质谱图6、图7、图8和图9对应的物质结构分别对应A链和B链的连接反应式中的四个物质结构，即A-Chain、B-Chain、A-B dimer、A(CH2-S)Insulin。
实施例3
胰岛素类似物热稳定性试验
分别取天然胰岛素和本发明胰岛素类似物100ug溶解于1mL水中，调pH为2溶解完全后将反应液置于60摄氏度恒温浴中。然后在0h、3h、6h、20h、24h、48h、72h分别取样100uL进HPLC分析C18柱分析。然后取剩余原料峰面积占零时刻原料峰面积百分比。最终数据整理后见图10。
由图10可见，对比天然胰岛素10h左右即降解50％，本发明胰岛素类似物需要近50h才会降解50％。由此可见该胰岛素类似物相比于天然胰岛素热稳定性有明显提高。因此可见，本发明得到的胰岛素类似物是热力学更加稳定的产物。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
序列表：
<110> 中国科学技术大学先进技术研究院
<120> 一种胰岛素类似物及其合成方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> Odonthobuthus doriae
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> Odonthobuthus doriae
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30

Claims (9)

1.一种胰岛素类似物，其特征在于，其A链和B链序列及结构如下：
2.如权利要求1所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照权利要求1所示的序列分别将A链和B链氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中A链第11位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，待A链第11位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至A链第7位，待A链第7位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令A链第11位二氨基二酸构件单元与A链第7位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合A链第5位以及余下的氨基酸；
最后经切割液处理以及连接后，获得所述胰岛素类似物；
3.如权利要求2所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，合成A链所用的树脂为Rink AM amide resin，合成B链所用的树脂为2-Cl-Trt-Cl-resin。
4.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，所述缩合剂选自HATU、HOAT、PyAOP中的任意一种或任意几种。
5.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，合成温度为25℃。
6.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，A链第21位氨基酸为Fmoc-Asp-OtBu、第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH；B链第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH。
7.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，Alloc保护基团的脱除试剂为四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物。
8.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，Fmoc保护基团的脱除试剂为含有20vt％哌啶的DMF溶液。
9.如权利要求2或3所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，A链所用的切割液为三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液；B链所用的切割液为三氟乙酸、水、TIPS、DTNP的混合液。
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