CN103533952A - 包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有置换半胱氨酸的人胰岛素类似物、含有聚乙二醇化的置换半胱氨酸的人胰岛素衍生物和制备它们的方法。本发明的化合物可用于治疗糖尿病。

Description

包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物
技术领域
本发明涉及新颖的人胰岛素类似物和衍生物。本发明也涉及制备它们的方法。
序列表的通过引用并入
标题为“ SEQUENCE LISTING (序列表)”的序列表是 6.317 字节,创建于 2011 3 1 日,且通过引用并入本文。
背景技术
糖尿病是代谢障碍,其中利用葡萄糖的能力部分地或完全地丧失。目前,糖尿病( I 型糖尿病和 II 型糖尿病两者)的治疗以越来越大的程度依赖于胰岛素治疗。
在过去的十年中,已经为特定作用模式(即速效或长效)设计了许多人胰岛素类似物。例如,胰岛素 Detemir® 是一种用于维持胰岛素的基础水平的长效人胰岛素类似物。与位置 B29 处的赖氨酸共价结合的脂肪酸 ( 豆蔻酸 ) 的存在延迟胰岛素的作用。
尽管最近在市场上可得到胰岛素类似物的改进,仍然持续需要扩大和多样化现有的胰岛素类似物集合,所述胰岛素类似物表现出不同的药理学性能,诸如稳定性和作用模式,同时维持有效的胰岛素活性,以便满足患者的各种具体需要。
赖氨酸残基已经被用作化学化合物在胰岛素分子上的连接位点。但是,使用赖氨酸作为锚定点来制备胰岛素衍生物的方法存在限制,且不容易操作。实际上,赖氨酸不允许在胰岛素分子上进行位点特异性的连接,因为胰岛素分子还包含 2 个在类似条件下与赖氨酸的ε - 氨基反应的 N- 端α - 氨基。与其它化学基团的反应可能产生连接在胰岛素上的不同位点处的一种或多种这类化学基团的异质混合物。另外,当在胰岛素的加工中使用水解无色杆菌( A. lyticus )蛋白酶( ALP )(其在赖氨酸残基后面切割)时,在胰岛素分子中不可能存在内部赖氨酸。因此,化学基团的连接位点限于 A- 链和 / B- 链的 C 端末端中的赖氨酸残基。
已经提议使用半胱氨酸作为锚定点。 Kuo 等人在专利文献 WO2010/033220 (其涉及意图用于肺给药的治疗性肽)中提示,用半胱氨酸残基替换胰岛素 B- 链的首 4 个氨基酸中的任一个,然后使这样的半胱氨酸残基与活化的聚乙二醇 (PEG) 反应,所述活化的聚乙二醇对与巯基 ( 例如, N- 马来酰亚胺基聚合物 ) 的反应是特异性的。但是,已知的是,半胱氨酸残基向胰岛素中的添加通常会使该分子失稳,并且 Kuo 等人没有公开制备这样的肽的方法,也没有证实这样的化合物的可行性和有效性。
因此,仍然需要新的胰岛素类似物和衍生物、在胰岛素分子上的新锚定位点、和它们的改进的制备方法。
发明内容
本发明涉及新胰岛素类似物和新胰岛素衍生物。
本发明基于下述认识:在位置 A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C 之一处向胰岛素分子中引入额外半胱氨酸,会提供实现化学选择性反应的新化学锚定点。
令人惊奇地,已经发现,本发明的胰岛素类似物在宿主细胞中具有良好的表达率,所述额外半胱氨酸不会造成对胰岛素中的现有二硫键的干扰,并且携带与所述额外半胱氨酸连接的化学化合物的胰岛素衍生物表现出对胰岛素受体的高结合亲和力和有效的生物活性。
实际上,这是重要的,因为本发明的发明人已经令人惊讶地发现,可以制备一些半胱氨酸置换的类似物,并且这些半胱氨酸置换的类似物中的一些可以有效地或容易地用于连接聚合物。本发明的发明人已经面对和克服了一些远远超过常规实验的困难。
在一个方面,本发明涉及人胰岛素类似物,其包含具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或 desB30 人胰岛素: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
在另一个方面,本发明涉及人胰岛素衍生物,其包含如本文中定义的人胰岛素类似物,其中所述置换半胱氨酸与甲基聚乙二醇马来酰亚胺分子 (MM(PEG)) 或与 N- 乙基马来酰亚胺分子 (NEM) 共价连接。
在一个方面,本发明的新颖的胰岛素化合物提供目前可得到的胰岛素化合物的有效替代物。另外或可替换地,本发明的新颖的胰岛素化合物可以容易地或有效地制备。另外或可替换地,本发明的新颖的胰岛素化合物表现出对胰岛素受体的有效结合亲和力。另外或可替换地,本发明的新颖的胰岛素化合物可以用于治疗糖尿病患者。另外或可替换地,本发明的新颖的胰岛素化合物表现出与人胰岛素相比增强的稳定性和 / 或延长的体内半衰期。另外或可替换地,本发明的新颖的胰岛素化合物可以通过皮下途径来施用。
在另一个方面,本发明涉及如本文中定义的人胰岛素类似物作为用于制备药物的起始原料或中间体化合物的用途。另外或可替换地,本发明涉及如本文中定义的人胰岛素类似物作为用于制备胰岛素化合物或人胰岛素衍生物的起始原料或中间体化合物的用途、或在制备胰岛素化合物或人胰岛素衍生物的方法中的用途。本发明的胰岛素类似物也为其它化学化合物的结合和新颖的胰岛素衍生物的生成提供了位点特异性的连接反应。
在另一个方面,本发明涉及用于制备这样的人胰岛素类似物和衍生物的方法。在一个方面,本发明的方法比现有技术的那些方法简化和 / 或更容易操作。另外或可替换地,它们是化学选择性的。另外或可替换地,它们不需要胰岛素分子的保护步骤。
在另一个方面,本发明涉及用作药物的如本文中定义的人胰岛素类似物和衍生物。另外或可替换地,本发明涉及用于治疗糖尿病的如本文中定义的人胰岛素类似物和衍生物。
在另一个方面,本发明涉及核酸序列,其编码如本文中定义的人胰岛素类似物或其前体。
在另一个方面,本发明涉及宿主细胞,其包含含有如本文中定义的核酸序列的表达载体。
附图说明
1 显示了携带置换 Cys 的不同胰岛素类似物的表达收率。图 1 a 涉及具有在 A- 链中的置换 Cys 的类似物,图 1 b 涉及具有在 B- 链中的置换 Cys 的类似物。
2 显示了不同胰岛素类似物的修饰前体相对于表达的类似物前体的总量的比例。
3 显示了在用 MM(PEG)12 烷基化 A21CdesB30 之前 ( 3 a) 和之后 ( 3 b) A21CdesB30 类似物和衍生物的群体。
4 显示了在胰岛素类似物或人胰岛素静脉内注射以后,大鼠的血糖水平的下降。
具体实施方式
在本发明中,提供了新颖的胰岛素类似物和衍生物。对随后的化学选择性反应而言,所述新颖的类似物提供了新化学锚定点。本发明的新颖的胰岛素类似物和衍生物可以用于治疗糖尿病。
在一个方面,本发明涉及具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或 desB30 人胰岛素: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
本文中使用的术语“人胰岛素”是指众所周知其序列、结构和性质的人胰岛素激素。人胰岛素具有 2 个被命名为 A- 链和 B- 链的多肽链。 A- 链是 21 氨基酸肽, B- 链是 30 氨基酸肽, 2 个链通过二硫键连接:第一个二硫键在 A- 链的位置 7 处的半胱氨酸和 B- 链的位置 7 处的半胱氨酸之间,第二个二硫键在 A- 链的位置 20 处的半胱氨酸和 B- 链的位置 19 处的半胱氨酸之间。第三个二硫键存在于在 A- 链的位置 6 11 处的半胱氨酸之间。
本文中使用的术语“ desB30 人胰岛素”是指人胰岛素的类似物,其中 B30 氨基酸缺失。 desB30 人胰岛素的序列是众所周知的。编码人胰岛素和 desB30 人胰岛素的核酸序列也是众所周知的。
以阐明链 (A B) 、位置、和置换天然氨基酸残基的氨基酸残基的单字母或三字母代码的方式表示胰岛素分子中的修饰。在本文中,诸如“ A1 ”、“ A2 ”和“ A3 ”等术语表示,从人胰岛素的 N- 端末端计起,分别在胰岛素 A 链中的位置 1 2 3 等处的氨基酸。类似地,诸如 B1 B2 B3 等术语表示,从人胰岛素的 N- 端末端计起,分别在胰岛素 B 链中的位置 1 2 3 等处的氨基酸。氨基酸位置的编号是基于人胰岛素的天然序列。例如,这意味着,其中缺失在天然人胰岛素序列的位置 A1 A2 处的氨基酸的胰岛素类似物开始于氨基酸 A3 。诸如 A10C A10Cys 等术语表示,在 A10 位置处的氨基酸已经被半胱氨酸替换。
本文中使用的术语“半胱氨酸置换”是指,用半胱氨酸氨基酸残基替换所谓的母体胰岛素分子中的氨基酸残基。在本发明的最宽范围内,被半胱氨酸替换的氨基酸残基位于母体胰岛素分子上的位置 A10 A14 A15 A18 A19 A21 B25 B27 处。所述半胱氨酸氨基酸残基被命名为“置换半胱氨酸”,且得到的胰岛素分子被命名为“被置换的胰岛素”或“胰岛素类似物”或“人胰岛素类似物”。
在一个实施方案中,本发明涉及具有一个且仅一个半胱氨酸置换的人胰岛素或其 desB30 人胰岛素,所述置换选自 A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
在本发明的一个实施方案中,所述半胱氨酸置换是 A21C
在另一个实施方案中,人胰岛素的 3 个二硫键得到保留。
根据本发明的被置换的胰岛素的非限制性例子是 A10C 人胰岛素, A14C 人胰岛素, A15C 人胰岛素, A18C 人胰岛素, A19C 人胰岛素, A21C 人胰岛素, B25C 人胰岛素, B27C 人胰岛素, A10C, desB30 人胰岛素, A14C, desB30 人胰岛素, A15C, desB30 人胰岛素, A18C, desB30 人胰岛素, A19C, desB30 人胰岛素, A21C, desB30 人胰岛素, B25C, desB30 人胰岛素,和 B27C, desB30 人胰岛素。这些化合物的二聚体也是本发明的一部分。 B25C 人胰岛素的二聚体和 B25C, desB30 人胰岛素的二聚体是这样的二聚体的非限制性例子。
作为非限制性例子, A21C, desB30 人胰岛素的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 1 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 2 (对于 B- 链))由下文化学式 1 表示:
化学式 1:
Figure 177868DEST_PATH_IMAGE001
其中 C* 表示在位置 A21 处的置换半胱氨酸,且 -S-S- 表示二硫键。
相应地定义了本发明的其它胰岛素类似物的序列。
作为非限制性例子, B25C, desB30 人胰岛素的二聚体的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 3 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 4 (对于 B- 链))由下文化学式 2 表示:
化学式 2:
Figure 95008DEST_PATH_IMAGE002
其中 C* 表示位置 B25 处的置换半胱氨酸, -S-S- 表示二硫键,且– C*-C*- 表示二聚化。
作为非限制性例子, A10C, desB30 人胰岛素的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 5 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 6 (对于 B- 链))由下文化学式 3 表示:
Figure 61696DEST_PATH_IMAGE003
作为非限制性例子, A14C, desB30 人胰岛素的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 7 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 8 (对于 B- 链))由下文化学式 4 表示:
作为非限制性例子, A15C, desB30 人胰岛素的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 9 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 10 (对于 B- 链))由下文化学式 5 表示:
Figure 208961DEST_PATH_IMAGE005
作为非限制性例子, A18C, desB30 人胰岛素的序列(在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 11 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 12 (对于 B- 链))由下文化学式 6 表示:
作为非限制性例子, A19C, desB30 人胰岛素的序列 ( 在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 13 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 14 (对于 B- 链) ) 由下文化学式 7 表示:
Figure 986872DEST_PATH_IMAGE007
作为非限制性例子, B25C, desB30 人胰岛素的序列 ( 在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 15 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 16 (对于 B- 链) ) 由下文化学式 8 表示:
Figure 185772DEST_PATH_IMAGE008
作为非限制性例子, B27C, desB30 人胰岛素的序列 ( 在附随的序列表中报告为 SEQ ID NO 17 (对于 A- 链)和 SEQ ID NO 18 (对于 B- 链) ) 由下文化学式 9 表示:
Figure 792334DEST_PATH_IMAGE009
在化学式 1 至化学式 9 中,胰岛素类似物显示为成熟形式, C* 表示置换半胱氨酸,且 -S-S- 表示二硫键。
本发明的被置换的胰岛素表现出在宿主细胞中的良好表达率的惊人优点。如图 1 所示,发明人在酵母细胞中试验了共 43 种被置换的胰岛素的生产,每种胰岛素携带不同的置换半胱氨酸。令人惊奇地,这些胰岛素类似物中的 8 种以令人满意的收率(即相对于人胰岛素( HI )高 12.5% 的收率)表达,这使得用这些类似物进一步研究成为可能。这 8 种胰岛素类似物(以前体形式从酵母细胞表达)具有下述半胱氨酸置换之一: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
本发明的被置换的胰岛素的另一个惊人优点是,所述额外半胱氨酸不会造成对胰岛素分子中的现有二硫键的干扰。该方面是特别令人感兴趣的,因为它允许使用本发明的被置换的胰岛素作为起始原料或中间体化合物来获得聚乙二醇化的胰岛素衍生物。实际上,根据本发明的置换半胱氨酸可用作用于选择性连接马来酰亚胺( maleimid - 聚乙二醇 (PEG) 分子的锚定点。
在另一个方面,本发明涉及人胰岛素衍生物,其包含如上文定义的被置换的胰岛素,且其中所述置换半胱氨酸被进一步聚乙二醇化。
本文中使用的“胰岛素衍生物”是指如以前公开的被置换的胰岛素,其通过在一个置换半胱氨酸中引入 PEG 侧链或 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM) 部分而进一步化学修饰。
在本文中应当理解,“聚乙二醇化”表示聚乙二醇 (PEG) 与其它化合物的共价连接,可能经由接头连接。术语“ PEG ”在本文中表示聚乙二醇 (PEG) 或其衍生物,其最终与接头偶联,如本领域中已知的。
在一个实施方案中,所述 PEG 由名称 PEGn 定义,所述 PEGn 表示具有由化学式 10 代表的结构的 PEG
化学式 10: HO-CH2-(CH2-O-CH2-)n-CH2-OH
其中 n 是整数,且范围为 1-12 。在一个实施方案中, n 范围为 8-12 。在另一个实施方案中, n 12 。短链 (CH2-O-CH2) 也被称为寡乙二醇 (OEG)
在另一个实施方案中,所述聚乙二醇化经由接头发生在置换半胱氨酸残基的巯基上。所述接头可以包含马来酰亚胺部分。在一个实施方案中,所述聚乙二醇分子是或包含 MM(PEG)n ,其中 PEG 是化学式 1 的分子,其具有作为接头的马来酰亚胺基团,且具有在 PEG 分子的游离末端处的甲基。“ n ”是整数,且范围为 1-12 8-12 ,或“ n ”是 12 。在一个实施方案中,所述聚乙二醇分子是或包含 MM(PEG)12 ,其表示化学式 11 PEG 分子:
化学式 11:
Figure 785698DEST_PATH_IMAGE010
换而言之, MM(PEG)12 是化学式 10 PEG 分子,其中 n 12 ,其具有作为接头的马来酰亚胺基团,且具有在 PEG 分子的游离末端处的甲基。
作为非限制性例子,“ A10C-MM(PEG)12 人胰岛素“是指这样的胰岛素衍生物,其中在天然存在的人胰岛素的位置 A10 处的氨基酸已经被半胱氨酸替换,且其中 MM(PEG)12 已经连接至所述半胱氨酸的巯基。
在另一个实施方案中,替代 MM(PEG)n 分子, N- 乙基马来酰亚胺 (NEM) 与本发明的被置换的胰岛素的置换半胱氨酸共价连接。作为非限制性例子,化学式 12 代表 A21C-NEM desB30 胰岛素:
化学式 12:
Figure 726978DEST_PATH_IMAGE011
其中 C* 表示在位置 A21 处的置换半胱氨酸,且 -S-S- 表示二硫键。
根据本发明的胰岛素衍生物的非限制性例子是: A10C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A14C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A15C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A18C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A19C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A21C-MM(PEG)12 人胰岛素、 B25C-MM(PEG)12 人胰岛素、 B27C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A10C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A14C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A15C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A18C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A19C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 B25C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素和 B27C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A10C-NEM 人胰岛素、 A14C-NEM 人胰岛素、 A15C-NEM 人胰岛素、 A18C-NEM 人胰岛素、 A19C-NEM 人胰岛素、 A21C-NEM 人胰岛素、 B25C-NEM 人胰岛素、 B27C-NEM 人胰岛素、 A10C-NEM desB30 人胰岛素、 A14C-NEM desB30 人胰岛素、 A15C-NEM desB30 人胰岛素、 A18C-NEM desB30 人胰岛素、 A19C-NEM desB30 人胰岛素、 A21C-NEM desB30 人胰岛素、 B25C-NEM desB30 人胰岛素和 B27C-NEM desB30 人胰岛素。
作为非限制性例子, A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素也被命名为 S{ β -A21}-[1-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2- 甲氧基乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙基氨基 ]-3- 氧代丙 ]-2,5- 二氧代吡咯 -3- ]-[CysA21],des-ThrB30- 胰岛素 ( )
本发明的胰岛素衍生物代表可用于治疗糖尿病患者的替代性胰岛素化合物。实际上,它们确实表现出对胰岛素受体的结合亲和力。在一个实施方案中,本发明的胰岛素衍生物对胰岛素受体的结合亲和力比天然存在的人胰岛素高 0% 。在另一个实施方案中,本发明的胰岛素衍生物对胰岛素受体的结合亲和力高 0.1% 0.2% 0.3% 0.4 0.5% 。在另一个实施方案中,本发明的胰岛素衍生物对胰岛素受体的结合亲和力高 1% 2% 3% 4% 5% 6% 8% 10% 11% 或达到 10% 11%
在一个实施方案中,本发明包括聚乙二醇化的胰岛素衍生物的一种对映异构体( enantiomere )。在另一个实施方案中,本发明包括聚乙二醇化的胰岛素衍生物的对映异构体的混合物。
作为非限制性例子, A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素由下文化学式 13 表示:
Figure 463990DEST_PATH_IMAGE012
且包括 R S 对映异构体、或 R S 对映异构体的混合物。两种对映异构体均表现出对胰岛素受体的有效结合。 C* 表示在位置 A21 处的置换半胱氨酸,且 -S-S- 表示二硫键。
使用蛋白质工程领域中的已知技术,如在专利文献 EP0214826 中公开的,可以制备本发明的被置换的胰岛素类似物。
在另一个方面,本发明涉及用于生产具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或 desB30 人胰岛素的前体的方法: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
在一个实施方案中,所述方法包括步骤 (i) :培养宿主细胞,所述宿主细胞包含编码如上定义的前体的核酸序列。
在一个实施方案中,步骤 (i) 的宿主细胞是酵母宿主细胞,且在另一个实施方案中,所述酵母宿主细胞选自酵母属。在另一个实施方案中,所述酵母宿主细胞选自酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae )种。在另一个实施方案中,所述酵母宿主细胞是酿酒酵母菌株 MT663
可以根据众所周知的技术和方案,诸如在专利 US6500645 中公开的,培养所述宿主细胞。通常在适当的条件下在适当的培养基中培养所述宿主细胞,并通常由宿主细胞表达从步骤 (i) 得到的前体和将其释放进培养基中。可以根据已知的技术,从培养基中进一步收集、分离、纯化和 / 或浓缩所述前体。
在另一个实施方案中,步骤 (i) 的核酸序列包含编码天然存在的胰岛素或 desB30 人胰岛素的序列,其中在得到的前体中与位置 A10 A14 A15 A18 A19 A21 B25 B27 之一处的氨基酸相对应的密码子已经被修饰成编码半胱氨酸氨基酸的密码子。在另一个方面,本发明涉及步骤 (i) 的核酸。编码天然存在的胰岛素、 desB30 人胰岛素的核酸序列和编码半胱氨酸的密码子是本领域已知的。
在另一个方面,本发明涉及载体,其包含步骤 (i) 的核酸序列。不同宿主细胞的载体是本领域已知的。
根据分子生物学领域众所周知的技术,得到步骤 (i) 的核酸序列和含有所述核酸序列的载体。在一个实施方案中,通过重叠聚合酶链式反应 (PCR) ,将根据本发明的半胱氨酸置换引入胰岛素编码序列中。
根据要转化的宿主细胞,选择含有步骤 (i) 的核酸的载体。适当的转化技术也是本领域众所周知的。
在另一个方面,本发明涉及宿主细胞,其含有步骤 (i) 的核酸序列或包含步骤 (i) 的核酸序列的载体。宿主细胞如上面所定义。
在另一个方面,本发明涉及从步骤 (i) 得到的前体。
在一个实施方案中,在步骤 (i) 中编码的前体是胰岛素原样融合蛋白,其包含间隔物和随后的通过微型 C- 肽与 A- (A1-A21) 连接的 B- 链,或者由它们组成。在另一个实施方案中,所述间隔物包含氨基酸序列 EEAEAEAPK 或者由其组成,所述 B- 链是 B- (B1-B29) ,所述微型 C- 肽的序列是 AAK ,且所述 A- 链是 A- (A1-A21)
本文中使用的术语“前体”表示非成熟形式的胰岛素分子。在一个实施方案中,术语“前体”表示需要一些进一步加工才能变成成熟形式的胰岛素分子。本文中使用的术语“成熟”表示胰岛素分子的活性形式。在一个实施方案中,胰岛素前体包含 A- 链和 B- 链,其中所述 A- 链和所述 B- 链不仅 通过二硫键而且通过一个或几个其它肽序列连接到一起。在一个实施方案中,所述胰岛素前体是或包含所谓的胰岛素原样融合蛋白,后者由间隔物 (EEAEAEAPK) 和随后的通过微型 C- AAK A- (A1-A21) 连接的 B- (B1-B29) 组成。
本发明的发明人令人惊讶地发现,本发明的被置换的胰岛素从宿主细胞有效地表达。实际上,已经设计了共 43 个核酸序列并将它们转化进酵母细胞中,所述 43 个核酸序列编码 desB30 人胰岛素的 43 种可能变体,每种变体携带一个不同的置换半胱氨酸。结果是,小于半数的具有在 B- 链中的修饰的类似物具有通过反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 可测量的表达收率。尽管大部分具有在 A- 链中的半胱氨酸修饰的类似物被表达, A- B- 链两者的收率通常较低。一些类似物不可从基质辅助的激光解吸电离 - 飞行时间质谱法 (MALDI-TOF MS) 的谱检测到,这表示,它们要么没有表达,要么具有低于检测限的表达收率:这是具有半胱氨酸置换 A16C B11C B15C B22C B23C 的类似物的情况。
总之, 8 种类似物前体以令人满意的收率表达。所述 8 种前体是具有下述半胱氨酸置换之一的类似物的前体: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C 。在酵母细胞中,这 8 种类似物以相对于人胰岛素 (HI) 12.5% 的收率表达。
一些表达的类似物前体从步骤 (i) 表达,这样的前体的一部分携带在置换半胱氨酸的巯基上的修饰。这样的修饰可以是共价二聚体形成、半胱氨酸部分的连接、谷胱甘肽部分的连接或其它未鉴别的修饰。这样的修饰前体相对于表达的前体的总量的比例随类似物不同而异。类似物 A18C A19C A21C 表现出未修饰前体相对于表达的前体的总量的最高比例。表达较高比例的修饰前体的类似物,例如 A10C A14C A15C B25C B27C ,还可以在还原步骤以后使用,以便减少修饰前体的比例。
在另一个方面,本发明涉及用于生产具有选自下述的半胱氨酸置换的人胰岛素或其类似物的方法: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C 。在一个实施方案中,本发明涉及用于生产具有选自下述的半胱氨酸置换的人胰岛素前体或其类似物前体的方法: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
在一个实施方案中,所述方法包括下述步骤:
(i) 培养宿主细胞,所述宿主细胞包含编码被置换的胰岛素的前体的核酸序列;和
(ii) 将所述前体转化成本发明的成熟的被置换的胰岛素。
步骤 (i) 和它的不同实施方案如前面所公开。
在一个实施方案中,对含有步骤 (i) 的胰岛素前体的培养基进行所述转化步骤 (ii) 。在另一个实施方案中,对除去宿主细胞以后的步骤 (i) 的培养基,例如对离心以后的无细胞上清液,进行所述转化步骤 (ii)
在另一个实施方案中,在所述转化步骤 (ii) 之前,进行从培养基中分离步骤 (i) 的胰岛素前体的步骤。这可以根据已知技术来实现。
在另一个实施方案中,在所述转化步骤 (ii) 之前,将所述前体浓缩、纯化或部分纯化,例如通过穿过阳离子交换柱的捕获步骤。
步骤 (ii) 的转化的目的是,将步骤 (i) 的胰岛素前体转化成成熟的胰岛素。转化方法的非限制性例子包括:借助于胰蛋白酶或借助于水解无色杆菌( Achromobacter lyticus )蛋白酶 (ALP) 的酶促转化。在一个实施方案中,在有 L- 苏氨酸酯存在下使用 ALP ,随后通过碱或酸水解将胰岛素类似物的苏氨酸酯转化成胰岛素类似物,如在美国专利号 4,343,898 4,916,212 的说明书中所述。
在一个实施方案中,通过用水解无色杆菌蛋白酶消化,将步骤 (i) 的前体转化成成熟的胰岛素类似物。所述 ALP 酶在赖氨酸残基后面切割所述前体。结果是,间隔物和 C 肽被从 胰岛素分子切掉。 A- 链和 B- 链仅通过 二硫键相连。在其中胰岛素原样融合蛋白包含如以前公开的 EEAEAEAPK 间隔物和 AAK 微型 C- 肽的实施方案中, ALP 在间隔物的赖氨酸残基后面、微型 C- 肽的赖氨酸残基后面和赖氨酸 B29 后面切割,产生 des(B30) 被置换的胰岛素。如果需要的话,可以根据已知方法,随后在位置 B30 处添加氨基酸残基。
在一个实施方案中,在 4-10 范围内的 pH ALP 酶进行所述转化步骤 (ii) 。在另一个实施方案中,在 8.5-9.5 9-9.5 范围内的 pH 进行,因为这是 ALP 表现出它的最适消化活性的范围。
已经观察到,本发明的被置换的胰岛素对二硫键混乱是敏感的,所述二硫键混乱是在高 pH 范围(诸如 pH 9-9.5 或左右)在还原的半胱氨酸和二硫键之间的巯基 - 二硫键交换,从而导致某种程度的二硫键错配或某种程度的降解。这是由于游离巯基和额外半胱氨酸在胰岛素中的存在。尽管当在高 pH (此时 ALP 显示出最适活性)进行转化时可能取回一定百分比的成熟的胰岛素类似物,发明人令人惊讶地发现了会提供 ALP 消化活性和胰岛素前体稳定性之间的最适平衡的 pH 范围。因此,在本发明的另一个实施方案中,在 4-8.5 4-8 4-7.5 4-7 4.5-6.5 5-6 范围内的 pH 或在 pH 5.5 用酶 ALP 进行转化步骤 (ii) 。由于该更高的敏感性,根据该特定实施方案的选择的 pH 范围简化和优化步骤 (ii) 的转化过程。它允许所述消化足够快速地进行,伴随具有游离巯基的类似物发生可接受的低损失。
在另一个方面,本发明涉及用于生产人胰岛素衍生物的方法,所述人胰岛素衍生物包含具有选自下述的半胱氨酸置换的人胰岛素或 desB30 人胰岛素: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C ,且其中所述置换半胱氨酸被进一步聚乙二醇化。
在一个实施方案中,所述方法包括下述步骤:将聚乙二醇分子连接到人胰岛素类似物或其前体的置换半胱氨酸上,所述人胰岛素类似物和前体如上所定义。
在一个实施方案中,所述方法包括下述步骤:
(i) 培养宿主细胞,所述宿主细胞包含编码人胰岛素前体或 desB30 人胰岛素前体的核酸序列;
(ii) 将步骤 (i) 的胰岛素前体转化成成熟的胰岛素;和
(iii) 使步骤 (ii) 的转化的胰岛素与 PEG 分子反应。
步骤 (i) (ii) 和它们的不同实施方案如前面所公开。
在步骤 (iii) 中,使 PEG 分子的一个接头与胰岛素类似物的置换半胱氨酸的游离巯基反应和共价连接,从而产生步骤 (ii) 的被置换的胰岛素的聚乙二醇化的衍生物。
“聚乙二醇化”、“ PEG 分子”和接头的定义和范围如前面关于本发明的胰岛素衍生物所定义。
在一个实施方案中,通过 RP-HPLC 分离和纯化得到的胰岛素衍生物。在另一个实施方案中,将它进一步低压冻干。
在一个实施方案中,所述聚乙二醇化步骤 (iii) 在转化步骤 (ii) 之后。将 PEG 分子加入步骤 (ii) 的胰岛素类似物中并与其一起温育。
在另一个实施方案中,所述聚乙二醇化步骤在转化步骤之前。因而,在该实施方案中,本发明的方法包括下述步骤:
(i) 培养宿主细胞,所述宿主细胞包含编码人胰岛素前体或 desB30 人胰岛素前体的核酸序列;
(ii) 使步骤 (i) 的胰岛素前体与 PEG 分子反应;和
(iii) 将步骤 (ii) 的聚乙二醇化的胰岛素前体转化成成熟的胰岛素衍生物。
这特别地、但不仅涉及非常易于降解的胰岛素类似物,诸如类似物 A19C
在另一个实施方案中,所述聚乙二醇化步骤和还原步骤在所谓的一锅反应中进行。当从步骤 (i) 表达胰岛素前体,其中一部分这样的前体携带置换半胱氨酸的巯基上的修饰时,应用该实施方案。这适用于,例如,但不仅限于, B25C 人胰岛素类似物的二聚体,以便将二聚体还原成单体。
在一个实施方案中,术语“一锅”反应是指,将反应的所有组分同时或顺序地加入同一个锅中。
在一个实施方案中,所述还原和聚乙二醇化一锅反应在步骤 (iii) 的转化之前进行。
在一个实施方案中,所述还原和聚乙二醇化一锅反应如下进行:将前体形式的目标胰岛素类似物与 TCEP ( (2- 羧乙基 ) ) 混合,并进一步将反应化合物加入所述类似物 -TCEP 混合物中。
在一个实施方案中,在将胰岛素类似物与 TCEP 混合之前,将盐加入胰岛素类似物中和 / 或加入 TCEP 中。在一个实施方案中,所述盐是 NaOAc ( 醋酸钠 )
在一个实施方案中,所述 TCEP 是固定化的 TCEP ,并在与胰岛素类似物混合之前用缓冲液平衡。在一个实施方案中,所述缓冲液包含盐,诸如 NaOAc
在一个实施方案中,所述 TCEP 和所述胰岛素类似物一起反应,然后将反应性化合物加入所述混合物中,并与所述胰岛素类似物反应。在一个实施方案中,所述与加入的反应性化合物的反应进行 45 分钟。
在一个实施方案中,所述反应性化合物是马来酰亚胺相关化合物。在一个实施方案中,所述反应性的马来酰亚胺相关化合物是 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM) 分子或 MM(PEG) 分子,所述 MM(PEG) 分子包括如上定义的 MM(PEG)n
本发明涵盖下述非限制性的实施方案:
实施方案 1 :人胰岛素类似物,其包含具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或 desB30 人胰岛素: A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C
实施方案 2 :根据实施方案 1 所述的人胰岛素类似物,其具有一个且仅一个选自 A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C 的半胱氨酸置换。
实施方案 3 :根据前述实施方案中的任一个所述的人胰岛素类似物,其中所述半胱氨酸置换是 A21C 或是 B25C
实施方案 4 :根据前述实施方案中的任一个所述的人胰岛素类似物,其中所述类似物是或包含 desB30 人胰岛素。
实施方案 5 :人胰岛素类似物,其选自: A10C 人胰岛素, A14C 人胰岛素, A15C 人胰岛素, A18C 人胰岛素, A19C 人胰岛素, A21C 人胰岛素, B25C 人胰岛素, B27C 人胰岛素, A10C,desB30 人胰岛素, A14C, desB30 人胰岛素, A15C, desB30 人胰岛素, A18C, desB30 人胰岛素, A19C, desB30 人胰岛素, A21C, desB30 人胰岛素, B25C, desB30 人胰岛素, B27C, desB30 人胰岛素, A10C 人胰岛素的二聚体, A14C 人胰岛素的二聚体, A15C 人胰岛素的二聚体, A18C 人胰岛素的二聚体, A19C 人胰岛素的二聚体, A21C 人胰岛素的二聚体, B25C 人胰岛素的二聚体, B27C 人胰岛素的二聚体, A10C, desB30 人胰岛素的二聚体, A14C, desB30 人胰岛素的二聚体, A15C, desB30 人胰岛素的二聚体, A18C, desB30 人胰岛素的二聚体, A19C, desB30 人胰岛素的二聚体, A21C, desB30 人胰岛素的二聚体, B25C, desB30 人胰岛素的二聚体,和 B27C, desB30 人胰岛素的二聚体。
实施方案 6 :根据前述实施方案中的任一个所述的人胰岛素类似物,其中所述类似物是呈前体的形式。
实施方案 7 :根据实施方案 6 所述的人胰岛素类似物,其中所述前体形式是或包含间隔物和随后的 B- (B1-B29) ,所述 B- 链通过微型肽连接至 A- (A1-A21)
实施方案 8 :根据实施方案 7 所述的人胰岛素类似物,其中所述间隔物具有肽序列 EEAEAEAPK ,且所述微型肽是微型 C- AAK
实施方案 9 :根据实施方案 1-5 中的任一个所述的人胰岛素类似物,其中所述类似物是呈成熟形式。
实施方案 10 :一种人胰岛素衍生物,其包含根据前述实施方案中的任一个所述的人胰岛素类似物,其中所述置换半胱氨酸被聚乙二醇化。
实施方案 11 :根据实施方案 10 所述的人胰岛素衍生物,其中 (PEG)n 分子经由接头与置换半胱氨酸共价连接,其中“ n ”是 1-12 之间的整数。
实施方案 12 :根据实施方案 11 所述的人胰岛素衍生物,其中“ n ”是 12 ,和 / 或所述接头是马来酰亚胺基团。
实施方案 13:. 根据实施方案 12 所述的人胰岛素衍生物其中所述置换半胱氨酸与甲基聚乙二醇马来酰亚胺分子 MM(PEG)n 共价连接,其中“ n ”是在 1-12 8-12 范围内的整数,或“ n ”是 12
实施方案 14 :根据实施方案 13 所述的人胰岛素衍生物,所述人胰岛素衍生物选自: A10C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A14C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A15C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A18C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A19C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A21C-MM(PEG)12 人胰岛素、 B25C-MM(PEG)12 人胰岛素、 B27C-MM(PEG)12 人胰岛素、 A10C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A14C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A15C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A18C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A19C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素、 B25C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素和 B27C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素。
实施方案 15 :人胰岛素衍生物,其包含根据实施方案 1-9 所述的人胰岛素类似物,其中所述置换半胱氨酸与 N- 乙基马来酰亚胺分子 (NEM) 共价连接。
实施方案 16 :根据实施方案 15 所述的人胰岛素衍生物,所述人胰岛素衍生物选自: A10C-NEM 人胰岛素、 A14C-NEM 人胰岛素、 A15C-NEM 人胰岛素、 A18C-NEM 人胰岛素、 A19C-NEM 人胰岛素、 A21C-NEM 人胰岛素、 B25C-NEM 人胰岛素、 B27C-NEM 人胰岛素、 A10C-NEM desB30 人胰岛素、 A14C-NEM desB30 人胰岛素、 A15C-NEM desB30 人胰岛素、 A18C-NEM desB30 人胰岛素、 A19C-NEM desB30 人胰岛素、 A21C-NEM desB30 人胰岛素、 B25C-NEM desB30 人胰岛素和 B27C-NEM desB30 人胰岛素。
实施方案 17 :根据实施方案 10-16 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其中所述衍生物是呈前体的形式。
实施方案 18 :根据实施方案 16 所述的人胰岛素衍生物,其中所述前体形式是或包含间隔物和随后的 B- (B1-B29) ,所述 B- 链通过微型肽与 A- (A1-A21) 连接。
实施方案 19 :根据实施方案 18 所述的人胰岛素衍生物,其中所述间隔物具有肽序列 EEAEAEAPK ,且所述微型肽是微型 C- AAK
实施方案 20 :根据实施方案 10-16 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其中所述衍生物是呈成熟形式。
实施方案 21 :根据实施方案 10-12 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其中所述衍生物选自: A21C 人胰岛素或 A21C, desB30 人胰岛素,所述胰岛素在置换半胱氨酸上被聚乙二醇化。
实施方案 22 :根据实施方案 10-14 17-21 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其中所述衍生物选自: A21C-MM(PEG)12 人胰岛素, A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素, A21C-MM(PEG)12 人胰岛素的前体, A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素的前体,或其二聚体。
实施方案 23 :根据实施方案 10-14 17-21 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其中所述衍生物选自: B25C-MM(PEG)12 人胰岛素, B25C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素, B25C-MM(PEG)12 人胰岛素的前体, B25C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素的前体,或其二聚体。
实施方案 24 :根据实施方案 22 23 中的任一个所述的人胰岛素衍生物,其呈前体形式,其中所述前体形式是或包含间隔物和随后的 B- (B1-B29) ,所述 B- 链通过微型肽与 A- (A1-A21) 连接。
实施方案 25 :根据实施方案 24 所述的人胰岛素衍生物,其中所述间隔物具有肽序列 EEAEAEAPK ,且所述微型肽是微型 C- AAK
实施方案 26 :制备人胰岛素类似物的方法,所述方法包括下述步骤:培养宿主细胞,所述宿主细胞编码如在实施方案 1-8 中定义的人胰岛素类似物的前体。
实施方案 27 :根据实施方案 26 所述的方法,其中所述宿主细胞是酵母细胞。
实施方案 28 :根据实施方案 26 27 所述的方法,所述方法另外包括下述步骤:将所述前体转化成成熟的人胰岛素类似物。
实施方案 29 :根据实施方案 28 所述的方法,其中用水解无色杆菌蛋白酶操作所述转化步骤。
实施方案 30 :根据实施方案 29 所述的方法,其中在 4-10 范围内的 pH 用水解无色杆菌蛋白酶操作所述转化步骤。
实施方案 31 :根据实施方案 30 所述的方法,其中在 8.5-9.5 9-9.5 范围内的 pH 用水解无色杆菌蛋白酶操作所述转化步骤。
实施方案 32 :根据实施方案 30 所述的方法,其中在 4-8.5 4-8 4-7.5 4-7 4.5-6.5 5-6 范围内的 pH 或在 5.5 pH 用水解无色杆菌蛋白酶操作所述转化步骤。
实施方案 33 :制备人胰岛素衍生物的方法,所述方法包括下述步骤:将聚乙二醇分子连接到如在实施方案 1-9 中的任一个中定义的人胰岛素类似物的置换半胱氨酸上。
实施方案 34 :制备人胰岛素衍生物的方法,所述方法包括下述步骤:将聚乙二醇分子经由接头或 NEM 化合物连接到如在实施方案 1-9 中的任一个中定义的人胰岛素类似物的置换半胱氨酸上。
实施方案 35 :根据实施方案 34 所述的方法,其中所述聚乙二醇分子是 MM(PEG)n 分子,其中“ n ”是 1-12 1-8 的整数,或“ n ”是 12
实施方案 36 :根据实施方案 33-35 中的任一个所述的方法,其中所述连接在人胰岛素类似物的前体上进行。
实施方案 37 :根据实施方案 33-35 中的任一个所述的方法,其中所述连接在成熟的人胰岛素类似物上进行。
实施方案 38 :根据实施方案 37 所述的方法,其中所述人胰岛素类似物是 A19C 人胰岛素或 A19C, desB30 人胰岛素。
实施方案 39: 根据实施方案 33-38 中的任一个所述的方法,其中所述聚乙二醇化步骤和还原步骤在所谓的一锅反应中进行。
实施方案 40 :根据实施方案 39 所述的方法,其中所述人胰岛素类似物携带在置换半胱氨酸的巯基上的修饰。
实施方案 41: 根据实施方案 40 所述的方法,其中所述在置换半胱氨酸的巯基上的修饰是谷胱甘肽化( gluthationylation )、半胱氨酰化、烷基化或二聚化,或其中所述人胰岛素类似物是 B25C 人胰岛素的二聚体或 B25C, desB30 人胰岛素的二聚体。
实施方案 42 :根据实施方案 39-41 中的任一个所述的方法,其中所述还原和聚乙二醇化一锅反应在人胰岛素类似物的前体上进行。
实施方案 43 :根据实施方案 39-42 中的任一个所述的方法,其中所述还原和聚乙二醇化一锅反应如下实现:将优选呈前体形式的胰岛素类似物与 TCEP ( (2- 羧乙基 ) ) 混合,和进一步将 PEG 化合物加入所述类似物 -TCEP 混合物中。
实施方案 44 :根据实施方案 43 所述的方法,其中在将胰岛素类似物与 TCEP 混合之前,将盐加入胰岛素类似物中和 / 或加入 TCEP 中。
实施方案 45 :根据实施方案 44 所述的方法,其中所述盐是 NaOAC ( 醋酸钠 )
实施方案 46 :根据实施方案 43-45 中的任一个所述的方法,其中所述 TCEP 是固定化的 TCEP ,并在与胰岛素类似物混合之前用缓冲液平衡。
实施方案 47 :根据实施方案 46 所述的方法,其中所述缓冲液包含盐,诸如醋酸钠。
实施方案 48 :根据实施方案 43-47 中的任一个所述的方法,其中所述 TCEP 和所述胰岛素类似物一起反应,然后将 PEG 化合物加入所述混合物中。
实施方案 49 :根据实施方案 43-48 中的任一个所述的方法,其中所述与加入的 PEG 化合物的反应进行 45 分钟。
实施方案 50 :根据实施方案 43-49 中的任一个所述的方法,其中所述 PEG 化合物是马来酰亚胺相关化合物。
实施方案 51 :根据实施方案 43-50 中的任一个所述的方法,其中所述 PEG 化合物是 MM-PEG 分子或 MM(PEG)n 分子,其中“ n ”是 1-12 1-8 的整数,或“ n ”是 12
实施方案 52 :根据实施方案 43-50 中的任一个所述的方法,其中使用 N- 乙基马来酰亚胺 (NEM) 分子替代 PEG 化合物。
实施方案 53 :核酸序列,其编码根据实施方案 1-8 中的任一个所述的人胰岛素类似物。
实施方案 54 :根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物作为制备药物的方法中的起始原料或中间体化合物的用途。
实施方案 55 :根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物作为制备新颖的胰岛素衍生物的方法中的起始原料或中间体化合物的用途。
实施方案 56 :根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物用于将其它化学化合物结合到所述人胰岛素类似物的置换半胱氨酸上的用途,所述其它化学化合物是例如 PEG 化合物或 NEM 分子。
实施方案 57 :根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物在制备人胰岛素衍生物、和尤其是在实施方案 10-25 中的任一个中定义的人胰岛素衍生物的方法中的用途。
实施方案 58 :用作药物的根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物或根据实施方案 10-25 中的任一个所述的人胰岛素衍生物。
实施方案 59 :用于治疗糖尿病的根据实施方案 1-9 中的任一个所述的人胰岛素类似物或根据实施方案 10-25 中的任一个所述的人胰岛素衍生物。
实施方案:本发明涉及核酸序列,其编码如本文中定义的人胰岛素类似物或其前体。
实施方案 60 :宿主细胞,其编码如在实施方案 1-8 中定义的人胰岛素类似物的前体。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容显而易见的其它问题。
实施例
a 质粒的构建和表达
进行胰岛素的系统性半胱氨酸扫描,在 desB30 胰岛素中的所有位置上引入单突变,将共 43 种可能的胰岛素变体(不包括 B29Lys )用于以后的加工中。根据众所周知的技术,通过重叠聚合酶链式反应 (PCR) ,在胰岛素编码序列中引入突变。材料、载体、株系和构建如前所述 (Kjeldsen 等人 , 1999; Kjeldsen 等人 , 1996; Kristensen 等人 , 1997)
在酿酒酵母菌株 MT663 中将胰岛素前体表达为胰岛素原样融合蛋白,后者由间隔物 (EEAEAEAPK) 和随后的通过微型 C- AAK A- (A1-A21) 连接的 B- (B1-B29) 组成。在 5 ml 培养物中表达所述前体。培养基和条件是本领域中已知的。
使用人胰岛素 (HI) 作为外标,通过反相高效液相色谱法 (RP-HPLC) 基于峰面积确定每种胰岛素前体的表达收率。结果报告在图 1 ( 1) 中。图 1 的图代表了携带置换 Cys 的类似物的每种胰岛素前体的表达收率,表示为人胰岛素表达水平的百分比。图 1 a 涉及在 A- 链中具有置换 Cys 的类似物,图 1 b 涉及在 B- 链中具有置换 Cys 的类似物。 x- 轴表示每种胰岛素类似物的置换位置 (A1 A2 A3 B1 B2 ) y- 轴表示表达收率。
这些结果表明,大部分具有在 A- 链中引入的 Cys 的类似物 ( 1 a) 被表达,且几乎半数的具有在 B- 链中的修饰的类似物 ( 1 b) 具有通过 RP-HPLC 可测量的收率。总体上,表达了约 60% 的构建的类似物,尽管在第 7 个引入的 Cys 3 个现有二硫键之间存在高二硫键混乱机会。用星号指示的类似物表现出低表达收率,且仅通过 MALDI MS 检测到,通过 HPLC 没有检测到。在表达的 60% 中,共 8 种类似物 (A10C A14C A15C A18C A19C A21C B25C B27C) 具有相对于 HI 12.5% 的收率,这使得它们成为聚乙二醇化的候选物。
b 适合聚乙二醇化的类似物的选择
选择类似物 A10C desB30 A14C desB30 A15C desB30 A18C desB30 A19C desB30 A21C desB30 B25C desB30 B27C desB30 ,用于进一步分析修饰前体在所有表达的前体中的分布。
因此,在一式两份地 (A10C, A14C, A15C, A18C, A19C B25C) 和一式三份地 (A21C B27C) 同样处理的小 200ml 培养物中,在酵母浸出物蛋白胨葡萄糖 (Yeast Extract Peptone Dextrose YPD) 培养基中发酵根据本发明的胰岛素类似物: A10C, desB30 人胰岛素, A14C, desB30 人胰岛素, A15C, desB30 人胰岛素, A18C, desB30 人胰岛素, A19C, desB30 人胰岛素, A21C, desB30 人胰岛素, B25C, desB30 人胰岛素和 B27C, desB30 人胰岛素。通过离心和倾析,除去细胞,并将上清液酸化至 pH 3 或刚好低于 3 。通过穿过阳离子交换柱的捕获步骤部分地纯化和浓缩前体。
通过 LC/MS ( 液相色谱法 / 质谱法 ) 分析类似物,并根据已知技术基于 214nm 紫外 (UV) 迹线的面积来计算每种前体形式的相对量。
结果报告在图 2 ( 2) 中。图 2 的图代表,对于每种试验的类似物(沿着 x- 轴指示 Cys 置换位置),不同修饰前体的比例,表示为表达的类似物的总量的百分比 (y- ) 。黑色条代表未修饰的前体,也被称为游离前体,具有垂直条纹的白色条代表半胱氨酰基化的前体,具有水平条纹的白色条代表谷胱甘肽化的前体,具有点的白色条代表二聚体前体,和具有方格的白色条代表含有其它未鉴别的修饰的前体。
2 表明,修饰前体在表达的前体的总量中的百分比和修饰的性质随类似物不同而异。前体的形式在未修饰的置换半胱氨酸 ( 即未修饰的前体 ) 至半胱氨酰基化的、谷胱甘肽化的变体和 / 或变体的共价二聚体的混合物之间变化。
2 也表明,类似物 A18C desB30 A19C desB30 A21C desB30 人胰岛素类似物呈现最高的未修饰的前体比例,超过 20% 。这些类似物允许直接聚乙二醇化步骤
从表达较小比例的未修饰的化合物的前体开始,可以如下改进进一步聚乙二醇化的效率:先进行涉及第 7 个半胱氨酸的二硫键的选择性还原步骤,以便暴露游离巯基。根据在实施例 (d) 中报告的方法,可以得到选择性还原。
由于本发明的胰岛素前体对碱性 pH 的高敏感性,对 ALP 切割过程中的 pH 进行了优化,结论是,在 pH 5.5 (在离子交换纯化步骤中使用的洗脱缓冲液的 pH ),所述消化足够快速地进行,伴随具有游离巯基的衍生物发生可接受的低损失。已经观察到,前体 A19C 在该 pH 是不稳定的,从而导致显著降解。因此,选择该类似物用于烷基化,使得在 ALP 消化之前进行烷基化反应成为优选的。
基于未修饰的衍生物的表达收率和降解稳定性, A21C, desB30 胰岛素类似物是用于进一步聚乙二醇化研究的良好候选物, A18C, desB30 A19C, desB30 类似物也是如此。 A10C, A14C, A15C, B25C B27C, desB30 类似物也是用于具有还原步骤的进一步聚乙二醇化的良好候选物。
c 纯化和聚乙二醇化
3L 培养物中发酵胰岛素类似物 A21C, desB30 人胰岛素。将无细胞的培养物上清液酸化至 pH 3 或刚好低于 3 ,并通过穿过阳离子交换柱的捕获步骤部分地纯化和浓缩前体。洗脱后,在 pH 5.5 的缓冲液中发现了类似物。然后通过基质结合的 ALP 将前体转化成双链的成熟 A21C, desB30 人胰岛素,并通过 MALDI-TOF-MS ( 基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法 ) 验证转化。在 ALP 消化后,以 1:25 MM(PEG)12: 类似物摩尔比,用过量的 100 mM MM(PEG)12 水溶液在混合下在室温将类似物聚乙二醇化,历时 3 天。反应完成后,通过 LC/MS 分析样品。
3 显示了在用 MM(PEG)12 烷基化之前 ( 3 a) 和之后 ( 3 b) ,得自 A21CDesB30 类似物和衍生物的 LC/MS 测定的 UV 色谱图,其中按 mAU ( 毫吸光度单位 ) 表示从 LC/MS 检测到的信号的强度 (y- ) ,作为按分钟计的时间 (x- ) 的函数。与不同衍生物和试剂对应的峰如下: 1 :谷胱甘肽化的 A21C-PEG 2 :半胱氨酰基化的 A21C-PEG 3 :未修饰的 A21C-PEG 4 :试剂, 5 :烷基化的 A21C-PEG1 6 :烷基化的 A21C-PEG2 PEG1 PEG2 表示所述化合物的 2 种对映异构形式。在烷基化以后,代表未修饰的类似物的峰 3 已经减少,且可以看到 2 个具有更高保留时间的新峰 5 6 ,二者具有与含有单个聚乙二醇化的未修饰的类似物相对应的质量。对比与 MM(PEG)12 反应之前和之后,马来酰亚胺化合物似乎与具有游离巯基的类似物反应。峰 5 6 之间的保留时间的差异可由 2 种异构形式的存在来解释,所述异构形式可能由新手性中心在硫醚处的形成造成。通过 V8 酶消化分析以及 MS/MS ( 串联质谱法 ) 分析 ( 数据未显示 ) ,已经排除了在现有键和第 7 Cys 之间的二硫键混乱。
通过 Cys 化学进行的烷基化似乎是非常化学选择性的,且观察到具有游离巯基的衍生物的接近 100% 的转化率。
烷基化以后,立即使用三氟乙酸 (TFA) 缓冲液系统通过 RP-HPLC 分离和纯化不同的衍生物。将级分低压冻干,并通过 UV 220nm 在中性和酸性 pH 测量纯度。
d 使用固定化的TCEP (三(2-羧乙基)膦)在一锅中还原和聚乙二醇化
当表达 胰岛素前体时,一部分这样的前体携带在置换半胱氨酸的巯基上的修饰,在所谓的一锅反应中与还原步骤一起进行聚乙二醇化步骤。例如,这用于 B25C 人胰岛素类似物的二聚体,以便将二聚体还原成单体。
制备胰岛素类似物 A10C, desB30 人胰岛素、 A14C, desB30 人胰岛素、 A15C, desB30 人胰岛素、 A18C, desB30 人胰岛素、 A19C, desB30 人胰岛素、 A21C, desB30 人胰岛素、 B25C, desB30 人胰岛素和 B27C, desB30 人胰岛素的前体,并使用如在实施例 (b) 中解释的阳离子交换色谱法部分地纯化。
在与 1M NaOAc ( 醋酸钠 ) pH 5.5 1:1 混合的洗脱缓冲液 ( 得自阳离子交换色谱法 ) 中,平衡固定在琼脂糖凝胶 (Thermo Scientific®) 上的 TCEP ( (2- 羧乙基 ) )
然后,将 100 μ l TCEP ( 除去了平衡缓冲液 ) 30 μ l 1M NaOAc pH 5.5 )和 25 μ l 如上定义的部分地纯化的类似物前体混合。通过在室温反转 15 min 来混合样品,以便悬浮凝胶,然后加入 5 μ l 在水中的 10mM MM(PEG)12 ( 100mM NEM) 。然后通过在室温反转另外 45 min 来混合样品,然后加入 60 μ l 10% TFA (2,2,2- 三氟乙酸或三氟乙酸 ) 以确保 pH 低于 3
在该步骤过程中,通过 TCEP 还原修饰前体,以便增加未修饰的前体的比例,随后在相同锅中进行聚乙二醇化。
通过离心,从 TCEP 凝胶中分离得到的样品,并在 LC/MS 上分析以鉴别成功地聚乙二醇化的前体的存在。每种试验的类似物的保留时间和质量显示在表 1 中。
所述 LC 方法使用 Dionex®Ultimate®3000 液相色谱法,使用 0.05% TFA 作为缓冲液 A ,并使用 0.04% TFA+80% 乙腈( acetonitril (w/w) 作为缓冲液 B ,在 60 ℃温度。使用的捕集柱是得自 Agilent®Technologies Zorbax®XDB-C18, 3.5 μ m, 35X0.3mm 柱,使用的分析柱是得自 Agilent®Technologies Zorbax®XDB-C18, 3.5 μ m, 150X0.3mm 柱。
所述 MS 方法使用得自 ThermoFisher®Scientific San Jose, CA )的 LTQ Orbitrap®XL 仪器。为 MS 选择的质量范围设定为 100 2000 m/z (m/z 代表质量 m 和电荷 z 之比 )
在下文表 1 中报告了捕集柱使用的洗脱缓冲液参数:梯度洗脱缓冲液的性质 ( 含有特定百分比的缓冲液 B 的缓冲液 A) ( 右列 ) ,洗脱缓冲液随着时间 ( 保留时间, min) ( 左列 ) 的流量 ( μ l/min) ( 中间列 )
1:
Figure 925058DEST_PATH_IMAGE013
在下文表 2 中报告了分析柱使用的洗脱缓冲液参数:梯度洗脱缓冲液的性质 ( 含有特定百分比的缓冲液 B 的缓冲液 A) ( 右列 ) ,洗脱缓冲液随着时间 ( 保留时间, min) ( 左列 ) 的流量 ( μ l/min) ( 中间列 )
2
Figure 354903DEST_PATH_IMAGE014
下文表 3 显示了在 2 个柱之间转换阀的定时,所述阀控制洗脱缓冲液穿过捕集柱和分析柱的途径。
3:
Figure 596528DEST_PATH_IMAGE015
结果报告在下文表 4 :
Figure 574716DEST_PATH_IMAGE016
4
该表 4 显示了每种预期的类似物前体化合物的理论单同位素质量( Da )与有效地洗脱的化合物的实测单同位素质量的对比。理论质量和实测质量之间的一致性指示,还原 - 聚乙二醇化反应已经成功。 RT 表示每种化合物的洗脱时间,即当在 UV 迹线上出现峰时的时间 ( 数据未显示 ) 。它们中的一些由于手性中心而表现出 2 个峰,正如以前关于 A21C 化合物所显示的 ( 参见图 3)
e 受体结合测定
为了研究所述类似物在引入 Cys 和添加 PEG 链以后 是否保留效能,在如本领域描述的闪烁亲近测定 (SPA) 中,对从 BHK ( 幼仓鼠肾 ) 细胞纯化的胰岛素受体 A 同种型进行体外胰岛素受体 (IR) 竞争结合测定。试验了成熟的聚乙二醇化的 A21C, desB30 2 种对映异构形式 A21C-PEG1 A21C-PEG2 。还试验了成熟的 B25C-NEM desB30 胰岛素衍生物的 2 种对映异构形式 B25C-NEM1 B25C-NEM2 。如在实施例 (c) 中所述得到所述化合物,在 HPLC 上纯化和冷冻干燥。
使用胰岛素类似物和 [125I]TyrA14- 标记的胰岛素在 SPA 测定中的结合竞争,确定结合受体亲和力。每个平板含有人胰岛素 (HI) 标准品 ( 实验重复 4 ) 和试验类似物 ( 实验重复 4 ) 。这重复 3 次。根据如本领域中描述的 4 参数数理逻辑模型分析数据,并相对于人胰岛素标准品表示亲和力,如下述数学式所定义:
数学式 1: [(IC50( 胰岛素 ) /IC50( 类似物 ) ) * 100%]
结果表明, A21C-PEG1 A21C-PEG2 分别具有 10% ( ± 1.7) 11% ( ± 1.8) 的平均相对结合效能,标准差显示在括号中。二者之间没有统计显著差异。手性中心在 PEG 链和胰岛素分子之间的接头中的存在,对结合性质没有影响。因而,尽管位置 A21 从天冬酰胺改变为半胱氨酸残基和添加了 12 单位的 PEG 链,所述类似物仍然保留了相当部分的结合亲和力。
结果还表明, B25C-NEM1 B25C-NEM2 desB30 胰岛素衍生物具有相对于 HI 0.24% 的相对结合效能。因而,尽管在胰岛素衍生物上存在改变,它仍然保留了它的一部分结合亲和力。
f 代谢效能的确定
为了研究 2 种立体异构体 A21C-PEG1 A21C-PEG2 是否同样能够产生体外应答,根据已知技术,通过脂肪生成确定了它们的代谢效能。如在实施例 (c) 中所述得到所述化合物。
因此,使用从 SPRD 大鼠分离的原代大鼠脂肪细胞。除去脂肪垫,并置于含有 Hepes 缓冲液、 Krebs 缓冲液、 0.1% HSA ( 人血清白蛋白 ) 、胶原酶和葡萄糖的降解缓冲液中。将所述细胞在 37 ℃剧烈摇动 1 h ,过滤细胞混悬液,洗涤 2 次,并再悬浮于含有 Hepes 缓冲液、 Krebs 缓冲液和 0.1% HSA 的温育缓冲液中。在 96- PicoPlates 中分布 100 μ L 等分试样,并在轻轻摇动下与 10 μ L 含有 D-[3-3H] 葡萄糖和葡萄糖的葡萄糖溶液和 10 μ L 递增 浓度的人胰岛素 ( 用作参照 ) A21C-MM(PEG12) 胰岛素类似物(一种或另一种对映异构形式)一起在 37 ℃温育 2 h 。通过加入 150 μ L MicroScint®E (Packard®) ,停止温育,并在 TopCount®NXT (PerkinElmer®Life Science) 中计数每个板的掺入放射性的量。
根据 4- 参数数理逻辑模型来分析数据,并相对于人胰岛素标准品来表示亲和力,如数学式 1 所定义 ( 参见实施例 (e)) 。两种形式都产生了应答,反映了 A21C-PEG1 A21C-PEG2 分别具有 7.57% ( ± 2.0) 10.32% ( ± 3.2) 的受体亲和力,并且没有观察到二者之间的统计显著差异。
g A21C-MM(PEG12) desB30,人胰岛素在Wistar大鼠中的体内作用
在体内试验了异构体之一 A21C-PEG1 ,以研究它的降低血液中的葡萄糖的能力。给 Wistar 大鼠静脉内施用 2 个剂量,将所述类似物与人胰岛素进行了对比。
因此,在试验物施用之前的时间点 -35 min ,使用 2 ml/kg Hypnorm-Dormicum (0.081 mg/ml 枸橼酸芬太尼和 1.25 mg/ml 咪达唑仑 ) 作为初次剂量,麻醉 29 只雄性进食的 Wistar 大鼠 (253-319 g) ,并在试验物施用之前的时间点 -5 min ,施用另外 1 ml/kg ,然后每 45 分钟施用 1 ml/kg (4 )
将大鼠分成 5 组,给 4 组中的 6 只大鼠施用人胰岛素和 A21C-MM(PEG)12 desB30 人胰岛素,给第 5 组中的 5 只大鼠施用媒介物。通过静脉内注射在动物的尾静脉中施用媒介物 (5 mM 磷酸盐缓冲液 , 140 mM NaCl, 70 ppm 聚山梨酯 20, pH 7.4)(1 ml/kg) 或衍生物 A21C-MM(PEG)12 desB30 (1.2 nmol/kg 3.6 nmol/kg) 或人胰岛素 (1.2 nmol/kg 3.6 nmol/kg) 。在给药之前的时间 -15 min 0 min 和给药之后的时间 3 7 15 30 60 120 180 240 分钟,通过穿刺尾巴尖部中的毛细血管,将用于确定全血葡萄糖浓度的血液样品收集在肝素化的 10µl 玻璃管中。使用 Biosen® 自动分析仪 (EKF Diagnostic®, 德国 ) ,通过固定化的葡萄糖氧化酶方法,测量在分析缓冲液 (500µl) 中稀释以后的血液葡萄糖浓度。
结果报告在图 4 中,其中表示了随胰岛素类似物或人胰岛素静脉内注射以后的时间 (x- 轴,分钟 ) ,大鼠中的血糖水平的差异 (y- 轴, mmol/L)
(○ ) 曲线对应于 1.2 nmol/kg 人胰岛素, ( ) 曲线对应于 3.6 nmol/kg 人胰岛素, ( ) 曲线对应于 1.2 nmol/kg A21C-PEG1 ( ) 曲线对应于 3.6 nmol/kg A21C-PEG1 ,且 ( ) 曲线对应于仅媒介物。所述值是各自重复 5-6 次的实验的平均值。
数据表明,所述类似物降低大鼠中的血糖水平,尽管没有达到与人胰岛素相同的程度。通过 ELISA 对在血浆中的平均保留时间 (MRT) 的估测表明了在低剂量从 5 min 31 min 与人胰岛素相比的增加。这意味着,本发明的胰岛素衍生物在施用后表现出与人胰岛素相比延长的半衰期。
尽管在本文中已经例证和描述了本发明的某些特征,本领域普通技术人员现在会明白许多修改、置换、变化和等效方案。因此,应当理解,所附权利要求意图涵盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和变化。
序列表
<110> Novo Nordisk A/S
<120> 包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物
<130> 8216.000
<160> 18
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A21C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Cys
20
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A21C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B25C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B25C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Cys Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A10C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 5
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1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A10C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 6
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1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
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<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A14C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 7
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20
<210> 8
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<220>
<223> A14C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A15C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 9
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20
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<220>
<223> A15C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 10
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<210> 11
<211> 21
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<220>
<223> A18C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 11
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20
<210> 12
<211> 29
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<213> 人工序列
<220>
<223> A18C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 12
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1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A19C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 13
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Cys Cys Asn
20
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A19C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 14
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B25C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 15
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B25C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Cys Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B27C, desB30人胰岛素的A-链
<400> 17
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> B27C, desB30人胰岛素的B-链
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Cys Pro Lys
20 25

Claims (15)

1.一种人胰岛素类似物,其包含具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或desB30人胰岛素:A10C、A14C、A15C、A18C、A19C、A21C、B25C、B27C。
2.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物,其中该半胱氨酸置换是A21C。
3.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物,其选自:A10C人胰岛素,A14C人胰岛素,A15C人胰岛素,A18C人胰岛素,A19C人胰岛素,A21C人胰岛素,B25C人胰岛素,B27C人胰岛素,A10C, desB30人胰岛素,A14C, desB30人胰岛素,A15C, desB30人胰岛素,A18C, desB30人胰岛素,A19C, desB30人胰岛素,A21C, desB30人胰岛素,B25C, desB30人胰岛素,B27C, desB30人胰岛素,及其二聚体。
4.一种人胰岛素衍生物,其包含如在权利要求1-3中定义的人胰岛素类似物,其中该置换半胱氨酸与甲基聚乙二醇马来酰亚胺分子(MM(PEG))或与N-乙基马来酰亚胺分子(NEM)共价连接。
5.根据权利要求4所述的人胰岛素衍生物,其选自:A10C-MM(PEG)12人胰岛素,A14C-MM(PEG)12人胰岛素,A15C-MM(PEG)12人胰岛素,A18C-MM(PEG)12人胰岛素,A19C-MM(PEG)12人胰岛素,A21C-MM(PEG)12人胰岛素,B25C-MM(PEG)12人胰岛素,B27C-MM(PEG)12人胰岛素,A10C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A14C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A15C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A18C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A19C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A21C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,B25C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素和B27C-MM(PEG)12 desB30人胰岛素,A10C-NEM人胰岛素,A14C-NEM人胰岛素,A15C-NEM人胰岛素,A18C-NEM人胰岛素,A19C-NEM人胰岛素,A21C-NEM人胰岛素,B25C-NEM人胰岛素,B27C-NEM人胰岛素,A10C-NEM desB30人胰岛素,A14C-NEM desB30人胰岛素,A15C-NEM desB30人胰岛素,A18C-NEM desB30人胰岛素,A19C-NEM desB30人胰岛素,A21C-NEM desB30人胰岛素,B25C-NEM desB30人胰岛素,和B27C-NEM desB30人胰岛素。
6.一种制备人胰岛素类似物的方法,所述方法包括下述步骤:培养宿主细胞,该宿主细胞包含编码如在权利要求1-3中定义的人胰岛素类似物的前体的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法,该方法另外包括下述步骤:将该前体转化成如在权利要求1-3中定义的成熟的人胰岛素类似物。
8.根据权利要求7所述的方法,其中在4-10范围内的pH用水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶操作该转化步骤。
9.一种制备如在权利要求4-5中定义的人胰岛素衍生物的方法,所述方法包括下述步骤:将聚乙二醇分子连接到如在权利要求1-3中定义的人胰岛素类似物或其前体的置换半胱氨酸上。
10.根据权利要求9所述的方法,其中该聚乙二醇分子的连接是在得自权利要求6所述的方法的人胰岛素类似物的前体上进行。
11.根据权利要求9所述的方法,其中该聚乙二醇分子的连接是在得自权利要求7或8所述的方法的成熟的人胰岛素类似物上进行。
12.根据权利要求9-11中的任一项所述的方法,其中该聚乙二醇分子的连接和还原步骤在所谓的一锅反应中进行。
13.根据权利要求1-3中的任一项所述的人胰岛素类似物在制备人胰岛素衍生物的方法中作为起始原料或中间体化合物的用途。
14.根据权利要求1-3中的任一项所述的人胰岛素类似物或根据权利要求4-6中的任一项所述的人胰岛素衍生物,其用作药物。
15.根据权利要求1-3中的任一项所述的人胰岛素类似物或根据权利要求4-6中的任一项所述的人胰岛素衍生物,其用于治疗糖尿病。
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