CN106478778A - 一种磷酸化多肽的固相合成方法 - Google Patents
一种磷酸化多肽的固相合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106478778A CN106478778A CN201610926856.0A CN201610926856A CN106478778A CN 106478778 A CN106478778 A CN 106478778A CN 201610926856 A CN201610926856 A CN 201610926856A CN 106478778 A CN106478778 A CN 106478778A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- maldi
- fmoc
- psd
- resin
- phase synthesis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Abstract
本发明公开一种磷酸化多肽的固相合成方法，包括以下具体步骤：选用2‑Cl‑Resin为起始载体，采用固相合成法，在活化剂和缩合剂的作用下，以Fmoc‑保护氨基酸为缩合原料，依次缩合磷酸化多肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，得到磷酸化多肽‑2‑Cl‑Resin；将磷酸化多肽‑2‑Cl‑Resin进行切割沉降反应，纯化并冻干，得到磷酸化多肽产品。本发明采用Fmoc固相合成法，采用不同的活化剂和缩合剂进行缩合反应，以及采用不同的洗涤方法洗涤多肽树脂，提高了缩合效率，经切割沉降、纯化得到磷酸化多肽产品。本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于多肽产品合成制备的技术领域，特别涉及一种磷酸化多肽的固相合成方法。
背景技术
磷酸化多肽序列：TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC，分子量：2288.08。
磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰，对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。生命活动与蛋白质的动态变化密切相关，很多情况下某些蛋白质的绝对量并不会发生明显变化，而是通过各种翻译后完成或改变其功能。在众多的蛋白质翻译后修饰中，磷酸化修饰时非常重要的一种，现今发现的所有蛋白质中超过30％可被磷酸化修饰。然而异常的磷酸化也是引起诸多疾病的起因，尤其是突变的蛋白激酶、磷酸酶可导致许多紊乱，很多天然毒素和病原体也是通过改变胞内蛋白的磷酸化状态来发挥它们的影响。丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化作用是一个可逆的蛋白修饰过程，它们参与调节无数的细胞活动，如受体信号转导、蛋白质缔合与分割、激活或抑制蛋白功能，甚至细胞的存活等。许多激素均是通过提高丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基的磷酸化状态来调节特异性酶的活性。
传统合成磷酸化多肽时需对磷酸根进行保护，在整个多肽链合成完毕后再进行脱保护，反应工艺复杂，且磷酸化多肽产品收率较低。本发明提供一种改进的磷酸化多肽合成方法，合成操作方便简单，反应条件温和，便于磷酸化多肽的快速合成制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸化多肽的固相合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产磷酸化多肽产品的广泛应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现
一种磷酸化多肽的固相合成方法，该固相合成方法包括以下具体步骤：
(1)选用2-Cl-Resin为起始载体，采用固相合成法，在活化剂和缩合剂的作用下，以Fmoc-保护氨基酸为缩合原料，依次缩合磷酸化多肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；
(2)将磷酸化多肽-2-Cl-Resin进行切割沉降反应，纯化并冻干，得到磷酸化多肽产品。
所述的起始氨基树脂为2-Cl-Resin，取代度为0.64mmol/g。
步骤(1)中所述缩合反应过程中以DIC/HOBT为活化剂和缩合剂，以DMF溶液洗涤多肽树脂，反应中氨基酸投料量为3倍所投树脂摩尔数，缩合反应时间为30-60min；以20％Pip/DMF溶液为脱保护剂，洗脱时间为20min。
步骤(1)中所述缩合反应过程中以HBTU/DIEA为缩合试剂，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗涤多肽树脂。
步骤(1)中所述Fmoc-保护氨基酸缩合顺序依次为：Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH、Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH，缩合反应温度为25℃。
步骤(2)中所述切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2体积比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次。
步骤(2)中所述纯化方法指采用高效液相色谱法纯化用C18色谱柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈为流动相，以B.Cone/％(2→55)，Time/min(0→30)的梯度进行多肽的分离提纯，冻干得到磷酸化多肽产品。
本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，以2-ClResin为固相载体，在缩合反应过程中采用不同的活化剂和缩合剂进行缩合反应，以及采用不同的洗涤方法洗涤多肽树脂，提高了缩合效率，经切割沉降、纯化得到磷酸化多肽产品。本发明大大缩短了反应时间，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。
实施例一
磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
1.2-Cl-Resin的溶胀
称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。
2.磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
磷酸化多肽-2-Cl-Resin为：
TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC-2-Cl-Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-18个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Pip：六氢吡啶
TFA：三氟醋酸
Trt：三苯甲基
tBu：叔丁基
otBu：氧叔丁基
DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
HOBT：1-羟基苯并三唑
(1)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的合成
称取210mg Fmoc-Cys(trt)-OH和230mg HOBT放于10ml离心管中，加5ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应1h。
(2)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的封头反应
配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。
(3)树脂的洗涤方法
用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。
(4)脱除Fmoc保护基
加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。
(5)保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Ser(tBu)-Cys(trt)-2-Cl-Resin的缩合为例，称取684mg Fmoc-Ser(tBu)-OH和230mg HOBT放于10ml离心管中，加入5ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
(6)磷酸化氨基酸的缩合
以HBTU/DIEA为缩合试剂加入到反应器中，缩合反应30-60min后，用DMF溶液洗涤树脂，然后按照上述方法脱除磷酸化氨基酸的Fmoc保护基，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗涤树脂1次，之后再以DMF溶液洗涤树脂3次。
(7)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成
将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于25℃的恒温震荡器中反应30-60min，洗涤，脱保护，再洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-18个Fmoc-保护氨基酸，即得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin。
实施例二
磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割沉降
(1)配置切割试剂
100ml配方为:87.5mlTFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mlEDT+5g苯酚，置于棕色试剂瓶中。现配备用，配制量一般为1g树脂加10ml切割试剂。
(2)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割
向抽干的反应器中加入切割试剂，置于脱色摇床上摇晃反应1h，速度20r/min。切割结束后，加入约35ml冰乙醚至50ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到磷酸化多肽粗肽产品。
实施例三
磷酸化多肽的纯化
切割沉降后的磷酸化多肽呈乳胶状态，其中含有较多的TFA盐和切割试剂，本发明采用C18色谱柱进行除盐，以便计算粗品得率。
将样品溶解并过滤，采用流动相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序进样洗脱：
称量冻干后的磷酸化多肽产品，经分析计算，产品纯度为95％，其纯品收率为71.8％，比现有技术仅30-50％的收率有大幅度提高。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，该固相合成方法包括以下具体步骤：
(1)选用2-Cl-Resin为起始载体，采用固相合成法，在活化剂和缩合剂的作用下，以Fmoc-保护氨基酸为缩合原料，依次缩合磷酸化多肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；
(2)将磷酸化多肽-2-Cl-Resin进行切割沉降反应，纯化并冻干，得到磷酸化多肽产品。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，所述的起始氨基树脂为2-Cl-Resin，取代度为0.64mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述缩合反应过程中以DIC/HOBT为活化剂和缩合剂，以DMF溶液洗涤多肽树脂，反应中氨基酸投料量为3倍所投树脂摩尔数，缩合反应时间为30-60min；以20％Pip/DMF溶液为脱保护剂，洗脱时间为20min。
4.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述缩合反应过程中以HBTU/DIEA为缩合试剂，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗涤多肽树脂。
5.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述Fmoc-保护氨基酸缩合顺序依次为：Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH、Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH，缩合反应温度为25℃。
6.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述切割试剂为TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2体积比，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次。
7.根据权利要求1所述的一种磷酸化多肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(2)中所述纯化方法指采用高效液相色谱法纯化用C18色谱柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈为流动相，以B.Cone/％(2→55)，Time/min(0→30)的梯度进行多肽的分离提纯，冻干得到磷酸化多肽产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610926856.0A CN106478778A (zh) | 2016-10-24 | 2016-10-24 | 一种磷酸化多肽的固相合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610926856.0A CN106478778A (zh) | 2016-10-24 | 2016-10-24 | 一种磷酸化多肽的固相合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106478778A true CN106478778A (zh) | 2017-03-08 |
Family
ID=58271156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610926856.0A Pending CN106478778A (zh) | 2016-10-24 | 2016-10-24 | 一种磷酸化多肽的固相合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106478778A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108070019A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-25 | 安徽省国平药业有限公司 | 一种多肽螯合金属离子的合成方法 |
| CN110156870A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-23 | 天津中科生物科技有限公司 | 一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法 |
| CN114736286A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-07-12 | 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 | 一种多肽杂质单硫化物的合成方法 |
-
2016
- 2016-10-24 CN CN201610926856.0A patent/CN106478778A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JOHN W. PERICH 等: ""Synthesis of phosphopeptides by the Multipin method: Evaluation of coupling methods for the incorporation of Fmoc-Tyr(PO3BzI,H)-OH,Fmoc-Ser(PO3Bzl,H)-OH and Fmoc-Thr(PO3Bzl,H)-OH"", 《LETTERS IN PEPTIDE SCIENCE》 * |
| 戴政清 等: ""Fmoc策略固相合成磷酰化肽研究进展"", 《中国药物化学杂志》 * |
| 罗施中 等: ""磷酸化血管紧张素Ⅱ的合成及性质"", 《高等学校化学学报》 * |
| 赵刚 等: ""O-磷酸酰化多肽及其类似物的化学合成"", 《有机化学》 * |
| 陈水冰 等: ""基于Fmoc策略的O-磷酸化多肽化学合成研究"", 《高等学校化学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108070019A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-25 | 安徽省国平药业有限公司 | 一种多肽螯合金属离子的合成方法 |
| CN110156870A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-23 | 天津中科生物科技有限公司 | 一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法 |
| CN110156870B (zh) * | 2019-05-06 | 2023-12-08 | 北京中科纳泰生物科技有限公司 | 一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法 |
| CN114736286A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-07-12 | 杭州诺泰澳赛诺医药技术开发有限公司 | 一种多肽杂质单硫化物的合成方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106478806B (zh) | 一种索玛鲁肽的固相合成方法 | |
| CN106928320B (zh) | 一种合成Etelcalcetide的方法 | |
| CN104031127B (zh) | 一种固液结合制备比伐卢定的方法 | |
| JP2018515471A5 (zh) | ||
| CN106478778A (zh) | 一种磷酸化多肽的固相合成方法 | |
| CN106892968A (zh) | 一种利那洛肽的合成方法 | |
| CN106167514A (zh) | 一种利那洛肽的合成和纯化方法 | |
| CN110894225B (zh) | 一种μ-芋螺肽的规模化制备纯化方法以及应用 | |
| CN106397573A (zh) | 一种利拉鲁肽的固相合成方法 | |
| CN104592362A (zh) | 卡贝缩宫素的合成工艺 | |
| CN107216374A (zh) | 一种齐考诺肽的合成方法 | |
| CN106518966A (zh) | 一种rgd环肽的合成方法 | |
| KR20090007709A (ko) | 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법 | |
| CN107056894A (zh) | 一种片段法固相合成醋酸加尼瑞克的方法 | |
| CN109021092A (zh) | 一种索玛鲁肽的合成方法 | |
| CN103980357B (zh) | 一种合成胸腺法新的方法 | |
| CN104761619A (zh) | 醋酸去氨加压素的固相制备工艺 | |
| CN104619717B (zh) | β-转角模拟肽环状化合物的合成 | |
| CN108003222A (zh) | 一种普利卡那肽的固相合成方法 | |
| CN111057129B (zh) | 一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法 | |
| CN106478813A (zh) | 一种比伐卢定的高效合成方法 | |
| CN108976296A (zh) | 一种利拉鲁肽的合成方法 | |
| CN105384799A (zh) | 一种固液相结合制备西那普肽的方法 | |
| CN106518979B (zh) | 一种亮丙瑞林的合成制备方法 | |
| CN106554407B (zh) | 一种乌拉立肽的合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170308 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |