CN114736286A - 一种多肽杂质单硫化物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽杂质单硫化物的合成方法，包括如下步骤：步骤一，根据多肽序列合成多肽树脂，其中一个半胱氨酸用Fmoc‑Ser(HPO3Bzl)‑OH或者Fmoc‑Ser(PO3Bzl2)‑OH代替；步骤二，多肽树脂偶联结束后，采用有机碱和DMF的混合溶液反应10h或以上；所述有机碱和DMF的混合溶液由含有体积份数10％有机碱的DMF组成；步骤三，所得树脂经裂解试剂TFA:H2O:Tis体积比＝95:2.5:2.5，室温下反应1‑2小时，冰乙醚沉淀，乙醚洗涤多次，真空干燥，得到目标产品；本方法操作简单，易于得到目标杂质，且提高了目标杂质的纯度与收率。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成领域，特别是一种多肽杂质单硫化物的合成方法。
背景技术
二硫键属于氨基酸序列的一级结构，也是形成高级结构的重要化学键，对维持多肽和蛋白质的空间结构发挥着重要作用。形成二硫键的实质是两个游离的巯基经过氧化后形成硫-硫共价键。而在多肽合成中，二硫键的形成要复杂很多，由于半胱氨酸的巯基非常活泼，容易发生副反应，在形成二硫键的过程中或长期稳定性中可能会发生脱硫现象，形成单硫化物杂质，该杂质是其副反应之一。因此研究该杂质，对二硫键合成的工艺开发和稳定性考察都具有十分重要的意义。
该杂质常采用2-氨基丙烯酸或丙烯酸类似物代替其中一个半胱氨酸合成相应的多肽树脂，通过Michael加成，得到该目的杂质，由于2-氨基丙烯酸不稳定，在反应过程中烯烃基团容易与其他反应试剂形成加合物，造成该杂质合成收率低下，甚至获得产物非目标杂质。市场需要一种操作简单，反应收率高，易于得到目标杂质的固相合成方法，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多肽杂质单硫化物的合成方法，本方法操作简单，易于得到目标杂质，且提高了目标杂质的纯度与收率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种多肽杂质单硫化物的合成方法，包括如下步骤：
步骤一，根据多肽序列合成多肽树脂，其中一个半胱氨酸用Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH或者Fmoc-Ser(PO3Bzl2)-OH代替；
步骤二，多肽树脂偶联结束后，采用有机碱和DMF的混合溶液反应10h或以上；所述有机碱和DMF的混合溶液为含有体积份数为10％有机碱的DMF溶液；
步骤三，所得树脂经裂解试剂TFA:H2O:Tis的体积比＝95:2.5:2.5，室温下反应1-2小时，冰乙醚沉淀，乙醚洗涤多次，真空干燥，得到目标产品。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，步骤二，多肽树脂偶联结束后，加入脱保护试剂反应后，再采用有机碱和DMF的混合溶液反应10h或以上。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，脱保护试剂为含有体积份数20％哌啶的DMF溶液。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，有机碱包括：NMM、DIPEA、三乙胺、吡啶或DBU。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，步骤一，根据兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2合成兰瑞肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，步骤一，兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2合成兰瑞肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，步骤一，奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)合成奥曲肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
前述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，步骤一，奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)合成奥曲肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
本发明的有益之处在于：
本发明采用2-氨基丙烯酸或丙烯酸类似物代替其中一个半胱氨酸合成相应的多肽树脂，通过Michael加成，得到该目的杂质，操作简单，易于得到目标杂质；
由于在脱保护反应过程中丙烯烃基团容易与伯胺或仲胺反应试剂形成加合物，本发明采用Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH通过过量的碱催化引起β-消除，与半胱氨酸的巯基反应形成硫醚键，避免了脱保护过程中与伯胺或仲胺反应试剂加合物的副产物，定向反应硫醚键，进而生成单硫化物，提高了纯度与收率。
附图说明
图1是本发明的一种实施例一(A)的色谱检测结果图；
图2是本发明的一种实施例一(B)的色谱检测结果图；
图3是本发明的一种实施例一(B)的分子量单同位素峰的质谱结果图；
图4是本发明的一种实施例二(A)的色谱检测结果图；
图5是本发明的一种实施例二(B)的色谱检测结果图；
图6是本发明的一种实施例二(B)的分子量单同位素峰的质谱结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例一，兰瑞肽单硫化物合成：
A，兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2，将2位置Cys(半胱氨酸)替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
称取Rink Amide-AM Resin(0.84mmol/g，2mmol)2.38g，加入DMF溶胀30min，抽干，加入脱保护试剂20％哌啶/DMF溶液(v/v体积比)，即含有体积份数20％哌啶的DMF溶液，反应30min，抽干，DMF洗涤6次，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(4mmol)1.59g，HOBt(4mmol)0.5g，DIC(4mmol)0.6mL，DMF 15mL，反应1-2h，反应茚三酮检测树脂无色透明，抽干，DMF洗涤4次，然后重复进行脱保护、偶联反应。依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-2-氨基丙烯酸,Fmoc-2-Nal-OH，氨基酸、DIC和HOBt投料比均为树脂的两倍(4mmol)。
得到的树脂，加入10％TFA/DCM(v/v体积比)反应1h，DCM洗涤3次。加入10％DIPEA/DMF溶液(v/v体积比)，反应10h后，抽干，DMF洗涤4次，DCM和甲醇交替洗涤3次，抽干，真空干燥。
将干燥后的树脂，加入到裂解液TFA:H2O:Tis体积比＝95:2.5:2.5(v/v)20mL，室温下反应2h，反应结束后过滤，少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，加入冰乙醚200mL沉淀，适量乙醚洗涤离心5次，真空干燥得到固体2.47g。
检测方法：
流动相：A相：50mmol/L磷酸氢二铵，氨水调PH＝6.5；B相：90％乙腈；
色谱柱：Aglient Pursuit C18 3μm 4.6×250mm；
柱温：45；℃检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：5μl；
洗脱梯度如表1：
表1
检测结果如图1所示，粗肽纯度为43.36％，粗肽经反相制备色谱，0.1％TFA/水、乙腈纯化，收集纯度大于95％的组分，合并冻干，得精肽0.21g，收率为9.6％。
B，兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2，将2位置Cys(半胱氨酸)替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
称取Rink Amide-AM Resin(0.84mmol/g，2mmol)2.38g，加入DMF溶胀30min，抽干，加入脱保护试剂20％哌啶/DMF溶液(v/v体积比)，反应30min，抽干，DMF洗涤6次，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(4mmol)1.59g，HOBt(4mmol)0.5g，DIC(4mmol)0.6mL，DMF 15mL，反应1-2h，反应茚三酮检测树脂无色透明，抽干，DMF洗涤4次，然后重复进行脱保护、偶联反应。依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH,Fmoc-2-Nal-OH，氨基酸、DIC和HOBt投料比均为树脂的两倍(4mmol)。
得到的树脂，加入10％TFA/DCM(v/v体积比)反应1h，DCM洗涤3次。加入10％DIPEA/DMF溶液，反应10h后，抽干，DMF洗涤4次，DCM和甲醇交替洗涤3次，抽干，真空干燥。
将干燥后的树脂，加入到裂解液TFA:H2O:Tis＝95:2.5:2.5(v/v体积比)20mL，室温下反应2h，反应结束后过滤，少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，加入冰乙醚200mL沉淀，适量乙醚洗涤离心5次，真空干燥得到固体2.32g。
检测方法：
流动相：A相：50mmol/L磷酸氢二铵，氨水调PH＝6.5；B相：90％乙腈；
色谱柱：Aglient Pursuit C18 3μm 4.6×250mm；
柱温：45；℃检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：5μl；
洗脱梯度如表1：
检测结果如图2、3所示，粗肽纯度81.17％，粗肽经反相制备色谱，0.1％TFA/水、乙腈纯化，收集纯度大于95％的组分，合并冻干，得精肽0.54g，收率为24.6％。MS：分子量1064.5，比兰瑞肽分子量少一个硫原子。
实施例二，奥曲肽单硫化物合成：
A，奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)，将2位置Cys替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
称取Fmoc-Thr(ol)-CTC Resin(0.55mmol/g，2mmol)3.64g，加入DMF溶胀30min，抽干，加入脱保护试剂20％哌啶/DMF溶液(v/v体积比)，反应30min，抽干，DMF洗涤6次，加入Fmoc-Cys(Acm)-OH(4mmol)1.66g，HOBt(4mmol)0.5g，DIC(4mmol)0.6mL，DMF 15mL，反应1-2h，反应茚三酮检测树脂无色透明，抽干，DMF洗涤4次，然后重复进行脱保护、偶联反应。依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-2-氨基丙烯酸,Boc-D-Phe-OH，氨基酸、DIC和HOBt投料比均为树脂的两倍(4mmol)。
得到的树脂，加入5eq碘、适量DMF反应1h，DMF洗涤3次。加入10％DIPEA/DMF溶液(v/v体积比)，反应10h后，抽干，DMF洗涤4次，DCM和甲醇交替洗涤3次，抽干，真空干燥。
将干燥后的树脂，加入到裂解液TFA:H2O:Tis体积比＝95:2.5:2.5(v/v)20mL，室温下反应2h，反应结束后过滤，少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，加入冰乙醚200mL沉淀，适量乙醚洗涤离心5次，真空干燥得固体2.13g。
检测方法：
流动相：A相：0.2％磷酸，氨水调PH＝5.0；B相：90％乙腈；
色谱柱：Aglient Pursuit C18 3μm 4.6×250mm；
柱温：45℃；检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：5μl；
洗脱梯度如表2所示：
表2
| 步骤 | 时间min | B％ | 流速mL/min |
| 1 | 0 | 15 | 1 |
| 2 | 23.5 | 35 | 1 |
| 3 | 24.5 | 90 | 1 |
| 4 | 25.5 | 90 | 1 |
| 5 | 26 | 15 | 1 |
| 6 | 36 | 15 | 1 |
检测结果如图4所示，粗肽纯度73.52％。粗肽经反相制备色谱，0.1％TFA/水、乙腈纯化，收集纯度大于95％的组分，合并冻干，得精肽0.32g，收率为16.2％。
B.奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)，将2位置Cys替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
称取Fmoc-Thr(ol)-CTC Resin(0.55mmol/g，2mmol)3.64g，加入DMF溶胀30min，抽干，加入脱保护试剂20％哌啶/DMF溶液(v/v体积比)，反应30min，抽干，DMF洗涤6次，加入Fmoc-Cys(Acm)-OH(4mmol)1.66g，HOBt(4mmol)0.5g，DIC(4mmol)0.6mL，DMF 15mL，反应1-2h，反应茚三酮检测树脂无色透明，抽干，DMF洗涤4次，然后重复进行脱保护、偶联反应。依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH,Boc-D-Phe-OH，氨基酸、DIC和HOBt投料比均为树脂的两倍(4mmol)。
得到的树脂，加入5eq碘、适量DMF反应1h，DMF洗涤3次。加入10％DIPEA/DMF溶液(v/v体积比)，反应10h后，抽干，DMF洗涤4次，DCM和甲醇交替洗涤3次，抽干，真空干燥。
将干燥后的树脂，加入到裂解液TFA:H2O:Tis＝95:2.5:2.5(v/v体积比)20mL，室温下反应2h，反应结束后过滤，少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，加入冰乙醚200mL沉淀，适量乙醚洗涤离心5次，真空干燥得固体1.98g。
检测方法：
流动相：A相：0.2％磷酸，氨水调PH＝5.0；B相：90％乙腈；
色谱柱：Aglient Pursuit C18 3μm 4.6×250mm；
柱温：45℃；检测波长：220nm；流速：1mL/min；进样量：5μl；
洗脱梯度如表2所示：
检测结果如图5、6所示，粗肽纯度83.58％。粗肽经反相制备色谱，0.1％TFA/水、乙腈纯化，收集纯度大于95％的组分，合并冻干，得精肽0.49g，收率为24.8％。MS：分子量986.4，比奥曲肽分子量少一个硫原子。
本发明采用2-氨基丙烯酸或丙烯酸类似物代替其中一个半胱氨酸合成相应的多肽树脂，通过Michael加成，得到该目的杂质，操作简单，易于得到目标杂质；由于在脱保护反应过程中丙烯烃基团容易与伯胺或仲胺反应试剂形成加合物，本发明采用Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH通过过量的碱催化引起β-消除，与半胱氨酸的巯基反应形成硫醚键，避免了脱保护过程中与伯胺或仲胺反应试剂加合物的副产物，定向反应硫醚键，进而生成单硫化物，提高了纯度与收率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，根据多肽序列合成多肽树脂，其中一个半胱氨酸用Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH或者Fmoc-Ser(PO3Bzl2)-OH代替；
步骤二，多肽树脂偶联结束后，采用有机碱和DMF的混合溶液反应10h或以上；所述有机碱和DMF的混合溶液为含有体积份数为10％有机碱的DMF溶液；
步骤三，所得树脂经裂解试剂TFA:H2O:Tis的体积比＝95:2.5:2.5，室温下反应1-2小时，冰乙醚沉淀，乙醚洗涤多次，真空干燥，得到目标产品。
2.根据权利要求1所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，步骤二，多肽树脂偶联结束后，加入脱保护试剂反应后，再采用有机碱和DMF的混合溶液反应10h或以上。
3.根据权利要求2所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，所述脱保护试剂为含有体积份数20％哌啶的DMF溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，所述有机碱包括：NMM、DIPEA、三乙胺、吡啶或DBU。
5.根据权利要求1所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，步骤一，根据兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2合成兰瑞肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
6.根据权利要求1所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，步骤一，兰瑞肽序列：H-D-2-Nal-[Cys2-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2合成兰瑞肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
7.根据权利要求1所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，步骤一，奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)合成奥曲肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-2-氨基丙烯酸。
8.根据权利要求1所述的一种多肽杂质单硫化物的合成方法，其特征在于，步骤一，奥曲肽序列：D-Phe-[Cys2-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr(ol)合成奥曲肽单硫化物，将2位置Cys替换为Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH。
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