JP6618176B2 - ７糖オリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドから２種類の7糖オリゴ糖を製造する方法に関する。

抗体医薬品の構成成分である糖鎖の構造は、抗体医薬品の薬効や安全性に影響を与える。たとえば、フコースの無い２本鎖アスパラギン結合型糖鎖を有する抗体では、薬効発現において重要な役割を果たす抗体依存性細胞障害活性が高くなる（非特許文献１）。また、非還元末端にαガラクトース残基が結合した糖鎖を有する抗体では、一部の患者においてアナフィラキシー症状が引き起こされることが報告された（非特許文献２）。

近年、抗体医薬品において、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の一方の側鎖の非還元末端にガラクトースが結合した糖鎖（Ｇ１糖鎖）が、主要な糖鎖であることが報告された（非特許文献３）。Ｇ１糖鎖には、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の５糖母核であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃにおいて、Ｍａｎα１−３側鎖の非還元末端にガラクトースが1残基結合した糖鎖と、Ｍａｎα１−６側鎖の非還元末端にガラクトースが1残基結合した糖鎖の二種類がある。非特許文献３に記載された報告では、これらの二種類の糖鎖の存在比は抗体によって異なることも明らかにされた。

このようなＧ１糖鎖を有する抗体の機能や安全性を明らかにするためには、均一なＧ１糖鎖を有する抗体を作成する必要がある。
均一なＧ１糖鎖を有する抗体の作成法として、特許文献１には、抗体に糖転移酵素と糖加水分解酵素を作用させて糖鎖構造を改変し調製する方法が開示されている。

また、均一な糖鎖構造を有する抗体を作成する手法として糖鎖リモデリング法が開発され、様々な抗体の作成に広く利用されている（非特許文献４）。この糖鎖リモデリング法によって均一なＧ１糖鎖を有する抗体を作成するためには、糖鎖供給源として７糖オリゴ糖、すなわちＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−ＯＨと、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−ＯＨが必要になる。そこで、これら7糖オリゴ糖の合成や、７糖オリゴ糖を用いたＧ１糖鎖を有する抗体の作成に関する研究が行われている。たとえば、非特許文献５には７糖オリゴ糖を化学的に合成し、糖鎖リモデリング法によってＧ１糖鎖を有する抗体を作成する方法が報告されている。また、特許文献２には、卵由来粗精製11糖シアリルオリゴ糖ペプチドから、非還元末端の構造が７糖オリゴ糖と同じで、８糖から成る糖鎖アスパラギン誘導体を調製する方法が開示されている。

特表２０１４−５３１２１５号公報 特開２００３−１２８７０３号公報

R. L. Shields, et al., J. Biol. Chem., 2002年, 277巻, p. 26733-26740. C. H. Chung, et al., N. Engl. J. Med., 2008年, 358巻, p. 1109-1117. T. Song, et al., Anal. Chem., 2014年, 86巻, p. 5661-5666. W. Huang, et al., J. Am. Chem. Soc., 2012年, 134巻, p. 12308-12318. C. W. Lin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015年, l12巻, p.10611-10616.

しかしながら特許文献１に開示された方法では、合成された抗体に結合したＧ１糖鎖は、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の５糖母核におけるＭａｎα１−３側鎖の非還元末端にガラクトースが結合した糖鎖か、Ｍａｎα１−６側鎖の非還元末端にガラクトースが結合したかについては言及されていない。

また非特許文献５に開示された方法では、糖鎖を調製するために多工程に及ぶ煩雑な合成操作と精製操作を繰り返す必要がある。さらにこの報告では、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の５糖母核におけるＭａｎα１−３側鎖の非還元末端にガラクトースが結合したＧ１糖鎖を有する抗体しか合成されていない。

また特許文献２に開示された方法では、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドから５工程で，非還元末端の構造が７糖オリゴ糖と同じで、８糖から成る糖鎖アスパラギン誘導体（特許文献２、化合物３７、化合物４２）を調製している。しかしこの方法では、各中間体化合物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーやＨＰＬＣにより精製する必要がある。また８糖から成る糖鎖アスパラギン誘導体の７糖オリゴ糖への変換については言及されていない。

以上のように従来の技術では、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の５糖母核におけるＭａｎα１−６側鎖の非還元末端にガラクトースが結合したＧ１糖鎖を有する抗体の作成は達成されていない。また、糖鎖リモデリング法によってＧ１糖鎖を有する抗体を作成する際に必要となる、２種類の７糖オリゴ糖の簡便な調製は報告されていない。

本発明が解決しようとする課題は、２本鎖アスパラギン結合型糖鎖の５糖母核におけるＭａｎα１−３側鎖と、Ｍａｎα１−６側鎖のそれぞれの非還元末端ガラクトースが結合した均一なＧ１糖鎖構造を有する抗体の作成に利用できる２種類の７糖オリゴ糖、すなわちＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−ＯＨと、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−ＯＨを簡便に収率良く製造する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（１）１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解して２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、（２）前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程、および（３）前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、非還元末端のガラクトースを加水分解し、シアル酸を加水分解し、還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解して、２種類の７糖オリゴ糖を得る工程を含む、７糖オリゴ糖の製造方法により、上記課題を解決できることを見出した。

特に、前記単離精製を逆相分配クロマトグラフィーで行い、前記工程（３）が、前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、（ａ）ガラクトシダーゼを添加し反応させる工程、（ｂ）ガラクトシダーゼを不活性化する工程、（ｃ）ノイラミニダーゼを添加し反応させる工程、および（ｄ）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し反応させる工程、を順次ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程である、7糖オリゴ糖の製造方法により、上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
（１）１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解して２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、（２）前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程、および（３）前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、非還元末端のガラクトースを加水分解し、シアル酸を加水分解し、還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解して、２種類の７糖オリゴ糖を得る工程を含む、７糖オリゴ糖の製造方法。
［２］
前記単離精製を逆相分配クロマトグラフィーで行う、［１］に記載の製造方法。
［３］
前記工程（３）が、前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、（ａ）ガラクトシダーゼを添加し反応させる工程、（ｂ）ガラクトシダーゼを不活性化する工程、（ｃ）ノイラミニダーゼを添加し反応させる工程、および（ｄ）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し反応させる工程、を順次ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程である、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］
前記２種類の７糖オリゴ糖が下記式１、および式２で表される糖鎖である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
式１：

式２：

本発明によれば、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドから、簡便に収率良く上記式１、および式２で表される２種類の７糖オリゴ糖を製造することができる。

実施例１において、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの酸加水分解後のＨＰＬＣチャートを示す。 実施例１において製造された１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。 実施例１において製造された１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。 実施例２、実施例３において糖鎖構造の解析に用いた衝突誘起解離スペクトル（ＭＳ^３スペクトル）を示す。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本発明の７糖オリゴ糖の製造方法は、（１）１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解して２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、（２）前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程、および（３）前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、非還元末端のガラクトースを加水分解し、シアル酸を加水分解し、還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解して、２種類の７糖オリゴ糖を得る工程を含む。

本発明において、７糖オリゴ糖とは、７個の糖残基からなる糖鎖を意味する。
７糖オリゴ糖は、非還元末端にガラクトース1残基を有する糖鎖である。
２種類の７糖オリゴ糖としては、下記式１、および下記式２で表される糖鎖が挙げられる。
式１：

式２：

本発明の製造方法により、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドより簡便に収率良く、上記式１、および式２で表される２種類の７糖オリゴ糖を製造することができる。

（１）１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解して２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程とは、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの２本鎖のうち一方の側鎖の非還元末端のシアル酸を加水分解して除去する工程である。

本発明において、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドとは、１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端にアミノ酸６残基からなるペプチド鎖が結合している糖ペプチドを意味する。
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの１１糖残基部分は、非還元末端に２つのシアリル基を有する糖部分である。
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドとしては、下記式３で表される糖ペプチドが挙げられる。
式３：

上記式３で表される糖ペプチドにおいては、糖鎖部分が、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＴｈｒのＡｓｎ残基に結合している（配列表配列番号１）。
本発明において、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。

アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。

１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドとしては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド（伏見製薬工業（株）、製品コード１７１８０１）や鶏卵卵黄より調製した１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド（A. Seko, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1997年, 1335巻, p. 23-32.）が挙げられる。

１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解する方法としては、ノイラミニダーゼを用いる方法であっても、酸性水溶液を用いる方法であってもよいが、酸性水溶液を用いる方法が好ましい。
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの加水分解に用いる酸性水溶液としては、特に限定されるものではないが、たとえば、塩酸水溶液、酢酸水溶液、硫酸水溶液などが挙げられる。

１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの酸性水溶液を用いた加水分解において、酸性水溶液の水素イオン濃度として、特に限定されるものではないが、ｐＨ＝１〜５の塩酸水溶液を用いることにより１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得ることができる。
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの酸性水溶液を用いた加水分解は、特に限定されるものではないが、１０〜１００℃の温度で行うことができる。
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの酸性水溶液を用いた加水分解は、特に限定されるものではないが、３０分〜１０時間で行うことができる。

（２）前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程とは、２本鎖のうち一方の側鎖の非還元末端にシアル酸が１残基結合した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程である。

前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する方法としては、順相カラムクロマトグラフィーや逆相分配クロマトグラフィー、そして多孔性グラファイトカーボンを充填したカラムクロマトグラフィーを用いる方法などが挙げられるが、逆相分配クロマトグラフィーを用いる方法が好ましい。

逆相分配クロマトグラフィーで２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを単離精製する工程とは、前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを、逆相分配クロマトグラフィーを備えたＨＰＬＣと、ＨＰＬＣ送液の移動相に緩衝溶液を用いて単離精製する工程である。

逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、特に限定されるものではないが、オクタデシル基が化学結合したシリカゲルを用いることにより１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを単離精製することができる。
ＨＰＬＣ送液の移動相としては、特に限定されるものではないが、ギ酸アンモニウム緩衝液、ギ酸−トリエチルアミン緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、酢酸−トリエチルアミン緩衝液などの移動相Ａと、移動相Ａに０．０１〜５％（ｖ／ｖ)のメタノール、エタノール、またはｎ−ブタノールを加えた移動相Ｂの混合液を用いることができるが、１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液から成る移動相Ａと、移動相Ａに０．０５％（ｖ／ｖ)のｎ−ブタノールを加えた移動相Ｂの混合液を用いることが好ましい。
ＨＰＬＣ送液の移動相の組成は、移動相Ａに対する移動相Ｂの割合が少ない状態から、徐々に移動相Ｂの割合が多くなるように変化させることが好ましい。

（３）前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、非還元末端のガラクトースを加水分解し、シアル酸を加水分解し、還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解して、２種類の７糖オリゴ糖を得る工程とは、非還元末端のガラクトース１残基を除去する工程、非還元末端のシアル酸１残基を除去する工程、および還元末端のＮ−アセチルグルコサミン−ペプチドを除去する工程からなる。

非還元末端のガラクトースを加水分解する方法としては、ガラクトシダーゼを用いる方法が好ましい。
シアル酸を加水分解する方法としては、ノイラミニダーゼを用いる方法であっても、酸性水溶液を用いる方法であってもよい。
還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解する方法としては、アルカリ加水分解やエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いる方法などが挙げられるが、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いる方法が好ましい。

前記工程（３）としては、前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、（ａ）ガラクトシダーゼを添加し反応させる工程、（ｂ）ガラクトシダーゼを不活性化する工程、（ｃ）ノイラミニダーゼを添加し反応させる工程、および（ｄ）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し反応させる工程、を順次ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程が好ましい。

前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、（ａ）ガラクトシダーゼを添加し反応させる工程、（ｂ）ガラクトシダーゼを不活性化する工程、（ｃ）ノイラミニダーゼを添加し反応させる工程、および（ｄ）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し反応させる工程、を順次ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程とは、２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれをガラクトシダーゼで処理して非還元末端のガラクトース１残基を除去したのち、それ以上ガラクトシダーゼを反応させないようにガラクトシダーゼを不活性化し、引き続きノイラミニダーゼで処理することで非還元末端のシアル酸１残基を除去し、最後にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理して還元末端のＮ−アセチルグルコサミン−ペプチドを除去する反応を、同一緩衝液中ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程である。

緩衝液としては、ｐＨが４．０〜８．０の緩衝液が好ましく、特に好ましくはｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液が好ましい。
反応温度としては、１０〜５０℃で行うことができる。

ガラクトシダーゼとしては特に限定されるものではないが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のガラクトシダーゼや、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ由来のガラクトシダーゼなどを挙げることができる。ガラクトシダーゼを用いる加水分解は、特に限定されるものではないが、たとえば５μｍｏｌの１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドに対して２０〜８０μｇのガラクトシダーゼ、または４００〜１０００ユニットのガラクトシダーゼを用いて、２０〜５０℃の温度で、１〜７２時間で行うことができる。なおここで１ユニットとは、３７℃、１時間で、１ｎｍｏｌのＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｉｎから非還元末端のガラクトースを０．９５ｎｍｏｌ以上遊離させるために必要な酵素量である。

ガラクトシダーゼを不活性化する方法としては、エタノール処理やフェノール処理、そして加熱処理などが挙げられるが、好ましくは６５〜９０℃で３０分〜１時間加熱することによって達成される。

ノイラミニダーゼとしては特に限定されるものではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼを利用できる。ノイラミニダーゼを用いる加水分解は、特に限定されるものではないが、たとえば５μｍｏｌの１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドに対して１００〜３００ユニットのノイラミニダーゼを用いて、２０〜５０℃の温度で、１〜５時間で行うことができる。なおここで１ユニットとは、３７℃、５分間で、１ｎｍｏｌのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｉｎから非還元末端のシアル酸を０．９５ｎｍｏｌ以上遊離させるために必要な酵素量である。

エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては特に限定されるものではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを利用できる。エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いる加水分解は、特に限定されるものではないが、たとえば５μｍｏｌの１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドに対して５〜２０μｇのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて、２０〜５０℃の温度で、１〜２４時間で行うことができる。

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本発明の実施に用いられる測定方法は以下のとおりである。

［ＨＰＬＣ分析］
カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ Ａｑｕａ（関東化学株式会社、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
移動相；（Ａ）１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ４．０），（Ｂ）Ａ＋０．０５％（ｖ／ｖ)ｎ−ブタノール
グラジエント；Ｂ，８％→２５％（２５ｍｉｎ）
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度；４０℃
ＵＶ；２２０ｎｍ

［ＨＰＬＣ分取］
カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ Ａｑｕａ（関東化学株式会社、２５０×１０ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の分取条件によりＨＰＬＣ分取を行った。
分取条件：
移動相；（Ａ）１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ４．０），（Ｂ）Ａ＋０．０５％（ｖ／ｖ)ｎ−ブタノール
グラジエント；Ｂ，１０％→１００％（２５ｍｉｎ）、１００％（２５ｍｉｎ→３０ｍｉｎ）
流速；２．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度；４０℃
ＵＶ；２２０ｎｍ

［^１Ｈ−ＮＭＲ測定］
Ｄ_２Ｏ ０．４ｍＬに試料２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で^１Ｈ−ＮＭＲを測定した。

［ＭＳ測定］
以下の測定条件で測定を行った。
ＡＸＩＭＡ ＴＯＦ^２， Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ
イオン化：ＭＡＬＤＩ
マトリックス：２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ

［ＭＳ−ＭＳ測定］
以下の測定条件で測定を行った。
ＡＸＩＭＡ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｂｉｏｔｅｃｈ
イオン化：ＭＡＬＤＩ
マトリックス：２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ
モード：Ｎｅｇａｔｉｖｅ

［１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドの調製］
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド（２６２．７ｍｇ，９１．７ｍｍｏｌ）を１０ｍＭ塩酸水溶液（１２ｍＬ）に溶解し、６０℃で３．５時間加熱撹拌した。この反応液に１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を１５０μＬ加え反応液の水素イオン濃度をｐＨ＝８にし、凍結乾燥することで白色粉末状化合物を得た。この白色粉末状化合物を７２０μＬの水に溶解し、１５〜３０μＬずつＨＰＬＣで精製したところ、７．５分後に下記式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドが、１０分後に下記式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドが溶出した。これらの溶出液に１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を加え中和し、減圧濃縮したのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２０ｍｍφ×７７０ｍｍ、展開溶媒は０．０５％アンモニア水溶液）で脱塩し、下記式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを３９．５ｍｇ（収率１７％）、および下記式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを４４．９ｍｇ（収率１９％）得た。

１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの酸加水分解後のＨＰＬＣによる測定結果を図１に、精製後の下記式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図２に、精製後の下記式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。
式４：

式５：

得られた式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１４（ｓ, １Ｈ）, ５．０５（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝９．６ Ｈｚ）, ４．９４（ｓ, １Ｈ）, ４.７２−４．６６（ｍ, １Ｈ）, ４．６６−４．５６（ｍ, ３Ｈ）, ４．４８（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２Ｈｚ）,４．４６（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．４１（ｄｄ, １Ｈ）, ４．３２（ｑ, １Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, ４．２７（ｂｓ, １Ｈ）, ４．２６−４．２０（ｍ， １Ｈ）， ４．２１（ｂｄ, １Ｈ, Ｊ＝３．４ Ｈｚ）, ４．１５（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝４．１ Ｈｚ）, ４．１４−４．１０（ｍ, ２Ｈ）, ４．０７−３．４５（ｍ, ５９Ｈ）, ３．０６−２．９６（ｍ, ４Ｈ）, ２．８７（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝５．５, １６．５ Ｈｚ）, ２．７６（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝７．６, １６．５ Ｈｚ）, ２．６８（ｄｄ, １Ｈ， Ｊ＝４．１, １２．４ Ｈｚ）, ２.１０−２．００（ｍ, １Ｈ）, ２．０９（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０８（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０６（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０４（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０１（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９６−１．８５（ｍ, １Ｈ）, １．８５−１．５７（ｍ, ８Ｈ）, １．５２−１．３５（ｍ, ４Ｈ）, １.３９（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, １．１８（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６.９ Ｈｚ）, ０．９８（ｄ, ６Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１Ｈ１７３Ｎ１４Ｏ６２^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋： ２５７４．１， ｆｏｕｎｄ ２５７４．１

式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１２（ｓ， １Ｈ）， ５．０５（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．６ Ｈｚ）， ４．９５（ｓ， １Ｈ）, ４．７８（ｓ, １Ｈ）, ４．６８（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝５．５, ７．６ Ｈｚ）, ４．６４−４．５６（ｍ, ３Ｈ）, ４．４９−４．４４（ｄ×２, ２Ｈ）, ４．４１（ｄｄ, １Ｈ）, ４．３１（ｑ, １Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, ４．２８−４．１８（ｍ, １Ｈ）, ４．２５（ｂｓ, １Ｈ）, ４．２０（ｂｄ, １Ｈ, Ｊ＝３．４ Ｈｚ）, ４．１４（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝４．１ Ｈｚ）, ４．１３−４．１０（ｍ, ２Ｈ）, ４．０２−３．４７（ｍ, ５９Ｈ）, ３．０４−２．９７（ｍ, ４Ｈ）, ２．８６（ｂｄ, １Ｈ, Ｊ＝４．８, １６．５ Ｈｚ）, ２．７６（ｂｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２, １６．５ Ｈｚ）, ２．６８（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝４．８, １２．４ Ｈｚ）, ２．１１−１．９９（ｍ, １Ｈ）, ２．０９（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０７（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０６（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０３（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０１（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９４−１．８５（ｍ, １Ｈ）, １．８２−１．６０（ｍ, ８Ｈ）, １．５２−１．３４（ｍ， ４Ｈ）， １．３８（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, １.１７（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．２ Ｈｚ）, ０．９７（ｄ, ６Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１Ｈ１７３Ｎ１４Ｏ６２^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋： ２５７４．１， ｆｏｕｎｄ ２５７４．３

［式１で表される７糖オリゴ糖の調製と構造決定］
実施例１で得られた式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチド（１５．０ｍｇ，６．２μｍｏｌ）を１００ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）５００μＬに溶解させ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のガラクトシダーゼ（８０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を５０μＬ加えた。この溶液を３７℃で加熱撹拌し、２２時間後Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のガラクトシダーゼ（８０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を７５μＬ追加し、３７℃で加熱撹拌を続けた。４５時間後で反応液を凍結乾燥したのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２０ｍｍφ×７７０ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、式６で表される９糖オリゴ糖ペプチドを１５．２ｍｇ（ｑｕａｎｔ．）得た。
式６：

式６で表される９糖オリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１３（ｓ, １Ｈ）, ５．０４（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝９．６ Ｈｚ）, ４．９２（ｓ, １Ｈ）, ４．７３−４．６７（ｍ, １Ｈ）, ４．６５−４．５８（ｍ, ２Ｈ）, ４．５６（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．４５（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝ ８．２ Ｈｚ）, ４．４２−４．３７（ｍ, １Ｈ）, ４．３４−４．２７（ｍ, １Ｈ）, ４．２６（ｂｓ, １Ｈ）, ４．２４−４．１７（ｍ, ２Ｈ）, ４．１７−４．０８（ｍ， ３Ｈ）， ４．０５−３．３９（ｍ, ５３Ｈ）, ３．０５−２．９２（ｍ, ４Ｈ）, ２．９１−２．８１（ｍ， １Ｈ）, ２．７５（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２, １５．８ Ｈｚ）, ２．６７（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝４.８, １２．４ Ｈｚ）, ２．１１−１．９９（ｍ, １Ｈ）, ２．０８（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０７（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０５（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０３（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．００（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９３−１．８４（ｍ， １Ｈ）, １．８３−１．５４（ｍ, ７Ｈ）, １．５３−１．３２（ｍ, ４Ｈ）, １．３８（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, １.１７（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．２ Ｈｚ）,１．０４−０．８９（ｍ， ６Ｈ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１６３Ｎ１４Ｏ５７^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋： ２４１２．０， ｆｏｕｎｄ ２４１３．１

式６で表される９糖オリゴ糖ペプチド（１５．２ｍｇ，６．２μｍｏｌ）を４０ｍＭ塩酸水溶液６００μＬに溶解し、８０℃で２．５時間過熱撹拌した。反応液に１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を３０μＬ加えｐＨ＝８としたのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、１７ｍｍφ×５４０ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、式７で表される８糖オリゴ糖ペプチドを１３．８ｍｇ（ｑｕａｎｔ．）得た。下記式７で表される８糖オリゴ糖ペプチドの衝突誘起解離スペクトル（ＭＳ^３スペクトル）を図４（下段）に示す。図４（下段）に示すスペクトルにおいてＭａｎα１−６分岐側のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ残基が解離したフラグメントイオンの脱水イオンに由来するシグナルｍ／ｚ５０８が観測されたことから、ガラクトース残基がＭａｎα１−３側鎖の非還元末端に結合していることを確認した。
式７：

式７で表される８糖オリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１５（ｓ, １Ｈ）, ５．０７（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝９．６ Ｈｚ）, ４．９５（ｓ, １Ｈ）, ４．７６−４．６９（ｍ, １Ｈ）, ４．６４（ｂｄ， １Ｈ， Ｊ＝６．９ Ｈｚ）， ４．６１（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．６ Ｈｚ）， ４．５９（ｄ， １Ｈ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ４．５０（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝７．６ Ｈｚ）, ４．４７−４．４０（ｍ， １Ｈ）， ４．３７−４．３０（ｍ, １Ｈ）, ４．２８（ｂｓ， １Ｈ），４．２５（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝４．１， ６．２ Ｈｚ）， ４．２２（ｂｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．７ Ｈｚ）， ４．２０−４．１１（ｍ, ３Ｈ）, ４．０５−３．４２（ｍ, ４６Ｈ）, ３．０７−２．８５（ｍ, ５Ｈ）, ２．８２−２．７１（ｍ, １Ｈ）, ２．１７−２．０２（ｍ， １Ｈ）， ２．１１（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０８（ｓ, ６Ｈ, Ａｃ×２）, ２．０３（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９７−１．８７（ｍ, １Ｈ）, １．８６−１．７４（ｍ, １Ｈ）, １．７４−１．５７（ｍ, ６Ｈ）, １．５５−１．３４（ｍ， ４Ｈ）， １．４１（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝７．６ Ｈｚ）,１．２０（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, １．０４−０．９４（ｍ， ６Ｈ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８４Ｈ１４５Ｎ１３ＮａＯ４９^＋［Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ］^＋： ２１４２．９， ｆｏｕｎｄ ２１４２．５

式７で表される８糖オリゴ糖ペプチド（１３．８ｍｇ，６．５μｍｏｌ）をリン酸緩衝生理食塩水２２５μＬに溶解し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（１μｇ／μＬ）を２５μＬ加えた。反応液を３７℃で２５時間過熱撹拌し、凍結乾燥した。凍結乾燥後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（イアトロビーズ６ＲＳ−８０６０（３０ｍＬ）、展開溶媒０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：１：２（２５０ｍＬ）を溶出したのち、０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ＝１：１（２００ｍＬ）を溶出）。溶出液をＴＬＣで追跡し（発色液はアニスアルデヒド）、Ｒｆ値＝０．８にスポットが確認された溶出液を減圧濃縮した。濃縮後の残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、１７ｍｍφ×６００ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、前記式１で表される７糖オリゴ糖を７．７ｍｇ（９４％）得た。

式１で表される７糖オリゴ糖の物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．２２（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝３．４ Ｈｚ）, ５．１３（ｓ, １Ｈ）, ４．９３（ｓ, １Ｈ）, ４．５９（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝７．６ Ｈｚ）, ４．５７（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．９ Ｈｚ）, ４．４８（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．２９−４．２５（ｍ, １Ｈ）， ４．２２−４．１９（ｍ, １Ｈ）, ４．１４−４．１０（ｍ, １Ｈ）, ４．０２−３．４１（ｍ, ３９Ｈ）, ２．０８−２．０５（ｍ, ９Ｈ, Ａｃ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８４Ｈ１４５Ｎ１３ＮａＯ４９^＋［Ｍ＋Ｎａ］^＋： １２９８．４， ｆｏｕｎｄ １２９９．４

［式２で表される７糖オリゴ糖の調製と構造決定］
実施例１で得られた前記式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチド（１６．１ｍｇ，６．７μｍｏｌ）を１００ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）５００μＬに溶解させ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のガラクトシダーゼ（８０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を５０μＬ加えた。この溶液を３７℃で加熱撹拌し、２２時間後Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のガラクトシダーゼ（８０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を７５μＬ追加し、３７℃で加熱撹拌を続けた。４７時間後で反応液を凍結乾燥したのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２０ｍｍφ×７７０ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、下記式８で表される８糖オリゴ糖ペプチド１５．７ｍｇ（収率９７％）得た。
式８：

前記式８で表される９糖オリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１２（ｓ, １Ｈ）,５．０５（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝９．６ Ｈｚ）,４．９５（ｓ, １Ｈ）, ４．７１−４．６６（ｍ, １Ｈ）, ４．６５−４．５９（ｍ, ２Ｈ）, ４．５６（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．４６（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．４３−４．３８（ｍ, １Ｈ）, ４．３５−４．２８（ｍ, １Ｈ）, ４．２６（ｂｓ, １Ｈ）, ４．２３（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝４．１, ６．２ Ｈｚ）, ４．２１−４．１８（ｍ, １Ｈ）, ４．１６−４．１３（ｍ, １Ｈ）, ４．１３−４．０９（ｍ, ２Ｈ）, ４．０３−３．４１（ｍ, ５３Ｈ）, ３．０４−２．９４（ｍ, ４Ｈ）, ２．９０−２．８２（ｍ, １Ｈ）, ２．８０−２．７２（ｍ, １Ｈ）, ２．７１−２．６５（ｄｄ, １Ｈ， Ｊ＝４．８， １２．４ Ｈｚ）, ２.１１−２．０２（ｍ, １Ｈ）, ２．０９（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０７（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０６（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０４（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０１（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９４−１．８５（ｍ, １Ｈ）, １．８３−１．５５（ｍ, ８Ｈ）, １．５２−１．３８（ｍ, ４Ｈ）, １．３８（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．９ Ｈｚ）, １．１７（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．２ Ｈｚ）, １．０２−０．９２（ｍ， ６Ｈ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１６３Ｎ１４Ｏ５７^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋： ２４１２．０， ｆｏｕｎｄ ２４１２．６

前記式８で表される９糖オリゴ糖ペプチド（１５．７ｍｇ，６．５μｍｏｌ）を４０ｍＭ塩酸水溶液６００μＬに溶解し、８０℃で４時間過熱撹拌した。反応液に１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液を加えｐＨ＝８としたのち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、１７ｍｍφ×６００ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、下記式９で表される８糖オリゴ糖ペプチド１３．７ｍｇ（９７％）得た。下記式９で表される８糖オリゴ糖ペプチドの衝突誘起解離スペクトル（ＭＳ３スペクトル）を図４（上段）に示す。図４（上段）のスペクトルにおいてＭａｎα１−６分岐側のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ残基が解離したフラグメントイオンの脱水イオンに由来するシグナルｍ／ｚ６７０が観測されたことから、ガラクトース残基がＭａｎα１−６側鎖の非還元末端に結合していることを確認した。
式９：

前記式９で表される８糖オリゴ糖ペプチドの物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．１５（ｓ, １Ｈ）, ５．０７（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝９．６ Ｈｚ）, ４．９６（ｓ, １Ｈ）, ４．７４−４．６９（ｍ， １Ｈ）， ４．６４（ｂｄ， １Ｈ， Ｊ＝７．６ Ｈｚ）， ４．６１（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ４．５８（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）, ４．５０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８．２Ｈｚ）, ４．４６−４．３９（ｍ, １Ｈ）, ４．３７−４．３０（ｍ, １Ｈ）, ４．２８（ｂｓ， １Ｈ）， ４．２７−４．２０（ｍ， １Ｈ）， ４．２２（ｂｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．１ Ｈｚ）， ４．２０−４．１０（ｍ, ３Ｈ）, ４．０８−３．４２（ｍ, ４６Ｈ）, ３．０６−２．８５（ｍ, ５Ｈ）, ２．８２−２．７０（ｍ, １Ｈ）, ２．１７−２．０２（ｍ， １Ｈ）， ２．１１（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０８（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０７（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, ２．０３（ｓ, ３Ｈ, Ａｃ）, １．９６−１．８６（ｍ, １Ｈ）, １．８５−１．７４（ｍ, １Ｈ）, １．７４−１．５７（ｍ, ６Ｈ）, １．５５−１．３４（ｍ， ７Ｈ）， １．１９（ｄ, ３Ｈ, Ｊ＝６．２ Ｈｚ）, １．０４−０．９４（ｍ，６Ｈ）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８４Ｈ１４５Ｎ１３ＮａＯ４９^＋［Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ］^＋： ２１４２．９， ｆｏｕｎｄ ２１４３．８

前記式９で表される８糖オリゴ糖ペプチド（１３．７ｍｇ，６．５μｍｏｌ）をリン酸緩衝生理食塩水２２５μＬに溶解し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（１μｇ／μＬ）を２５μＬ加えた。反応液を３７℃で２４時間過熱撹拌し、凍結乾燥した。凍結乾燥後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（イアトロビーズ６ＲＳ−８０６０（３０ｍＬ）、展開溶媒０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：１：２（４００ｍＬ）を溶出したのち、０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ＝１：１（２００ｍＬ）を溶出）。溶出液をＴＬＣで追跡し（発色液はアニスアルデヒド）、Ｒｆ値＝０．８にスポットが確認された溶出液を減圧濃縮した。濃縮後の残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、１７ｍｍφ×５４０ｍｍ、展開溶媒は０．１％アンモニア水溶液）で脱塩し、前記式２で表される７糖オリゴ糖を７．９ｍｇ（９６％）得た。

式２で表される７糖オリゴ糖の物理的データは以下の通りである。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）５．２２（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝３．４ Ｈｚ）, ５．１２（ｓ, １Ｈ）, ４．９４−４．９２（ｍ, １Ｈ）, ４．８１−４．７６（ｍ, １Ｈ）, ４．５９（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ４．５６（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．２ Ｈｚ）， ４．４７（ｄ, １Ｈ, Ｊ＝７．６ Ｈｚ）, ４．２９−４．２４（ｍ, １Ｈ）, ４．２１−４．１８（ｍ， １Ｈ）， ４．１２（ｄｄ, １Ｈ, Ｊ＝１．４, ３．４ Ｈｚ）, ４.０３−３．４１（ｍ, ３９Ｈ）, ２．０８−２．０４（ｍ, ９Ｈ, Ａｃ×３）； ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８４Ｈ１４５Ｎ１３ＮａＯ４９^＋［Ｍ＋Ｎａ］^＋： １２９８．４， ｆｏｕｎｄ １２９７．３

［式１で表される７糖オリゴ糖のワンポット合成］
実施例１で得られた前記式４で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチド（３．０ｍｇ，１．２μｍｏｌ）を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１１５．８３μＬに溶解し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ由来のガラクトシダーゼ（３μｇ／μＬ）を１．１７μＬ加えた。反応液を３７℃で２１時間過熱撹拌したのち、７０℃で１時間加熱しガラクトシダーゼを失活させた。次に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を１０μＬ加えた。３７℃で２時間加熱撹拌したのち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（１μｇ／μＬ）を５μＬ加えた。反応液を３７℃で２０時間過熱撹拌したのち、凍結乾燥した。凍結乾燥後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（イアトロビーズ６ＲＳ−８０６０（１０ｍＬ）、展開溶媒０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：１：２（４５ｍＬ）〜０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ＝１：１（３０ｍＬ）を溶出）。溶出液をＴＬＣで追跡し（発色液はアニスアルデヒド）、Ｒｆ値＝０．８にスポットが確認された溶出液を減圧濃縮した。濃縮後の残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアジャパン（株）、製品コード１７０８５１０１、展開溶媒は脱イオン水）で脱塩し、前記式１で表される７糖オリゴ糖を１．２ｍｇ（８６％）得た。実施例２で合成した７糖オリゴ糖と^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが一致したことから、構造を決定した。

［式２で表される７糖オリゴ糖のワンポット合成］
実施例１で得られた前記式５で表される１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチド（３．４ｍｇ，１．３μｍｏｌ）を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１３０．６８μＬに溶解し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ由来のガラクトシダーゼ（３μｇ／μＬ）を１．３２μＬ加えた。反応液を３７℃で２１時間過熱撹拌したのち、７０℃で１時間加熱しガラクトシダーゼを失活させた。次に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を１０μＬ加えた。３７℃で２時間加熱撹拌したのち、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（１μｇ／μＬ）を５μＬ加えた。反応液を３７℃で２０時間過熱撹拌したのち、凍結乾燥した。凍結乾燥後の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（イアトロビーズ６ＲＳ−８０６０（１０ｍＬ）、展開溶媒０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：１：２（４５ｍＬ）〜０．１％ＮＨ_４ＯＨ：ＭｅＯＨ＝１：１（３０ｍＬ）を溶出）。溶出液をＴＬＣで追跡し（発色液はアニスアルデヒド）、Ｒｆ値＝０．８にスポットが確認された溶出液を減圧濃縮した。濃縮後の残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィーＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアジャパン（株）、製品コード１７０８５１０１、展開溶媒は脱イオン水）で脱塩し、前記式２で表される７糖オリゴ糖１．７ｍｇ（ｑｕａｎｔ．）得た。実施例３で合成した７糖オリゴ糖と^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが一致したことから、構造を決定した。

本発明によれば、２本鎖のうち一方の側鎖の非還元末端にガラクトースが１残基結合した２種類の７糖オリゴ糖を簡便かつ収率良く製造する方法を提供することができる。７糖オリゴ糖は、抗体医薬品の主要構成成分であるＧ１糖鎖を有する抗体の糖鎖供給源であり、新しい医薬品を製造するための原料として利用できる可能性がある。

Claims (4)

1. （１）下記式３で表される１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを加水分解して下記式４と下記式５で表される２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、（２）前記２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれを単離精製する工程、および（３）前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、非還元末端のガラクトースを加水分解し、シアル酸を加水分解し、還元末端のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加水分解して、２種類の７糖オリゴ糖を得る工程を含む、７糖オリゴ糖の製造方法。
   式３：
   

   

   式４：
   

   

   式５：
   

   
2. 前記単離精製を逆相分配クロマトグラフィーで行う、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記工程（３）が、前記単離精製した２種類の１０糖モノシアリルオリゴ糖ペプチドのそれぞれについて、（ａ）ガラクトシダーゼを添加し反応させる工程、（ｂ）ガラクトシダーゼを不活性化する工程、（ｃ）ノイラミニダーゼを添加し反応させる工程、および（ｄ）エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加し反応させる工程、を順次ワンポットで行い２種類の７糖オリゴ糖を得る工程である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記２種類の７糖オリゴ糖が下記式１、および式２で表される糖鎖である、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
   式１：
   

   

   式２：
   

   

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