CN109021079A - 一种降血糖十六肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降血糖十六肽，所述十肽的氨基酸序列如下所示：Arg‑Asn‑Pro‑Phe‑Val‑Phe‑Ala‑Pro‑Thr‑Leu‑Leu‑Thr‑Val‑Ala‑Ala‑Arg，缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR，分子量1773.11Da，纯度为95.2%。本发明的十肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外α‑淀粉酶和α‑葡萄糖苷酶的抑制活性检测表明，对2种酶都有良好抑制作用，对α‑淀粉酶的50%抑制浓度（IC50）为1077.59μg/mL，对α‑葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为164.49μg/mL。本发明提供一种在体外降血糖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血糖十六肽。
背景技术
糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起的蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢紊乱，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽S-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。
人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶这两种关键酶。因此，抑制这两种关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升高过快的目的。
发明内容
本发明选取α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶为研究对象，测定合成肽的体外抑制活性。本发明的目的是提供一种具有体外降血糖活性的十六肽，可应用于生物制药领域。
本发明所述的合成多肽缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR，分子量1773.11Da，纯度为95.2％，序列为：Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg。其中，
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；
Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为Valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基；
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Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
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Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
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Thr表示英文名称为Threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为Valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。
本发明通过研究合成肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用进而确定其降血糖作用。
进一步地，所述十六肽对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为1077.59μg/mL。
进一步地，所述十六肽对α-葡萄糖苷酶的50％抑制浓度(IC50)为164.49μg/mL。
进一步地，所述十六肽分子量1773.11Da，纯度为95.2％。
进一步地，所述十六肽在浓度为2.5～5mg/mL内，对α-淀粉酶的抑制率是60％～80％。
进一步地，所述十六肽在浓度为1-2.5mg/mL内，对α-葡萄糖苷酶的抑制率是90％～100％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该降血糖十六肽，并该十肽肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，所述合成多肽具有降血糖能力。
附图说明
图1a为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的HPLC图。
图1b为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的MS图。
图2a为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg对α-淀粉酶的抑制活性曲线。
图2b为合成多肽Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。
多肽固相合成
选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro-Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg的特征，先将Arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Asn的氨基和Arg的羧基缩水反应，处理后，再添加Pro，Asn的氨基和Pro的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Arg氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B:含有0.09％TFA(v/v)的溶液(80％乙腈+20％水)；20min内B相由14.0％上升到24.0％，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到95％以上，并经MS鉴定结构(如图1所示)。
合成多肽对α-淀粉酶的体外抑制活性
1试剂的配制
1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na2HPO4 2.84g、KH2PO4 2.72g分别溶于100mL蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过程用pH计测量实时酸碱度。
2)1U/mL淀粉酶溶液：取淀粉酶4μL，与1996μL蒸馏水混合，配成2mL酶液。
3)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉，溶于99mL缓冲液中。
4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同剂量的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。
5)DNS终止反应液：称取1g DNS，12g酒石酸钠钾于锥型瓶中，加入87mL 0.4MNa2CO3溶液。
6)阿卡波糖溶液：用于阳性对照，称取一定量阿卡波糖配制成不同浓度梯度的溶液(0～8mg/mL)。
2实验步骤
1)1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。
2)实验组用移液枪吸取抑制剂(0～10mg/mL)20μL与酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(0～8mg/mL)20μL与酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。
3)加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。
4)加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。
5)反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度,实验组与对照组分别用A实验组与A对照组表示。
合成多肽对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性
1试剂的配制
1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na2HPO4 2.84g、KH2PO4 2.72g分别溶于100mL蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过程用pH计测量实时酸碱度。
2)P-NPG溶液：底物溶液，称取0.003765g p-NPG,溶于15mL蒸馏水中。
3)0.2U/mLα葡萄糖苷酶液：吸取已分装的酶液(200U/ml)5μL，用蒸馏水配成5mL。
4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同浓度的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。
5)0.2M Na2CO3：称取0.848g Na2CO3，溶于40mL蒸馏水中。
2实验步骤
1)于96孔板中反应，实验组、背景组、对照组、阳性对照组添加试剂如表1所示，于37℃摇床反应20min。
表1样品的添加量
2)各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μL Na2CO3溶液终止反应。
3)于405nm测吸光度。
应用实施例1
取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十六肽(2.5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十六肽对α-淀粉酶的抑制率是60％。
应用实施例2
取1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。实验组用移液枪吸取十六肽(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(5mg/mL)20μL与α-淀粉酶酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度，计算抑制率。由图2a可知，十六肽对α-淀粉酶的抑制率是80％。
应用实施例3
于96孔板中添加实验组(十六肽(2.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、背景组(十六肽(2.5mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(2.5mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μLNa2CO3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十六肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是100％，是阿卡波糖抑制率(50％)的2倍。
应用实施例4
于96孔板中添加实验组(十六肽(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、背景组(十六肽(1mg/mL)20μL与缓冲液10μL)、对照组(缓冲液10μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)、阳性对照组(阿卡波糖溶液(1mg/mL)20μL与α-葡萄糖苷酶酶液10μL)，于37℃摇床反应20min。各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除，加入140μL Na2CO3溶液终止反应。于405nm测吸光度并计算抑制率。由图2b可知，十六肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率是90％，是阿卡波糖抑制率(28％)的3倍。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种降血糖十六肽
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 十六肽(RNPFVFAPTLLTVAAR)
<400> 2
Arg Asn Pro Phe Val Phe Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Ala Ala Arg
1 5 10 15
Claims (6)
1.一种降血糖十六肽，其特征是该十六肽RNPFVFAPTLLTVAAR的氨基酸序列为Arg-Asn-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Pro- Thr-Leu-Leu-Thr-Val-Ala-Ala-Arg，缩写为RNPFVFAPTLLTVAAR。
2. 如权利要求1 所述的一种降血糖十六肽，其特征在于所述十六肽对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为1077.59μg/mL。
3.如权利要求1 所述的一种降血糖十六肽，其特征在于所述十六肽对α-葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为164.49μg/mL。
4.如权利要求1 所述的一种降血糖十六肽，其特征在于所述十六肽分子量1773.11Da，纯度为95.2%。
5.如权利要求1 所述的一种降血糖十六肽，其特征在于所述十六肽在浓度为2.5 ~5mg/mL内，对α-淀粉酶的抑制率是60%~80%。
6.如权利要求1 所述的一种降血糖十六肽，其特征在于所述十六肽在浓度为1-2.5mg/mL内，对α-葡萄糖苷酶的抑制率是90%~100%。
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