CN105968186A - 具有长效化作用的胰高血糖素(Glu)类似物及其应用 - Google Patents
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Classifications
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
本发明涉及具有长效化作用的胰高血糖素(Glu)类似物及其合成方法。通过对C端酰胺化的Glu的16，17，21位氨基酸进行替换修饰得到具有更长药理作用时间的Glu类似物，目标多肽的合成是通过微波促进固相合成方法快速实现，粗品经纯化，冻干得到Glu类似物。
Description
技术领域
本发明涉及降糖和减肥的药物领域，具有长效化作用的胰高血糖素(Glu)类似物及其应用。
背景技术
代谢综合征的病因是蛋白质、脂肪及碳水化合物等多种代谢异常的共同病理、生理基础。营养过剩、体力活动减少等原因会导致肥胖以及肥胖相关疾病如2型糖尿病、血脂代谢异常的发病率日益增高。
胰高血糖素：(Glu)含29个氨基酸组成的，胰脏胰岛α-细胞分泌的激素。肽序为：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH。它的药理活性是通过激动GLP-1受体(GLP-1R)和胰高血糖素受体(GCGR)发挥作用。激动GCGR，表现出促进分解作用，胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高。胰高血糖素通过cAMP-PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速氨基酸进入肝细胞，并激活糖异生过程有关的酶系，糖异生增强，促进氨基酸的代谢分解。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多，表现为促进脂肪分解，降低体重；而激动GLP-1受体，能葡萄糖依赖性的促进胰岛素的释放，降低血糖。并且激活GLP-1受体也表现出生热作用，能一定程度降低体重。而胰高血糖素对GCGR的激动活性远远强于对GLP-1受体的激动活性，因此主要表现出GCGR的作用，表现出升糖作用、很好的促分解和减肥作用。
多肽类似物在体内也易被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)快速降解，还会被肾脏快速滤过代谢，所以需要我们对该Glu类似物进行长效化改造，以提高稳定性。
因此这里，我们设计了一类具有长效化的降糖减肥作用多肽，通过对胰高血糖素进行结构改造，提高对GLP-1R的激动作用，并且适度降低对GCGR的激动作用，通过肽链的半胱氨酸与马来酰亚胺化的脂肪链或脂肪酸缀合，增加肽链与血清白蛋白的结合，避免了多肽的肾脏快速滤过和代谢失活，从而显著延长半衰期及体内降糖作用时间，有效的逆转了升糖作用，协同发挥减肥作用，获得了长效化和降糖减肥效果更优的多肽。
发明内容
本发明涉及一类胰高血糖素(Glu)相关缀合物，其序列为：
His-Xaal-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa2-Xaa3-Arg-Ala-Gln-Xaa4 Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-NH2(SEQ.ID NO：1)
其中：
Xaal：Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；
Xaa2：Ser或脂肪链修饰的Cys；
Xaa3：Arg或脂肪链修饰的Cys；
Xaa4：Asp或脂肪链修饰的Cys；
其中脂肪链修饰的Cys选自
这里：n选自1～20。
其中优选的脂肪链修饰的Cys结构为
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
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在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)缀合物：
本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明进一步提供了述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于降糖和减肥的药物中的运用。
本发明提供的上述化合物化学性质稳定，较原型胰高血糖素(Glu)(半衰期2min)有显著的提高，另外，本发明提供的上述化合物或化合物作为有效成分制备的药物组合物用于降低体内血糖浓度时，具有显著的降糖效果，还能显著减轻体重。长效化效果达12h，从而克服了多肽必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效的缺陷。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。
本发明的优点在于：
1.提出的一种具有长效化作用的胰高血糖素(Glu)缀合肽具有降糖减肥活性，并提高了稳定性。
2.微波促进固相合成的胰高血糖素(Glu)缀合肽大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右，常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提 高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。
3.微波促进固相合成胰高血糖素(Glu)缀合肽的粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。
4.微波促进固相方法合成胰高血糖素(Glu)缀合肽，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。
5.微波促进固相合成胰高血糖素(Glu)缀合肽的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。
因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的具有长效化作用的胰高血糖素(Glu)缀合肽，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的胰高血糖素(Glu)缀合肽，降血糖作用明显、减肥作用时间长，适合作为治疗糖尿病、减肥药物的活性成分。
具体实施方式
在本说明书全文中采用以下缩写：
Et3N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly.甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。
本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。
实施例1
的微波促进固相合成
(1)树脂的溶胀
称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
(2)微波促进Fmoc保护基的脱除
将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
(3)微波促进Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide-MBHA Resin的合成
将Fmoc-Thr(tBu)OH(0.4mmol)，HBTU(0.4mmol)，HOBT(0.4mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(4)偶合效率的检测
用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。
茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
(5)肽链的延长
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，合成到肽链17位时，加入脂肪链修饰的半胱氨酸，偶合45min，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次 连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到化合物的粗品332mg，收率为94.3％。
(7)马来酰亚胺化的脂肪链或脂肪酸的合成
将β-氨基丙氨酸，6-氨基己酸，12-氨基十二酸(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。(8)马来酰亚胺化的脂肪链与多肽的缀合
称取1-己基-1H-马来酰亚胺-2，5-酮(0.1mmol)溶于2ml甲醇中，粗肽溶于2ml水中，并相互混合，5ul DIEA作为催化剂，5ul NMP助溶，室温下搅拌反应2h。
(9)多肽缀合物的纯化
将多肽混合物溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品300mg。理论相对分子质量为3495.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1227.0，[M+4H]4+920.6；calu[M+3H]3+1226.6，[M+4H]4+920.2。
实施例2～12
根据实施例1所述的一般性方法，根据相应的序列合成得到实施例2～12的胰高血糖素类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
实施例2
理论相对分子质量为3760.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1254.7，[M+4H]4+941.3；calu[M+3H]3+1254.6，[M+4H]4+941.2
实施例3
理论相对分子质量为3790.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1264.2，[M+4H]4+948.9；calu[M+3H]3+1264.7，[M+4H]4+948.7。
实施例4
理论相对分子质量为3817.1。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1273.7，[M+4H]4+955.6；calu[M+3H]3+1273.4，[M+4H]4+955.3。
实施例5
理论相对分子质量为3607.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1204.1，[M+4H]4+903.4；calu[M+3H]3+1203.6，[M+4H]4+902.9。
实施例6
理论相对分子质量为3691.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1232.1，[M+4H]4+924.1；calu[M+3H]3+1231.6，[M+4H]4+924.0。
实施例7
理论相对分子质量为3721.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1241.2，[M+4H]4+931.4；calu[M+3H]3+1241.6，[M+4H]4+931.5。
实施例8
理论相对分子质量为3748.0。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1250.7，[M+4H]4+938.1；calu[M+3H]3+1250.4，[M+4H]4+938.0。
实施例9
理论相对分子质量为3694.9。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1232.4，[M+4H]4+924.9；calu[M+3H]3+1232.6，[M+4H]4+924.7。
实施例10
理论相对分子质量为3779.2。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1260.7，[M+4H]4+945.6；calu[M+3H]3+1260.7，[M+4H]4+945.8。
实施例11
理论相对分子质量为3808.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1270.9，[M+4H]4+953.1；calu[M+3H]3+1270.6，[M+4H]4+953.2。
实施例12
理论相对分子质量为3834.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]3+1279.1，[M+4H]4+959.6；calu[M+3H]3+1279.3，[M+4H]4+959.7。
实施例13
Glu及脂肪链缀合的胰高血糖素(Glu)类似物的血浆半衰期测定实验
大鼠眼球取血，血液装入含有肝素的离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清血浆作为温孵血浆，利用LC-MS来检测化合物的响应信号。100ul的Glu和Glu类似物溶液与100ul的血浆，涡旋混合后置入37℃水浴中，温孵96小时，在0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72，96h时间点取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm离心，取上清液进LC-MS，计算各个时间点的峰面积，做出衰减曲线，计算半衰期。如表1所示，没有经过改造的原型Glu类似物半衰期半小时不到，而脂肪链修饰后的Glu类似物血浆稳定性明显提高，半衰期明显延迟，最长的化合物半衰期已经达到30小时以上。.
表1脂肪链缀合的Glu多肽类似物体外血浆稳定性数据
实施例14
脂肪链缀合的胰高血糖素类似物的GLP-1R和GCGR受体激动活性筛选
HEK293细胞分别共转染编码GLP-1R或GCGR的cDNA，细胞系表达并利用WesternBlot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R或GCGR的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达的细胞株HEK293。
测定化合物的试验中，提前2h将细胞种于96孔板中，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的细胞中。细胞孵化20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒，使用酶标仪测定荧光读数，建立标准曲线将荧光读数转化为相应的cAMP数值，使用Graphpad Prism 5.0软件的非线性回归计算化合物的EC50数值。
如表2所示，大部分化合物较原型胰高血糖素相比，对GLP-1R的激动活性表现出明显的提高，而保持了对GCGR的激动活性，其中SEQ.ID NO：4对GLP-1R的激动活性提高了近10倍。
表2长效化脂肪链缀合的Glu类似物对GLP-1R和GCGR激动活性
实施例15
Glu及脂肪链缀合的胰高血糖素类似物的口服降血糖实验
正常ICR小鼠，分为14组，每组6只，小鼠饲养在标准化动物房中。禁食12h后，给予Glu及脂肪链缀合的胰高血糖素类似物，对照组注射生理盐水。进行小鼠单次腹腔葡萄糖耐量实验。各组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)，注射葡萄糖时定为0min，在0，15，30，60，120min用血糖仪测定血糖水平。
如表3所示，改造后部分化合物的降糖活性与给生理盐水组相比，降糖活性提高明显。其中以SEQ.ID NO：4，SEQ.ID NO：6和SEQ.ID NO：12的降糖活性最为显著，与我们获得的化合物具有很好的GLP-1R激动活性，并且GCGR激动活性适度减弱结果一致。
表3 Glu及胰高血糖素缀合肽口服降血糖的效应
n＝6， *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs saline as control
实施例16
Glu及优选的胰高血糖素缀合肽的多次腹腔葡萄糖耐量实验
选取8周龄ICR小鼠，随机分组，每组8只，适应性饲养7天后，在实验开始前12小时禁食，只给予饮水。每组小鼠在给予Glu及优选的胰高血糖素缀合肽之前，测初始血糖值，定为0min，然后腹腔给予长效化Glu类似物，30min后腹腔注射葡萄糖(每千克18mmol)，对照组注射相同体积的生理盐水。0min，15min，30min，60min，120min分别尾部取血，测定血液葡萄糖浓度。并且于180min，360min，540min再次注射葡萄糖，继续测定血糖值，一共重复给予4次葡萄糖，检测化合物的长效化降糖活性。
如表4所示，Glu缀合肽SEQ.ID NO：4在第四次给予葡萄糖时，仍然维持了很好的降糖活性，表明化合物经过改造后，其长效化降糖作用显著，达到了12h以上。
表4 Glu及胰高血糖素(Glu)缀合肽多次腹腔葡萄糖耐量效应
n＝8， *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs saline as control。
Claims (9)
1.一种含有式I(SEQ.ID NO：1)结构的长效化胰高血糖素(Glu)类似物，其序列为：His-Xaa1-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa2-Xaa3-Arg-Ala-Gln-Xaa4-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID NO：1)
其中：
Xaa1：Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；
Xaa2：Ser或脂肪链修饰的Cys；
Xaa3：Arg或脂肪链修饰的Cys；
Xaa4：Asp或脂肪链修饰的Cys；
2.根据权利要求1所述的肽，其中脂肪链修饰的Cys选自
这里：n选自1～20。
3.根据权利要求2所述，其中优选的脂肪链修饰的Cys结构为
4.根据权利要求1所述的胰高血糖素(Glu)类似物，优选的序列为：
5.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的胰高血糖素类似物和其药学上可接受的盐。
6.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的胰高血糖素类似物和药学上可接受的载体或稀释剂。
7.权利要求1中所述的胰高血糖素类似物和其药学上可接受的盐在制备用于降糖和减肥的药物中的运用。
8.权利要求1中所述的胰高血糖素类似物和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于降糖和减肥的药物中的运用。
9.权利要求1中所述的胰高血糖素类似物的制备方法，包括生物表达、液相合成和固相合成制备方法。
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