BR112014026077B1

BR112014026077B1 - Método de síntese em fase sólida de uma cadeia b de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia b de insulina, e método para preparação de um peptídeo da cadeia b de insulina

Info

Publication number: BR112014026077B1
Application number: BR112014026077-0A
Authority: BR
Inventors: Kleomenis K. Barlos
Original assignee: Kleomenis K. Barlos
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2022-03-08
Also published as: NZ631001A; CN104428314A; CN104428314B; AU2013250755A1; HK1203525A1; US20210388051A1; EP2838915B1; EP2838915A1; US20160031962A1; CA2870891A1; CA2870891C; IL235183B; BR112014026077A2; IN2014DN09089A; WO2013156977A1

Abstract

síntese de peptídeos em fase sólida de insulina usando lisina ancorada na cadeia lateral. o presente pedido de patente descreve a preparação de peptídeos, incluindo insulina e os derivados de insulina, usando métodos eficientes para síntese de peptídeos em fase sólida e em fase de solução.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A insulina e os derivados de insulina e os análogos são preparados eficientemente pela síntese em fase sólida das cadeias A e B e a oxidação randômica da cadeia A bisoxidada com a cadeia B linear. Lisina e peptídeos contendo lisina que foram ligados pela cadeia lateral de lisina em resinas ácidas e termolábeis. Este método permite a síntese em fase sólida de vários peptídeos e peptídeos modificados.

[002] A insulina é uma pequena proteína que consiste de duas cadeias peptídicas, cadeias A e B, que são juntadas por duas ligações dissulfeto intermoleculares. Além disso, a cadeia A contém uma ligação dissulfeto intramolecular adicional. A insulina e seus derivados são os fármacos mais importantes para o tratamento do diabetes. As propriedades farmacêuticas da insulina podem ser modificadas por modificações leves das duas cadeias peptídicas. Por isso, vários derivados de insulina (Figura 1) foram desenvolvidos e comercializados como insulina detemir (Levemir), insulina glargina (Lantus), insulina aspart (Novolog), insulina lispro (Humalog) e insulina glulisina (Apidra).

[003] A preparação da insulina usando abordagens biomiméticas é conhecida na técnica. P. E. Oyer, S. Cho, J. D. Peterson, D. F. Steiner, J. Biol. Chem. 1971, 246, 1375-1386; W. Kemmler, J. D. Peterson, D. F. Steiner, J. Biol. Chem. 1971, 246, 6786-6791. Estes métodos produzem a pró-insulina por técnicas de DNA recombinante, e o produto da pró- insulina linear então é dobrado por oxidação. Finalmente, utilizando enzimas, o peptídeo C central da pró-insulina é removido e a insulina final é liberada.

[004] Até o momento, uma via química e economicamente factível para a insulina não foi desenvolvida apesar dos numerosos esforços do trabalho de Zahn, Katsogiannis, Kisho, Kent, Instituto de Xangai, Ciba Geigy, Eli Lilly, Novo Nordisc, Sanofi-Aventis e outros. Nenhum destes esforços produziu insulina sintética em rendimento e custos razoáveis.

[005] Os quatro métodos que foram aplicados até o momento são: 1) a mistura randômica de cadeias A e B lineares e sua oxidação ao ar; 2) a mistura de grupos ácidos sulfônicos contendo a cadeia A na posição dos grupos tiol dos resíduos cisteína, com a cadeia B sulfonada; 3) a construção direcionada ao sítio de três ligações dissulfeto entre as cadeias A e B; e 4) uma síntese onde a função de peptídeo C na pró- insulina foi substituída por uma ligação éster entre as cadeias laterais de Glu (A14) e Thr (B30). Este método requer duas reações com fluoreto de hidrogênio líquido e nove purificações cromatográficas, mas este método é considerado ser a síntese química mais eficaz até o momento.

[006] As principais dificuldades encontradas durante a síntese química da insulina e seus análogos são: a) A insolubilidade da cadeia A e de peptídeos intermediários protegidos que impedem uma síntese em fase sólida e purificação gradual eficaz; b) A difícil síntese da cadeia B de insulina usando aminoácidos Fmoc associados com a difícil reação de acoplamento em posições His(B10), Leu(B11) e Val(B12) [B. Due Larsen e A. Holm J. Peptide Res. 1998, 52, 470-476]; e c) O baixo rendimento obtido em combinação das cadeias. Por exemplo, o método 2 (acima), forneceu somente um rendimento combinado de 7% das cadeias A e B.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

[007] Em uma modalidade, o presente pedido de patente descreve métodos eficazes para superar os problemas citados acima que, dessa forma, permitem a síntese química da insulina, seus derivados e seus análogos. O presente pedido de patente descreve: 1) A síntese de cadeias A; 2) cadeias B; e 3) A combinação das cadeias A e B bisoxidadas.

[008] Em uma modalidade, é fornecido um conjugado resina-lisina compreendendo uma resina e uma lisina ou um derivado de lisina da fórmula I: em que

[009] W é uma resina sensível ao ácido ou sensível ao calor ou resina que é tanto sensível ao ácido como ao calor em direção à clivagem da lisina ou do derivado de lisina da resina;

[0010] R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri- alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro- O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, - Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente grupo carboxila terminal protegido e um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;

[0011] em que Pr1 é um grupo protetor -OH e cada Pr2 e PR3 é independentemente hidrogênio ou um grupo protetor guanidina; e

[0012] P é hidrogênio, um grupo protetor amino, um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo amino terminal protegido, em que o resíduo peptídico N-terminal compreende um C-terminal e um N-terminal e um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;

[0013] contanto que quando R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro-O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)- OH, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)- Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, - Thr(Pr1)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri- alquilsilila C1-3 e um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, então P não é hidrogênio ou um grupo protetor amino.

[0014] Como usado neste pedido, a cláusula "um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e grupo carboxila terminal opcionalmente protegido" significa que, onde o resíduo peptídico compreende um ou mais aminoácidos, cada uma das cadeias laterais do aminoácido pode ser independentemente desprotegida ou pode ser independentemente protegida por um grupo protetor, e o grupo carboxila pode ser um grupo carboxila livre (-COOH) ou um grupo carboxila protegido.

[0015] Em um aspecto do mencionado acima, a resina é selecionada do grupo consistindo em resina 2-clorotritila, resina 4- metoxitritila, resina 4-metiltritila, resina tri-alcoxidifenila, resina tetra- alcoxidifenila, resina benzila, resina metoxibenzila, resina dimetoxibenzila e resina trimetoxibenzila. Em outro aspecto, a resina W compreende as fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId:

[0016] em que: n é 0, 1, 2 ou 3; cada R1 e R3 é independentemente selecionado de H ou é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-Cl, 2-alquila C1-3, 2-alcóxi C1-3, 4-alquila C1-3, 4-alcóxi C1-3, contanto que em cada uma das fórmulas Ib, Ic e Id, somente um de R1 e R3 seja 2-Cl e somente um de R1 e R3 seja H; R2 é a fase sólida da resina; e Z é uma ligação ou -C(=O)-

[0017] Em outro aspecto, o conjugado lisina-resina compreendendo as SEQ ID NOs, como observado neste pedido, inclui o resíduo peptídico compreendendo lisina ou derivado de lisina que é ligado à resina, e a lisina ou o derivado de lisina podem estar localizados no C- terminal, N-terminal ou em uma posição interna do resíduo peptídico. Em outro aspecto do conjugado acima, P é selecionado do grupo consistindo em terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc), benzilóxi-carbonila (carboxibenzila ou Z), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-etila (Dde), 2-nitrofenilsulfenila (Nps) e aliloxicarbonila (aloc). Em um aspecto, P é selecionado do grupo consistindo em acetila (Ac), Fmoc, grupo 9-fluorenoacetila, grupo 1- fluorenocarboxílico, grupo 9-fluorenocarboxílico, grupo 9-fluorenona-1- carboxílico, benziloxicarbonila, xantila (Xan), tritila (Trt), 4-metiltritila (Mtt), 4-metoxitritila (Mmt), 4-metóxi-2,3,6-trimetil-benzenosulfonila (Mtr), mesitileno-2-sulfonila (Mts), 4,4-dimetoxibenzidrila (Mbh), tosila (Tos), croman-6-sulfonila 2,2,5,7,8-pentametila (Pmc), 4-metilbenzila (MeBzl), 4-metoxibenzila (MeOBzl), benzilóxi (BzlO), benzila (Bzl), benzoíla (Bz), 3-nitro-2-piridinossulfenila (Npis), 1-(4,4-dimetila-2,6- dioxociclohexilideno)etila (Dde), 2,6-diclorobenzila (2,6-DiCl-Bzl), 2-clorobenziloxicarbonila (2-Cl-Z), 2-bromobenziloxicarbonila (2-Br-Z), benziloximetila (Bom), t-butoxicarbonila (tBoc), ciclohexilóxi (cHxO), t- butoximetila (Bum), t-butóxi (tBuO), t-butila (tBu) e trifluoroacetila (TFA).

[0018] Como usado neste pedido, um "resíduo peptídico" ou "fragmento peptídico" é um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos. Um resíduo peptídico que é ligado ao terminal carboxila, como aquele do conjugado lisina-resina da fórmula I, por exemplo, pode ser um aminoácido único que tem um grupo protetor alfa-amino ou um grupo protetor carboxila ou ambos os grupos protetores (isto é, protegido ou parcialmente protegido), ou o aminoácido sem um grupo protetor amino ou sem um grupo protetor carboxila (isto é, desprotegido ou parcialmente protegido) ou o resíduo peptídico pode ser dipeptídeo ou polipeptídeo, em que cada um dos aminoácidos no peptídeo pode ser protegido, parcialmente protegido ou desprotegido.

[0019] Em um aspecto do mencionado acima, R é -OH ou é um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo da prolina (Pro), treonina (Thr) e treonina-arginina-arginina (Thr-Arg-Arg), cada um protegido, parcialmente protegido ou desprotegido. Em um aspecto do mencionado acima, o grupo -OH protetor Pr1 é um grupo protetor tipo alquila ou benzila como terc-butila, 4-metóxi-benzila etc. Em outro aspecto, cada Pr2 e Pr3 é independentemente um grupo protetor guanidina, um tipo alcoxicarbonila ou arilsulfonila C1-6 como Pbf, Pmc etc.

[0020] Um método para a síntese em fase sólida de um resíduo peptídico protegido, parcialmente protegido ou desprotegido compreendendo 1 a 200 aminoácidos, o processo compreendendo:

[0021] a) preparação de um conjugado lisina-resina compreendendo uma resina e uma lisina ou um derivado de lisina da fórmula I, em que:

[0022] W é uma resina sensível ao ácido ou sensível ao calor ou resina que é tanto sensível ao ácido como ao calor em direção à clivagem da lisina ou derivado de lisina da resina;

[0023] R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri- alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro- O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, - Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido e um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;

[0024] em que Pr1 é hidrogênio ou um grupo protetor -OH e cada Pr2 e PR3 é independentemente hidrogênio ou um grupo protetor guanidina;

[0025] P é hidrogênio, um grupo protetor amino, um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo amino terminal protegido, em que o resíduo peptídico N-terminal compreende um C-terminal e um N-terminal e um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36;

[0026] contanto que quando R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro-O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)- OH, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)- Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, - Thr(Pr1)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri- alquilsilila C1-3 e um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, então P não é hidrogênio ou um grupo protetor amino;

[0027] b) o acoplamento do conjugado lisina-resina da fórmula I em que R é -OH com um peptídeo C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, para formar o conjugado da fórmula Ia:

[0028] em que R1 é selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro-O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)- Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-tri- alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O-alquila C1-6, - Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3 ou um resíduo peptídico C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido; ou

[0029] b’) acoplamento do conjugado lisina-resina da fórmula I em que P é H e R1 é um grupo protetor carboxila ou um resíduo peptídico C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, em que o resíduo peptídico compreende um C-terminal e um N-terminal, no grupo alfa-amino da lisina ou derivado de lisina,

[0030] com um peptídeo N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente grupo amino terminal protegido, em que o peptídeo N- terminal compreende um C-terminal e um N-terminal, para formar o conjugado da fórmula Ia:

[0031] em que R1 e P são como definidos acima; e

[0032] c) opcionalmente removendo o grupo protetor Pr1, Pr2 ou Pr3 ou o grupo protetor no resíduo peptídico C-terminal para formar o conjugado desprotegido da fórmula Ia em que Pr1, Pr2 e Pr3 são hidrogênio ou onde o C-terminal é um grupo carboxila livre; e d) opcionalmente clivando o resíduo peptídico da resina W.

[0033] Em um aspecto do mencionado acima, o grupo protetor amino dos 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida, como Fmoc, é removido pelo tratamento com uma amina secundária como piperidina ou dietilamina e a amina livre é acoplada ainda com um aminoácido opcionalmente protegido ou um peptídeo opcionalmente protegido compreendendo 1 a 200 aminoácidos usando um agente de acoplamento como DCC, DIC ou EDAC, opcionalmente na presença de um aditivo selecionado de HOBt, HOSu, tiofenol ou pentafluorofenol.

[0034] Em outro aspecto do método acima, a resina W compreende uma fórmula IIIa, IIIb, IIIc ou IIId, em que as variáveis n, R1, R2, R3 e Z são como definidas acima.

[0035] Em outro aspecto do acima mencionado, a lisina ou derivado de lisina é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36.

[0036] Em outro aspecto do método acima, o acoplamento do conjugado lisina-resina da fórmula I:

[0037] para a etapa b) em que R é -OH na fórmula I com um peptídeo C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos é realizado pela ativação do grupo carboxila C-terminal livre e pela condensação do grupo carboxila ativado com o peptídeo C-terminal para formar o conjugado da fórmula Ia, em que R1 é o resíduo peptídico C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido; ou

[0038] para a etapa b’) em que o grupo alfa-amino da lisina ou derivado de lisina é acoplado com um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos, é realizado pela ativação do grupo carboxila N-terminal livre para formar um grupo carboxila ativado que usa um grupo ativado selecionado do grupo consistindo em DCC, PFPOH, DMAP; PFP-trifluoroacetato, piridina; PFPOH, EDC, DMA; EDC, HOBt; FDPP, DIEA, DMF, EDC, HOAt; HBTU; HATU; HATU, HOAt; Ac2O, DMAP; Ac2O, piridina; DPPA; FDPP; DCC, HOAt; DCC, HOBt; DIC, HOBt; e EDC-HCl; e condensação do grupo carboxila ativado do peptídeo N-terminal para formar o conjugado da fórmula Ia, em que P é um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido.

[0039] Como usado em referência para o composto da fórmula I, a cláusula "R é um resíduo peptídico C-terminal compreendendo 1-200 aminoácidos" significa que os 1-200 aminoácidos são ligados ao C- terminal da lisina ou derivado da lisina. Similarmente, a cláusula "P é um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1-200 aminoácidos" significa que os 1-200 aminoácidos são ligados ao N-terminal (ou o grupo alfa-amino) da lisina ou derivado da lisina. Em um aspecto, a ativação do grupo carboxila C-terminal livre é realizado em um solvente selecionado do grupo consistindo em DCM, DMF, NMP, DMSO ou misturas destes.

[0040] Em outro aspecto do método acima, em que após a etapa b) ou b’) o método compreendendo ainda: d) clivagem do resíduo peptídico da resina W entrando em contato com o conjugado de peptídeo ligado à resina da fórmula Ia sob condição acídica branda usando uma mistura de um ácido orgânico e um solvente, ou aquecimento do peptídeo ligado à resina a uma temperatura elevada, ou tanto usando uma mistura de um ácido orgânico como um solvente, junto com o aquecimento do peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada por um período de tempo suficiente para clivar o peptídeo compreendendo uma lisina com um grupo amino livre da resina W; e) acilação do grupo amino livre da lisina compreendendo o peptídeo com R’CO-X onde X é Cl, Br, CH3CO- e R’ é selecionado do grupo consistindo em CH3CO- ou um resíduo peptídico com carboxila C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos para formar um derivado peptídico N-acilado; e h) isolamento do derivado de peptídeo N-acilado da fórmula II:

[0041] Em outro aspecto do método acima, o grupo acila (R’CO-) é derivado do haleto de acila ou anidrido de ácido mirístico, um haleto de aminoácido codificado ou não codificado, Fmoc-Glu-OtBu e tBuO-CO- (CH2)14 -CO-NH-Glu-OtBu. Em outro aspecto do método acima, o conjugado lisina-resina da fórmula Ia compreendendo um grupo carboxila C-terminal livre é ainda convertido em alquil éster de carboxila correspondente colocando em contato o grupo carboxila com um haleto de alquila selecionado do grupo consistindo em cloreto de difenilmetila, cloreto de 4-metoxidifenilmetila, cloreto de 4-metildifenilmetila, cloreto de tritila, cloreto de 2-clorotritila, cloreto de 4-metiltritila e cloreto de trimetilsilila e cloreto de trietilsilila na presença de uma base, ou ativando o grupo carboxila C-terminal e reagindo com uma resina amino selecionada de resina Rink-MBHA amida ou Rink-AM amida. Em um aspecto do método acima, o peptídeo C-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos ou resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos é selecionado de uma cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina, ou é um resíduo peptídico selecionado das SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36.

[0042] Em outro aspecto do método, o grupo acila (R’CO-) é derivado de haleto ou anidrido de ácido mirístico, um haleto de aminoácido codificado ou não codificado, Fmoc-Glu-OtBu e tBuO-CO- (CH2)14-CO-NH-Glu-OtBu. Em outro aspecto do mencionado acima, o conjugado lisina-resina da fórmula Ia compreendendo um grupo carboxila C-terminal livre é convertido ainda em alquil éster de carboxila correspondente colocando em contato com o grupo carboxila com um haleto de alquila selecionado do grupo consistindo em cloreto de difenilmetila, cloreto de 4-metoxidifenilmetila, cloreto de 4- metildifenilmetila, cloreto de tritila, cloreto de 2-clorotritila, cloreto de 4- metiltritila e cloreto de trimetilsilila e cloreto de trietilsilila na presença de uma base, ou ativando o grupo carboxila C-terminal e reagindo com uma resina amino selecionada de Rink-MBHA amida ou resina Rink-AM amida. Em uma variação, a base é di-isopropiletilamina. Rink-MBHA amida e resina Rink-AM amida são conhecidas na técnica. Ver Boussard, Cyrille et al. European Journal of Medicinal Chemistry, 37(11), 2002, pp.883-890; a resina Rink-AM amida também é conhecida como resina 4-(2’,4’-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil) fenoxiacetamidoaminometila.

[0043] Em outro aspecto do mencionado acima, o método compreendendo ainda: oxidação simultânea e clivagem do peptídeo da resina de uma resina do peptídeo da cadeia A da SEQ ID NO: 9 seguido de desproteção para formar a cadeia A de insulina bisoxidada desprotegida bisoxidada da SEQ ID NO: 14; e combinar a cadeia A de insulina bisoxidada da SEQ ID NO: 14 com uma cadeia B da SEQ ID NO: 27 para formar um análogo de insulina da SEQ ID NO:6; ou combinar a cadeia A de insulina bisoxidada da SEQ ID NO: 14 com uma cadeia B da SEQ ID NO: 29 para formar um análogo de insulina da SEQ ID NO:8; ou combinar a cadeia A de insulina bisoxidada da SEQ ID NO: 36 com uma cadeia B da SEQ ID NO: 23 para formar um análogo de insulina da SEQ ID NO:4.

[0044] Em outro aspecto, é fornecido um método para a síntese em fase sólida de uma cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina, o processo compreendendo: preparação de um conjugado lisina-resina compreendendo uma resina e uma lisina ou um derivado de lisina da fórmula I, em que:

[0045] W é uma resina de umas fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId:

[0046] em que n, R1, R2 e R3e Z são como definidos acima;

[0047] R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri- alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro- O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, - Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido;

[0048] em que Pr1 é hidrogênio ou um grupo protetor -OH e cada Pr2 e PR3 é independentemente hidrogênio ou um grupo protetor guanidina;

[0049] P é hidrogênio, um grupo protetor amino, um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo amino terminal protegido, em que o resíduo peptídico N-terminal compreende um C-terminal e um N-terminal;

[0050] contanto que quando R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro-O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)- OH, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)- Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, - Thr(Pr1)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri- alquilsilila C1-3, então P não é hidrogênio ou um grupo protetor amino; o acoplamento do conjugado lisina-resina da fórmula I, em que R é selecionado de -OH, um grupo protetor carboxila e um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, com um resíduo peptídico protegido, parcialmente protegido ou desprotegido Ib, onde o resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos e o resíduo peptídico Ib em conjunto compreende a cadeia B de insulina ou o derivado da cadeia B de insulina, para formar a cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina. Em um aspecto do método, o resíduo peptídico Ib é a identidade de sequência de resíduo peptídico como descrito no presente pedido de patente que compreende a identidade de sequência da cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina. Em outro aspecto, a cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado do grupo consistindo em análogo da cadeia B de insulina des-Thr (30), uma cadeia B de insulina detemir (insulina levemir), uma insulina degludec, uma insulina Lispro (Humalog), uma insulina glargina (Lantus), uma insulina aspart (Novolog), e análogos ou derivados destas.

[0051] Em um aspecto do método acima, a resina é uma resina 2-clorotritila. Em outro aspecto do mencionado acima, P é selecionado do grupo consistindo em terc-butiloxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc), benzilóxi-carbonila (carboxibenzila ou Z), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)-etila (Dde), 2-nitrofenilsulfenila (Nps) e aliloxicarbonila (aloc). Em outro aspecto do método, a cadeia B de insulina parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7 e 8, e análogos ou derivados destas; e a clivagem adicional da cadeia B de insulina ligada à resina ou um derivado da cadeia B de insulina colocando em contato com o peptídeo ligado à resina sob a condição acídica branda usando uma mistura de um ácido orgânico e um solvente alcoólico, ou aquecendo o peptídeo ligado à resina a uma temperatura elevada, ou tanto usando uma mistura de um ácido orgânico como um solvente alcoólico junto com o aquecimento do peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada por um período de tempo suficiente para clivar a cadeia B de insulina ou um derivado da cadeia B de insulina da resina. Em outro aspecto do método, o ácido orgânico é selecionado do grupo consistindo em ácido trifluoroacético e ácido acético e misturas destes, o solvente alcoólico é selecionado do grupo consistindo em trifluoroetanol, hexafluoro-isopropanol, metanol e misturas destes, e o aquecimento da resina ligada ao peptídeo é realizado com micro-ondas. Em outro aspecto do método, a cadeia B de insulina parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado do grupo consistindo em um derivado N-acilado, um derivado pegilado, um derivado biotinilado, um derivado compreendendo um cromóforo e um resíduo peptídico compreendendo um resíduo de aminoácido natural, um resíduo de aminoácido não natural e misturas destes.

[0052] Em outra modalidade, é fornecido um método para a síntese em fase sólida de uma cadeia A de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia A de insulina, o processo compreendendo: a preparação de um conjugado de peptídeo- resina compreendendo uma resina e um resíduo peptídico, em que o conjugado de peptídeo-resina compreende a fórmula I, em que:

[0053] R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri- alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro- O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, - Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido;

[0054] P é hidrogênio, um grupo protetor amino, um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo amino terminal protegido, em que o resíduo peptídico N-terminal compreende um C-terminal e um N-terminal;

[0055] em que a resina W compreende umas fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId:

[0056] em que: n, R1, R2, R3 e Z são como definidos acima; e em que o resíduo peptídico é uma cadeia A de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia A de insulina, ou é um resíduo peptídico selecionado das SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mistura destas;

[0057] o método compreendendo contato do conjuga peptídeo- resina com o agente oxidante para oxidar simultaneamente a cadeia A de insulina e clivar o resíduo peptídico da resina; desproteger globalmente a cadeia A da insulina bisoxidada protegida; e purificar a cadeia A de insulina bisoxidada desprotegida. Em um aspecto, o método compreende ainda contato da cadeia A de insulina bisoxidada desprotegida com um peptídeo da cadeia B de insulina selecionado das SEQ ID NOS: 3, 23, 27, 29 e 34 para formar uma insulina animal ou humana ou análogo de insulina. Em outro aspecto do método, insulina animal ou humana ou análogo de insulina é selecionado das SEQ ID NOS: 1, 4, 5, 6, 7 e 8, e insulina glulisina (Adipra).

[0058] Em outra modalidade, é fornecido um método para preparer um peptídeo da cadeia B de insulina selecionado das SEQ ID NOS: 3, 23, 27, 29 e 34 compreendendo clivagem do peptídeo de um conjugado de peptídeo-resina da fórmula IV:

[0059] em que: W é uma resina de fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId em que n, R1 R2 e R3 e Z são como definidos acima, em que:

[0060] AA1 é:

[0061] A) um primeiro resíduo peptídico compreendendo um resíduo de lisina ou derivado desta ligado a W por:

[0062] i) a cadeia lateral amino da lisina ou derivado de lisina;

[0063] ii) o grupo carboxila da lisina ou derivado de lisina; ou

[0064] iii) o grupo amino N-terminal;

[0065] ou

[0066] B) um resíduo peptídico não lisina ligado a W por:

[0067] i) o grupo carboxila do resíduo peptídico não lisina;

[0068] ii) o grupo amino N-terminal do resíduo peptídico não lisina; e

[0069] AAm é o segundo ao número m de resíduos onde m é um número inteiro de 1-200; colocando em contato o conjugado peptídeo- resina com uma mistura de um ácido orgânico e um solvente, ou aquecendo a resina do peptídeo a uma temperatura elevada, ou tanto usando uma mistura de um ácido orgânico como um solvente, junto com o aquecimento do peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada por um período de tempo suficiente para clivar o resíduo peptídico da resina W. Em um aspecto do método, o conjugado de peptídeo-resina é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 20, 22 e 24. Em outro aspecto do método, o conjugado de peptídeo-resina é selecionado das SEQ ID NOs. 16 ou 17 é adicionalmente desprotegido para formar a cadeia B humana da SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto do método acima, o ácido orgânico é selecionado do grupo consistindo em ácido trifluoroacético e ácido acético e misturas destes, o solvente alcoólico é selecionado do grupo consistindo em trifluoroetanol, hexafluoro-isopropanol, metanol e misturas destes, e o aquecimento do conjugado de peptídeo-resina é realizado em aproximadamente 30 a 50°C. Em outro aspecto do método acima, a clivagem do peptídeo ligado à resina é realizada aquecendo o peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada em um solvente alcoólico com a adição intermitente de aproximadamente 0,01% p/p, 0,02% p/p, 0,03% p/p, 0,05% p/p, 0,1% p/p, 0,2% p/p, 0,5% p/p, 1,0% p/p, 2,0% p/p, 3,0% p/p, 4,0% p/p ou aproximadamente 5,0% p/p de ácido orgânico. O ácido pode ser adicionado em intervalos de aproximadamente 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos ou aproximadamente 1 hora. Em outro aspecto do método, aquecimento do peptídeo ligado à resina é realizado em uma temperatura elevada de aproximadamente 25-30°C, 30-35°C ou 35-40°C. Em outro aspecto do método, a clivagem pode ser aumentada com um aditivo que acelera reações de acoplamento na síntese de peptídeo selecionada de hidroxibenzotriazol, hidroxisuccinimida, pentafluorofenol e tiofenol. Em outro aspecto, a cadeia B de insulina parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado do grupo consistindo em um derivado N-acilado, um derivado pegilado, um derivado biotinilado, um derivado compreendendo um cromóforo e um resíduo peptídico compreendendo um resíduo de aminoácido natural, um resíduo de aminoácido desnatural e misturas destes. Em outro aspecto do mencionado acima, o derivado é uma variante da cadeia B de insulina ou derivado da cadeia B de insulina.

[0070] Geralmente, quando o peptídeo é clivado da resina, síntese de peptídeo adicional pode ser realizada por síntese de peptídeo em solução, síntese de peptídeo em fase sólida ou uma combinação de síntese de peptídeo em solução e em fase sólida, também referida como síntese de mudança de fase. Além disso, já que uma lisina tem uma cadeia lateral amina, um grupo alfa-amino e um grupo carboxila, as reações de acoplamento de peptídeos com uma lisina, que pode ser ligada à resina pela cadeia lateral ou pelo grupo carboxila, há múltiplas permutações da síntese de peptídeo (fase sólida ou fase em solução) para preparar peptídeos lineares e/ou ramificados. Isto é, quando o peptídeo contendo lisina é clivado da resina, síntese de peptídeo em fase de solução adicional pode incluir várias combinações das etapas de: 1) Proteção do grupo amina livre da cadeia lateral de lisina; 2) desproteção do grupo carboxila C-terminal e acoplamento do grupo carboxila livre com um aminoácido ou fragmento de peptídeo ou derivados destes; 3) desproteção do grupo carboxila C-terminal e ligação do grupo carboxila livre à resina e realizando síntese de peptídeo em fase sólida adicional por acoplamento de peptídeo ao N- terminal ou acoplamento de peptídeo à cadeia lateral amina da lisina (para preparar peptídeos ramificados); 4) desproteção do grupo amino N-terminal (grupo alfa-amino) e acoplamento da amina livre com um aminoácido ou fragmento de peptídeo; e 5) combinações destes.

DEFINIÇÕES:

[0071] Como usado neste pedido, uma resina "sensível ao ácido", uma resina "sensível ao calor" ou tanto uma resina "sensível ao ácido como ao calor" é uma resina, como a resina no conjugado de resina- lisina, que se separa da lisina ou derivado de lisina sob condições acídicas brandas, sob temperaturas relativamente baixas ou tanto sob condições acídicas brandas como sob temperaturas relativamente baixas, e a resina se separa sob tais condições que não resulta nas reações laterais indesejadas, a desproteção indesejada de um grupo protetor selecionado, desproteção global ou racemização da lisina, derivados de lisina ou peptídeos.

[0072] Como usado neste pedido, um "peptídeo ramificado" é um peptídeo que pode ser preparado de acordo com os métodos descritos neste pedido, em que os aminoácidos ou os resíduos de peptídeos podem ser ligados 1) à cadeia lateral amino de um grupo lisina, 2) ao grupo carboxila C-terminal, e 3) ao grupo amino N-terminal.

[0073] Como usado neste pedido, "desproteção global" significa que sob certas condições de desproteção, como uma condição ácida fortemente acídica, a condição resulta na desproteção de todos os grupos protetores do derivado de lisina ou peptídeo na resina. Em um aspecto, o resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos opcionalmente protegidos compreende um grupo protetor amino P no aminoácido, em que cada P no resíduo de aminoácido é hidrogênio (isto é, desprotegido) ou é independentemente selecionado do grupo consistindo em terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc), benzilóxi-carbonila (carboxibenzila ou Z), 1-(4,4-dimetil-2,6- dioxociclohex-1-ilideno)-etila (Dde), 2-nitrofenilsulfenila (Nps) e aliloxicarbonila (aloc).

[0074] Como usado neste pedido, "opcionalmente protegido" significa que o resíduo peptídico que compreende um aminoácido único ou um resíduo peptídico, e em que cada grupo amino e cada grupo carboxila do resíduo peptídico podem ser independentemente protegidos ou desprotegidos. Em um aspecto, o resíduo peptídico ou fragmento de peptídeo contém pelo menos 2 resíduos de aminoácido, pelo menos 10 resíduos de aminoácido ou pelo menos 200 resíduos de aminoácido.

[0075] Como usado neste pedido, um "grupo protetor carboxila" por exemplo, como representado no composto da fórmula I, significa que o grupo R que é ligado ao grupo -C(O)- inclui o oxigênio do grupo -C(O)- e ainda compreende o grupo protetor como conhecido na técnica e como descrito neste pedido. Uma lista abrangente de grupos protetores adequados pode ser encontrada em T. W. Greene, Protecting Groups in Organic Synthesis, 3a edição, John Wiley & Sons, Inc. 1999.

[0076] Como usado neste pedido, uma "variante" significa um peptídeo substancialmente homólogo a um peptídeo nativo ou derivado, mas que tem uma ou mais sequências de aminoácidos que é diferente do peptídeo nativo ou derivado de peptídeo que são baseados uma ou mais deleções, inserções ou substituições. As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxila terminais que variam no comprimento de um resíduo peptídico que contêm dez, vinte ou trinta ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. As inserções intrassequência, isto é, inserções dentro da sequência polipeptídica desejada, podem variar geralmente de aproximadamente 1 a 10 resíduos, 1 a 5 ou 1 a 3 resíduos. As variantes podem compreender sequências substituídas de modo conservativo, significando que um resíduo de aminoácido dado é substituído por um resíduo que tem características físico-químicas similares. Ver, Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co., (1983). É bem estabelecido que certas substituições de aminoácidos, isto é, substituições de aminoácido "conservativas", podem ser frequentemente feitas em uma proteína ou um peptídeo sem alterar a confirmação ou a função da proteína ou peptídeo. Tais modificações incluem a substituição de qualquer uma de isoleucina (I), valina (V) e leucina (L) por qualquer um de outros destes aminoácidos; ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) e vice-versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice-versa; e serina (S) por treonina (T) e vice-versa. As variantes terão uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 90% com a sequência de referência, identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. As variantes conservarão a função primária do parental do qual são derivados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[0077] A Figura 1 mostra a sequência da insulina humana e vários derivados.

[0078] A Figura 2 é um esquema de processo representativo de uma síntese em fase sólida de isômeros da cadeia A de insulina humana bisoxidada.

[0079] A Figura 3 é um esquema representativo mostrando uma síntese em fase sólida etapa por etapa da cadeia B de insulina usando uma resina CTC.

[0080] A Figura 4 é um esquema representativo mostrando a síntese de uma cadeia B de insulina usando Fmoc-Lys-Thr(tBu)-OH ligado pela cadeia lateral de Lys em uma resina MMT.

[0081] A Figura 5 é um esquema representativo da síntese em fase sólida de Fmoc-Lys-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf) -OH (SEQ ID NO: 19) para a cadeia B de Glargina.

[0082] A Figura 6 é um esquema representativo da síntese da insulina cadeia B de Glargina usando Fmoc-Lys-Thr(tBu)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-OH ligado pela cadeia lateral de Lys em uma resina MMT.

[0083] A Figura 7 é um esquema representativo da síntese da insulina cadeia B de Detemir com a proteção N-terminal e usando Fmoc- Lys ligado pela cadeia lateral para uma resina MMT.

[0084] A Figura 8 é um esquema representativo da síntese da insulina cadeia B de Degludec usando Fmoc-Lys ligado pela cadeia lateral na resina MMT.

[0085] A Figura 9 é um esquema representativo da síntese da insulina cadeia B de Degludec usando a proteção N-terminal.

[0086] A Figura 10 é um esquema representativo da síntese da cadeia B de insulina biotinilada.

[0087] A Figura 11 é um esquema representativo da síntese de insulina e análogos de insulina (Lispro e Aspart) pela combinação de cadeia.

[0088] A Figura 12 é um esquema representativo da combinação da cadeia de análogos de insulina (Detemir e Degludec).

[0089] A Figura 13 é um esquema representativo da combinação da cadeia de um análogo de insulina Glargina.

Síntese de Cadeias A:

[0090] Em uma modalidade, é fornecido um método para a síntese em fase sólida da cadeia A de insulina bisoxidada na qual a clivagem do peptídeo protegido da resina e sua oxidação prossegue concorrentemente e em um período curto de tempo. Neste método, o problema sintético devido à insolubilidade da cadeia A é superado. Em um aspecto, isto é alcançado aplicando a síntese em fase sólida usando resinas lábeis em ácido. Tais resinas incluem tipo tritila, difenilmetila e benzila. A cadeia de peptídeo é montada usando protocolos padrão para a síntese em fase sólida de peptídeos usando, por exemplo, Fmoc- aminoácidos (Figura 2). A oxidação do peptídeo ligado à resina pode ser realizada usando iodo sob condições acídicas brandas, tal como em hidrocarbonetos halogenados. Sob estas condições, a clivagem do peptídeo protegido do produto de resina concorrentemente com a reação de oxidação e a precipitação da cadeia A é evitada. Em um aspecto, as soluções de ácido trifluoroacético ou ácido acético em diclorometano que são misturadas com álcoois, como trifluoroetanol ou metanol, foram usadas como o solvente para a oxidação simultânea e clivagem da resina. Em uma modalidade, a resina 2-clorotritila foi usada para a montagem da cadeia em fase sólida da cadeia A protegida. A cadeia A linear protegida bisoxidada que foi obtida foi desprotegida colocando em contato a cadeia A com várias soluções de solventes acídicos, incluindo DCM, TFA, TES e tioéteres e misturas destes. Em um aspecto, o presente pedido de patente descreve os três isômeros esperados da cadeia A de insulina bisoxidada (Figura 2). Os isômeros podem ser separados por HPLC mas também podem ser isolados e purificados como uma mistura de isômeros.

Síntese de Cadeias B

[0091] Em uma modalidade, o presente pedido de patente descreve uma síntese da cadeia B de insulina em uma maneira etapa por etapa em resinas sensíveis a ácidos tipo tritila, como a resina 2-clorotritila (Figura 3). A aplicação de Fmoc-aminoácidos apropriadamente protegidos nas suas cadeias laterais com grupos sensíveis a ácidos também foi empregada.

[0092] O presente pedido de patente também descreve a síntese de peptídeos da cadeia B de insulina e seus derivados como a cadeia B de insulina des-Thr(B30) podem ser preparados onde a cadeia lateral de Lys(B29) é ligada à resina em vez do grupo carboxila da cadeia (Figuras 4). Similarmente, a cadeia B de Glargina pode ser sintetizada pela ligação em fase sólida da arginina protegida pelo grupo carboxila (Figura 5) ou usando ligação de grupo lateral pela lisina (Figura 6). Além disso, a cadeia lateral da lisina que é ligada à resina pode ser usada para preparar a cadeia B de Insulina Detemir (Figura 7) e Cadeia B de Insulina Degludec (Figura 8, 9).

[0093] O presente pedido de patente descreve ainda que se a resina usada para a ligação da cadeia lateral de Lys for relativamente lábil, como a resina 2-clorotritila ou a resina 4-metoxitritila, a cadeia B de insulina parcialmente protegida pode ser prontamente obtida pelo tratamento acídico ou térmico brando do peptídeo ligado à resina, onde o peptídeo é clivado da resina com a função amino seletivamente desprotegida da cadeia lateral de Lys. As cadeias B de insulina parcialmente desprotegidas, seus fragmentos mais curtos ou mais longos e derivados, podem ser seletivamente acilados em solução em uma variedade de fornecimento da cadeia lateral de lisina de derivados da cadeia B importantes.

[0094] O presente pedido de patente descreve ainda a síntese da cadeia B de insulina Lys(15-miristoil)-des-Thr(30) humana, a síntese da cadeia B de insulina Lys (15-carboxipentadecanoil-Y-glutamil)B(29)-des- Thr(B30) humana e a pegilação seletiva e biotinilação (Figura 11) da cadeia lateral de Lys(B29) bem como a síntese em fase sólida de peptídeos seletivamente ramificados da cadeia B de Insulina na cadeia lateral de Lys(B29).

[0095] O presente pedido de patente também descreve a acilação seletiva da cadeia lateral da cadeia B de insulina Lys(B29) humana e seus análogos peptídicos mais curtos e mais longos e seus derivados. Isto pode ser realizado preparando e isolando a cadeia B de insulina protegida na sua função terminal amino pelo grupo Fmoc ou um grupo tipo Z. Após remoção dos grupos protetores da cadeia lateral do derivado da cadeia B de insulina, a função amino livre da insulina Lys(B30) pode ser acilada.

Combinação da cadeia A bisoxidada com B

[0096] O presente pedido de patente descreve ainda que a combinação das cadeias de insulina usando a cadeia A bisoxidada de insulina humana ou animal e seus derivados, com a cadeia B de insulina humana ou animal e seus derivados prosseguem suavemente em soluções aquosas tamponadas com a adição de vários sais, como sais de sódio, cálcio, zinco, ferro etc. Além disso, a solução pode conter solventes orgânicos como álcoois, DMSO, acetonitrila etc. em vários pH, incluindo em pH >7, e em temperaturas diferentes, incluindo de aproximadamente 0-5°C, 2-6°C e 5-10°C. A cadeia A bisoxidada e a cadeia B podem ser reagidas em proporções diferentes, como uma proporção onde a proporção cadeia A/cadeia B é >1, tal como 1,05:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,5:1 e 2:1. Em um aspecto, a reação fornece uma mistura da cadeia A mono-oxidada, cadeia B oxidada e dímeros da cadeia B, dímeros da cadeia A e misturas destes. A mistura de produto pode ser separada por HPLC e reciclada após oxidação da mistura da cadeia A mono e di-oxidada, ou convertida em produtos de insulina diferentes equilibrando com um sistema redox como cisteína cisteína, ou glutationa oxidada e reduzida etc. Usando o presente método, rendimentos de combinação >60% podem ser obtidos. Alternativamente, um oxidante brando é adicionado à mistura de combinação, como DMSO ou a mistura redox de glutationa oxidada e reduzida, para reoxidar a cadeia A. Na mistura resultante, um agente redutor brando, como tióis, incluindo tiolamina, ditiotreitol ou sistema redox, pode ser adicionado. Usando o presente método, o rendimento total de insulina e análogos de insulina pode ser melhorado em 5-25% (Figuras 11 a 13).

[0097] A preparação de insulina, análogos de insulina e análogos de insulina acilados é descrita nos exemplos a seguir. Os esquemas de purificação e reação descritos são geralmente aplicáveis à preparação de vários derivados de insulina diferentes, mas as condições de reações e as sequências podem não ser aplicáveis a todos os peptídeos, incluindo certos análogos de insulina e derivados, como seria prontamente reconhecido pelos especialistas na técnica. Nestes casos, as reações podem ser realizadas com sucesso por modificações habituais conhecidas pelos especialistas na técnica na síntese de peptídeos, isto é, pela proteção apropriada de grupos de interferência, modificando outros reagentes convencionais ou modificação regular de condições de reação e sequências de reação.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Síntese em fase sólida de cadeia A, cadeia B de insulina e dos seus segmentos protegidos PROCEDIMENTO GERAL: A1. Preparação de resinas 2-clorotritila carregadas

[0098] Resina de cloreto de 2-Clorotritila (CTC-Cl) (100 g; carga 1,6 mmol/g) de CBL-Patras, foi colocada em um reator de síntese de peptídeos de 2 L e avolumada com 700 mL de diclorometano (DCM) por 30 min a 25°C. A resina foi filtrada e uma solução de Fmoc-aminoácido 100 mmol e diisopropiletilamina 300 mmol (DIEA) em 500 mL de DCM foram adicionados. A mistura foi agitada sob nitrogênio durante 2 horas a 25°C. Os sítios ativos restantes de resina 2-CTC foram neutralizados adicionando 10 mL de metanol (MeOH) e reagindo durante 1 hora. A resina foi filtrada e lavada duas vezes com 400 mL de DMF. A resina foi filtrada e tratada duas vezes com 500 mL de 25% em volume de piperidina em DMF por 30 min. A resina foi lavada quatro vezes com 500 mL de DMF. A resina foi desavolumada com 3 lavagens com 500 mL de isopropanol (IPA); e seca a peso constante. 70-95% dos mmols do aminoácido usado foram ligados na resina.

A2. Preparação de resinas MBH carregadas, método geral

[0099] Resina MBH-Br (100 g; 190 mmol) foi colocada em um sintetizador de peptídeos de 2 L e avolumada com 700 mL de DCM por 30 min a 25°C. A resina foi filtrada e em seguida uma solução de Fmoc- aminoácido e DIEA em 500 mL de DCM foi adicionada. A mistura foi agitada sob nitrogênio por 6 h a 25°C. Então os sítios ativos restantes da resina MBH foram ligados adicionando 10 mL de MeOH e agitada por 24 h. A resina então foi filtrada e lavada duas vezes com 400 mL de DMF. A resina foi filtrada e reagida duas vezes com 500 mL de uma solução de 25% em volume de piperidina em DMF por 30 min. A resina então foi lavada quatro vezes com 500 mL de DMF. A resina foi desavolumada com três lavagens com 500 mL de IPA. A resina então foi seca em peso constante sob vácuo (1,99 kPa, 25°C). 60-90% dos mmols do aminoácido usado foram ligados à resina.

B. Síntese em fase sólida, protocolo geral

[00100] A síntese em fase sólida foi realizada a 24°C, com 1,0 g de aminoácido esterificado à resina CTC ou MBH como descrito na Parte A do Exemplo 1. Durante a síntese inteira, o seguinte protocolo foi usado.

B1. Avolumamento da resina

[00101] A resina foi colocada em um reator de 15 ml e tratada duas vezes com 7 mL de NMP, seguido de filtração.

B2. Ativação do aminoácido

[00102] O aminoácido (3,0 equiv.) e 1-hidroxibenzotriazol (4,0 equiv.) foram dissolvidos em um reator com 2,5 vezes seu volume em NMP e resfriados a 0°C. DIC então foi adicionado (3,0 equiv.) e a mistura foi agitada por 15 min.

B3. Reação de acoplamento

[00103] A solução que foi preparada em B2 então foi adicionada ao reator B1. O reator foi lavado uma vez com um volume de DCM e foi adicionado ao reator que foi agitado por 1 a 3 h a 25°-30°C. Um Teste de Kaiser foi realizado para determinar a realização da reação. Se a reação de acoplamento não foi completada após 3 h (Teste de Kaiser positivo), a mistura de reação foi filtrada e reacoplada com uma solução fresca do aminoácido ativado. Após realização do acoplamento, a mistura de reação foi filtrada e lavada 4 vezes com NMP (5 volumes por lavagem).

B4. Remoção do grupo Fmoc

[00104] A resina resultante em B3 foi filtrada e em seguida tratada por 30 min com 5 mL de uma solução que continha 25% em volume de piperidina. A resina é lavada 3 X 5 mL de NMP.

B5. Alongamento da cadeia peptídica

[00105] Após incorporação de cada aminoácido as etapas B1-B5 foram repetidas até que a cadeia peptídica desejada fosse formada.

[00106] Os seguintes Fmoc-aminoácidos foram usados para o acoplamento do aminoácido individual ou fragmentos de aminoácido: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile -OH, Fmoc-Leu- OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)- OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc- Thr(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr (Clt)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH, Fmoc-Cys(Mmt)-OH e Fmoc-Cys(Acm)-OH; e os seguintes Boc-aminoácidos: Boc-Phe-OH e Boc-Gly-OH.

C. O método geral para a clivagem da resina CTC dos peptídeos de insulina parcialmente protegidos e dos seus fragmentos protegidos que contêm grupos Fmoc ou Boc no seu N-terminal e são seletivamente desprotegidos em uma cadeia lateral de lisina.

[00107] O segmento de peptídeo ou peptídeo ligado à resina que foi produzido como descrito acima em B1-B5 e foi protegido em uma cadeia lateral de Lys específica com Mmt ou Mtt, foi lavado 4 vezes com 5 mL de NMP, 3 vezes com 5 ml de IPA e finalmente 5 vezes com 7 ml de DCM para remover completamente qualquer NMP residual ou outros componentes básicos. A resina então foi resfriada a 0°C, filtrada de DCM e foi tratada seis vezes com uma solução de 10 mL de TFA 1,01,5% em DCM/TES (95:5) a 5°C. A mistura então foi agitada 20 min a 0°C e filtrada. A resina então é lavada três vezes com 10 mL de DCM. Piridina então é adicionada aos filtrados (1,3 equiv. Em relação a TFA) para neutralizar o TFA. A solução de clivagem em DCM então foi misturada com um volume igual de água. A mistura resultante foi destilada em pressão reduzida para remover DCM (46,66 kPa a 28°C). O peptídeo ou fragmento de peptídeo precipitou após remoção de DCM. O peptídeo resultante foi lavado com água e éter e seco a 30-35°C sob vácuo de 1,99 kPa. Alternativamente DCM foi removido a vácuo e o peptídeo parcialmente protegido foi precipitado pela adição de éter.

D. Clivagem da resina CTC e mono-oxidação simultânea de peptídeos protegidos com iodo. Preparação de cadeias A de Insulina bisoxidadas. Procedimento geral.

[00108] A resina ligada ao N- e no peptídeo protegido nas cadeias laterais, obtida como descrito acima, foi lavada 4 X 5 mL de NMP, 3 X 5 ml de IPA e finalmente 5 vezes com 7 ml de DCM para remover completamente NMP e outros componentes básicos. A resina então foi resfriada a 0°C. Após filtração de DCM, a resina foi processada duas vezes a 5°C com uma solução de 10 mL de TFA 1% em DCM contendo 20 equivalentes (equiv.) de iodo em relação ao peptídeo ligado à resina. A mistura resultante foi agitada por 5 min a 0°C e filtrada (em vez de TFA 1% o mesmo volume de uma mistura de diclorometano/ácido acético/trifluoroetanol pode ser usado com resultados similares). A resina então foi lavada três vezes com 10 mL de DCM. Os filtrados combinados foram aquecidos a 15°C e misturados por mais 30 min. Piridina então foi adicionada aos filtrados (1,3 equiv. em relação a TFA) para neutralizar o TFA. A solução de clivagem em DCM então foi misturada com um volume igual de tiossulfato de sódio 3% em água a fim de remover iodo em excesso. Isto foi indicado pelo descoramento da mistura. A mistura resultante foi destilada em baixa pressão para remover DCM (46,66 kPa em 28°C). O peptídeo resultante ou fragmento de peptídeo foi removido após remoção de DCM. O peptídeo resultante foi lavado com água e seco a 30-35°C sob vácuo de 1,99 kPa.

EXEMPLO 2 A desproteção das cadeias A de insulina bisoxidadas descritas na Figura 2. Método geral:

[00109] A cadeia A de insulina protegida obtida como descrito acima no Exemplo 1 (0,01 mmol) foi tratada com 10 mL de TFA/TES/tioanisol/água (85:5:5:5) por 3 h a 5°C e por 1 h a 15°C. A solução resultante foi concentrada a vácuo e em seguida o peptídeo desprotegido foi precipitado pela adição de di-isopropiléter e lavada três vezes com 10 mL de di-isopropiléter. O sólido resultante foi seco a vácuo (25°C, 1,99 kPa) até o peso constante.

EXEMPLO 3 Desproteção das cadeias B de insulina bisoxidadas. Método geral:

[00110] A cadeia de insulina protegida B obtida como descrito acima no Exemplo 1 (0,01 mmol) foi tratada com 10 mL de TFA/DTT/água (90:5:5) por 3 h a 5°C e por 1 h a 15°C. A solução resultante é concentrada a vácuo e em seguida o peptídeo desprotegido foi precipitado pela adição de di-isopropiléter e lavado com 3 X 10 mL de di-isopropiléter. O sólido resultante foi seco a vácuo (25°C, 1,99 kPa) até o peso constante.

EXEMPLO 4 A síntese de peptídeos ligados em resinas pela cadeia lateral de Lisina.

[00111] 1 mmol de um aminoácido ou peptídeo com a cadeia lateral de Lys desprotegida, que pode ser obtido como descrito no exemplo 1C, foi dissolvido em 15 ml de DCM. Então, 1,5 mmol de DIPEA foram adicionados e 1 g de resina de cloreto de 4-metoxitritila (1,2 mmol/g) e a mistura foi agitada ao longo da noite. 1 ml de metanol foi adicionado e a mistura foi agitada por 4 h adicionais à TA. A resina então foi filtrada, lavada 3 X DCM, 3 X DMF, 3 X iPrOH e 3 X hexanos e seca a vácuo até o peso constante.

EXEMPLO 5 Síntese de peptídeos acilados seletivamente na cadeia lateral de Lisina. Procedimento geral.

[00112] 1 mmol de aminoácido ou peptídeo com a cadeia lateral de Lys desprotegida, que pode ser obtido como descrito no exemplo 1C, foi dissolvido em 15 ml de DMF. Então, 1,2 mmol de DIPEA foram adicionados e 1 equivalente do agente ativado eletrofilicamente e a mistura foi agitada por 1-12 h à TA. A mistura então foi vertida em água gelada e o precipitado resultante foi lavado com água e éter, desprotegido como descrito sob o exemplo 3 e purificado como descrito sob o exemplo 6 abaixo.

EXEMPLO 6 Purificação dos peptídeos desprotegidos. Procedimento geral.

[00113] Os sais de ácido trifluoroacético desprotegidos brutos das cadeias de insulina e de derivados da cadeia A bicíclicos foram dissolvidos em acetonitrila 15% em água e carregados na coluna 10x25 mm semipreparativa carregada com Chromasil; Fase A = TFA 1% em acetonitrila, fase B = TFA 1% em água; gradiente linear de 25%-A a 65%-A em 30 min. O rendimento de purificação variou de 30 a 90%.

EXEMPLO 7

[00114] Síntese de insulina como peptídeos e dos seus derivados pela combinação linear da cadeia A bicíclica da insulina e dos seus derivados e da cadeia B linear de insulina e dos seus derivados: procedimento geral.

[00115] A cadeia A bicíclica desprotegida da insulina como peptídeo ou dos seus derivados (0,006 mmol) e da cadeia B linear da insulina como peptídeos ou derivados (0,005 mmol) foram dissolvidos em 4 ml de um tampão de glicinato de sódio / hidrocloreto de guanidina 6 N (4:1) em pH = 10,5. Então 1 ml de DMSO foi adicionado gradualmente ao longo de 12 horas e em seguida a mistura foi agitada por mais 4 h a 15°C. Da solução resultante, os peptídeos similares à insulina foram isolados pela purificação realizada como descrito no Exemplo 4. O rendimento médio de três experimentos em peptídeos similares à insulina foi 5-80% calculados de acordo com a cadeia B aplicada.

[00116] Embora diversas modalidades exemplares, aspectos e variações tenham sido fornecidos neste pedido, aqueles especialistas na técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e combinações e certas subcombinações das modalidades, aspectos e variações. É destinado que as seguintes reivindicações sejam interpretadas para incluir todas tais modificações, permutações, adições e combinações e certas subcombinações das modalidades, aspectos e variações estejam dentro do seu escopo. As revelações inteiras de todos os documentos citados em todas as partes deste pedido de patente são incorporadas neste pedido por referência.

Claims

1. Método de síntese em fase sólida de uma cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina, caracterizado pelo fato de que compreende: preparação de um conjugado lisina-resina compreendendo uma resina e uma lisina ou um derivado de lisina da fórmula I, em que:

W é uma resina de fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId: em que:

n é 0, 1, 2 ou 3; cada R1 e R3 é independentemente selecionado de H ou é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-Cl, 2-alquila C1-3, 2-alcóxi C1-3, 4-alquila C1-3, 4-alcóxi C1-3, contanto que em cada uma das fórmulas IIIb, IIIc e IIId, somente um dentre R1 e R3 seja 2-Cl e somente um dentre R1 e R3 seja H; R2 é a fase sólida da resina; e Z é uma ligação ou -C(=O)-; R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri- alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em -Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro- O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-OH, - Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)- Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, -Thr(Pr1)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-alquenila C2-6 e -Thr(Pr1)-O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido; em que Pr1 é hidrogênio ou um grupo protetor -OH e cada Pr2 e PR3 é independentemente hidrogênio ou um grupo protetor guanidina; P é hidrogênio, um grupo protetor amino, um resíduo peptídico N-terminal compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo opcionalmente a cadeia lateral protegida e opcionalmente o grupo amino terminal protegido, em que o resíduo peptídico N-terminal compreende um C-terminal e um N-terminal; contanto que quando R é selecionado do grupo consistindo em -OH, um grupo protetor carboxila, -NH2, -O-alquila C1-6, -O-alquenila C2-6, -O-tri-alquilsilila C1-3, um resíduo peptídico selecionado do grupo consistindo em -Pro-OH, -Pro-NH2, -Pro-O-alquila C1-6, -Pro-O-alquenila C2-6, -Pro-O-tri-alquilsilila C1-3, Thr(Pr1), -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)- OH, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-NH2, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O- alquila C1-6, -Thr(Pr1)-Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-alquenila C2-6, -Thr(Pr1)- Arg(Pr2)-Arg(Pr3)-O-tri-alquilsilila C1-3, -Thr(Pr1)-OH, -Thr(Pr1)-NH2, - Thr(Pr1)-O-alquila C1-6, -Thr(Pr1)-O-C2-6 alquenila e -Thr(Pr1)-O-tri- alquilsilila C1-3, então P não é hidrogênio ou um grupo protetor amino; o acoplamento do conjugado lisina-resina da fórmula I, em que R é selecionado de -OH, um grupo protetor carboxila e um resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos compreendendo a cadeia lateral opcionalmente protegida e opcionalmente o grupo carboxila terminal protegido, com um resíduo peptídico protegido, parcialmente protegido ou desprotegido Ib, onde o resíduo peptídico compreendendo 1 a 200 aminoácidos e o resíduo peptídico Ib em conjunto compreende a cadeia B de insulina ou o derivado da cadeia B de insulina, para formar a cadeia B de insulina protegida, parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina.

2. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina é uma resina 2-clorotritila.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que P é selecionado do grupo consistindo em terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc), benzilóxi-carbonila (carboxibenzila ou Z), 1-(4,4-dimetil-2,6- dioxociclohex-1-ilideno)-etila (Dde), 2-nitrofenilsulfenila (Nps) e aliloxicarbonila (aloc).

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia B de insulina parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado a partir do grupo consistindo em a cadeia B da insulina glargin (SEQ ID NO: 23), a cadeia B da SEQ ID NO: 5 (insulina Lispro), a cadeia B da insulina detemir (SEQ ID NO: 27), a cadeia B da SEQ ID NO: 7 (insulina aspart), a cadeia B da insulina degludec (SEQ ID NO: 29, e análogos ou derivados do mesmo; e clivagem adicional da cadeia B de insulina ligada à resina ou um derivado da cadeia B de insulina colocando em contato com o peptídeo ligado à resina sob a condição acídica branda usando uma mistura de um ácido orgânico e um solvente alcoólico, ou aquecendo o peptídeo ligado à resina a uma temperatura elevada, ou tanto usando uma mistura de um ácido orgânico como um solvente alcoólico junto com o aquecimento do peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada por um período de tempo suficiente para clivar a cadeia B de insulina ou um derivado da cadeia B de insulina da resina.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é selecionado do grupo consistindo em ácido trifluoroacético e ácido acético e misturas destes, o solvente alcoólico é selecionado do grupo consistindo em trifluoroetanol, hexafluoro-isopropanol, metanol e misturas destes, e o aquecimento do peptídeo ligado à resina é realizado com micro-ondas.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia B de insulina parcialmente protegida ou desprotegida ou um derivado da cadeia B de insulina é selecionado do grupo consistindo em um derivado N-acilado, um derivado pegilado, um derivado biotinilado, um derivado compreendendo um cromóforo e um resíduo peptídico que compreende um resíduo de aminoácido natural, um resíduo de aminoácido não natural e misturas destes.

7. Método para preparação de um peptídeo da cadeia B de insulina selecionado dentre as SEQ ID NOS: 3, 23, 27, 29 e 34, caracterizado pelo fato de compreender clivagem do peptídeo de um conjugado de peptídeo-resina da fórmula IV:

em que: W é uma resina das fórmulas IIIa, IIIb, IIIc ou IIId:

em que: n é 0, 1, 2 ou 3; cada R1 e R3 é independentemente selecionado de H ou é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-Cl, 2-alquila C1-3, 2-alcóxi C1-3, 4-alquila C1-3, 4-alcóxi C1-3, com a ressalva que em cada uma das fórmulas IIIb, IIIc e IIId, somente um dentre R1 e R3 seja 2-Cl e somente um dentre R1 e R3 seja H; R2 é a fase sólida da resina; e Z é uma ligação ou -C(=O)-; AA1 é: um primeiro resíduo peptídico compreendendo um resíduo de lisina ou derivado deste ligado a W: pela cadeia lateral amino da lisina ou derivado de lisina; e AAm é o segundo para o número m de resíduos onde m é um número inteiro de 1 a 200; por contato do conjugado peptídeo-resina com uma mistura de um ácido orgânico e um solvente, ou aquecendo a resina do peptídeo a uma temperatura elevada, ou tanto usando uma mistura de um ácido orgânico como um solvente, junto com o aquecimento do peptídeo ligado à resina em uma temperatura elevada por um período de tempo suficiente para clivar o resíduo peptídico da resina W.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjugado de peptídeo-resina é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 17, 22 e 24.

9. Método de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o conjugado de peptídeo-resina é selecionado de SEQ ID NO: 17, é adicionalmente desprotegido para formar a cadeia B humana da SEQ ID NO: 3.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é selecionado do grupo consistindo em ácido trifluoroacético e ácido acético e misturas destes, o solvente alcoólico é selecionado do grupo consistindo em trifluoroetanol, hexafluoro-isopropanol, metanol e misturas destes, e o aquecimento do conjugado de peptídeo-resina é realizado em aproximadamente 30°C a 50°C.