PT2035451E - Síntese de péptidos insulinotrópicos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE PEPTIDOS INSULINOTRÓPICOS" A invenção diz respeito a métodos para preparar péptidos insulinotrópicos, em especial semelhantes ao péptido 1 do tipo da glucagona (GLP-1) e as suas equivalentes, utilizando processos em fase sólida e em fase de solução. A invenção presente diz além disto respeito a fragmentos peptídicos intermediários que se podem utilizar nestes métodos.

Estão descritos na literatura muitos métodos de síntese peptídica (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. No. 6..5,881; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4005-4008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29: 4009-4012; Kamber et al. (editores), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49: 11065-11133; e Andersson et al. (2000) Biopolymers 55: 227-250. Os vários métodos de síntese diferem entre si pelo estado físico da fase em que a síntese ocorre, nomeadamente fase sólida ou fase líquida.

Na síntese peptídica em fase sólida (SPPS), liga-se um grupo aminoácido ou péptido a uma resina sólida de suporte. E seguida, ligam-se ao péptido já ligado ao 2 suporte diversos grupos sucessivos, aminoácido ou péptido, até se formar o material peptidico de interesse. Cliva-se então tipicamente o péptido que se encontra ligado ao suporte, e submete-se a mais processamentos e/ou purificação. Em alguns casos, a sintese em fase sólida permite obter um produto peptidico pronto; noutros casos o péptido clivado do suporte (isto é, um "fragmento peptidico intermediário") é utilizado na preparação de um produto peptidico de maior dimensão.

Podem acoplar-se uns aos outros os fragmentos peptidicos intermediários gerados durante os processos sintéticos em fase sólida ou em fase liquida (referidos neste documento como de "sintese em fase de solução"). A sintese em fase de solução pode ser especialmente útil nos casos em que a sintese de um péptido maduro e útil em fase sólida seja quer impossível, quer não prático. Por exemplo, na síntese em fase sólida, os péptidos de maior comprimento podem adoptar eventualmente uma conformação irregular enquanto ainda estão ligados ao suporte sólido, o que torna difícil adicionarem-se mais aminoácidos ou material peptidico à cadeia em crescimento. À medida que a cadeia peptídica se torna mais comprida sobre a resina de suporte, a eficiência dos passos do processo tais como o acoplamento e a desprotecção pode ficar comprometida. Isto, por sua vez, pode originar períodos de processamento mais longos para compensar estes problemas, para além de perdas incrementais de matérias-primas, tais como aminoácidos activáveis, co-reagentes, e solventes. Estes problemas 3 podem aumentar à medida que aumenta o comprimento da cadeia peptidica. É portanto relativamente pouco comum encontrarem-se péptidos maduros com comprimentos maiores do que 30 aminoácidos, sintetizados num único fragmento, utilizando apenas um procedimento em fase sólida. Em vez disto, podem sintetizar-se em separado fragmentos individuais sobre uma fase sólida, e depois acoplar-se em fase sólida e/ou em fase de solução, para se construir o produto peptídico pretendido. Esta metodologia necessita de uma selecção cuidadosa dos candidatos a fragmentos. Enquanto a selecção peptidica pode ser orientada por alguns princípios gerais, é amiúde necessário testar de forma empírica os candidatos a fragmento. As estratégias relativas a fragmentos que funcionam num contexto podem não funcionar noutros. Mesmo quando se revelam candidatos razoáveis a fragmentos, podem ainda ser necessárias inovações processuais para que uma estratégia de síntese funcione em condições comercialmente exequíveis. Portanto, as sínteses peptídicas utilizando esquemas híbridos são amiúde difíceis, e pode em muitos casos surgir problemas inerentes e imprevisíveis num determinado esquema sintético, até se levar a cabo a síntese em questão.

No acoplamento em fase de solução, acoplam-se dois fragmentos peptídicos, ou um fragmento peptídico intermediário e um aminoácido reactivo, num solvente apropriado, em geral na presença de reagentes adicionais 4 que promovem a eficiência e a qualidade da reacção de acoplamento. Os fraqmentos peptídicos intermediários estão dispostos de modo reactivo de tal forma que o terminal N de um fragmento seja acoplado ao terminal C do outro fragmento, ou vice-versa. Para além disto, os grupos protectores das cadeias laterais, que estão normalmente presentes durante a sintese em fase sólida, são habitualmente retidos durante o acoplamento de fragmentos em fase de solução, para assegurar a reactividade especifica das extremidades terminais dos fragmentos. Estes grupos protectores das cadeias laterais são tipicamente não removidos até se formar um péptido maduro.

Melhorias significativas num ou em mais passos do esquema sintético global podem contribuir para melhoramentos significativos na preparação do péptido maduro. Essas melhorias podem levar a uma poupança global importante, quer em tempo, quer em reagentes, e também podem melhorar significativamente a pureza e o rendimento em produto final.

Embora a descrição da importância das melhorias significativas da sintese hibrida seja aplicável a qualquer tipo de péptido produzido recorrendo a estes processos, é especialmente importante no contexto dos péptidos que são úteis do ponto de vista terapêutico e que são fabricados numa escala capaz para utilização medicinal comercial. A sintese de fármacos biomoleculares de maiores dimensões, tais como os péptidos terapêuticos, pode ser muito cara. 5

Isto devido ao custo dos reagentes, ao tempo utilizado na sintese, ao grande número de passos sintéticos, para além de outros factores, pelo que pequenas melhorias no processo sintético destes fármacos biomoleculares de maiores dimensões podem ter um impacto significativo sobre se é ou não economicamente realizável produzir um tal fármaco. Estas melhorias são necessárias devido a estes custos de produção elevados para os fármacos biomoleculares de grandes dimensões com base no facto de que, em muitos casos, existem poucas, se é que existem algumas, alternativas terapêuticas adequadas para estes tipos de fármacos biomoleculares de maiores dimensões.

Isto pode ver-se de forma clara no caso do péptido 1 do tipo da glucagona (GLP-1) e das suas equivalentes. Estes péptidos têm sido implicados como agentes terapêuticos possíveis para tratamento da diabetes melitus de tipo 2 não dependente de insulina, bem como de patologias metabólicas com ela relacionadas, tais como a obesidade. Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994: 17: 1039-44 .

Lopez et al. determinaram que o GLP-1 nativo apresentava um comprimento de 37 resíduos de aminoácido. Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 80: 5485-5489 (1983). Esta determinação foi confirmada pelo trabalho de Uttenthal, L. O., et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 61: 472-479 (1985). O GLP-1 nativo pode ser representado pela notação GLP-1 (1-37). Esta notação indica 6 que o péptido tem todos os aminoácidos entre o 1 (terminal N) e o 37 (terminal C). 0 GLP-1 nativo apresenta a sequência de aminoácidos conforme a SEQ ID NO. 1:

H DEFERHAE GTFTSDVSSYLE GQAAKE FIAWLVKGRG

Foi descrito que a GLP-1 (1-37) nativa é em geral incapaz de mediar a biossintese da insulina, mas que fragmentos biologicamente importantes deste péptido apresentam propriedades insulinotrópicas. Por exemplo, o péptido nativo com 31 aminoácidos de comprimento GLP-1 (7-37), de acordo com a SEQ ID NO. 2:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG é insulinotrópico e tem os aminoácidos das posições 7 (terminal N) a 37 (terminal C) da GLP-1 nativa. A GLP-1 (7-37) tem uma glicina terminal. Quando esta glicina está ausente, o péptido resultante ainda é activo do ponto de vista insulinotrópico e faz-se referência a ele como GLP-1 (7-36), de acordo com a SEQ ID NO. 3:

ΗAE G T F T S DV S S Y LE GQAAKE FIAWLVKGR 0 GLP-1 (7-36) existe amiúde com a sua arginina do terminal C sob forma amidada, e pode representar-se esta forma pela notação GLP-1 (7-36) -NH2. 7

Em geral, o GLP-1(1-37) é transformado in vivo numa sua equivalente insulinotrópica. Por exemplo, o GLP-1 (1-37) é naturalmente transformado no GLP-1 (7-37) in vivo. Este péptido, por sua vez, também pode sofrer processamento adicional por remoção proteolitica da glicina do terminal C para se obter o GLP-1 (7-36), que amiúde existe sob a sua forma amidada GLP-1(7-36)-NH2. Os tratamentos terapêuticos podem portanto envolver a administração do GLP-1 (1-37) ou de uma sua equivalente, esperando-se que se formem suas formas derivadas insulinotrópicas in vivo. Mais habitualmente, no entanto, os tratamentos terapêuticos sob investigação envolvem a administração dos fragmentos insulinotrópicos de GLP-1 eles próprios.

De acordo com a US 6.887.849, a actividade insulinotrópica do GLP-1(7-37), do GLP-1(7-36) e do GLP-l(7-36)-NH2 parece ser especifica das células pancreáticas beta, nas quais estes péptidos parecem induzir a biossíntese da insulina. Isto torna estes péptidos e as suas equivalentes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico úteis no estudo da patogénese do despoletar da diabetes melitus em adultos, um estado caracterizado por hiperglicémia no qual a dinâmica da secreção da insulina é anormal. Para além disto, estes péptidos do tipo da glucagona seriam úteis na terapia e no tratamento desta doença, e na terapia e no tratamento da hiperglicémia. De acordo com a EP 1.137.667 Bl, estes péptidos ou as suas equivalentes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para tratar outros tipos de diabetes, a obesidade, os glucagonomas, as patologias segregacionais das vias respiratórias, a patologia metabólica, a artrite, a osteoporose, as doenças do sistema nervoso central, a restenose, as doenças neurodegenerativas, a falha renal, a insuficiência cardíaca congestiva, a síndrome nefrótica, a cirrose, o edema pulmonar, a hipertensão, e/ou as patologias nas quais uma diminuição do consumo de alimentos seja pretendida. 0 GLP-1(1-37) nativo e as suas equivalentes activas de forma insulinotrópica de acordo com as SEQ ID NO. 1 a 3 são metabolicamente instáveis, com uma vida média no plasma de apenas 1 a 2 minutos, in vivo. 0 GLP-1 exógeno administrado também é rapidamente degradado. Esta instabilidade metabólica tem limitado o potencial terapêutico do GLP-1 nativo e dos seus fragmentos nativos. Têm sido desenvolvidas equivalentes sintéticas dos péptidos GLP-1 com maior estabilidade. Por exemplo, o péptido de acordo com a SEQ ID NO. 4 é descrito na EP 1.137.667 Bl:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR 9

Este péptido é semelhante ao GLP-1(7-36) nativo, excepto que aparece um resíduo aquiral de ácido alfa-aminoisobutírico (esquematicamente representado pela notação Aib) nas posições 8 e 35, em vez dos aminoácidos nativos correspondentes a estas posições. Também se designa 0 ácido alfa-aminoisobutírico aquiral como metilalanina. Este péptido pode ser designado pela fórmula (Aib8,35) GLP- 1 (7-36) -NH2.

Na EP 1.137.667 afirma-se que o péptido de acordo com a SEQ ID NO: 4 e as suas equivalentes podem ser construídos sob a forma de um só fragmento recorrendo a técnicas em fase sólida. A síntese do fragmento único sugerida na EP 1.137.667 é problemática. A título de um dos seus problemas, esta técnica pode levar a altos teores de epimerização no acoplamento do último aminoácido, por exemplo, histidina no caso do (Aib8,35) GLP-1 (7-36) . Para além disto, pode ser difícil a remoção de impurezas durante a purificação cromatográfica, e o rendimento pode ter tendência a ser muito baixo demais. São portanto necessárias estratégias melhores para a síntese de péptidos de acordo com a SEQ ID NO. 4, para ser possível manufacturar este péptido e as suas equivalentes com rendimentos e purezas comercialmente aceitáveis, nas quantidades pretendidas.

Para além destas preocupações, os problemas relacionados com a recuperação do produto e a sua pureza na produção de péptidos em grande escala, bem como os de 10 manuseamento de reagentes, a sua armazenagem e a sua eliminação, podem ter um forte impacto na viabilidade de um esquema sintético do péptido. Portanto existe uma necessidade actual de processos de síntese de péptidos capazes para a produção eficiente de materiais peptídicos com interesse comercial, em fabricos de grande dimensão, com rendimentos melhores. A invenção presente diz respeito à preparação de péptidos insulinotrópicos, que sejam sintetizados através de uma metodologia que compreenda síntese em fase sólida e em fase de solução ("híbrida"). Em geral, a metodologia inclui sintetizarem-se três fragmentos peptídicos intermediários utilizando química no estado sólido. Utiliza-se então química em solução para adicionar mais aminoácidos a um dos fragmentos. Acoplam-se então os fragmentos uns aos outros, quer em fase sólida quer em fase de solução. A utilização de uma pseudoprolina num destes fragmentos torna mais fácil a síntese desse fragmento em fase sólida, e também torna mais fácil o acoplamento subsequente desse fragmento, em fase de solução, a outros fragmentos. A invenção presente é muito útil para formar péptidos insulinotrópicos tais como GLP-1, GLP-1(7-36) e as equivalentes naturais e não naturais destes materiais, em especial GLP-1 (7-36) e as suas equivalentes naturais e não naturais. 11

Num aspecto, a invenção presente diz respeito a um método para fabricar um péptido insulinotrópico, incluindo os passos de: a) se preparar um fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 sejam cada um deles residuos de um aminoácido aquiral, ou o fragmento referido é uma sua equivalente, incluindo os residuos X8 e X10, incluindo todos os Η, E, X8 e X10 opcionalmente protecção das suas cadeias laterais; e b) se incorporar o fragmento peptídico num péptido insulinotrópico.

Preferivelmente X8 é um residuo de aminoácido correspondendo a metilalanina (Aib). X10 é preferivelmente um residuo de aminoácido correspondendo a glicina.

Num aspecto adicional, a invenção diz respeito a um fragmento peptídico com uma sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 e X10 sejam ambos resíduos de um aminoácido aquiral, incluindo opcionalmente em todos os grupos Η, E, X8 e X10 protecção das suas cadeias laterais. Preferivelmente, X8 um resíduo de aminoácido correspondendo a Aib e X10 e um resíduo de aminoácido correspondendo a glicina. 12

Noutro aspecto, a invenção presente diz respeito a um método de fabricar um péptido insulinotrópico, compreendendo os passos de: a) se preparar um fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ. ID No. 8), em que o resíduo denotado pelo símbolo x17"18 seja um resíduo dipeptídico de uma pseudoprolina; e b) se incorporar o fragmento peptídico num péptido insulinotrópico.

Noutro aspecto, a invenção presente diz respeito a um péptido ou a um seu equivalente, incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17'18YLEG (SEQ. ID No. 8), em que o resíduo denotado pelo símbolo X17-18 é um resíduo de um dipéptido de uma pseudoprolina; incluindo-se nos resíduos de aminoácido referidos, opcionalmente, as protecções das suas cadeias laterais.

Num aspecto adicional, a invenção presente diz respeito a um método de se fabricar um péptido insulinotrópico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo os passos de: a) se acoplar o primeiro fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 e X10 sejam ambos resíduos 13 de um aminoácido aquiral, podendo existir opcionalmente protecção das cadeias laterais de H e de E, com o segundo fragmento peptidico, incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17' 18YLEG (SEQ ID NO. 8), na qual o residuo denotado pelo simbolo X17-18 seja um residuo de um dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo os referidos resíduos de aminoácido da sequência, opcionalmente, protecção das cadeias laterais, para se obter um terceiro fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG (SEQ ID NO. 11), incluindo opcionalmente protecções das cadeias laterais dos resíduos de aminoácido da sequência referida; e b) se incorporar o fragmento peptidico num péptido insulinotrópico.

Noutro aspecto, a invenção presente diz respeito a um método de se fabricar um péptido insulinotrópico, compreendendo os passos de: a) se preparar um fragmento peptidico ou um seu equivalente, incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um resíduo de um aminoácido quiral, incluindo opcionalmente os referidos 14 resíduos da sequência uma protecção das suas cadeias laterais; e b) se incorporar o fragmento peptídico num péptido insulinotrópico.

Noutro aspecto, a invenção presente diz respeito a um método de se fabricar um péptido insulinotrópico, compreendendo os passos de: a) se proporcionar um primeiro fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 e X10 sejam ambos resíduos de um aminoácido quiral, incluindo-se em H e em E opcionalmente a protecção das suas cadeias laterais; b) se proporcionar um segundo fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO. 8), na qual o resíduo denotado pelo símbolo X17-18 seja um resíduo de dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; c) se acoplar o primeiro fragmento com o segundo fragmento para se obter um terceiro fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos 15 HX8EX10TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 11), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; d) se proporcionar um quarto fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um resíduo de um aminoácido quiral, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e) se acoplar o quarto fragmento peptídico com a arginina para se obter um quinto fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 12), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e f) se acoplar o quinto fragmento com o terceiro fragmento para se obter uma sequência de um péptido insulinotrópico que inclui a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17_ 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 13), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais. 16

Preferivelmente, a invenção presente diz respeito ao método de fabrico de um péptido insulinotrópico, incluindo os passos de: a) se proporcionar um primeiro fragmento peptidico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 e X10 sejam ambos resíduos de aminoácido quiral, ambos os H e E incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; b) se proporcionar um segundo fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resíduo denotado pelo símbolo X17-18 seja um resíduo de dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; c) se acoplar o primeiro fragmento com o segundo fragmento para se obter um terceiro fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO. 11), que inclui opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; 17 d) se proporcionar um quarto fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um residuo de um aminoácido aquiral, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e) se acoplar o quarto fragmento peptídico com arginina para se obter um quinto fragmento peptídico que inclua a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e f) se acoplar o quinto fragmento com o terceiro fragmento para se obter um péptido insulinotrópico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEGQAAKEFIAWLVK X35r (SEQ ID NO. 13), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais.

Noutro aspecto, a invenção diz respeito ao método tal como se descreve neste documento, compreendendo um passo adicional de: 18 g) se removerem os grupos protectores da cadeia lateral para se obter um péptido insulinotrópico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 5) e os seus equivalentes, em que todos os simbolos X nas posições 8, 10, e 35 denotam independentemente um residuo de aminoácido quiral, opcionalmente impedido do ponto de vista estereoquimico. A remoção dos grupos protectores da cadeia lateral é preferivelmente levada a cabo empregando uma solução de desprotecção que inclua pelo menos um reagente capaz de acidólise e pelo menos um agente de captação de catiões. Seleccionam-se de preferência os reagentes capazes de acidólise para a desprotecção global de entre o conjunto constituído por ácido trifluoroacético (TFA), HC1, ácidos de Lewis tais como o BF3»Et20 ou o MesSiBr, ácido fluorídrico líquido (HF) , ácido bromídrico (HBr), ácido trifluorometanossulfónico, e combinações de todos estes. Os captadores de catiões adequados são preferivelmente seleccionados de entre ditiotreitol (DTT), anisole, p-cresol, etanoditiol e sulfureto dimetílico. A solução de desprotecção também pode incluir água.

Noutro aspecto, a invenção presente diz respeito ao método de fabrico de um péptido insulinotrópico, incluindo os passos de: 19 a) se proporcionar um primeiro fragmento peptidico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual Η, E X8 e X10 sejam todos eles residuos de aminoácido quiral, ambos os H e E incluindo opcionalmente nos residuos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; b) se proporcionar um segundo fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17" 18yleg (SEQ ID NO. 8) em que o residuo denotado pelo símbolo X17-18 seja um resíduo de dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; c) se acoplar o primeiro fragmento com o segundo fragmento para se obter um terceiro fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17'18YLEG (SEQ ID NO. 11), que inclui opcionalmente nos residuos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; d) se proporcionar um quarto fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um residuo de um aminoácido aquiral, incluindo 20 opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e) se acoplar o quarto fragmento peptídico com arginina para se obter um quinto fragmento peptídico que inclua a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e f) se acoplar o quinto fragmento com o terceiro fragmento para se obter um péptido insulinotrópico com a fórmula (SEQ. ID No. 5) HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R, e os seus equivalentes, em que cada um dos símbolos X, nas posições 8, 10, e 35, denote independentemente um resíduo de um aminoácido quiral, opcionalmente apresentando impedimento estereoquímico; e em que um ou mais dos resíduos de aminoácido inclua opcionalmente protecção das suas cadeias laterais. A Fig. 1 é um diagrama esquemático de um esquema sintético de acordo com a invenção presente. 21 0 Fragmento 12 é um fragmento peptídico que inclui a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6). 0 fragmento 14 é um fragmento peptídico que inclui a sequência de aminoácidos T11FTSD15VX17_18YL20EG (SEQ ID NO. 8) . 0 fragmento 16 é um fragmento peptídico que inclui a sequência de aminoácidos Q23AA25KEFIA30WLVKX35 (SEQ ID NO. 9) . 0 fragmento intermediário 18 é um fragmento peptídico que inclui a sequência de aminoácidos H7X8EX10TFTSO15VX17 18YL20EG (SEQ ID NO. 11) . 0 fragmento peptídico intermediário 20 é um péptido que inclui a sequência de aminoácidos Q23AA25KEFIA30WLVKX35R (SEQ ID NO. 12) . O produto 11 é o péptido protegido pretendido H7X8EX10TFTSD15VX17 18YL20EGQAA25KEFIA30WLVKX35R (SEQ ID NO. 13), no qual a Ser-Ser nas posições 17 e 18 ainda se encontra na forma de pseudoprolina protegida. O diagrama é descrito adiante em mais pormenor.

As concretizações da invenção presente que se descrevem adiante não pretendem ser exaustivas nem limitar o âmbito da invenção às formas especificamente descritas na descrição pormenorizada que se segue. Em vez disso, as concretizações foram escolhidas e são descritas de modo a que outros indivíduos com conhecimentos da técnica possam apreciar e compreender os princípios e as práticas da invenção presente. A invenção presente diz respeito a métodos sintéticos para fabricar o péptido-1 (GLP-1) do tipo da glucagona, e os seus equivalentes naturais e não naturais 22 activos do ponto de vista insulinotrópico, recorrendo a técnicas de fase sólida e/ou de fase de solução. As moléculas de péptido da invenção podem estar protegidas, não protegidas, ou parcialmente protegidas. A protecção pode incluir uma protecção do terminal N, protecção de cadeias laterais, e/ou protecção do terminal C. Embora a invenção diga em geral respeito à sintese destes péptidos do tipo da glucagona, dos seus equivalentes, de seus fragmentos e os seus equivalentes, de produtos de fusão e dos seus equivalentes, os ensinamentos inventivos deste documento também podem ser aplicáveis à sintese de outros péptidos, em especial aqueles que são sintetizados utilizando uma combinação de técnicas em fase sólida e em fase de solução. A invenção também é aplicável à sintese de fragmentos peptidicos intermediários associados a impurezas, em especial a impurezas de piroglutamato. As moléculas GLP-1 preferidas, úteis na prática da invenção presente, incluem o GLP-1 (7-36) natural e não natural, e os seus equivalentes.

Tal como se utiliza neste documento, a expressão "incluindo a sequência de aminoácidos" significa preferivelmente "possuindo a sequência de aminoácidos".

Tal como se aplica neste documento, um "equivalente" refere-se a análogos naturais e não naturais, a derivados, a compostos de fusão, a sais, ou a outros semelhantes, de um péptido. Tal como se utiliza neste documento, um análogo a um péptido refere-se em geral a um 23 péptido com uma sequência de aminoácidos modificada, tal como por uma ou mais operações sobre os seus aminoácidos, que sejam substituições, eliminações, inversões, e/ou adições, em relação a outro péptido ou a outro equivalente ao péptido. As substituições podem envolver um ou mais aminoácidos naturais ou não naturais. As substituições podem de preferência ser conservativas ou fortemente conservativas. Uma substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoácido por outro que apresenta em geral o mesmo valor liquido de carga electrónica e em geral as mesmas dimensões e a mesma topologia. Por exemplo, os aminoácidos com cadeias laterais alifáticas ou alifáticas substituídas têm aproximadamente tamanhos idênticos quando o número total de átomos de carbono e de heteroátomos nas suas cadeias laterais diferem entre si de não mais de quatro unidades. Eles podem ter aproximadamente a mesma topologia quando os números de ramificações nas suas cadeias laterais diferem em não mais do que cerca de um ou dois. Considera-se que os aminoácidos com grupos fenilo, ou fenilo substituído, nas suas cadeias laterais, têm a mesma dimensão e a mesma topologia. Listam-se adiante cinco grupos de aminoácidos. Substituindo um aminoácido num composto, por outro aminoácido do mesmo grupo, representa em geral numa substituição conservativa.

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisterna, metionina e aminoácidos que não ocorrem naturalmente com cadeias laterais alifáticas C1-C4 ou alifáticas C1-C4 substituídas com hidroxilo (cadeias lineares ou com uma ramificação).

Grupo II: ácido glutâmico, ácido aspártico e aminoácidos que não ocorrem na natureza, com cadeias laterais alifáticas Ci-C4 substituídas com ácido carboxilico (lineares ou com uma ramificação).

Grupo III: lisina, ornitina, arginina e aminoácidos que não ocorrem na natureza com cadeias laterais alifáticas C1-C4 substituídas com amina ou guanidina (lineares ou com uma ramificação).

Grupo IV: glutamina, asparagina e aminoácidos que não ocorrem na natureza com cadeias laterais alifáticas Ci~C4 substituídas com grupos amida (lineares ou com uma ramificação).

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina e triptofano.

Tal como se utiliza neste documento, o termo "equivalente" refere-se mais preferivelmente aos sais de péptidos, ou aos seus derivados com uma função amida no terminal C.

Uma "substituição altamente conservativa" é a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possua o mesmo grupo funcional na cadeia lateral, e tenha 25 quase o mesmo tamanho e a mesma forma. Os aminoácidos com cadeias laterais alifáticas ou alifáticas substituídas, têm praticamente o mesmo tamanho quando o número total de átomos de carbono e de heteroátomos nas suas cadeias laterais difere em não mais do que dois. Eles têm praticamente a mesma forma quando têm o mesmo número de ramificações nas suas cadeias laterais. Incluem-se nos exemplos das substituições altamente conservativas, as da valina por leucina, da treonina por serina, do ácido aspártico por ácido glutâmico, e da fenilglicina por fenilalanina.

Um "derivado de péptido" refere-se em geral a um péptido, um análogo a um péptido, ou outro equivalente ao péptido que apresente modificação química de um ou mais dos seus grupos laterais, dos seus átomos de carbono em alfa, o seu grupo terminal amino, e/ou o seu grupo terminal ácido carboxílico. A título de exemplo, uma modificação química inclui, sem que se limite a, adicionarem-se espécies químicas, criarem-se novas ligações, e/ou removerem-se espécies químicas. Incluem-se nas modificações de grupos laterais de aminoácidos, em limitação, a acilação dos grupos ε-amino da lisina, a alquilação em N da arginina, da histidina, ou da lisina, a alquilação de grupos ácido carboxílico, quer glutâmico, quer aspártico, e a desamidação da glutamina ou da asparagina. Incluem-se nas modificações do grupo amino terminal, sem qualquer limitação, a modificação por des-aminação, as modificações por substituição com N-alquilo inferior, N-di-alquilo 26 inferior, e N-acilo (por exemplo, -CO-alquilo inferior). Incluem-se nas modificações do grupo carboxilo terminal, sem qualquer limitação, a amida, a alquilamida inferior, a dialquilamida, e modificações com éster alquílico inferior. Os derivados preferidos são os derivados com o grupo carboxilo terminal amidado, por exemplo a amida, uma alquilamida inferior ou uma dialquilamida do péptido. Deste modo, os péptidos parcial ou completamente protegidos constituem derivados de péptido.

Na prática da invenção presente, um composto tem actividade "insulinotrópica" quando é capaz de estimular, ou provocar a estimulação de, ou ajudar a provocar a estimulação da sintese ou da expressão da hormona insulina. Nos modos de praticar preferidos, pode demonstrar-se a actividade insulinotrópica de acordo com ensaios descritos nas Pat. U.S. Nos. 6.887.849 e 6.703.365.

Nas concretizações preferidas, a invenção presente proporciona metodologias para se sintetizarem péptidos sintéticos (X8, X10, X35)GLP-1 (7-36) com a fórmula seguinte (SEQ. ID NO. 5):

HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R e os seus equivalentes, em que qualquer um dos simbolos X nas posições 8, 10, e 35 denota independentemente um residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente com impedimento 27 estereoquímico. Qualquer um dos resíduos X8, X10, e/ou X35 pode incluir opcionalmente um ou mais grupos protectores da cadeia. Os péptidos, de acordo com a sua fórmula, diferem do GLP-1 (7-36) nativo pelo menos pelo facto de os resíduos aquirais, opcionalmente com impedimento estereoquímico, X8 e X35 substituem os resíduos de aminoácido nativos nas posições 8 e 35. 0 resíduo X10 pode ser derivado da glicina aquiral nativa ou de outro aminoácido aquiral. A utilização dos aminoácidos aquirais X8, X10, e X35 não só ajudam a estabilizar o péptido resultante, mas também se verificou agora que a utilização destes aminoácidos a título de unidades construtivas também facilita a via fácil de síntese da invenção presente, tal como se ilustra na Fig. 1, e se descreve mais em pormenor adiante.

Uma concretização especialmente preferida de um péptido (X8, X10, X35) GLP-11 (7-36) que pode ser sintetizado de acordo com os princípios da invenção presente inclui um péptido de acordo com a fórmula (SEQ ID NO. 4) :

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR e os seus equivalentes, que tenham de preferência uma amida no terminal C. Este 28 péptido utiliza o resíduo aquiral de ácido alfa-aminoisobutírico (ou metilalanina, esquematicamente representado pela abreviatura Aib) uma vez que ambos os X8 e X35 têm preferivelmente uma amida no terminal C, utiliza um resíduo da G nativa na posição 10, e pode ser designado pela fórmula (Aib8,35) GLP-1 (7-36)-NH2. Esta notação indica que um resíduo de aminoácido correspondendo ao aminoácido "Aib" aparece nas posições 8 e 35 em vez da alanina nativa. O ácido alfa-aminoisobutírico aquiral, também é denominado metilalanina. O péptido de acordo com a SEQ ID NO. 4 está descrito na EP 1.137.667 BI. A presença dos resíduos Aib nas posições 8 e 35 desacelera a degradação metabólica no corpo, tornando este péptido muito mais estável no corpo do que o péptido nativo GLP-1(7-36). A invenção presente proporciona metodologias melhoradas para o fabrico de péptidos GLP-1(7-36) tais como o (Aib8,35) GLP-1 (7-36)-NH2. A título de exemplo, a Fig. 1 mostra de forma esquemática um esquema 10 ilustrativo para sintetizar péptidos GLP-1(7-36) e os seus equivalentes. Crê-se que o esquema 10 da Fig. 1 é especialmente adequado para a síntese em grande escala dos péptidos GLP-1(7-36). Os processos em grande escala são tipicamente levados a cabo para proporcionarem uma quantidade de péptido que seja útil para a distribuição comercial. Por exemplo, a quantidade de péptido num processo submetido a um aumento 29 de escala, pode ser de 500 g, ou de 1 kg, por fabrico, e mais tipicamente serão dezenas de kg a centenas de kg por fabrico, ou mais. Em concretizações preferidas, os métodos inventivos podem proporcionar melhoramentos tais como uma diminuição o periodo de processamento (sintese), melhoramentos no rendimento em produtos, melhoramentos na pureza dos produtos, e/ou uma diminuição da quantidade de reagentes e de matérias-primas que são necessárias. O esquema sintético 10 ilustrado na Fig. 1 recorre a uma combinação de técnicas em fase sólida e em fase de solução, para preparar o produto peptídico 11.

Tal como se ilustra na Fig. 1, o esquema 10 envolve sintetizarem-se os fragmentos peptidicos intermediários 12, 14, e 16 sobre a fase sólida. O fragmento 12 é um fragmento peptidico que inclui residuos de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO. 6: HX8EX10 nos quais X8 e X10 são tais como se definiram acima, ou é um equivalente a ele que inclui os residuos X e X10. Um ou mais dos residuos de aminoácido podem incluir grupos protectores das cadeias laterais de acordo com as práticas convencionais. Em algumas concretizações, o fragmento peptídico 12 pode estar ligado à resina pelo seu 30 terminal C. Este fragmento pode opcionalmente ter grupos protectores no terminal N e/ou no terminal C. Tem-se verificado que o Fmoc é um grupo especialmente útil para a protecção do terminal N, no que diz respeito à sintese do fragmento peptidico em fase sólida. O fragmento 12 inclui os 4 resíduos de aminoácido correspondentes aos aminoácidos nas posições 7 a 10 do péptido nativo GLP-1 (7-36), e pode portanto representar-se pela notação (X8, X10) GLP-1 (7-10). Nas concretizações preferidas, X8 é Aib e X10 é glicina, de acordo com a SEQ ID NO. 7 : H7AibEG10 ou é um seu equivalente que inclua o resíduo Aib na posição 10. O fragmento peptidico de acordo com a SEQ ID NO. 7, pode ser representado pela notação (Aib8)GLP-1(7-10) para indicar a substituição da alanina nativa por Aib na posição 8 do GLP-1(7-10) nativo. A sintese em fase sólida é em geral levada a cabo na direcção que vai do terminal C para o terminal N do fragmento 12. Deste modo, o aminoacrdo X , que esta presente na porção do terminal C do fragmento, é o primeiro resíduo de aminoácido que é acoplado ao suporte de resina em fase sólida. A síntese em fase sólida prossegue adicionando-se consecutivamente resíduos de aminoácido de um modo correspondente à sequência pretendida. A síntese 31 dos fragmento de péptido intermediário completa-se de pois de se ter adicionado o residuo do terminal N (por exemplo, o residuo de histidina do terminal N (H), à cadeia peptidica em crescimento. A selecção e a utilização de um fragmento peptidico de acordo com as SEQ ID Nos. 6 e 7 proporciona vantagens significativas adentro do esquema 10. Em primeiro lugar, H tende a ser um resíduo de aminoácido difícil de adicionar a uma cadeia de péptido em crescimento devido, pelo menos em parte, a problemas de epimerização. No entanto, o fragmento 12 é suficientemente pequeno para aliviar em grande parte estas preocupações. No entanto, o fragmento 12 é suficientemente comprido para apresentar dois centros quirais. Deste modo, uma simples cristalização permite a purificação do fragmento. Caso o fragmento 12 terminasse no Aib, este fragmento apenas teria um centro quiral e seria, em consequência, mais difícil de purificar racemicamente. Fazer-se com que a G aquiral esteja posicionada no terminal C também evita as preocupações com a racemização que de outro modo poderiam estar presentes caso o fragmento 12 terminasse no seu terminal C com o E quiral. Em resumo, a selecção do fragmento 12 a título de unidade construtiva peptidica torna mais fácil construir-se o fragmento, purificar-se, e acoplar-se a outro material peptidico. A selecção do fragmento também demonstra uma racemização pequena no H. De forma surpreendente, o H adiciona-se a este fragmento com um teor de epimerização 32 muito pequeno, por exemplo, cerca de 3 %, em peso, em alguns dos modos de aplicação. 0 fragmento 14 é um fragmento peptidico incluindo residuos de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO. 8:

T11ftsd15VX17'18YL20EG na qual o residuo denotado pelo simbolo X17-18 é um residuo dipeptidico de uma pseudoprolina, definido mais pormenorizadamente adiante, ou um seu equivalente que inclua χ17-18 nas posições 17 e 18. 0 fragmento 14 inclui resíduos de aminoácido que correspondem em geral aos resíduos de aminoácido nas posições 11 até 22 do péptido GLP-1(7-36) nativo, excepto que o residuo de dipéptido de pseudoprolina X17'18 é utilizado em vez dos residuos SS (Ser-Ser) que ocupam as posições 17 e 18 correspondentes no GLP-1(7-36) nativo.

Um ou mais dos resíduos de aminoácido do fragmento 14 pode incluir grupos protectores das cadeias laterais, de acordo com as práticas convencionais. Em algumas concretizações, o fragmento peptidico 14 pode estar ligado à resina pelo terminal C. Este fragmento pode opcionalmente ter grupos de protecção do terminal N e/ou do terminal C. Verificou-se que o Fmoc era um grupo protector especialmente útil para o terminal N, no que diz respeito à 33 síntese do fragmento peptídico em fase sólida. Pode referir-se o fragmento peptídico de acordo com a SEQ ID NO. 8 usando a notação (X17-18) GLP-1 (11-22) , para se denotar a substituição do resíduo Ser-Ser nas posições 17 e 18 por um resíduo X17-18 de pseudoprolina.

Tal como se utiliza na prática da invenção presente, o termo pseudoprolina refere-se a um dipéptido que inclui um resíduo de um aminoácido funcional tal como Ser ou Thr, cuja cadeia lateral funcional hidroxilo se encontra protegida por um anel semelhante à prolina, lábil ao TFA, de oxazolidina, entre o grupo alfa-amino e o hidroxilo da cadeia lateral. Em consequência do anel de oxazolidina, o dipéptido funciona a título de um agente reversível que mimetiza a prolina.

Em geral, um resíduo de pseudoprolina típico tal como é incorporado num péptido, pode ser representado pela fórmula

em que Φ representa o resíduo de qualquer aminoácido e ambos os R1 e R2 é independentemente uma espécie divalente de ligação adequada. Em grande parte dos casos, R1 é uma espécie divalente com a fórmula 34 R4 R—C—

I em que ambos os R3 e R4 é independentemente uma espécie monovalente tal como H, ou alquilo inferior tal como metilo. R3 e R4 também podem ser co-membros de uma estrutura anelar. Numa concretização desejável, ambos os R3 e R4 é metilo. No caso de uma Ser protegida com um anel de oxazolidina, R2 é a espécie divalente CH2, enquanto no caso de Thr, R2 é a espécie divalente (CH3)CH. 0 termo "alquilo inferior" refere-se a um grupo alquilo monovalente, linear ou ramificado, com um a seis átomos de carbono, preferivelmente um a quatro átomos de carbono. Este termo é exemplificado mais em pormenor por grupos tais como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 2-etilbutilo e outros semelhantes. Os resíduos alquilo inferior preferíveis são metilo e etilo, sendo especialmente preferido o metilo.

Durante a desprotecção, a espécie R1 é clivada para proporcionar um resíduo de dipéptido de acordo com a fórmula seguinte: 35

OH na qual Φ e R2 são tais como foram definidos acima. Tal como se aplica ao fragmento 14, o resíduo de pseudoprolina corresponde preferivelmente a um resíduo de Ser-Ser no qual a Ser que está mais próxima do terminal C está protegida com o anel de oxazolidina, e tem a estrutura seguinte:

A cadeia lateral da Ser mais próxima do terminal N contendo um hidroxilo está protegida, tal como por um grupo protector t-Bu. Quando o anel protector com a estrutura anelar de oxazolidina e o t-Bu são clivados, obtém-se o resíduo Ser-Ser. A utilização de um agente mimético da prolina como unidade para construção na síntese do fragmento 14 proporciona vantagens significativas no contexto da invenção presente. Em primeiro lugar, a síntese em fase sólida do fragmento 14 torna-se tremendamente mais fácil. Quando a pseudoprolina não é utilizada no decurso da síntese em fase sólida do fragmento 14, podem registar-se 36 problemas significativos com as remoções do Fmoc dos resíduos 13 a 11. Crê-se que esta dificuldade pode ser devida à formação de uma folha beta. A utilização da pseudoprolina torna estas remoções de Fmoc muito mais simples porque, crê-se, diminui o grau de formação de folhas beta. Em segundo lugar, o acoplamento em fase sólida subsequente entre o fragmento 14 e o fragmento 12 para formar o fragmento 18, descrito adiante, torna-se muito mais fácil. Na ausência do resíduo de pseudoprolina, a solubilidade do fragmento 18 numa fase de solução em solventes típicos para acoplamento, é muito pequena. A pseudoprolina aumenta as características de solubilidade do fragmento 18, tornando mais fácil o acoplamento em fase de solução que envolve este fragmento e o fragmento 20 (Veja-se a descrição da Fig. 1, adiante).

Leva-se em geral a cabo a síntese em fase sólida na direcção partindo do terminal C e em direcção ao terminal N do fragmento 14. Deste modo, o aminoácido G, que se encontra presente na porção do terminal C do fragmento, é o primeiro resíduo de aminoácido que é acoplado à resina de suporte da fase sólida. A síntese em fase sólida prossegue então adicionando-se consecutivamente resíduos de aminoácidos de um modo que corresponda à sequência que se pretende. No entanto, o dipéptido de pseudoprolina X17"18 é adicionado à cadeia em crescimento numa posição que corresponde às posições 17 e 18 do GLP-1 (7-36) , em vez de se adicionarem consecutivamente dois resíduos nativos de Ser nas posições 17 e 18. A síntese do fragmento 37 intermediário peptídico fica completa depois de se haver adicionado o resíduo do terminal N (por exemplo, o resíduo de treonina do terminal N (T) foi adicionado à cadeia de péptido nascente. 0 fragmento 16 é um fragmento peptídico, ou um seu equivalente, que inclui resíduos de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO. 9: Q23AA25KEFIA30WLVKX35 em que X35 é tal como se definiu acima, ou é um seu equivalente incluindo o resíduo X35. Um ou mais dos resíduos de aminoácidos podem incluir grupos protectores das suas cadeias laterais, de acordo com aquilo que é praticado convencionalmente. 0 fragmento 16 inclui os resíduos de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições de 23 a 35 do péptido nativo GLP-1 (7-36), excepto que X35 se encontra na posição 35 em vez do aminoácido nativo daquela posição. 0 fragmento 16 pode ser representado pela notação (X35) GLP-1 (23-35) .

Em algumas concretizações, o fragmento peptídico 16 pode estar ligado a uma resina pelo terminal C. Este fragmento pode opcionalmente ter grupos protectores na cadeia lateral, no terminal N e/ou no terminal C. Verificou-se que o Fmoc é um grupo protector especialmente 38 eficaz para o terminal N, em quanto diz respeito à sintese em fase sólida do fragmento peptidico.

Em concretizações preferidas, X35 é Aib de acordo com a SEQ ID NO. 10: Q23AA25KEFIA30WLVKAib35 ou um seu equivalente, que inclui o Aib na posição 35. O fragmento peptidico de acordo com a SEQ ID NO. 10 pode ser representado pela notação (Aib35)GLP-1(23-35) para se anotar a substituição do aminoácido nativo da posição 35 do GLP-1(7-36) nativo por Aib.

Note-se que o fragmento 16, de acordo com as SEQ ID Nos. 9 e 10, não inclui ainda o resíduo R (Arg) na posição 36 no terminal C. A Arg é subsequentemente acoplada ao terminal C do fragmento 16 na fase de solução, preferivelmente utilizando Arg sem protecção da cadeia lateral. Esta estratégia proporciona vantagens significativas adentro do esquema 10 da Fig. 1, porque evita reacções colaterais indesejáveis que tendem a ocorrer em consequência de se utilizar Arg protegida. Por exemplo, na desprotecção da Arg protegida, os produtos secundários da desprotecção podem ter tendência para reagir com outros constituintes do péptido, por exemplo, o triptofano. Isto 39 diminui a quantidade de péptido pretendido disponível na mistura, para purificação. A síntese em fase sólida é em geral levada a cabo na direcção partindo do terminal C a caminho do terminal N do fragmento 16. Deste modo, o aminoácido X35, que está presente na porção do terminal C do fragmento, é o primeiro resíduo de aminoácido que é acoplado ao suporte em resina da fase sólida. A síntese em fase sólida prossegue então adicionando consecutivamente resíduos de aminoácidos de um modo que corresponda à sequência pretendida. A síntese do fragmento peptídico intermediário completa-se depois de se haver adicionado o resíduo do terminal N (por exemplo, o resíduo de glutamina (Q) do terminal N, à cadeia peptídica nascente. Qualquer um dos aminoácidos utilizados na síntese do fragmento 16 pode incluir protecção das cadeias laterais, de acordo com as práticas convencionais.

Devido ao impedimento estereoquímico próximo da resina de suporte já carregada com ο X35, o acoplamento da lisina (34) e o da valina (33) com o péptido cuja cadeia vai crescendo pode ser problemático. Mesmo com um excesso do aminoácido, é difícil forçar estas reacções de acoplamento a prosseguirem até se completarem. A escolha do solvente e/ou o revestimento de extremidades pode ajudar a aliviar este problema. Verificou-se que a natureza do solvente de acoplamento pode ter um impacto sobre o grau ao qual o acoplamento prossegue até se completar. Num conjunto de experiências, por exemplo, levaram-se a cabo reacções de 40 acoplamento em misturas de NMP/DCM a 3:1 e a 1:1, e de DMF/DCM a 1:1 e a 3:1. As razões figuradas nestas misturas de solventes são baseadas em volumes. NMP significa N-metilpirrolidona, DCM refere-se a diclorometano, e DMF refere-se a dimetilformamida. Verificou-se que as reacções de acoplamento prosseguiam mais até ao final quando se utilizava DMF/DCM a 1:1.

Pode também utilizar-se o revestimento das extremidades a seguir a cada acoplamento com lisina e com valina, para impedir que material suportado sobre resina e que não reagiu, venha a continuar a reagir em mais reacções de acoplamento. O material com extremidades revestidas é removido mais facilmente durante a purificação, se tal se pretender. Podem utilizar-se as técnicas convencionais para revestimento de extremidades.

Continuando a fazer referência à Fig. 1, os fragmentos 12, 14, e 16, em conjunto com Arg, são ligados para se completar o péptido pretendido 11. Para conseguir este efeito, adiciona-se o fragmento 12 ao fragmento 14 na fase sólida, para se obter o fragmento intermediário maior, 18, que incorpora residuos de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO. 11:

H7X8EX10TFTSD15VX17"18YL20EG 41 no qual X8, X10, e X17-18 são tal como se definiram acima. Numa concretização preferida, X8 é Aib, X10 é G nativa, e X17-18 é um resíduo de dipéptido de pseudoprolina, tal como se definiu acima. Este fragmento peptídico intermediário pode ser representado pela notação (X8, X10, X17-18) GLP-1 (7-22) . A Fig. 1 mostra ainda que Arg é adicionado ao terminal C do fragmento 16 na fase de solução, para se obter o fragmento peptídico intermediário maior 20, que incorpora resíduos de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO. 12: q23aa25kefia30wlvkx35r em que X35 é tal como se definiu acima, e é preferivelmente Aib. Preferivelmente, a Arg adicionada deste modo ao fragmento peptídico não inclui protecção da cadeia lateral. Este fragmento peptídico intermediário 20 pode ser representado pela notação (X35) GLP-1 (23-36) . Os fragmentos peptídicos 18 e 20 são então acoplados um com o outro na fase de solução para se obter péptido protegido pretendido 11 de acordo com a SEQ ID NO. 13, na qual o Ser-Ser das posições 17 e 18 ainda se encontra sob a forma protegida de pseudoprolina:

H7X8EX10TFTSD15VX17'18YL20EGQAA25KEFIA30WLVKX35R 42

Pode designar-se o péptido 11 usando a notação (X8, X10, X17-18, X35) GLP-1 (7-36) . Na medida em que outros aminoácidos têm protecção das cadeias laterais, é desejável manter-se esta protecção durante este passo.

Ao levar a cabo o esquema reaccional da Fig. 1, podem levar-se a cabo as sínteses em fase sólida e em fase de solução pelos métodos padrão utilizados na indústria. Em modos representativos de prática, sintetizam-se os péptidos na fase sólida utilizando química através da qual os aminoácidos são adicionados inicialmente no terminal C, e em direcção ao terminal N. Deste modo, o primeiro aminoácido ou grupo peptídico a ser adicionado à resina é o terminal C de um determinado fragmento. Isto ocorre fazendo-se reagir a funcionalidade do terminal C como aminoácido ou o grupo peptídico com funcionalidade complementar que já está ligado ao suporte em resina. 0 lado do terminal N do aminoácido ou do péptido é mascarado para impedir a concorrência de reacções colaterais indesejáveis. 0 aminoácido ou grupo peptídico inclui também desejavelmente também protecção da cadeia lateral. Em seguida ligam-se aminoácidos ou grupos péptido sucessivos ao material peptídico já ligado ao suporte até se formar o péptido pretendido. A maior parte destes inclui também grupos protectores das cadeias laterais de acordo com as práticas de protecção convencionais. Com cada acoplamento sucessivo, é removido o grupo que mascara o terminal N do material peptídico ligado à resina de suporte. Este 43 terminal reage então com o terminal C do aminoácido seguinte, cujo terminal N se encontra mascarado. 0 produto de uma sintese em fase sólida é portanto um péptido ligado a uma resina de suporte.

Pode utilizar-se qualquer tipo de material de suporte que seja apropriado para levar a cabo na prática a sintese de péptidos em fase sólida. Nas concretizações preferidas, o suporte inclui uma resina que pode ser feita a partir de um ou mais polímeros, copolímeros ou combinações de polímeros tais como poliamidas, poli-sulfamidas, poli (etilenos substituídos), polietilenoglicol, resinas fenólicas, polissacáridos, ou poliestireno. 0 suporte polimérico também pode ser qualquer sólido que seja suficientemente insolúvel e inerte aos solventes utilizados na síntese do péptido. 0 suporte sólido inclui tipicamente uma espécie de ligação com a qual se acopla o péptido em crescimento durante a síntese e que pode ser clivada em condições pretendidas para libertar o péptido do suporte. Os suportes sólidos aceitáveis podem ter agentes de ligação que sejam cliváveis por fotólise, por TFA, por HF, pelo ião fluoreto, por redução; por Pd(0); por acção de um nucleófilo; ou por um radical. As espécies de ligação preferidas são cliváveis em condições tais que os grupos das cadeias laterais do péptido clivado ainda estão substancialmente protegidos.

Num método de síntese preferido, os fragmentos intermediários de péptido sintetizados sobre um suporte 44 sólido sensível a ácidos que inclui grupos tritilo, e mais preferivelmente sobre uma resina que inclua grupos tritilo substituídos com grupos cloro, por exemplo uma resina de cloreto de 2-clorotritilo (2-CTC) (Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946). Também se incluem nos exemplos a resina de cloreto de tritilo, a resina de 4-metiltritilo, a resina de 4-metoxitritilo, a resina de 4-aminobutan-l-ol 2-clorotritilo, a resina de 4-aminometilbenzoí1 2-clorotritilo, a resina de 3-aminopropan-l-ol 2-clorotritilo, a resina de ácido bromoacético 2-clorotritilo, a resina de ácido cianoacético 2-clorotritilo, a resina de ácido 4-cianobenzóico 2-clorotritilo, a resina de glicinol 2-clorotritilo, a resina de ácido propiónico 2-clorotritilo, a resina de etilenoglicol 2-clorotritilo, a resina de N-Fmoc-hidroxilamina 2-clorotritilo, a resina de hidrazina 2-clorotritilo. Incluem-se em alguns suportes sólidos preferidos o poliestireno, que se pode copolimerizar com divinilbenzeno para se formar um material de suporte no qual se ancoram os grupos reactivos.

Outros resíduos que se utilizam na síntese em fase sólida incluem as resinas "Wang", que compreendem um copolímero de estireno com divinilbenzeno tendo grupos de ancoragem de 4-hidroximetilfenilocimetilo (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.), e resina de ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenilbutírico (Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706). Podem por exemplo adquirir-se as resinas de Wang, de cloreto de 2-clorotritilo, e de 4- 45 hidroximetil-3-metoxifenilbutírico junto da Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Califórnia.

Para se preparar uma resina para a síntese em fase sólida, pode fazer-se uma lavagem prévia da resina com solvente(s) aceitável(is). Por exemplo, Adiciona-se uma resina de fase sólida tal como uma resina 2-CTC à câmara do péptido e faz-se uma lavagem prévia com um solvente adequado. 0 solvente de lavagem prévia pode ser escolhido com base no tipo de solvente (ou mistura de solventes) que se utiliza na reacção de acoplamento, ou vice-versa. Os solventes que são adequados para lavar, e também para a reacção de acoplamento que se segue, incluem o diclorometano (DCM), o dicloroetano (DCE), a dimetilformamida (DMF), e outros semelhantes, bem como as misturas destes reagentes. Outros solventes úteis incluem DMSO, piridina, clorofórmio, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, e misturas de todos estes. Em alguns casos o acoplamento pode ser levado a cabo num sistema solvente binário, tal como uma mistura de DMF com DCM a uma razão em volume na gama de entre 9:1 e 1:9, mais habitualmente de 4:1 a 1:4.

As sínteses da invenção presente são preferivelmente levadas a cabo na presença de grupos protectores adequados a não ser que se afirme especificamente o contrário. A natureza e a utilização de grupos protectores é bem conhecida na técnica. Em geral, um grupo protector adequado é qualquer tipo de grupo que pode 46 ajudar a impedir o átomo ou a espécie a que se liga, por exemplo, oxigénio ou azoto, de participar em reacções indesejadas durante o processamento e a sintese. Incluem-se nos grupos protectores aqueles que protegem cadeias laterais e os que protegem grupos amino em ε ou o terminal N. Os grupos protectores também podem impedir a reacção ou a ligação de ácidos carboxilicos, tióis e outros semelhantes.

Um grupo protector de uma cadeia lateral refere-se a uma espécie química acoplada à cadeia lateral (isto é, ao grupo R na fórmula geral de aminoácido H2N-C (R) (H)-COOH) , de um aminoácido, que ajude a impedir uma parte da cadeia lateral de reagir com os produtos químicos utilizados nos passos se síntese, processamento, etc. dos péptidos. A escolha de um grupo protector de uma cadeia lateral pode depender de diversos factores, por exemplo, do tipo de síntese que se leva a cabo, do processamento ao qual o péptido será submetido em seguida, e do produto pretendido, quer seja intermediário, quer final. A natureza de grupo protector da cadeia lateral também depende da natureza do aminoácido ele próprio. Em geral, selecciona-se um grupo protector de uma cadeia lateral que não seja removido durante a desprotecção dos grupos α-amino, durante a síntese em fase sólida. Daqui resulta portanto que em geral, o grupo protector do α-amino não é o mesmo que se utiliza como protector da cadeia lateral. 47

Em alguns casos, e consoante os tipos de reagente utilizados na síntese em fase sólida e no resto do processamento do péptido, um aminoácido pode não necessitar da presença de um grupo protector da cadeia lateral. Esses aminoácidos não incluem tipicamente átomos de oxigénio ou de azoto reactivos, nem qualquer outra espécie reactiva, na cadeia lateral.

Incluem-se nos exemplos dos grupos protectores da cadeia lateral, os grupos acetilo (Ac) , benzoílo (Bz) , terc-butilo, trifenilmetilo (tritilo), tetrahidropiranilo, éter benzílico (Bzl) e 2,6-diclorobenzilo (DCB), t-butoxicarbonilo (Boc), nitro, p-toluenossulfonilo (Tos), adamantiloxicarbonilo, xantilo (Xan), benzilo, 2,6-diclorobenzilo, éster de metilo, etilo e t-butilo, benziloxicarbonilo (Z), 2-clorobenziloxicarbonilo (2-C1-Z), t-amiloxicarbonilo (Aoc), e grupos protectores do tipo de uretanos alifáticos ou aromáticos, grupos fotolábeis tais como nitroveratriloxicarbonilo (NVOC); e grupos lábeis ao fluoreto, tais como trimetilsililoxicarbonilo (TEOC).

Os grupos protectores de cadeias laterais preferidos para aminoácidos, utilizados habitualmente para sintetizar péptidos GLP-1 na prática da invenção presente estão listados na Tabela A que se segue:

Tabela A: iAminoácido iíAib |Ala

Grupo(s) Protector(es) de Cadeia Lateral INenhum INenhum 48

Aminoácido íGrupo(s) Protector(es) de Cadeia Lateral Arg INenhum Asp |éster t-butílico (OtBu) ÍGln iiéster tritílico (trt) iGlu IjOtBu iGly.......................................... INenhum |His |tritilo (trt) ;Ile i|Nenhum |Leu iijNenhum Lys It-butiloxicarbonilo (Boc) Phe iNenhum |Ser |t-butil (tBu) |x17-18 |anel de oxazolidina entre o azoto em alfa e o! i (correspondendo |0H da Ser mais próximo do terminal C; tBu na: |a Ser-Ser) |outra Ser ÍThr !tBU |Boc ItBu ÍVal INenhum

Um grupo protector do terminal amino inclui uma espécie química acoplado ao grupo amino em alfa de um aminoácido. 0 grupo protector do terminal amino é tipicamente removido numa reacção de desprotecção, antes da adição do aminoácido seguinte à cadeia de péptido em crescimento, mas pode manter-se quando o péptido é clivado do suporte. A escolha de um grupo protector do amino terminal pode depender de diversos factores, por exemplo, do tipo de síntese levada a cabo e do produto intermediário ou do produto final.

Incluem-se nos exemplos de grupos protectores do terminal amino, (1) grupos protectores do tipo acilo, tais como formilo, acrililo (Acr), benzoílo (Bz) e acetilo (Ac); (2) grupos protectores aromáticos do tipo de uretano, tais 49 como benziloxicarbonilo (Z) e Z substituído, tais como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo; (3) grupos protectores uretano alifáticos, tais como t-butiloxicarbonilo (Boc) , di-isopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores cicloalquilo do tipo uretano, tais como 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, e ciclohexiloxicarbonilo; e (5) grupos protectores do tipo tiouretano, tais como feniltiocarbonilo. Incluem-se nos grupos protectores preferidos o 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), o 2-(4-bifenilil)-propil(2)-oxicarbonilo (Bpoc) , o 2-fenilpropil(2)-oxicarbonilo (Poc) e o t-butiloxicarbonilo (Boc). A química do Fmoc ou de semelhantes a Fmoc é altamente preferida para a síntese de péptidos em fase sólida, na medida em que clivar-se o péptido resultante num estado de protegido é relativamente fácil de levar a cabo, utilizando agentes de clivagem ligeiramente ácidos. Este tipo de reacção de clivagem é relativamente limpa em termos de produtos colaterais que se venham a obter, impurezas, etc., tornando técnica e economicamente possível recuperar-se péptido numa base de grande escala, tanto a partir das lavagens com aumento e com diminuição de dimensão, aumentando o rendimento. Tal como se utiliza neste documento, "grande escala" dizendo respeito á síntese de péptido, inclui em geral a síntese de péptidos na gama de 50 pelo menos 500 g, mais preferivelmente de pelo menos 2 kg por fabrico. A síntese em grande escala é tipicamente levada a cabo em reactores grandes, tais como reactores em aço inoxidável, que conseguem acomodar quantidades de reagentes tais como resinas, solventes, aminoácidos, produtos químicos para acoplamento, e reacções de desprotecção, que são dimensionadas para a produção de péptidos na gama de entre o quilograma e a tonelada métrica.

Para além disto, o grupo protector Fmoc pode ser clivado selectivamente de um péptido em relação aos grupos protectores de cadeias laterais, de modo que a protecção das cadeias laterais fica no seu lugar quando se cliva o Fmoc. Este tipo de selectividade é importante durante o acoplamento de aminoácidos, para minimizar as reacções das cadeias laterais. Para além disto, podem clivar-se selectivamente os grupos protectores de cadeias laterais, o que permite removê-los mantendo o Fmoc no seu lugar. Esta última selectividade é muito vantajosamente utilizada durante os esquemas de purificação descritos mais adiante. A reacção de acoplamento em fase sólida pode ser levada a cabo na presença de um ou mais compostos que aumentam ou melhoram a reacção de acoplamento. Incluem-se nos compostos que podem aumentar a velocidade da reacção e que diminuem a velocidade das reacções secundárias, os sais de urónio e de fosfónio que podem, na presença de uma base terciária, por exemplo di-isopropiletilamina (DIEA) e 51 trietilamina (TEA), transformar aminoácidos protegidos em espécies activadas (por exemplo, BOP, PyBOPO, HBTU, e TBTU geram todos eles ésteres de HOBt). Outros reagentes ajudam a impedir a racemização por proporcionarem um reagente protector. Incluem-se nestes reagentes as carbodi-imidas (por exemplo, DCC ou WSCDI) com adição de um nucleófilo auxiliar (por exemplo, 1-hidroxi-benzotriazole (HOBt), 1-hidroxiazabenzotriazole (HOAt), ou HOSu). 0 método do anidrido misto, utilizando cloroformato de isobutilo, com ou sem um nucleófilo auxiliar adicionado, pode também ser utilizado, tal como o pode o método da azida, devido à pequena razemização associada com ele. Estes tipos de compostos também podem aumentar a velocidade dos acoplamentos mediados por carbodi-imida, bem como impedir a desidratação dos residuos Asn e Gin.

Depois de se determinar ter acabado o acoplamento, lava-se a mistura reaccional do acoplamento com um solvente, e repete-se o ciclo de acoplamento para cada um dos residuos de aminoácidos subsequentes do material peptidico. Para se acoplar o aminoácido seguinte, consegue-se tipicamente remover o grupo protector do terminal N (por exemplo, um grupo Fmoc) do material ligado à resina, por tratamento com um reagente que inclui 20-50 % (em peso) de piperidina num solvente, tal como a N-metilpirrolidona (NMP) ou a dimetilformamida (DMF). Depois de se remover o grupo protector Fmoc, são tipicamente levadas a cabo diversas lavagens para se remover a 52 piperidina residual e os subprodutos de Fmoc (tais como o dibenzofulveno e o seu composto de adição a piperidina).

Podem utilizar-se os aminoácidos subsequentes num excesso estequiométrico dos aminoácidos em relação ao factor de carga do material peptidico sobre a resina de suporte. Em geral, a quantidade dos aminoácidos que é utilizada no passo de acoplamento é pelo menos equivalente ao factor de carga do primeiro aminoácido sobre a resina (1 equivalente, ou mais). Preferivelmente a quantidade de aminoácidos que se utiliza no passo de acoplamento é de pelo menos 1,3 equivalentes (excesso de 0,3 vezes) ou mais, e mais preferivelmente entre cerca de 1,5 equivalente (excesso de 0,5 vezes), ou mais. Em alguns casos, por exemplo, o passo de acoplamento utiliza uma quantidade de equivalentes de aminoácidos, na gama de entre 1 e 3. A seguir ao último ciclo de acoplamento, lava-se a resina com um solvente tal como a NMP, e depois lava-se com um segundo solvente inerte, tal como o DCM. Para se remover o material peptidico sintetizado da resina a que se liga, leva-se a cabo um tratamento de clivagem de tal modo que o material peptidico clivado ainda mantém uma protecção suficiente nas cadeias laterais e também grupos protectores terminais. Deixando o grupo protector no local ajuda a impedir acoplamentos indesejáveis ou outras reacções também indesejáveis dos fragmentos peptídicos, durante ou depois da clivagem em relação à resina. No caso em que se utiliza quimica de Fmoc ou outra semelhante para sintetizar o 53 péptido, pode conseguir-se uma clivagem protegida de um modo qualquer, tal como pela utilização de um reagente ácido relativamente fraco, tal como ácido acético ou TFA diluído, num solvente tal como o DCM. A utilização de entre 0,5 e 10 por cento e peso, preferivelmente de entre 1 e 3 por cento, em peso, de TFA em DCM, é típica. Veja-se, por exemplo, a Pat. U.S. N°. 6.281.335.

Os passos para clivar o fragmento intermediário de péptido da fase sólida podem seguir as linhas de um processo exemplar, tal como se segue. No entanto, pode utilizar-se qualquer processo adequado que clive eficazmente o fragmento de péptido intermediário em relação á resina. Por exemplo, adiciona-se aproximadamente entre cerca de 5 a 20, preferivelmente cerca de 10 volumes, de um solvente contendo um agente de clivagem ácido, ao dispositivo de reacção contendo o material peptídico ligado à resina. Em consequência faz-se a imersão da resina, tipicamente sob a forma de pérolas, no reagente. Esta reacção de clivagem ocorre enquanto o conteúdo líquido é agitado a uma temperatura adequada e durante um intervalo de tempo adequado. A agitação ajuda a impedir a aglomeração das pérolas. As condições adequadas de duração e de temperatura dependerão de factores tais como o reagente ácido que se está a utilizar, a natureza do péptido, a natureza da resina, e outras semelhantes. A título de linhas de orientação gerais, uma agitação a entre cerca de -15°C e cerca de 5°C, preferivelmente a entre cerca de -10°C e cerca de 0°C, durante entre cerca de 5 minutos e 54 duas horas, preferivelmente entre cerca de 25 minutos e cerca de 45 minutos, seria adequada. 0 período em que ocorre a clivagem pode ser ao fim de entre cerca de 10 minutos e cerca de 2 horas, ou mesmo tanto como um dia. Leva-se a cabo a clivagem, de uma forma desejável, a uma gama de temperaturas frias que permitam acomodar a exotermia da reacção que pode tipicamente ocorrer durante a reacção. Para além disto, a utilização de pequenas temperaturas para a clivagem impede a remoção nesta mesma altura, de grupos protectores de cadeias laterais que sejam sensíveis a ácidos, tais como os grupos tritilo.

No final do tratamento de clivagem, termina-se a reacção. Isto pode ser conseguido, por exemplo, combinando o reagente de clivagem com uma base adequada, tal como piridina ou algo semelhante, e continuando a agitar durante um período adicional tal como durante mais entre 5 minutos e 2 horas, preferivelmente entre 20 minutos e cerca de 40 minutos. Adicionar a base e continuar a agitação faz com que a temperatura do conteúdo do vaso reaccional aumente. No final da agitação, os conteúdos do reactor podem estar a uma temperatura na gama de entre cerca de 0°C e cerca de 15°C, preferivelmente entre cerca de 5°C e cerca de 10°C.

Podem opcionalmente incorporar-se factores tais como aumentos ou diminuições de volume da resina para se melhorarem aspectos da recuperação do péptido no processo sintético global. Estas técnicas são descritas, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 2005/0164912 AI. 55

Em alguns aspectos, podem preparar-se os fragmentos peptídicos clivados por acoplamento em fase de solução, com outros fragmentos peptídicos e/ou aminoácidos. As reacções de acoplamento de péptidos na fase de solução são revistos em, por exemplo, New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafael; Dodsworth, David J.; e Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303. O acoplamento de fragmentos intermediários de péptido com outros fragmentos o aminoácido(s) na fase de solução pode ser levado a cabo utilizando reagentes de acoplamento in situ, por exemplo hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)tris(dimetilamino)fosfónio (BOP), hexafluorofosfato de o-(benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio (HBTU), hexafluorofosfato de o-(7-azobenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HATU), diciclohexilcarbodi-imida (DCC), carbodi-imida solúvel em água (WSCDI), ou tetrafluoroborato de o-(benzotriazol-l-il) -Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurónio (TBTU). Outras técnicas de acoplamento recorrem a ésteres activos previamente formados tais como de hidroxissuccinimida (HOSu) e de p-nitrofenol (HONp); anidridos simétricos previamente formados; anidridos não simétricos tais como N-carboxianidridos (NCAs); ou halogenetos de acilo tais como fluoretos de acilo bem como cloretos de acilo. 56

Pode utilizar-se um solvente de acoplamento adequado na reacção de acoplamento em fase de solução. Deve entender-se que o(s) solvente(s) de acoplamento utilizados podem afectar o qrau de racemização da ligação peptidica formada; a solubilidade do péptido e/ou dos fragmentos peptídicos; e a velocidade da reacção de acoplamento. Em algumas concretizações, o solvente de acoplamento inclui um ou mais reagentes miscíveis com água. Incluem-se nos exemplos de solventes misciveis com a água, por exemplo, DMSO, piridina, clorofórmio, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxano, ou misturas de todos estes.

Noutras concretizações, a reacção de acoplamento pode incluir um ou mais reagentes não misciveis com a água. Um exemplo de solvente não miscivel com a água é cloreto de metileno. Nestas concretizações, o solvente não miscivel com a água é preferivelmente compatível com a reacção de desprotecção; por exemplo, quando se utilizar de preferência um solvente miscivel com a água, ele não afecta de forma adversa a reacção de desprotecção.

Depois de se formar o péptido 11, o produto pode ser submetido a uma desprotecção, uma purificação, uma liofilização, processamento adicional (por exemplo, reacção com outro péptido para se formar uma proteina de fusão); combinações de todas estas, e ou operações semelhantes, consoante se pretenda. 57

Por exemplo, de acordo com a invenção, os grupos protectores das cadeias laterais são tipicamente retidos nos fragmentos peptidicos intermediários ao longo de toda a sintese em fase sólida e também na transferência e durante os acoplamentos em fase de solução. Em geral, depois de se haver completado o passo de acoplamento em fase de solução, podem ser levados a cabo um ou mais passos de desprotecção para remover um ou mais grupos protectores do péptido. A remoção dos grupos protectores da cadeia lateral por desprotecção global recorre tipicamente a uma solução de desprotecção que inclui um agente acidolitico para clivar os grupos protectores da cadeia lateral. Os reagentes acidoliticos habitualmente utilizados na desprotecção global incluem ácido trifluoroacético tal e qual (TFA) , HC1, ácidos de Lewis tais como o BF3Et20 ou o MesSiBr, ácido fluoridrico liquido (HF), ácido bromidrico (HBr), ácido trifluorometanossulfónico, e as combinações destes. A solução de desprotecção também inclui um ou mais captadores de catiões aceitáveis, por exemplo, ditiotreitol (DTT), anisole, p-cresol, etanoditiol, ou sulfureto de dimetilo. A solução de desprotecção também pode incluir água. Tal como se utilizam neste documento, expressam-se as quantidades de reagentes presentes na composição de desprotecção, tipicamente sob a forma de uma razão, em que a quantidade de uma componente individual é expressa sob a forma de um numerador, em "partes", tais como "partes em peso" ou "partes em volume", sendo o denominador o número total de partes na composição. Por exemplo, uma solução de 58 desprotecção contendo TFA:H20: DTT numa razão de 90:5:5 (peso/peso/peso) tem TFA a 90/100 partes, em peso, H20 a 5/100 partes, em peso, e DTT a 5/100 partes , em peso.

Em algumas concretizações, pode ser levada a cabo uma reacção de desprotecção na qual o agente acidolítico, preferivelmente o TFA, na composição de desprotecção, é maior do que 90/100 partes em peso. Outras composições preferidas de soluções de desprotecção incluem uma quantidade de agente acidolítico de 93/100 partes, em peso, ou mais, ou numa quantidade de entre 93/100 partes em peso, e 95/100 partes em peso. A precipitação é tipicamente conduzida utilizando um éter, por exemplo éter dietílico ou MTBE (Éster Metil-Terc-Butílico) . Após a precipitação, o péptido é desejavelmente isolado e seco antes de ser combinado com outros ingredientes, liofilizado, embalado, armazenado, mais processado, e/ou manipulado de outra forma. Isto pode ser levado a cabo por um qualquer dos modos apropriados. De acordo com uma metodologia apropriada, recolhe-se o péptido por filtração, lava-se com lavagens generosas de MTBE para diminuir o conteúdo em sal no produto final até a um teor adequado, e depois seca-se. A invenção presente também proporciona técnicas úteis para purificar uma larga gama de péptidos, incluindo péptidos GLP-1 e os seus equivalentes. 59

Um processo de purificação especialmente preferido inclui pelo menos duas passagens de purificação através de meios cromatográficos, em que pelo menos uma primeira passagem ocorra a um primeiro valor de pH e pelo manos uma segunda passagem ocorra a um segundo valor de pH. Mais preferivelmente, a primeira passagem ocorre a um pH ácido, enquanto a segunda passagem ocorre a um pH básico. Em concretizações preferidas, ocorre pelo menos uma passagem em condições ácidas antes de uma passagem em condições básicas. Um modo ilustrativo de praticar esta metodologia de purificação pode ser descrito no contexto, para ilustração, da purificação do péptido completamente protegido 11 proveniente do esquema 10 ilustrado na Fig. 1. Inicialmente, o péptido é globalmente desprotegido. São clivados os grupos protectores, tanto do terminal N como das cadeias laterais. Leva-se a cabo uma primeira passagem cromatográfica com um gradiente de água/ACN (acetonitrilo), utilizando a quantidade de TFA suficiente para proporcionar um pH de cerca de 1 a 5, preferivelmente de cerca de 2. Leva-se então a cabo uma segunda passagem com um gradiente de água/ACN utilizando um pouco de amónia e/ou de acetato de amónio, ou outro semelhante, para se obter um pH de cerca de 8 a 9, preferivelmente entre 8,5 e 8,9.

Os valores de pH, quer ácidos quer básicos, promovem uniformidade na medida em que apenas está presente uma única forma iónica, em cada caso. Deste modo, o valor ácido do pH será desejavelmente suficientemente pequeno para assegurar que substancialmente todos os residuos de 60 aminoácidos no material peptídico estejam protonados. O valor do pH básico será desejavelmente elevado tanto quanto é necessário para assegurar que substancialmente todos os residuos de aminoácidos do material peptidico estejam desprotonados. Pode levar-se a cabo a cromatografia ácida, e a básica, por uma ordem qualquer. É conveniente que a cromatografia básica seja a última a ser corrida, quando o acetato do péptido é um produto pretendido na medida em que o acetato pode bem ser o produto da cromatografia.

Os princípios da invenção presente serão agora mais ilustrados, através de quanto diz respeito aos exemplos representativos que se seguem. Em quanto segue, todas as percentagens e todas as razões são em volume, a não ser quando se afirmar expressamente algo em contrário.

Exemplo 1 - Síntese me Fase Sólida do Fragmento 12 com Protecção por Fmoc no Terminal N, e protecção das cadeias laterais de His e de Glu. A. Preparação da Resina 2CTC Carregada com Fmoc-

Gly

Inicialmente, preparou-se resina cCTC carregada com Fmoc-Gly. Listam-se na tabela seguinte as quantidades de reagentes que se utilizaram:

Preparação de Resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritilo 61

Preparação de Resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritilo Materiais |MM |Eq |mmol fgramas|mL

Resina de cloreto de 2-|- |- |52,24f35, 06 |- clorotritilo | | | | |

Fmo c - G1 y-OH............................................................12 9 7,3 11, 0 || 13, 0 613, 88 | -

Di-isopropiletilamina 1129, 25|2,35i|30,72 13, 97 | (DIEA) ! | || 1 | 1270 1785 350 1050

Dimetilformamida (DMF) Diclorometano (DCM)

Metanol:DIEA a 9:1 em| volume

Isopropanol (IPA) |

Colocou-se resina de 2-CTC num reactor de fabrico de péptidos de 500 mL e deixou-se aumentar de volume com 400 mL de DCM durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o solvente e adicionou-se uma solução de Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (a 87,5:12,5). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

Retirou-se o liquido e lavou-se uma vez com 350 mL de DMF e uma vez com 175 mL de DMF. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes na resina de 2-CTC com 350 mL de uma solução de MeOH:DIEA (a 9:1), durante 1 hora. Retirou-se o liquido que banhava o leito, lavou-se duas vezes com 250 mL de DMF, e depois com 350 mL de DCM quatro vezes. Lavou-se a resina com 3X350 mL de IPA 62 para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a massa constante para se obterem 38,20 g de resina carregada. Uma análise demonstrou um factor de carga de 0,18 mmol/g. B. Síntese em Fase Sólida

Levou-se a cabo uma sintese em fase sólida partindo de 20,0 g de resina Fmoc-Gly-2-CTC carregada a 0,18 mmol/g tal como se havia preparado na Parte A deste Exemplo 1. Deixou-se o volume da resina aumentar em DCM (200 mL) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM solvente e lavou-se a resina três vezes com NMP (5 volumes em cada lavagem).

Tratou-se então a resina por duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (5 volumes em cada tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em NMP, lavou-se a resina cinco vezes com NMP (5 volumes em cada tratamento) até se obter um teste com cloranilo negativo.

Para se preparar a solução de acoplamento, pesam-se o aminoácido (2,85 equiv.) e 6-cloro-l-hidroxibenzotriazole (6-C1-HOBT, 2,85 equiv.), dissolvem-se em 2,55 x o volume de NMP e depois misturam-se com DIEA (3,25 equiv.) a entre 5 °C e 10°C. Dissolve-se TBTU (2,85 equiv.) em 1,3 x o volume de NMP a entre 5°C e 10°C. Misturam-se então as duas soluções. Coloca-se a solução 63 resultante no reactor. Lava-se este reactor com 1,3 xo volume de DCM adicionando-o ao reactor que em seguida se agita durante 2-3 horas a entre 25°C e 27°C. Retira-se uma amostra para se fazer uma reacção Teste de Kaiser para averiguar se o acoplamento se completou. Caso o acoplamento não se tenha completado ao fim de 3 horas (Teste de Kaiser positivo), retira-se o fluido do reactor e volta a fazer-se o acoplamento com uma solução fresca de aminoácido activado. Completada a reacção de acoplamento, retira-se a solução de acoplamento e lava-se a resina 4 vezes com NMP 4 (5 volumes de cada vez). Em seguida repete-se a remoção do grupo protector Fmoc e o ciclo da reacção de acoplamento para os aminoácidos restantes do fragmento (isto é, pela ordem Glu(OtBu)^Aib-His(trt)).

Devido à dificuldade da reacção de acoplamento entre Fmoc-His(trt)-OH activado e H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC, e à instabilidade do Fmoc-His(trt)-OH activado, a reacção de acoplamento é forçada a completar-se retirando a solução ao fim de uma hora e levando imediatamente a cabo uma nova reacção de acoplamento com uma segunda solução, fresca de Fmoc-His(trt)-OH activado.

Todos os reagentes utilizados na Parte B deste exemplo estão listados na tabela seguinte: 64 lAminoácido |g 6- ÍDIEA Inmp |tbtu NMP ÍÍDCM ÍPeriodo de| Cl- ÍHOBT (g) (g) í (mL) (g) : (mL) i (mL) |acop Lamen Lo | (minutos) |Glu (OtBu) ±'.3± 1,76, 1,55 51,0 [3,2 8] Í26, Oj 26, 0 150............... |Aib 3,36 1,7 6 1,51 51,0 7-,2 3 i2.6/..0.. 26,p jl55 | |His (trt) jj6, 32 1,78 1,56 151,0 3,29 2 6,0 |2 6, 0 Í60 ΠΙ i s (trt) Inovo iacop 1 amento 6, 32 1,79 ]l, 56 Ϊ51,0 i 3,2 91 26, 0 (26, 0 192

Lavou-se o fragmento peptídico ligado à resina com NMP (5 volumes) 4 vezes, com DCM (6 volumes) 5 vezes, com IPA (5 volumes) 3 vezes. Secou-se então a resina desinchada a 35°C em vazio para se obterem 22,58 g de resina com péptido ligado. C. Clivagem do Fmoc e do fragmento com cadeias laterais protegidas, da resina

Inchou-se a resina já portadora de péptido da Parte B acima em DCM (12,5 volumes em relaçção ao peso de resina utilizado; 12,5 mL de DCM por g de resina ou 12,5 litros por kg) durante 30 minuto a 25°C e depois lavou-se 2 vezes com DCM (6,25 volumes de cada vez) para remover qualquer residuo de NMP. Arrefeceu-se a resina com a última lavagem de DCM, até -5 °C. Separou-se o DCM, adicionou-se uma solução fria a 1 % de TFA/DCM (10 volumes a entre -5°C 65 e -10°C), e agitou-se durante 30 minutos a 0°C. Adicionou-se piridina (1,3 equiv. do TFA) ao reactor para neutralizar o TFA. Separou-se a solução de clivagem por filtração recolhendo-se num balão. Enquanto a mistura reaccional aqueceu até 25°C, lavou-se a resina t vezes com DCM (7,5 volumes). Misturaram-se as lavagens com a solução de clivagem. Misturou-se o DCM da solução de clivagem com água (7,5 volumes). Destilou-se a mistura obtida sob pressão reduzida para se remover o DCM (350 torr a 28°C) . O fragmento peptidico precipitou da água quando se removeu o DCM. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a 30°C-35°C em vazio. Obteve-se no total 4,73 g de Fmoc-(Aib8) GLP-1 (7-10)-OH.

Exemplo 2 A. Preparação de Resina 2CTC carregada com Fmoc-

Gly

Preparou-se resina 2CTC carregada com Fmoc-Gly. Listam-se na tabela seguinte as quantidades de reagentes que se utilizaram:

Preparação de Resina 2CTC carregada com Fmoc-Gly

Materiais Resina de cloreto de 2-clorotritilo MW |Eq iiimmol Igramas |ml, 59, 66!40,04 |-

fFmoc-Gly-OH 112 97,3 fl,0 Ií2 9, 84 j|8,87 66

ÍP reparação de Resina 2CTC carregada com Fmoc-Gly ÍMateriais |MW |Eq |mmol !g ramas |mL ÍDi-isopropi 1 et i lamina |129, 25 |1, 67 §49, 90 16, 45 i(DIEA) | 1 I 1 1;

Dimetilformamida (DMF) | | 1 | 115 8 01

Diclorometano (DCM) | | 1; § ;ί 184 0 1

Metanol :DIEA a 9:1 | I | | ii390 | I sopropano 1 ( I ΡΛ) | | | 1:10501

Colocou-se resina 2-CTC num reactor de 500 mL para síntese de péptidos, inchando-se com 400 mL DCM durante 30 minutos. Retirou-se o liquido da resina, e adicionou-se uma solução de Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (a 87,5:12,5, em volume). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

Retirou-se o líquido do leito de resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF e uma vez com 200 mL de DMF. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes da resina de 2-CTC com 390 mL de uma solução de MeOH:DIEA (a 9:1 em volume) durante 1 hora. Voltou a coar-se o líquido que banhava a resina, que se lavou duas vezes com 350 mL de DMF, e se lavou quatro vezes com 350 mL de DCM. Lavou-se então a resina com 3X350 mL de IPA para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a 35°C em vazio, até peso constante, para se obterem 48,51 g de resina carregada. Uma análise mostrou um factor de carga de 0,54 mmo1/g. 67 B. Síntese em Fase Sólida

Levou-se a cabo a síntese em fase sólida partindo de 27,59 g de resina Fmoc-Gly-2-CTC carregada a 0,54 mmol/g. Inchou-se a resina em DCM (300 mL) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM usado como solvente, e lavou-se a resina três vezes com NMP (5 volumes por lavagem).

Tratou-se então a resina duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (5 volumes por tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. Depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em volume em NMP, lavou-se a resina por seis vezes com NMP (5 volumes por lavagem) até que o teste do cloranilo desse negativo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesou-se o aminoácido (1,7 equiv.) e o 6-cloro-l-hidroxibenzotriazole (6-C1-HOBT, 1,7 equiv.), dissolveram-se em 4,6xo volume de NMP, e depois misturou-se com DIEA (1,9 equiv.) a entre 5°C e 10°C. Dissolveu-se TBTU (1,7 equiv.) em 2,2 8 x volumes de NMP a entre 5°C e 10 °C. Misturaram-se então ambas as soluções. Adicionou-se a solução resultante ao reactor. Lavou-se o frasco que as continha com 2,28 volumes de DCM, para dentro do reactor, o qual em seguida se agitou durante 2-3 horas a entre 25°C e 27°C. Retirou-se uma amostra para se fazer o Teste de 68

Kaiser para determinar se a reacção se havia completado. Completada a reacção de acoplamento, retirou-se a solução de acoplamento, e lavou-se a resina com NMP 4 vezes (5 volumes em cada lavagem). Após remoção do grupo Fmoc repetiu-se o ciclo da reacção de acoplamento para os restantes aminoácidos do fragmento (isto é, na ordem de Glu(OtBu)^Aib-^His(trt)).

Todos os reagentes utilizados neste exemplo estão listados na tabela seguinte: lAminoácido |g 16- JDIEAj fNMP |TBTUj |NMP |DCM |Período de: Ici- |(g) 1 | (mL) |(g) I !; (rnL) 1 (mL) |acoplamento j Ihobt 1 (minutos) 1 (g) | |Glu(OtBu) ! |l0,79j N, 24 1 [2, 67 I Π 27 |8, 13 Í63 16 3 I1.5.6.. |Aib 1 oo 1 K) 1 |4,32 3,73 : 25 18,14 |65 65 |l80 |His (trt) )l5, 68 I4,31 3, 69 ί 12 5 |b, 12 ! 6 5 65 118 0 C. Clivagem do fragmento a partir da resina

Lavou-se a resina já construída com NMP (5 volumes) 6 vezes, e depois com DCM (6 volumes) 8 vezes, para se removerem os resíduos de NMP. Arrefeceu-se a resina com a última lavagem com DCM, a -5 °C. Depois de se retirar o DCM, adicionou-se uma solução fria (de -5°C a -10°C) de 1 % de TFA em DCM (10 volumes), e agitou-se a mistura resultante no reactor durante 30 minutos a 0°C. Colocou-se 69 piridina (1,3 equiv. em relação ao TFA) no reactor para neutralizar o TFA. Recolheu-se a solução de clivagem no balão. Enquanto o reactor aquecia até 25°C, lavou-se a resina com DCM (7,5 volumes) 11 vezes, retirando-se para a solução de clivagem. Misturou-se a solução em DCM com água (10 volumes). Destilou-se a mistura resultante sob pressão reduzida para se remover o DCM (350 torr a 28°C) . O fragmento precipitou a partir da água quando se retirou o DCM. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a entre 30°C e 35°C em vazio. Obteve-se no total 11,12 g de Fmoc-(Aib8) GLP-1(7-10)-OH (rendimento de 78,8 %) .

Exemplo 3 A. Preparação de Resina de 2 CTC carregada com

Fmoc-Gly

Preparou-se resina de 2CTC carregada com Fmoc-Gly. As quantidades de reagentes utilizados estão listadas na tabela seguinte:

Preparação de Resina Materiais Resina de cloreto clorotritilo Fmoc-G l.y-OIi :Di-isopropiletilamina

Fmoc-Gly-2-clorotritilo MW |Eq iiimmol Hq ramas

imL de 2- 60,8 8 |4 0,86 !297,3 11,0 :::42,58112, 66 129,2511,48163,2118,17 (DIEA) 70

Preparacão de Resina Fmoc-Gly-2-clorotritilo Materiais |MW |Eq jjmmo 1 IgramasImL iDimetilformamida (DMF) 11380 IDic1oromeLano (DCM) 11840 |Metanol:DIEA a 9:1 1390

llsopropanol (IPA) | | | lilOOO

Carregou-se resina de 2-CTC num reactor de sintese de péptidos com 500 mL e inchou-se com 400 mL de DCM durante 30 minutos Retirou-se o liquido da resina, e adicionou-se uma solução de Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volumes de DMFrDCM (a 87,5:12,5, em volume). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

Retirou-se o liquido do leito de resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes da resina de 2-CTC com 390 mL de uma solução de MeOH:DIEA (a 9:1 em volume) durante 1 hora. Voltou a coar-se o liquido que banhava a resina, que se lavou quatro vezes com 350 mL de DCM. Lavou-se então a resina com 4X350 mL de IPA para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a 35°C em vazio, até peso constante, para se obterem 52,02 g de resina carregada. Uma análise mostrou um factor de carga de 0,72 mmol/g. B. Síntese em Fase Sólida 71

Levou-se a cabo a síntese em fase sólida partindo de 24,43 g de resina Fmoc-Gly-2-CTC carregada a 0,72 mmol/g. Inchou-se a resina em DCM (250 mL) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM usado como solvente, e lavou-se a resina três vezes com NMP (5 volumes por lavagem).

Tratou-se então a resina duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (5 volumes por tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. Depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em volume em NMP, lavou-se a resina por seis vezes com NMP (5 volumes por lavagem) até que o teste do cloranilo desse negativo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesou-se o aminoácido e o 6-cloro-l-hidroxibenzotriazole (6-Cl-HOBT) dissolveram-se em NMP, e depois misturou-se com DIEA a entre 5°C e 10°C. Dissolveu-se TBTU em NMP a entre 5°C e 10°C. Misturaram-se então ambas as soluções. Adicionou-se a solução resultante ao reactor. Lavou-se o frasco que as continha com DCM (vejam-se as quantidades na tabela que se segue), para dentro do reactor, o qual em seguida se agitou durante 2-6 horas a entre 25°C e 27°C. Caso a reacção de acoplamento não se tivesse completado passadas 3 horas (Teste de Kaiser positivo), retirava-se o líquido e levava-se a cabo uma nova reacção de acoplamento com uma solução fresca de aminoácido activado. Completada a reacção de acoplamento, retirou-se a solução de acoplamento, e lavou- 72 se a resina com NMP 4 vezes (5 volumes em cada lavagem) . Após remoção do grupo Fmoc, repetiu-se o ciclo da reacção de acoplamento para os restantes aminoácidos do fragmento (isto é, na ordem de Glu (OtBu)->Aib-->His (trt) ) .

Todos os reagentes utilizados neste exemplo estão listados na tabela seguinte: jíAminoácido |g í\ ÍEq 6-Cl- HOBT (g/Eq) |diea 1 (g/Eq) (NMP iTBTU ( (ml, | (g/Eq) |) | NMP iiÍDCM : (rnL | (rnL ) ii) (Período dei (acoplamenti (o s(minutos) ÍGlu(OtBu) 112,40 | 4,95/1,6 ÍÍ4,29/1, 8 ! 145 |9,37/1,65 í ° ^1 o 118 0 1 1/ i Í5 ii5 ii|l, 65 iiAib 19,48/ I 4,9 Í4,23/1,8 jjl40 19,33/1,65 l70 13 5 2 i ii 11,65 i/1,65 i:5 ;Aib novo|4,73/ co ^r1 CM Í2,15/0, 9 17 2 14, 85/0, 8 3 i i 3 6 13 6 ϋ120 i i;acoplament|o, 83 /0, 83 ii:2 io | jiHis (trt) |Í21,18 5,80/1,9 ii4, 99/2,1 ! 14 0 110, 98/1,9 -J O -J o ii180 j 1 |/ | Í4 |Í4 ii |: 4 1,94 i;His (trt) ! 10,80 O Oó CM CO ^r1 CM ^r1 LO CM Γ- i3 6 13 6 ii180 i inovo il/0,97 i/0, 97 ii/1,07 ii 1/0,97 iiacoplamentil i io 1 i 73 C. Clivagem do fragmento Fmoc-AA (7-10) -OH a partir da resina

Lavou-se a resina já construída com NMP (5 volumes) 6 vezes, e depois com DCM (6 volumes) 7 vezes, para se removerem o NMP. Arrefeceu-se a resina com a última lavagem com DCM, a -5 °C. Depois de se retirar o DCM, adicionou-se uma solução fria (de -5°C a -10°C) de 1 % de TFA em DCM (11,26 volumes), e agitou-se a mistura resultante no reactor durante 5 minutos a 0°C. Recolheu-se a solução de clivagem num balão, ao qual se havia adicionado piridina (1,3 equiv. do TFA total) para neutralizar o TFA. Em seguida adicionou-se a segunda porção de solução fria a 1 % de TFA em DCM (6,14 volumes), e agitou-se durante 2 minutos. De novo se separou o líquido de clivagem para dentro do balão. Enquanto o reactor aquecia até 25°C, lavou-se a resina com DCM (8,2 volumes) 9 vezes, retirando-se para a o balão da solução de clivagem. Misturou-se a solução em DCM com água (8,2 volumes). Destilou-se a mistura resultante sob pressão reduzida para se remover o DCM (350 torr a 28°C). O fragmento precipitou a partir da água quando se retirou o DCM, e recolheu-se. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a entre 30 °C e 35°C em vazio. Obteve-se no total 14,02 g de Fmoc-(Aib8) GLP-1 (7-10)-OH (rendimento de 86,6 %) , de acordo com a SEQ ID NO. 7. Uma análise permitiu determinar uma pureza de 94,3 % AN.

Exemplo 4 - Síntese em Fase Sólida de Fmoc- (Aib35) GLP-1 (23-35)-OH com cadeias laterais protegidas A. Preparação de resina 2CTC carregada com Fmoc-

Aib

Preparou-se resina 2CTC carregada com Fmoc-Aib. As quantidades dos reagentes utilizados estão listadas na tabela seguinte: iPreparação de Resina de |Materiais iResina de cloreto de iiiclorotritilo iFmoc-Aib-OH |Di-isopropiletilamina

Fmoc-Aib-2-Clorotritilo |MW |Eq 2-1- 1- ! 3 2 5, 5 §1,0 112 9, 2 5! 2,3 immo 1 jlgramas |mL Í5 9, 66 Ϊ4 0,04 |- 14, 91!4,85 §- 35,20 §4,61 (DIEA) 1480 1840 450 1050 iDimetilformamida (DMF) iDiclorometano (DCM) iiMetanol: DIEA a 9:1 iilsopropanol (IPA)

Carregou-se resina de 2-CTC num reactor de sintese de péptidos com 500 mL e inchou-se com 400 mL de DCM durante 30 minutos Retirou-se o liquido da resina, e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes 75 de DMF:DCM (a 87,5:12,5, em volume). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

Retirou-se o liquido do leito de resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF, e de novo com mais 200 mL. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes da resina de 2-CTC com 390 mL de uma solução de MeOHrDIEA (a 9:1 em volume) durante 1 hora. Voltou a coar-se o liquido que banhava a resina, que se lavou quatro vezes com 350 mL de DCM. Lavou-se então a resina com 3X350 mL de IPA para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a 35°C em vazio, até peso constante, para se obterem 45,15 g de resina carregada. Uma análise mostrou um factor de carga de 0,24 mmo1/g. B. Síntese em Fase Sólida

Colocaram-se 10,01 g de resina Fmoc-Aib-2-CTC carregada a 0,24 mmol/g num balão reaccional e inchou-se a resina em DCM (250 mL) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM usado como solvente, e lavou-se a resina três vezes com NMP (6 volumes por lavagem).

Tratou-se então a resina duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (6 volumes por tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. Depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em volume em NMP, lavou-se a resina por quatro vezes com NMP (6 volumes por lavagem). 76

Para preparar a solução de acoplamento, pesou-se o aminoácido (1,875 equiv.) e o mono hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (hidrato de HOBT, 2,07 equiv.) dissolveram-se em 3,5 volumes de NMP, e depois misturou-se com 16,1 mL de uma solução de HTBU (2,0 equiv.) em NMP. Em seguida adicionou-se 2,2 mL de DIEA a entre 5°C e 10°C ao balão de activação. Transferiu-se a solução resultante para um balão reaccional. Lavou-se o balão de activação com 1,5 x volumes de DCM, para dentro do reactor, que em seguida se agitou durante 2 horas a 25°C. Retirou-se o liquido do balão de reacção. Dissolveu-se TBTU em NMP a entre 5°C e 10°C. Misturaram-se então ambas as soluções. Adicionou-se a solução resultante ao reactor. Repetiu-se a reacção de acoplamento com uma solução fresca de aminoácido activado (1,875 equiv.). Completada a segunda reacção de acoplamento, retirou-se a solução de acoplamento, e lavou-se a resina com NMP 4 vezes (6 volumes em cada lavagem). Em seguida, repetiu-se a remoção do grupo Fmoc e o ciclo da reacção de acoplamento para os restantes aminoácidos do fragmento (isto é, na ordem de

Lys (Boc) ->Val^Leu^Trp (Boc) ->Ala->Ile->Phe->Glu (OtBu) -^Lys (Boc) -^Al a->Ala->Gln (trt) ) .

Todos os reagentes utilizados neste exemplo estão listados na tabela seguinte:

Reacção de acoplamento de Fmoc-AA(23-35)-OH Exemplo 1 77 (Aminoácido (g iHidrato (NMP (:HBTU |NMP (DCM :(: DI EA ((Período de (de HOBT ( (mL) 1 (g) 1 (mL) (: (mLO :(: (mL) ((acoplamento (g) ((: (minutos) (Lys (Boc) (2,12 (Õ, 76 ((30, Õ ((1,83 ((1(5,0 ((15, Õ |ϊ,ΐ......... (((12 0 (Novo (acoplamento (Lys (Boc) de (2,12 (0,76............ ((30 , Õ 11, 8 3 (((15, 0 ((15,0 (ΐ,ΐ.......... ”1(120........................... (Vai (1,53 (0,76 ((30, 0 I1, 83 :((15, 0 ((15, 0 (((1,1 I120 (Novo (acoplamento (Vai de (1,53 (0,76 ((30, 0 (((1,83 :((1(5,0 ((15,0 (((Ϊ,Ϊ |Ϊ2 Õ (Leu (1,58 10776............ (307(7 fl, 83 (15, 0 (:15,Ò ΐΐ,ΐ.......... ”1(120........................... (Novo (acoplamento (Leu de (1,58 (0,76 ((3o7o (((1,83 p5,"o" ((15,0 |ϊ, ϊ (|12 0 (Trp (Boc) (2,37 íÕ7 7 6............ (( 30 7 0 (((17 8 3 (((15,”0” (:157o ΙΐΖΓΖ" ((((120.......................... (Novo (acoplamento (Trp (Boc) de (2,36 (0,76 ((30, 0 (((1, 83 :((15, 0 ((15,0 I1'1 I120 (Ala (1,42 (0,76 ((30, 0 |1, 83 (((15, 0 ((15, 0 (((ΐ,ΐ......... I120 (Novo (acoplamento (Ala de (1,42 (0,76 (30, 0 ((1,83 (((15, Ò ((l5,0 I1'1 (((12 0 i;Ile (i759’ (0,76............ ((30 ,"Õ" (((1,83 (((1570" ((15,”o” (((ΐ,’ι.......... ”"f(12 0........................... (Novo (acoplamento (Ile de 7759' íÕ7 7 6............ ((307 0 (;(17 8 3 (((15, "Õ" ((157o" |ΐ'7ΐ......... ((((12 0.......................... (Phe 7774' (0,76............ ((30 7 Õ" ((1,83 fl5,0” ((15,0 ιτ,'ΐ.......... ""|Ϊ2 0........................... (Novo (acoplamento (Phe de (1,74 (0,76 (30, 0 ((3,83 (((15, 0 ((15,0 I1'1 I120 ((Glu(OtBuj ΙΓ,"93” ÍÕ7 7 6............ (30 7o P'7'83" (((15,0 ((15 7o !ϊϊΓ((7" ""(((120.......................... (Novo (acoplamento (Glu(OtBu) de (Í792 (0,76............ ((30 ,"Õ" (((1,83 (((157 Õ" ((15 ,Õ (((ΐ,ΐ.......... (((12 0........................... (Lys(Boc) (2,12 (0,76 (30, 0 I1, 83 (((15, 0 ((15, 0 (((1,1 I120 (Novo (acoplamento (Lys(Boc) de (2,11 (0,76 (30, 0 ((1,83 :((1(5,0 ((15,0 I1'1 I120 (Ala (1,41 (0,76 (30, 0 (((1,83 :((15, 0 ((15, 0 (((1,1 (((12 0 (Novo (acoplamento (Ala de (i740" (0,76 (3o7o (((1,83 p5,"o" ((15,0 ρτΐ ((12 0 (Ala 7,41" (0 7 7 6............ ((307o (((17 8 3 (((15,0 ((157o Ι'ΐϊ'ΐ......... ((((lio.......................... (Novo (acoplamento (Ala de :7740 (0,76............ ((30,0 |l, 83 p'5'7'Ò" ((15,0 (ΐ,’ι.......... ((12 0........................... (Gin (trt) (27'77" (0776............ fãoTÕ" (((7783" (((15, Õ ((ΪΙ,Ο" |ΐ7ϊ......... ""((((T2Õ.......................... (Novo (acoplamento de (2,7 6 (0,76............ ((30,"o" (((1,83 (((15, 0 ((15,"O" ((4,1 |Ϊ2 0...........................

Gin(trt) 78

Isolou-se a resina construída lavando 4 vezes com NMP (6 volumes), 4 vezes com DCM (6 volumes), e 3 vezes com Isopropanol (IPA, 6 volumes). Secou-se a resina construída a 35 °C em vazio. Obtiveram-se 14,3 g de resina construída. C. Clivagem do fragmento intermediário a partir da resina construída

Deixaram-se inchar 6,6 g de resina construída obtida acima em 10 x o volume de DCM durante 30 minutos, e arrefeceu-se a -10 °C. Retirou-se o DCM e adicionou-se uma solução fria, a 1 % e TFA em DCM (12 volumes, a entre -5°C e -10°C), agitando-se durante 30 minutos a 0 °C. Recolheu-se a solução de clivagem num recipiente contendo piridina (2-3 equiv. do TFA). Enquanto aquecia até 25°C, agitou-se a resina com a solução a 1 % de TFA/DCM (10 x volumes) durante 5 minutos, e adicionou-se piridina (2-3 equiv.). Passados mais 5 minutos, recolheu-se a solução. Lavou-se a resina com DCM 4 vezes (10 volumes). Misturou-se o conjunto das lavagens em DCM com água (água/DCM = 1/4). Destilou-se a mistura resultante sob pressão reduzida para remover o DCM (350 torr a 28°C). O fragmento precipitou da água quando o DCM foi removido. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a entre 30°C e 35°C em vazio. Repetiu-se o processo de clivagem mais uma vez. Obteve-se no total 2,36 g de Fmoc-(Aib35) GLP-1 (23-35)-OH (um rendimento de 92 %) .

Exemplo 5 79 A. Preparação de Resina de 2CTC carregada com

Fmoc-Aib

Preparou-se resina de 2CTC carregada com Fmoc-Aib. As quantidades dos reagentes utilizados neste exemplo estão listadas na tabela seguinte: : 7-repara cão de Resina de ^Materiais iiResina de cloreto de liclorotritilo

Fmoc-Aib-2-Clorotritilo IMW |Eq Immol Igramas 59, 67 §40,05

;mL 2- |325, 5 §1,0 114, 9214,85 ij-112 9,2 512,3 513 5,2 0 55

Fmoc-Aib-OH Di-isopropiletilamina (DIEA)

Dimetilf ormamida (DMF) | | 112 8 0

Diclorometano (DCM) | 1 11840

Metanol:DIEA a 9:1 f | 1400

Isopropanol (IPA) | 1 11050

Carregou-se resina de 2-CTC num reactor de síntese de péptidos com 500 mL e inchou-se com 400 mL de DCM durante 30 minutos. Retirou-se o líquido da resina, e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (a 87,5:12,5, em volume). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C. 80

Retirou-se o líquido do leito de resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes da resina de 2-CTC com 390 mL de uma solução de MeOH:DIEA (a 9:1 em volume) durante 1 hora. Voltou a coar-se o líquido que banhava a resina, que se lavou uma vez com 200 mL de DMF, e quatro vezes com 350 mL de DCM. Lavou-se então a resina com 3X350 mL de IPA para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a 35°C em vazio, até peso constante, para se obterem 45, 32 g de resina carregada. Uma análise mostrou um factor de carga de 0,30 mmol/g. B. Síntese em Fase Sólida

Levou-se a cabo a síntese em fase sólida partindo de 15,0 g de resina Fmoc-Aib-2-CTC carregada a 0,30 mmol/g.

Inchou-se a resina em DCM (150 mL; ) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM usado como solvente, e lavou-se a resina duas vezes com DCM (6 volumes por lavagem) e três vezes com NMP (6 volumes por lavagem).

Tratou-se então a resina duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (6 volumes por tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. Depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em volume em NMP, lavou-se a resina por seis vezes com NMP (6 volumes por lavagem), até dar um resultado negativo no teste de cloranilo. 81

Para preparar a solução de acoplamento, pesou-se o aminoácido (1,7 equiv.) e 6-cloro-l-hidroxibenzotriazole (6-C1-H0BT, 1,7 equiv.)/ e dissolveram-se em 2,6 volumes de NMP a entre 5°C e 10 °C, e depois misturou-se DIEA (1,9 a 3,0 equiv.). Dissolveu-se TBTU ou HBTU (1,7 equiv.) em 1,33 x o volume de NMP a entre 10°C e 5°C. Misturaram-se ambas as soluções. Transferiu-se a solução resultante para um balão reaccional. Lavou-se o balão de mistura com 1,33 x o volume de DCM, para dentro do reactor, que em sequida se agitou durante 2 a 3 horas a entre 25°C e 27°C. Retirou-se uma amostra para se fazer o Teste de Kaiser de completude da reacção. Caso a reacção de acoplamento estivesse incompleta (Teste de Kaiser positivo) ao fim de 3 horas, retirou-se o liquido do balão de reacção, e voltou a fazer-se uma reacção de acoplamento com uma solução fresca de aminoácido activado. Completada a reacção de acoplamento, retirou-se a solução de acoplamento, e lavou-se a resina com NMP 4 vezes (6 volumes em cada lavagem) . Em seguida, repetiu-se a remoção do grupo Fmoc e o ciclo da reacção de acoplamento para os restantes aminoácidos do fragmento (isto é, na ordem de Lys (Boc) ->Val->Leu->Trp (Boc) ->Ala->Ile->Phe->Glu (OtBu) -^Lys (Boc) ->A1 a->Ala-/Gln (trt) ) .

Devido a um possivel efeito de justaposição entre a 2-metilalanina (Aib) e a resina de 2-CTC, é consideravelmente dificil forçar as duas primeiras reacções de acoplamento de aminoácidos (Lys(Boc)-34 e Val-33) a completarem-se. Portanto, levaram-se a cabo ambas estas 82 reacções de acoplamento por três vezes (para Lys(Boc)-34 e Val-33) (isto é, cada um destes acoplamentos foi seguido por duas novas edições destes acoplamentos). Além disto, utilizou-se anidrido acético para revestir o material por reagir ligado à resina após as reacções de acoplamento de Lys(Boc)-34 e de Val-33. Isto melhorou a eficiência da purificação subsequente porque afasta as impurezas para longe do produto pretendido, durante a purificação por cromatografia.

Todos os reagentes utilizados neste exemplo estão listados na tabela seguinte: iíReacção de Acoplamento do Fmoc- -ΑΑ(23 -35) -ΟΗ jiAminoácido lig/ Eq i: 6—C í — ;:D I EA ΝΜΡ : TBTU HBTU :;ΝΜΡ !;DCM ijPeriodo dei lÍHOBT ii (g/Eq) (mL) : (g/Eq)| (g/Eq) : (mL) ϋ (mL) ijacoplamento i:(g/Eq) j: (minutos) |j i|í° de!3, 61 !!:, 33 / fl, 15 / 39, 0! 2,50 /! - ::2Õ, 5 ÍÍ2 0, 0 117 5 1 jjLys(Boc) |/ 1,7 I1,7 μ, 9 1,7 |2° de| 3,61 !T;ir 7' μ,Ϊ6 71 39, 0 '2,48' 71 _ |2Õ”7Õ' ÍÕ70 Ιΐ'β'ο 1 |Lys(Boc) %/ 1,7: μ,7 μ,9 1,7 |3° dei 3,61 ΙΪ, 33 7 Γι’,Η’ ”71 39, 0 2,47 7| - Í20; 0 !Í2 0 , θ’ 118 Ò.......................... i;Lys (Boc) ::/ 1,7: μ,7 μ,9 1,7 jAnidrido ::2,33 ; μ’ΓΗ’ 71 60, 0: - - Í3o7o ::120.......................... jAcético |/ 5,0| 5,5 :;1° de Vai :12,62 11,33 71 ίΐ, 13 / 39, 0! 2,51 /1 - \20, 0 i:2 0,0 Ϊ17 0 1 | i / i, 7! μ,7 μ,9 1,7 iÍ2°’de’Val.....12,62.....i 7,33 7] Ο'7" ”71 3 9 , ”01 2,"49 71 _ μ'ό','ο Ι2 0, 0 i’l80..........................| ψ 1,7; μ,7 ί,9 1,7 i3 de Val jj2,63 i μ,32 71 3,”67” 71 39, 0 2,50 '71 - |2 0, 0 Í20, Ò j 14 1 1/ 1,7; μ,7 :1,9 1,7 83

jReacçãc de Acoplamento do Fmoc-AA(23-35)-OH ÍAminoácido ig/ Eq ί; 6—C1 — (:Η0ΒΤ 1 (g/Eq) |D I EA 1 (g/Eq) (ΝΜΡ : (mL) ITBTU ((g/Eq) IHBTU J(g/Eq) (:ΝΜΡ :( (mL) (DCM ( (mL) iPeriodo deli jacoplamento: : (minutos) Anidrido Acético (4,69 (/ fio, 0 (7,13 7’ 112,0 :,: :((30,' 0 (153 ( Leu !“““ /1,7 Íi735''''' f/1.,7....... Ιΐ7'ΐ2................ 1/1,..9........ ,: - : -," κ- polo’ ((20, 0 (180 ( Trp(Boc) 4,03/ μ,7 ii 1,33' ' " [/1,7 11778“ (/3, 0 ,: 2,50 (/1,7 ((20,0 (2 0, 5 ((180 :Ala i,.: | /1,7 ίΓΓ3™' (/1,7 |ΓΓ7δ“ |/3,0 |39, 0 :- ψ2","ξΤ"""" (/1,7 20, 0 ((20, 0 ((185................... | Ile Ρ7'7Τ"' (/1,7 , 3 i...... (/1,7 /1,78....... 1/3,0 (39,0 :- .2,93 ((/ 1,7 (EÕ7o’ (55,5 .180 ;Phe 13, 00 /1,7 μ,3ϊ....... /1,7 /1,78........ /3, 0 (39, 0 :- 2,93 /1,7 ((7ο’,"ο ((20, Ô’ ((180.......................... ÍGlu(ÓtBu) !/1,7 1,3 1 /1,7 111,78 1/3,0 (39, 0 : — .2,93 /1,7 ..20,0 (55,"0’ ((185.......................... Lys(Boc) (3, 61 1/1,7 1,3 1 /1,7 |ΐ,78 1/3, 0 (39, 0 |2,93....... /1,7 ((20,0 ((20,0 (180 Ala |2,4 0 \/1,7 ::1,31 (/1,7 11,78 ((/3,0 (39, 0 Γ §2,"93....... I /1,7 ((7ο7ο ((55,5 (J.80 Ala \'λ, Λ \ [/1,7 1:1,31 (/1,7 ΙΪΙΤδ (/3,0 (39,0 : — |2,93 (/1,7 ((20,0 (75,5 (180 Gin(trt) 4,72 [/1,7 Γί 7 3 L...... (/1,7 ί| ϊ, 78....... ((/3,0 Í39, 0 :- Ε, 93....... \/1,Ί 520, 0 (55,5 180 ;Gln (trt) :4,72"" [/1,7 Οΐ...... (/1,7 /1,78....... 1/3,0 139,0 5:2, 93 (/1,7 (20,0 (55,o |Ϊ80 C. Clivagem do fragmento a partir da resina contraída

Lavou-se a resina construída de acima com DCM 7 vezes (6 volumes em cada lavagem) para remover residuo de NMP, e arrefeceu-se a resina com a última lavagem com DCM, a -5°C. Separou-se o DCM, e adicionou-se uma solução fria de TFA a 1 % em DCM (12 volumes a entre -5°C e -10°C), agitando-se durante 30 minutos a 0°C. Recolheu-se a solução 84 de clivagem num balão contendo piridina (1,3 equiv. do TFA) . Enquanto o balão aquecia até 25°C, lavou-se a resina com DCM 9 vezes (10 volumes) recolhendo os fluidos no recipiente da solução de clivagem. Misturou-se a solução em DCM com água (6 volumes). Destilou-se a mistura resultante sob pressão reduzida para se remover o DCM (350 torr a 28 °C) . O fragmento precipitou a partir de água quando se removeu o DCM. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a entre 30°C e 35°C em vazio. Para este exemplo repetiu-se o processo de clivagem mais uma vez. Obteve-se no total 6,78 g de Fmoc-(Aib35) GLP-1 (23-35)-OH (um rendimento de 68,1 %) com uma pureza de 87,3 % AN.

Exemplo 6 A. Preparação de Resina de 2CTC carregada com

Fmoc-Aib

Preparou-se resina de 2CTC carregada com Fmoc-Aib. Listam-se na tabela seguinte as quantidades de reagentes utilizadas neste exemplo: :P repa ração de Resina de sMateriais jRes i na de cloreto de iclorotritilo | Fmoc-Aib-OH |Di-isopropiletilamina

Fmoc-Aib-2-Clorotritilo |MW |Eq iiimmol Igramas 2-1- I- !59.85 140.44 1325, 5 |l, 0 |2 0, 95|6, 82 |l29,25 |0, 95 119, 88 |2,57

mL 85

Carregou-se resina de 2-CTC num reactor de síntese de péptidos com 500 mL e inchou-se com 400 mL de DCM durante 30 minutos. Retirou-se o líquido da resina, e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes de DMFrDCM (a 87,5:12,5, em volume). Agitou-se a mistura sob azoto durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

Retirou-se o líquido do leito de resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF. Em seguida, revestiram-se os locais activos remanescentes da resina de 2-CTC com 400 mL de uma solução de MeOH:DIEA (a 9:1 em volume) durante 1 hora. Voltou a coar-se o líquido que banhava a resina, que se lavou uma vez com 400 mL de DMF uma vez com 200 mL de DMF e quatro vezes com 350 mL de DCM. Lavou-se então a resina com 3X350 mL de IPA para diminuir o seu volume. Secou-se a resina a 35°C em vazio, até peso constante, para se obterem 45,32 g de resina carregada. Uma análise mostrou um factor de carga de 0,37 mmol/g. B. Síntese em Fase Sólida 86

Levou-se a cabo a síntese em fase sólida partindo de 15,0 g de resina Fmoc-Aib-2-CTC carregada a 0,37 mmol/g. Inchou-se a resina em DCM (250 mL) durante 30 minutos a 25°C. Retirou-se o DCM usado como solvente, e lavou-se a resina duas vezes com DCM (6 volumes por lavagem) e três vezes com NMP (6 volumes por lavagem).

Tratou-se então a resina duas vezes com piperidina a 20 % em volume em NMP (6 volumes por tratamento) para se removerem os grupos protectores de Fmoc. Depois do segundo tratamento com piperidina a 20 % em volume em NMP, lavou-se a resina por seis vezes com NMP (6 volumes por lavagem), até dar um resultado negativo no teste de cloranilo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesou-se o aminoácido e o β-cloro-l-hidroxibenzotriazole (6-C1-HOBT) , e dissolveram-se em 3,2 volumes de NMP (ou em DMF para Lys-34, Val-33, e Gln-23), a entre 5°C e 10 °C. Dissolveu-se TBTU em 1,6 x o volume de NMP a entre 10°C e 5°C. Misturaram-se ambas as soluções. Transferiu-se a solução resultante para um balão reaccional. Adicionou-se a solução resultante ao balão reaccional, e lavou-se o balão que a continha com 1,6 x o volume de DCM, para dentro do reactor, que em seguida se agitou com a resina durante 2 a 3 horas a entre 25°C e 27°C. Retirou-se uma amostra para se fazer o Teste de Kaiser de completude da reacção. Caso a reacção de acoplamento estivesse incompleta (Teste de 87

Kaiser positivo) ao fim de 3 horas, retirou-se o liquido do balão de reacção, e voltou a fazer-se uma reacção de acoplamento com uma solução fresca de aminoácido activado. Completada a reacção de acoplamento, retirou-se a solução de acoplamento, e lavou-se a resina com NMP 4 vezes (6 volumes em cada lavagem). Em seguida, repetiu-se a remoção do grupo Fmoc e o ciclo da reacção de acoplamento para os restantes aminoácidos do fragmento (isto é, na ordem de Lys (Boc) -^Val-*Leu^Trp (Boc) -^Ala->Ile^Phe^Glu (OtBu) -^Lys (Boc) ->A1 a->Ala->Gln (trt) ) .

Devido a um possivel efeito de justaposição entre a 2-metilalanina (Aib) e a resina de 2-CTC, é consideravelmente dificil forçar as duas primeiras reacções de acoplamento de aminoácidos (Lys(Boc)-34 e Val-33) a completarem-se. Portanto, modificaram-se as condições de acoplamento para Lys(Boc)-34, Val-33, e Gin(trt)-23 aumento as utilizações tanto do aminoácido como do 6-C1-H0BT de 1,7 Equiv. para 2,5 Equiv. e a de DIEA de 1,9 Equiv. para 3,0 Equiv. O solvente da reacção de acoplamento também foi alterado de NMP e DMF para forçar a reacção de acoplamento a completar-se. Além disto, utilizou-se anidrido acético para revestir o material por reagir ligado à resina após as reacções de acoplamento de Lys(Boc)-34 e de Val-33. Isto melhorou a eficiência da purificação subsequente porque afasta as impurezas para longe do produto pretendido, durante a purificação por cromatografia.

Todos os reagentes utilizados neste exemplo estão listados na tabela seguinte:

iReacção de acoplamento do Fmoc-AA(23-35)-OH jjMaterial jipeso i (g) / ;:Eq Í6-C1-jHOBT j (g/Eq) |diea (g/Eq) |dmf ! (mL) Inmp i (mL) ÍTBTU i(g/Eq) ÍDMF 1 (mL) iÍNMP :: (mL) ÍDCM (mL) jPerío Ide ÍAcopl : (min. jjLys (Boc) 110784' \/ 2,5 P, 93'“'“ 1/2,5 :|37 63'""" /3, 0 Ρ’ο’,’ο” ρ,’ίί....... ::/2,5 14 0, Ò" í- polo’ 117 0 IjAnidrido IjAcético j:4,72'""""' ii/5, 0 ifiTii 1./5,5 5- ίί'οο'Γο' ΙΒ'ο'Γο' 112 0 IVal 7,85 2, _ Í3,92....... 1/2,5 |13, 6 7....... ,: p'ò, 0 : - 17,4 4 [/2,5 Í4 0, 0 ? — Í4 0, 0 1177 IjAnidrido jAcético i|/10 , 0 114,4 6 : ú- :'i'o’o’,"o’ > ~ 1:50, 0 :12I0 l;Leu |5756"" |2,68 :/i,7 ::2,33....... ../1,9 : 7 8,6 P, 05 ::/1,7 :: “ pl',"3 139, 3 1184 jjTrp (Boc) - : i 2,7 0""" :/i,7 lllls'''"' 1/1,9 í- : 7 8,6 Pios....... ::/1,7....... - [39,"3 Í39,3 : 180 IjAla U, 92 1/1,7 7,68 1/1,7 IPPd....... 1/1,9 ú- 17 8, 6..... P, 05 /1,7 : ” 139,3 139, 3 :'i 77 |Ile Í5,5 6 1/1,7 i, :/1,7 12,26...... /1,9 78, 6 Í5, 06 1/1,7 :> — :39, 3 39, 3 1168....... ilPhe ii6, 10..... :| /1,7 12,70 :/1,.7....... ¢2,3 1 1/1,9 1/8, 6 P, 06 1/1.,..7....... — ..3.9,.3. .39,.3.. :168 jÍGlu (OtBu) •6,72 /1,7 12,61 |/1,7 |2,29 /1,9 :·: — '78, 6 Í5, 05 /1,7 A — 139, 3 :39,3 : 16 8 jjLys (Boc) 7,39 /1,7 ;2,70 1/1,7 52,29 /1,9 |:/8"'β"" b, 05 /1,7 :> — [39,3 P9,3 1165 jjAla 4,91 /1,7 :2,70 1/1,7 :|:2,41 /1,9 x- .78, 6 , r 1/1,7 A — 139,3 :39,3 :'l80....... IjAla U, 92 /1,7 \2,68 [/1,7....... 52,32 /1,9 ! 7 8, 6 Í5, 03 [/.1.,.7....... A — [39, 3 :39,3 :i7i jjGln (trt) >14,13 1/2,5 p, 94 1/2,5 :í 3, 71 1/3,0 :põ, õ > — :Í7,42 1/2,5 Π 4 0, 0 :· — 140, 0 1185 C. Clivagem do fragmento a partir da resina construída

Lavou-se a resina construída de acima com DCM 6 vezes (6 volumes em cada lavagem) para remover resíduo de NMP, e arrefeceu-se a resina com a última lavagem com DCM, 89 a -5°C. Separou-se o DCM, e adicionou-se uma solução fria de TFA a 1 % em DCM (10 volumes a entre -5°C e -10°C), agitando-se durante 30 minutos a 0°C. Recolheu-se a solução de clivagem num balão contendo piridina (1,3 equiv. do TFA) . Enquanto o balão aquecia até 25°C, lavou-se a resina com DCM 7 vezes (6 volumes) recolhendo os fluidos no recipiente da solução de clivagem. Misturou-se a solução em DCM com água (10 volumes). Destilou-se a mistura resultante sob pressão reduzida para se remover o DCM (350 torr a 28°C). O fragmento precipitou a partir de água quando se removeu o DCM. Lavou-se o fragmento com água e secou-se a entre 30°C e 35°C em vazio. Para este exemplo repetiu-se o processo de clivagem mais uma vez. Obteve-se no total 12,36 g de Fmoc-(Aib35) GLP-1 (23-35)-OH (um rendimento de 59,35 %) com uma pureza de 84,3 % AN.

Exemplo 7 1. Lavagem da Resina

Partindo da resina previamente carregada, Fmoc-Gly-O-2-CTC (carregada a entre 0,18 e 0,65 mmol/g) , ou da Fmoc-Aib-O-2-CTC (carregada a entre 0,25 e 0,65 mmol/g), aplicou-se a química de Fmoc habitual. Inchou-se primeiro a resina em 10 x o volume de DCM durante 30-60 minutos. Depois retirou-se o DCM e lavou-se a resina com 10 x o volume de NMP, 3-5 vezes(5 minutos de cada vez). 2. Ciclo Sintético Geral: 90

Utilizando uma resina lavada de acordo com a Secção A deste Exemplo 7, conseguiu-se a remoção do Fmoc com dois tratamentos com ~10 x solução de Piperidina a 20 % em NMP (em volume). Cada tratamento durou 15 a 30 minutos. A seguir a cada tratamento separou-se o liquido. Lavou-se então a resina com NMP, 4-5 vezes (10 x o volume, 5 minutos por lavagem).

Para se preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido (AA) protegido com Fmoc, e HOBt, (a 1,5-2,0 equiv) , dissolveram-se em 4 x o volume de NMP a 10°C, e misturaram-se com DIEA (1,5-2,0 equiv). Dissolveu-se HBTU (1,5-2,0 equiv) em 3 x o volume de NMP a 10 °C. Misturaram-se então ambas as soluções com 3 x o volume de DCM, durante 1-2 minutos. Adicionou-se a solução resultante ao balão reaccional e misturou-se com a resina, sob agitação, durante 1,5-5 horas. Retirou-se uma amostra para o teste de Kaiser, para verificar se a reacção de acoplamento se completara. Caso não se houvesse completado, levou-se a cano novo acoplamento. Completada a reacção de acoplamento, separou-se a solução de acoplamento e lavou-se a resina com NMP 5 vezes (10 x o volume, 5 minutos cada uma) . A. Seguindo um procedimento geral de sintese, construiu-se em passos o fragmento Fmoc-GLP-1 91 (11-22)-2-CTC possuidor da sequência nativa, utilizando o mesmo processo geral de sintese, acoplou-se um fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 com o fragmento resultante Fmoc-GLP-1 (11— 22)-2-CTC preparado nesta Secção A utilizando o processo geral de sintese. B. Seguindo o processo geral de sintese, construiu-se em passos o fragmento Fmoc-GLP-1 (11-22)-2-CTC. No entanto, alteraram-se as condições de remoção do Fmoc utilizando-se uma solução de 10 % de piperidina e 2 % de DBU em NMP (e volume) , em vez de 20 % de piperidina em NMP (em volume). Para além disto, os períodos de tratamento para a posição do AA14 [Fmoc-Ser(tBu)-] e para a posição do AA13 [Fmoc-Thr(tBu)-] foram aumentados para 1,5 h para se levar a reacção a completar-se. Utilizando o mesmo processo geral de síntese, acoplou-se um fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 com o Fmoc-GLP-1 (11-22)-2-CTC resultante, recorrendo ao mesmo processo geral de síntese. C. Seguindo-se o processo geral de síntese, utilizando como solução de remoção do Fmoc 10 % de piperidina e 2 % de DBU em NMP (em volume) , construiu-se por passos o Fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 (11-22)-2-CTC . Em seguida acoplou-se o fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 com o 92 fragmento resultante Fmoc-(X17 18) GLP-1 (11 — 22) — 2-CTC utilizando o processo geral de sintese. D. Seguindo-se o processo geral de sintese, construiu-se por passos o fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 (11-22)-2-CTC. Em seguida, acoplou-se o fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 com o fragmento resultante Fmoc- (X17-18) GLP-1 (11 — 22) — 2-CTC, utilizando o processo geral de sintese. E. Seguindo-se o processo geral de sintese da Secção D imediatamente acima, e excepto no que toca às diferenças resumidas na tabela seguinte, 17_ construiu-se por passos um fragmento Fmoc-(X 18) GLP-1 (11-22)-2-CTC. Em seguida, acoplou-se um fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 com o fragmento resultante Fmoc-(X17’18) GLP-1 (11-22)-2-CTC, utilizando o processo geral de sintese. A tabela que se segue resume os pormenores dos processos A a E deste Exemplo:

Ex2 . Escala ;Carga :Condições Pseudoprolina Equiv, ::Pureza Rendimento: :mmol/g de remoção:: na Posição de AA ;por ide Fmoc 17-18 HPLC A I5 g ::0,24 |2 0 % de jjpiperidina/ jÍNMP jNào pTô Π 3 0 % |42 %* j B |2Ò g |d, 30 110 % de jjpiperidina/ jNào l1'7 15 8 % |62 % j |2 % de|

ÍDBU/NMP 93 Εχ2. .Escala

Carga mmol/g; C |5 g |0, 30 D..........|" g..............|θ, 30 ;Condições sPseudoprolina sEquiv, de remoçãosna Posição de AA de Fmoc 17-18 :Ϊ0 % de|Sim §2,0 ipiperidina/ | § Í2 % de!| I ÍDBU/NMP | I 12 0 % de|Sim |2,0 ipiperidina/ | ÍNMP | 1

Pureza por HPLC fèT''”' 75 %

Rendimento 74 % 80 % Ê..........pcfg.......|Ô, 42........§20............%...........defsim.................................§2,0...........|89"%........|86 "% | | Ipiperidina/ § | | 1 1 ÍNMP I I | F. A Clivagem de Fragmentos:

Para se conseguir a clivagem de fragmentos com respeito a qualquer dos fragmentos peptídicos sintetizados neste Exemplo, incha-se a resina carregada com péptido em 10 x o volume de DCM, durante 30 minutos, e arrefece-se a -10°C. Separa-se o DCM e adiciona-se uma a solução de 1 % de TFA em DCM (10 x o volume), agitando-se durante 30 minutos. Recolhe-se a solução de clivagem num balão contendo piridina (2-3 equiv. em relação a TFA) . Enquanto aquecia até 25°C, tratou-se a resina com 1 % de TFA/DCM (10 x o volume) durante 5 minutos, e depois adicionou-se piridina (2-3 equiv. do TFA) . Passados mais 5 minutos de agitação, recolhe-se a solução. Lava-se então a resina com 10 x o volume DCM durante 4 (5 minutos cada). Misturam-se as soluções de todas as lavagens e da clivagem e mistura-se com água (razão de água/DCM = ~l/4 em volume) . Destila-se a mistura resultante sob pressão reduzida para se remover o 94 DCM (350 torr/28°C). O fragmento peptídico precipita da água quando se remove o DCM, e separa-se por filtração. Lava-se o fragmento peptidico com água e seca-se a 30°C em vazio.

Exemplo 8 - Síntese em Solução: Adição de Arg

Dissolveu-se um fragmento (Aib35) GLP-1 (23-35) (com protecção das cadeias laterais de acordo com a Tabela A, e com protecção do Fmoc no terminal N (9,11 g, 3,94 mmol) , em DMSO (90 mL) . Adicionam-se a esta solução HOBt (2,42 g, 4 equiv.), HBTU (5,98 g, 4 equiv.), DIEA (3,44 mL, 5 equiv.), e Η-Arg (2HC1)-NH2 (3,88 g, 4 equiv.), em conjunto com 10 mL de DMSO. Agitou-se a mistura reaccional que se monitorizou por HPLC. Passadas 4 horas, a reacção não se tinha completado, por isso adicionou-se 2 mL de DIEA. A reacção completou-se de um dia para o outro. Depois adicionou-se piperidina (5 mL) à mistura reaccional. A remoção do Fmoc levou 2 horas. Terminou-se a reacção adicionando água gelada à mistura reaccional (800 mL) e agitou-se durante 40 minutos. Separou-se por filtração o sólido branco que se formou, lavou-se com água (400 mL) e secou-se de um dia para o outro para se obter o fragmento (9,65 g, rendimento em peso 109 %) (Aib35) GLP-1 (23-36).

Exemplo 9

Dissolveu-se o fragmento (Aib8, X17 18) GLP-1 (7- 22) (7,73 g, 2,88 mmol) com grupos protectores da cadeia 95 lateral de acordo com a Tabela A e protecção do Fmoc do terminal N, em DMSO (65 mL).

Adicionaram-se a esta solução HOBt (0,73 g, 4,77 mmol), HBTU (1,46 g, 3,85 mmol), DIEA (0,71 mL, 7,40 mmol), e o Fragmento (Aib35) GLP-1 (23-36) (8,5 g, 3m45 mmol), em conjunto com 20 mL de DMSO. Agitou-se a reacção e monitorizou-se por HPLC. Ao fim de 3 horas o acoplamento tinha-se completado. Em seguida adicionou-se piperidina (5 mL) à mistura reaccional. A remoção do Fmoc levou 2 horas. Terminou-se a reacção adicionando água gelada à mistura reaccional (800 mL) e agitou-se durante 30 minutos. Separou-se por filtração o sólido branco gue se formou, lavou-se com água (400 mL) e secou-se de um dia para o outro para se obter o péptido protegido (Aib , X , Arb ) GLP-1 (7-36).

Exemplo 10 - Desprotecção Global

Tratou-se um péptido preparado de acordo com o Exemplo 9 (16,24 g) com uma solução de TFA/DTT/Água (100 mL/5 g/2,0 mL) durante 2 horas, e verteu-se a solução resultante sobre MTBE (800 mL) num banho de gelo. Passados 30 minutos sob agitação, separou-se o sólido branco que se formou, lavou-se com MTBE (400 mL) e secou-se para se obter o produto peptidico em bruto (16,0 g, rendimento em peso 138 %) . O péptido desprotegido resultante é doravante referido como péptido 'em bruto'. 96

Exemplo 11 - Purificação

Leva-se a cabo a purificação do péptido em bruto sobre uma coluna Kromasil® C4, de 10 micron, com 2,0 x 25 cm, obtendo-se péptido purificado com uma pureza de 98+ % e um rendimento de ~60 % contido/ contido. A purificação envolve uma primeira passagem por uma coluna cromatográfica a pH 2, seguida por uma segunda passagem a pH 9. Depois desta purificação, o péptido purificado ainda pode ser mais manipulado ou processado de diversas maneiras. A titulo de exemplo, pode liofilizar-se o material purificado obtido da segunda passagem, ou pode fazer-se passar através de uma coluna de concentração, isolando-se por precipitação. Ambos os métodos de isolamento permitirão obter o mesmo péptido pretendido (acetato). A titulo de visão geral do processo com duas passagens, dissolve-se o péptido em bruto a 5 mg/mL (base contida) numa mistura de 10 % de acetonitrilo / água (com ácido acético 0,2 M) . Fazem-se réplicas de injecções de 1.000 mg (base contida) utilizando um gradiente de acetonitrilo / THF / água /TFA, e juntam-se as fracções com pureza de ~95 %. Também se juntam as componentes de uma 97 "fracção de reciclagem", a uma pureza de ~70 % e representando ~34 % do total recuperado. Volta a injectar- se a fracção de reciclagem utilizando o mesmo gradiente de acetonitrilo / THF / água / TFA, e mistura-se a mistura a uma pureza de ~85 % que se obtém com a o material purificado obtido. 0 rendimento contido em contido para a Ia passagem da purificação cromatográfica é de 70 %. A mistura resultante da primeira passagem (pH 2) é em seguida mais purificada numa 2 a passagem na mesma coluna Kromasil®C4, mas utilizando um gradiente de acetonitrilo / THF / água / acetato de amónio (pH 8,8). Misturam-se as fracções obtendo-se uma pureza de 98+ % e uma recuperação de ~85 % na segunda passagem. O rendimento global para ambos os passos de purificação será de 60 % (contido /contido). A mistura resultante da 2a passagem (pH 8,8) foi então concentrada utilizando a mesma coluna Kromasil®C4 mas usando um gradiente em degraus de metanol / água / acetato 98 de amónio. Combinam-se as fracções que estão prontas para o isolamento. A. Preparação de solução do péptido em bruto:

Dissolveram-se 8 g de péptido em bruto em 500 mL de uma solução de 90 % de ácido acético 0,2 N e 10 % de acetonitrilo. Filtrou-se a solução, uma vez através de um filtro Durapore de 0,45 micron (com diâmetro de 47 mm) (Millipore) e outra vez através de um filtro Supor EKV de empilhamento de discos micron (0,65 / diâmetro de 0,2 mm) (Pall Filters). A solução de injecção em bruto foi analisada por HPLC e verificou-se que continha 5,02 mg (% em peso) de péptido contido por mL. (500 mL x 5,02 mg/mL = 2.512 mg de péptido contido). B. Cromatografia- lâ passagem a pH ~2:

Fizeram-se quatro réplicas de injecções com a solução em bruto, nas seguintes condições:

Coluna: Manufacturada pela Kromasil com um empacotamento C4, 10 micron e as dimensões de 2,0 x 25 cm

Detector: Detector no ultravioleta ajustado para 280 nm (largura de banda de 8 nm, 350/20 nm ref a) 99

Temperatura da Coluna: ambiente

Caudal: 13,0 mL/minuto (contrapressão de ~50 bar)

Fase móvel: A = mistura de 0,1 % de ácido trifluoroacético, 15 % de acetonitrilo e 85 % de água B = mistura de 0,1 % de ácido trifluoroacético, 15 % de tetrahidrofurano, 70 % de acetonitrilo e 15 % de água

Gradiente: O gradiente inicia-se com uma fase móvel de 100 % de A que dura 0,1 minuto.

Carrega-se então manualmente a amostra na coluna usando a bomba C (veja-se adiante uma descrição da bomba C) . Depois de ter sido carregada a amostra, corre-se um gradiente linear de 100 % de A até 83 % de A ao longo de 1 minuto. Mantém-se então a fase móvel a 83 % de A durante os 11 minutos seguintes. Corre-se então um segundo gradiente linear até 73 % de A ao longo de 10 minutos. Mantém-se a fase móvel a 73 % de A durante os 15 minutos seguintes. Terminou neste momento a eluição, e corre-se 10 0% de B durante 10 minutos para lavar a coluna, e em seguida 100 esta volta a ser equilibrada correndo 1000 % de A durante 20 minutos.

Carregou-se a amostra utilizando uma bomba isocrática HP 1100 em separado, a 9,0 mL/minuto (bomba - C) . As impurezas que eluem antes são separadas do pico principal pela manutenção do caudal isocrático de 83 % de A durante 11 minutos, seguindo-se um gradiente linear até 73 % de A ao longo dos 10 minutos seguintes. Elui então o pico principal de péptido durante os 15 minutos em que se mantém 73 % de A. Recolhem-se as fracções durante esta manutenção a 73 % de A durante 15 minutos. C. Ia Passagem a pH ~2 do Reciclável:

Obtém-se a mistura destinada a reciclagem a partir das fracções cuja pureza é determinada como sendo inferior à que permite a sua inclusão na mistura de amostras de produto. Combinam-se portanto estas fracções em separado e diluem-se com igual volume de água. Faz-se uma injecção de reciclável na coluna, desta mistura a partir desta outra mistura armazenada separadamente. Utilizam-se as mesmas condições cromatográficas e combinam-se as fracções com pureza aceitável, dilui-se com igual volume de água, e adicionam-se à mistura de amostras da Ia passagem. 101 A quantidade a tratar por injecção do reciclável é significativamente menor do que aquando da injecção do péptido em bruto, devido ao aumento das impurezas que eluem perto do pico do péptido. Em média utiliza-se 1 injecção de reciclável por cada 2 injecções de produto em bruto.

D. 2â Passagem Cromatográfica Preparativa a pH 8.8:

Voltou a purificar-se por cromatografia a mistura final das fase da Ia passagem, a pH 8,8. A utilização do pH 8.8 para a 2a passagem altera significativamente a ordem de eluição das impurezas, permitindo uma melhor limpeza enquanto se obtém alto rendimento de recuperação. As condições para este 2° passo cromatográfico são tal como se segue:

Coluna: Manufacturada pela Kromasil com empacotamento C4, 10 micron e as dimensões de 2,0 x 25 cm

Detector: Detector no ultravioleta ajustado para 280 nm (largura de banda 8 nm, 350/20 nm refa)

Temperatura da Coluna: ambiente

Caudal: 13,0 mL/minuto (contrapressão de ~50 bar) 102

Fase móvel: A = mistura de 15 % de acetonitrilo / 85 % de água contendo 2 gramas por litro de acetato de amónio e 1 mL por litro de hidróxido de amónio concentrado B = mistura de 15 % de tetrahidrofurano / 60 % de acetonitrilo / 25 % de água contendo 2 gramas por litro de acetato de amónio e 1 mL por litro de hidróxido de amónio concentrado.

Gradiente: O gradiente inicia-se com uma fase móvel de 100 % de A que se mantém durante 0,1 minuto. Carrega-se então manualmente a amostra na coluna recorrendo à bomba C. Depois de carregada a amostra, corre-se um gradiente linear de 100 % de A a 67 % de A ao longo de 2 minutos. Mantém-se então a fase móvel a 67 % de A durante os 33 minutos que se seguem. Terminou deste modo a eluição e segue-se uma lavagem durante 5 minutos com 100 % de B, e em seguida 15 minutos com 100 % de A para voltar a equilibrar a coluna.

Carregou-se a amostra utilizando uma bomba isocrática em separado, HP 1100, a 9,0 mL/minuto (bomba - C) . Depois do passo de 30 minutos de carga, corre-se um gradiente curto de 100 % de A 103 a 67 % de A durante entre 30,2 e 32 minutos. O principal pico de péptido eluiu durante um periodo de 33 minute em que se manteve 67 % de A. Recolhem-se as fracções a partir dos 20 minutos a seguir à carga da coluna e terminam-se depois de o pico principal haver completado a sua eluição. Recolhem-se as fracções durante cerca de 15 minutos. Misturam-se as fracções aceitáveis e dilui-se com igual volume de água. É possível fazer uma reciclagem nesta altura da purificação, mas as fracções não seleccionadas não contêm em geral quantidade suficiente de péptido para que valha a pena fazer uma injecção de reciclagem. Isto pode tornar-se exequível caso se faça um grande número de injecções e se juntem as fracções rejeitadas para as reciclar. E. Cromatografia para Concentração:

Juntam-se todas as fracções provenientes da 2a passagem que se carregam na mesma coluna eluindo-se rapidamente com uma fase móvel diferente para se concentrar o péptido para isolamento. As condições utilizadas neste passo são as seguintes:

Coluna: Manufacturada pela Kromasil com um empacotamento C4, 10 mícron e as dimensões de 2,0x25 cm 104

Detector: Detector no ultravioleta ajustado para 280 nm (largura de banda 8 nm, 350/20 nm refa)

Temperatura da Coluna: ambiente

Caudal: 13,0 mL/minuto (contrapressão ~50 bar)

Fase móvel: A = mistura de 10 % de metanol / 90 % de

acetato de amónio 20 mM B = mistura de 90 % de metanol / 10 % de

acetato de amónio 20 mM

Gradiente: O gradiente inicia-se com uma fase móvel de 100 % de A que se mantém 0,1 minuto. Carrega-se então manualmente a amostra sobre a coluna com a bomba C. Depois de se carregar a

amostra, mantém-se a fase móvel a 100 % de A durante 5 minutos. Altera-se então imediatamente a fase móvel em degrau para 100 % de B durante os 20 minutos seguintes. Completou-se então a eluição e seguem-se 15 minutos de eluição com 100 % de A para voltar a equilibrar a coluna. 105

Carregou-se a amostra utilizando uma bomba isocrática HP 1100 em separado, a 9,0 mL/minuto (bomba - C) . Depois do passo de 45 minutos de carga, mantém-se 100 % de A durante um período curto de 5 minutos e depois faz-se um gradiente em degrau para 100 % de B, que corre durante 2 0 minutos para aluir o péptido. 0 pico principal começa a eluir 2 minutos após o gradiente em degrau para 100 % de B. As fracções recolhidas durante os 12 minutos seguintes continham péptido e juntaram-se para o seu isolamento.

Exemplo 12 - Liofilização

Tarou-se um balão em FLPE de 1 litro com gargalo largo. Adicionou-se a este balão a mistura das amostras purificadas (210 mL) de acetato de (Aib8, X17-18, Aib35) GLP-1 (7-36) em acetonitrilo aquoso/acetato de amónio. Lavou-se o conteúdo do balão de proveniência com água desionizada, 3 x 5 mL, adicionando-se as lavagens à mistura. Agitou-se o balão contendo esta solução para se homogeneizar e depois tapou-se e congelou-se colocando-o em azoto liquido. Destapa-se o balão congelado e tapou-se o gargalo com um Kimwipe dobrado, mantido no lugar com um elástico em borracha. Colocou-se o balão dentro de um contentor para vácuo no liofilizador, e liofilizou-se. Temperatura do condensador -89°C, pressão 19 micron. 106

Passadas 24 h, abriu-se o contentor da vácuo para se monitorizar o progresso, mas ainda continha uma pedra de gelo audivel. Recomeçou-se a liofilização.

Passadas mais 18 h removeu-se o balão do liofilizador e controlou-se o seu peso. O peso era instável, aumentando rapidamente devido à natureza higroscópica do produto. Transferiu-se rapidamente o produto que colava para um tubo de cintilação e pesou-se, obtendo-se 0,822 g de péptido.

Exemplo 13: Precipitação de um péptido purificado

Num balão, diluiu-se uma solução de 100,5 mg de acetato de (Aib8, X17-18, Aib35) GLP-1 (7-36) puro em 2 mL de acetato de amónio 20 mM em MeOH/água (a 9:1 em volume) com 1 mL de acetato de amónio 20 mM em MeOH/água (a 9:1 em volume). Sob agitação, adicionaram-se-lhe lentamente 20 mL Isopropanol (IPA) a entre 20°C e 25°C. A mistura começou a turvar quando se atingiram 15 mL de IPA. Continuou a agitar-se de um dia para o outro a entre 20°C e 25°C. Separou-se o produto precipitado por filtração e lavou-se com 5 mL de IPA, secando-se depois a 25°C em vazio até peso constante. Obtiveram-se 90,9 mg de péptido (uma recuperação de 90,42 %).

Exemplo 14: Isolamento de um péptido purificado 107

Num balão, diluiu-se uma solução de 497,7 mg de acetato de (Aib8, X17'18, Aib35) GLP-1 (7-36) em 10 mL de acetato de amónio 20 mM em MeOH/água (a 9:1 em volume) com 6 mL de acetato de amónio 20 mM em MeOH/água (a 9:1 em volume). Sob agitação, adicionaram-se lentamente ao balão 40 mL de isopropanol (IPA) e entre 20°C e 25°C, ao longo de 35 minutos. A mistura dentro do balão começou a turvar assim que se haviam adicionado 2 mL de IPA. Continuou a agitar-se durante mais uma hora a entre 20°C e 25°C. Separou-se o produto precipitado por filtração e lavou-se com 5 mL de IPA, secando-se em seguida a 25°C em vazio, até peso constante. Obtiveram-se 458,4 mg de péptido (uma recuperação de 92 %).

Exemplo 15: Isolamento de um péptido purificado

Num balão, adicionaram-se lentamente 900 mL de IPA a uma solução agitada de ~ 1.000 mg de acetato de (Aib8, X17”18, Aib35) GLP-1 (7-36) purificado em 150 mL de acetato de amónio 20 mM em MeOH/água (a 9:1), através de uma coluna de concentração, a entre 20°C e 25°C. Esta adição completou-se ao longo de 45 minutos. A mistura dentro do balão começou a turvar depois de se haverem adicionado 260 mL de IPA. Continuou a agitar-se durante mais 40 minutos a entre 20°C e 25°C. Separou-se o produto precipitado por filtração e lavou-se com 5 mL de IPA, e depois secou-se a entre 20°C e 25°C em vazio, até peso constante. Obtiveram-se 746 mg de péptido (uma recuperação de 74,6 %) . 108

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Robert S, Christopher R

UTILIZANDO EM FASE DE

<12 0> SÍNTESE DE PÉPTIDOS INSULINOTRÓPICOS COMBINAÇÕES DE TÉCNICAS EM FASE SÓLIDA E SOLUÇÃO <130> Caso 23831 <150> US 60/815.919 <151> 2006-06-23 <160> 13 <170> Patente Na Versão 3.4

<210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 109 H s Asp <3 u Phe Gu Arg Hs Ala Gu Gy Thr Phe Thr Ser Asp Vai 1 5 10 15

Ser Ser Tyr Leu QuQyGnAlaAla Lys G u Phe lie AI a Trp Leu 20 25 30

Vai Lys G y Arg G y 35

<210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Hs Ala Gu Gy Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu G u G y 15 10 15 G n AI a AI a Lys G u Phe 11 e AI a Trp Leu Vai Lys G y Arg Gy 20 25 30

<210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Hs Ala Gu Gy Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu G u G y 15 10 15 G π AI a AI a Lys G u Phe 11 e AI a Trp Leu Vai Lys G y Arg 20 25 30

<210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial 110 <22 0> <223> Fragmento peptídico sintetizado quimicamente <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (2) . . (2) <223> Xaa é Aib <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (29) . . (29) <223> Xaa é Aib <400> 4 H s Xaa Q u Q y 1

Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser 5 10

Ser Tyr Leu G u 0 y 15 0 n AI a AI a Lys 20 G u Phe 11 e AI a Trp Leu Vai 25

Lys Xaa Arg 30

<210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptidico sintetizado quimicamente 111 <22 0> <221> CARACTERÍSTICA Μ SC <222> (2) . . (2) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <220> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (4) . . (4) <223> Xaa é um aminoácido quiral <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (29)..(29) aminoácido aquiral <223> Xaa é um aminoácido aquiral <400> 5

Hi s Xaa Q u Xaa Thr Pha Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu G u G y 15 10 15 G n AI a AI a Lys G u Phe lie AI a Trp Leu Vai Lys Xaa Arg 20 25 30

<210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 112 <223> Fragmento peptídico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (2) . . (2) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <220> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (4) . . (4) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <400> 6

His Xaa Glu Xaa 1

<210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptidico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (2) . . (2) <223> Xaa é Aib 113 <4Ο0> 7

His Xaa Glu Gly 1

<210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptidico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (7) . . (7) <223> Xaa é um aminoácido de um dipéptido pseudoprolina (residuos 7-8) <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (8) . . (8) <223> Xaa é um aminoácido de um dipéptido pseudoprolina (residuos 7-8) <400> 8

Thr Phe Thr Ser Asp Vai Xaa Xaa Tyr Leu G u G y 1 5 10 <210> 9 114

<211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptidico sintetizado artificialmente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (13)..(13) <223> Xaa é um aminoácido quiral <400> 9 Q n AI a AI a Lys Q u Phe lia AI a Tr p Leu Vai Lys Xaa 15 10

<210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptidico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (13)..(13) <223> Xaa é Aib 115 <4 Ο 0> 10 Q η AI a AI a Lys Q u Phe 11 θ AI a Trp Leu Vai Lys Xaa 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptídico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (2) . . (2) <223> Xaa é um aminoácido quiral <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (4)..(4) aminoácido aquiral <223> Xaa é um aminoácido aquiral <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (11).. (11) <223> Xaa é um aminoácido de um dipéptido de pseudoprolina (resíduos 11-12) 116 <22 0> <221> CARACTERÍSTICA Μ SC <222> (12)..(12) <223> Xaa é um aminoácido de um dipéptido de pseudoprolina (resíduos 11-12) <4 0 0> 11 H s Xaa Q u Xaa Thr Pha Thr Ser Asp Vai Xaa Xaa Tyr Leu G u G y 1 5 10 15

<210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptídico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (13)..(13) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <4 0 0> 12 G n AI a AI a Lys G u Pha lie AI a Trp Lau Vai Lys Xaa Arg 1 5 10 117 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Fragmento peptídico sintetizado quimicamente <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (2).. (2) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (4) . . (4) <223> Xaa é um aminoácido aquiral <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (11).. (11) <223> Xaa é um aminoácido de um dipéptido de pseudoprolina (resíduos 11-12 <22 0> <221> CARACTERÍSTICA M SC <222> (12) . . (12) <223> Xaa é u, aminoácido de um dipéptido de pseudoprolina (resíduos 11-12) 118 <22 0> <221> CARACTERÍSTICA Μ SC <222> (29) . . (29) <223> Xaa é um aminoácido quiral <4 0 0> 13 H s Xaa Q u Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Vai Xaa Xaa Tyr Leu 3u Qy 15 10 15 Q n AI a AI a Lys Q u Phe lie AI a Trp Leu Vai Lys Xaa Arg 20 25 30

Lisboa, 2 de Junho de 2010.

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de fabricar um péptido insulinotrópico, que inclua is passos a) a f) seguintes: a) se proporcionar um primeiro fragmento peptidico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 e X10 sejam ambos residuos de aminoácido quiral, ambos os H e E incluindo opcionalmente nos residuos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; b) se proporcionar um segundo fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resíduo denotado pelo símbolo X17-18 seja um resíduo de dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; c) se acoplar o primeiro fragmento com o segundo fragmento para se obter um terceiro fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 11), que inclui opcionalmente nos resíduos de aminoácidos 2 referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; d) se proporcionar um quarto fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um residuo de um aminoácido aquiral, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e) se acoplar o quarto fragmento peptidico com arginina para se obter um quinto fragmento peptidico que inclua a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e f) se acoplar o quinto fragmento com o terceiro fragmento para se obter um péptido insulinotrópico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17'18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 13), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, incluindo um passo adicional em que: 3 g) se removem os grupos protectores da cadeia lateral para se obter um péptido insulinotrópico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ id no. 5) e os seus equivalentes, em que todos os simbolos X nas posições 8, 10, e 35 denotam independentemente um resíduo de aminoácido quiral, opcionalmente impedido do ponto de vista estereoquímico.

3. Um método para fabricar um péptido insulinotrópico de acordo com a reivindicação 1, que inclua os passos seguintes: a) se proporcionar um primeiro fragmento peptídico que inclua a sequência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), na qual X8 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a Aib e X seja um resíduo de aminoácido correspondendo a glicina, e tanto H como E incluam opcionalmente a protecção das suas cadeias laterais; b) se proporcionar um segundo fragmento peptídico incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resíduo denotado pelo símbolo X17’18 seja um resíduo de dipéptido de uma pseudoprolina, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos 4 referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; c) se acoplar o primeiro fragmento com o segundo fragmento para se obter um terceiro fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG (SEQ ID NO. 11), que inclui opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; d) se proporcionar um quarto fragmento peptidico incluindo a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), na qual X35 seja um residue de um aminoácido aquiral, incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e) se acoplar o quarto fragmento peptidico com arginina para se obter um quinto fragmento peptidico que inclua a sequência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), incluindo opcionalmente nos resíduos de aminoácidos referidos na sequência a protecção das suas cadeias laterais; e f) se acoplar o quinto fragmentoo com o terceiro fragmento para se obter um péptido 5 insulinotrópico com a fórmula (SEQ. ID No. 5) HX1 2EX3TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R, e os seus equivalentes, em que X1 e X35 sejam resíduos de aminoácidos correspondendo a Aib e X3 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a glicina. 4. 0 método de acordo com as reivindicações 1 ou 3, no qual X1 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a metilalanina. 5. 0 método de acordo com as reivindicações 1 ou 3, no qual X3 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a glicina.

6. Um fragmento peptídico com a sequência de aminoácidos HX1EX3 (SEQ ID NO. 6), na qual X1 e X3 sejam ambos resíduos de um aminoácido quiral, e Η, E, X1 e X3 incluam opcionalmente protecção das cadeias laterais. 7. 0 fragmento peptídico da reivindicação 6, no qual X1 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a Aib e X3 seja um resíduo de aminoácido correspondendo a glicina. 1 0 método de acordo com a reivindicação 1, no 2 qual o péptido insulinotrópico inclua a sequência de 3 aminoácidos (SEQ. ID No. 5) HX1EX3TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R e seus equivalentes, e que os diversos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 denote 6 independentemente um resíduo de aminoácido aquiral, opcionalmente com impedimento estereoquímico; e em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclua opcionalmente protecção das cadeias laterais. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, no qual pelo menos um de entre X8 e X35 seja um resíduo de Aib.

10. O método de acordo com a reivindicação 8, no qual X10 seja um resíduo de glicina.

11. O método de acordo com a reivindicação 1, em que X17 18 tenha a fórmula r /K-<? ±φ~Ηγ cr J na qual Φ represente o resíduo de qualquer aminoácido que inclua opcionalmente protecção das cadeias laterais, e ambos os R1 e R2 sejam independentemente espécies divalentes de ligação.

12. O método de acordo com a reivindicação 11, no qual Φ represente um resíduo de Ser incluindo opcionalmente protecção da cadeia lateral.

13. O método de acordo com a reivindicação 11 7 em que R2 sela -CH2-. 14. 0 método de acordo com a reivindicação 11, em que R1 seja R3-

em que tanto R3 como R4 sejam independentemente espécies monovalentes seleccionadas de entre H ou alquilo inferior; ou R3 e R4 ambos participem como membros numa estrutura anelar. 15. 0 método de acordo com a reivindicação 14, no qual tanto R3 como R4 sejam metilo.

16. Um péptido ou um seu equivalente, incluindo a sequência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ. ID NO. 8), no qual o residuo denotado pelo simbolo X17-18 seja um dipéptido, residuo de uma pseudoprolina; incluindo o residuo de aminoácidos referido opcionalmente uma protecção das cadeias laterais. 17. 0 método de acordo com a reivindicação 1, no qual X35 seja um residuo de aminoácido de metilalanina. 18. to 2, no qual aminoácidos 0 método de acordo com as reivindicações 1 o péptido insulinotrópico tenha sequência de (SEQ. ID No . 4) 8 HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR e os seus equivalentes. 19. 0 método de acordo com a reivindicação 18, no qual o péptido insulinotrópico tenha a sequência de aminoácidos (SEQ. ID No. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR e os seus equivalentes, que seja amidada no terminal C. Lisboa, 2 de Junho de 2010.