MX2008015935A - Sintesis de un peptido insulinotropico. - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada la preparación de péptidos insulinotrópicos que se sintetizan utilizando un método en fase sólida y en solución ("híbrida"). En general, el método incluye la síntesis de tres fragmentos de péptido intermediarios diferentes utilizando la química de fase sólida. Entonces se utiliza la química de fase en solución para añadir material de aminoácidos adicional a uno de los fragmentos. Entonces se acoplan los fragmentos en la fase en solución sólida. La utilización de una pseudoprolina en uno de los fragmentos facilita la síntesis en fase sólida de ese fragmento y también facilita el subsiguiente acoplamiento en fase en solución de este fragmento con otros fragmentos. La presente invención es muy útil para la formación de péptidos insulinotrópicos como el GLP-1(7-36) y sus homólogos naturales y no naturales.

Description

SINTESIS DE UN PEPTIDO INSULINOTROPICO DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención está relacionada con los métodos para la preparación de péptidos insulinotrópicos, particularmente del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y los homólogos del mismo, utilizando procesos en fase sólida y en solución. La presente invención además está relacionada con los fragmentos de péptido intermediarios que pueden utilizarse en estos métodos. Se han descrito en la bibliografía muchos métodos para la síntesis de péptidos (por ejemplo, véase la Patente Estadounidense N° 6,015.881; Mergler y otros (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler y otros (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber y otros (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; Riniker y otros (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams y otros (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; y Andersson y otros (2000) Biopolymers 55:227-250. Estos diferentes métodos de síntesis se distinguen por el estado físico de la fase en donde la síntesis tiene lugar, es decir fase líquida o fase sólida. En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés) , ¾e une un aminoácido o grupo peptídico a un soporte sólido de resina. Posteriormente, se Ref. 198594 unen sucesivos aminoácidos o grupos peptidicos al péptido unido al soporte hasta que el material peptidico de interés se ha formado. Entonces normalmente el péptido unido al soporte se escinde del soporte y se somete a un procesamiento y/o purificación posterior. En algunos casos, la síntesis en fase sólida proporciona un producto peptidico maduro; en otros casos el péptido escindido del soporte (es decir, un "fragmento de péptido intermediario") se utiliza en la preparación de un producto peptidico maduro más grande. Los fragmentos de péptido intermediarios generados en los procesos de fase sólida pueden acoplarse en un proceso sintético de fase sólida o de fase líquida (referido de ahora en adelante como "síntesis en fase en solución"). La síntesis en fase en solución puede ser particularmente útil en los casos en los que la síntesis de un péptido maduro útil en fase sólida es imposible o no es práctica. Por ejemplo, en la síntesis en fase sólida, los péptidos largos, pueden adoptar eventualmente una conformación irregular mientras aún están unidos al soporte sólido, haciendo difícil la adición de aminoácidos o material peptidico a la cadena creciente. A medida que la cadena de péptido se hace más larga en el soporte de resina, la eficiencia de los pasos del proceso, como el acoplamiento y la desprotección, pueden estar comprometidos. Esto, a su vez, puede resultar en tiempos de procesamiento más largos para compensar estos problemas, además del incremento de las pérdidas de materiales de partida, como los aminoácidos activables, co-reactivos y disolventes. Estos problemas pueden aumentar a medida que la longitud del péptido aumenta. Por lo tanto, es bastante raro encontrar péptidos maduros mayores de 30 aminoácidos de longitud sintetizados en un único fragmento utilizando solamente un procedimiento de fase sólida. En lugar de esto, pueden sintetizarse fragmentos individuales de forma separada en fase sólida, y después acoplarse en fase sólida y/o en solución para conseguir el producto peptidico deseado. Este método requiere una cuidadosa selección de los fragmentos candidatos. Aunque algunos principios generales pueden servir de guia en la selección de fragmentos, a menudo son necesarias pruebas empíricas de los fragmentos candidatos. Estrategias de fragmentos que funcionan en un contexto pueden no . funcionar en otros. Aún cuando se encuentran fragmentos candidatos razonables, todavía pueden ser necesarias innovaciones del proceso para que la estrategia de síntesis para que funcione bajo condiciones razonables a nivel comercial. Por lo tanto, la síntesis de péptido utilizando esquemas híbridos es a menudo un reto, y en muchos casos es difícil predecir los problemas inherentes en un esquema de síntesis hasta que se realiza la síntesis real. En el acoplamiento en fase en solución, se acoplan dos fragmentos de péptido intermediarios, o un fragmento intermediario de péptido y un aminoácido reactivo, en un solvente apropiado, normalmente en presencia de reactivos adicionales que promueven la eficiencia y la calidad de la reacción de acoplamiento. Los fragmentos de péptido intermediarios están dispuestos de forma reactiva de forma que el extremo N-terminal de un fragmento se acopla al extremo C-terminal del otro fragmento o viceversa. Además, los grupos protectores de cadenas laterales, que están presentes durante la síntesis en fase sólida, comúnmente se retienen en los fragmentos durante la fase de acoplamiento en solución para asegurar la reactividad específica de los extremos terminales de los fragmentos. Estos grupos protectores de cadenas laterales normalmente no se eliminan hasta que se ha formado un péptido maduro. Pequeñas mejoras en uno o más pasos en el esquema sintético general pueden proporcionar una mejora significativa en la preparación del péptido maduro. Tales mejoras pueden resultar en un gran ahorro general de tiempo y reactivos, y también puede mejorar significativamente la pureza y el rendimiento del producto final. Mientras la explicación de la importancia de las mejoras en la síntesis híbrida es aplicable a cualquier tipo de péptido producido utilizando estos procedimientos, esto es de una particular importancia en el contexto de los péptidos que son terapéuticamente útiles y que están elaborados a una escala para uso médico comercial. La síntesis de fármacos biomoleculares mayores, como los péptidos terapéuticos, puede ser muy cara. Debido al costo de los reactivos, el tiempo de síntesis, muchos pasos de síntesis, además de otros factores, pequeñas mejoras en el proceso sintético de estos fármacos biomoleculares grandes pueden tener un impacto significativo en sí es económicamente factible producir este medicamento. Tales mejoras son necesarias debido a estos altos costos de producción para medicamentos biomoleculares grandes como se sostiene en el hecho de que, en muchos casos, existen pocas alternativas terapéuticas adecuadas, si las hay, para estos tipos de fármacos biomoleculares grandes. Esto está claro en el caso del péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y sus homólogos. Estos péptidos se han implicado como posibles agentes terapéuticos en el tratamiento de diabetes mellitus no insulino-dependiente de tipo 2 así como en los trastornos metabólicos relacionados, como la obesidad. Gutniak, M.K. y otros, Diabetes Care 1994:17:1039-44. López y otros han determinado que el GLP-1 nativo tiene una longitud de 37 residuos aminoacídicos . López L. C. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 80:5485-5489 (1983). Esta determinación se confirmó con el trabajo de Uttenthal, L. O. y otros, J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985). El GLP-1 nativo puede representarse mediante la anotación GLP-1 (1-37). Esta anotación indica que el péptido posee todos los aminoácidos desde el 1 (N-terminal) hasta el 37 (C-terminal) . El GLP-1 nativo posee la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID No. 1: HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG Se ha descrito que el GLP-1 nativo (1-37) es generalmente incapaz de mediar en la biosintesis de insulina, pero fragmentos biológicamente importantes de este péptido poseen propiedades insulinotrópicas . Por ejemplo, el péptido GLP-1 (7-37) nativo de 31 aminoácidos de longitud de acuerdo con la SEC ID No. 2: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG es insulinotrópico y posee los aminoácidos desde la posición 7 (N terminal) a la 37 (C terminal) del GLP-1 nativo. EL GLP-1 (7-37) posee una glicina terminal. Cuando esta glicina está ausente, el péptido resultante es aún insulinotrópicamente activo y se denomina GLP-1 (7-36) de acuerdo con la SEC ID No. 3: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR El GLP-1 (7-36) a menudo se encuentra con la arginina C-terminal en su forma amidada, y esta forma puede representarse mediante la anotación GLP-1 ( 7-36 ) -NH2. El GLP-1 (1-37) generalmente se convierte in vivo en un homólogo insulinotrópicamente activo del mismo. Por ejemplo, el GLP-1 (1-37) se convierte naturalmente en el GLP-1(7-37) in vivo. Este péptido, a su vez, puede también sufrir un procesamiento adicional mediante la eliminación proteolitica de la glicina C-terminal para producir el GLP-1(7-36), que a menudo existe en la forma amidada GLP-1 (7-36)-NH2. De acuerdo con lo anterior, los tratamientos terapéuticos pueden involucrar la administración del GLP-1 (1-37) o un homólogo del mismo, esperando que se forme un derivado insulinotrópicamente activo del mismo in vivo. Más comúnmente, no obstante, los tratamientos terapéuticos en investigación involucran la administración de los fragmentos insulinotrópicamente activos de GLP-1 en si mismos. De acuerdo con la US 6,887,849, la actividad insulinotrópica de GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36) y GLP-1 (7-36) -NH2 parece ser especifica para las células pancreáticas beta, en las que estos péptidos parecen inducir la biosintesis de insulina. Esto hace útiles a estos péptidos, y a sus homólogos farmacéuticamente aceptables, en el estudio de la patogénesis de la aparición de la diabetes mellitus en adultos, una enfermedad caracterizada por la hiperglucemia en donde la dinámica de secreción de insulina es anormal. Además, estos péptidos similares al glucagón serán útiles en la terapia y el tratamiento de esta enfermedad, y en la terapia y tratamiento de la hiperglucemia. De acuerdo con la PE 1137667B1, estos péptidos o sus homólogos farmacéuticamente aceptables también pueden ser útiles para el tratamiento de otros tipos de diabetes, obesidad, glucagonomas, trastornos de secreción de las vias respiratorias, trastornos metabólicos, artritis, osteoporosis , enfermedad del sistema nervioso central, restenosis, enfermedad neurodegenerativa, fallo renal, fallo cardíaco congestivo, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar, hipertensión y/o trastornos en los que se desea una reducción de la ingesta de comida. El GLP-1 nativo (1-37) y sus homólogos insulinotrópicamente activos nativos de acuerdo con los SEC ID No. 1 a 3 son metabólicamente inestables y poseen una vida media en plasma de sólo 1 a 2 minutos in vivo. El GLP-1 administrado de forma externa también se degrada de forma rápida. Esta inestabilidad metabólica ha limitado el potencial terapéutico del GLP-1 nativo y de los fragmentos nativos del mismo. Se han desarrollado homólogos sintéticos de los péptidos de GLP-1 con una estabilidad mejorada. Por ejemplo, el péptido de acuerdo con la SEC ID No. 4 se describe en la PE 1137667 Bl: HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR Este péptido es similar al GLP-1 nativo (7-36) , con la excepción que el residuo aquiral del ácido alfa-aminoisobutírico (mostrado de forma esquemática con la abreviatura Aib) aparece en las posiciones 8 y 35 en lugar de los aminoácidos nativos correspondientes en estas posiciones. El ácido alfa-aminoisobutirico aquiral también es conocido como metilalanina . Este péptido puede denominarse mediante la fórmula (Aib8' 35) GLP-1 ( 7-36 ) -NH2. La EP 1137667 expone que el péptido de acuerdo con la SEC ID No. 4 y sus homólogos pueden obtenerse como un único fragmento utilizando técnicas de fase sólida. El método de síntesis de fragmentos únicos sugerida en la EP 1137667 es problemática. Uno de los problemas es que este método puede llevar a altos niveles de epimerización en el acoplamiento final de aminoácidos, por ejemplo, histidina en el caso de (Aib8,35) GLP-1 (7-36) . Además las impurezas pueden ser difíciles de eliminar durante la purificación cromatográfica y el rendimiento puede tender a ser demasiado bajo. En consecuencia, son necesarias estrategias mejoradas para la síntesis de péptidos de acuerdo con la SEC ID No. 4 para poder fabricar este péptido y sus homólogos con rendimientos, purezas y cantidades comercialmente aceptables. Además de estas preocupaciones, los problemas relacionados con la recuperación del producto y la pureza del producto para la producción a gran escala de péptidos, así como la manipulación de reactivos, almacenamiento y deshecho, pueden influir enormemente en que un esquema de síntesis del péptido sea factible. Por lo tanto, existe la necesidad continua de procesos de síntesis de péptidos capaces de producir eficientemente los materiales peptídicos de interés comercial en cantidades a gran escala con rendimientos mej orados . La presente invención está relacionada con la preparación de péptidos insulinotrópicos que están sintetizados utilizando un método de fase sólida y en solución ("híbrida"). Generalmente, el método incluye la síntesis de tres fragmentos de péptido intermediarios diferentes utilizando la química de fase sólida. La química de fase en solución se utiliza entonces para añadir material de aminoácidos adicional a uno de los fragmentos. Los fragmentos se acoplan entonces en fase sólida y en solución. El uso de una pseudoprolina en uno de los fragmentos facilita la síntesis en fase sólida de este fragmento y también facilita la posterior fase de acoplamiento en solución de este fragmento a otros fragmentos. La presente invención es muy útil para obtener péptidos insulinotrópicos como el GLP-1, GLP-l(7-36) y los homólogos naturales y no naturales de estos, particularmente el GLP-l(7-36) y sus homólogos naturales y no naturales. En un aspecto, la presente invención está relacionada con un método para realizar un péptido insulinotrópico, que comprende los pasos de: a) la preparación de un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX EX (SEC ID No. 6) en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, o dicho fragmento es un homólogo del mismo que incluye los residuos X8 y X10, tanto H como E, Xs y X10 incluyen de forma opcional protección de la cadena lateral; y b) la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico . Preferiblemente, X8 es un residuo de aminoácido que corresponde a metilalanina (Aib) . X10 es preferiblemente un residuo de aminoácido que corresponde a glicina. En otro aspecto, la invención está relacionada con un fragmento peptidico que posee la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, y tanto H como E, X8 y X10 incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral. Preferiblemente, X8 es un residuo de aminoácido que corresponde a Aib y X10 es un residuo de aminoácido que corresponde a glicina. En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que comprende los pasos de: a) la preparación de un fragmento peptidico o un homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina; y b) la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico . En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un péptido o un homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17~18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17-18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina; y dichos residuos de aminoácidos incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral. En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un método para elaborar un péptido insulinotrópico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el paso de: a) el acoplamiento del primer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6) , en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral, con el segundo fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8), en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral, para proporcionar un tercer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX EX TFTSDVX YLEG (SEC ID No. 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y b) la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico . En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que comprende los pasos de: a) la preparación de un fragmento peptidico o un homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9), en donde X35 es un residuo de un aminoácido aquiral, y dichos residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y b) la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico. En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que comprende uno o más pasos de: a) proporcionar un primer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en los que X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, y tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; b) proporcionar un segundo fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; c) el acoplamiento del primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIA LVKX35 (SEC ID No. 9), en donde X35 es un residuo de un aminoácido aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; e) el acoplamiento del cuarto fragmento peptídico a una arginina para proporcionar un quinto fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y dichos residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y f) el acoplamiento del quinto fragmento al tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~ 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 13), y dichos residuos de la sepuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral. Preferiblemente, la presente invención está relacionada con el método para elaborar un péptido insulinotrópico, que comprende los pasos de: a) proporcionar un primer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en los que X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, y tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; b) proporcionar un segundo fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; c) el acoplamiento del primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~18YLEG (SEC ID No. 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; d) proporcionar un cuarto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9), en donde X35 es un residuo de un aminoácido aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; e) el acoplamiento del cuarto fragmento peptidico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y dichos residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y f) el acoplamiento del quinto fragmento al tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~ 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 13), y dichos residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral. En otro aspecto, la invención está relacionada con el método tal y como se ha descrito hasta aquí, que comprende otro paso de: g) eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEG-QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 5) y homólogos de la misma, en que cada uno de los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 independientemente denotan un residuo de aminoácido aquiral, esféricamente obstaculizado de forma opcional. La eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral se lleva a cabo preferiblemente empleando una de solución de desprotección que comprende al menos un reactivo acidolitico y al menos un neutralizador de cationes. Los reactivos acidoliticos para la desprotección global están seleccionados preferiblemente de entre el grupo que consiste en ácido trifluoroacético (TFA) , HC1, ácidos de Lewis como BF3 Et20 o Me3SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF) , bromuro de hidrógeno (HBr) , ácido trifluorometansulfónico y combinaciones de los mismos. Los neutralizadores de cationes adecuados se seleccionan preferiblemente de entre ditiotreitol (DTT) , anisol, p-cresol, etanoditiol y dimetil sulfuro. La solución de desprotección puede también incluir agua . En otro aspecto, la presente invención está relacionada con un método para elaborar un péptido insulinotrópico, que comprende los pasos de: a) proporcionar un primer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, y tanto H como E, X8 y X10 incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; b) proporcionar un segundo fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; c) el acoplamiento del primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~18YLEG (SEC ID No. 11), y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; d) proporcionar un cuarto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9), en donde X35 es un residuo de un aminoácido aquiral, y dichos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; e) el acoplamiento del cuarto fragmento peptidico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y dichos residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y f) el acoplamiento del quinto fragmento al tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico con la fórmula (SEC ID No. 5) HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKX35R y homólogos de la misma, en las que los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 denotan independientemente un residuo de aminoácido aquiral, estéricamente obstaculizado de forma opcional; y en donde uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen de forma opcional la protección de la cadena lateral . La Figura 1 es un diagrama esquemático de un esquema de síntesis de acuerdo con la presente invención. El fragmento 12 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6) . El fragmento 14 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia -de aminoácidos TnFTSD15VX17~1BYL20EG (SEC ID No. 8). El fragmento 16 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos Q23AA25KEFIA30WLVKX35 (SEC ID No. 9) . El fragmento intermediario 18 es un fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos H7X8EX10TFTSD15~VX1 _18YL20EG (SEC ID No. 11). El fragmento peptídico intermediario 20 es un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos Q23AA25KEFIA30 LVKX35R (SEC ID No. 12). El producto 11 es el péptido protegido deseado H7X8EX10TFTS-D15VX17_18YL20EG QAA25KEFIA30WLVKX35R (SEC ID No. 13) en el que las Ser-Ser de las posiciones 17 y 18 están aún en la forma de pseudoprolina protegida. El diagrama se describe en más detalle a continuación . Las modalidades de la presente invención descritas más adelante no pretenden ser exhaustivas o limitar la invención a las formas precisas descritas en la siguiente descripción detallada. En lugar de ello, las modalidades se han escogido y se describen para que otros expertos en la materia puedan apreciar y entender los principios y prácticas de la presente invención. La presente invención está dirigida a los métodos sintéticos para elaborar péptidos como el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y sus homólogos naturales y no naturales insulinotrópicamente activos, utilizando técnicas en fase sólida y/o en solución. Las moléculas peptidicas de la invención pueden estar protegidas, no protegidas o parcialmente protegidas. La protección puede incluir protección del extremo N-terminal, protección de la cadena lateral y/o protección de C-terminal. Mientras la invención está generalmente dirigida a la síntesis de estos péptidos similares al glucagón, sus homólogos, fragmentos y sus homólogos y productos de fusión y sus homólogos, los presentes ejemplos de la invención también pueden aplicarse a la síntesis de otros péptidos, particularmente a aquellos que se sintetizan utilizando una combinación de aproximaciones en fase sólida y en solución. La invención se puede aplicar también a la síntesis de fragmentos de péptido intermediarios asociados con impurezas, particularmente impurezas de piroglutamato . Las moléculas útiles de GLP-1 preferidas en la práctica de la presente invención incluyen al GLP-1 (7-36) natural y no natural, y los homólogos del mismo. Tal y como se utiliza aquí, el término "que incluye la secuencia de aminoácidos" preferiblemente significa "que posee la secuencia de aminoácidos".

Tal y como se utiliza aquí, un "homólogo" se refiere a los análogos naturales y no naturales, derivados, compuestos de fusión, sales o similares de un péptido. Tal y como se utiliza aquí, un análogo de péptido generalmente se refiere a un péptido que posee una secuencia modificada de aminoácidos con una o más sustituciones de aminoácidos, eliminaciones, inversiones y/o adiciones relacionadas con otro péptido o péptido homólogo. Las sustituciones pueden involucrar uno o más aminoácidos naturales o no naturales. Las sustituciones pueden ser preferiblemente conservadoras o altamente conservadoras. Una sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro que posee generalmente la misma carga electrónica neta y generalmente el mismo tamaño y forma. Por ejemplo, los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o alifáticas sustituidas poseen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en menos de cuatro. Poseen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramas en sus cadenas laterales difieren en no más de una o dos. Los aminoácidos con grupos fenilo o grupos fenilo sustituidos en su cadena lateral se considera que tienen el mismo tamaño y forma. A continuación se listan cinco grupos de aminoácidos. Sustituyendo un aminoácido en un compuesto con otro aminoácido del mismo grupo generalmente resulta en una sustitución conservadora.

Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteina, metionina y aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas de C1-C4 o alifáticas de C1-C4 sustituidas por hidroxilo (cadenas sencillas o mono-ramificadas) . Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas de C1-C4 sustituidas con ácido carboxilico (no ramificadas o un punto de ramificación) . Grupo III: lisina, ornitina, arginina y aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas de C1-C4 sustituidas con amina o guanidina (no ramificadas o un punto de ramificación) . Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos que no existen de forma natural con cadenas laterales alifáticas de C1-C4 sustituidas con amida (no ramificadas o un punto de ramificación) . Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y triptófano. Tal y como se utiliza aquí, el término "homólogo" más preferiblemente se refiere a las sales de los péptidos o a los derivados de los mismos que están amidados en el extremo C-terminal. Una "sustitución altamente conservadora" es la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que posee el mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o alifáticas sustituidas poseen casi el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en menos de dos. Poseen casi la misma forma cuando poseen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas laterales. Ejemplos de sustituciones altamente conservadoras incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina. Un "derivado peptidico" generalmente se refiere a un péptido, a un análogo de péptido u otro homólogo de péptido que posee una modificación química de uno o más de sus grupos laterales, átomos de carbono alfa, grupo amino terminal y/o grupo ácido carboxilo terminal. A modo de ejemplo, una modificación química incluye, pero no se limita a, la adición de porciones químicas, creación de nuevos enlaces y/o eliminación de porciones químicas. Las modificaciones en los grupos laterales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de los grupos e-amino de la lisina, N-alquilación de arginina, histidina o lisina, alquilación de los grupos ácido carboxílico del glutámico o aspártico y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación, modificaciones de des-aminación, N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior y N-acilo (por ejemplo, -C0-alquilo inferior) . Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones amida, alquilamida inferior, dialquilamida y alquiléster inferior. Los derivados preferidos son aquellos derivados que están amidados en el grupo carboxi terminal, por ejemplo, la amida, alquilamida inferior o dialquilamida del péptido. Asi, los péptidos parciales o totalmente protegidos constituyen derivados de los péptidos. En la práctica de la presente invención, un compuesto posee una actividad "insulinotrópica" si es capaz de estimular, provocar la estimulación o ayuda a provocar la estimulación de la síntesis o expresión de la hormona insulina. En las formas de práctica preferidas, la actividad insulinotrópica puede demostrarse de acuerdo con los ensayos descritos en las Patentes Estadounidenses N° 6,887,849 y 6, 703, 365. En las modalidades preferidas, la presente invención proporciona metodologías para sintetizar péptidos sintéticos (X8, X10, X35) GLP-l(7-36) que poseen la siguiente fórmula (SEC ID No. 5) : HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R y homólogos de la misma, en donde cada uno de los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 independientemente denotan un aminoácido aquiral, obstaculizado estéricamente de forma opcional. Cualquiera de los residuos X8, X10 y/o X35 puede incluir opcionalmente grupos protectores de cadenas laterales. Los péptidos de acuerdo con esta fórmula difieren del GLP-l(7-36) nativo en que al menos los residuos aquirales, obstaculizados estéricamente de forma opcional X8 y X35 están sustituidos por los residuos de aminoácidos nativos en las posiciones 8 y 35. El residuo X10 puede derivarse de la glicina aquiral nativa u otro aminoácido aquiral. El uso de los aminoácidos aquirales X8, X10, y X35 no sólo ayuda a estabilizar el péptido resultante, sino que también se acaba de descubrir que el uso de estos aminoácidos como bloques de construcción facilita la ruta de síntesis sencilla de la presente invención que se muestra en la Figura 1 y se describe en detalle más adelante. Una modalidad particularmente preferida de un péptido (X8, X10, X35) GLP-1 (7-36) que puede sintetizarse de acuerdo con los principios de la presente invención incluye un péptido de acuerdo con la fórmula (SEC ID No. 4) : HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR y homólogos de la misma, que preferiblemente están amidados en C-terminal. Este péptido utiliza el residuo aquiral del ácido alfa-aminoisobutírico (o metilalanina, mostrado de forma esquemática mediante la abreviatura Aib) como en X8 y X35, que preferiblemente poseen una amida en C- terminal, o utiliza un residuo de G nativa en la posición 10, y puede designarse mediante la fórmula (Aib8,35) GLP-1 (7-36)-NH2. Esta notación indica que un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido "Aib" aparece en las posiciones 8 y 35 en lugar de la alanina nativa. El ácido alfa-aminoisobutirico aquiral, también se conoce como metilalanina . El péptido de acuerdo con la SEC ID No. 4 se describe en la PE 1137667 Bl. La presencia de residuos de Aib en las posiciones 8 y 35 ralentiza la degradación metabólica en el cuerpo, haciendo que este péptido sea mucho más estable en el cuerpo que el péptido GLP-l(7-36) nativo. La presente invención proporciona metodologías mejoradas para obtener péptidos GLP-l(7-36) como el (Aib8,35) GLP-1 (7-36) -NH2. A modo de ejemplo, la Figura 1 muestra de forma esquemática el esquema ilustrativo 10 para sintetizar péptidos GLP-1 (7-36) y sus homólogos. El esquema 10 de la Figura 1 se cree que es particularmente adecuado para el escalado de síntesis de los péptidos GLP-1 (7-36). Los procedimientos de escalado normalmente se realizan para proporcionar una cantidad de péptido útil para su distribución comercial. Por ejemplo la cantidad de péptido en un procedimiento de escalado puede ser de 500 g o 1 kg por lote, y más normalmente de decenas a cientos de kg por lote o más. En las modalidades preferidas, los métodos de la invención pueden proporcionar mejoras como la reducción en el tiempo de procesado (síntesis) , mejoras en el rendimiento de los productos, mejoras en la pureza del producto y/o reducción en la cantidad de reactivos y materiales de partida necesarios . El esquema de síntesis 10 mostrado en la Figura 1 utiliza una combinación de técnicas en fase sólida y en solución para preparar el producto peptídico 11. Como se muestra en la Figura 1, el esquema 10 involucra la síntesis de los fragmentos intermediarios del péptido 12, 14 y 16 en la fase sólida. El fragmento 12 es un fragmento peptídico que incluye los residuos de aminoácido de acuerdo con la SEC ID No. 6: HX8EX10 en el que X8 y X10 son como se ha definido antes, o es un homólogo de la misma, lo que incluye los residuos X8 y X10. Uno o más de los residuos de aminoácidos puede incluir grupos protectores de las cadenas laterales de acuerdo con las prácticas convencionales. En algunas modalidades, el fragmento peptídico 12 puede estar enlazado a una resina a través del extremo C-terminal. Este fragmento puede llevar opcionalmente grupos protectores en N-terminal y/o C-terminal. Se ha encontrado que el Fmoc es un grupo protector de N-terminal particularmente útil en la síntesis en fase sólida del fragmento peptídico. El fragmento 12 incluye los 4 residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos en las posiciones de 7 a 10 del péptido GLP-l(7-36) nativo, y por lo tanto puede representarse mediante la notación (X , X ) GLP-1(7-10). En las modalidades preferidas, X es Aib y X es glicina, de acuerdo con la SEC ID No. 7: H7AibEG10 o es un homólogo del mismo que incluye el residuo Aib en la posición 10. El fragmento peptidico de acuerdo con la SEC ID No. 7 puede representarse mediante la notación (Aib8) GLP-1 (7-10) para indicar la sustitución de Aib por la alanina nativa en la posición 8 del GLP-1 (7-10) nativo. La síntesis en fase sólida se lleva a cabo generalmente en dirección de C-terminal a N-terminal del fragmento 12. Así, el aminoácido X10, que está presente en la porción C-terminal del fragmento, es el primer residuo de aminoácido que está acoplado al soporte de resina en fase sólida. La síntesis en fase sólida continúa entonces mediante la adición consecutiva de los residuos de aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento del péptido intermediario se completa después de que el residuo N-terminal (por ejemplo, el residuo histidina (H) N-terminal) se haya añadido a la cadena de péptido naciente . La selección y uso de un fragmento peptidico de acuerdo con los SEC ID No. 6 y 7 proporciona ventajas significativas dentro del esquema 10. Primero, la H tiende a ser un residuo de aminoácido difícil de añadir a la cadena de péptido naciente debido a, al menos en parte, problemas de epimerización . No obstante, el fragmento 12 es suficientemente pequeño para minimizar estos problemas en su mayor parte. Aún así, el fragmento 12 es suficientemente largo para tener dos centros quirales. Por lo tanto, una única cristalización permite purificar al fragmento. Si el fragmento 12 termina en Aib, el fragmento poseerá solo un centro quiral y será, en consecuencia, más difícil de purificar de forma racémica. Situando la G aquiral en posición C-terminal también evita los problemas de racemización que de otro modo serían preocupantes si el fragmento 12 acabara en C-terminal con E quiral. En resumen, la selección del fragmento 12 como un bloque de construcción del péptido hace más fácil la construcción, la purificación y el acoplamiento del fragmento a otro material peptídico. La selección de este fragmento también proporciona una baja racemización de H. Sorprendentemente, puede añadirse la H a este fragmento con un nivel muy bajo de epimerización, por ejemplo, alrededor del 3% en peso en algunas formas de la práctica . El fragmento 14 es un fragmento peptídico que incluye residuos de aminoácido de acuerdo con la SEC ID No. 8: TilFTSDibVXi _iBYL¿uEG en el que el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, definida en detalle más adelante, o es un homólogo del mismo que incluye el X17"18 en las posiciones 17 y 18. El fragmento 14 incluye los residuos de aminoácido que generalmente corresponden a los residuos de aminoácido en las posiciones 11 a 22 del péptido GLP-1 (7-36) nativo, excepto que se utiliza el residuo dipéptido de pseudoprolina X17"18 en lugar de los residuos SS (Ser-Ser) que ocupan las posiciones correspondientes 17 y 18 del GLP-1 (7-36) nativo. Uno o más de los residuos de aminoácido del fragmento 14 puede incluir grupos protectores de cadenas laterales de acuerdo con las prácticas convencionales. En algunas modalidades, el fragmento peptídico 14 puede estar unido a resina a través del extremo C-terminal. Este fragmento puede llevar opcionalmente grupos protectores en N-terminal y/o C-terminal. Se ha encontrado que Fmoc es un grupo protector de N-terminal particularmente útil para la síntesis en fase sólida del fragmento peptídico. El fragmento peptídico de acuerdo con la SEC ID No. 8 puede estar referido mediante la notación (X17-18) GLP-1 (11-22) para indicar la sustitución por los residuos de pseudoprolina X17-18 de los residuos Ser-Ser en las posiciones 17 y 18. Como se utiliza en la práctica de la presente invención, el término pseudoprolina se refiere a un dipéptido que incluye un residuo de un aminoácido con función hidroxilo como la Ser o Thr en las que la cadena lateral con la función hidroxilo está protegida con un anillo oxazolidina, lábil a TFA, similar a prolina entre el amino alfa y la cadena lateral hidroxilo. Como consecuencia del anillo oxazolidina, el dipéptido funciona como un mimético de prolina reversible. Generalmente, un residuo típico de pseudoprolina tal como se incorpora en un péptido puede representarse mediante la fórmula en donde F representa un residuo de cualquier aminoácido y tanto R1 como R2 son independientemente una porción de unión divalente adecuada. A menudo, R1 es una porción divalente de fórmula en donde tanto R3 y R4 es independientemente una porción monovalente como H, o un alquilo inferior como metilo. R3 y R4 también pueden ser co-miembros de una estructura en anillo. Es deseable que tanto R3 como R4 sea metilo. En el caso de una Ser protegida por un anillo oxa zol idinina , R2 es la porción divalente CH2, mientras que en el caso de la Thr, R2 es la porción divalente (CH3)CH. El término "alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo monovalente de cadena lineal o ramificada de uno a seis átomos de carbono, preferiblemente de uno a cuatro átomos de carbono. Este término se ejemplifica además mediante radicales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 2-etilbutilo y similares. Los residuos de alquilo inferior preferibles son metilo y etilo, siendo metilo especialmente preferido. Durante la desprotección, la porción R1 se escinde para proporcionar un residuo dipeptidico de acuerdo con la siguiente fórmula: en donde F y R2 son como se ha definido anteriormente. Aplicado al fragmento 14, el residuo de pseudoprolina preferiblemente corresponde a un residuo Ser-Ser en el que la Ser que es más proximal a C-terminal está protegida con el anillo oxazolidina y posee la siguiente estructura : La cadena lateral con un hidroxilo de la Ser más cercana a N-terminal está protegida, por ejemplo mediante el grupo de protección t-Bu. Cuando se rompe la estructura del anillo oxazolidina y t-Bu protectora, aparece el residuo SerSer. La utilización de este mimético de prolina como un bloque de construcción en la síntesis del fragmento 14 proporciona ventajas significativas en el contexto de la presente invención. Primero, la síntesis en fase sólida del fragmento 14 se facilita enormemente. Cuando la pseudoprolina no se utiliza durante el curso de la síntesis en fase sólida del fragmento 14, puede haber problemas significativos con las eliminaciones de Fmoc de los residuos 13 al 11. Se cree que esta dificultad puede ser debida a la formación de láminas beta. El uso de la pseudoprolina hace que estas eliminaciones de Fmoc sean más fáciles, se cree que mediante la reducción del grado de formación de láminas beta. Segundo, el posterior acoplamiento en fase sólida del fragmento 14 al fragmento 12 para formar el fragmento 18, descrito más abajo, se facilita enormemente. En ausencia del residuo de pseudoprolina, la solubilidad del fragmento 18 en los solventes de acoplamiento típicos en fase en solución es muy pobre. La pseudoprolina aumenta las características de solubilidad del fragmento 18, facilitando el acoplamiento de este fragmento al fragmento 20 en fase en solución (Véase discusión de la Figura 1, a continuación) . La síntesis en fase sólida se lleva a cabo generalmente en dirección de C-terminal a N-terminal del fragmento 14. Así, el aminoácido G, que está presente en la porción C-terminal del fragmento, es el primer residuo de aminoácido que está acoplado al soporte de resina de fase sólida. La síntesis en fase sólida continúa entonces mediante la adición consecutiva de residuos de aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada. Sin embargo, se añade el dipéptido pseudoprolina X17"18 a la cadena creciente en una posición que corresponde a las posiciones 17 y 18 del GLP-1 (7-36) en lugar de añadir de forma consecutiva un par de residuos Ser nativos en estas posiciones 17 y 18. La síntesis del fragmento de péptido intermediario se completa después de que el residuo N-terminal (por ejemplo, el residuo treonina (T) N-terminal) se haya añadido a la cadena de péptido naciente . El fragmento 16 es un fragmento de péptido, u homólogo del mismo, que incluye los residuos de aminoácido de acuerdo con la SEC ID No. 9: Q"AA^KEFIAJUWLVKXJ3 en el que X35 es como se ha definido anteriormente, o es un homólogo del mismo que incluye el residuo X35. Uno o más de los residuos de aminoácido pueden incluir grupos protectores de cadenas laterales de acuerdo con las prácticas convencionales. El fragmento 16 incluye los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos en las posiciones de 23 a 35 del péptido GLP-l(7-36) nativo, excepto que en la posición 35 está el X35 en lugar del aminoácido nativo en esa posición. El fragmento 16 puede estar representado mediante la notación (X35) GLP-1 ( 23-35 ) . En algunas modalidades, el fragmento peptidico 16 puede estar unido a la resina a través del extremo C-terminal. Este fragmento puede llevar opcionalmente grupos protectores de la cadena lateral, N-terminal y/o C-terminal. Se ha encontrado que el Fmoc es un grupo protector de N-terminal particularmente útil para la síntesis en fase sólida del fragmento peptidico. En modalidades preferidas, X35 es Aib de acuerdo con la SEC ID No. 10: Q23AA25KEFIA30WLVKAib35 o un homólogo del mismo que incluye el Aib en la posición 35. El fragmento peptidico de acuerdo con la SEC ID No. 10 puede estar representado por la notación (Aib35) GLP-1(23-35) para indicar la sustitución de Aib por el aminoácido nativo en la posición 35 del GLP-l(7-36) nativo. Nótese que el fragmento 16 de acuerdo con los SEC ID No. 9 y 10 no incluye todavía el residuo R (Arg) en la posición 36 en C-terminal. La Arg se acopla posteriormente en C-terminal del fragmento 16 en la fase en solución, preferiblemente utilizando Arg sin la protección de la cadena lateral. Esta estrategia proporciona ventajas significativas dentro del esquema 10 de la Figura 1, debido a que evita reacciones adversas no deseadas que tienden a ocurrir como consecuencia de utilizar Arg protegida. Por ejemplo, tras la desprotección de la Arg protegida, los productos secundarios de la desprotección tienden a reaccionar con otros constituyentes del péptido, por ejemplo, el triptófano. Esto reduce la cantidad de péptido crudo deseado disponible para la purificación. La síntesis en fase sólida se lleva a cabo generalmente en dirección desde C-terminal a N-terminal del fragmento 16. Así, el aminoácido X35, que está presente en la porción C-terminal del fragmento, es el primer residuo de aminoácido que se acopla al soporte de resina en fase sólida. La síntesis en fase sólida continúa entonces mediante la adición consecutiva de residuos de aminoácido de la forma correspondiente a la secuencia deseada. La síntesis del fragmento de péptido intermediario se completa cuando el residuo N-terminal (por ejemplo, el residuo glutamina (Q) N- terminal) se ha añadido a la cadena naciente de péptido. Cualquiera de los aminoácidos utilizados en la síntesis del fragmento 16 puede incluir protección de la cadena lateral de acuerdo con las prácticas convencionales. Debido a la obstaculización estérica proximal en el soporte de resina cargado con X35, el acoplamiento de lisina (34) y valina (33) en la cadena de péptido creciente puede ser problemática. Aún con un exceso de aminoácido, es difícil de forzar estas reacciones de acoplamiento hasta su finalización. La elección del solvente y/o la protección del extremo puede ayudar a mitigar este problema. Se ha descrito que la naturaleza del solvente de acoplamiento puede impactar en el grado en el que finaliza el acoplamiento. En un grupo de experimentos, por ejemplo, las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo con NMP/ DCM 3:1, NMP/ DC 1:1, DMF/ DCM 1:1 y DMF/ DCM 3:1. Las proporciones en estas combinaciones de solventes se realizaron en base a su volumen. NMP se refiere a N-metilpirrolidona , DCM se refiere a diclorometano y DMF se refiere a dimetilformamida . Se encontró que las reacciones de acoplamiento continúan más allá en su finalización cuando se utiliza DMF/DCM 1:1. También se puede utilizar la protección del extremo después de cada uno de los acoplamientos de lisina y valina para prevenir posteriores reacciones de acoplamiento del material unido a la resina que no ha reaccionado. El material protegido en el extremo se elimina más fácilmente durante la purificación si se desea. Se pueden utilizar las técnicas convencionales de protección de extremos. Continuando con la referencia a la Figura 1, los fragmentos 12, 14 y 16, junto con Arg, se ensamblan para completar el péptido 11 deseado. Para conseguir esto, el fragmento 12 se añade al fragmento 14 en esta fase sólida para producir el fragmento intermediario 18 más largo, que incorpora los residuos de aminoácido de acuerdo con la SEC ID No. 11: H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG en el que X8, X10 y X17"18 son como se ha definido anteriormente. En una modalidad preferida, X8 es Aib, X10 es la G nativa, y X17"18 es un residuo dipeptidico de pseudoprolina como se ha definido antes. Este intermediario del fragmento peptidico puede estar representado por la notación (X8, X10, X17"18) GLP-l(7-22). La Figura 1 muestra además que se añade la Arg en el extremo C-terminal del fragmento 16 en la fase en solución para proporcionar el fragmento peptidico intermediario 20 más largo, que incorpora los residuos de aminoácido de acuerdo con la SEC ID No. 12: Q23AA25KEFIA30WLVKX35R en el que X35 es como se ha definido anteriormente y es preferiblemente Aib. Preferiblemente, la Arg añadida al fragmento peptídico de esta forma no incluye la protección de la cadena lateral. Este del fragmento peptidico intermediario 20 puede estar representado por la notación (X35) GLP-1 (23-36) . Los fragmentos peptidicos 18 y 20 se acoplan entonces en la fase en solución para proporcionar el péptido protegido 11 deseado de acuerdo con la SEC ID No. 13 en el que la Ser-Ser en las posiciones 17 y 18 está todavía en forma de pseudoprolina protegida: H7X8EX10TFTSD15VX17"18YL20EG QAA25KEFIA30WLVKX35R El péptido 11 puede estar designado por la notación (X8, X10, X17"18, X35) GLP-1 (7-36) . En el caso de que el resto de aminoácidos lleven la protección de la cadena lateral, es deseable mantener esta protección a lo largo de este paso. Al llevar a cabo el esquema de reacción de la Figura 1, las síntesis en fase sólida y en solución pueden llevarse a cabo mediante métodos estándar conocidos en la industria. En las formas representativas de la práctica, los péptidos se sintetizan en fase sólida utilizando la química mediante la que los aminoácidos se añaden de C-terminal a N-terminal. Así, el aminoácido o grupo peptídico proximal a C-terminal de un fragmento particular es el primero en añadirse a la resina. Esto sucede al reaccionar la función en C-terminal del aminoácido o grupo peptídico con la función complementaria en el soporte de resina. La parte N-terminal del aminoácido o grupo peptídico está enmascarada para prevenir reacciones adversas no deseadas. Es deseable que el aminoácido o grupo peptidico también incluya protección de la cadena lateral. A continuación, se unen sucesivos aminoácidos o grupos peptidicos al material peptidico unido al soporte hasta que el péptido de interés se haya formado. La mayoría de éstos también incluyen protección de cadenas laterales de acuerdo con las prácticas convencionales. Con cada acoplamiento sucesivo, se elimina el grupo de enmascaramiento en el extremo N-terminal del material peptidico unido a la resina. Éste se hace reaccionar con el extremo C-terminal del siguiente aminoácido, cuyo extremo N-terminal está enmascarado. El producto de la síntesis en fase sólida es así un péptido unido a un soporte de resina. Puede utilizarse cualquier tipo de soporte adecuado en la práctica de la síntesis de péptidos en fase sólida. En las modalidades preferidas, el soporte comprende una resina que puede elaborarse a partir de uno o más polímeros, copolímeros o combinaciones de polímeros como poliamida, polisulfamida, polietilenos sustituidos, polietilenglicol , resinas fenólicas, polisacáridos o poliestireno . El soporte polimérico puede ser también cualquier sólido que sea suficientemente insoluble e inerte en los solventes utilizados en las síntesis de péptidos. El soporte sólido normalmente incluye una porción de unión a la que el péptido creciente se acopla durante la síntesis y que puede ser escindido bajo las condiciones deseadas de liberación del péptido del soporte. Los soportes sólidos adecuados pueden ser enlazadores que sean foto-divisibles, divisibles con TFA, divisibles con HF, divisibles con ion fluoruro, divisibles reductivamente, divisibles con Pd(0), divisibles con nucleófilos o divisibles con radicales. Las porciones de unión preferidas son divisibles bajo condiciones en las que los grupos de las cadenas laterales del péptido escindido aún estén sustancialmente protegidos en su totalidad. En un método de síntesis preferido, los fragmentos de péptido intermediarios se sintetizaron en un soporte sólido sensible al ácido que incluye grupos tritilo, y más preferiblemente en una resina que incluye grupos tritilo que tienen grupos cloro expuestos, por ejemplo una resina de cloruro de 2-clorotritilo (2-CTC) (Barios y otros (1989) Tetrahedron Letters 30 (30) : 3943-3946) . Los ejemplos también incluyen la resina de cloruro de tritilo, resina de cloruro de 4-metiltritilo, resina de cloruro de 4-metoxitritilo, resina de 4-aminobutan-l-ol 2-clorotritilo, resina de 4-aminometilbenzoil 2-clorotritilo, resina de 3-aminopropan-l-ol 2-clorotritilo, resina de ácido bromoacético 2-clorotritilo, resina de ácido cianoacético 2-clorotritilo, resina de ácido 4-cianobenzoico 2-clorotritilo, resina de glicinol 2-clorotritilo, resina de ácido propiónico 2-clorotritilo, resina de etilenglicol 2-clorotritilo, resina de N-Fmoc hidroxilamina 2-clorotritilo, resina de hidracina 2-clorotritilo . Algunos soportes sólidos preferidos incluyen el poliestireno, que puede co-polimerizarse con divinilbenceno para formar el material de soporte al que se pueden anclar los grupos reactivos. Otras resinas que se utilizan en la síntesis en fase sólida incluyen las resinas "Wang", que comprenden un copolímero de estireno y divinilbenceno con grupos de anclaje 4-hidroximetilfenil-oximetilo (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.) y las resinas de ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico (Richter y otros (1994), Tetrahedron Letters 35 (27 ): 705-4706) . Las resinas de Wang, cloruro de 2-clorotritilo y ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxi butírico pueden obtenerse de, por ejemplo, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California. Para preparar una resina para la síntesis en fase sólida, la resina puede pre-lavarse en solvente (s) adecuado (s). Por ejemplo, una resina de fase sólida como la resina 2-CTC se añade a una cámara peptídica y se pre-lava con un solvente adecuado. El solvente de prelavado puede elegirse en función del tipo de solvente (o mezcla de solventes) que se utilizan en la reacción de acoplamiento, o viceversa. Los solventes que son adecuados para el lavado, y también para la posterior reacción de acoplamiento incluyen el diclorometano (DCM) , dicloroetano (DCE), dimetilformamida (DMF) y similares, asi como las mezclas de estos reactivos. Otros solventes útiles incluyen el DIVISO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona y mezclas de los mismos. En algunos casos el acoplamiento puede realizarse en un sistema de solvente binario, como una mezcla de DMF y DCM en una proporción en volumen en el intervalo de 9:1 a 1:9, más comúnmente de 4:1 a 1:4. La síntesis de la presente invención preferiblemente se lleva a cabo en presencia de grupos protectores apropiados a menos que se especifique de otra manera. La naturaleza y utilización de los grupos protectores es bien conocida en la materia. Generalmente, un grupo protector adecuado es cualquier tipo de grupo que pueda ayudar a prevenir la participación del átomo o la porción al que está unido, por ejemplo oxigeno o nitrógeno, en reacciones no deseadas durante el procesado y la síntesis. Los grupos protectores incluyen los grupos protectores de cadenas laterales y los grupos protectores amino- o N-terminal. Los grupos protectores pueden también prevenir la reacción o unión de ácidos carboxílieos , tioles y similares. Un grupo protector de cadena lateral se refiere a una porción química acoplada a la cadena lateral (es decir, un grupo R en la fórmula general de los aminoácidos H2N-C(R) (H)-COOH) de un aminoácido que ayuda a prevenir que una porción de la cadena lateral reaccione con los reactivos utilizados en los pasos de síntesis del péptido, procesado, etc. La elección de un grupo protector de cadena lateral puede depender de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis realizada, el procesado al que se someterá el péptido y el producto intermediario o producto final deseado. La naturaleza del grupo protector de la cadena lateral también depende de la naturaleza del aminoácido en sí. Generalmente, se elige un grupo protector de cadena lateral que no se elimine durante la desprotección de los grupos examino durante la síntesis en fase sólida. Por lo tanto el grupo protector a-amino y el grupo protector de la cadena lateral no son normalmente el mismo. En algunos casos, y dependiendo del tipo de reactivos utilizados en la síntesis en fase sólida y del resto de procesado del péptido, puede no ser necesaria la presencia de un grupo protector de la cadena lateral de un aminoácido. Tales aminoácidos normalmente no incluyen un oxígeno reactivo, nitrógeno u otra porción reactiva en la cadena lateral. Ejemplos de grupos protectores de cadenas laterales incluyen acetilo (Ac) , benzoilo (Bz) , ter-butilo, trifenilmetilo (tritilo) , tetrahidropiranilo, éter de bencilo (Bzl) y 2 , 6-diclorobencilo (DCB) , t-butoxicarbonilo (Boc) , nitro, p-toluensulfonilo (Tos), adamantiloxicarbonilo, xantilo (Xan) , bencilo, 2 , 6-diclorobencilo, metilo, etilo y éster de t-butilo, benciloxicarbonilo (Z), 2-clorobencil-oxicarbonilo (2-C1-Z), t-amiloxi-carbonilo (Aoc) y los grupos protectores de tipo uretano aromáticos o alifáticos, los grupos fotolábiles como el nitro veratrilo oxicarbonilo (NVOC) y los grupos lábiles al fluoruro como el trimetilsilil oxicarbonilo (TEOC) . Los grupos protectores de cadenas laterales preferidos para los aminoácidos comúnmente utilizados para sintetizar los péptidos GLP-1 en la práctica de la presente invención se muestran en la siguiente Tabla A: Tabla A: Grupo (s) protector (es) de la Aminoácido cadena lateral Aib Ninguno Ala Ninguno Arg Ninguno Asp éster de t-butilo (OtBu) Gln tritilo (trt) Glu OtBu Gly Ninguno His tritilo (trt) lie Ninguno Leu Ninguno Lys ' t-butiloxicarbonilo (Boc) Grupo (s) protector (es) de la Aminoácido cadena lateral Phe Ninguno Ser t-butilo (tBu) anillo oxazolidina entre el X17"18 (que nitrógeno alfa y el OH de la corresponde a Ser- Ser más cercano a C-terminal; Ser) tBu en la otra Ser Thr tBu Trp Boc Tyr tBu Val Ninguno Un grupo protector amino-terminal incluye una porción química acoplada al grupo amino alfa de un aminoácido. Normalmente, el grupo protector amino-terminal se elimina en una reacción de desprotección antes de la adición del siguiente aminoácido a añadir a la cadena de péptido creciente, pero puede mantenerse cuando el péptido se escinde del soporte. La elección de un grupo protector amino terminal puede depender de varios factores, por ejemplo, del tipo de síntesis realizada y del producto intermediario o producto final deseado. Ejemplos de grupos protectores amino-terminales incluyen (1) los grupos protectores de tipo acilo, como formilo, acrililo (Acr) , benzoilo (Bz) y acetilo (Ac) ; (2) los grupos protectores de tipo uretano aromático, como benciloxicarbonilo (Z) y Z sustituido, como p-clorobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) los grupos protectores uretano alifáticos, como t-butiloxicarbonilo (Boc) , diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, aliloxicarbonilo ; (4) los grupos protectores de tipo uretano cicloalquilo, como 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc) , ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, y ciclohexiloxicarbonilo; y (5) los grupos protectores de tipo tiouretano, como feniltiocarbonilo . Los grupos protectores preferidos incluyen 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), 2- ( 4-bifenilil ) -propil (2 ) oxi-carbonilo (Bpoc) , 2-fenilpropil ( 2 ) -oxicarbonilo (Poc) y t-butiloxicarbonilo (Boc). La química con Fmoc o parecida a Fmoc es altamente preferible para la síntesis de péptidos en fase sólida, considerando que la división del péptido resultante en un estado protegido es relativamente fácil de llevar a cabo utilizando agentes de división medianamente acídicos. Este tipo de reacción de división es relativamente limpia en términos de productos secundarios resultantes, impurezas, etc., haciendo que sea técnicamente y económicamente factible la recuperación del péptido a gran escala a partir de ambos lavados de expansión y contracción, aumentando el rendimiento. Tal y como se utiliza aquí, "a gran escala" referido a la síntesis de péptido incluye generalmente la síntesis de péptidos en el intervalo de al menos 500 g, y más preferiblemente al menos 2 kg, por lote. La síntesis a gran escala se realiza normalmente en recipientes de reacción grandes, como un tanque de reacción de acero, que puede acomodar cantidades de los reactivos como las resinas, solventes, aminoácidos, reactivos para las reacciones de acoplamiento y de desprotección, que se ajustan para permitir la producción de péptidos en el intervalo de ente kilogramos y toneladas. De forma adicional, el grupo protector Fmoc puede dividirse selectivamente de un péptido en relación a los grupos protectores de la cadena lateral, de forma que la protección de la cadena lateral permanece en su lugar cuando se escinde el Fmoc. Este tipo de selectividad es importante durante el acoplamiento de aminoácidos para minimizar las reacciones de la cadena lateral. De forma adicional, los grupos protectores de la cadena lateral pueden dividirse de forma selectiva para eliminarlos respecto al Fmoc, permaneciendo el Fmoc en su lugar. Los esquemas de purificación descritos en profundidad a continuación se basan de forma muy ventajosa en esta última selectividad. La reacción de acoplamiento en fase sólida puede realizarse en presencia de uno o más compuestos que aumenten o mejoren la reacción de acoplamiento. Los compuestos que pueden incrementar la velocidad de reacción y reducir la velocidad de reacciones secundarias incluyen las sales de fosfonio y uronio que en presencia de una base terciaria, por ejemplo diisopropiletilamina (DIEA) y trietilamina (TEA) , pueden convertir los aminoácidos protegidos en especies activadas (por ejemplo, BOP, PyBOPO, HBTU y TBTU, todas generan ésteres de HOBt) . Otros reactivos ayudan a prevenir la racemización proporcionando un reactivo de protección. Estos reactivos incluyen las carbodiimidas (por ejemplo, DCC o WSCDI) con un nucleófilo auxiliar añadido (por ejemplo, 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-azabenzotriazol (HOAt) o HOSu) . También puede utilizarse el método de anhídrido mezclado, que utiliza cloroformiato de isobutilo, con o sin un nucleófilo auxiliar añadido, así como el método de azida, debido a la baja racemización asociada con él. Estos tipos de compuestos pueden también aumentar la velocidad de acoplamientos mediados por carbodiimida, así como prevenir la deshidratación de los residuos Asn y Gln. Después de determinar la finalización del acoplamiento, la mezcla de reacción de acoplamiento se lava con un solvente y el ciclo de acoplamiento se repite para cada uno de los residuos de aminoácido subsiguientes del material peptídico. Para acoplar el siguiente aminoácido, normalmente se logra la eliminación del grupo protector en N- terminal (por ejemplo, un grupo Fmoc) del material unido a la resina mediante el tratamiento con un reactivo que incluye un 20-50% (en base al peso) de piperidina en un solvente como la N-metilpirrolidona (N P) o dimetilformamida (DMF) . Tras la eliminación del grupo protector de Fmoc, normalmente se realizan varios lavados para eliminar los productos secundarios residuales de la piperidina y el Fmoc (como dibenzofulveno y su aducto de piperidina) . Los siguientes aminoácidos pueden utilizarse en un exceso estequiométrico de aminoácidos en relación al factor de carga del material peptidico en el soporte de resina. Generalmente, la cantidad de aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es al menos equivalente al factor de carga del primer aminoácido en la resina (1 equivalente o más) . Preferiblemente la cantidad de aminoácidos utilizados en el paso de acoplamiento es de al menos 1.3 equivalentes (0.3 de exceso) o más, y más preferiblemente alrededor de 1.5 equivalentes (0.5 de exceso) o más. En algunos casos, por ejemplo, el paso de acoplamiento utiliza una cantidad de equivalentes de aminoácido en el intervalo de entre 1 y 3. Tras el ciclo final de acoplamiento, la resina se lava con un solvente como NMP, y después se lava con un segundo solvente inerte como el DCM. Para eliminar el material peptidico sintetizado de la resina, se lleva a cabo un tratamiento de división de forma que el material peptidico escindido todavía tiene suficientes grupos protectores de la cadena lateral y terminal. La permanencia de los grupos protectores en su lugar ayuda a prevenir acoplamientos no deseados u otras reacciones no deseables de los fragmentos de péptido durante o tras la división de la resina. En el caso de utilizar Fmoc o un reactivo similar para sintetizar el péptido, se puede conseguir una división protegida de cualquier forma deseada, por ejemplo utilizando un reactivo ácido relativamente débil como el ácido acético o TFA diluido en un solvente como el DCM. Normalmente se utiliza TFA en DC entre un 0.5 y 10 por ciento en peso, preferiblemente entre 1 y 3 por ciento en peso. Véase, por ejemplo, la Pat . Estadounidense N° 6,281,335. Los pasos de división del fragmento de péptido intermediario de la resina en fase sólida pueden darse de forma similar a las de un proceso de ejemplo como sigue. No obstante, puede utilizarse cualquier proceso adecuado que escinda de forma efectiva el fragmento de péptido intermediario de la resina. Por ejemplo, pueden añadirse aproximadamente de 5 a 20, preferiblemente alrededor de 10 volúmenes de un solvente que contenga un reactivo de división acídico al recipiente que contiene el material peptídico unido a la resina. La resina, normalmente en forma de cuentas, queda sumergida en el reactivo como consecuencia. La reacción de división sucede cuando el contenido líquido se agita a una temperatura adecuada durante un periodo de tiempo adecuado. La agitación ayuda a evitar la aglutinación de las cuentas. Las condiciones de tiempo y temperatura adecuadas dependerán de varios factores .como el reactivo ácido que se vaya a utilizar, la naturaleza del péptido, la naturaleza de la resina y similares. Como una guia general, será adecuada una agitación de entre alrededor de -15 °C y alrededor de 5°C, preferiblemente entre alrededor de -10 °C y alrededor de 0°C durante entre alrededor de 5 minutos y dos horas, preferiblemente durante entre alrededor de 25 minutos y alrededor de 45 minutos. El tiempo de división puede estar en el intervalo de alrededor de 10 minutos a alrededor de 2 horas o incluso tanto como un día. La división se lleva acabo deseablemente en dicho intervalo de temperaturas frías para acomodar la reacción exotérmica que normalmente ocurre durante la reacción. Además, la temperatura baja de la reacción de división evita que los grupos protectores de las cadenas laterales sensibles al ácido, como los grupos tritilo, sean eliminados en esta fase. Al final del tratamiento de división, la reacción se detiene. Esto se puede lograr, por ejemplo, combinando el reactivo de división con una base adecuada, como la piridina o similares, y continuando la agitación durante un periodo adicional de entre 5 minutos y 2 horas, preferiblemente entre alrededor de 20 minutos y alrededor de 40 minutos. Añadir la base y continuar con la agitación provoca un aumento de temperatura del contenido del recipiente. Al final de la agitación, el contenido del recipiente puede estar a una temperatura en el intervalo de entre alrededor de 0°C y alrededor de 15°C, preferiblemente entre alrededor de 5°C y alrededor de 10°C. Los factores como la expansión y contracción de la resina para mejorar aspectos de la recuperación del péptido pueden incorporarse opcionalmente en el proceso global de síntesis. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en la Publicación de Pat. Estadounidense N° 2005/0164912 Al. En algunos aspectos, los fragmentos de péptido dividido pueden prepararse para un acoplamiento en fase en solución a otros fragmentos de péptido y/o aminoácidos. Las reacciones de acoplamiento de péptidos en fase en solución se revisan en, por ejemplo, New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafael; Dodsworth, David J. ; y Najera, Carmen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303. El acoplamiento de los fragmentos de péptido intermediarios con otros fragmentos o aminoácido ( s ) en la fase en solución puede llevarse a cabo utilizando reactivos de acoplamiento in situ, por ejemplo hexafluorofosfato de 2- ( lH-benzotriazol-l-il ) tris (dimetilamino) fosfonio (BOP) , hexafluorofosfato de o- (benzotriazol-l-il ) -N, , ' , N' - tetrametiluronio (HBTU) , hexafluorofosfato de o- (7-azobenzotria-zol-l-il) -1,1,3, 3-tetrametiluronio (HATU) , diciclohexilcarbodiimida (DCC), carbodiimida soluble en agua (WSCDI) o tetrafluoroborato de o- (benzotriazol-l-il ) -N, , N' , N' -tetra-metiluronio (TBTU) . Otras técnicas de acoplamiento utilizan ésteres activos preformados como la hidroxisuccinimida (HOSu) y ésteres de p-nitrofenol (HONp) , anhídridos simétricos preformados, anhídridos no simétricos como N-carboxianhídridos (NCA) o haluros de ácido como el fluoruro de acilo, así como el cloruro de acilo. Un solvente de acoplamiento adecuado puede utilizarse en la reacción de acoplamiento en fase en solución. Se entiende que el (los) solvente (s) de acoplamiento utilizado (s) puede afectar al grado de racemización del enlace peptídico formado; la solubilidad del péptido y/o fragmentos peptídicos; y a la velocidad de la reacción de acoplamiento. En algunas modalidades, el solvente de acoplamiento incluye uno o más reactivos miscibles en agua. Ejemplos de solventes miscibles en agua incluyen, por ejemplo, DMSO, piridina, cloroformo, dioxano, tetrahidrofurano, acetato de etilo, N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxano o mezclas de los mismos. En otras modalidades, la reacción de acoplamiento puede incluir uno o más reactivos no miscibles en agua. Un ejemplo de solvente no miscible en agua es el cloruro de metileno. En estas modalidades, el solvente no miscible en agua es preferiblemente compatible con la reacción de desprotección; por ejemplo, si se utiliza un solvente no miscible en agua, preferiblemente no afectará de forma adversa a la reacción de desprotección. Tras la formación del péptido 11, el producto puede someterse a la desprotección, purificación, liofilización, posterior procesado (por ejemplo, reacción con otro péptido para formar una proteina de fusión) , combinaciones de estos y/o similares, como se prefiera. Por ejemplo, de acuerdo con la invención, los grupos protectores de cadenas laterales están normalmente retenidos en los fragmentos de péptido intermediarios a lo largo de la síntesis en fase sólida y también a través de las reacciones de acoplamiento en fase en solución. Generalmente, tras finalizar el paso de acoplamiento en fase en solución, se pueden realizar uno o más pasos de desprotección para eliminar uno o más grupos protectores del péptido. La eliminación de grupos protectores de cadenas laterales mediante la desprotección global normalmente utiliza una solución de desprotección que incluye un agente acidolítico para dividir los grupos protectores de las cadenas laterales. Los reactivos acidolíticos utilizados comúnmente para la desprotección global incluyen el ácido trifluoroacético puro (TFA) , HC1, ácidos de Lewis como BF3Et20 o Me3SiBr, ácido fluorhídrico líquido (HF) , bromuro ácido (HBr) , ácido trifluorometansulfónico y combinaciones de los mismos. La solución de desprotección también incluye uno o más neutralizadores de cationes adecuados, por ejemplo, ditiotreitol (DTT) , anisol, p-cresol, etanoditiol o sulfuro de dimetilo. La solución de desprotección también puede incluir agua. Tal y como se utiliza aquí, las cantidades de reactivos presentes en la composición de desprotección se expresan normalmente en una proporción, en donde la cantidad de un componente individual se expresa como un numerador en "partes", como "partes de peso" o "partes de volumen" y el denominador es el número de partes totales en la composición. Por ejemplo, una solución de desprotección que contiene TFA: H20: DTT en una proporción de 90:5:5 (peso/ peso/ peso) posee TFA a 90/100 partes en peso, H20 a 5/100 partes en peso, y DTT a 5/100 partes en peso. En algunas modalidades, la reacción de desprotección puede realizarse con una cantidad del agente acidolítico, preferiblemente TFA, en la composición de desprotección que es superior a 90/100 partes en peso. Otras composiciones de desprotección preferidas incluyen una cantidad de agente acidolítico en una proporción de 93/100 partes en peso o superior, o en una cantidad en el intervalo de entre 93/100 partes en peso y 95/100 partes en peso. La precipitación se realiza normalmente utilizando un éter, por ejemplo, dietil éter o MTBE (Metil Ter Butil Éter) . Tras la precipitación, preferiblemente se aisla el péptido y se seca antes de combinarse con otros ingredientes, liofilizarse, empaquetarse, almacenarse, procesarse y/o manipularse de otro modo. Esto se puede lograr de cualquier forma adecuada. De acuerdo con un método adecuado, el péptido se recoge mediante filtración, se lava mediante generosos lavados con MTBE para reducir el contenido final de sales hasta un nivel adecuado y después se seca. La presente invención también proporciona técnicas útiles para purificar una amplia variedad de péptidos, que incluye los péptidos GLP-1 y sus homólogos. Un proceso de purificación particularmente preferido involucra al menos dos pasos de purificación a través de medio cromatográfico, en que al menos el primer paso ocurre a un primer pH y al menos un segundo paso ocurre a un segundo pH. Más preferiblemente, el primer paso ocurre a un pH acidico, mientras que el segundo paso ocurre a un pH básico. En modalidades preferidas, ocurre al menos un paso bajo condiciones acidicas previamente a un paso bajo condiciones básicas. Una forma ilustrativa de poner en práctica este método de purificación se describe en el contexto ilustrativo de la purificación del péptido 11 completamente protegido resultante del esquema 10 que se muestra en la Figura 1. Inicialmente, el péptido está totalmente desprotegido. Tanto los grupos protectores de las cadenas laterales como de N-terminal se han escindido. Se llevó a cabo un primer paso cromatográfico en un gradiente de agua/ACN (acetonitrilo) , utilizando suficiente TFA para proporcionar un pH de entre alrededor de 1 y 5, preferiblemente de alrededor de 2. Entonces se lleva a cabo un segundo paso en un gradiente de agua/ ACN utilizando un poco de amoniaco y/o acetato amónico o similares, para proporcionar un pH de entre alrededor de 8 y 9, preferiblemente de entre 8.5 y 8.9. Los valores de pH, ya sean ácidos o básicos, promueven la uniformidad, en el sentido que especies iónicas uniformes están presentes en cada caso. Asi, el pH acidico deseado es suficientemente bajo para que sustancialmente todos los residuos de aminoácido en el material peptidico estén protonados . El pH básico deseado es suficientemente alto para que sustancialmente todos los residuos de aminoácido en el material peptidico estén desprotonados . La cromatografía ácida y básica puede llevarse a cabo en cualquier orden. Es conveniente realizar la cromatografía básica al final cuando el acetato de péptido es el producto deseado considerando que el acetato pueda ser el producto de la cromatografía. Los principios de la presente invención se ilustrarán en detalle a continuación mediante los siguientes ejemplos ilustrativos. A partir de este momento, los porcentajes y proporciones están expresados en volumen a menos que se especifique de otra manera. Ejemplo 1 - Síntesis en fase sólida del Fragmento 12 con protección de Fmoc en N-terminal y protección de la cadena lateral en la His y Glu. A. Preparación de la resina de 2CTC cargada con Fmoc-Gly Inicialmente, se preparó la resina 2CTC cargada con Fmoc-Gly. Las cantidades de reactivos utilizados se listan en la siguiente tabla: resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidico de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. a 25°C. El lecho se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87,5:12,5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho se drenó y se lavó una vez con 350 mi de DMF y una vez con 175 mi de DMF. Posteriormente, los sitios activos restantes en la resina de 2-CTC se protegieron en el extremo con 350 mi de solución MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó con 250 mi de DMF dos veces y después con 350 mi de DCM cuatro veces. La resina se contrajo mediante lavados con 3 X 350 mi de IPA. La resina se secó hasta peso constante para proporcionar 38.20 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.18 mmoles/ g. B. Síntesis en fase sólida La síntesis en fase sólida se llevó a cabo comenzando con 20.0 g de resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly a 0.18 mmoles/ g como se preparó en la Parte A de este Ejemplo 1. La resina se expandió en DCM (200 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente DCM se drenó y la resina se lavó tres veces con NMP (5 vol. cada lavado). La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 20% en volumen en NMP (5 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores de Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina al 20% /NMP, la resina se lavó cinco veces con NMP (5 vol. cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa. Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido (2.85 equiv.) y 6-cloro-l-hidroxibenzotriazol (6-C1-HOBT, 2.85 equiv.), se disolvieron en 2.55 volúmenes de NMP y después se combinaron con DIEA (3.25 equiv.) a entre 5°C y 10°C. El TBTU (2.85 equiv.) se disolvió en 1.3 volúmenes de NMP a entre 5°C y 10°C. Entonces se combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió al recipiente de reacción. El recipiente se enjuagó con 1.3 volúmenes de DCM añadido al reactor, que se agitó entonces durante 2-3 horas a entre 25°C y 27°C. La muestra se extrajo para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Si la reacción de acoplamiento resultaba incompleta tras 3 horas (ensayo Kaiser positivo) , el recipiente de reacción se drenaba y se realizaba un reacoplamiento con una nueva solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (5 vol. cada lavado). La eliminación del grupo protector Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitió para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir, en el orden de Glu(OtBu)- Aib? His(trt)). Debido a la dificultad de la reacción de acoplamiento entre la Fmoc-His ( trt ) -OH activada y la H-Aib-Glu (OtBu) -Gly-2-CTC, y la inestabilidad de la Fmoc-His (trt ) -OH activada, se forzó la finalización de la reacción de acoplamiento mediante el drenaje de la solución de reacción tras una hora y realizando inmediatamente la reacción de reacoplamiento con una segunda nueva solución activada de Fmoc-His (trt) -OH. Todos los reactivos utilizados en la Parte B de este ejemplo se listan en la siguiente tabla: El fragmento peptidico unido a la resina se lavó con NMP (5 vol.) 4 veces, DCM (6 vol.) 5 veces e IPA (5 vol.) 3 veces. La resina contraída se secó entonces a 35°C al vacío para proporcionar 22.58 g de resina con péptido unido a la resina . C . División del fragmento protegido de la cadena lateral y Fmoc de la resina La resina obtenida en la Parte B anterior se expandió en DCM (12.5 volúmenes en relación al peso de la resina utilizada; 12.5 mi de DCM por g de resina o 12.5 litros por kg) durante 30 min. a 25°C y después se lavó con DCM 2 veces (6.25 vol. cada lavado) para eliminar cualquier residuo de NMP. La resina se enfrió con el último lavado de DCM hasta -5°C. El DCM se drenó y se añadió una solución fría de TFA/ DCM al 1% (10 vol. a entre -5°C y -10°C) y se agitó durante 30 min. a 0°C. Se añadió piridina (1.3 equiv. de TFA) al reactor para neutralizar el TFA. La solución de división se separó por filtración y se recogió en un recipiente. Mientras el recipiente se calentaba hasta 25°C, la resina se lavó con DCM 7 veces (7.5 vol.) . Los lavados se combinaron con la solución de división. La solución de división de DCM se combinó con agua (7.5 vol.) . La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento peptidico se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacio. Se obtuvieron un total de 4.73 g de Fmoc- (Aib8 ) GLP-1 ( 7-10 ) -OH .

Ejemplo 2 A. Preparación de la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly Se preparó la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly. Las cantidades de reactivos utilizados se listan en la siguiente tabla: resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidico de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. a 25°C. La resina se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87.5:12.5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho de resina se drenó y se lavó una vez con 400 mi de DMF y una vez con 200 mi de DMF. Posteriormente, los sitios activos restantes en la resina de 2-CTC se protegieron en el extremo con 390 mi de solución de MeOH: DIEA (9:1 en volumen) durante 1 hora. El lecho se drenó de nuevo, se lavó con 350 mi de DMF dos veces, y se lavó con 350 mi de DCM cuatro veces. La resina se contrajo entonces mediante lavados con 3 X 350 mi de IPA. La resina se secó a 35°C al vacio hasta un peso constante para proporcionar 48.51 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.54 inmoles/ g. B. Síntesis en fase sólida La síntesis en fase sólida se llevó a cabo comenzando con 27.59 g de resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly a 0.54 mmoles/ g. La resina se expandió en DCM (300 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente de DCM se drenó y la resina se lavó tres veces con NMP (5 vol. cada lavado) . La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 20% en volumen en NMP (5 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina al 20%/ NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (5 vol. cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa. Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido (1.7 equiv. ) y el 6-cloro-l-hidroxibenzo-triazol (6-C1-HOBT, 1.7 equiv.), se disolvieron en 4.6 volúmenes de NMP y después se combinaron con DIEA (1.9 equiv.) a entre 5°C y 10°C. El TBTU (1.7 equiv.) se disolvió en 2.28 volúmenes de NMP a entre 5°C y 10°C. Entonces se combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió al recipiente de reacción. El recipiente se enjuagó con los 2.28 volúmenes de DCM añadidos al reactor, que se agitó entonces durante 2-3 horas a 25°C-27°C. Se extrajo una muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Tras completar la reacción de acoplamiento, se drenó la solución de acoplamiento y la resina se lavó con NMP 4 veces (5 vol. cada lavado). La eliminación del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden Glu(OtBu)? Aib? His(trt)). Todos los reactivos utilizados en este ejemplo se listan en la siguiente tabla: C . División del fragmento de la resina La resina obtenida se lavó con NMP (5 vol.) 6 veces y después con DCM (6 vol.) 8 veces para eliminar el residuo de NMP. La resina se enfrió en el último lavado con DCM hasta -5°C. Después del drenaje de DCM, se añadió una solución fría (entre -5°C y -10°C) de TFA al 1%/ DCM (10 vol . ) , y la mezcla resultante se agitó durante 30 min. a 0°C. Se cargó piridina (1.3 equiv., de TFA) en el reactor para neutralizar el TFA. La solución de división se recogió en el recipiente. Mientras el recipiente se calentaba hasta 25°C, la resina se lavó con DCM (7.5 vol.) 11 veces y se añadió a la solución de división. La solución de DCM se combinó con agua (10 vol.) . La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacio. Se obtuvieron un total de 11.12 g de Fmoc- (Aib8) GLP-1 (7-10) -OH (rendimiento del 78.8%). Ejemplo 3 A. Preparación de la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly Se preparó la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly.

Las cantidades de reactivos utilizados se listan en la siguiente tabla: Preparación de la resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritilo Materiales PM Eq. mmole gramos mi s Resina de cloruro de - - 60.88 40.86 - 2-Clorotritilo Fmoc-Gly-OH 297.3 1.0 42.58 12.66 - Diisopropiletilamina 129.25 1.48 63.21 8.17 (DIEA) Dimetilformamida 1380 (DMF) Diclorometano (DCM) 1840 Metanol: DIEA 9:1 390 Isopropanol (IPA) 1000 La resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidico de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Gly-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87.5: 12.5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho se drenó y se lavó una vez con 400 mi de DMF y una vez con 200 mi de DMF. Posteriormente, los sitios activos restantes en la resina de 2-CTC se protegieron en el extremo con 390 mi de solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó con 350 mi de DMF dos veces y después con 350 mi de DCM cuatro veces. La resina se contrajo entonces mediante lavados con 4 X 250 mi de IPA. La resina se secó a 35°C al vacio hasta un peso constante para proporcionar 52.02 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.72 mmoles/ g. B. Síntesis en fase sólida La síntesis en fase sólida se llevó a cabo comenzando con los 24.43 g de resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Gly a 0.72 mmoles/ g. La resina se expandió en DCM (250 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente de DCM se drenó y la resina se lavó tres veces con NMP (5 vol. cada lavado) . La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 20% en NMP (5 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores de Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina al 20%/ NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (5 vol. cada lavado) hasta una prueba de cloranilo negativa. Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido y el 6-cloro-l-hidroxibenzotriazol (6-Cl-HOBT) , se disolvieron en NMP y después se combinaron con DIEA a 10°C-5°C. El TBTU (1.7 equiv. ) se disolvió en 2.28 volúmenes de NMP a entre 5°C y 10°C. Entonces se combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió al recipiente de reacción. El recipiente se enjuagó con el DCM añadido al reactor (véanse las cantidades en la siguiente tabla), que se agitó entonces durante 2-6 horas a 25°C-27°C. Se extrajo muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Si la reacción de acoplamiento estaba incompleta tras 3 horas (ensayo Kaiser positivo) , el recipiente de reacción se drenaba y se realizaba un reacoplamiento con una nueva solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (5 vol. cada lavado) . La eliminación del grupo protector Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden de Glu(OtBu)- Aib? His(trt)). Todos los reactivos utilizados en este ejemplo se listan en la siguiente tabla: C. División del fragmento Fmoc-AA(7-10) -OH de la resina La resina obtenida se lavó con NMP (5 vol.) 6 veces y después con DCM (6 vol.) 7 veces para eliminar la NMP. La resina se enfrió con el último lavado de DCM hasta -5°C. El DCM se drenó y el lecho de la resina se lavó con una solución fría (entre -5°C y -10°C) de TFA al 1%/ DCM (11.26 vol.) durante 5 min. a 0°C. La solución de división se recogió en el recipiente, al que se le había añadido piridina (1.3 equiv. de TFA total) para neutralizar el TFA. Entonces, se añadió una segunda porción de TFA al 1%/ DCM fría (6.14 vol.) al reactor y se agitó durante 2 min. La segunda solución de división se añadió de nuevo en el recipiente recolector. Mientras el recipiente se calentaba hasta 25°C, la resina se lavó con DCM 9 veces (8.2 vol.) y se añadió a la solución de división. La solución de DCM se combinó con agua (8.2 vol.). La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacío. Se obtuvieron un total de 14.02 g de Fmoc- (Aib8 ) GLP-1 ( 7-10 ) -OH (rendimiento del 86.6%) de acuerdo con la SEC ID No. 7. El análisis mostró una pureza del 94.3% AN. Ejemplo 4 - Síntesis en fase sólida de la cadena lateral protegida Fmoc- (Aib35) GLP-1 (23-35) -OH A. Preparación de la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Aib Se preparó la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Aib. Las cantidades de reactivos utilizados se listan en la siguiente tabla: Preparación de la resina de Fmoc-Aib-2-Clorotritilo Materiales PM Eq. mmoles gramos mi Resina de cloruro - - 59.66 40.04 - de 2-clorotritilo Fmoc-Aib-OH 325.5 1.0 14.91 4.85 - Diisopropiletilamin 129.25 2.39 35.20 4.61 a (DIEA) Dimetilformamida 1480 (DMF) Diclorometano (DCM) 1840 Metanol: DIEA 9: 1 450 Isopropanol (IPA) 1050 resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidico de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87.5:12.5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho se drenó y se lavó una vez con 400 mi de DMF y otra con 200 mi. Posteriormente, los sitios activos restantes en la resina de 2-CTC se protegieron en el extremo con 400 mi de solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó. La resina se lavó una vez con 450 mi de DMF/ MeOH/ DIEA (4: 0.9: 0.1), una vez con 200 mi de DMF y después cuatro veces con 350 mi de DCM. La resina se contrajo mediante lavados con 3 x 350 mi de IPA. La resina se secó hasta peso constante para proporcionar 45.15 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.24 mmoles/ g. B. Síntesis en fase sólida Se cargaron 10.01 g de resina de CTC-2 con Fmoc-Aib con factor de carga de 0.24 mmoles/ g en un recipiente de reacción y se expandieron en DCM (120 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente de DCM se drenó, y la resina se lavó tres veces con NMP (6 vol. cada lavado). La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 5% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores Fmoc . Tras el segundo tratamiento con piperidina al 5%/ NMP, la resina se lavó cuatro veces con NMP (6 vol. cada lavado). Para preparar la solución de acoplamiento, se disolvieron el aminoácido (1.875 equiv.) y 1-hidroxi-benzotriazol monohidrato (HOBT hidrato, 2.07 equiv.) en 3.5 volúmenes de NMP a 5°C-10°C y después se combinaron con una solución de 16.1 mi de HBTU (2.0 equiv.) en NMP (1.5 vol.). Después se añadieron 2.2 mi de DIEA (2.63 equiv.) al recipiente de activación a 10°C-5°C. La solución resultante se transfirió al recipiente de reacción. El recipiente de activación se enjuagó con 1.5 volúmenes de DCM añadido al reactor, que se agitó entonces durante 2 horas a 25°C. El recipiente de reacción se drenó. La reacción de acoplamiento se repitió una vez más con nueva solución de aminoácido activado (1.875 equiv.). Tras completar la segunda reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (6 vol. cada lavado). Después, la eliminación del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir, en el orden de Lys(Boc)? Val-» Leu? Trp(Boc)? Ala? Ile? Phe? Glu(OtBu)? Lys(Boc)? Ala- Ala? Gln (trt) ) . Todos los reactivos utilizados en este ejemplo se listan en la siguiente tabla: Reacción de acoplamiento de Fmoc-AA ( 23-35 ) -OH Ejemplo 1 Aminoácido g HOBT NMP HBTU NMP DCM DIEA T. de hidrato (mi) (g) (mi) (mi) (mi) acoplam. (g) (min . ) Lys (Boc) 2.12 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 2.12 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Lys (Boc) Val 1.53 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.53 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Val Leu 1.58 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.58 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Leu Trp (Boc) 2.37 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 2.36 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Trp (Boc) Ala 1.42 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.42 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Ala lie 1.59 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam . 1.59 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 lie Phe 1.74 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.74 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Phe Glu (OtBu) 1.93 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.92 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Glu (OtBu) Lys (Boc) 2.12 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 2.11 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Lys (Boc) Ala 1.41 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.40 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Ala Ala 1.41 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 1.40 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Ala Gln (trt) 2.77 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Reacoplam. 2.76 0.76 30.0 1.83 15.0 15.0 1.1 120 Gln (trt) La resina obtenida se aisló lavando 4 veces con NMP (6 vol. ) , 4 veces con DCM (6 vol . ) y 3 veces con isopropanol (IPA, 6 vol.)- La resina obtenida se secó a 35°C al vacio. Se obtuvieron 14.3 g de la resina. C. División del fragmento intermediario de la resina construida Se expandieron 6.6 g de la resina obtenida en el paso anterior en 10 volúmenes de DCM durante 30 min., y se enfrió hasta -10°C. El DCM se drenó y se añadió una solución fria de TFA al 1%/ DCM (12 vol. a entre -5°C y -10°C) y se agitó durante 30 min. a 0°C. La solución de división se recogió en un recipiente que contenia piridina (2-3 equiv. de TFA) . Mientras se calentaba a 25°C, la resina se agitó con TFA al 1%/ DCM (10 vol.) durante 5 min. y se añadió piridina (2-3 equiv.). Tras otros 5 minutos, se recogió la solución. La resina se lavó con DCM 4 veces (10 vol.) . Todos los lavados de DCM se combinaron con agua (agua/ DCM = 1/4) . La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacio. EL procedimiento de división se repitió una vez más. Se obtuvieron un total de 2.36 g de Fmoc-(Aib35) GLP-1 ( 23-35 ) -OH (rendimiento del 92 %) . Ejemplo 5 ?. Preparación de la resina de 2-CTC cargada con Pmoc-Aib Se preparó la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Aib. Las cantidades de reactivos utilizados se listan en la siguiente tabla: resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidi de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87.5: 12.5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho se drenó y se lavó con 400 mi de DMF.

Posteriormente, cualquier sitio activo restante en la resina de 2-CTC se protegió en el extremo con 400 mi de solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó una vez con 400 mi de DMF, una vez con 200 mi de DMF y cuatro veces con 350 mi de DCM. La resina se contrajo mediante lavados con 3 x 350 mi de IPA. La resina se secó hasta peso constante para proporcionar 45.32 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.30 mmoles/ g. B. Síntesis en fase sólida La síntesis en fase sólida se llevó a cabo comenzando con 15.0 g de resina de CTC-2 con Fmoc-Aib cargada a 0.24 mmoles/ g. La resina se expandió en DCM (150 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente de DCM se drenó, y la resina se lavó dos veces con NMP DCM (6 vol . cada lavado) y tres veces con NMP (6 vol. cada lavado) . La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 20% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina al 20%/ NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (6 vol. cada lavado) hasta un ensayo cloranilo negativo. Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido (1.7 equiv.) y el 6-cloro-l-hidroxibenzo-triazol (6-C1-HOBT, 1.7 equiv.), se disolvieron en 2.6 volúmenes de NMP a 10°C-5°C, y después se combinaron con DIEA (de 1.9 a 3.0 equiv.). Se disolvió TBTU o HBTU (1.7 equiv.) en 1.33 volúmenes de NMP a 10°C-5°C. Después se combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió a un recipiente de reacción. El recipiente de mezclado se enjuagó con 1.33 volúmenes de DCM en el reactor, que se agitó entonces con resina durante 2-3 horas a 25°C-27°C. Se extrajo muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Si la reacción de acoplamiento estaba incompleta tras 3 horas (ensayo Kaiser positivo) , el recipiente de reacción se drenaba y se realizaba un reacoplamiento con nueva solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (6 vol. cada lavado). Entonces, la eliminación del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitió para los restantes aminoácidos en el fragmento (es decir, en el orden Lys(Boc)? Val? Leu-. Trp(Boc)? Ala- lie- Phe? Glu(OtBu)? Lys (Boc)? Ala? Ala? Gln (trt) ) . Debido a un posible efecto de refuerzo entre la 2-metilalanina (Aib) y la resina de 2-CTC, es considerablemente difícil forzar hasta la finalización las primeras dos reacciones de acoplamiento de aminoácidos (Lys(Boc)-34 y Val-33). Por lo tanto, ambas reacciones de acoplamiento de (Lys (Boc) -34 , Val-33) se realizaron tres veces (es decir, tras el acoplamiento se realizaron dos re-acoplamientos).

Además, se utilizó anhídrido acético para proteger el extremo del material unido a la resina que no ha reaccionado tras las reacciones de acoplamiento de Lys(Boc)-34 y Val-33. Esto ha mejorado la eficiencia de las posteriores purificaciones separando las impurezas del producto deseado durante la purificación cromatográfica . Todos los reactivos utilizados en este ejemplo se listan en la siguiente tabla: Reacción de acoplamiento del Fmoc-AA(23-35)-OH Aminoácido 9/ Eq. 6-CI-HOBT DIEA (g/ NMP (m TBTU (g/ HBTU (g/Eq NMP (mi DCM (n T. de (9/Eq.) Eq.) Eq.) acopl. (min.) 1o 3.61 /1.7 1.33/1.7 1.15/1.9 39.0 2.50/1.7 - 20.0 20.0 175 Lys(Boc) 2o 3.61 /1.7 1.33/1.7 1.16/1.9 39.0 2.48/1.7 - 20.0 20.0 180 Lys(Boc) 3o 3.61 /1.7 1.33/1.7 1.13/1.9 39.0 2.47/1.7 - 20.0 20.0 180 Lys(Boc) Anhídrido Acético 2.33/5.0 3.22/5.5 60.0 - 30.0 120 1o Val 2.62/1.7 1.33/1.7 1.13/1.9 39.0 2.51 /1.7 - 20.0 20.0 170 2° Val 2.62/1.7 1.33/1.7 1.17/1.9 39.0 2.49/1.7 20.0 20.0 180 3o Val 2.63/1.7 1.32/ 1.7 3.67/ 1.9 39.0 2.50/ .7 20.0 20.0 141 Anhídrido Acético 4.69/10.0 - 7.13/ 12.0 60.0 - 30.0 - 153 Leu 2.73/ 1.7 1.35/1.7 1.12/1.9 39.0 2.50/ 1.7 20.0 20.0 180 Trp(Boc) 4.03/ 1.7 1.33/1.7 1.78/3.0 39.0 2.50/ 1.7 - 20.0 20.0 180 Ala 2.41/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 lie 2.72/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Phe 3.00/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Glu(OtBu) 3.28/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Lys(Boc) 3.61/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Ala 2.40/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Ala 2.41/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Gln(trt) 4.72/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 Gln(trt) 4.72/ 1.7 1.31/ 1.7 1.78/ 3.0 39.0 - 2.93/ 1.7 20.0 20.0 180 C. División del fragmento de la resina construida La resina obtenida anteriormente se lavó con DCM 7 veces (6 vol. cada lavado) para eliminar el residuo de NMP, y la resina se enfrió con el último lavado de DCM hasta -5°C. El DCM se drenó, y se añadió una solución fría de TFA al 1%/ DCM (12 vol. a entre -5°C y -10°C) y se agitó durante 30 min. a 0°C. La solución de división se recogió en un recipiente que contenia piridina (1.3 equiv. de TFA) . Mientras el recipiente se calentó hasta 25°C, la resina se lavó con DCM 9 veces (10 vol.) y se añadió a la solución de división. La solución de DCM se combinó con agua (6 vol.) . La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacio. En este ejemplo el procedimiento de división se repitió una vez más. Se obtuvieron un total de 6.78 g de Fmoc-(Aib35) GLP-1 (23-35) -OH (rendimiento del 68.1%) con una pureza del 87.3% AN. Ejemplo 6 A. Obtención de la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Aib Se preparó la resina de 2-CTC cargada con Fmoc-Aib.

Las cantidades de reactivos utilizados se listan siguiente tabla: La resina de 2-CTC se cargó en un reactor peptidico de 500 mi y se expandió con 400 mi de DCM durante 30 min. El lecho se drenó y se añadió una solución de Fmoc-Aib-OH y DIEA en 8 volúmenes de DMF: DCM (87.5:12.5). La mezcla se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas a una temperatura de 25°C. El lecho se drenó y se lavó con 400 mi de DMF. Posteriormente, cualquier sitio activo restante en la resina 2-CTC se protegió en el extremo con 400 mi de solución de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. El lecho se drenó, se lavó una vez con 400 mi de DMF, una vez con 200 mi de DMF y cuatro veces con 350 mi de DCM. La resina se contrajo mediante lavados con 3 x 350 mi de IPA. La resina se secó hasta peso constante para proporcionar 47.56 g de resina cargada. El análisis mostró un factor de carga de 0.37 mmoles/ g. B. Síntesis en Fase sólida La síntesis en fase sólida se llevó a cabo comenzando con 25.0 g de resina de CTC-2 con Fmoc-Aib cargada con 0.37 mmoles/ g. La resina se expandió en DCM (250 mi) durante 30 min. a 25°C. El solvente de DCM se drenó, y la resina se lavó dos veces con DCM (6 vol. cada lavado) y tres veces con NMP (6 vol. cada lavado). La resina se trató entonces dos veces con piperidina al 20% en NMP (6 vol. cada tratamiento) para eliminar los grupos protectores Fmoc. Tras el segundo tratamiento con piperidina al 20%/ NMP, la resina se lavó seis veces con NMP (6 vol. cada lavado) hasta un ensayo cloranilo negativo. Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido y el 6-cloro-l-hidroxibenzotriazol (6- Cl-HOBT) , se disolvieron en 3.2 volúmenes de NMP (o DMF para Lys-34, Val-33 y Gln-23) y después se combinaron con DIEA a entre 10°C y 5°C. Se disolvió TBTU en 1.6 volúmenes de NMP (o DMF para Lys-34, Val-33 y Gln-23) a 10°C-5°C. Después se combinaron las dos soluciones. La solución resultante se añadió a un recipiente de reacción, y el recipiente se enjuagó con 1.6 volúmenes de DCM en el reactor, que se agitó entonces con la resina durante 2-3 horas a entre 25°C y 27°C. Se extrajo muestra para un ensayo Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. Si la reacción de acoplamiento estaba incompleta tras 3 horas (ensayo Kaiser positivo) , el recipiente de reacción se drenaba y se realizaba un reacoplamiento con nueva solución de aminoácido activado. Tras completar la reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 4 veces (6 vol. cada lavado). Entonces, la desprotección del grupo Fmoc y el ciclo de reacción de acoplamiento se repitieron para los restantes aminoácidos del fragmento (es decir, en el orden Lys(Boc)? Val? Leu- Trp(Boc)? Ala? Ile-? Phe? Glu(OtBu)? Lys (Boc)? Ala? Ala? Gln (trt) ) . Debido a un posible efecto de refuerzo entre la 2-metilalanina (Aib) y la resina de 2-CTC, existe una dificultad considerable en forzar hasta su finalización las primeras dos reacciones de acoplamiento de aminoácidos (Lys(Boc)-34 y Val-33). Las condiciones de acoplamiento de (Lys (Boc) -34 , Val-33) se modificaron para aumentar la utilización de ambos aminoácidos y el 6-C1-H0BT de 1.7 Equiv. a 2.5 Equiv. y la DIEA de 1.9 Equiv. a 3.0 Equiv. El solvente para la reacción de acoplamiento también se cambió de NMP a DMF para forzar la finalización de la reacción de acoplamiento. Además, en este ejemplo se utilizó anhídrido acético para proteger el extremo del material unido a la resina que no ha reaccionado tras las reacciones de acoplamiento de Lys (Boc) -34 y Val-33. Esto ha mejorado la eficiencia de la posterior purificación separando las impurezas del producto deseado durante la purificación cromatográfica . Todos los reactivos utilizados en este ejemplo se listan en la siguiente tabla: Reacción de acoplamiento de Fmoc-AA(23-35)-OH Material peso 6-CI- DIEA (g/ E DMF NMP TBTU DMF NMP DCM T. (9/ Eq.) HOBT (g/Eq.) (mi) (mi) (g/Eq. (mi) (mi) (mi) acop. (min) Lys(Boc) 10.84/ 3.93/ 3.63/ 3.0 80.0 - 7.44/ 40.0 - 40.0 170 2.5 2.5 2.5 Anhídrido acét 4.72/ 5.0 - 6.61/ 5.5 - 100.0 - . 50.0 - 120 Val 7.85/ 2.5 3.92/ 3.67/ 3.0 80.0 - 7.44/ 40.0 - 40.0 177 2.5 2.5 Anhídrido 9.48/ - 14.46/12.C 100.0 - - 50.0 - 120 acético 10.0 Leu 5.56/ 1.7 2.68/ 2.33/ 1.9 - 78.6 5.05 - 39.3 39.3 184 1.7 / 1.7 Trp(Boc) 8.30/ 1.7 2.70/ 2.28/ 1.9 - 78.6 5.05/ - 39.3 39.3 180 1.7 Ala 4.92/ 1.7 2.68/ 2.30/ 1.9 - 78.6 5.05/ - 39.3 39.3 177 1.7 He 5.56/ 1.7 2.70/ 2.26/ 1.9 - 78.6 5.06/ - 39.3 39.3 168 1.7 Phe 6.10/ 1.7 2.70/ 2.31/ 1.9 - 78.6 5.06/ - 39.3 39.3 168 1.7 Glu(OtBu) 6.72/ 1.7 2.67/ 2.29/ 1.9 - 78.6 5.05/ - 39.3 39.3 168 1.7 Lys(Boc) 7.39/ 1.7 2.70/ 2.29/ 1.9 - 78.6 5.05/ - 39.3 39.3 165 1.7 Ala 4.91/ 1.7 2.70/ 2.41/ 1.9 - 78.6 5.05/ - 39.3 39.3 180 1.7 Ala 4.92/ 1.7 2.68/ 2.32/ 1.9 - 78.6 5.03/ - 39.3 39.3 171 1.7 Gln(trt) 14.13 /2.5 3.94/ 3.71/ 3.0 80.0 - 7.42/ 40.0 - 40.0 185 2.5 C . División del fragmento de la resina construida La resina obtenida anteriormente se lavó con DCM 6 veces (6 vol. cada lavado) para eliminar la N P, y la resina se enfrió con el último lavado de DCM a -5°C. El DCM se drenó y se añadió una solución fría de TFA al 1%/ DCM (10 vol. a entre -5°C y -10°C) y se agitó durante 30 min. a 0°C. La solución de división se recogió en un recipiente que contenia piridina (1.3 equiv. de TFA) . Mientras el recipiente se calentaba a 25°C, la resina se lavó- con DCM 7 veces (6 vol.) y se añadió a la solución de división. La solución de DCM se combinó con agua (10 vol.) . La mezcla resultante se destiló bajo presión reducida para eliminar el DCM (350 torr a 28°C) . El fragmento se separó del agua por precipitación cuando se eliminó el DCM. El fragmento se lavó con agua y se secó a 30°C-35°C al vacio. En este ejemplo el procedimiento de división se repitió una vez más para conseguir una división completa. Se obtuvieron un total de 12.36 g de Fmoc- (Aib35) GLP-1 (23-35) -OH (rendimiento del 59.35%) con una pureza del 84.3% AN. Ejemplo 7 1. Lavado de la resina Empezando con la resina de Fmoc-Gly-O-2-CTC precargada (cargada de 0.18 a 0.65 mmoles/ g) , o de Fmoc-Aib-0-2-CTC precargada (cargada de 0.25 a 0.65 mmoles/ g) , se aplicó la química estándar de Fmoc. La resina se expandió primero en 10 volúmenes de DCM durante 30-60 min. Después se drenó el DCM y la resina se lavó 3-5 veces (5 min. cada vez) con 10 volúmenes de NMP. 2. Ciclo General de Síntesis : Utilizando una resina lavada de acuerdo con la Sección A de este Ejemplo 7, se logró la eliminación de Fmoc mediante dos tratamientos con una solución ~10x de piperidina al 20% en NMP (v/v) . Los tratamientos duraron 15-30 min. cada uno. La solución de piperidina/ NMP se drenó tras cada tratamiento. La resina se lavó entonces con NMP 4-5 veces (10 volúmenes, 5 min. cada uno) . Para preparar la solución de acoplamiento, se pesaron el aminoácido protegido con Fmoc (AA) y el HOBt (a 1.5-2.0 equiv.), se disolvieron en 4 volúmenes de NMP a 10°C y se combinaron con DIEA (1.5-2.0 equiv.). Se disolvió HBTU (1.5-2.0 equiv) en 3 volúmenes de NMP a 10°C. Las dos soluciones se combinaron y se mezclaron con 3 volúmenes de DCM durante 1-2 min. La solución resultante se añadió al recipiente de reacción y se mezcló con la resina bajo agitación durante 1.5-5 horas. Se extrajo una muestra para el ensayo de Kaiser para comprobar la finalización de la reacción. El acoplamiento incompleto se re-acopló. Tras finalizar la reacción de acoplamiento, la solución de acoplamiento se drenó y la resina se lavó con NMP 5 veces (10 volúmenes, 5 min. cada uno). A. Siguiendo el procedimiento de síntesis general, el fragmento Fmoc- GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC con la secuencia nativa se construyó paso a paso utilizando el mismo procedimiento de síntesis general, y se acopló un fragmento de acuerdo con la SEC ID No. 7 con el fragmento Fmoc-GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC resultante preparado en esta Sección A utilizando el procedimiento de síntesis general. B. Siguiendo el procedimiento de síntesis general, el fragmento Fmoc-GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC se construyó paso a paso. No obstante, las condiciones de eliminación de Fmoc se cambiaron por una solución de piperidina al 10% y DBU al 2% en NMP (v/v) en lugar de piperidina al 20% en NMP (v/v) . Además, los tiempos de tratamiento en la posición de AA14 [Fmoc-Ser (tBu) -] y la posición de AA13 [Fmoc-Thr (tBu) -] se extendieron a 1.5 h para finalizar la reacción. Utilizando el mismo procedimiento de síntesis general, se acopló un fragmento de acuerdo con la SEC ID No. 7 con el Fmoc-GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC resultante utilizando el procedimiento de síntesis general. C. Siguiendo el procedimiento de síntesis general, con la solución de eliminación de Fmoc de piperidina al 10% y DBU al 2% en NMP (v/v) , se construyó el fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 (11-22) -2-CTC paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con la SEC ID No. 7 con el Fmoc- (X17- 18) GLP-1 (11-22) -2-CTC resultante utilizando el procedimiento de síntesis general. D. Siguiendo el procedimiento de síntesis general, se construyó el fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con la SEC ID No. 7 con el Fmoc- (X17-18) GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC resultante utilizando el procedimiento de síntesis general.

E. Siguiendo el procedimiento de síntesis general de la sección D anterior, y con la excepción de las diferencias descritas en la siguiente tabla, se construyó un fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC paso a paso. Después se acopló el fragmento de acuerdo con la SEC ID No. 7 al fragmento Fmoc- (X17-18) GLP-1 ( 11-22 ) -2-CTC resultante utilizando el procedimiento de síntesis general. La siguiente tabla resume los detalles de los procedimientos de A a E en este Ejemplo: F. División del Fragmento: Para lograr la división de fragmento con respecto a cualquiera de los fragmentos peptídicos sintetizados en este Ejemplo, la resina de péptido obtenida se expande en 10 volúmenes de DCM durante 30 min. y se enfria hasta -10°C. El DCM se drena y se añade una solución de TFA al 1%/ DCM (10 volúmenes) y se agita durante 30 min. La solución de división se recoge en un recipiente que contiene piridina (2-3 equiv. en relación a TFA) . Mientras se calienta a 25°C, la resina se trata con TFA al 1%/ DCM (10 volúmenes) durante 5 min., y después se añade piridina (2-3 equiv. a TFA) . Tras otros 5 min. de agitación, se recoge la solución. La resina se lava entonces 4 veces con 10 volúmenes de DCM (5 min. cada uno). Las soluciones de todos los lavados y de la división se combinan y se mezclan con agua (proporción de agua/ DCM = ~l/4 en volumen) . La mezcla resultante se destila a una presión reducida para eliminar el DCM (350 torr/ 28°C) . El fragmento peptidico se separó del agua por precipitación cuando se elimina el DCM, y se filtra. El fragmento peptidico se lava con agua y se seca a 30°C al vacio. Ejemplo 8 - Síntesis en Solución: Adición de Arg Un fragmento (Aib35) GLP-1 (23-35) (que lleva protección de la cadena lateral de acuerdo con la Tabla A y es portador de protección Fmoc en N-terminal (9.11 g, 3.94 mmoles) se disolvió en DMSO (90 mi). A esta solución, se añadieron HOBt (2.42 g, 4 equiv.), HBTU (5.98 g, 4 equiv.), DIEA (3.44 mi, 5 equiv.) y H-Arg (2HC1)-NH2 (3.88 g, 4 equiv.) junto con 10 mi de DMSO. La reacción se agitó y se monitorizó mediante HPLC. Tras 4 horas, la reacción no había finalizado, por lo que se añadieron 2 mi de DIEA. La reacción se dejó toda la noche. Posteriormente se añadió piperidina (5 mi) a la mezcla de reacción. La eliminación de Fmoc se realizó en 2 horas. La mezcla de reacción se enfrio con agua helada (800 mi) y se agitó durante 40 min. El sólido blanco formado se filtró, se lavó con agua (400 mi) y se secó durante toda la noche para proporcionar el fragmento (Aib35) GLP-1 (23-36) (9.65 g, rendimiento en peso del 109%). Ejemplo 9 El fragmento (Aib8, X17"18) GLP-1 (7-22) (7.73 g, 2.88 mmoles) que contiene grupos de protección de las cadenas laterales de acuerdo con la Tabla A y protección Fmoc en el extremo N-terminal se disolvió en D SO (65 mi) . A esta solución, se le añadieron HOBt (0.73 g, 4.77 mmoles), HBTU (1.46 g, 3.85 mmoles), DIEA (0.71 mi, 7.40 mmoles), y el fragmento (Aib35) GLP-1 (23-36) (8.5 g, 3.45 mmoles) junto con 20 mi de DMSO. La reacción se agitó y monitorizó mediante HPLC. Tras 3 horas el acoplamiento se había completado. Entonces se añadió piperidina (5 mi) a la mezcla de reacción. La eliminación de Fmoc se realizó en 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió con agua helada (800 mi) y se agitó durante 30 min. El sólido blanco formado se filtró, se lavó con agua (400 mi) y se secó durante toda la noche para dar lugar al péptido protegido (Aib8, xl7~18, Aib35) GLP-1 (7-36) .

Ejemplo 10 - Desprotección global Un péptido preparado de acuerdo con el Ejemplo 9 (16.24 g) se trató con una solución de TFA/ DTT/ Agua (100 mi/ 5 g/ 2.0 mi) durante 2 horas y la solución resultante se vertió en MTBE (800 mi) en un baño de hielo. Tras 30 min. en agitación, el sólido blanco formado se filtró, se lavó con MTBE (400 mi) y se secó para proporcionar el producto peptidico crudo (16.0 g, rendimiento en peso del 138%) . El péptido desprotegido resultante se denomina a partir de este momento péptido "crudo". Ejemplo 11 - Purificación La purificación del péptido crudo se realizó en un Kromasil® C4, columna de 10 mieras, 2.0 x 25 cm y resultó en péptido purificado con una pureza del 98+% y un rendimiento del ~60% contenido/ contenido. La purificación involucra un primer paso de purificación cromatográfica a pH 2, seguida de un segundo paso a pH 9. Tras esta purificación, el péptido purificado puede manipularse o procesarse posteriormente de varias formas. Por ejemplo, la colección purificada resultante del segundo paso puede liofilizarse o pasarse a través de una columna de concentración y aislarse por precipitación. Ambos aislamientos darán lugar al péptido deseado (acetato) . Como resumen del proceso de dos pasos, se disolvió péptido crudo a 5 mg/ mi (en base a contenido) en una mezcla de acetonitrilo 10%/ agua (ácido acético 0.2 ) . Se realizaron inyecciones replicadas de 1000 mg (en base a contenido) utilizando un gradiente de acetonitrilo/ THF/ agua/ TFA, y se agruparon las fracciones de una pureza de -95%. También se agrupó una "fracción reciclada" a una pureza de ~70% que representa una recuperación del -34%. La fracción reciclada se re-inyectó utilizando el mismo gradiente de acetonitrilo/ THF/ agua/ TFA, y una colección de una pureza del -85% se combinó con la colección principal. El rendimiento de contenido a contenido para el primer paso de purificación cromatográfica es del 70%. La colección combinada del primer paso (pH 2) se purificó entonces posteriormente en un segundo paso en la misma columna Kromasil® C4 pero utilizando un gradiente de acetonitrilo/ THF/ agua/ acetato amónico (pH 8.8). Las fracciones se combinaron para dar lugar a una pureza del 98+% con una recuperación del -85% en el segundo paso. El rendimiento global de ambos pasos de purificación será del 60% (contenido/ contenido) . La colección del segundo paso combinada (pH 8.8) se concentró entonces utilizando la misma columna Kromasil® C4 pero utilizando un paso de gradiente de metanol/ agua/ acetato amónico. Las fracciones se combinaron y estaban listas para su aislamiento.

A. Obtención de la solución de péptido crudo: 8 g de péptido crudo se disolvieron en 500 mi de una solución de ácido acético 0.2N 90%/ acetonitrilo 10%. La solución se filtró, una vez a través de un filtro de 0.45 mieras Durapore (diámetro 47 itim) (Millipore) y luego a través de un filtro apilador de miera en disco Supor EKV (0.65/ diámetro 0.2 mm) (Pall Filters) . La solución de inyección cruda se analizó mediante HPLC y se encontró que contenia 5.02 mg (% peso) de péptido contenido por mi. (500 mi x 5.02 mg/ mi = 2512 mg péptido contenido) . B . Cromatografía - primer paso a pH~2 : Se realizaron cuatro inyecciones replicadas con la solución cruda 'bajo las siguientes condiciones: Columna: Fabricada por Kromasil con un empaquetamiento de C4, 10 mieras y las dimensiones 2.0 x 25 cm Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280 nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.) Temperatura de la columna: ambiente Velocidad de flujo: 13.0 mi/ min. (contrapresión -50 bar) Fase móvil: A = mezcla de ácido trifluoroacético 0.1%/ acetonitrilo 15%/ agua 85% B = mezcla de ácido trifluoroacético 0.1% / tetrahidrofurano 15%/ acetonitrilo 70%/ agua 15% Gradiente: El gradiente empieza con la fase móvil A 100% y se mantiene durante 0.1 minutos. Entonces la muestra se carga manualmente en la columna mediante la bomba C (véase a continuación la descripción de la bomba C) . Tras la carga de la muestra, se realiza un gradiente lineal de A 100% a A 83% durante 1 minuto. Entonces la fase móvil se mantiene con A 83% durante los próximos 11 minutos. Luego se realiza un segundo gradiente lineal con A 73% durante 10 minutos. Entonces la fase móvil se mantiene con A 73% durante los siguientes 15 minutos. Entonces se ha completado el proceso y se continúa con un aclarado de 10 minutos con B 100% seguido de un re-equilibrado de la columna de 20 minutos con A 100%. La muestra se cargó utilizando una bomba isocrática HP 1100 separada a 9.0 mi/ min. (bomba C) . Las impurezas eluidas inicialmente se separan del pico principal mediante un mantenimiento isocrático inicial de 11 minutos con A 83% seguido de un gradiente lineal con A 73% durante los siguientes 10 minutos. El pico de péptido principal se eluye entonces durante el mantenimiento de 15 minutos con A 73%. Las fracciones se agrupan durante este mantenimiento de 15 minutos con A 73%. C . Reciclado en el primer paso a pH~2 : La colección reciclada se obtiene de las fracciones en las que se ha determinado que tiene una pureza inferior a la que permite añadirlas a la colección combinada. Estas fracciones se combinaron de forma separada y se diluyeron con un volumen igual de agua. Se realizó una inyección de reciclado de nuevo en la columna a partir de esta colección combinada de forma separada. Se utilizaron las mismas condiciones cromatográficas y las fracciones con una pureza aceptable se combinaron, se diluyeron con un volumen igual de agua, y se añadieron a la colección combinada del primer paso. La carga con inyecciones de reciclado es significativamente inferior que con inyecciones crudas debido al aumento de impurezas que se eluyen cerca del pico del péptido. De promedio se realiza una inyección de reciclado por cada dos inyecciones crudas. D. Segundo paso de la cromatografía preparativa a pH 8.8: La colección combinada final del primer paso se purificó posteriormente mediante la re-cromatografia a pH 8.8. Utilizando el pH 8.8 en el segundo paso cambia significativamente el orden de elución de las impurezas, lo que permite una mayor limpieza en recuperaciones superiores. Las condiciones utilizadas para este segundo paso de cromatografía fueron las siguientes: Columna: Fabricada por Kromasil con un empaquetamiento de C4, 10 mieras y las dimensiones 2.0 x 25 cm Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280 nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.) Temperatura de la columna: ambiente Velocidad de flujo: 13.0 mi/ min. (contrapresión -50 bar) Fase móvil: A = mezcla de acetonitrilo 15%/ agua 85% que contiene 2 gramos por litro de acetato amónico y 1 mi por litro de hidróxido amónico concentrado B = mezcla de tetrahidrofurano 15%/ acetonitrilo 60%/ agua 25% que contiene 2 gramos por litro de acetato amónico y 1 mi por litro de hidróxido amónico concentrado. Gradiente: El gradiente empieza con la fase móvil A 100% y se mantiene durante 0.1 minutos. Entonces la muestra se carga manualmente en la columna mediante la bomba C. Tras la carga de la muestra, se realiza un gradiente lineal de A 100% a A 67% durante 2 minutos. Entonces la fase móvil se mantiene con A 67% durante los próximos 33 minutos. Entonces se ha completado el proceso y se continúa con un aclarado de 5 minutos con B 100% seguido de un re-equilibrado de la columna de 15 minutos con A 100%. La muestra se cargó utilizando una bomba isocrática HP 1100 separada a 9.0 mi/ min. (bomba C) . Tras los 30 minutos del paso de carga, se realizó un gradiente corto con A 100% a A 67% de los 30.2 a 32 min. El pico de péptido principal se eluyó durante el mantenimiento de 33 minutos con A 67%. Las fracciones se recogieron a partir de los 20 minutos tras la carga de la columna y finalizó después de la completa elución del pico principal. Las fracciones se recogieron durante aproximadamente 15 minutos. Las fracciones aceptables se agruparon y diluyeron con un volumen igual de agua. En esta etapa de la purificación es posible un reciclado pero las fracciones descartadas generalmente no contienen suficiente péptido para garantizar una inyección de reciclado. Esto puede ser factible si se realizan un gran número de inyecciones y se agrupan las fracciones descartadas para el reciclado. E . Paso de concentración : La colección combinada final del segundo paso se cargó en la misma columna y se eluyeron rápidamente utilizando una fase móvil diferente para concentrar el péptido para su aislamiento. Las condiciones utilizadas para este paso fueron las siguientes: Columna: Fabricada por Kromasil con un empaquetamiento de C4, 10 mieras y las dimensiones 2.0 x 25 cm Detector: Detector de ultravioleta fijado a 280 nm (ancho de banda 8 nm, 350/20 nm ref.) Temperatura de la columna: ambiente Velocidad de flujo: 13.0 mi/ min. (contrapresión -50 bar) Fase móvil: A = mezcla de metanol 10%/ acetato amónico 20 mM 90% B = mezcla de metanol 90%/ acetato amónico 20 mM % Gradiente: El gradiente empieza con la fase móvil A 100% y se mantiene durante 0.1 minutos. Entonces la muestra se carga manualmente en la columna mediante la bomba C. Tras la carga de la muestra, la fase móvil se mantiene con A 100% durante 5 minutos. Entonces la fase móvil se cambia inmediatamente a B 100% durante los próximos 20 minutos. Entonces se ha completado el proceso y se continúa con un reequilibrado de la columna de 15 minutos con A 100%. La muestra se cargó utilizando una bomba isocrática HP 1100 separada a 9.0 mi/ min. (bomba C) . Tras los 45 minutos del paso de carga, se realizó un mantenimiento corto con A 100% durante 5 minutos, luego se realizó un paso de gradiente con B 100% durante 20 minutos para eluir el péptido. El pico de péptido principal empezó a eluirse 2 minutos tras el gradiente con B 100%. Los siguientes 12 minutos de fracciones contenían péptido y se agruparon para su aislamiento.

Ejemplo 12 - Liofilización Se taró una botella de 1 litro de boca ancha de FLPE. A esta botella se le añadió la colección purificada (210 mi) de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-l(7-36) en acetonitrilo acuoso/ acetato amónico. El contenedor se enjuagó con agua desionizada 3 x 5 mi y los enjuagues se añadieron a la colección. Esta solución se agitó para homogeneizarla y luego se tapó y se congeló en nitrógeno liquido. La botella congelada se destapó y la boca se cubrió con un Kimwipe doblado sujeto con una banda de goma. La botella se situó en un vacutainer en el liofilizador y se liofilizó. Temperatura del condensador -89°C, presión 19 mieras . Tras 24 h el vacutainer se aireó para comprobar el progreso; aún había una bola de hielo audible presente. Se reinició la liofilización . Tras 18 h más la botella se extrajo del liofilizador y se comprobó el peso. El peso era inestable, con un rápido aumento debido a la naturaleza higroscópica del producto. El producto estático se transfirió rápidamente a un vial de centelleo tarado y se pesó, se obtuvieron 0.822 g de péptido . Ejemplo 13: Precipitación de péptido purificado En un recipiente, una solución de 100.5 mg de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-l(7-36) puro en 2 mi de acetato amónico 20 mM en MeOH/ agua (9:1 en volumen) se diluyó con 1 mi de acetato amónico 20mM en MeOH/ agua (9:1 en volumen) Con agitación, se añadieron lentamente 20 mi de isopropanol (IPA) al recipiente a entre 20°C y 25°C. Esta mezcla se puso turbia tras la adición de 15 mi de IPA. La agitación continuó durante toda la noche a entre 20°C y 25°C. El producto precipitado se filtró y se lavó mediante 5 mi de IPA y luego se secó a 25°C bajo vacio hasta un peso constante. Se obtuvieron 90.9 mg de péptido (una recuperación del 90.42%) . Ejemplo 14: Aislamiento de péptido purificado En un recipiente, una solución de 497.7 mg de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-l(7-36) puro en 10 mi de acetato .amónico 20 mM en MeOH/ agua (9:1) se diluyó con 6 mi de acetato amónico 20 mM en MeOH/ agua (9:1). Con agitación, 40 mi isopropanol (IPA) se añadieron lentamente en el recipiente a entre 20°C y 25°C durante 35 min. Esta mezcla se puso turbia tras la adición de 2 mi de IPA. La agitación continuó durante una hora a entre 20°C y 25°C. El producto precipitado se filtró y se lavó mediante 5 mi de IPA y luego se secó a 25°C bajo vacio hasta un peso constante. Se obtuvieron 458.4 mg de péptido (una recuperación del 92%). Ejemplo 15: Aislamiento de péptido purificado En un recipiente, se añadieron lentamente 900 mi de IPA en una solución en agitación de ~1000 mg de acetato de (Aib% Xi -ia, AibJ ) GLP-K7-36) purificado en 150 mi de acetato amónico 20 mM en MeOH/ agua (9:1) a través de una columna de concentración a entre 20°C y 25°C. Esta adición se completó a los 45 min. Esta mezcla se puso turbia tras la adición de 260 mi de IPA. La agitación continuó durante 40 min a entre 20°C y 25°C. El producto precipitado se filtró y se lavó mediante 5 mi de IPA y luego se secó a entre 20°C y 25°C bajo vacío hasta un peso constante. Se obtuvieron 746 mg de péptido (una recuperación del 74.6%) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un método para obtener un péptido insulinotrópico, caracterizado porque comprende uno o más de los siguientes pasos: h) proporcionar un primer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; i) proporcionar un segundo fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17"18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina , y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; j) acoplar el primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 11) , y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; k) proporcionar un cuarto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIA LVKX35 (SEC ID
2. No. 9), en el que X es un residuo de un aminoácido aquiral y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; 1) acoplar el cuarto fragmento peptidico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y los residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y m) acoplar el quinto fragmento al tercer fragmento para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17"18YLEGQAAKEFIA LVK X35R (SEC ID No. 13), y los residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los pasos de a) a f ) .
3. 3. - El método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque comprende otro paso de: n) eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAA KEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 5) y los homólogos de la misma, en donde cada uno de los símbolos X en las posiciones, 8, 10 y 35 independientemente indican un residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstaculizado esféricamente.
4. 4.- Un método para obtener un péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar un primer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), en donde X8 es un residuo de aminoácido que corresponde a Aib y X10 es un residuo de aminoácido que corresponde a glicina, y tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; b) proporcionar un segundo fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprolina, y los residuos de aminoácido de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; c) acoplar el primer fragmento al segundo fragmento para proporcionar un tercer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 TFTSDV X17_18YLEG (SEC ID No. 11), y los residuos de aminoácido de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; d) proporcionar un cuarto fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9), en los que X35 es un residuo de aminoácido que corresponde a Aib, y los residuos de aminoácido de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral ; e) acoplar el cuarto fragmento peptidico a arginina para proporcionar un quinto fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y los residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y f) acoplar el quinto fragmento al tercer fragmento seguido de la eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral para proporcionar un péptido insulinotrópico de fórmula HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 5) y los homólogos de la misma, en donde X8 y X35 son residuos de aminoácido que corresponden a Aib, y X10 es un residuo de aminoácido que corresponde a glicina.
5. 5.- El método para obtener un péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de: a) preparar un fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6) en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, o el fragmento es un homólogo de la misma que incluye los residuos X8 y X10, y tanto H como E, X8 y X10 incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y incorporando el fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico .
6. 6.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 5, caracterizado porque X es un residuo de aminoácido que corresponde a metilalanina .
7. 7. - El método de conformidad con las reivindicaciones 1 o 5, caracterizado porque X10 es un residuo de aminoácido que corresponde a glicina.
8. 8. - Un fragmento peptidico con la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6), caracterizado porque X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral, tanto H como E, X8 y X10 incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral.
9. 9. - El fragmento peptidico de conformidad con la reivindicación 8, en el que X8 caracterizado porque es un residuo de -aminoácido que corresponde a Aib y X10 es un residuo de aminoácido que corresponde a glicina.
10. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el péptido insulinotrópico incluye la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 5) HX8EX10TE'TSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKX35R y los homólogos de la misma, en donde todos los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 indican de forma independiente un residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstaculizado estéricamente; y en donde uno o más de los residuos de aminoácido incluye opcionalmente la protección de la cadena lateral.
11. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos uno de entre X y X es un residuo de Aib.
12. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque X10 es un residuo de glicina.
13. 13.- El método para obtener un péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de: b) preparar un fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17-18 es un residuo dipeptídico, de pseudoprolina; y la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico.
14. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el péptido insulinotrópico incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~ 18YLEGQAAKEFIA LVKX35R (SEC ID No. 13) y los homólogos de la misma, en donde los símbolos X8, X10 y X35 indican de forma independiente un residuo de aminoácido aquiral, X17"18 es un residuo de pseudoprolina, y los residuos de aminoácido incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral.
15. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o 13, caracterizado porque X17"18 tiene la fórmula en donde F representa el residuo de cualquier aminoácido que opcionalmente incluye protección de la cadena lateral, y tanto R1 como R2 son independientemente una porción de unión divalente adecuada.
16. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque F representa un residuo de Ser que incluye opcionalmente la protección de la cadena lateral.
17. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque R2 es -CH2-.
18. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque R1 es en donde tanto R3 como R4 son independientemente una porción monovalente seleccionada de entre H o alquilo inferior; o R3 y R4 pueden ser también co-miembros de una estructura en anillo.
19. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque tanto R3 como R4 es metilo.
20. 20. - Un péptido o un homólogo del mismo caracterizado porque incluye la secuencia de aminoácidos TFTSDVX YLEG (SEC ID No. 8) en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprol ina ; y los residuos de aminoácidos incluyen opcionalment e la protección de la cadena lateral.
21. 21. -El método para la obtención de un péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de : c) el acoplamiento del primer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 (SEC ID No. 6) , en donde X8 y X10 son ambos residuos de un aminoácido aquiral y tanto H como E incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral, con el segundo fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos T FT S DVX17"18YLEG (SEC ID No. 8) , en donde el residuo denotado mediante el símbolo X17"18 es un residuo dipeptídico de pseudoprol ina y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral, para proporcionar un tercer fragmento peptídico que incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17~18YLEG (SEC ID No. 11) y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y la incorporación del fragmento peptídico en un péptido insulinotrópico .
22. 22. - El método para la obtención de un péptido insulinotrópico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de: d) la preparación de un fragmento peptidico o un homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9), en los que X35 es un residuo de un aminoácido aquiral y los residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y la incorporación del fragmento peptidico en un péptido insulinotrópico.
23. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque X35 es un residuo de aminoácido de metilalanina .
24. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque además comprende el paso de: e) el acoplamiento del fragmento peptidico u homólogo del mismo que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEC ID No. 9) a una arginina para proporcionar un fragmento peptidico que incluye la secuencia de aminoácidos QAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 12), y los residuos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral .
25. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque R no incluye la protección de la cadena lateral.
26. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el péptido insulinotrópico incluye la secuencia de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~ 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEC ID No. 13) y homólogos de la misma, en donde los símbolos X8, X10 y X35 independientemente indican un residuo de aminoácido aquiral, y los residuos de aminoácidos de la secuencia incluyen opcionalmente la protección de la cadena lateral; y en donde X17"18 es un residuo de pseudoprolina .
27. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el péptido insulinotrópico incluye la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 5) HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R y homólogos de la misma, en donde cada uno de los símbolos X en las posiciones 8, 10 y 35 indican independientemente un residuo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstaculizado estéricamente; y en donde uno o más de los residuos de aminoácido opcionalmente incluyen la protección de la cadena lateral.
28. 28. - El método de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 7, 13 o de 21 a 25, caracterizado porque el péptido insulinotrópico posee la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR y homólogos de la misma.
29. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el péptido insulinotrópico posee la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKAibR y homólogos de la misma, que está amidada en el extremo C-terminal.