BRPI0713575A2 - mÉtodo para preparar um peptÍdeo insulinotràpico, fragmento de peptÍdeo, peptÍdeo ou uma contraparte do mesmo - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PREPARAR UM PEPTÍDEO INSULINOTRàPICO, FRAGMENTO DE PEPTÍDEO, PEPTÍDEO OU UMA CONTRAPARTE DO MESMO. Refere-se a presente invenção à preparação de peptídeos insulinotrópicos que são sintetizados utilizando-se uma abordagem de fase sólida e de solução ("hídrida"). De uma maneira geral, a abordagem inclui sintetizar três fragmentos intermediários de peptídeos diferentes utilizando-se química de fase sólida. A química de fase de solução é então usada para adicionar material aminoácido adicional a um dos fragmentos. Os fragmentos são então acoplados entre si na fase de solução de sólidos. O uso de uma pseudoprolina em um dos fragmentos alivia a síntese da fase sólida desse fragmento e também alivia o acoplamento de fase de solução subseqüente deste fragmento a outros fragmentos. A presente invenção é muito útil para a formação de peptídeos insulinotrópicos tais como GLP-1(7-36) e suas contrapartes naturais e não naturais.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR UM PEPTIDEO INSULINOTRÓPICO, FRAG- MENTO DE PEPTIDEO7 PEPTIDEO OU UMA CONTRAPARTE DO MESMO

A invenção refere-se a métodos para a pre- paração de peptídeos isulinotrópicos, particularmente peptídeo-1 semelhante a glucagona (GLP-I) e suas con- trapartes, mediante utilização de processos de fase só- lida e solução. A presente invenção refere-se igual- mente a fragmentos de peptideo intermediários que podem ser usados nestes métodos. São muitos os métodos descritos na litera-

tura para a sintase de peptideos (por exemplo, vide a patente U.S. N°. 6.015.881; Mergler et al. (1988) Te- trahedron Letters 29:4005-4 008; Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al. (eds), Peptideos, Chemistry e Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-52 6; Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; e Andersson et al. (2000) Bio- polymers 55:227-250). Os vários métodos de sintase são diferençáveis pelo estado físico da fase em que ocorre a sintase, ou seja, a fase liquida ou a fase sólida.

Na síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS), um grupo de aminoácidos ou peptídeos é ligado a uma resina de suporte sólida. Então, grupos de aminoá- cidos ou peptídeos sucessivos são vinculados ao pepti- deo ligado a suporte até ser formado o material de pep- tideo de interesse. 0 peptideo ligado a suporte é então tipicamente clivado do suporte e submetido a ulterior processamento e/ou purificação. Em alguns casos, a sín- tese de fase sólida proporciona um produto de peptídeo completamente formado; em outros casos o peptideo cli- vado a partir do suporte (isto é, utiliza-se um "frag- mento intermediário de peptideo") é usado na preparação de um produto de peptídeo maior, completamente formado.

Os fragmentos intermediários de peptídeos gerados a partir dos processos de fase sólida podem ser acoplados entre si na fase sólida ou em um processo sintético de fase líquida (chamado neste contexto de "síntese de fase de solução"). A síntese de fase de so- lução pode ser particularmente útil em casos onde a síntese de um peptídeo completamente formado de utili- dade por fase sólida é ou não possível ou não prático. Por exemplo, na síntese de fase sólida, os peptídeos mais longos eventualmente podem adotar uma conformação irregular enquanto ainda estão vinculados ao suporte sólido, tornando difícil adicionar aminoácidos ou mate- rial peptídico à cadeia em crescimento. Quando a cadeia se torna mais longa na resina de suporte, a eficiência das etapas de processo, tais como acoplamento e despro- teção, pode ser comprometida. Isto, por sua vez, pode resultar em tempos de processamento mais longos para compensar estes problemas, além de perdas graduais nos materiais de partida, tais como aminoácidos, co- reagentes, e solventes ativáveis. Estes problemas podem aumentar na medida em que aumenta o comprimento do pep- tídeo . Conseqüentemente, é relativamente incomum encontrar peptídeos completamente formados de mais que aminoácidos de comprimento sintetizados em um único fragmento utilizando-se somente um procedimento de fase sólida. Em vez disso, fragmentos individuais podem ser sintetizados separadamente na fase sólida, e então aco- plados na fase sólida e/ou de solução para construir o produto de peptideo desejado. Esta abordagem requer se- leção cuidadosa de candidatos de fragmentos. Embora al- guns princípios gerais possam orientar a seleção de fragmentos, quase sempre é requerido o teste empírico de candidatos a fragmentos. Estratégias de fragmentos que funcionam em um contexto podem não funcionar em ou- tros. Mesmo quando são descobertos candidatos a frag- mentos razoáveis, inovações de processo podem ser ainda necessárias para uma estratégia de síntese funcionar sob condições comercialmente razoáveis. Portanto, a síntese de peptídeos que utiliza esquemas híbridos é freqüentemente controversa, e em muitos casos é difícil prognosticar quais os problemas que são inerentes em um esquema de síntese até que seja executada a síntese verdadeira.

No acoplamento de fase de solução, dois fragmentos intermediários de peptideo, ou um fragmento intermediário de peptideo e um aminoácido reativo são acoplados em um solvente apropriado, usualmente na pre- sença de reagentes adicionais que promovem a eficiência e qualidade da reação de acoplamento. Os fragmentos in- termediários de peptídeos são dispostos de forma reati- va de maneira tal que o terminal-N de um fragmento tor- na-se acoplado ao terminal-C do outro fragmento, ou vi- ce versa. Adicionalmente, grupos de proteção de cadeia lateral, que estão presentes durante a síntese de fase sólida, são comumente retidos nos fragmentos durante o acoplamento de fase de solução para assegurar a reati- vidade específica das extremidades terminais dos frag- mentos. Estes grupos de proteção de cadeia lateral são tipicamente não-removidos até que tenha sido formado um peptídeo completamente formado.

Aperfeiçoamentos modestos em uma ou mais etapas no esquema sintético completo podem alcançar a- perfeiçoamentos significativos na preparação do peptí- deo completamente formado. Tais aperfeiçoamentos podem conduzir a uma grande economia total no tempo e reagen- tes, e também podem aperfeiçoar significativamente a pureza e rendimento do produto final.

Embora a discussão da importância dos a- perfeiçoamentos na síntese híbrida seja aplicável a qualquer espécie de peptídeo produzido utilizando-se estes procedimentos, é de particular importância no contexto de peptídeos que são terapeuticamente úteis e que são manufaturados para uso médico em uma escala co- mercial. A síntese de produtos farmacêuticos biomolecu- lares maiores, tais como peptídeos terapêuticos, pode ser muito dispendiosa. Por causa do custo dos reagen- tes, tempo de síntese, muitas etapas de síntese, adi- cionalmente a outros fatores, aperfeiçoamentos muito pequenos no processo sintético destes agentes farmacêu- ticos biomoleculares maiores podem ter um impacto sig- nificativo na condição de se é ainda economicamente vi- ável produzir tal produto farmacêutico. Tais aperfeiço- amentos são necessários devido a estes altos custos de produção para produtos farmacêuticos biomoleculares maiores tais como sustentados pelo fato de que, em mui- tos casos, existem poucas, se é que existem, alternati- vas terapêuticas adequadas para estes tipos de produtos farmacêuticos biomoleculares maiores.

Isto é observado claramente no caso do po- lipeptidio-1 semelhante a glucagona (GLP-I) e de suas contrapartes. Estes peptideos tinham implicação como possíveis agentes terapêuticos para o tratamento de di- abetes mellitus não dependentes de insulina do tipo 2, bem como distúrbios metabólicos relacionados, tais como obesidade. Gutniak, M.K., et al. , Diabetes Care

1994:17:1039-44.

Lopez et al. determinaram que GLP-I nativo foi de resíduos de 37 aminoácidos de extensão. Lopez, L. C., et al., Proc. MatI. Acad. Sei. USA., 80:5485- 5489 (1983). Esta determinação foi confirmada pelo tra- balho de Uttenthal, L. 0., et al., J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985). 0 GLP-I nativo pode ser representado pela notação GLP-I (1-37). Esta notação indica que o peptídeo tem todos os aminoácidos desde 1 (término-N) até 37 (término-C). 0 GLP-I nativo tem a β/104 seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO. 1: HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

Reportou-se que o GLP-I(1-37) nativo é ge- ralmente incapaz de mediar a biossintese de insulina, mas fragmentos biologicamente importantes deste peptí- deo têm propriedades insulinotrópicas. Por exemplo, o peptideo GLP-I de 31-aminoácidos de comprimento nativos (7-37) de acordo com SEQ XD NO. 2:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG é insulinotrópico e tem os aminoácidos desde a posição 7 (término N) até 37 (término C) do GLP-I nativo. O GLP-I (7-37) tem uma glicina terminal. Quando esta gli- cina está ausente, o peptideo resultante é ainda insu- linotropicamente ativo e é referido como sendo GLP-I (7-36) de acordo com a SEQ ID NO. 3:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR Freqüentemente o GLP-I (7-36) existe com a arginina C-terminal na forma amidada, e esta forma pode ser representada pela notação GLP-I (7-36)-NH2.

O GLP-I(1-37) geralmente é convertido na sua contraparte insulinotropicamente ativa in vivo. Por exemplo, GLP-I (1-37) é naturalmente convertido para GLP-I (7-37) in vivo. Este peptideo, por sua vez, tam- bém pode passar por processamento adicional mediante remoção proteolitica da glicina C-terminal para produ- zir GLP-I (7-36), que freqüentemente existe na forma amidada GLP-I(7-36)-NH2. Conseqüentemente, os tratamen- tos terapêuticos podem envolver a administração de GLP- 1 (1-37) ou uma contraparte do mesmo, com a expectativa de que se forma um derivativo insulinotropicamente ati- vo do mesmo in vivo. Entretanto, mais comumente, os tratamentos terapêuticos sob investigação envolvem a administração dos próprios fragmentos de GLP-I insuli- notropicamente ativos.

De acordo com a OS 6.887.849, a atividade

insulinotrópica de GLP-I(7-37), GLP-I(7-36) e GLP-I (7- 36)-NH2 parece ser especifica para as células beta pan- creáticas, onde estes peptídeos parecem induzir a bios- sintese de insulina. Isto torna estes peptideos e suas contrapartes farmaceuticamente aceitáveis de utilidade no estudo da patogênese no início da diabetes mellitus de adulto, uma condição caracterizada por hiperglicemia em que a dinâmica da secreção é anormal. Além disso, estes peptídeos semelhantes a glucagona serão de utili- dade na terapia e tratamento desta enfermidade, e na terapia e tratamento de hiperglicemia. de acordo com EP 1137667B1, estes peptídeos ou suas contrapartes farma- ceuticamente aceitáveis também podem ser de utilidade para o tratamento de outros tipos de diabetes, obesida- de, glucagonomas, distúrbios secretores das vias de respiração, distúrbio metabólico, artrite, osteoporose, enfermidade do sistema nervoso central, restenose, en- fermidade neuro-degenerativa, falha renal, falha cardí- aca congestiva, síndrome neofrótica, cirrose, edema pulmonar, hipertensão, e/ou distúrbios onde se deseja uma redução na ingestão de alimentos. O GLP-I(1-37) nativo e a suas contrapartes insulinotropicamente ativas, nativas, de acordo com SEQ ID NO. 1 até 3 são metabolicamente instáveis, tendo uma serai-vida de plasma de somente 1 a 2 minutos in vivo. O GLP-I administrado exogenamente também é rapidamente degradado. Esta instabilidade metabólica tem limitado o potencial terapêutico do GLP-I nativo e dos seus frag- mentos nativos.

Desenvolveram-se as contrapartes sintéti- cas dos peptideos GLP-I com estabilidade aperfeiçoada. Por exemplo, o peptideo de acordo com SEQ ID NO. 4 en- contra-se descrito em EP 1137667 BI:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR Este peptideo é similar ao GLP-I(7-36) na- tivo, exceto que o residuo aquiral do ácido alfa- aminoisobutirico (ilustrado esquematicamente pela abre- viatura Aib) aparece nas posições 8 e 35 no lugar dos aminoácidos nativos correspondentes nestas posições. O ácido alfa-aminobutirico aquiral também é conhecido co- mo metilalanina. Este peptideo pode ser designado pela

fórmula (Aib8'35) GLP-I (7-36) -NH2-

A EP 1137667 estabelece que o peptideo de acordo com a SEQ ID NO. 4 e suas contrapartes podem ser construídos como um único fragmento utilizando-se téc- nicas de fase sólida. A única abordagem de sintese de fragmento sugerida por EP 1137 667 é problemática. Como um ponto controverso, esta abordagem pode conduzir a altos níveis de epimerização no acoplamento de aminoá- cidos final, por exemplo, histidina no caso de (Aib 8'35) GLP-I (7-36), por exemplo. Adicionalmente, impure- zas podem ser difíceis de remover durante a purificação cromatográfica e o rendimento pode tender a ser muito baixo. Consequentemente, são necessárias estratégias aperfeiçoadas para sintetizar peptídeos de acordo com a SEQ ID NO.4 a fim de ser capaz de manufaturar este pep- tídeo e suas contrapartes em rendimentos, purezas e quantidades comercialmente aceitáveis.

Adicionalmente a estes assuntos, questões referentes à recuperação de produto e pureza de produto para a produção de peptídeos em grande escala, bem como manuseio, armazenamento e descarte de reagentes, podem afetar enormemente a viabilidade do esquema de síntese de peptídeos. Desta forma, existe uma necessidade cons- tante de processos de sintase de peptídeos capazes de produzirem eficientemente materiais peptídicos de inte- resse comercial em lotes de grande quantidade com ren- dimentos aperfeiçoados.

A presente invenção refere-se à preparação de peptídeos insulinotrópicos que são sintetizados uti- lizando-se uma abordagem de fase sólida e de solução ("híbrida"). De uma maneira geral, a abordagem inclui a sintetização de três fragmentos intermediários de pep- tídeo diferentes utilizando-se a química de fase sóli- da . Química de fase de solução é então usada para a- crescentar material de aminoácido adicional a um dos fragmentos. Os fragmentos são então acoplados entre si nas fases sólida e de solução. O uso de uma psudoproli- na em um dos fragmentos facilita a síntese de fase só- lida desse fragmento e também facilita o acoplamento de fase de solução subseqüente deste fragmento a outros fragmentos. A presente invenção é de grande utilidade para a formação de peptideos insulinotrópicos, tais co- mo GLP-I, GLP-I(7-36) e contrapartes naturais e não- naturais destes, particularmente GLP-I (7-36) e suas contrapartes naturais e não-naturais. De acordo com um aspecto, a presente in-

venção refere-se a um método de produzir um peptideo insulinotrópico, que compreende as etapas de:

a) preparar um fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID

NO. 6) em que X8 e X10 são cada um resíduos

de um aminoácido aquiral, ou o dito fragmen- to é uma contrapartes do mesmo que inclui os resíduos X8 e X10, cada um de Η, E, X8 e X10 opcionalmente que inclui proteção de cadeia lateral; e

b) incorporar o fragmento de peptideo em um peptideo insulinotrópico.

Preferentemente, X8 é um resíduo de amino- ácido correspondente a metil alanina (Aib); X10 é pre- ferentemente um resíduo de aminoácido correspondente a glicina.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento de peptideo dotado de uma seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são cada um resíduos de um aminoácido aquiral, cada um de Η, E, X8 e X10 que inclui opcionalmente proteção de ca- deia lateral. Preferentemente, X8 é um resíduo de ami- noácido correspondente a Aib e X10 é um resíduo de ami- noácido correspondente a glicina.

Segundo outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produzir um peptídeo insulino- trópico, que compreende as etapas de: a) preparar um fragmento de peptídeo ou uma

contraparte do mesmo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ. ID No. 8) em que o resíduo assinalado pelo símbolo

17 ~ 18

X e um resíduo de dipeptídeo de uma

pseudoprolina; e

b) incorporar o fragmento de peptídeo em um peptídeo insulinotrópico.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um peptídeo ou uma contraparte do

mesmo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17"

1 8

YLEG {SEQ. ID No. 8) em que o resíduo assinalado pelo símbolo χ17-18 é um resíduo de resíduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina; com o dito resíduo de aminoácidos que inclui opcionalmente proteção de cadeia lateral. Em um outro aspecto mais, a presente in-

venção refere-se ao método de produzir um peptídeo in- sulinotrópico de acordo com a reivindicação 1, que com- preende a etapa de: a) acoplar o primeiro fragmento de peptideo que

Λ Λ Λ

inclui a seqüência de aminoacidos HX EX (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são cada um resíduos de um aminoácido aquiral, cada um de H e E opcionalmente que inclui proteção

de cadeia lateral, ao segundo fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoá- cidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8), em que

ι η _ ι o χ

o resíduo assinalado pelo símbolo X1' 10 e um resíduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina,

com o dito resíduo de aminoácidos da se- qüência que inclui opcionalmente proteção de cadeia lateral, para proporcionar um terceiro fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 T FTS DVX17-

18YLEG (SEQ ID NO.11), o dito resíduo de a- minoácidos da seqüência que inclui opcio- nalmente proteção de cadeia lateral; e

b) incorporar o fragmento de peptideo em um peptideo insulinotrópico.

Segundo outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produzir um peptideo insulino- trópico, que compreende as etapas de:

a) preparar um fragmento de peptideo ou contra- parte do mesmo que inclui a seqüência de a-

minoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), em que X35 é um resíduo de um aminoácido a- quiral, os ditos resíduos da seqüência in- cluindo opcionalmente proteção de cadeia la- teral; e

b) incorporar o fragmento de peptídeo em um peptídeo insulinotrópico.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método destinado a produzir um peptideo insulinotrópico, que compreende uma ou mais das etapas de:

a) proporcionar um primeiro fragmento de pepti- deo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são ca- da um resíduos de um aminoácido aquiral, ca- da um de H e E incluindo opcionalmente pro- teção de cadeia lateral;

b) proporcionar um segundo fragmento de peptí- deo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17"18YLEG (SEQ ID NO.8), em que o re- síduo assinalado pelo símbolo χ17-18 é um re- síduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, o dito resíduo de aminoácidos da seqüência in- cluindo opcionalmente proteção de cadeia la- teral;

c) acoplar o primeiro fragmento ao segundo fragmento para proporcionar um terceiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO.11), o dito resíduo de aminoácidos da se- qüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral;

d) proporcionar um quarto fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKE- FIAWLVKX35 (SEQ ID NO.9), em que X35 é um re-

siduo de um aminoácido aquiral, o dito resí-

duo de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral;

e) acoplar o quarto fragmento de peptideo a ar- ginina a fim de proporcionar um quinto frag-

mento de peptideo que inclui a seqüência de

aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), os ditos resíduos da seqüência incluin- do opcionalmente proteção de cadeia lateral; e

f) acoplar o quinto fragmento ao terceiro frag-

mento a fim de proporcionar um peptideo in- sulinotrópico que inclui a seqüência de ami- noácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEGQAAKEFIAWL VK X35R (SEQ ID NO. 13), os ditos resíduos da seqüência incluindo opcionalmente proteção

de cadeia lateral.

Preferentemente, a presente invenção refe- re-se ao método de produzir um peptideo insulinotrópi- co, que compreende as etapas de: a) proporcionar um primeiro fragmento de pepti-

deo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são ca- da um resíduos de um aminoácido aquiral, com cada um de H e E incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral;

proporcionar um segundo fragmento de peptí- deo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resí- duo assinalado pelo símbolo χ17-18 é um resí- duo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, os ditos resíduos de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral;

acoplar o primeiro fragmento ao segundo fragmento para proporcionar um terceiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO.11), os ditos resíduos de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral;

proporcionar um quarto fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKE- FIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), em que X35 é um re- síduo de um aminoácido aquiral, os ditos re- síduo de aminoácido da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; acoplar o quarto fragmento de peptídeo a ar- ginina a fim de proporcionar um quinto frag- mento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), os ditos resíduos da seqüência incluin- do opcionalmente proteção de cadeia lateral; e

f) acoplar o quinto fragmento ao terceiro frag- mento a fim de proporcionar um peptideo in- sulinotrópico que inclui a seqüência de ami- noácidos HX8EX10TFTSDVX17_18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO.13), os ditos resíduos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral.

De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se ao método tal como descrito anteriormente neste contexto, que compreende uma etapa adicional de:

g) remover os grupos de proteção de cadeia la- teral a fim de proporcionar um peptideo in- sulinotrópico que inclui a seqüência de ami- noácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 5) e contrapartes do mesmo, em que cada um dos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 indica, independentemente, um resí- duo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstruído estericamente.

A remoção dos grupos de proteção de cadeia lateral é realizada preferentemente pelo emprego de uma solução de desproteção que compreende pelo menos um re- agente acidolítico e pelo menos um cátion depurador. Os reagentes acidolíticos para desproteção global são preferentemente selecionados a partir do grupo que con- siste de ácido trifluoroacético (TFA), HCl, ácidos de Lewis, tais como BF3 Et2O ou Me3SiBr, ácido fluoridrico liquido (HF), brometo de hidrogênio (HBr), ácido tri- fluorometano-sulfônico, e combinações dos mesmos. Os depuradores de cátions adequados são preferentemente selecionados a partir de ditiotreitol (DTT), anisol, p- cresol, etanoditiol e sulfeto de dimetila. A solução de desproteção também pode incluir água.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produzir um peptideo insulinotrópico, que compreende as etapas de:

a) proporcionar um primeiro fragmento de pepti- deo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são, cada um, resíduos de um aminoácido aquiral, cada um de Η, E, X8 e X10 incluindo opcional- mente proteção de cadeia lateral;

b) proporcionar um segundo fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17~18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resí- duo assinalado pelo símbolo χ17-18 é um resí- duo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, o di- to resíduo de aminoácidos da seqüência inclu- indo opcionalmente proteção de cadeia late- ral ;

c) acoplar o primeiro fragmento ao segundo fragmento para proporcionar um terceiro fragmento de peptideo que inclui a seqüência

de aminoácidos HX8EX10 TFTSDV X17-18YLEG (SEQ ID NO.11), o dito resíduo de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; d) proporcionar um quarto fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKE-

FIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), em que X35 é um resíduo de um aminoácido aquiral, o dito re- síduo de aminoácido da seqüência que inclui opcionalmente proteção de cadeia lateral; e) acoplar o quarto fragmento de peptídeo a ar-

ginina a fim de proporcionar um quinto frag- mento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), sendo que os ditos resíduos da seqüên- cia incluem opcionalmente proteção de cadeia

lateral; e

f) acoplar o quinto fragmento ao terceiro frag- mento a fim de proporcionar um peptídeo in- sulinotrópico da fórmula (SEQ. ID No. 5) HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R e contra-

partes do mesmo, em que cada um dos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 indica, indepen- dentemente, um resíduo de aminoácido aqui- ral, opcionalmente obstruído estericamente;

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e em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos in- clui opcionalmente proteção de cadeia lateral.

A Figura 1 é um diagrama esquemático de um esquema de síntese de acordo com a presente invenção.

O fragmento 12 é um fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos hx8ex10 (seq id NO. 6). O fragmento 14 é um fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos TiiFtsd15VX17^8YL20EG (seq id NO. 8). O fragmento 16 é um fragmento de pepti- deo que inclui a seqüência de aminoácidos q23AA25KEFiA30WLVKX35 (seq id NO. 9). O fragmento interme- diário 18 é um fragmento de peptideo que inclui a se- qüência de aminoácidos H7x8ex10tftsd15VX17_18YL20eg (seq id NO.11). O fragmento intermediário de peptideo 20 é um peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos q23AA25KEFiA30WLVKX35R (seq id NO.12). O produto 11 é o peptideo protegido desejado h7x8ex10tftsd15VX17_18YL20eg Qaa25Kefia30WLVKX35R (seq id N0.13) em que o Ser-Ser nas posições 17 e 18 está ainda na forma de pseudoprolina protegida. 0 diagrama encontra-se descrito mais adiante de forma mais detalhada.

As concretizações da presente invenção descritas adiante não têm a finalidade de ser completas ou de limitar a invenção às formas precisas expostas na descrição detalhada seguinte. em vez disso, as concre- tizações foram escolhidas e descritas de forma que ou- tros versados na técnica possam apreciar e compreender os princípios e práticas da presente invenção.

A presente invenção refere-se aos métodos sintéticos para produzir peptídeos tais como o peptí- deo-1 semelhante a glucagona (GLP-I), e contrapartes insulinotropicamente ativas naturais e não-naturais do mesmo, utilizando-se técnicas de fase sólida e/ou de solução. As moléculas de peptideo da invenção podem ser protegidas, desprotegidas ou parcialmente protegidas. A proteção pode incluir proteção N-terminal, proteção de cadeia lateral, e/ou proteção C-terminal. Muito embora a invenção seja de um modo geral dirigida à sintese destes peptideos semelhantes a glucagona, suas contra- partes, fragmentos e suas contrapartes, e produtos de fusão e as contrapartes destes, os ensinamentos da in- venção neste caso podem ser igualmente aplicados à sin- tese de outros peptideos, particularmente aqueles que são sintetizados utilizando-se uma combinação das abor- dagens de fase sólida e fase de solução. A invenção é igualmente aplicável à sintese de fragmentos intermedi- ários de peptideos associados com impurezas, particu- larmente impurezas de piroglutamato. As moléculas de GLP-I preferidas de utilidade na prática da presente invenção incluem GLP-I natural e não-natural (7-36) e contrapartes do mesmo.

Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "que inclui a seqüência de aminoácidos" prefe- rentemente significa "que tem a seqüência de aminoáci- dos".

Da maneira que é utilizada neste contexto, uma "contraparte" refere-se a análogos, derivados, com- postos de fusão, sais, ou assemelhados naturais e não- naturais de um peptideo. Da maneira que é utilizado neste contexto, um análogo de peptídeo de uma maneira geral refere-se a um peptídeo dotado de uma seqüência de aminoácidos modificada tal como por uma ou mais de substituições, supressões, inversões, e/ou adições de aminoácidos em relação a outro peptídeo ou contraparte de peptídeo. As substituições podem envolver um ou mais aminoácidos naturais ou não-naturais. As substituições preferentemente podem ser conservativas ou altamente conservativas. Uma substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoácido com outro que tem ge- ralmente a mesma carga eletrônica líquida e de uma ma- neira geral a mesma dimensão e forma. Por exemplo, ami- noácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticas ou alifáticas substituídas têm aproximadamente a mesma dimensão quando o número total de carbono e heteroáto- mos nas suas cadeias laterais diferem em não mais do que cerca de quatro. Eles têm aproximadamente a mesma forma quando o número de ramificações em suas cadeias laterais diferem em não mais do que cerca de uma ou du- as. Os aminoácidos com grupos fenila ou fenila substi- tuído nas suas cadeias laterais são considerados como tendo aproximadamente a mesma dimensão e forma. Adiante encontram-se listados cinco grupos de aminoácidos. A substituição de um aminoácido em um composto por outro aminoácido proveniente dos mesmos grupos de uma maneira geral resulta em uma substituição conservativa.

Grupo I: glicina, alanina, valina, leuci- na, isoleucina, serina, treonina, cisteina, metionina e aminoácidos que se apresentam não-naturalmente com ca- deias laterais Ci-C4 alifáticas ou Ci-C4 alifáticas hi- droxila substituídas (cadeia normal ou monoremifiçada).

Grupo II: ácido glutâmico, ácido aspártico e aminoácidos que se apresentam não-naturalmente com cadeias laterais C1-C4 alifáticas substituídas por áci- do carboxíIico (não ramificadas ou com um ponto de ra- mificação) .

Grupo III: lisina, ornitina, arginina e aminoácidos que se apresentam não-naturalmente com ca- deias laterais C1-C4 alifáticas substituídas por amina ou guanidino (não ramificadas ou com um ponto de rami- ficação) .

Grupo IV: glutamina, asparagina e aminoá- cidos que se apresentam não-naturalmente com cadeias laterais C1-C4 alifáticas substituídas por amida (não ramiifiçadas ou um ponto de remificação) .

Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tiro- sina e tritofan.

Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "contraparte" com maior preferência refere-se aos sais de um peptídeo, ou aos derivativos do mesmo que são amidados no término-C.

Uma "substituição altamente conservativa" é a substituição de um aminoácido com outro aminoácido que tem o mesmo grupo funcional na cadeia lateral e a- proximadamente do mesmo tamanho e forma. Aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticos ou ali- fáticos substituídos têm aproximadamente o mesmo tama- nho quando o número total de carbonos e heteroátomos nas suas cadeias laterais diferem em não mais do que dois. Eles têm aproximadamente a mesma forma quando e- Ies têm o mesmo número de ramificações nas suas cadeias laterais. Exemplos de substituições altamente conserva- tivas incluem valina para leucina, treonina para seri- na, ácido aspártico para ácido glutâmico e fenilglicina para fenilalanina.

Um "derivado de peptídeo" de uma maneira geral refere-se a um peptídeo, um análogo de peptídeo, ou outra contraparte de peptídeo que tem modificação química de um ou mais de seus grupos laterais, átomos de carbono alfa, grupo amino terminal, e/ou grupo de ácido carboxíIico terminal. A título de exemplo, uma modificação química inclui, sendo que não se fica limi- tado à mesma, adição de metades químicas, criação de novas ligações, e/ou remoção de metades químicas. Modi- ficações em grupos laterais de aminoácido incluem, sem limitação, acilação de grupos e-amino de lisina, N- alquilação de arginina, histidina, ou lisina, alquila- ção de grupos de ácido glutâmico ou aspártico carboxí- Iico, e desamidação de glutamina ou asparagina. Modifi- cações do grupo amino terminal incluem, sem limitação, as modificações de des-amino, N-alquila inferior, N-di- alquila inferior, e N-acila (por exemplo, -CO-alquila inferior). As modificações propostas para o grupo car- boxila terminal incluem, sem limitação, as modificações de amida, amida alquila inferior, dialquila amida, e éster de alquila inferior. Derivativos preferidos são os derivativos que são amidados no grupo carboxila ter- minal, por exemplo, a amida, amida de alquila inferior ou dialquila amida do peptideo. Desta forma, peptídeos parcialmente ou totalmente protegidos constituem deri- vados de peptídeos.

Na prática da presente invenção, um com- posto é dotado de atividade "insulinotrópica" se ele for capaz de estimular, ou provocar o estímulo de, ou ajudar a provocar o estímulo da síntese ou expressão do hormônio de insulina. Nas modalidades de prática prefe- ridas, a atividade insulinotrópica pode ser demonstrada de acordo com ensaios descritos nas patentes u.s. N°s. u.s. 6.887.849 e 6.703.365.

Nas concretizações preferidas, a presente invenção proporciona metodologias para sintetizar pep- tídeos sintéticos (X8, X10, X35) GLP-I (7-36) que têm a seguinte fórmula (SEQ. ID NO.5):

hx8ex10tfts dvs sylegqaakefiawlvkx35r

e contrapartes do mesmo, em que cada um dos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 indica indepen- dentemente um resíduo de aminoácido aquiral opcional- mente impedido estericamente. Qualquer um dos resíduos X8, X10, e/ou X35 opcionalmente pode incluir grupo (s) de proteção de cadeia lateral. Os peptídeos de acordo com esta fórmula diferem em relação ao glp-i(7-36) nativo pelo menos em que os resíduos nesses resíduos X8 e X35 aquirais, opcionalmente impedidos estericamente são substituídos pelo resíduo nativo de aminoácidos nas po- sições 8 e 35. O resíduo X10 pode ser derivado da gli- cina aquiral nativa ou de outro aminoácido aquiral. 0 uso dos aminoácidos X8, X10, e X35 aquirais não só ajuda a estabilizar o peptídeo resultante, mas também se des- cobriu que o uso destes aminoácidos como blocos cons- trutores também facilita a fácil rota de síntese da presente invenção tal como se encontra ilustrada na Fi- gura 1 e descrita mais adiante.

Uma concretização particularmente preferi- da de um peptídeo (X8, X10, X35) GLP-Il (7-36) que pode ser sintetizado de acordo com os princípios da presente invenção inclui um peptídeo de acordo com a fórmula (SEQ ID NO.4):

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

e contrapartes do mesmo, que preferente- mente é amidado no término-C. Este peptídeo usa o resí- duo aquiral de ácido alfa-aminoisobutírico {ou metila- lanina, ilustrado esquematicamente pela abreviatura Aib) uma vez que X8 e X35, preferentemente têm uma amida no término-C, utiliza um resíduo do G nativo na posição 10, e pode ser designado pela fórmula (Aib 8'35) GLP-I (7- 36)-NH2. Esta notação indica que um resíduo de aminoá- cido correspondente ao aminoácido "Aib" aparece nas po- sições 8 e 35 no lugar da alanina nativa. O ácido alfa- aminoisobutírico aquiral, também é conhecido como meti- lalanina. The peptídeo according to SEQ ID NO.4 is des- cribed in EP 1137667 Bi. A presença dos resíduos Aib nas posições 8 e 35 retarda a degradação metabólica no corpo, tornando este peptideo muito mais estável no corpo do que o peptideo GLP-I(7-36) nativo.

A presente invenção proporciona metodolo- gias aperfeiçoadas para produzir peptideos GLP-I(7-36) tais como o (Aib 8'35) GLP-I (7-36)-NH2. A titulo de exem- plo, a Figu ra 1 mostra esquematicamente um esquema i— lustrativo 10 para sintetizar peptideos GLP-I(7-36) e suas contrapartes. Acredita-se que o esquema 10 da Fi- gura 1 seja particularmente adequado para a síntese au- mentada de peptideos GLP-I(7-36). Os procedimentos de aumento gradual são realizados tipicamente para propor- cionar uma quantidade de peptideo de utilidade para distribuição comercial. Por exemplo, a quantidade de peptideo em um procedimento aumentado pode ser 500g, ou 1 kg por lote, e mais tipicamente, dezenas de kg até centenas de kg por lote ou mais. De acordo com concre- tizações preferidas, os métodos da invenção podem pro- porcionar aperfeiçoamentos tais como redução no tempo de processamento (síntese), aperfeiçoamentos no rendi- mento dos produtos, aperfeiçoamentos na pureza do pro- duto, e/ou redução na quantidade de reagentes e materi- ais de partida requeridos.

0 esquema de síntese 10 ilustrado na Figu- ra 1 utiliza uma combinação de técnicas de fases sólida e de solução para preparar o produto peptideo 11.

Tal como se encontra ilustrado na Figura 1, o esquema 10 envolve a sintetização de intermediá- rios de fragmentos de peptideos 12, 14, e 16 na fase sólida. O fragmento 12 compreende um fragmento de pep- tideo que inclui resíduo de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO.6:

HX8EX10

em que X8 e X10 são tais como definidos an- teriormente, ou é uma contraparte do mesmo que inclui os resíduos X8 e X10. Um ou mais dos resíduos de aminoá- cidos pode incluir grupos de proteção de cadeia lateral de acordo com práticas convencionais. Em algumas con- cretizações, o fragmento de peptídeo 12 pode ser ligado por resina via o término-C. Este fragmento opcionalmen- te pode carregar grupos de proteção término-N e/ou tér- mino-C. Constatou-se que Fmoc constitui um grupo de proteção de término-N particularmente útil com relação à síntese de fase sólida do fragmento de peptídeo.

0 fragmento 12 inclui os 4 resíduos de a- minoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 7 até 10 do peptídeo GLP-I(7-36) nativo, e portanto po- de ser representado pela notação (X8, X10)GLP-I(7-10). Nas concretizações preferidas, X8 é Aib e X10 é glicina de acordo com SEQ ID NO.7:

H7AibEG10

ou é uma contraparte do mesmo que inclui o resíduo Aib na posição 10. O fragmento de peptídeo de acordo com a SEQ ID NO. 7 pode ser representado pela notação (Aib8)GLP-I(7-10) para notar a substituição de Aib para a alanina nativa na posição 8 do GLP-I(7-10) nativo.

A sintese de fase sólida é de uma maneira geral real izada em uma direção que vai do término-C ao término-N do fragmento 12. Assim, o aminoácido X10, que se encontra presente na parte na parte terminal-C do fragmento, é o primeiro resíduo de aminoácido que é a- coplado ao suporte de resina de fase sólida. A síntese de fase sólida então prossegue ao adicionar-se consecu- tivamente resíduo de aminoácidos de uma maneira corres- pondente à seqüência desejada. A síntese do fragmento intermediário de peptídeo é concluída depois do resíduo terminal-N (for exemplo, o resíduo de histidina termi- nal-N (H)) ter sido adicionado à cadeia de peptídeo de estado nascente.

A seleção e uso de um fragmento de peptí- deo de acordo com SEQ ID NOS. 6 e 7 proporciona vanta- gens significativas dentro do esquema 10. Em primeiro lugar, H tende a ser um resíduo de aminoácido difícil de adicionar a uma cadeia de peptídeo em desenvolvimen- to devido, pelo menos em parte, a problemas de epimeri- zação. Entretanto, o fragmento 12 é suficientemente pe- queno para aliviar estas considerações em grande parte. No entanto, o fragmento 12 é suficientemente longo para ter dois centros quirais. Desta forma, uma única cris- talização permite que o fragmento seja purificado. Se o fragmento 12 terminou em Aib, o fragmento terá apenas um centro quiral e será, como uma conseqüência, mais difícil de purificar racemicamente. Fazer-se com que o G aquiral G seja posicionado no término-C também evita preocupações de racemização que poderiam de outro modo constituir-se em uma preocupação se o fragmento 12 fos- se até o final no término-C com o E quiral. Em resumo, a seleção do fragmento 12 como um bloco de construção de peptídeo torna mais fácil construir o fragmento, pu- rificá-lo e acoplar o mesmo a outro material peptidico. A seleção de fragmento também desfruta da baixa racemi- zação de H. Surpreendentemente, H é adicionado a este fragmento com um nível de epimerização muito baixo, por

exemplo, de cerca de 3% em peso, em algumas modalidades de prática.

O fragmento 14 é um fragmento de peptídeo que inclui resíduo de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO. 8 :

T11FTSD15VX17-18YL20EG

em que o resíduo assinalado pelo símbolo

17 ~ 18 '

X e um resíduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, mais bem definida adiante, ou é uma contraparte da mes- ma que inclui o X17"18 nas posições 17 e 18. 0 fragmento 14 inclui o resíduo de aminoácidos de uma maneira geral correspondente ao resíduo de aminoácidos nas posições 11 até 22 do peptídeo GLP-I(7-36) nativo, exceto que é usado o resíduo de dipeptídeo X17"18 de pseudoprolina em vez dos resíduos SS (Ser-Ser) que ocupam as correspon- dentes posições 17 e 18 do GLP-I(7-36) nativo.

Um ou mais dos resíduos de aminoácidos do fragmento 14 podem incluir grupos de proteção de cadeia lateral de acordo com práticas convencionais. Em algu- mas concretizações, o fragmento de peptideo 14 pode ser ligado por resina via o término-C. Este fragmento op- cionalmente pode suportar os grupos de proteção de tér- minos-N e/ou términos-C. Constatou-se que Fmoc consti- tui um grupo de proteção de terminal-N particularmente útil com relação à síntese de fase sólida do fragmento de peptideo. 0 fragmento de peptideo de acordo com SEQ ID NO.8 pode ser referido pela notação (X17~18) GLP-I (11- 22) para indicar a substituição do resíduo pseudoproli-

17 18

na X para o resíduo Ser-Ser nas posições 17 e 18. Tal como utilizado na prática da presente invenção, o termo pseudoprolina refere-se a um dipeptídeo que in- clui um resíduo de um aminoácido hidroxila funcional, tal como Ser ou Thr em que a cadeia lateral funcional hidroxila é protegida tal como um anel oxazolidina, instável a TFA, semelhante a prolina, entre o alfa- amino e o hidroxila de cadeia. Como uma conseqüência do anel de oxazolidina, o dipeptídeo funciona como um imi- tador de prolina reversível.

De uma maneira geral, um resíduo de pseu- doprolina típico quando incorporado em um peptideo pode ser representado pela fórmula

R^O

Vr2

/ τ

■Φ —N k2 em que Φ representa o resíduo de qualquer

aminoácido e cada um de R1 e R2 é independentemente uma metade de encadeamento bivalente adequada. Freqüente- mente, R1 é uma metade bivalente da fórmula

R4

3 1

R—Ci- em que cada um de R3 e R4 é independente- mente uma metade monovalente, as Hf ou alquila inferi- or, tal como metila. R3 e R4 também podem ser co- membros de uma estrutura de anel. Convenientemente, ca- da um de R3 e R4 é metila. No caso de um Ser protegido por anel de oxazolidinina, R2 é a metade bivalente CH2, enquanto no caso de Thr, R2 é a metade bivalente (CH3) CH.

0 termo "alquila inferior" refere-se a um radical de alquila monovalente de cadeia normal ou ra- mificada de um a seis átomos de carbono, preferentemen- te um a quatro átomos de carbono. Este termo é ainda exemplificado por radicais, tais como metila, etila, n- propila, isopropila, n-butila, s-butila, isobutila, t- butila, n-pentila, 3-metilbutila, n-hexila, 2- etilbutila e assemelhados. Resíduos de alquila inferior preferíveis são metila e etila, sendo que metila é es- pecialmente preferido.

Durante a desproteção, a metade R1 é cli- vada para proporcionar um resíduo de dipeptídeo de a- cordo com a seguinte fórmula: H

O

Φ—N-C-C' H T

I

OH

em que Φ e R2 são tais como definidos an- teriormente. Quando aplicado ao fragmento 14, o resíduo de pseudoprolina preferentemente corresponde a um resí- duo Ser-Ser, em que o Ser que fica mais próximo do tér- mino-C é protegido com o anel de oxazolidina e tem a seguinte estrutura:

Ό

-Φ—N

c/

A cadeia lateral portadora do Ser mais próximo do término-N é protegida, tal como por um grupo de proteção t-Bu. Quando a estrutura de anel de oxazo- lidina de proteção e t-Bu são separados, resulta no re- síduo Ser-Ser.

0 uso de tal mimético de prolina como um bloco de construção na síntese de fragmento 14 propor- ciona vantagens significativas no contexto da presente invenção. Primeiramente, a síntese de fase sólida do fragmento 14 é tremendamente facilitada. Quando a pseu- doprolina não é usada no decorrer da síntese de fase sólida do fragmento 14, podem ocorrer problemas signi- ficativos com as remoções de Fmoc a partir dos resíduos 13 até 11. Acredita-se que esta dificuldade pode ser decorrente da formação de folha beta. O uso da pseudo- prolina toma estas remoções de Fmoc muito mais fáceis acredita-se, pela redução do grau de formação de folha beta. Em segundo lugar, o acoplamento de fase sólida subseqüente do fragmento 14 ao fragmento 12, para for- mar o fragmento 18, descrito adiante, é enormemente fa cilitado. Na ausência do resíduo de pseudoproüna, a solubilidade de fragmento 18 em solventes de acoplamen to de fase de solução típica é muito deficiente. A pseudoproüna aumenta as características de solubilida de do fragmento 18, facilitando o acoplamento da fase de solução que envolve este fragmento ao fragmento 20 (vide discussão da Figura 1, adiante).

A síntese de fase sólida é de uma maneira geral realizada em uma direção do término-C para o tér- mino-N do fragmento 14. Desta forma, o aminoácido G, que se encontra presente na parte terminal-C do frag- mento, é o primeiro resíduo de aminoácido que é acopla- do ao suporte de resina de fase sólida. A síntese de fase sólida então prossegue ao adicionar-se consecuti- vamente resíduo de aminoácidos de uma maneira corres- pondente à seqüência desejada. Entretanto, o dipeptídeo de pseudoproüna X17~18 é adicionado à cadeia em cresci- mento em uma posição correspondente às posições 17 e 18 de GLP-I(7-36) em vez de adicionar consecutivamente um par dos resíduos Ser nativos nas posições 17 e 18. A síntese do fragmento de peptídeo intermediário é con- cluída depois que o resíduo terminal-N (por exemplo, o resíduo de treonina terminal-N (T)) foi adicionado à cadeia de peptídeo em fase de nascença.

O fragmento 16 é um fragmento de peptídeo, ou contraparte do mesmo, que inclui os resíduos de ami- noácidos de acordo com a SEQ ID NO.9:

Q23AA25KEFIA30WLVKX35

em que X35 é tal como definido anterior- mente, ou é uma contraparte do mesmo que inclui o resí- duo X35. Um ou mais dos resíduos de aminoácidos podem incluir grupos de proteção de cadeia lateral de acordo com práticas convencionais. 0 fragmento 16 inclui os resíduos de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos nas posições 23 até 35 do peptídeo nativo GLP-I(7-36), com a exceção de que X35 está na posição 35 em vez de o aminoácido nativo nessa posição. 0 fragmento 16 pode ser representado pela notação (X35)GLP-I(23-35).

Em algumas concretizações, o fragmento de peptídeo 16 pode ser ligado por resina por meio do tér- mino-C. Opcionalmente, este fragmento pode suportar a cadeia lateral, grupos de proteção de término-N e/ou término-C. Constatou-se que o Fmoc é um grupo de porte- ção término-N particularmente útil com relação à sínte- se de fase sólida do fragmento de peptídeo.

Em concretizações preferidas, X35 é Aib de acordo com SEQ ID NO.10:

Q23AA25KEFIA30WLVKAib35 ou uma contraparte do mesmo que inclui o

Aib na posição 35. 0 fragmento de peptideo de acordo com a SEQ ID NO.10 pode ser representado pela notação (Aib 35)GLP-I(23-35) para indicar a substituição de Aib pelo aminoácido nativo na posição 35 do GLP-I(7-36) na- tivo .

Observe-se que o fragmento 16 de acordo com as SEQ ID NOS. 9 e 10 não inclui ainda o residuo R (arg) na posição 36 no término-C. 0 Arg é subseqüente- mente acoplado ao término-C do fragmento 16 na fase de solução, preferentemente utilizando-se Arg sem proteção de cadeia lateral. Esta estratégia proporciona vanta- gens significativas dentro do esquema 10 da Figura 1, porque ele evita reações laterais indesejáveis que ten- dem a ocorrer como uma conseqüência do uso de Arg pro- tegido. Por exemplo, na desproteção de Arg protegido, subprodutos da desproteção podem tender a reagir com outros constituintes do peptideo, por exemplo, tripto- fan. Isto reduz a quantidade de peptideo desejado dis- ponível em bruto para purificação.

A síntese de fase sólida é de uma maneira geral realizada em uma direção a partir do término-C para o término-N do fragmento 16. Desta forma, o amino- ácido X35, que está presente na parte de término-C do fragmento, é o primeiro resíduo de aminoácido que está acoplado ao suporte de resina de fase sólida. A síntese de fase sólida então prossegue ao adicionar-se consecu- tivamente o resíduo de aminoácidos de uma maneira cor- respondente à seqüência desejada. A síntese do fragmen- to de peptideo intermediário é completada depois do re- síduo terminal-N (for exemlo, o resíduo de glutamina terminal-N (Q)) ter sido adicionado à cadeia de pepti- deo de condição nascente. Qualquer um dos aminoácidos usados na síntese de fragmento 16 pode incluir proteção de cadeia lateral de acordo com as práticas convencio- nais .

Devido ao impedimento estérico próximo à resina de suporte carregada por X35, o acoplamento de lisina (34) e valina (33) à cadeia de peptideo de cres- cimento pode ser problemático. Mesmo com um excesso de aminoácido, é difícil forçar estas reações de acopla- mento para a conclusão. A escolha de solvente e/ou ca- peamento extremo pode ajudar a aliviar este problema. Constatou-se que a natureza do solvente de acoplamento pode provocar impacto no grau em que o acoplamento a- tinge a conclusão. Em um conjunto de experiências, por exemplo, realizaram-se reações de acoplamento em uma relação 3:1 NMP/DCM, 1:1 NMP/DCM, 1:1 DMF/DCM, e 3:1 DMF/DCM. As relações nestas combinações de solventes são numa base por volume. NMP refere-se a N-metil prro- lidona, DCM refere-se a diclorometano, e DMF refere-se a dimetílformamida. Constatou-se que as reações de aco- plamento prosseguiram até à conclusão quando se utili- zou 1:1 DMF/DCM.

Os capeamentos extremos depois da cada um dos acoplamentos de lisina e valina também podem ser usados para impedir que material suportado por resina

que não reagiu prossiga em outras reações de acoplamen-

to. 0 material de capeamento extremo é mais facilmente

removido durante a purificação, se desejado. Podem ser

utilizadas técnicas de capeamento extremo convencio- nais .

Continuando a fazer-se referência à Figura 1, os fragmentos 12, 14, e 16, em conjunto com Arg, são montados para completar o peptídeo 11 desejado. Para que isto seja obtido, o fragmento 12 é adicionado ao fragmento 14 na fase sólida para produzir o fragmento intermediário maior 18 que incorpora resíduos de amino- ácidos de acordo com SEQ ID NO.11:

H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG

em que X8, X10, e X17"18 são tais como defi- nidos anteriormente. Eiri uma concretização preferida, X8 é Aib, X10 é o G nativo, e X17"18 é um resíduo de dipep- tídeo de pseudoprolina como definido anteriormente. Es- te fragmento intermediário de peptídeo pode ser repre- sentado pela notação (X8, X10, χ17~ΐ8) GLP-I (7-22).

A Figura 1 mostra ainda que Arg é adicio- nado ao término-C de fragmento 16 na fase de solução para proporcionar o fragmento de peptídeo intermediário maior 20 que incorpora resíduos de aminoácidos de acor- do com SEQ ID NO.12:

Q23AA25KEFIA30WL VKX35R em que X35 é tal como definido anterior- mente e é preferentemente Aib. Preferentemente, o Arg adicionado ao fragmento de peptídeo desta maneira não inclui proteção de cadeia lateral. Este fragmento de peptideo intermediário 20 pode ser representado pela notação (X35)GLP-I(23-36) . Os fragmentos de peptideo 18 e 20 são então acoplados na fase de solução para pro- porcionar o peptideo protegido desejado 11 de acordo com SEQ ID NO.13, em que o Ser-Ser nas posições 17 e 18 está ainda na forma de pseudoprolina protegida:

H7X8EX10TFTS D15VX17-18YL20EG QAA25KE FIA30WLVKX35R

O peptideo 11 pode ser designado pela no- tação (X8, X10, X17"18, X35) GLP-I (7-36) . Na extensão em que os outros aminoácidos sustentam proteção de cadeia lateral, esta proteção desejavelmente é mantida durante esta etapa.

Na realização do esquema de reação da Fi- gura 1, as sínteses de fase sólida e fase de solução podem ser realizadas por meio de métodos padrão conhe- cidos na indústria. Nas modalidades de prática repre- sentativas, os peptídeos são sintetizados na fase sóli- da utilizando-se química pela qual aminoácidos são adi- cionados do término-C ao término-N. Desta maneira, o grupo de aminoácidos ou peptídeos próximo ao término-C de um fragmento particular é o primeiro a ser adiciona- do à resina. Isto ocorre pela reação da funcionalidade do término-C do grupo de aminoácidos ou peptídeos com funcionalidade complementar no suporte de resina. O la- do de término-N do grupo de aminoácidos ou peptideos é ocultado para impedir reações laterais indesejáveis. O grupo de aminoácidos ou peptideos desejavelmente também inclui proteção de cadeia lateral. Então, grupos de a- minoácidos ou peptideos sucessivos são vinculados ao material de peptideo ligado a suporte até ser formado o peptideo de interesse. A maior parte destes também in- clui proteção de cadeia lateral de acordo com práticas convencionais. Com cada acoplamento sucessivo, o grupo de mascaramento na extremidade de término-N do material de peptideo ligado por resina é removido. Faz-se então reagir este com o término-C do aminoácido seguinte, cu- jo término-N é ocultado. 0 produto de síntese de fase sólida é deste modo uma ligação de peptideo a um supor- te de resina.

Pode ser usado qualquer tipo de suporte adequado na prática de síntese de peptideo de fase só- lida. Nas concretizações preferidas, o suporte compre- ende uma resina que pode ser preparada a partir de um ou mais polímeros, copolímeros ou combinações de polí- meros, tais como poliamida, polissulfamida, polietile- nos substituídos, polietilenoglicol, resinas fenólicas, polissacarídeos, ou polistireno. O suporte de polímero também pode ser qualquer sólido que seja suficientemen- te insolúvel ou inerte aos solventes usados na síntese de peptideos. Tipicamente, o suporte sólido inclui uma metade de ligação à qual o peptideo em crescimento é acoplado durante a síntese e que pode ser clivado sob condições desejadas para liberar o peptídeo do suporte. Suportes sólidos que são adequados podem ter agentes de ligação que são foto-cliváveis, TFA-cliváveis, HF- cliváveis, íon fluoreto-cliváveis, cliváveis redutora- mente; Pd(0)-cliváveis; nucleofilicamente-cliváveis; ou radicalmente-cliváveis. As metades de ligação preferi- das são cliváveis sob condições tais que os grupos de cadeia lateral do peptídeo clivado são ainda protegidos de forma substancialmente global.

Em um método de síntese preferido, os fragmentos intermediários de peptídeo sintetizados em um suporte sólido sensível a ácido que inclui grupos de tritila, e com maior preferência em uma resina que in- clui grupos de tritila dotados de grupos de cloro pen- dentes, por exemplo, uma resina de cloreto de 2- clorotritila (2-CTC) (Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30 (30) : 3943-3946) . Exemplos também incluem re- sina de cloreto de tritila, resina de cloreto de 4- metiltritila, resina de cloreto de 4-metóxitritila, re- sina de 4-aminobutan-l-ol 2-clorotritila, resina de 4- aminometiIbenzoila 2-clorotritila, resina de 3- aminopropan-l-ol 2-clorotritila, resina de 2- clorotritila de ácido bromoacético, resina de 2- clorotritila de ácido cianoacético, resina de 2- clorotritila de ácido 4-cianobenzóico, resina de 2- clorotritila de glicinol, resina de 2-clorotritila pro- piônica, resina de 2-clorotritila de etileneglicol, re- sina de 2-clorotritila de N-Fmoc hidroxilamina, resina de 2-clorotritila de hidrazina. Alguns suportes sólidos preferidos incluem polistireno, o qual pode ser copoli- merizado com divinilbenzeno, para formar material de suporte ao qual são amarrados os grupos reativos.

Outras resinas que são usadas na síntese de fase sólida incluem as resinas "Wang", que compreedem um copolímero de estireno e divinilbenzeno com grupos de amarração de 4-hidroximetilfenil-oximetil (Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc.), e resina de ácido 4-hidroxi-metil-3-

metoxifenoxibutírico (Richter et al. (1994), Tetrahe- dron Letters 35(27):4705-4706). As resinas de Wang, de cloreto de 2-clorotritila, e de ácido 4-hidroximetil-3- metoxifenoxi butírico podem ser adquiridas a partir de, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Califórnia.

A fim de preparar uma resina para síntese de fase sólida, a resina pode ser pré-lavada em solven- te (s) adequado(s). Por exemplo, uma resina de fase só- lida, tal como uma resina 2-CTC é adicionada a uma câ- mara de peptídeo e pré-lavada com um solvente adequado. 0 solvente de pré-lavagem pode ser escolhido com base no tipo de solvente (ou mistura de solventes) que é u- sado na reação de acoplamento, ou vice-versa. Os sol- ventes que são adequados para a lavagem, e também a re- ação de acoplamento subseqüente incluem diclorometano (DCM), dicloroetano (DCE), dimetilformamida (DMF), e assemelhados, bem como misturas destes reagentes. Ou- tros solventes de utilidade incluem DMSO, piridina, clorofórmio, dioxana, tetraidrofurano, acetato de eti- la, N-metilpirrolidona, e as suas misturas. Em alguns casos o acoplamento pode ser realizado em um sistema de solventes binários, tais como uma mistura de DMF e DCM sob uma proporção em volume na faixa de 9:1 até 1:9, mais comumente 4:1 até 1:4.

As sínteses da presente invenção preferen- temente são realizadas na presença de grupos de prote- lo ção adequados a não ser que de outro modo indicado. A natureza e uso dos grupos de proteção é amplamente co- nhecida na técnica. De uma maneira geral, um grupo de proteção adequado é qualquer espécie de grupo que possa ajudar a impedir que o átomo ou metade à qual ele está vinculado, por exemplo, oxigênio ou nitrogênio, parti- cipe em reações indesejáveis durante o processamento e síntese. Os grupos de proteção incluem grupos de prote- ção de cadeia lateral e grupos de proteção amino- ou terminal-N. Os grupos de proteção também podem impedir a reação ou ligação de ácidos carboxílicos, tióis e as- semelhados .

Um grupo de proteção de cadeia lateral re- fere-se a uma metade química acoplada à cadeia lateral (isto é, o grupo R na fórmula de aminoácido geral H2N- C(R)(H)-COOH) de um aminoácido que ajuda a impedir que uma parte da cadeia lateral reaja com produtos químicos usados nas etapas de síntese, processamento e outras de peptídeos. A escolha de um grupo de proteção de cadeia lateral pode depender de vários fatores, por exemplo, tipo de síntese realizada, processamento ao qual o pep- tídeo será submetido, e o produto intermediário ou pro- duto final desejado. A natureza do grupo de proteção de cadeia lateral também depende da natureza do aminoácido propriamente dito. De uma maneira geral, um grupo de proteção de cadeia lateral é selecionado de forma tal que ele não seja removido durante a desproteção dos grupos α-amino durante a síntese de fase sólida. Conse- qüentemente, o grupo de proteção α-amino e o grupo de proteção de cadeia lateral, tipicamente, não são os mesmos.

Em alguns casos, e na dependência do tipo de reagentes usados na síntese de fase sólida e em ou- tro processamento de peptídeos, um aminoácido pode não requerer a presença de um grupo de proteção de cadeia lateral. Tais aminoácidos tipicamente não incluem um oxigênio, nitrogênio reativo, ou outra metade reativa na cadeia lateral. Exemplos de grupos de proteção de cadeia

lateral incluem acetil (Ac), benzoila (Bz), terc- butila, trifenilmetila (tritila), tetraidropiranil, benzil éter (Bzl) e 2,6-diclorobenzil (DCB), t- butoxicarbonil (Boc), nitro, p-toluenossulfonila (Tos), adamantiloxicarbonila, xantila (Xan), benzilaa, 2,6-

diclorobenzila, metila, etila e éster de t-butila, ben- ziloxicarbonila (Z), 2-clorobenziloxicarbonila(2-C1-Z), t-amiloxi-carbonila (Aoc), e grupos de proteção do tipo uretana aromático ou alifático, grupos foto-instáveis, tais como nitro veratril oxicarbonil (NVOC); e grupos instáveis de fluoreto, tais como trimetilsilila oxicar bonila (TEOC).

Grupos de proteção de cadeia lateral pre- feridos para aminoácidos comumente usados para sinteti zar peptideos GLP-I na prática da presente invenção es tão ilustrados na Tabela A exposta em seguida:

Tabela A:

Aminoácido Grupo(s) de Proteção de Cadeia Lateral Aib Nenhum Ala Nenhum Arg Nenhum Asp t-butil éster (OtBu) Gln tritila (trt) Glu OtBu Gly Nenhum His tritila (trt) Ile Menhum Leu Nenhum Lys t-butiloxicarbonil (Boc) Aminoácido Grupo(s) de Proteção de Cadeia Lateral Phe Nenhum Ser t-butila (tBu) X17"18 (corres- pondente a Ser-Ser) anel de oxazolidina en- tre alfa nitrogênio e OH de Ser mais próximo do término-C; tBu em outro Ser Thr tBu Trp Boc Tyr tBu Val Nenhum

Um grupo de proteção amino-terminal inclui uma metade química acoplada ao grupo alfa amino de um amino ácido. Tipicamente, o grupo de proteção amino- terminal é removido em uma reação de desproteção antes da adição ao aminoácido seguinte a ser adicionado à ca- deia de peptídeo de crescimento, mas pode ser mantido quando o peptídeo é clivado do suporte. A escolha de um grupo de proteção amino-terminal pode depender de vá- rios fatores, por exemplo, tipo de síntese realizada e do produto intermediário ou produto final desejado. Exemplos de grupos proteção amino- terminais incluem (1) grupos de proteção do tipo acila, tais como formila, acrilila (Acr), benzoila (Bz) e ace- tila (Ac); (2) grupos de proteção do tipo aromático, tais como benziloxicarbonil (Z) e Z substituído, tais como p-clorobenziloxicarboniIa, p-nitrobenziloxicar- bonil, p-bromobenζiloxicarboni1, p-metoxibenziloxicar- bonil; (3) grupos de proteção de uretana alifática, tais como t-butiloxicarbonil (Boc), diisopropilmetoxi- carbonil, isopropiloxicarbonil, etoxicarbonil, aliloxi- carbonil; (4) grupos de proteção do tipo uretana ciclo- alquila, tais como 9-fluorenil-methiloxicarbonil (Fmoc), ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, e cicloexiloxicarbonil; e (5) grupos de proteção do tipo tiouretana, tais como feniltiocarbonila. Grupos de pro- teção preferidos incluem 9-fIuorenil-metiloxicar-bonil (Fmoc), 2-(4-bifenilil)-propil(2)oxicarbonil (Bpoc), 2- fenilpropil(2)-oxicarbonil (Poc) e t-butilo-xicarbonil (Boc).

A química de Fmoc ou semelhante a Fmoc é

altamente preferida para a síntese de peptídeo de fase sólida, uma vez que a clivagem do peptídeo resultante em um estado protegido é relativamente direto de reali- zar utilizando-se agentes de clivagem suavemente áci- dos. Esta espécie de reação de clivagem é relativamente limpa em termos de subprodutos resultantes, impurezas, e outros, tornando técnica e economicamente viável re- cuperar peptídeo em uma base de grande escala a partir de lavagens de inchamento e contração, aumentando o r4endimento. Tal como utilizado neste caso, "grande es- cala" com relação à sintase de peptídeo de uma maneira geral inclui a sintase de peptídeos na faixa de pelo menos 500 g, com maior preferência pelo menos 2 kg por lote. Tipicamente, a síntese em grande escala é reali- zada em grandes vasos de reação, tais como vasos de re- ação de aço, os quais podem acomodar quantidades de re- agentes, tais como resinas, solventes, aminoácidos, a- gentes químicos para acoplamento, e reações de despro- teção, que são dimensionados para permitir a produção de peptídeos na faixa do quilograma à tonelada métrica. Adicionalmente, o grupo de proteção de Fmoc pode ser dividido seletivamente a partir de um peptídeo em rela- ção aos grupos de proteção de cadeia lateral de forma que as proteções de cadeia lateral são deixadas no lo- cal quando o Fmoc é dividido. Esta espécie de de sele- tividade é importante durante o acoplamento do aminoá- cido para reduzir ao mínimo reações de cadeia lateral. Adicionalmente, os grupos de proteção de cadeia lateral podem ser clivados seletividade para os remover em re- lação ao Fmoc, deixando o Fmoc na posição. Muito vanta- josamente, pode-se confiar nesta última seletividade durante os esquemas de purificação que se encontram descritos mais adiante.

The reação de acoplamento de fase sólida pode ser realizada na presença de um ou mais compostos que aumentam ou aperfeiçoam a reação de acoplamento. Os compostos que podem aumentar a taxa de reação e reduzir a taxa de reações laterais incluem sais de fosfônio ou de urônio que podem, na presença de uma base terciária, por exemplo, diisopropiletilamina (DIEA) e trietilamina (TEA), converter aminoácidos protegidos em espécies a- tivadas (por exemplo, BOP, PyBOPO, HBTU, e TBTU todos eles geram ésteres HOBt). Outros reagentes ajudam e im- pedir a racemização pela provisão de um reagente de proteção. Estes reagentes incluem carbodiimidas (por exemplo, DCC ou WSCDI) com um nucleófilo auxiliar adi- cionado (por exemplo, 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 1- hidroxi-azabenzotriazol (HOAt), ou HOSu). O método de anidrido misturado, utilizando-se cloroformato de iso- butila, com ou sem um nucleófila auxiliar adicionado, também pode ser utilizado, da mesma forma que pode o

método azida, devido à baixa racemização associada com ele. Estes tipos de compostos também podem aumentar a taxa de acoplamentos mediados por carbodiimida, bem co- mo impedir a desidratação dos resíduos Asn e Gln. Depois de o acoplamento ser determinado

como concluído, a mistura de reação de acoplamento é lavada com um solvente, e o ciclo de acoplamento é re- petido para cada um dos resíduos de aminoácidos subse- qüentes do material de peptídeo. A fim de acoplar o a- minoácido seguinte, a remoção do grupo de proteção ter- minal-N (por exemplo, um grupo Fmoc) a partir do mate- rial de ligação de resina é realizada tipicamente medi- ante tratamento com um reagente que inclui 20-50% (em uma base em peso) de piperidina em um solvente, tal co- mo N-metilpirrolidona (NMP) ou dimetilformamida (DMF). Depois da removal do grupo de proteção Fmoc, diversas lavagens são tipicamente, realizadas para se remover piperidina residual e by-products de Fmoc (tais como dibenzofulveno e seu adutor de piperidina).

Os aminoácidos subseqüentes podem ser uti- lizados sob um excesso estequiométrico de aminoácidos em relação ao fator de carga do material de peptideo no suporte de resina. De uma maneira geral, a quantidade de aminoácidos usados na etapa de acoplamento é pelo menos equivalente ao fator de carga do primeiro aminoá- cido na resina (1 equivalente ou mais). Preferentemente a quantidade de aminoácidos usados na etapa de acopla- mento é pelo menos 1,3 equivalentes (excesso de 0,3) ou mais, e com maior preferência de cerca de 1,5 equiva- lentes (excesso de 0,5) ou mais. Em alguns casos, por exemplo, a etapa de acoplamento utiliza uma quantidade equivalente de aminoácidos na faixa situada entre 1 e 3.

Em seguida ao ciclo de acoplamento final acoplar, a resina é lavada com um solvente, tal como NMP, e então lavada com um segundo solvente inerte, tal corno DCM. A fim de remover da resina o material de pep- tideo sintetizado, realiza-se um tratamento de clivagem de uma maneira tal que o material de peptideo clivado ainda carrega cadeia lateral e grupos de proteção de término suficientes. Deixarem-se os grupos de proteção no lugar ajuda a prevenir o acoplamento indesejável ou outras reações indesejáveis de fragmentos de peptideo durante ou depois da clivagem de resina. No caso em que Fmoc ou química assemelhada é usada para sintetizar o peptideo, clivagem protegida pode ser executada de

qualquer maneira desejada, tal como pelo uso de um rea- gente ácido relativamente fraco, tal como ácido acético ou TFA diluído em um solvente, tal como DCM. 0 uso de 0,5 to 10 por cento, em peso,, preferentemente 1 a 3 por cento, em peso, de TFA em DCM, é típico. Vide, por exemplo, a patente U.S. N0 6.281.335.

As etapas de clivagem do fragmento inter- mediário de peptideo a partir da resina de fase sólida podem prosseguir ao longo de linhas de um processo e- xemplificativo como se segue. Entretanto, poderá ser

utilizado qualquer processo adequado que promova efeti- vamente a clivagem do fragmento intermediário de pepti- deo a partir da resina. For exemplo, aproximadamente 5 a 20, preferentemente de cerca de 10 volumes de um sol- vente que contém um reagente de clivagem ácido é adi- cionado ao vaso que contém o material de peptideo de ligação de resina. A resina, tipicamente na forma de glóbulos, é mergulhada no reagente como uma conseqüên- cia. A reação de clivagem ocorre quando o conteúdo Ii- quido é submetido a agitação a uma temperatura adequada durante um período de tempo adequado. A agitação ajuda a impedir que os glóbulos se aglomerem. Tempo e condi- ções de temperatura adequados dependerão de fatores tais como o reagente ácido que está sendo usado, a na- tureza do peptídeo, a natureza da resina e assemelha- dos. Como diretrizes gerais, será adequada agitação a cerca de -15eC até cerca de 5°C, preferentemente desde cerca de -IOeC até cerca de OeC durante de cerca de 5 minutos até duas horas, preferentemente de cerca de 25 minutos até cerca de 45 minutos. O tempo de clivagem poderá estar situado na faixa de cerca de 10 minutos até cerca de 2 horas ou mesmo tanto quanto um dia. A clivagem é realizada desejavelmente sob uma faixa de

temperatura gelada capaz de acomodar uma reação exotér- mica que possa tipicamente ocorrer durante a reação. Adicionalmente, a temperatura mais baixa da reação de clivagem impede que os grupos de proteção de cadeia Ia- teral sensíveis a ácido, tais como os grupos de triti- la, sejam removidos neste estágio.

Ao final do tratamento de clivagem, a rea- ção é esfriada rapidamente. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela combinação do reagente de clivagem com uma base adequada, tal como piridina ou assemelha- do, e continuando-se a mexer e agitar durante um perío- do adicional, tal como durante um adicional de 5 minu- tos até 2 horas, preferentemente de cerca de 20 minutos até cerca de 40 minutos. A adição da base e continuação da agitação faz com que a temperatura do conteúdo do

vaso aumente. Ao final do período de agitação, o conte- údo do vaso pode encontrar-se a uma temperatura na fai- xa de cerca de O0C até cerca de 15°C, preferentemente de cerca de 5°C até cerca de 10°C.

Fatores, tais como inchamento e contração da resina a fim de aperfeiçoar aspectos da recuperação de peptideo podem ser opcionalmente incorporados ao processo de síntese global. Estas técnicas encontram-se descritas, por exemplo, na publicação de patente U.S. N°. 2005/0164912 Al.

Em alguns aspectos, os fragmentos de pep- tideo clivados podem ser preparados para acoplamento de fase de solução a outros fragmentos de peptideo e/ou

aminoácidos. Reações de acoplamento de peptídeos na fa- se de solução são revistos, por exemplo, em New Trends in Peptideo Acoplar Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; e Najera, Ar- men; Organic Preparations e Procedures International (2003), 33(3), 203-303.

O acoplamento de fragmentos intermediários de peptídeos a outros fragmentos ou aminoácido(s) na fase de solução pode ser realizado utilizando-se rea- gentes de acoplamento in situ, por exemplo, hexafluoro- fosfato de 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-il)tris(dimetilamino) fosfônio (BOP), hexafluorofosfato de o-(benzotriazol-1- il)-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametilurônio (HBTU), hexafluorofosfa- to de o-(7-azobenzotriazol-l-il)-1,1, 3,3-tetrametil- urônio (HATU), dicicloexilcarbodiimida (DCC), carbodii- mida solúvel em água (WSCDI), ou tetrafluoroborato de o-(benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametilurô-nio (TB- TU). Outras técnicas de acoplamento utilizam ésteres ativos pré-formados, tais como hidroxissuccinimida (HO-

Su) e ésteres de p-nitrofenol (HONp); anidridos simé- tricos pré-formados; anidridos não-simétricos, tais co- mo N-carboxianidridos (NCAs); ou halogenetos ácidos, tais como fluoreto de acila, bem como cloreto de acila.

Um solvente de acoplamento adequado pode ser usado na reação de acoplamento da fase de solução. Compreende-se que o(s) solvente(s) de acoplamento usa- do (s) podem afetar o grau de racemização da ligação de peptideo formada; a solubilidade do peptídeo e/ou frag- mentos de peptideo; e a proporção de reação de acopla- mento rate. Em algumas concretizações, o solvente de acoplamento inclui um ou mais reagentes misciveis em água. Exemplos de solventes misciveis em água incluem, for exemplo, DMSO, piridina, clorofórmio, dioxana, te- traidrofurano, acetato de etila, N-metilpirrolidona, dimetilformamida, dioxana, ou mixturas dos mesmos.

Em outras concretizações, a reação de aco- plamento pode incluir um ou mais reagentes não misci- veis em água. Um solvente não miscivel em água exempli- ficativo é o cloreto de metileno. Nestas concretiza- ções, o solvente não miscivel em água é preferentemente compatível com a reação de desproteção; por exemplo, se for usado um solvente não miscivel em água, preferente- mente ele não afeta prejudicialmente a reação de des- proteção .

Depois do peptideo 11 ser formado, o pro- duto pode ser submetido a desproteção, purificação, li- ofilização, outro processamento (por exemplo, reação com outro peptídeo para formar uma proteína de fusão); combinações destes e/ou assemelhado, como desejado.

Por exemplo, de acordo com a invenção, os grupos de proteção de cadeia lateral são tipicamente, retidos nos fragmentos intermediários de peptídeos a- través de toda a síntese de fase sólida e também duran- te a através das reações de acoplamento de fase de so- lução. De uma maneira geral, depois de a etapa de aco- plamento de fase de solução ser concluída, uma ou mais etapas de desproteção podem ser realizadas para remove- rem do peptídeo um ou mais grupos de proteção.

A remoção de grupos de proteção de cadeia lateral por desproteção global tipicamente utiliza uma solução de desproteção que inclui um agente acidolítico para separar os grupos de proteção de cadeia lateral. Os reagentes acidolíticos comumente usados para despro- teção global incluem ácido trifluoroacético puro (TFA), HCl, ácidos de Lewis, tais como BF3Et2O ou Me3SiBr, áci- do fluorídrico líquido (HF), brometo de hidrogênio (H- Br) , ácido trifluorometanossulfônico, e combinações do mesmo. A solução de desproteção também inclui um ou mais depuradores de cátions adequados, por exemplo, di- tiotreitol (DTT), anisol, p-cresol, etanoditiol, ou sulfureto de dimetila. A solução de desproteção também pode incluir água. Da maneira que é usado neste contex- to, quantidades de reagentes presentes na composição de desproteção são tipicamente, expressas em uma propor- ção, em que a quantidade de componente individual é ex- pressa como um numerador "em partes", tal como "partes em peso" ou "partes em volume" e o denominador é o to- tal de partes na composição. Por exemplo, uma solução de desproteção que contém TFArH2O: DTT em uma proporção de 90:5:5 {peso/peso/peso) tem TFA a 90/100 partes em peso, H2O a 5/100 partes em peso, e DTT a 5/100 partes em peso.

Em algumas concretizações, a reação de desproteção pode ser realizada em que a quantidade do agente acidolitico, preferentemente TFA, na composição de desproteção é maior do que 90/100 partes, em peso. Outras composições de desproteção preferidas incluem uma quantidade de agente acidolitico em uma quantidade de 93/100 partes, em peso, ou maior, ou em uma quanti- dade da faixa de 93/100, em peso, até 95/100 partes, em peso.

A precipitação é realizada tipicamente, utilizando-se um éter, por exemplo, éter dietilico ou MTBE (Terc Butil Éter de Metila). Depois da precipita- ção, o peptideo é desej avelmente isolado e submetido a secagem antes de ser combinado com outros ingredientes, Iiofilizado, acondicionado, armazenado, processado adi- cionalmente, e/ou de outro modo manipulado. Isto poderá ser realizado de qualquer maneira adequada. De acordo com uma abordagem adequada, o peptideo é colletado por meio de filtragem, lavado com amplas lavagens de MTBE para reduzir o teor salino final a um nível ácidoequa- do, e então submetido a secagem.

A presente invenção também proporciona técnicas de utilidade para purificação de uma ampla ga- ma de peptideos, que inclui peptideos GLP-I e as suas contrapartes.

Um processo de purificação particularmente preferido envolve pelo menos duas passagens de purifi- cação através de meios cromatográficos, em que pelo me- nos uma primeira passagem ocorre sob um primeiro pH e pelo menos uma segunda passagem ocorre sob um segundo pH. Com maior preferência, a primeira passagem ocorre sob um pH ácido, enquanto a segunda passagem ocorre sob um pH básico. Em concretizações preferidas, pelo menos uma passagem sob condições ácidas ocorre antes de ocor- rer uma passagem sob condições básicas. Uma modalidade ilustrativa de praticar esta abordagem de purificação pode ser descrita no contexto ilustrativo de purificar peptideo 11 plenamente protegido resultante do esquema ilustrado na Figura 1. Inicialmente, o peptideo é globalmente desprotegido. O Término-N e grupos de pro- teção de cadeia lateral são clivados. Uma primeira pas- sagem cromatográfica é realizada em um gradiente de á- gua/ACN (acetonitrilo) , utilizando-se TFA suficiente para proporcionar um pH de cerca de 1 até 5, preferen- temente cerca de 2. Um segunda passagem é então reali- zada em um gradiente de água/ACN utilizando-se um pouco de amônia e/ou acetato de amônio, ou assemelhado, para proporcionar um pH em torno de 8 a 9, preferentemente 8,5 a 8,9.

Os valores de pH, sejam eles ácidos ou bá- sicos, promovem uniformidade em que uma espécie iônica uniforme está presente em cada caso. Assim, o pH ácido desejavelmente é suficientemente baixo de forma que substancialmente todos os resíduos de aminoácidos do material de peptideo são protonatados. 0 pH básico é desejavelmente suficientemente alto de forma que subs- tancialmente todos os resíduos de aminoácidos no mate- rial de peptideo sejam desprotonatados. A cromatografia ácida e de base pode ser realizada em qualquer ordem. É conveniente realizar a cromatografia básica por último quando o acetato de peptideo é um produto desejado na medida em que o acetato possa ser o produto de cromato- grafia.

Os princípios da presente invenção serão agora mais bem ilustrados com relação aos exemplos i- lustrativos seguintes. No que se segue, todas as per- centagens e proporções são em volume, a não ser que de outro modo expressamente estabelecido.

Exemplo 1 - Sintese de Fase Sólida do Fragmento 12 com proteção de Fmoc no Término-N, e proteção de cadeia la- teral no His e Glu. A. Preparação de Resina 2CTC carregada de Fmoc-Gly Inicialmente, preparou-se resina 2CTC car-

regada de Fmoc-Gly. As quantidades dos reagentes usados estão listadas na tabela exposta em seguida: Preparação de Resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritila Materiais MW Eq mmol gramas ml Resina de cloreto de 2-clorotritila - - 52,24 35, 06 - Fmoc-Gly-OH 297,3 1,0 13,06 3,88 - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 2, 35 30,72 3, 97 Dimetil formamida (DMF) 1270 Diclorometano (DCM) 1785 9:1 em volume Meta- nol: DIEA 350 Isopropanol (IPA) 1050

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptideo de 500 ml e intumesceu-se com 400 ml DCM du- rante 30 min a 25°C. 0 leito foi drenado e adicionou-se uma solução Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volume de DMF:DCM (87,5:12,5). A mistura foi aubmetida a agitação sob ni- trogênio durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

O leito foi drenado e lavado uma vez mais com 350 ml DMF e uma vez com 175 ml de DMF. Então, Io- cais ativos remanescentes na resina 2-CTC foram capea- dos nas extremidades com 350 ml de solução de MeOH:DIEA (9:1) durante 1 hora. 0 leito foi drenado, lavado com 250 ml de DMF duas vezes, e então com 350 ml de DCM quarto vezes. A resina foi desintumescida por lavagem com 3X350 ml IPA. A resina foi submetida a secagem para um peso constante para proporcionar 38,20 g de resina carregada. Análise mostrou um fator de carga de 0,18 mmol/g.

B. Síntese de Fase Sólida

A sintase de fase sólida foi realizada co- meçando com 20,0 g de resina Fmoc-Gly-2-CTC carregada em 0,18 mmol/g quando preparada na Parte A deste Exem- plo 1. A resina foi intumescida em DCM (200 ml) duran- te 30 min a 25°C. O solvente de DCM foi drenado e a resina foi lavada três vezes com NMP (5 volumes cada lavagem).

A resina foi então tratada duas vezes com 20% em volume de piperidina em NMP (5 volumes cada tra- tamento) para remover o grupo de proteção Fmoc. Depois do segundo tratamento de 20% piperidina/NMP, a resina foi lavada cinco vezes com NMP (5 volumes cada lavagem) para um teste de cloranil negativo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido (2,85 equiv.) e 6-cloro-l- Hidroxibenzotriazol (6-C1-HOBT, 2,85 equiv.), dissolve- ram-se em 2,55 χ volume de NMP então combinaram-se com DIEA (3,25 equiv.) a 5°C até 10°C. Dissolveu-se então TBTU {2,85 equivalentes) em 1,3 χ volume de NMP a 5°C até 10°C. As duas soluções foram então combinadas. A solução resultante foi adicionada ao vaso de reação. O balão de vidro foi enxaguado com 1,3 χ volume de DCM adicionado dentro do reator, que foi então submetido a agitação durante 2-3 horas a de 25°C a 27°C. A amostra foi puxada para o Kaiser Test, a fim de verificar a conclusão da reação. Na eventualidade de a reação de acoplamento estar incompleta depois de 3 horas (Kaiser Test positivo) , o vaso de reação foi drenado e reali- zou-se reacoplamento com solução fresca de aminoácido ativado. Depois de completada a reação de acoplamento, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi la- vada com NMP 4 vezes (5 vol. cada lavagem). Então, re- petiu-se o ciclo de remoção do grupo de proteção Fmoc e reação de acoplamento para os aminoácidos remanescentes no fragmento (isto é, na ordem de

Glu(OtBu)-Aib-His(trt)).

Devido à dificuldade da reação de acopla- mento entre Fmoc-His(trt)-OH ativado e H-Aib-Glu(OtBu)- Gly-2-CTC e à instabilidade do Fmoc-His(trt)-OH ativa- do, a reação de acoplamento foi forçada para a conclu- são mediante drenagem da solução de reação depois de uma hora e realizando-se imediatamente a reação de rea- coplamento com uma segunda solução de Fmoc-His(trt)-OH reativada nova. Todos os reagents usados na Parte B deste exemplo estão listados na tabela seguinte:

Amino- ácido g 6- Cl- HOBT (g) DIEA (g) NMP (ml) TBTU (g) NMP (ml) DCM (ml) Tempo de aco- plamen- to (min) Glu(OtBu) 4, 34 1,76 1, 55 51, 0 3,28 26,0 26, 0 150 Aib 3, 36 1,76 1, 51 51, 0 3,29 26,0 26, 0 155 His (trt) 6,32 1,78 1, 56 51, 0 3,29 26,0 26, 0 60 His(trt) reacopla- mento 6,32 1,79 1, 56 51,0 3,29 26,0 26,0 92

0 fragmento de peptideo ligado por resina foi lavado com NMP (5 vol.) 4 vezes, DCM (6 vol.) 5 ve- zes, IPA {5 vol.) 3 vezes. A resina desintumescida foi então submetida a secagem a 35°C sob vácuo para propor- cionar 22,58 g de resina e peptideo ligado por resina.

C. Clivagem do Fmoc e fragmento protegido por cadeia lateral a partir da resina

A resina de construção proveniente da Par- te B retro foi intumescida em DCM (12,5 volumes em re- lação ao peso de resina usado; 12,5 ml DCM por g de re- sina ou 12,5 litros por kg) durante 30 min a 25°C e en- tão lavou-se com DCM 2 vezes (6,25 vol. cada lavagem) para remover qualquer resíduo de NMP. A resina foi re- frigerada com a última lavagem de DCM para -5°C. O DCM foi drenado e adicionou-se uma solução fria de 1% TFA/DCM (10 vol. a -5°C até -10°C) e submeteu-se a agi- tação durante 30 minutos a 0°C. Adicionou-se piridina (1,3 equiv. de TFA) ao reator para neutralizar o TFA. A solução de clivagem foi removida por filtragem e colle- tada em um balão de vidro. Enquanto o vaso aqueceu até 25°C, a resina foi lavado com DCM 7 vezes (7,5 vol.). as lavagens foram combinadas com a solução de clivagem. A solução de clivagem de DCM foi combinada com água (7,5 vol.) . A mistura resultante foi destilada sob pressão reduzida para remover DCM (350 torr a 28°C). O fragmento de peptideo precipitous-se a partir da água quando o DCM foi removido. O fragmento foi lavado com água e submetido a secagem a 30°C-35°C sob vácuo. Obte- ve-se um total de 4,73 g de Fmoc-(Aib8) GLP-I(7-10)-OH.

Exemplo 2

A. Preparação de resina 2CTC carregada de Raoc-Gly-

Preparou-se resina 2CTC carregada de Fmoc- Gly-. As quantidades de reagentes usados encontram-se listadas na tabela seguinte: Preparação de Resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritila Materiais MW Eq mmol gramas ml Resina de cloreto de 2-Clorotritila - - 59, 66 40, 04 - Fmoc-Gly-OH 297, 3 1,0 29, 84 8,87 - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 1, 67 49, 90 6,45 Dimetil formamida (DMF) 1580 Diclorometano (DCM) 1840 9:1 Metanol: DIEA 390 Isopropanol (IPA) 1050

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptídeo de 500 ml e intumesceu-se com 400 ml de DCM

durante 30 min. a resina foi drenada e adicionou-se uma solução de Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (87,5:12,5). A mistura foi aubmetida a agitação sob ni- trogênio durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

O leito de resina foi drenado e lavado uma vez com 400 ml de DMF e uma vez com 200 ml de DMF. En- tão, locais ativos remanescentes na resina 2-CTC foram capeados nas extremidades com 390 ml de solução de Me- OH:DIEA (9:1 em volume) durante 1 hora. O leito foi drenado novamente, lavado duas vezes com 350 ml de DMFr e lavado quatro vezes com 350 ml de DCM. A resina foi então desintumescida por lavagem com 3X350 ml de IPA. A resina foi submetida a secagem a 35°C sob vácuo para um peso constante para proporcionar 48,51 g de resina car- regada . Análise mostrou um fator de carga de 0,54 mmol/g.

B. Síntese de Fase Sólida

A sintase de fase sólida foi realizada co- meçando com 27,59 g de resina Fmoc-Gly-2-CTC carregada em 0,54 mmol/g. A resina foi intumescida em DCM {300 ml) durante 30 min a 25°C. O solvente de DCM foi dre- nado e a resina foi lavada três vezes com NMP (5 volu- mes cada lavagem).

A resina foi então tratada duas vezes com 20% em volume de piperidina em NMP (5 volumes cada tra- tamento) para remover o grupo de proteção Fmoc. Depois do segundo tratamento de 20% piperidina/NMP, a resina foi lavada seis vezes com NMP (5 volumes cada lavagem) para um teste de cloranil negativo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido (1,7 equiv.) e 6-cloro-l- Hidroxibenzotriazol {6-C1-H0BT, 1,7 equiv.), dissolve- ram-se em 4,6 χ volume de NMP, e então combinaram-se com DIEA (1,9 equivalentes) a 5°C até 10°C. Dissolveu- se então TBTU (1,7 equivalentes) em 2,28 χ volume de NMP a 5°C até 10°C. As duas soluções foram então com- binadas. A solução resultante foi adicionada ao vaso de reação. O balão de vidro foi enxaguado com 2,28 χ volu- me de DCM dentro do reator, que foi então submetido a agitação durante 2-3 horas a de 25°C a 27°C. A amostra foi puxada para o Kaiser Test, a fim de verificar a conclusão da reação. Depois de completada a reação de acoplamento, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com NMP 4 vezes (5 vol. cada lava- gem) . Repetiu-se o ciclo de remoção do grupo de prote- ção Fmoc e reação de acoplamento para os aminoácidos remanescentes no fragmento (isto é, na ordem de Glu(OtBu)^Aib^His(trt)).

Todos os reagents usados neste exemplo en-

contram-se listados na tabela seguinte:

Aminoácido g 6- Cl- HOBT <g) DIEA (g) NMP (ml) TBTU (g) NMP (ml) DCM (ml) Tempo de acopla- mento (min) Glu(OtBu) 10,79 4,24 2, 67 127 8,13 63 63 156 Aib 8,26 4,32 3,73 125 8,14 65 65 180 His(trt) 15, 68 4, 31 3, 69 125 8,12 65 65 180

C. Clivagem do fragmento a partir da resina

A resina construída foi lavada com NMP (5 volumes) 6 vezes e então DCM (6 volumes) 8 vezes para remover o resíduo de NMP. A resina foi refrigerada com a última lavagem de DCM para -5°C. Depois da drenagem de DCM, adicionou-se uma solução fria (-5°C até -10°C) de 1% TFA/DCM (10 vol.) e a mistura de vaso resultante foi submetida a agitação durante 30 minutos a 0°C. Car- regou-se piridina (1,3 equivalente de TFA) para o rea- tor para neutralizar o TFA. A solução de clivagem foi coletada em um balão de vidro. Enquanto o vaso aqueceu até 25°C, a resina foi lavado com DCM 11 vezes (7,5 vol.) e drenada dentro da solução de clivagem. A solu- ção de DCM foi combinada com água (10 vol.). A mistura resultante foi destilada sob pressão reduzida para re- mover DCM (350 torr a 28°C). 0 fragmento foi predipita- do a partir da água quando o DCM foi removido. O frag- mento foi lavado com água e submetido a secagem a 30°C- 35°C sob vácuo. Obteve-se um total de 11,12 g de Fmoc- (Aib8)GLP-I(7-10)-OH (rendimento de 78,8%).

Exemplo 3

A. Preparação de Resina 2CTC Carregada com Pmoc-Gly-

Preparou-se resina 2CTC carregada com Fmoc-Gly-. As quantidades de reagentes utilizadas en- contram-se listadas na tabela seguinte: Preparação de Resina de Fmoc-Gly-2-Clorotritila Materiais MW Eq mmol gramas ml Resina de cloreto de 2-clorotritila - - 60,88 40,86 - Fmoc-Gly-OH 297, 3 1,0 42,58 KO KO Oi 1—I - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 1, 48 63,21 8, 17 Dimetil formamida (DMF) 1380 Diclorometano (DCM) 1840 9:1 Metanol: DIEA 390 Isopropanol (IPA) 1000

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptideo de 500 ml e intumesceu-se com 400 ml de DCM durante 30 minutos. O leito foi drenado e adicionou-se uma solução de Fmoc-Gly-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (87,5:12,5). A mistura foi aubmetida a agitação sob nitrogênio durante 2 horas a uma temperatura de 0C.

0 leito foi drenado e lavado uma vez com 400 ml de DMF e uma vez com 200 ml de DMF. Então, quaisquer locais ativos remanescentes na resina 2-CTC foram capeados nas extremidades com 390 ml de solução de MeOH:DIEA (9:1) durante 1 hora. 0 leito foi drenado novamente, lavado duas vezes com 350 ml de DMF, e então lavado quatro vezes com 350 ml de DCM. A resina foi en- tão desintumescida por lavagem com 4X250 ml de IPA. A resina foi submetida a secagem a 35°C sob vácuo para um peso constante para proporcionar 52,02 g de resina car- regada. A análise mostrou um fator de carga de 0,72 mmol/g.

B. Sintese de Fase Sólida

A sintase de fase sólida foi realizada co- meçando com 24,43 g de resina de Fmoc-Gly-2-CTC carre- gada em 0,72 mmol/g. A resina foi intumescida em DCM (250 ml) durante 30 min a 25°C. O solvente de DCM foi drenado e a resina foi lavada três vezes com NMP (5 vo- lumes cada lavagem).

A resina foi então tratada duas vezes com 20% em volume de piperidina em NMP (5 volumes cada tra- tamento) para remover os grupos de proteção Fmoc. De- pois do segundo tratamento de 20% piperidina/NMP, a re- sina foi lavada seis vezes com NMP (5 volumes cada la- vagem) para um teste de cloranil negativo.

Para preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido e 6-cloro-l-hidroxibenzotriazol (6-C1-HOBT, dissolveram-se em NMP, e então combinaram- se com DIEA a IO0C - 5°C. Dissolveu-se então TBTU em NMP a 10°C-50C. As duas soluções foram então combina- das. A solução resultante foi adicionada a um vaso de reação. O balão de vidro foi enxaguado com DCM (vide tabela seguinte para as quantidades) dentro do reator, que foi então submetido a agitação durante 2-6 horas a de 25°C - 210Q.. A amostra foi puxada para o Kaiser Test, a fim de verificar a conclusão da reação. Na e- ventualidade de a reação de acoplamento estar incomple- ta depois de 3 horas {Kaiser Test positivo), o vaso de reação foi drenado e realizou-se reacoplamento com so- lução fresca de aminoácido ativado. Depois de completa- da a reação de acoplamento, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com NMP 4 vezes (5 volume cada lavagem). Então, repetiu-se o ciclo de re- moção do grupo de proteção Fmoc e reação de acoplamento para os aminoácidos remanescentes no fragmento (isto é, na ordem de Glu (OtBu) -*Aib~»His (trt) ) .

C. Clivagem do fragmento Fmoc-AA(7-10)-OH a partir da resina

Todos os reagentes usados neste exemplo

encontram-se listados na tabela exposta em seguida:

Aminoácido g/Eq 6-CI- HOBT (g/Eq) DIEA (g/Eq) NMP (ml) TBTU (g/Eq) NMP (ml) DCM (ml) Tempo de acopla mento (min) GIu(OtBu) 12,40 /1,65 4,95 /1,65 4,29 /1,85 145 9,37 /1,65 70 70 180 Aib 9,48 /1,65 4,96 /1,65 4,23 /1,85 140 9,33 /1,65 70 70 352 Reacoplamen- to Aib 4,73 /0,83 2,48 /0,83 2,15 /0,92 72 4,85 /0,83 36 36 120 His(trt) 21,18 /1,94 5,80 /1,94 4,99 /2,14 140 10,98 /1,94 70 70 180 Reacoplamen- to His(trt) 10,80 /0,97 2,90 /0,97 2,48 /1,07 72 5,49 /0,97 36 36 180 A resina construída foi lavada com NMP (5 vol. ) β vezes e DCM (6 vol. ) 7 vezes para remover o NMP. A resina foi refrigerada com a última lavagem de DCM para -5°C. 0 DCM foi drenado, e o leito de resina foi lavado com uma solução fria (-5°C até -10°C) de 1% TFA/DCM {11,26 volumes) durante 5 min a 0°C. A solução de clivagem foi coletada no balão de vidro, ao qual ti- nha sido adicionada piridina (1,3 equiv. do total TFA) para neutralização de TFA. Então, a segunda parte de 1% TFA/DCM frio (6,14 vol.) foi adicionada ao reator e submetida a agitação durante 2 min. A segunda solução de clivagem foi novamente drenada dentro do balão de vidro de coleta. Enquanto o vaso era aquecido até 25°C, a resina foi lavada com DCM 9 vezes (8,2 vol.) e drena- da para dentro da solução de clivagem. A solução de DCM foi combinada com água (8,2 vol.). A mistura resultante foi destilada sob pressão reduzida para remover DCM (350 torr a 28°C). O fragmento foi precipitado a partir da água quando se removeu. O fragmento foi lavado com água e submetido a secagem sob temperatura de 30°C a 350C sob vácuo. Obteve-se um total de 14,02 g de Fmoc- (Aib8)GLP-I(7-10)-OH (rendimento de 86,6%) de acordo com a SEQ ID NO.7. A análise mostrou uma pureza de 94,3% AN.

Exemplo 4 - Sintese de Fase Sólida de cadeia lateral

protegida A. Preparação de Resina 2CTC Carregada de Fmoc-Aib-

Preparou-se resina 2CTC carregada de Fmoc-

Aib-. As quantidades de reagentes usadas encontram-se listadas na tabela seguinte:

Preparação de Resina de Fmoc-Aib-2-Clorotritila Materiais MW Eq mmol gramas ml Resina de cloreto de 2- Clorotritila - - 59,66 40,04 - Fmoc-Aib-OH 325,5 1,0 14,91 4,85 - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 2,39 35,20 4,61 Dimetil formamida (DMF) 1480 Diclorometano (DCM) 1840 9:1 Metanol: DIEA 450 Isopropanol (IPA) 1050

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptideo de 500 ml e intumesceu-se com 400 ml de DCM durante 30 minutos. O leito foi drenado e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (87,5:12,5). A mistura foi aubmetida a agitação sob nitrogênio durante 2 horas a uma temperatura de 25°C.

0 leito foi drenado e lavado uma vez com 400 ml de DMF e uma segunda vez com 200 ml de DMF. En- tão, quaisquer locais ativos remanescentes na resina 2- CTC foram capeados nas extremidades com 400 ml de solu- ção de MeOH:DIEA (9:1) durante 1 hora. O leito foi dre- nado. Ά resina foi lavada uma vez com 450 ml de DMF/MeOH/DIEA (4 : 0, 9 : 0,1) , uma vez com 200 ml de DMF, e quatro vezes com 350 ml de DCM. A resina foi desintu- mescida por lavagem com 3X350 ml de IPA. A resina foi submetida a secagem para um peso constante para propor- cionar 45,15 g de resina carregada. A análise mostrou um fator de carga de 0,24 mmol/g.

B. Síntese de Fase Sólida

Carregaram-se 10,01 g de resina Fmoc-Aib- 2-CTC com um fator de carga a 0,24 mmol/g em um vaso de reação e intumesceu-se em DCM (150 ml) durante 30 min a 250C. O solvente de DCM foi drenado e a resina foi la- vada três vezes com NMP (6 volumes cada lavagem).

A resina foi então tratada duas vezes com 5% em volume de piperidina em NMP (6 volumes cada tra- tamento) para remover os grupos de proteção de Fmoc. Depois do segundo tratamento de 5% piperidina/NMP, a resina foi lavada quatro vezes com NMP (6 volumes cada lavagem).

Para preparar a solução de acoplamento, dissolveram-se o aminoácido (1,875 equiv.) e monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol (hidrato HOBT, 2,07 equiv.) em 3,5 χ volume de NMP, a 5°C até IO0C e então combinaram- se com 16,1 ml de solução de HBTU (2,0 equiv.) em NMP l,5x vol.). Então adicionaram-se 2,2 ml de DIEA (2,63 equiv.) ao vaso de ativação a 10°C-5°C. A solução re- sultante foi transferida para um vaso de reação. 0 vaso de ativação foi enxaguado com DCM 1,5x volume de DCM dentro do reator, que foi então aubmetido a agitação durante 2 horas a 25°C. Drenou-se o vaso de reação. Repetiu-se a reação de acoplamento uma vez mais com so- lução fresca do aminoácido ativado (1,875 eq.). Depois de completada a segunda reação de acoplamento, a solu- ção de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com NMP quatro vezes (6 volumes cada lavagem). Então, repetiu-se o ciclo de remoção do grupo Fmoc e reação de acoplamento para os aminoácidos remanescentes no frag- mento (isto é, na ordem de Lys (Boc) -*Va 1->Leu->Trρ (Boc) -»Ala^Ile^Phe->Glu (OtBu)-* Lys (Boc)->Ala-»Ala-*Gln (trt) ) .

Todos os reagentes usados neste exemplo encontram-se listados na tabela exposta em seguida:

Reação de acoplamento de Fmoc-AA(23-35)-OH Exemplo 1 Aminoácido 9 HOBT hydrate (9) NMP (ml) HBTU (g) NMP (ml) DCM (mIO DIEA (ml) Tempo de- acoplamen- to (min) Lys(Boc) 2,12 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento deLys(Boc) 2,12 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Val 1,53 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento de Val 1,53 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Leu 1,58 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento de Leu 1,58 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Trp(Boe) 2,37 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Trp(Boe) 2,36 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Ala 1,42 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Ala 1,42 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Ile 1,59 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Ile 1,59 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Phe 1,74 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Phe 1,74 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 GIu(OtBu) 1,93 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Glu(OtBu) 1,92 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Lys(Boe) 2,12 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reaeoplamento de Lys(Boe) 2,11 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Ala 1,41 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento de Ala 1,40 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Ala 1,41 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento de Ala 1,40 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Gln(trt) 2,77 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120 Reacoplamento de Gln(trt) 2,76 0,76 30,0 1,83 15,0 15,0 1,1 120

A resina de construção foi isolada por la- vagem com 4 vezes com NMP (6 vol.), 4 vezes com DCM (6 vol.), e 3 vezes com Isopropanol (IPA, 6 vol.). A resi- na de construção foi submetida a secagem a 35°C sob vá- cuo. Obtiveram-se 14,3 g de resina de construção.

C. Clivagem do fragmento intermediário a partir da re- sina de construção

6,6 g de resina de construção proveniente do anterior foram intumescidos em IOx volume de DCM du- rante 30 min, e refrigerados para -10°C. 0 DCM foi dre- nado e uma solução fria de 1% TFA/DCM (12 vol. a -5°C até -IO0C) foi adicionada e submetida a agitação duran- te 30 min a 0°C. A solução de clivagem foi coletada em um balão de vidro que continha piridina (2-3 equiv. de TFA). Enquanto aquecia até 25°C, a resina foi submetida a agitação com 1% TFA/DCM (IOx vol.) durante 5 minutos e adicionou-se piridina {2-3 equivalentes). Depois de outros 5 minutos, a solução foi coletada. A resina foi

lavada com DCM 4 vezes (10 vol.). Todas as lavagens de DCM foram combinadas com água (água/DCM = 1/4). A mis- tura resultante foi destilada sob pressão reduzida para remover DCM (350 torr a 28°C). 0 fragmento precipitou- se a partir da água quando o DCM foi removido. O frag- mento foi lavado com água e submetido a secagem a 30°C- 35°C sob vácuo. Repetiu-se o procedimento de clivagem uma vez mais. Obteve-se um total de 2,3 6 g de Fmoc- (Aib35) GLP-I (23-35)-OH (um rendimento de 92 %).

Exemplo 5

A. Preparação de Resina 2CTC carregada de Fmoc-Aib-

Preparou-se resina 2CTC carregada de Fmoc- Aib-. As quantidades de reagentes usados neste exemplo encontram-se listadas na tabela seguinte:_

Preparação de Resina Fmoc-Aib-2-Clorotritila Materiais MW Bq mmol gramas ml Resina de cloridrato de 2- Clorotritila - - 59,67 40,05 - Fmoc-Aib-OH 325,5 1,0 14,92 4,85 - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 2,35 35,20 4,55 Dimetil formamida (DMF) 1280 Diclorometano (DCM) 1840 9:1 Metanol: DIEA 400 Isopropanol (IPA) 1050

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptídeo de 500 ml e intumesceu-se com 400 ml de DCM durante 30 minutos. 0 leito foi drenado e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (87,5:12,5). A mistura foi aubmetida a agitação sob nitrogênio durante 2 horas a uma temperatura de 0C.

0 leito foi drenado e lavado uma vez com 400 ml de DMF. Então, quaisquer locais ativos remanes- centes na resina 2-CTC foram capeados nas extremidades com 400 ml de solução de MeOH:DIEA (9:1) durante 1 ho- ra. 0 leito foi drenado, lavado uma vez com 400 ml de DM F, uma vez com 200 ml de DMF, e quatro vezes com 350 ml de DCM. A resina foi desintumescida por lavagem com 3 X 350 ml de IPA. A resina foi submetida a secagem pa- ra um peso constante para proporcionar 45,32 g de resi- na carregada. A análise mostrou um fator de carga de 0,30 mmol/g.

B. Síntese de Fase Sólida

A síntese de fase sólida foi realizada i-

niciando-se com 15,0 g de resina Fmoc-Aib-2-CTC carre- gada em 0,30 mmol/g. A resina foi intumescida em DCM (150 ml) durante 30 min a 25°C. O solvente de DCM foi drenado e a resina foi lavada duas vezes com NMP (6 vo- lumes cada lavagem) e três vezes com NMP (6 volumes ca- da lavagem). A resina foi então tratada duas vezes com piperidina a 20% em NMP (6 volumes cada tratamento) pa- ra remover os grupos de proteção de Fmoc. Depois do se- gundo tratamento de 2 0% piperidina/NMP, a resina foi lavada seis vezes com NMP (6 volumes cada lavagem) para um teste de cloranil.

Para preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido (1,7 equiv.) e 6-cloro-l- hidroxibenzotriazol (6-C1-HOBT, 1,7 equiv.), dissolve- ram-se em 2,6 χ volume de NMP, a IO0C -5°C, e então combinaram-se com DIEA (1,9 a 3,0 equiv.)· Dissolveu- se TBTU ou HBTU (1,7 equiv.) em 1,33 χ volume de NMP a 10°C-5°C. As duas soluções foram então combinadas. A solução resultante foi adicionada a um vaso de reação. O balão de vidro de mistura foi enxaguado com 1,33 χ volume de DCM dentro do reator, que foi então aubmetido a agitação com resina durante 2-3 horas a 25°C-27°C. A amostras foi puxada para o Kaiser Test, a fim de veri- ficar a conclusão da reação. Na eventualidade de a rea- ção de acoplamento estar incompleta depois de 3 horas (Kaiser Test positivo), o vaso de reação foi drenado e realizou-se reacoplamento com solução fresca de aminoá- cido ativado. Depois de completada a reação de acopla- mento, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com NMP 4 vezes {6 vol. cada lavagem). En- tão, repetiu-se o ciclo de remoção do grupo de proteção Fmoc e a reação de acoplamento para os aminoácidos re- manescentes no fragmento (isto é, na ordem de Lys (Boc)~»Val-»Leu-> Trp (Boc)^Ala-Ile-Phe^Glu (OtBu)

-►Lys (Boc) -»Ala->Ala->Gln (trt) ) .

Devido a possível efeito de reforço entre 2-metilalanina (Aib) e resina 2-CTC, existe uma difi- culdade considerável em forçar as reações de acoplamen- to dosdois primeiros aminoácidos (Lys(Boc)-34 e Val-33) até à conclusão. Consequentemente, as reações de aco- plamento para (Lys(Boc)-34, Val-33) foram executadas três vezes (isto é, o acoplamento foi seguido por dois reacoplamentos) . Da mesma maneira, utilizou-se anidrido acético para o eapeamento extremo do material de liga- ção de resina que não tinha reagido depois das reações de acoplamento de Lys(Boc)-34 e Val-33. Isto aperfeiço- ou a eficiência da purificação subsequente pela movi- mentação das impurezas para longe do produto desejável durante a purificação cromatográfica.

Todos os reagentes usados neste exemplo encontram-se listados na tabela seguinte: Reação de acoplamento do Fmoc-AA(23-35)-OH Aminoácido g / Eq 6-CI- HOBT (g/Eq) DIEA (g/Eq) NMP (ml) TBTU (g/Eq) HBTU (g/Eq) NMP (ml) DCM (ml) Tempo de Aco- pl. (min) Ί ot Lys(Boc) 3,61 /1,7 1,33/ 1,7 1,15/ 1,9 39,0 2,50/ 1,7 - 20,0 20,0 175 2o Lys(Boc) 3,61 /1,7 1,33/ 1,7 1,16/ 1,9 39,0 2,48/ 1,7 - 20,0 20,0 180 3o Lys(Boe) 3,61 /1,7 1,33/ 1,7 1,13/ 1,9 39,0 2,47/ 1,7 - 20,0 20,0 180 Anidrido Acético 2,33 /5,0 - 3,22/ 5,5 60,0 - - 30,0 - 120 I0VaI 2,62 /1,7 1,33/ 1,7 1,13/ 1,9 39,0 2,51 / 1,7 - 20,0 20,0 170 2o Val 2,62 /1,7 1,33/ 1,7 1,17/ 1,9 39,0 2,49/ 1,7 - 20,0 20,0 180 3o Val 2,63 /1,7 1,32/ 1,7 3,67/ 1,9 39,0 2,50/ 1,7 - 20,0 20,0 141 Anidrido Acético 4,69 / 10,0 - 7,13/ 12,0 60,0 - - 30,0 - 153 Leu 2,73 /1,7 1,35/ 1,7 1,12/ 1,9 39,0 2,50/ 1,7 - 20,0 20,0 180 Trp(Boc) 4,03 /1,7 1,33/ 1,7 1,78/ 3,0 39,0 2,50/ 1,7 - 20,0 20,0 180 Ala 2,41 1,31 / 1,78/ 39,0 - 2,93/ 20,0 20,0 180 /1,7 1,7 3,0 1,7 Ile 2,72 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Phe 3,00 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 GIu(OtBu) 3,28 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Lys(Boc) 3,61 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Ala 2,40 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Ala 2,41 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Gln(trt) 4,72 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180 Gln(trt) 4,72 /1,7 1,31 / 1,7 1,78/ 3,0 39,0 - 2,93/ 1,7 20,0 20,0 180

C. Clivagem do fragmento a partir da resina construída

A resina construída proveniente do exposto retro foi lavada com DCM 7 vezes (6 volumes em cada Ia- vagem) para remover o resíduo de NMP, e a resina foi refrigerada com a última lavagem de DCM para -5°C. Drenou-se o DCM, adicionou-se uma solução fria de 1% TFA/DCM (12 vol. a -5°C até -IO0C) e foi submetida a agitação durante 30 minutos a 0°C. A solução de cliva- .0 crem foi coletada em um balão de vidro que continha pi- ridina {1,3 equiv de TFA). Enquanto o vaso aqueceu até 25°C, a resina foi lavado com DCM 9 vezes (10 vol.) e drenada dentro da solução de clivagem. A solução de DCM foi combinada com água (6 vol.). A mistura resultante foi destilada sob pressão reduzida para remover DCM (350 torr a 28°C). 0 fragmento foi predipitado a partir da água quando o DCM foi removido. O fragmento foi la- vado com água e submetido a secagem a 30°C-35°C sob vá- cuo. Para este exemplo repetiu-se o procedimento de clivagem uma vez mais. Obteve-se um total de 6,78 g de Fmoc- (Aib35)GLP-I (23-35) -OH (um rendimento de 68, 1%) com pureza de 87,3% AN.

Exemplo 6

A. Preparação de Resina 2CTC carregada de Fmoc-Aib

Preparou-se resina 2CTC carregada de Fmoc- Aib. As quantidades de reagentes usadas neste exemplo encontram-se listadas na tabela seguinte:

Preparação de Resina Fmoc-Aib-2-Clorotritila Materiais MW Eq mmol grams ml Resina de cloreto de 2- Clorotritila - - 59,85 40,44 - Fmoc-Aib-OH 325,5 1,0 20,95 6,82 - Diisopropiletilamina (DIEA) 129,25 0,95 19,88 2,57 Dimetil formamida (DMF) 1280 Diclorometano (DCM) 1840 9:1 Metanol: DlEA 400 Isopropanol (IPA) 1050

Carregou-se resina 2-CTC para um reator de

peptídeo de 500 ml e intumesceu-se com 4 00 ml de DCM durante 30 minutos. O leito foi drenado e adicionou-se uma solução de Fmoc-Aib-OH e DIEA em 8 volumes de DMF:DCM (87,5:12,5). Amistura foi aubmetida a agitação sob nitrogênio durante 2 horas a uma temperatura de 0C.

O leito foi drenado e lavado com 400 ml de DMF. Então, quaisquer locais ativos remanescentes na resina 2-CTC foram capeados nas extremidades com 400 ml de solução de MeOH: DIEA (9:1) durante 1 hora. O leito foi drenado, lavado uma vez com 400 ml de DMF, lavado uma vez com 200 ml de DMF, e lavado quatro vezes com 350 ml de DCM. A resina foi desintumescida por lavagem com 3 X 350 ml de IPA. A resina foi submetida a secagem para um peso constante para proporcionar 47,56 g de re- sina carregada. A análise mostrou um fator de carga de 0,37 mmol/g.

B. Sintese de Fase Sólida

A síntese de fase sólida foi realizada i-

niciando-se com 25,0 g de resina Fmoc-Aib-2-CTC carre- gada em 0,37 mmol/g. A resina foi intumescida em DCM (250 ml) durante 30 min a 25°C. 0 solvente de DCM foi drenado e a resina foi lavada duas vezes com NMP (6 vo- lumes cada lavagem) e três vezes com NMP (6 volumes ca- da lavagem).

A resina foi então tratada duas vezes com piperidina a 20% em NMP (6 volumes cada tratamento) pa- ra remover os grupos de proteção de Fmoc. Depois do se- gundo tratamento de 20% piperidina/NMP, a resina foi lavada seis vezes com NMP {6 volumes cada lavagem) para um teste de cloranil.

Para preparar a solução de acoplamento, pesaram-se o aminoácido e 6-cloro-l-hidroxibenzotriazol {6-C1-H0BT), dissolveram-se em 3,2 χ volume de NMP (ou DMF para Lys-34, Val-33 e Gln-23) então combinaram-se com DIEA a IO0C até 5°C. Dissolveu-se o TBTU em 1,6 χ volume de NMP (ou DMF para Lys-34, Val-33, e Gln-23) a IO0C até 5°C. As duas soluções foram então combinadas. A solução resultante foi adicionada a um vaso de reação e o balão de vidro foi enxaguado com 1,6 χ volume de DCM dentro do reator, que foi então aubmetido a agita- ção com resina durante 2-3 horas a 25°C-27°C. A amostra foi puxada para o Kaiser Test, a fim de verificar a conclusão da reação. Na eventualidade de a reação de acoplamento estar incompleta depois de 3 horas (Kaiser Test positivo) , o vaso de reação foi drenado e reali- zou-se reacoplamento com solução fresca de aminoácido ativado. Depois de completada a reação de acoplamento, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi la- vada com NMP 4 vezes (6 vol. cada lavagem). Então, re- petiu-se o ciclo de desproteção remoção do grupo de proteção Fmoc e a reação de acoplamento para os aminoá- cidos remanescentes no fragmento (isto é, na ordem de Lys (Boc)-»Val~*Leu-> Trp (Boc)-»Ala^Ile^Phe^Glu (OtBu)

-»Lys (Boc)->Ala-»Ala-»Gln (trt) ) .

Devido a possível efeito de reforço entre 2-metilalanina (Aib) e resina 2-CTC, existe uma difi- culdade considerável em forçar as reações de acoplamen- to dosdois primeiros aminoácidos (Lys(Boc)-34 e Val-33) até à conclusão. Consequentemente, as reações de aco- plamento para (Lys(Boc)-34, Val-33) foram modificadas pelo aumento das utilizações do aminoácido e do 6-C1- HOBT a partir de 1,7 Eq até 2,5 Eq e DIEA a partir de 1,9 Eq até 3,0 Eq. 0 solvente para reação de acopla- mento também foi trocado de NMP para DMF a fim de for- çar a reação de acoplamento até à conclusão. Da mesma maneira, neste exemplo utilizou-se anidrido acético pa- ra o capeamento extremo do material de ligação de resi- na que não tinha reagido depois das reações de acopla- mento de Lys(Boc)-34 e Val-33. Isto aperfeiçoou a efi- ciência da purificação subsequente pela movimentação das impurezas para longe do produto desejável durante a purificação cromatográfica.

Todos os reagentes usados neste exemplo encontram-se listados na tabela seguinte: Reação de acoplamento de the Fmoe-AA(23-35)-OH Material wt (g) /Eq 6-CI- HOBT (g/Eq) DIEA (g/Eq) DMF (ml) NMP (ml) TBTU (g/Eq) DMF (ml) NMP (ml) DCM (ml) Tempo de Acop (min) Lys(Boc) 10,84 /2,5 3,93 /2,5 3,63/ 3,0 80,0 - 7,44/ 2,5 40,0 - 40,0 170 Anidrido Acético 4,72/ 5,0 - 6,61 I 5,5 - 100,0 - - 50,0 - 120 Val 7,85/ 2,5 3,92 /2,5 3,67/ 3,0 80,0 - 7,44/ 2,5 40,0 - 40,0 177 Anidrido Acético 9,48/ 10,0 - 14,46 /12,0 - 100,0 - - 50,0 - 120 Leu 5,56/ 1,7 2,68 /1,7 2,33/ 1,9 - 78,6 5,05/ 1,7 - 39,3 39,3 184 Trp(Boc) 8,30/ 1,7 2,70 /1,7 2,28/ 1,9 - 78,6 5,05/ 1,7 - 39,3 39,3 180 Ala 4,92/ 1,7 2,68 /1,7 2,30/ 1,9 - 78,6 5,05/ 1,7 - 39,3 39,3 177 Ile 5,56/ 1,7 2,70 /1,7 2,26/ 1,9 - 78,6 5,06/ 1,7 - 39,3 39,3 168 Phe 6,10/ 1,7 2,70 /1,7 2,31 / 1,9 - 78,6 5,06/ 1,7 - 39,3 39,3 168 G Iu (OtBu 6,72/ 1,7 2,67 /1,7 2,29/ 1,9 - 78,6 5,05/ 1,7 - 39,3 39,3 168 Lys(Boc) 7,39/ 1,7 2,70 /1,7 2,29/ 1,9 - 78,6 5,05/ 1,7 - 39,3 39,3 165 Ala 4,91 / 2,70 2,41 / - 78,6 5,05/ - 39,3 39,3 180 1,7 /1,7 1,9 1,7 Ala 4,92/ 1,7 2,68 /1,7 2,32/ 1,9 - 78,6 5,03/ 1,7 - 39,3 39,3 171 Gln(trt) 14,13 /2,5 3,94 /2,5 3,71 / 3,0 80,0 - 7,42/ 2,5 40,0 - 40,0 185

C. Clivagem do fragmento a partir da resina construída

A resina construída proveniente do exposto retro foi lavada com DCM 6 vezes (6 volumes em cada Ia- vagem) para remover o resíduo de NMP, e a resina foi refrigerada com a última lavagem de DCM para -5°C. Drenou-se o DCM, adicionou-se uma solução fria de 1% TFA/DCM (10 vol. a -5°C até -10°C) e foi submetida a agitação durante 30 minutos a 0°C. A solução de cliva- gem foi coletada em um balão de vidro que continha pi- ridina (1,3 equiv de TFA). Enquanto o vaso aqueceu até 25°C, a resina foi lavada com DCM 7 vezes (6 vol.) e drenada dentro da solução de clivagem. A solução de DCM foi combinada com água (10 vol.). A mistura resultante foi destilada sob pressão reduzida para remover DCM (350 torr a 28°C). O fragmento foi predipitado a partir da água quando o DCM foi removido. 0 fragmento foi la- vado com água e submetido a secagem a 30°C-35°C sob vá- cuo. Para este exemplo repetiu-se o procedimento de clivagem uma vez mais para conseguir a clivagem comple- ta. Obteve-se um total de 12,36 g de Fmoc-(Aib35)GLP- 1(23-35)-OH (um rendimento de 59,35%) com uma pureza de 84,3% AN.

Exemplo 7

1. Lavagem de Resina

Iniciando-se com resina Fmoc-Gly-O-2-CTC pré-carregada (carga de 0,18 até 0,65 mmol/g), ou Fmoc- Aib-O-2-CTC (carga de 0,25 até 0,65 mmol/g), aplicou-se quimica de Fmoc padrão. A resina foi primeiro intumems- cida em 10 χ volume de DCM durante 30-60 min. Então, o DCM foi drenado e a resina foi lavada com 10 χ volume de NMP durante 3-5 vezes (5 min cada uma).

2. Ciclo de Sintese Geral:

Utilizando-se uma resina lavada de acordo com a Seção A deste Exemplo 7, realizou-se a remoção de Fmoc por dois tratamentos de -IOx solução de Piperidi- na a 20%em NMP (v/v) . Os tratamento demoraram 15-30 min/cada um. A solução de Piperidina/NMP foi drenada depois de cada tratamento. A resina foi então lavada por NMP 4-5 vezes (10 χ volume, 5 min/cada uma) .

Para preparar a solução de acoplamento, o aminoácido Fmoc protegido (AA), e HOBt, foram pesados (a 1,5-2,0 equiv) , dissolvidos em 4x volume de NMP a IO0C, e combinados com DIEA (1,5-2,0 equiv). Dissolveu- se HBTU (1,5-2,0 equiv) em 3 χ volume de NMP a 10°C. as duas soluções foram então combinadas e misturadas com 3x volume de DCM durante 1-2 minutos. A solução resul- tante foi adicionada ao vaso de reação e misturada com a resina sob agitação durante 1,5-5 horas. A amostra foi puxada para o teste de Kaiser para verificar a rea- ção quanto à conclusão. O acoplamento incompleto foi reacoplado. Depois de a reação de acoplamento ter sido comcluída, a solução de acoplamento foi drenada e a re- sina foi lavada com NMP 5 vezes (10 χ volume, 5 min/cada uma).

A. Seguindo-se o procedimento de síntese geral, o fragmento Fmoc- GLP-I (11-22)-2-CTC dotado da seqüência nativa foi construído gradualmente utilizan- do-se o mesmo procedimento de síntese geral, um frag- mento de acordo com a SEQ ID NO.7 foi acoplado ao frag- mento resultante Fmoc-GLP-I (11-22)-2-CTC preparado nesta Seção A utilizando-se o procedimento de síntese geral.

B. Seguindo-se o procedimento de síntese geral, o fragmento Fmoc-GLP-I (11-22)-2-CTC foi cons- truído gradualmente. Entretanto, a condição de remoção de Fmoc foi alterada para uma solução de piperidina a 10% e DBU a 2% em NMP(v/v) em vez de piperidina a 20% em NMP (v/v) . Adicionalmente, os tempos de tratamento na posição de AA14 [Fmoc-Ser(tBu)-] e a posição de AA13 [Fmoc-Thr (tBu) -] foram estendidos para 1,5 h para pro- mover a conclusão da reação. Utilizando-se o mesmo pro- cedimento de síntese geral, um fragmento de acordo com a SEQ ID NO.7 foi acoplado ao Fmoc-GLP-I (11-22)-2-CTC resultante utilizando-se o procedimento de síntese ge- ral .

C. Seguindo-se o procedimento de síntese geral, com a solução de remoção de Fmoc como piperidina

17 ~ 1 8

a 10% e DBU a 2% em NMP(v/v), o fragmento Fmoc-(X ) GLP-I (11-22)-2-CTC foi construído gradualmente. Então, o fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 foi acoplado ao Fmoc- (X17-18) GLP-I (11-22) -2-CTC resultante utili- zando-se o procedimento de síntese geral.

D. Seguindo-se o procedimento de síntese geral, o fragmento Fmoc-(X17"18) GLP-I (11-22)-2-CTC foi construído gradualmente. Então, o fragmento de acordo com a SEQ ID NO. 7 foi acoplado ao Fmoc- (X17-18) GLP-I resultante (11-22)-2-CTC utilizando-se o procedimento de síntese geral.

E. Seguindo-se o procedimento de síntese geral da seção D imediatamente precedente, e exceto quanto às diferenças observadas na tabela seguinte, construiu-se um fragmento Fmoc-(X17-18) GLP-I (11-22)-2- CTC gradualmente. Então, um fragmento de acordo com a

17 ~ 18

SEQ ID NO.7 foi acoplado ao fragmento Fmoc-(X ) GLP- 1 (11-22)-2-CTC resultante utilizando-se o procedimento de síntese geral.

A tabela seguinte resumo detalhes dos pro- cedimentos A até E neste Exemplo: Ex. Es- cala Carga mmol/g Condição de remoção de Fmoc Pseudo- prolina @ Position 17-18 Equiv. de AA Pureza HPLC Ren- dimen- to A 5g 0.24 20% piperi- dina/ NMP Não 2.0 30% 42%* B 20g 0.30 10% piperi- dina/ 2% DB U/N M P Não 1.7 58% 62% C 5g 0.30 10% piperi- dina/ 2%DBU/NMP Sim 2.0 84% 74% D 5g 0.30 20% piperi- dina/ NMP Sim 2.0 75% 80% E 20g 0.42 20% piperi- dina/ NMP Sim 2.0 89% 86%

F. Clivagem de Fragmento:

Para realizar a clivagem de fragmento com relação a qualquerum dos fragmentos de peptideo snteti- zados neste Exemplo, a resina peptideo construída é in- tumescida em 10 χ volume de DCM durante 30 min, e é re- frigerada para -10°C. O DCM é drenado e uma solução de 1% TFA/DCM (10 χ volume) é adicionada e submetida a a- gitação durante 30 min. A solução de clivagem é coleta- da em um balão de vidro que contém piridina (2-3 equiv. em relação a TFA). Enquanto se aquece até 25°C, a resi- na é tratada com 1% TFA/DCM (10 χ volume) durante 5 min, e então adiciona-se piridina {2-3 equiv. para TFA) . Depois de outros 5 min de agitação, a solução é coletada. A resina é então lavada com 10 χ volume de DCM durante 4 tempos (5 min/cada um) . As soluções de todas as lavagens e a clivagem são combinadas e mistu- radas com água (relação de água/DCM = -1/4 em volume). A mistura resultante é destilada sob pressão reduzida para remover DCM {350 torr/28°C). 0 fragmento de peptí- deo crashes out from water when DCM is removed, e is filtrada. O fragmento de peptideo é lavado com água e submetido a secagem a 30°C sob vácuo.

Exemplo 8 ~ Sintese de Solução: Adição de Arg

Dissolveu-se um fragmento de (Aib35) GLP-I (23-35) (carreando proteção de cadeia lateral de acordo com a Tabela A e carreando proteção de Fmoc no término- N (9,11 g, 3,94 mmol) em DMSO (90 ml). A esta solução carregaram-se HOBt (2,42 g, 4 equiv), HBTU (5,98 g, 4 equiv), DIEA (3,44 ml, 5 equiv), e H-Arg (2HC1)-NH2 (3,8 8g, 4 equiv) juntamente com 10 ml de DMSO. A rea- ção foi submetida a agitação e monitorada por HPLC. De- pois de 4 horas, a reação não foi concluída, de forma que adicionaram-se 2 ml de DIEA. A reação foi realizada durante a noite. Então adicionou-se piperidina (5 ml) à mistura de reação. A remoção de Fmoc foi realizada em 2 horas. A mistura de reação foi esfriada rapidamente com água gelada (800 ml) e submetida a agitação durante 40 minutos. 0 sólido branco formado foi filtrado, lavado com água (4 00 ml) e submetido a secagem durante a noite para proporcionar o fragmento (9,65 g, rendimento em peso 109%) (Aib35) GLP-I (23-36).

Exemplo 9

0 fragmento (Aib8, X17"18) GLP-I (7-22) (7,73 g, 2,88 mmol) portador de grupos de proteção de cadeia lateral de acordo com a Tabela A e proteção de Fmoc no Término-N foi dissolvido em DMSO (65 ml).

A esta solução, HOBt (0,73 g, 4,77 mmol), HBTU (1,46 g, 3,85 mmol), DIEA (0,71 ml, 7,40 mmol), e o fragmento (Aib35) GLP-I (23-36) (8, 5 g, 3,45 mmol) carregara-se junto com 20 ml de DMSO. A reação foi aub- metido a agitação e monitorada por HPLC. Depois de 3 horas o acoplamento foi concluído. Então adicionou-se piperidina (5 ml) à mistura de reação. A remoção de Fmoc foi realizada em 2 horas. A mistura de reação foi esfriada rapidamente com água gelada (800 ml) e subme- tida a agitação durante 30 minutos. 0 sólido branco formado foi filtrado, lavado com água (400 ml) e subme- tido a secagem durante a noite para proporcionar o pep- tideo protegido (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-I (7-36).

Exemplo 10 - Desproteçião Global

Um peptídeo preparado de acordo com o E- xemplo 9 (16,24 g) foi tratado com uma solução de TFA/DTT/água (100 ml/5 g/2,0 ml) durante 2 horas e a solução resultante foi vazada em MTBE (800 ml) em banho de gelo. Depois de 30 min de agitação, o sólido branco formado foi filtrado, lavado com MTBE (400 ml) e subme- tido a secagem para proporcionar o produto de peptideo bruto (16,0 g, rendimento em peso 138%) . O peptideo desprotegido resultante é doravante chamado de o pepti- deo "bruto".

Exemplo 11 - Purificação

A purificação do peptideo bruto é realiza- da em um Kromasil® C4, 10 micrômetros, coluna de 2,0 κ cm proporcionando peptideo purificado um rendimento de 98+% pureza e -60% contido / contido. S purificação envolve uma Ia purificação cromatográfica sob pH 2, se- guida por uma 2a passagem sob pH 9. Depois desta puri- ficação, o peptideo purificado pode ser ainda manipula- do ou processado em uma variedade de formas. A titulo de exemplo, o grupo purificado resultante proveniente da segunda passagem pode ser liofilizado ou levado a passar através de uma coluna de concentração e isolado por precipitação. Os dois isolamentos proporcionarão o peptideo desejado (acetato).

Como uma visão geral do processo de duas passagens, dissolve-se peptideo bruto a 5 mg/ml (base contida) em uma mistura de acetonitrila 10%/ água (Áci- do acétido 0,2M). Injeções replicativas de 1000 mg (ba- se contida) são preparadas utilizando-se um gradiente de acetonitrila / THF / água /TFA, e agrupam-se frações de -95% de pureza. Uma "fração de reciclo" é também a- grupada sob pureza de -70% representando -34% de recu- peração. A fração de reciclo é novamente injetada uti- lizando-se o mesmo gradiente de acetonitrila / THF / água / TFA, e um grupo sob -85% de pureza é combinado com o agrupamento principal. O rendimento contido para contido para a Ia passagem de purificação cromatográfi- co é de 7 0%.

0 agrupamento de Ia passagem combinada (pH 2) foi então ainda purificado em uma segunda passagem na mesma coluna Kromasil® C4, mas utilizando-se um gra- diente de acetonitrila / THF / água / acetato de amônio (pH 8,8). As frações são combinadas proporcionando 98 +% de pureza sob uma recuperação de 2 a passagem de -85%. 0 rendimento global para as duas etapas de puri- ficação será de 60% (contido / contido).

0 agrupamento de 2a passagem combinada (pH 8,8) foi então concentrado utilizando-se a mesma coluna Kromasil® C4, mas utilizando-se um gradiente de etapa de metanol / água / acetato de amônio. As frações são combinadas e estão prontas para isolamento.

A. Preparação de solução de peptídeo bruto:

Dissolveram-se 8 g de peptideo bruto em 500 ml de uma solução de ácido acético 0,2N a 90%/ a- cetonitrila a 10%. A solução foi filtrada, uma vez a- través de um filtro Durapore 0,45 micrômetros (47 mm de diêmetro) (Millipore) e, então, através de um filtro micrométrico de pilha de discos Supor EKV (0,65 /0,2 mm de diâmetro) (Pall Filters). A solução de injeção bruta foi analisada por HPLC e constatou-se conter 5,02 mg (% em peso) de peptídeo contido por ml. (500 ml χ 5,02 mg/ml = 2512 mg peptideo contido).

B. Cromatografia - Ia passagem sob pH ~2:

Prepararam-se quatro injeções replicativas com a solução bruta sob as seguintes condições:

Coluna:

Manufaturada por Kromasil com um acondicionamento de C4, 10 micrômetros e as dimensões de 2,0 χ 25 cm

Detetor: Detector de ultravioleta ajustado para 280 nm (8 nm largura de banda, 350/20 nm ref)

Temperatura de Coluna: ambiente

Velocidade de fluxo: 13,0 ml/min (contrapressão de bar- ra -50)

Fase móvel:

A = mistura de ácido trifluoroacético a 0,1% / 15% acetonitrila / 85% água

B = mistura de ácido trifluoroacético a 0,1% / 15% tetraidrofurano / 70% acetonitrila / 15% água

Gradiente: 0 gradiente começa com fase móvel A 100% e é mantida durante 0,1 minuto. A amostra é então car- regada manualmente na coluna pela bomba C (vide a- diante para descrição da Bomba C). Depois do carre- gamento da amostra, faz-se escoar um gradiente li- near de 100% A até 83% A durante 1 minuto. A fase móvel é então mantida a 83% A durante os 11 minutos seguintes. Faz-se então escoar um segundo gradiente linear para 73% Δ durante 10 minutos. A fase móvel é então mantida a 73% A durante os 15 minutos se- guintes. O escoamento é então completado e é segui- do por um escoamento de 100% B de 10 minutos segui- do por um reequilibrio durante 20 minutos da coluna a 100% A.

A amostra foi carregada utilizando-se uma bomba HP 1100 isocrática separada a 9,0 ml/min (bomba - C) . As impurezas de eluição no começo são separadas do pico principal por uma contenção isocrática inicial de 11 minutos a 83% A seguida por um gradiente li- near para 73% A durante os 10 minutos seguintes. O pico de peptideo principal é então eluido durante os 15 minutos contido a 73% A. As frações são co- letadas durante estes 15 minutos de contenção a 73% A.

C. Ia Passagem sob pH ~2 Reciclo:

0 agrupamento de reciclo é obtido a partir da frações determinadas para terem purezas abaixo das quais elas podem ser adicionadas ao agrupamento combi- nado. Estas frações foram combinadas separadamente e diluídas com um volume de água igual. Uma injeção de reciclo foi preparada de volta sobre a coluna a partir deste agrupamento combinado separadamente. Utilizaram- se as mesmas condições cromatográficas e as frações de pureza aceitável são combinadas, diluídas com igual vo- lume de água, e adicionadas ao agrupamento combinado de Ia passagem.

O carregamento para a injeção de reciclo é significativamente menor do que a injeção bruta devido às impurezas aumentadas que são eluidas próximo ao pico de peptideo. Em média existe 1 injeção de reciclo para cada 2 injeções brutas.

D. Cromatografia Preparatória de 2a Passagem sob pH 8,8:

O agrupamento de Ia passagem combinada fi- nal foi ainda purificado por re-cromatografia sob pH 8,8. Utilizando-se pH 8,8 para a 2a passagem alterou-se de forma significativa a ordem de eluição das impure- zas, possibilitando uma melhor limpeza sob alta recupe- ração. As condições usadas para esta 2a etapa de croma- tografia foram as seguintes:

Coluna: Manufaturada por Kromasil com um acondiciona- mento de C4, 10 micrômetros e as dimensões de 2,0 χ 25 cm

Detetor: Detetor de ultravioleta ajustado para 280 nm (8 nm largura de banda, 350/20 nm ref)

Temperatura de Coluna: ambiente

Velocidade de Fluxo: 13,0 ml/min (contrapressão -50

bar) Fase Móvel:

A - mistura de acetonitrila a 15% / 85% água con- tendo 2 gramas por litro de acetato de amônio e Iml por litro de hidróxido de amônio concentrado B = mistura de tetraidrofurano a 15%/ acetonitril a 60%/ 25% água contendo 2 gramas por litro de aceta- to de amônio e 1 ml por litro de hidróxido de amô- nio concentrado.

Gradiente: 0 gradiente começa com fase móvel A 100% e é mantida durante 0,1 minuto. A amostra é então car- regada manualmente na coluna pela bomba C. Depois do carregamento da amostra, faz-se escoar um gradi- ente linear de 100% A até 67% A durante 2 minutos. A fase móvel é então mantida a 67% A durante os 33 minutos seguintes. O escoamento é então completado e é seguido por um escoamento de 100% B de 5 minu- tos seguido por um reequilíbrio durante 15 minutos da coluna a 100% A.

A amostra foi carregada utilizando-se uma bomba HP 1100 isocrática separada a 9,0 ml/min (bomba - C) . Depois dos 30 minutos de etapa de carga, fez-se escoar um gradiente curto de 100%A até 67% A, de 30,2 a 32 min. O pico de peptideo principal foi eluido durante uma conservação de 33 minutos a 67% A. Frações são coletadas começando-se minutos depois dp carregamento da coluna e ter- mina depois de o pico principal ter completado a eluição. As frações são coletadas durante aproxima- damente 15 minutos. As frações aceitáveis são agru- padas e diluídas com um volume igual de água. Um reciclo é possível neste estágio da purificação, mas as frações de refugo de uma maneira geral não contêm prptídeo suficiente para garantir uma inje- ção de reciclo. Isto pode tornar-se viável se for realizado um grande número de injeções e as frações de refugo forem agrupadas para reciclo.

E. Corrida de Concentração:

O agrupamento combinado de 2a passagem combinada final é carregado sobre a mesma coluna e elu- ída rapidamente utilizando-se uma fase móvel diferente para concentrar peptídeo para isolamento. As condições usadas para esta etapa foram as seguintes:

Coluna: Manufaturada por Kromasil com um acondiciona- mento de C4, 10 micrômetros e as dimensões de 2,0 χ 25 cm

Detetor: Detetor de ultravioleta ajustado para 280 nm (8 nm largura de banda, 350/20 nm ref)

Temperatura de Coluna: ambiente

Velocidade de Fluxo: 13,0 ml/min {contrapressão -50 bar)

Fase Móvel:

Δ = mistura de metanol a 10% / acetato de amônio raM a 90%

B = mistura de metanol a 90% / acetato de amônio mM a 10% Gradiente: O gradiente começa com fase móvel A 100% e é mantido durante 0,1 minuto. A amostra é então car- regada manualmente na coluna pela bomba C. Depois do carregamento da amostra, a fase móvel é mantida a 100% A durante os 5 minutos. A fase móvel é então imediatamente escalonada para 100% B durante os 20 minutos seguintes. 0 escoamento é então completado e é seguido por um reequilíbrio durante 15 minutos da coluna a 100% A.

A amostra foi carregada utilizando-se uma bomba HP 1100 isocrática separada a 9,0 ml/min (bomba - C) . Depois dos 45 minutos de etapa de carga, uma retenção curta utilizando-se 100% A du- rante 5 minutos e então um gradiente escalonado de 100% B foi escoado durante 20 minutos para eluição do peptideo. O pico principal começou a eluição 2 minutos depois do gradiente escalonado para 100% B. Os 12 minutos seguintes das frações continham pep- tideo e foram agrupadas para isolamento.

Exemplo 12 - Liofilização

Tarou-se uma garrafa de PLPE de boca larga de 1 litro. A esta garrafa adicionou-se o agrupamento purificado (210 ml) de acetato (Aib8, xl7~18, Aib35) GLP-I (7-36) em acetonitrila/ acetato de amônio aquoso. O re- cipiente foi enxaguado com água desionizada 3 χ 5 ml e os enxaguados foram adicionados ao agrupamento. Esta solução foi submetida a redemoinho para homogeneização e tapada, e congelada em camisa em nitrogênio liquido. A garrafa cogelada foi destapada e a boca coberta com um Kimwipe dobrado mantido na posição com uma cinta de borracha. A garrafa foi colocada em recipiente de vácuo no aparelho de liofilizar e liofilizada. Tamperatura de condensador -89°C, pressão 19 micrômetros.

Depois de 24 h o recipiente de vácuo foi ventilado para se verificar o progresso; ainda havia a presença de uma boa quantidade de gelo audível. Reini- ciou-se a Iiofilização.

Depois de outras 18 h a garrafa foi remo- vida do liofilizador e checou-se o peso. 0 peso era instável, subindo rapidamente devido à natureza higros- cópica do produto. 0 produto estático foi rapidamente transferido para um frasco de cintilação tarado e pesa- do, obtiveram-se 0,822 g de peptídeo.

Exemplo 13: Precipitação de peptideo purificado

Em um balão de vidro, diluiu-se uma solu- ção de 100,5 mg de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-I (7-36) puro em 2 ml 20 mM acetato de amônio em Me- OH/água (9:1 por volume) com 1 ml 20mM de acetato de amônio em MeOH/água (9:1 por volume). Com agitação, alimentaram-se lentamente 20 ml de Isopropanol (IPA) em um frasco a de 20°C até 25°C. A mistura do vaso torbou- se nebulosa depois da adição de 15 ml de IPA. Continu- ou-se com agitação durante a noite a 20°C até 25°C. 0 produto de precipitação foi filtrado e lavado por 5 ml IPA e então submetido a secagem a 25°C sob vácuo até obtenção de um peso constante. Obtiveram-se 90,9 mg de peptideo (uma recuperação de 90,42%).

Exemplo 14: Isolamento de peptideo purificado

Em um balão de vidro, diluiu-se uma solu- ção de 4 97, 7 mg de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-I (7-36) puro em 10 ml 20 mM de acetato de amônio em Me- OH/água (9:1) com 6 ml de 20 mM acetato de amônio em MeOH/água (9:1). Com agitação, alimentaram-se lentamen- te 40 ml de isopropanol (IPA) para dentro do balãi de vidro a 20°C até 25°C durante 35 minutos. A mistura do vaso tornou-se nebulosa depois da adição de 2 ml de I- PA. Continuou-se com a agitação durante uma hora a 20°C até 25 0C. O produto de precipitação foi filtrado e la- vado por meio de 5 ml IPA e então submetido a secagem a 25°c sob vácuo até um peso constante. Obtiveram-se 458,4 mg de peptideo (uma recuperação de 92%).

Exemplo 15: Isolamento de peptideo purificado

Em um balão de vidro, adicionaram-se len- tamente 900 ml de IPA em uma solução de agitação de -1000 mg de acetato de (Aib8, x17"18, Aib35) GLP-I purifi- cado (7-36) em 150 ml de 20 mM acetato de amônio em Me- OH/água (9:1) através de uma coluna de concentração a 2 0°C até 25°C. Esta adição foi completada dorante 4 5 min. a mistura de vaso tornou-se nubulosa depois da a- dição de 260 ml IPA. Prosseguiu-se com a agitação du- rante 40 minutos a 20°C até 25°C. O produto de precipi- tação foi filtrado e lavado por 5 ml de IPA e então submetido a secagem a 20°C até 25°C sob vácuo até atin- gir um peso constante. Obtiveram-se 746 mg de peptídeo (uma recuperação de 74,6%).

Claims (29)

1. - Método para preparar um peptídeo insu- linotrópico, caracterizado por compreender uma ou mais das etapas de: h) proporcionar um primeiro fragmento de pepti- deo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são ca- da um residuos de um aminoácido aquiral, ca- da um de H e E incluindo opcionalmente pro- teção de cadeia lateral; i) proporcionar um segundo fragmento de peptí- deo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ ID NO. 8) , em que o re- síduo assinalado pelo símbolo X e um re- síduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, o dito resíduo de aminoácidos da seqüência in- cluindo opcionalmente proteção de cadeia la- teral; j) acoplar o primeiro fragmento ao segundo fragmento para proporcionar um terceiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17~18YLEG (SEQ ID NO.11), o dito resíduo de aminoácidos da se- qüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; k) proporcionar um quarto fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKE- FIAWLVKX35 (SEQ ID NO.9), em que X35 é um re- siduo de um aminoácido aquiral, o dito resí- duo de aminoácldos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; 1.) acoplar o quarto fragmento de peptideo a ar- ginina a fim de proporcionar um quinto frag- mento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), os ditos resíduos da seqüência incluin- do opcionalmente proteção de cadeia lateral; e m) acoplar o quinto fragmento ao terceiro frag- mento a fim de proporcionar um peptideo in- sulinotrópico que inclui a seqüência de ami- noácidos HX8EX10TFTSDVX17"18YLEGQAAKEFIAWL VK X35R (SEQ ID NO. 13) , os ditos resíduos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral.

2. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de a) a f).

3. - Método, de acordo com as reivindica- ções 1 ou 2, caracterizado por compreender uma etapa adicional de: n) remover os grupos de proteção de cadeia la- teral a fim de proporcionar um peptideo in- sulinotrópico que inclui a seqüência de ami- noácidos HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO. 5) e contrapartes do mesmo, em que cada um dos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 indica, independentemente, um resí- duo de aminoácido aquiral, opcionalmente obstruído estericamente.

4. - Método para preparar um peptídeo insu- linotrópico, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por compreender as etapas de: a) proporcionar um primeiro fragmento de peptí- deo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 é um resíduo de aminoácido correspondente a Aib e X10 é um resíduo de aminoácido correspondente a glicina, com cada um de H e E incluindo op- cionalmente proteção de cadeia lateral; b) proporcionar um segundo fragmento de peptí- deo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17"18YLEG (SEQ ID NO. 8) em que o resí- 1Ί ia duo assinalado pelo símbolo Xi e um resí- duo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, os ditos resíduos de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; c) acoplar o primeiro fragmento ao segundo fragmento para proporcionar um terceiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17~18YLEG (SEQ ID NO.11), os ditos resíduos de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; d) proporcionar um quarto fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKE- FIAWLVKX35 (SEQ ID NO.9), em que X35 é um re- síduo de um aminoácido correspondente a Aib, os ditos resíduo de aminoácido da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; e) acoplar o quarto fragmento de peptideo a ar- ginina a fim de proporcionar um quinto frag- mento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos QAAKEFIAWLVK X35R {SEQ ID NO. 12), os ditos resíduos da seqüência incluin- do opcionalmente proteção de cadeia lateral; e f) acoplar o quinto fragmento ao terceiro frag- mento seguido por remoção dos grupos de pro- teção de cadeia lateral a fim de proporcio- nar um peptideo insulinotrópico da fórmula que inclui HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R (SEQ. ID 8 35

5. e suas contrapartes, em que XeX são resíduos de aminoácidos correspondentes a Aib e X10 é um resíduo de aminoácido cor- respondente a glicina. - Método para preparar um peptideo insu- linotrópico, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado por compreender a etapa de: a) preparar um fragmento de peptideo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ. ID

6. em que X8 e X10 são cada um deles resí- duos de um aminoácido aquiral, ou o dito fragmento é uma contraparte do mesmo que in- clui os resíduos X8 e X10, cada um de Η, E, X8 e X10 incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; e incorporar o fragmento de peptídeo era um pep'tideo in- sulinotrópico. β - Método, de acordo com as reivindica- ções 1 ou 5, caracterizado por X8 ser um resíduo de a- minoácido correspondente a metil alanina.

7. - Método, de acordo com as reivindica- ções 1 ou 5, caracterizado por X10 ser um resíduo de aminoácido correspondente a glicina.

8. - Fragmento de peptídeo, caracterizado por ser dotado da seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO-6), em que X8 e X10 são, cada um deles, resíduos de um aminoácido aquiral, sendo que cada um de Η, Ε, X e X10 inclui opcionalmente uma proteção de cadeia late- ral.

9. - Fragmento de peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por X8 ser um resíduo de aminoácido correspondente a Aib e X10 ser um resíduo de aminoácido correspondente a glicina.

10. - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o peptídeo insulinotrópico incluir a seqüência de aminoácidos (SEQ. ID No. 5) hx8ex10t ftsdvs sylegqaakefiawlvkx35r E as suas contrapartes, em que cada um dos símbolos X nas posições, 8, 10, e 35 indicam independentemente um resíduo de aminoácido opcionalmente obstruído esterica- mente; e em que um ou mais dos resíduos de aminoácido opcionalmente inclui proteção de cadeia lateral.

11. - Método, de acordo com a reivindicação Λ TC 10, caracterizado por pelo menos um de X e X ser um resíduo de Aib.

12. - Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por X10 ser um resíduo de glicina.

13. - Método para preparar um peptídeo in- sulinotrópico, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por compreender a etapa de b) preparar um fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17~18YLEG (SEQ. ID No.8) em que o resíduo assinalado pelo símbolo χ17"18 é um resíduo dipeptídico de uma pseudoprolina; e incorporar o fragmento de peptídeo em um peptídeo insu- linotrópico.

14. - Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o peptídeo insulinotrópico inclu- ir a seqüência de aminoácidos HX8EX10TFTSDVX17~lsYLEG QA- AKEFIAWLVKX35R (SEQ ID NO.13) e as suas contrapartes, em que os símbolos X8, X10, e X35 cada um independente- mente indica um resíduo de aminoácido aquiral, e X é um resíduo de uma pseudoprolina, os ditos resíduos de aminoácidos incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral.

15. - Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizado por X17"18 ter a fórmula <formula>formula see original document page 112</formula> em que Φ representa o resíduo de qualquer aminoácido que opcionalmente inclui proteção de cadeia lateral e cada um de R1 e R2 é independentemente uma metade de encadeamento bivalente adequada.

16. - Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por Φ representar um resíduo de Ser, que inclui opcionalmente proteção de cadeia lateral.

17. - Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por R2 ser -CH2-.

18. - Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por R1 ser <formula>formula see original document page 112</formula> em que cada um de R3 e R4 é independentemente uma meta- de monovalente selecionada a partir de H ou alquila in- ferior; ou R3 e R4 também podem ser co-elementos de uma estrutura de anel.

19. - Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por cada um de R3 an R4 ser metila.

20. - Pept ídeo ou contraparte do mesmo, caracterizado por incluir a seqüência de aminoácidos TFTSDVX17_18YLEG (SEQ. ID NO. 8) em que o residuo assina- lado pelo símbolo χ17"18 é um resíduo dipeptídico de uma pseudoprolina; os ditos resíduos de aminoácidos inclu- indo opcionalmente proteção de cadeia lateral.

21. - Método para preparar um peptídeo in- sulinotrópico, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por compreender a etapa de: c) acoplar o primeiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 (SEQ ID NO. 6), em que X8 e X10 são cada um resíduos de um aminoácido aquiral, cada um de H e E opcionalmente incluindo proteção de cadeia lateral, ao segundo fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoá- cidos TFTSDVX17~18YLEG (SEQ ID NO. 8), em que 17 — 18 ' o resíduo assinalado pelo símbolo X e um resíduo de dipeptídeo de uma pseudoprolina, com o dito resíduo de aminoácidos da se- qüência que inclui opcionalmente proteção de cadeia lateral, para proporcionar um terceiro fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoácidos HX8EX10 TFTSDVX17" 18YLEG (SEQ ID NO.11), o dito resíduo de a- minoácidos da seqüência que inclui opcio- nalmente proteção de cadeia lateral; e incorporar o fragmento de peptídeo em um peptídeo insu- linotrópico.

22. - Método para preparar um peptídeo in- sulinotrópico, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por compreender a etapa de d) preparar um fragmento de peptideo ou contra- parte do mesmo que inclui a seqüência de a- minoácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9), em que X35 é um resíduo de um aminoácido a- quiral, os ditos resíduos da seqüência in- cluindo opcionalmente proteção de cadeia la- teral; e incorporar o fragmento de peptídeo em um peptídeo insu- linotrópico.

23. - Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por X35 ser um resíduo de aminoácido de metilalanina.

24. - Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender ainda a etapa de: e) acoplar o framento de peptídeo ou contrapar- te do mesmo que inclui a seqüência de amino- ácidos QAAKEFIAWLVKX35 (SEQ ID NO. 9) a argi- nina a fim de proporcionar um fragmento de peptídeo que inclui a seqüência de aminoáci- dos QAAKEFIAWLVK X35R (SEQ ID NO. 12), OS di- tos resíduos da seqüência incluindo opcio- nalmente proteção de cadeia lateral.

25. - Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por R não incluir proteção de cadeia lateral.

26. - Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o peptideo insulinotrópico inclu- ir a seqüência de aminoácidos hx8ex10tftsdvx17~ 18Ylegqaakefiawlvkx35R (seq id no.13) e suas contrapar- tes, em que os símbolos x8, x10, e x35 cada um indepen- dentemente indica um resíduo de aminoácido aquiral, os ditos resíduos de aminoácidos da seqüência incluindo opcionalmente proteção de cadeia lateral; e em que X17" 18 é um resíduo de uma pseudoprolina.

27. - Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o peptideo insulinotrópico inclu- ir a seqüência de aminoácidos (SEQ. id No. 5) hx8ex10tftsdvssylegqaakefiawl vkx35r E as suas contrapartes, em que cada um dos símbolos X nas posições 8, 10, e 35 indica independentemente um resíduo de aminoácido opcionalmente obsteuído esterica- mente, aquiral; e em que um ou mais dos resíduos de a- minoácidos inclui opcionalmente proteção de cadeia la- teral .

28. - Método, de acordo com as reivindica- ções 1 a 7, 13 ou 21 a 25, caracterizado por o peptideo insulinotrópico ser dotado da seqüência de aminoácidos (SEQ. ID No. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR E suas contrapartes.

29. - Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o peptideo insulinotrópico ser dotado da seqüência de aminoácidos (SEQ. ID No. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR e suas contrapartes, que é amidfado no término-C.