CN101563364A - 促胰岛素肽合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促胰岛素肽的制备，所述促胰岛素肽利用固相和溶液相(“杂合”)方法合成。一般地，所述方法包括利用固相化学合成3种不同的肽中间体片段。然后，利用溶液相化学将额外的氨基酸物质添加到片段中的一个上。然后，将所述片段在固体溶液相中偶联在一起。在一个片段中使用假脯氨酸使得所述片段的固相合成更容易，并且还使得将这一片段偶联到其它片段的后续的溶液相更容易。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP－1(7－36)以及它的天然的和非天然的负体。

Description

促胰岛素肽合成
本发明涉及利用固相和溶液相方法制备促胰岛素肽、特别是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的方法。本发明还涉及可以用在这些方法中的中间体肽片段。
在文献中描述了很多肽合成方法(例如，参见美国专利号6,015,881；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4005-4008；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4009-4012；Kamber等.(编)，肽、化学和生物(Peptides，Chemistry and Biology)，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：9307-9320；Lloyd-Williams等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：11065-11133；和Andersson等.(2000)生物聚合物(Biopolymers)55：227-250)。许多合成方法以所述合成在其中发生的相的物体状态，即液相或固相，进行区分。
在固相肽合成(SPPS)中，将氨基酸或肽基团结合到固体支持物树脂上。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到结合在支持物上的肽上，直到形成目的肽物质。然后结合在支持物上的肽典型地被从所述支持物上切离，并且进行进一步的加工和/或纯化。在一些情形中，固相合成产生成熟的肽产物；在另一些情形中，从所述支持物上切离下的肽(即，“肽中间体片段”)用于制备更大的、成熟的肽产物。
从固相方法生成的肽中间体片段可以在固相或在液相合成过程(本文叫作“溶液相合成”)中偶联在一起。溶液相合成可以特别有效地用于通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或不实际的情形中。例如，在固相合成中，更长的肽尽管仍然附着在固体支持物上，但是最终可能采取不规则的构象，使得很难将其它的氨基酸或肽物质添加到延长的链上。由于肽链在支持物树脂上变得更长，加工步骤诸如偶联和去保护的效率可能受到损害。除了起始材料如活化的氨基酸、共同试剂和试剂的增加的损失之外，这又可能导致更长的加工时间来弥补这些问题。这些问题可能随着肽长度的增加而增加。
因此，仅利用固相方法，发现在单一片段合成的长度大于30个氨基酸的成熟的肽相对是不常见的。相反，可以在固相上分开合成个体片段，然后偶联到固相和/或溶液相，以构建需要的肽产物。这种方法需要仔细选择片段候选物。尽管一些通用原理可以指导片段选择，但是通常非常需要凭经验检测片段候选物。在一种情形中作用的片段策略可能在其它情形中不起作用。甚至在不包括合理的片段候选物时，对于合成策略仍然可能需要加工创新，以在商业合理条件下作用。因此，利用杂合方案的肽合成通常是具有挑战性的，并且在许多情形中，在进行实际合成之前很难预测在合成方案中固有什么样的问题。
在溶液相偶联中，两种肽中间体片段、或肽中间体片段和活性氨基酸在适当的溶剂中偶联，通常在促进偶联反应的效率和质量的其它试剂的存在下进行偶联。所述肽中间体片段是反应性排列的，因此一个片段的N端偶联到另一个片段的C端，或者反之亦然。另外，在溶液相偶联过程中，在固相合成过程中存在的侧链保护基团通常保留在所述片段上，以确保所述片段末端的特异性反应性。这些侧链保护基团典型地直到形成成熟的肽之后才去除。
在综合合成方案中的一个步骤或多个步骤中的适度改进可以汇集成制备成熟的肽中的显著的改进。这样的改进可以导致时间和试剂的更大、全面的节约，并且还可以显著提高终产物的纯度和产量。
尽管关于在杂合合成中的改进的重要性的讨论适用于利用这些方法生产的任何种类的肽，但是在治疗有用性的肽和以商业医药用途规模制造的肽的情形中特别重要。合成更大的生物分子药物，诸如治疗性肽，可能是非常昂贵的。由于试剂的成本、合成时间，许多合成步骤，除了其它因素之外，在这些更大生物分子药剂的合成过程中的很小的改进可能对于生产这样的药剂是否甚至是经济可行的具有显著影响。这样的改进是必需的，原因在于对于更大的生物分子药剂的这些高生产成本，这是得到这样的事实的支持的，即，在许多情形中，对于这些类型的更大生物分子药剂，存在很少，如果有一些的话，适当的治疗性备选物。
这在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的情形中可以清楚的看出。这些肽已经作为可能的治疗剂参与治疗2型非胰岛素依赖型糖尿病糖尿症以及相关的代谢病症，诸如肥胖症。Gutniak，M.K.，等，糖尿病基因(DiabetesCare)1994：17：1039-44。
Lopez等确定天然的GLP-1长度是37个氨基酸残基。Lopez，L.C.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，80：5485-5489(1983)。这一确定得到Uttenthal，L.O.，等，临床内分泌学和代谢学杂志(J.Clin.Endocrinal.Metabol.)，61：472-479(1985)的工作的证实。天然GLP-1可以由符号GLP-1(1-37)表示。这一符号表示所述肽具有从1(N端)到37(C端)的全部氨基酸。天然的GLP-1具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列：
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
已经报道天然GLP-1(1-37)通常不能调控胰岛素的生物合成，但是该肽的生物学重要的片段确实具有促胰岛素特征。例如，SEQ ID NO.2所述的长度为31个氨基酸的天然肽GLP-1(7-37)：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
是促胰岛素的，并且具有天然GLP-1的7(N端)-37(C端)的氨基酸。GLP-1(7-37)具有末端甘氨酸。当这个甘氨酸不存在时，得到的肽仍然是促胰岛素活性的，并且叫作GLP-1(7-36)，其为SEQ ID NO.3：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
GLP-1(7-36)通常以C端精氨酸酰胺化的形式存在，并且这种形式可以由符号GLP-1(7-36)-NH2表示。
GLP-1(1-37)通常在体内转化成它的促胰岛素活性的负体。例如，GLP-1(1-37)在体内自然转化成GLP-1(7-37)。该肽又还可以进行蛋白水解去除C端甘氨酸的额外的加工以产生GLP-1(7-36)，其通常以酰胺化形式GLP-1(7-36)-NH2存在。因此，治疗性治疗可以包括施用GLP-1(1-37)或其负体，期望在体内形成它的促胰岛素活性的衍生物。然而，更普遍地，在研究中的治疗性治疗包括施用促胰岛素活性GLP-1片段本身。
依据US 6,887,849，GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)和GLP-1(7-36)-NH2的促胰岛素活性似乎是对胰腺β细胞特异性的，在其中这些肽似乎诱导胰岛素的生物合成。这使得这些肽和它们的药用负体有效用于成年起病型糖尿病糖尿症的病理研究，成年起病型糖尿病糖尿症是一种以胰岛素分泌的动力学异常的高血糖症为特征的病症。此外，这些胰高血糖素样肽将有效用于这种疾病的治疗和处理，并且有效用于高血糖症的治疗和处理。依据EP 1137667B1，这些肽或它们的药用负体还可以有效用于治疗其它类型的糖尿病、肥胖症、胰高血糖症(glucagonomas)、呼吸的分泌紊乱、代谢紊乱、关节炎、骨质疏松症、中枢神经系统病、再狭窄、神经变性病、肾衰竭、充血性心脏衰竭、neophrotic综合征、硬化、肺水肿、高血压、和/或需要减少食物摄入量的病症。
SEQ ID NO.1-3的天然GLP-1(1-37)和它的促胰岛素活性负体是代谢不稳定的，在体内仅有1-2分钟的血浆半衰期。外源施用的GLP-1也快速地降解。这种代谢不稳定性已经限制了天然GLP-1和其天然片段的治疗潜力。
已经开发了具有提高的稳定性的GLP-1肽的合成负体。例如，在EP1137667B1中描述了SEQ ID NO.4的肽：
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
除了在位置8和35出现α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)的非手性残基取代在这些位置的相对应的天然氨基酸之外，该肽与天然GLP-1(7-36)相似。非手性α-氨基异丁酸还叫作甲基丙氨酸。该肽可以表示为式(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2。
EP 1137667陈述SEQ ID NO.4的肽及其负体可以利用固相技术构建为单一片段。由EP 1137667提出的单一片段合成方法是有问题的。一个问题是，这种方法可能在最后的氨基酸偶联中导致高水平的差向异构，例如，在例如(Aib8，35)GLP-1(7-36)的情形中的组氨酸。另外，在层析纯化过程中很难去除杂质，并且产量倾向于太低。因此，为了能够以商业接受的产量、纯度和数量制造该肽及其负体，需要用于合成SEQ ID NO.4的肽的改进的策略。
除了这些考虑之外，关于肽的大规模生产的产物回收和产物纯度的问题，以及试剂处理、储存和出售的问题可能极大地影响肽合成方案的可行性。因此，对于能够以具有提高的产量的大批次数量有效生产商业目的的肽物质的肽合成方法存在持续的需求。
本发明涉及利用固相和溶液相(“杂合”)方法合成的促胰岛素肽的制备。通常，所述方法包括利用固相化学合成3个不同的肽中间体片段。然后，利用溶液相化学将额外的氨基酸物质添加到一个片段上。然后，将所述片段在固相和溶液相中偶联在一起。在一个片段中使用假脯氨酸使得所述片段的固相合成更容易，并且还使得将这一片段偶联到其它片段的后续的溶液相更容易。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP-1、GLP-1(7-36)以及这些的天然的和非天然的负体，特别是GLP-1(7-36)以及它的天然的和非天然的负体。
在一方面，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)制备包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸残基，或所述片段是其包括X8和X10残基的负体，H、E、X8和X10中任一个可选地包含侧链保护；和
b)将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
优选地，X8是与甲基丙氨酸(Aib)相对应的氨基酸残基。X10优选是与甘氨酸相对应的氨基酸残基。
在另一个方面，本发明涉及具有氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸，H、E、X8和X10中任一个可选地包含侧链保护。优选地，X8是与Aib相对应的氨基酸残基。X10是与甘氨酸相对应的氨基酸残基。
在另一方面，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)制备包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ.ID No.8)的肽片段或其负体，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基；和
b)将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
在另一方面，本发明涉及包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ.ID No.8)的肽或其负体，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基；所述氨基酸残基任选地包含侧链保护。
在另一方面，本发明涉及制备权利要求1所述的促胰岛素肽的方法，所述方法包括步骤：
a)将包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段与包含氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，其中在第一肽片段中，X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H和E中的每一个任选地包含侧链保护；在第二肽片段中，由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；第三肽片段所述序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；和
b)将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
在另一方面，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)制备包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的肽片段或其负体，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
b)将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
在另一方面，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤中的一步或多步：
a)提供包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H和E中的每一个任选地包含侧链保护；
b)提供包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
c)将所述第一片段与所述第二片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，其中该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
d)提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的第四肽片段，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述氨基酸任选地包含侧链保护；
e)将所述第四肽片段与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.12)的第五肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
f)将所述第五片段与所述第三片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.13)的促胰岛素肽，该序列的所述残基任选地包含侧链保护。
优选地，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H和E中的每一个任选地包含侧链保护；
b)提供包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
c)将所述第一片段与所述第二片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，其中该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
d)提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的第四肽片段，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述氨基酸任选地包含侧链保护；
e)将所述第四肽片段与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.12)的第五肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
f)将所述第五片段与所述第三片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.13)的促胰岛素肽，该序列的所述残基任选地包含侧链保护。
在另一方面，本发明涉及如前文所述的方法，所述方法还包括下述步骤：
g)去除侧链保护基团，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.5)的促胰岛素肽及其负体，其中在位置8、10和35的符号X分别独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
去除侧链保护基团优选地通过使用去保护溶液进行，所述去保护溶液包含至少一种酸解试剂和至少一种阳离子清除剂。用于完全去保护的酸解试剂优选地选自由下列各项组成的组：三氟乙酸(TFA)，HCl，路易斯酸如BF3Et2O或Me3SiBr，液体氢氟酸(HF)，氢溴酸(HBr)，三氟甲烷-磺酸，和它们的组合。适当的阳离子清除剂优选地选自二硫苏糖醇，苯甲醚，对甲酚，乙二硫醇，和二甲硫。去保护溶液还可以包含水。
在另一方面，本发明涉及制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H，E，X8和X10中的每一个任选地包含侧链保护；
b)提供包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
c)将所述第一片段与所述第二片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，其中该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
d)提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的第四肽片段，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述氨基酸任选地包含侧链保护；
e)将所述第四肽片段与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.12)的第五肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
f)将所述第五片段与所述第三片段偶联，以提供式(SEQ ID NO.5)HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R的促胰岛素肽及其负体，其中在位置8，10和35的每个符号X独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且其中所述氨基酸残基中的一个或多个任选地包含侧链保护。
图1是依据本发明所述的合成方案的示意图。
片段12是包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的肽片段。片段14是包括氨基酸序列T11FTSD15VX17-18YL20EG(SEQ ID NO.8)的肽片段。片段16是包括氨基酸序列Q23AA25KEFIA30WLVKX35(SEQ ID NO.9)的肽片段。中间体片段18是包括氨基酸序列H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG(SEQ ID NO.11)的肽片段。中间体肽片段20是包括氨基酸序列Q23AA25KEFIA30WLVKX35R(SEQ ID NO.12)的肽。产物11是需要保护的肽H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG QAA25KEFIA30WLVKX35R(SEQ IDNO.13)，其中在位置17和18的Ser-Ser仍然是以被保护的假脯氨酸的形式。该方案在下文中更详细地描述。
下文所述的本发明的实施方案不是意欲是详尽的或者意欲将本发明限制为在下述详细描述中公开的具体形式。而是，选择并描述实施方案，以致本领域的其他技术人员可以领会和理解本发明的原理和实施。
本发明针对利用固相和/或溶液相技术制备肽如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)以及它的天然和非天然的促胰岛素活性负体的合成方法。本发明的肽分子可以是被保护的、未被保护的、或部分保护的。保护可以包括N端保护，侧链保护，和/或C端保护。尽管本发明通常针对这些胰高血糖素样肽、它们的负体、片段以及它们的负体、和融合产物以及它们的这些的负体的合成，但是本发明的创造性教导还可以适用于合成其它肽，特别是利用固相和溶液相方法的组合合成的那些。本发明还适用于合成与杂质特别是与焦谷氨酸杂质缔合的肽中间体片段。用于实施本发明的优选的GLP-1分子包括天然的和非天然的GLP-1(7-36)以及它们的负体。
当用于本文时，术语“包括氨基酸序列”优选地意指“具有氨基酸序列”。
当用于本文时，“负体”是指肽的天然的和非天然的类似物、衍生物、融合化合物、盐等。当用于本文时，肽类似物通常是指相对于另一种肽或肽负体具有修饰的氨基酸序列的肽，诸如通过一个或多个氨基酸取代、删除、翻转、和/或添加而进行的修饰。取代可以包括一个或多个天然的或非天然的氨基酸。取代优选地可以是保守的或高度保守的。保守取代是指用通常具有相同的净电荷和通常相同的大小和形状的另一种氨基酸取代氨基酸。例如，当在它们的侧链中的碳和杂原子总数的差别不多于4个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似相同的大小。当在它们侧链中的分支数目的差别不多于一个或两个时，它们具有近似相同的形状。认为在它们的侧链中具有苯基或取代的苯基的氨基酸具有大约相同的大小和形状。以下列出的是5组氨基酸。用同一组的另一种氨基酸取代化合物中的氨基酸通常导致保守取代。
组I：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链的(直链或单分支的)非天然存在的氨基酸。
组II：谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组III：赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组IV：谷氨酰胺，天冬酰胺，和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组V：苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
当用于本文时，术语“负体”更优选地是指肽的盐，或指它的在C端酰胺化的衍生物。
“高度保守的取代”是用在侧链上具有相同的官能团并且几乎相同大小和形状一种氨基酸取代一种氨基酸。当在它们侧链中的碳和杂原子的总数的差别不多于2个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当它们在它们的侧链中具有相同数目的分支时，它们具有几乎相同的形状。高度保守的取代的实例包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，和苯基甘氨酸取代苯丙氨酸。
“肽衍生物”通常是指具有其侧链基团、α碳原子、末端氨基、和/或末端羧基中的一个或多个的化学修饰的肽、肽类似物，或其它肽负体。例如，化学修饰包括，但不限于，添加化学部分，生成新的键，和/或去除化学部分。在氨基酸侧链基团的修饰包括，但不限于，赖氨酸ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括，但不限于，脱氨基，N-低级烷基、N-二-低级烷基、和N-酰基(例如，-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、和低级烷基酯修饰。优选的衍生物是在末端羧基酰胺化的那些衍生物，例如，肽的酰胺、低级酰胺或二烷基酰胺。因此，部分或完全保护的肽组成了肽衍生物。
在本发明的实施中，如果化合物能够刺激、或引起刺激、或辅助引起刺激激素胰岛素的合成或表达，那么该化合物具有“促胰岛素”活性。在优选的实施方式中，促胰岛素活性可以依据在美国专利号6,887,849和6,703,365中所述的测定证明。
在优选的实施方案中，本发明提供用于合成具有下式(SEQ.ID NO.5)：
HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R的合成(X8，X10，X35)GLP-1(7-36)肽及其负体的方法，其中在位置8、10和35的符号X独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X8，X10，和/或X35残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基团。依据该式所述的肽与天然GLP-1(7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X8和X35残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。X10残基可以衍生自天然非手性甘氨酸或另一种非手性氨基酸。非手性X8，X10和X35氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在发现使用这些氨基酸作为构建组件还促使如在图1所示和在下文进一步描述的本发明的合成途径更容易。
可以按照本发明的原理合成的(X8，X10，X35)GLP-11(7-36)肽的特别优选的实施方案包括依据式(SEQ ID NO.4)：
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化。该肽使用非手性α-氨基异丁酸(或甲基丙氨酸，示意性表示为缩写Aib)残基作为X8和X35，优选地在C端具有酰胺，在位置10使用天然G残基，并且可以指定为式(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2。这种符号表示与氨基酸“Aib”相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO.4的肽在EP 1137667 B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-1(7-36)肽更稳定得多。
本发明提供用于制备GLP-1(7-36)肽如(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2的改进的方法。例如，图1示意性显示用于合成GLP-1(7-36)肽以及它们的负体的一个示意性方案10。据信图1的方案10特别适用于GLP-1(7-36)肽的按比例增加合成。典型地进行按比例增加的步骤，以提供用于商业分布数量的肽。例如，在按比例增加步骤中的肽的量可以是500g或1kg/批次，并且更典型地数十-数百kg/批次或更多。在优选实施方案中，所述创造性方法可以提供这样的改进：减少加工(合成)时间，提高产物产量，提高产物纯度，和/或减少需要的试剂和起始原料的量。
图1所示的合成方案10利用固相和溶液相技术的组合来制备肽产物11。
如在图1中所示，方案10包括在固相合成肽中间体片段12、14和16.片段12是包括SEQ ID NO.6的氨基酸残基的肽片段：
HX8EX10
其中X8和X10如上文所定义，或者是其包括X8和X10残基的负体。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基团。在一些实施方案中，肽片段12可以通过C端与树脂结合。这一片段任选地可以携带N端和/或C端保护基团。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有效的N端保护基团。
片段12包括与天然GLP-1(7-36)肽的位置7-10的氨基酸相对应的4个氨基酸残基，并且因此可以用符号(X8，X10)GLP-1(7-10)表示。在优选实施方案中，依据SEQ ID NO.7：
H7AibEG10
X8是Aib，并且X10是甘氨酸，或者是在位置10包括Aib残基的它的负体。SEQ ID NO.7的肽片段可以用符号(Aib8)GLP-1(7-10)表示，以表示用Aib取代天然GLP-1(7-10)位置8的天然丙氨酸。
固相合成通常以片段12的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的X10氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端组氨酸残基(H))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。
SEQ ID NOS.6和7所述的肽片段的选择和使用在方案10内提供显著的优点。首先，由于，至少部分由于差向异构问题，H倾向于是难以添加到正在增长的肽链上的氨基酸残基。然而，片段12足够小，足以减轻在大片段中的这些考虑。然而，片段12足够长，足以具有两个手性中心。因此，简单的结晶允许所述片段被纯化。如果片段12在Aib终止，那么所述片段将只具有一个手性中心，并且结果，将更难以进行外消旋纯化。使得非手性的G位于C端也避免了外消旋考虑，如果片段12在C端以手性的E终止，则其可能另外是考虑的问题。简言之，选择片段12作为肽构建组件使得构建所述片段、纯化其、和将其偶联到其它肽物质上更容易。片段的选择还喜欢H的低外消旋性。令人惊讶地，H添加到这一片段上，具有非常低的外消旋水平，例如，在一些实施模式中，约3重量％。
片段14是包括SEQ ID NO.8：T11FTSD15VX17-18YL20EG的氨基酸残基的肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，其由下文进一步定义，或是在位置17和18包括X17-18的它的负体。除了使用假脯氨酸二肽残基X17-18代替占据天然GLP-1(7-36)中对应的位置17和18的SS(Ser-Ser)残基之外，片段14包括通常与天然GLP-1(7-36)肽的位置11-22中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基。
依据常规实施，片段14的氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基团。在一些实施方案中，肽片段14可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带N端和/或C端保护基团。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有效的N端保护基团。SEQ ID NO.8所述的肽片段可以由符号(X17-18)GLP-1(11-22)表示，以表示X17-18假脯氨酸残基取代在位置17和18的Ser-Ser残基。
当用于本发明的实施中时，术语假脯氨酸是指包括羟基官能氨基酸诸如Ser或Thr的残基的二肽，其中羟基官能侧链被保护成为在α-氨基和侧链羟基之间的脯氨酸样的、TFA易变的、噁唑烷环。作为噁唑烷环的结果，所述二肽作用为可逆的脯氨酸模拟物。
通常，结合到肽中的典型的假脯氨酸残基可以表示为式：
Figure A20078002326500191
其中Ф表示任何氨基酸残基，并且R1和R2分别独立地是适当的二价连接部分。通常，R1是下式的二价部分：
Figure A20078002326500201
其中R3和R4分别独立地是单价部分，如H，或低级烷基，如甲基。R3和R4还可以是环结构的共同成员。理想地，R3和R4分别是甲基。在噁唑烷环-保护的Ser的情形中，R2是二价部分CH2，而在Thr的情形中，R2是二价部分(CH3)CH。
术语“低级烷基”是指1-6个碳原子、优选1-4个碳原子的分支的或支链的单价烷基自由基。这一术语进一步示例为如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基丁基、正己基、2-乙基丁基等的自由基。优选的低级烷基残基是甲基和乙基，甲基是特别优选的。
在去保护过程中，切割R1部分，以提供下式所述的二肽残基：
Figure A20078002326500202
其中Ф和R2如上文所定义。当用于片段14时，假脯氨酸残基优选地对应这样的Ser-Ser残基，其中更接近C端的Ser用噁唑烷环保护，并且具有下述结构：
更接近N端的Ser的携带羟基的侧链被保护，诸如通过t-Bu保护基团保护。当保护的噁唑烷环结构和t-Bu被切割时，形成Ser-Ser残基。
在本发明的情形中，使用这样的脯氨酸模拟物作为合成片段14的构建组件提供了显著的优点。首先，片段14的固相合成变得极容易。当在片段14的固相合成中不使用假脯氨酸时，可能存在关于从残基13-11去除Fmoc的显著问题。据信这种困难可能是由于β折叠的形成。据信，通过减少β折叠形成的程度，使用假脯氨酸使得这些Fmoc去除容易得多。其次，下文所述的将片段14与片段12偶联形成片段18的随后固相变得更容易。在不存在假脯氨酸残基时，片段18在典型的溶液相偶联溶剂中的溶解度是极低的。假脯氨酸提高了片段18的溶解性特性，使得包括该片段与片段20的溶液相偶联更容易(参见下文图1的讨论)。
固相合成通常以从片段14的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的G氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。然而，将X17-18假脯氨酸二肽添加到正在增长的链的与GLP-1(7-36)的位置17和18相对应的位置，替代在位置17和18连续添加一对天然的Ser残基。在N端残基(例如，N端苏氨酸残基(T))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。
片段16是包括SEQ ID NO.9：Q23AA25KEFIA30WLVKX35所述的氨基酸残基的肽片段或其包括X35残基的负体，其中X35如上文定义。依据常规实施，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基团。除了在位置35是X35替代在该位置的天然氨基酸之外，片段16包括与天然GLP-1(7-36)肽的位置23-35中的氨基酸相对应的氨基酸残基。片段16可以表示为符号(X35)GLP-1(23-35)。
在一些实施方案中，肽片段16可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带侧链、N端和/或C-端保护基团。已经发现Fmoc是关于所述肽片段固相合成的特别有效的N端保护基团。
在优选实施方案中，依据SEQ ID NO.10：Q23AA25KEFIA30WLVKAib35或在位置35包括Aib的它的负体，X35是Aib。SEQ ID NO.10所述的肽片段可以用符号(Aib35)GLP-1(23-35)表示，以表示用Aib取代在天然GLP-1(7-36)的位置35的天然氨基酸。
注意到SEQ ID NOS.9和10所述的片段16在C端的位置36并不包括R(arg)残基。随后在溶液相中，将Arg偶联到片段16的C端，优选地使用没有侧链保护的Arg。这一策略在图1的方案10中提供显著的优点，因为它避免了作为使用保护的Arg的后果而倾向于发生的不需要的侧链反应。例如，当去保护被保护的Arg时，去保护作用副产物可以倾向于与肽的其它组成例如色氨酸反应。这减少了可从用于纯化的原始物质中获得的需要的肽的量。
固相合成通常以从片段16的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的X35氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端谷氨酰胺残基(Q))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。依据常规实施，用于片段16合成的任何一个氨基酸可以包含侧链保护。
由于与负载X35的支持物树脂邻近的空间位阻，将赖氨酸(34)和缬氨酸(33)偶联到正在增长的肽链上可能是有问题的。即使使用过量的氨基酸，也难以促使这些偶联反应完成。溶剂选择和/或末端-封端可以帮助减轻这一问题。已经发现偶联溶剂的性质可以影响偶联继续完成的程度。在一组试验中，例如，偶联反应在3∶1NMP/DCM，1∶1NMP/DCM，1∶1DMF/DCM，和3∶1DMF/DCM中进行。这些溶剂组成中的比例是基于体积基础的。NMP是指N-甲基吡咯烷酮，DCM是指二氯甲烷，和DMF是指二甲基甲酰胺。发现当使用1∶1DMF/DCM时，偶联反应进行得更远至完成。
在赖氨酸和缬氨酸分别偶联后的末端-封端还可以用来防止未反应的树脂-支持的物质在进一步的偶联反应中继续反应。在纯化过程中，如果需要纯化的话，末端-封端的物质更容易去除。可以利用常规末端-封端技术。
继续参考图1，组装片段12、14和16以及Arg，以完成需要的肽11。为了实现这，在固相上将片段12添加到片段14上，以产生更大的中间体片段18，所述中间体片段18结合SEQ ID NO.11：H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EG的氨基酸残基，其中X8，X10，和X17-18如上文定义。在优选实施方案中，X8是Aib，X10是天然的G，并且X17-18是如上文定义的假脯氨酸二肽残基。这一中间体肽片段可以由符号(X8，X10，X17-18)GLP-1(7-22)表示。
图1还显示在溶液相中将Arg添加到片段16的C端，以产生更大的中间体肽片段20，所述中间体肽片段20结合SEQ ID NO.12：Q23AA25KEFIA30WLVKX35R的氨基酸残基，其中X35如上文定义，并且优选是Aib。优选地，以这种方式添加到肽片段上的Arg不包含侧链保护。这种中间体肽片段20可以由符号(X35)GLP-1(23-36)表示。然后，将肽片段18和20在溶液相中偶联，以产生SEQ ID NO.13所述的需要的保护的肽11，其中在位置17和18的Ser-Ser仍然是采用保护的假脯氨酸形式：
H7X8EX10TFTSD15VX17-18YL20EGQAA25KEFIA30WLVKX35R
肽11可以指定为符号(X8，X10，X17-18，X35)GLP-1(7-36)。在其它氨基酸携带侧链保护的程度上，理想地在这一步骤过程中维持这种保护。
在进行图1的反应方案时，固相和溶液相合成可以通过工业上已知的标准方法进行。在代表性实施模式中，利用化学法在固相中合成肽，通过化学法将氨基酸从C端添加到N末端。因此，最接近特定片段的C端的氨基酸或肽基团是第一个添加到树脂上的。这通过将氨基酸或肽基团C端的官能性与树脂支持物上的互补官能性反应而发生的。所述氨基酸或肽基团的N端被掩蔽，以防止不需要的侧链反应。所述氨基酸或肽基团理想地还包含侧链保护。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到与支持物结合的肽物质上，直到形成目的肽。依据常规实施，这些中的大部分还包含侧链保护。随着每次连续的偶联，在与树脂结合的肽物质的N末端掩蔽基被去除。然后，这与N端被掩蔽的下一个氨基酸的C端反应。因此，固相合成的产物是与树脂支持物结合的肽。
可以使用适合实施固相肽合成的任何类型的支持物。在优选实施方案中，所述支持物包括可以由一种或多种聚合物、聚合物的共聚物或组合制成的树脂，所述聚合物诸如聚酰胺、聚硫酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖、或聚苯乙烯。聚合物支持物还可以是对肽合成中所用的溶剂是充分不溶和惰性的任何固体。固体支持物典型地包括连接部分，在合成过程中正在增长的肽与其偶联，并且所述连接部分可以需要的条件下分裂，以将肽从支持物上释放。适当的固体支持物可以具有接头，所述接头是光-分裂性的、TFA-分裂性的、HF-分裂性的、氟化物离子-分裂性的、还原剂-分裂性的；Pd(O)-分裂性的；亲核-分裂性的；或自由基-分裂性的。优选的连接部分是在某些条件下可切离的，以致被切离的肽的侧链基团仍然是基本上完全被保护的。
在一种优选的合成方法中，肽中间体片段在包含三苯甲基基团的酸敏性固体支持物上合成，并且更优选地在包含具有悬垂的氯基团的三苯甲基基团的树脂，例如2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂(Barlos等.(1989)四面体通讯(Tetrahedron Letters)30(30)：3943-3946)上合成。实例还包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基树脂、4-氨基甲基苯甲酰基2-氯三苯甲基树脂、3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基树脂、溴乙酸2-氯三苯甲基树脂、氰基乙酸2-氯三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基树脂、glicinol 2-氯三苯甲基树脂、丙酸2-氯三苯甲基树脂、乙二醇2-氯三苯甲基树脂、N-Fmoc羟铵2-氯三苯甲基树脂、肼2-氯三苯甲基树脂。一些优选的固体支持物包含聚苯乙烯，其可以与二乙烯基苯共聚，形成反应基团与其锚定的支持物物质。
用于固相合成的其它树脂包括“Wang”树脂，其包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，所述共聚物具有4-羟甲基苯基-氧甲基锚定基团(Wang，S.S.1973，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.))，和4-羟基-甲基3-甲氧基苯氧丁酸树脂(Richter等.(1994)，四面体通讯(Tetrahedron Letters)35(27)：4705-4706)。所述Wang、2-氯三苯甲基氯和4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可以购自，例如，加利福尼亚州圣地亚哥的Calbiochem-Novabiochem公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，California)。
为了准备用于固相合成的树脂，树脂可以在适当的溶剂中预先洗涤。例如，将固相树脂如2-CTC树脂添加到肽室中，并且用适当的溶剂预先洗涤。预洗的溶剂可以基于偶联反应中所用的溶剂(或溶剂混合物)的类型进行选择，或反之亦然。适用于洗涤以及随后的偶联反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)，二氯乙烷(DCE)，二甲基甲酰胺(DMF)，等，以及这些试剂的混合物。其它有用的溶剂包括DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，以及它们的混合物。在一些情形中，偶联可以在二元溶剂系统中进行，诸如在以在9∶1-1∶9、更普遍的4∶1-1∶4范围内的体积比的DMF和DCM的混合物中进行。
除非另外指明，本发明的合成优选地在适当的保护基团的存在下进行。保护基团的性质和应用是本领域公知的。通常，适当的保护基团是可以在加工和合成过程中帮助防止附着在其上的原子或部分如氧或氮参与不需要的反应的任何种类的基团。保护基团包含侧链保护基团和氨基-或N端保护基团。保护基团还可以防止羧酸、硫醇等的反应或键合。
侧链保护基团是指与氨基酸的侧链(即，在通用氨基酸式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基团)偶联的化学部分，其帮助防止所述侧链部分与肽合成、加工等步骤中所用的化学试剂反应。侧链-保护基团的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型、肽要进行的加工、和需要的中间体产物或终产物。侧链保护基团的性质还取决于氨基酸自身的性质。通常，选择这样的侧链保护基团，即，所述侧链保护基团在固相合成过程中在α-氨基基团的去保护过程中不被去除。因此，所述α-氨基保护基团和所述侧链保护基团典型地是不相同的。
在一些情形中，并且取决于固相合成和其它肽加工中所用的试剂的类型，氨基酸可以不需要存在侧链保护基团。这样的氨基酸在侧链中典型地不包含活性氧、氮、或其它活性部分。
侧链保护基团的实例包括乙酰基(Ac)，苯甲酰(Bz)，叔-丁基，三苯基甲基(三苯甲基)，四氢吡喃基，苯甲醚(Bzl)和2，6-二氯苯基(DCB)，叔-丁氧基羰基(Boc)，硝基，p-甲苯磺酰基(Tos)，adamantyloxycarbonyl，呫吨基(Xan)，苄基，2，6-二氯苯甲基，甲基，乙基和叔-丁基酯，苄氧基羰基(Z)，2-二氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)，t-戊氧基-羰基(Aoc)，和芳香族或脂肪族尿烷型保护基团如硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)；和氟化物易变基团如三甲代甲硅烷基氧基羰基(TEOC)。
在本发明的实施中，用于合成GLP-1肽通常所用的氨基酸的优选侧链保护基团在下表A中显示：
表A：
  氨基酸   侧链保护基团
  Aib   无
  Ala   无
  Arg   无
  氨基酸   侧链保护基团
  Asp   t-丁基酯(OtBu)
  Gln   三苯甲基(trt)
  Glu   OtBu
  Gly   无
  His   三苯甲基(trt)
  Ile   无
  Leu   无
  Lys   叔-丁氧基羰基(Boc)
  Phe   无
  Ser   t-丁基(tBu)
  X17-18(对应于Ser-Ser)   在更接近C端的Ser的α氮和OH之间的噁唑烷环；在另一个Ser上的tBu
  Thr   tBu
  Trp   Boc
  Tyr   tBu
  Val   无
氨基端保护基团包括与氨基酸的α氨基基团偶联的化学部分。典型地，在下一个氨基酸被添加到正在增长的肽链上之前，氨基端保护基团在去保护反应中去除，但是当肽从支持物上切离下来时可以保持。氨基端保护基团的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型和需要的中间体产物或终产物的类型。
氨基端保护基团的实例包括(1)酰基型保护基团，诸如甲酰基，烯丙酰(Acr)，苯甲酰基(Bz)和乙酰基(Ac)；(2)芳香族尿烷型保护基团，诸如苄氧基羰基(Z)和取代的Z，诸如对-氯苄氧基羰基，对-硝基苄氧基羰基，对-溴苄氧基羰基，对-甲氧基苄氧基羰基；(3)脂肪族尿烷保护基团，诸如叔-丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰基，异丙基氧基羰基，乙氧基羰基，烯丙氧基羰基；(4)环烷基尿烷型保护基团，诸如9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，环戊氧基羰基，adamantyloxycarbonyl，和环己基氧基羰基；和(5)硫代尿烷-型保护基团，诸如苯硫羰基。优选的保护基团包括9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，2-(4-联苯基)-丙基(2)氧基羰基(Bpoc)，2-苯基丙基(2)-氧基羰基(Poc)和叔-丁氧基羰基(Boc)。
Fmoc或Fmoc-样化学试剂是固相肽合成高度优选的，因为利用微酸性分裂试剂分裂处于保护状态的得到的肽相对直接地进行。在得到的副产物、杂质等方面，这种分裂反应相对比较干净，使得以大规模基础从溶胀和收缩洗液中回收肽是技术和经济可行的，增加产量。当用于本文时，关于肽合成的“大规模”通常包括合成在至少500g、更优选至少2kg/批次的范围内的肽。大规模合成典型地在大反应容器中进行，诸如在钢反应容器中，其可以容纳大量试剂如树脂、溶剂、氨基酸、用于偶联的化学试剂、和去保护反应，其具有允许生产在千克到公制的吨范围内的肽的大小。
另外，Fmoc保护基团可以相对于侧链保护基团选择性地从肽上切离下来，以致当切离Fmoc时，侧链保护留在原位。这种选择性在氨基酸偶联过程中对最小化侧链反应是重要的。另外，所述侧链保护基团可以相对于Fmoc选择性地切离以去除它们，将Fmoc留在原位。在下文所述的纯化方案过程中，非常有利地依赖于后一种选择性。
固相偶联反应可以在增强或提高偶联反应的一种或多种化合物的存在下进行。可以提高反应速率并且减小副反应速率的化合物包括鏻盐和uronium盐，在叔碱如二异丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)的存在下，所述鏻盐和uronium盐可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类(例如，BOP，PyBOPO，HBTU，和TBTU都产生HOBt酯)。其它试剂通过提供保护试剂而辅助防止外消旋作用。这些试剂包括具有加入的辅助亲核体(例如，1-羟基-苯并三唑(HOBt)，1-羟基-氮杂苯并三唑(HOAt)，或HOSu)的碳二亚胺(例如，DCC或WSCDI)。还可以使用混合的酐方法，其利用异丁基氯甲酸酯，具有或没有添加的辅助亲核体，由于与叠氮化物相关的低外消旋作用，所述方法可以是叠氮化物方法。这些类型的化合物还可以增加碳二亚胺-介导的偶联的速率，以及防止Asn和Gln残基脱水。
在确定偶联完成后，将偶联反应混合物用溶剂洗涤，并且对于肽物质的后续氨基酸残基的每一个重复偶联循环。为了偶联下一个氨基酸，从与树脂结合的物质去除N端保护基团(例如，Fmoc基团)典型地通过用在溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)中包含20-50％(基于重量)的哌啶的试剂处理而实现。在去除Fmoc保护基团之后，典型地进行一些洗涤，以去除残留的哌啶和Fmoc副产物(诸如二苯并富烯和其哌啶加合物)。
后续氨基酸可以以相对于在树脂支持物上的肽物质的负载因子以化学计量过量的氨基酸进行使用。通常，偶联步骤所用的氨基酸的量至少等于在树脂上的第一氨基酸的负载因子(1当量或更多)。优选地，偶联步骤所用的氨基酸的量至少为1.3当量(0.3过量)或更多，并且最优选地约1.5当量(0.5过量)或更多。在一些情形中，例如，偶联步骤利用等于1-3范围内的氨基酸的量。
在最后的偶联循环之后，树脂用溶剂如NMP洗涤，然后用惰性第二溶剂如DCM洗涤。为了从树脂上去除合成的肽物质，切离处理以这样的方式进行，以致切离的肽物质仍然携带充分的侧链和末端保护基团。在树脂切离过程中或之后，使得保护基团保留在原位帮助防止肽片段的不需要的偶联或其它不需要的反应。在当使用Fmoc或相似的化学试剂合成肽的情形中，被保护的切离可以以任何需要的方式实现，诸如通过使用相对弱酸试剂如醋酸，或将TFA稀释在如DCM的溶剂中。典型地，在DCM中使用0.5-10重量％、优选1-3重量％的TFA。参见，例如，美国专利号6,281,335。
从固相树脂切离肽中间体片段的步骤可以按照下述示例性过程的顺序进行。然而，可以利用有效从树脂切离肽中间体片段的任何适当的方法。例如，将约5-20、优选约10体积的含有酸性切离试剂的溶剂加入到含有与树脂结合的肽物质的容器中。因此，所述树脂，典型地以珠子的形式，浸没在该试剂中。当液体内容物在适当温度下搅拌适当的时间阶段时，发生切离反应。搅拌帮助防止珠子结块。适当的时间和温度条件将取决于这样的因素，诸如所用的酸试剂、肽的性质、树脂的性质等。作为通用的指导，在约-15℃-约5℃、优选地约10℃-约0℃持续约5分钟-2小时、优选地约25分钟-约45分钟的搅动将是适宜的。切离时间可以在约10分钟-约2小时或者甚至如一天一样久的范围内。切离理想地在这样冷却的温度范围内进行，以调节典型地可能在反应过程中发生的反应放热曲线。另外，切离反应的更低温度防止酸敏性侧链保护基团如三苯甲基基团在这一阶段被去除。
在分裂处理结束时，反应终止。这可以，例如，通过将切离试剂与适当的碱诸如吡啶等结合，并且继续搅拌和搅动额外的时间阶段如额外的5分钟-2小时、优选地约20分钟-约40分钟而实现。加入碱和持续的搅拌使得容器内容物的温度增加。在搅拌结束时，容器内容物可以处于约0℃-约15℃、优选地约5℃-约10℃的范围内的温度。
诸如溶胀和收缩树脂以提高肽回收的方面的因素可以任选地结合在整个合成过程中。例如，这些技术在美国专利公布号2005/0164912A1中描述。
在一些方面，可以制备切离的肽片段，用于溶液相，与其它肽片段和/或氨基酸偶联。在溶液相的肽偶联反应，例如，在肽偶联试剂的新趋势(New Trends in Peptide Coupling Reagents)；Albericio，Fernando；Chinchilla，Rafeal；Dodsworth，David J.；和Najera，Armen；国际有机制备和方法(Organic Preparations and Procedures International0(2003)，33(3)，203-303中描述。
在溶液相中将肽中间体片段与其它片段或氨基酸偶联可以利用原位偶联试剂进行，所述原位偶联试剂例如，2-(1H-苯并三唑-1-基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(phosphate)(BOP)，o-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲(uranium)六氟磷酸酯(HBTU)，o-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，二环己基碳二亚胺(DCC)，水溶性碳二亚胺(WSCDI)，或o-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲(uronium)四氟硼酸酯(TBTU)。其它偶联技术利用预制的活性酯如羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和对-硝基苯酚(HONp)酯；预制的对称酐；不对称酐如N-羧基酐(NCAs)；或酸性卤化物如酰基氟化物和酰基氯化物。
适当的偶联溶剂可以用于溶液相偶联反应中。应该理解，所用的偶联试剂可以影响形成的肽键的外消旋程度；肽和/或肽片段的溶解性；和偶联反应速率。在一些实施方案中，偶联溶剂包括一种或多种水易混合性试剂。水易混合性溶剂的实例包括，例如，DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二噁烷，或它们的混合物。
在其它实施方案中，偶联反应可以包括一种或多种非水易混合性溶剂。示例性的非水易混合性溶剂是二氯甲烷。在这些实施方案中，所述非水易混合性溶剂优选地与去保护反应相容；例如，如果使用非水易混合性溶剂，则优选它不会不利地影响去保护反应。
在形成肽11后，在需要时，产物可以进行去保护、纯化、冻干、进一步加工(例如，与另一种肽反应以形成融合蛋白)；这些的组合，和/或类似的。
例如，按照本发明，在整个固相合成过程中，并且还在整个溶液相偶联反应过程中，侧链保护基团典型地保留在肽中间体片段上。通常，在溶液相偶联步骤完成后，可以进行一步或多步去保护步骤，以从肽上去除一个或多个保护基团。
通过完全去保护去除侧链保护基团典型地利用包含酸水解试剂的去保护溶液，以切离侧链保护基团。通常用于完全去保护的酸水解试剂包括纯的三氟乙酸(TFA)，HCl，路易斯酸如BF3Et2O或Me3SiBr，液体氢氟酸(HF)，氢溴酸(HBr)，三氟甲烷磺酸，以及它们的组合。去保护溶液还包括一种或多种适当的阳离子清除剂，例如，二硫苏糖醇(DTT)，苯甲醚，对甲酚，乙二硫醇，和二甲硫。去保护溶液还可以包含水。当用于本文时，在去保护组合物中存在的试剂的量典型地以比例表示，其中单个成分的量表示为单位为“份”的分子(numerator)，诸如“份重量”或“份体积”，并且分母是该组合物的总份数。例如，包含比例为90∶5∶5(重量/重量/重量)的TFA∶H2O∶DTT的去保护溶液具有重量为90/100份的TFA，重量为5/100份的H2O，重量为5/100份的DTT。
在一些实施方案中，可以进行去保护反应，其中酸水解试剂优选TFA在去保护组合物中的量为大于90/100重量份。其它优选地去保护组合物包括93/100重量份或更多的量，或在93/100重量份-95/100重量份范围内的量的酸水解试剂。
沉淀典型地使用醚，例如二乙基醚或MTBE(甲基叔丁醚)进行。沉淀后，在与其它成分组合之前，将肽理想地分离并干燥，冻干，包装，存储，进一步加工，和/或另外处理。这可以以任何适当的方式实现。按照一种适当的方式，肽通过过滤收集，用充足的MTBE洗液洗涤，以将最终盐含量减少到适当水平，然后干燥。
本发明还提供纯化宽泛范围的肽的有用技术，所述肽包括GLP-1肽和它们的负体。
特别优选的纯化方法包括经过层析介质的至少两次纯化，其中至少第一次经过在第一pH发生，并且至少第二次经过在第二pH发生。更优选地，第一次经过在酸性pH发生，而第二次经过在碱性pH发生。在优选实施方案中，至少一次在酸性条件下的经过在发生在碱性条件下的经过之前发生。实施这种纯化方法的示例性模式可以在纯化由图1所示的方案10获得的完全被保护的肽11的示例性情形中描述。首先，肽完全去保护。切离N端和侧链保护基团。经过第一次层析在水/ACN(乙腈)梯度中进行，使用足够的TFA以提供约1-5、优选地约2的pH。然后，第二次经过在水/CAN梯度中进行，使用少量氨水和/或乙酸铵，等等，以提供约8-9、优选8.5-8.9的pH。
pH值，不管是酸性还是碱性，促进了均一性，因为在每种情形中存在均一的离子种类。因此，酸性pH理想地充分低，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被质子化。碱性pH理想地足够高，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被去质子化。酸性和碱性层析可以以任何顺序进行。当肽醋酸盐是需要的产物时，便利地最后进行碱性层析，因为醋酸盐可能是层析产物。
现在，将参考下述示例性实施例进一步举例说明本发明的原理。在下文中，除非另外清楚地指明，所有的百分数和比例都是用体积表示的。
实施例1-片段12的固相合成，片段12在N端具有Fmoc保护，并且在 His和Glu上具有侧链保护。
A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂
首先，制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：
Figure A20078002326500321
将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且在25℃用400mLDCM溶胀30分钟。将沉积层(bed)排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将沉积层排干，并且用350mL DMF洗涤一次，再用175mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上剩余的活性位点用350mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用250mL DMF洗涤两次，然后用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供38.20g负载的树脂。分析表明负载因子为0.18mmol/g。
B.固相合成
使用20.0g在本实施例1中A部分制备的以0.18mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。
然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤5次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(2.85当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT，2.85当量)，将其溶解在2.55x体积的NMP中，然后在5℃-10℃与DIEA(3.25当量)组合。TBTU(2.85当量)在5℃-10℃溶解在1.3x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的1.3x体积的DCM润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，用激活的氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc保护基团的去除和偶联反应循环。
由于在活化的Fmoc-His(trt)-OH和H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC之间的偶联反应的困难以及活化的Fmoc-His(trt)-OH的不稳定性，通过在一小时后排干反应溶液，并立即用第二、新鲜的活化的Fmoc-His(trt)-OH溶液进行再偶联反应，而促使偶联反应完成。
在本实施例B部分所用的所有试剂在下表中列出：
  氨基酸   g   6-Cl-HOBT(g)   DIEA(g)   NMP(mL)   TBTU(g)   NMP(mL)   DCM(mL)   偶联时间(分钟)
  Glu(OtBu)   4.34   1.76   1.55   51.0   3.28   26.0   26.0   150
  Aib   3.36   1.76   1.51   51.0   3.29   26.0   26.0   155
  His(trt)   6.32   1.78   1.56   51.0   3.29   26.0   26.0   60
  His(trt)再偶联   6.32   1.79   1.56   51.0   3.29   26.0   26.0   92
将与树脂结合的肽片段用NMP(5体积)洗涤4次，DCM(6体积)洗涤5次，IPA(5体积)洗涤3次。然后，将消溶胀的树脂在真空下在35℃干燥，以提供22.58g树脂和与树脂结合的肽。
C.从树脂上切离Fmoc和侧链保护的片段
将由上述B部分构建的树脂在25℃在DCM(相对于所用的树脂重量为12.5体积；12.5ml DCM/g树脂或12.5升/kg)中溶胀30分钟，然后用DCM洗涤2次(每次洗涤用6.25体积)，以去除任何NMP残留物。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并且加入1％TFA/DCM(10体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液并在0℃搅拌30分钟。向反应器中加入吡啶(TFA的1.3当量)以中和TFA。将切离溶液过滤并且收集在烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM洗涤7次(7.5体积)。将洗液与切离溶液合并。DCM切离溶液与水(7.5体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，肽片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共4.73g的Fmoc-(Aib8)GLP-1(7-10)-OH。
实施例2
A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂
制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：
Figure A20078002326500341
将2-CTC树脂装入到500-mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将树脂排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(体积比为87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将树脂沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤一次，再用200mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上剩余的活性位点用390mL MeOH∶DIEA(体积比为9∶1)溶液末端-封端1小时。再将沉积层排干，用350mL DMF洗涤两次，并用350mL DCM洗涤4次。然后，将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂在35℃在真空下干燥至恒定重量，以提供48.51g负载的树脂。分析表明负载因子为0.54mmol/g。
B.固相合成
使用27.59g以0.54mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(300mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。
然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(1.7当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOB T，1.7当量)，将其溶解在4.6x体积的NMP中，然后在5℃-10℃与DIEA(1.9当量)合并。TBTU(1.7当量)在5℃-10℃溶解在2.28x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的2.28体积的DCM润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
  氨基酸   g   6-Cl-HOBT(g)   DIEA(g)   NMP(mL)   TBTU(g)   NMP(mL)   DCM(mL)   偶联时间(分钟)
  Glu(OtBu)   10.79   4.24   2.67   127   8.13   63   63   156
  Aib   8.26   4.32   3.73   125   8.14   65   65   180
  His(trt)   15.68   4.31   3.69   125   8.12   65   65   180
C.从树脂上切离片段
将构建的树脂用NMP(5体积)洗涤6次，然后用DCM(6体积)洗涤8次，以去除NMP残留物。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干后，加入1％TFA/DCM(10体积)的冰冷(在-5℃～-10℃)溶液，并将得到的瓶装混合物在0℃搅拌30分钟。向反应器中加入吡啶(TFA的1.3当量)以中和TFA。将切离溶液收集在烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM(7.5体积)洗涤11次，并且引流到切离溶液中。将DCM溶液与水(10体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共11.12g的Fmoc-(Aib8)GLP-1(7-10)-OH(78.8％的产量)。
实施例3
A.制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂
制备负载Fmoc-Gly的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：
Figure A20078002326500361
将2-CTC树脂装入到500-mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Gly-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤一次。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用390mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用350mL DMF洗涤两次，然后用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用4X250mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂在35℃在真空下干燥至恒定重量，以提供52.02g负载的树脂。分析表明负载因子为0.72mmol/g。
B.固相合成
使用24.43g以0.72mmol/g负载的Fmoc-Gly-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(250mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用5体积)。
然后，将树脂用在NMP中的20％的哌啶处理2次(每次处理用5体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用5体积)至阴性氯醌检测。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT)，将其溶解在NMP中，然后在10℃-5℃与DIEA合并。TBTU在10℃-5℃溶解在NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。烧瓶用加入到反应器中的DCM(用量参见下表)润洗，然后将其在25℃-27℃搅拌2-6小时。取出样品进行开氏检测(Kaiser Test)以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用5体积)。然后对于片段中剩余的氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
  氨基酸   g/Eq   6-Cl-HOBT(g/Eq)   DIEA(g/Eq)   NMP(mL)   TBTU(g/Eq)   NMP(mL)   DCM(mL)   偶联时间(分钟)
  Glu(OtBu)   12.40/1.65   4.95/1.65   4.29/1.85   145   9.37/1.65   70   70   180
  Aib   9.48/1.65   4.96/1.65   4.23/1.85   140   9.33/1.65   70   70   352
  Aib再偶联   4.73/0.83   2.48/0.83   2.15/0.92   72   4.85/0.83   36   36   120
  His(trt)   21.18/1.94   5.80/1.94   4.99/2.14   140   10.98/1.94   70   70   180
  His(trt)再偶联   10.80/0.97   2.90/0.97   2.48/1.07   72   5.49/0.97   36   36   180
C.从树脂上切离片段Fmoc-AA(7-10)-OH
将构建的树脂用NMP(5体积)洗涤6次，用DCM(6体积)洗涤7次，以去除NMP。将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并将树脂沉积层在0℃用1％TFA/DCM(11.26体积)的冰冷(-5℃～-10℃)溶液洗涤5分钟。将切离溶液收集在烧瓶中，烧瓶中已经加入吡啶(总TFA的1.3当量)以中和TFA。然后，向反应器中加入第二部分冰冷的1％TFA/DCM(6.14体积)，并且搅拌2分钟。再将第二切离溶液引流到收集烧瓶中。当容器加温到25℃时，树脂用DCM(8.2体积)洗涤9次，并且引流到切离溶液中。将DCM溶液与水(8.2体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏，以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。获得总共14.02g的SEQ ID NO.7所述的Fmoc-(Aib8)GLP-1(7-10)-OH(86.6％的产量)。分析表明纯度为94.3％AN。
实施例4-固相合成侧链保护的Fmoc-(Aib 35 )GLP-1(23-35)-OH
A.制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂
制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂。所用的试剂的量在下表中列出：
Figure A20078002326500391
将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Aib-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤第一次，200mL DMF洗涤第二次。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mLMeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用450mLDMF/MeOH/DIEA(4∶0.9∶0.1)洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供45.15g负载的树脂。分析表明负载因子为0.24mmol/g。
B.固相合成
将10.01g具有0.24mmol/g负载因子的Fmoc-Aib-2-CTC树脂装入到反应容器中，并且在25℃在DCM(120mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤3次(每次洗涤用6体积)。
然后，将树脂用在NMP中的5体积％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次5％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。
为了制备偶联溶液，将氨基酸(1.875当量)和1-羟基苯并三唑一水合物(HOBT水合物，2.07当量)在5℃-10℃溶解在3.5x体积的NMP中，然后与16.1mL在NMP(1.5x体积)中的HBTU(2.0当量)溶液合并。然后，将2.2mL DIEA(2.63当量)在10℃-5℃加入到活化容器中。将得到的溶液转移到反应容器中。活化容器用加入到反应器中的1.5x体积DCM润洗，然后将其在25℃搅拌2小时。将反应容器排干。偶联反应用活化氨基酸(1.875当量)的新鲜溶液再重复一次。在第二次偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure A20078002326500401
Figure A20078002326500411
构建的树脂通过用NMP(6体积)洗涤4次、用DCM(6体积)洗涤4次和用异丙醇(IPA，6体积)洗涤3次而分离。将构建的树脂在35℃在真空下干燥。获得14.3g构建的树脂。
C.从构建的树脂上切离中间体片段
将6.6g由上文构建的树脂在10x体积DCM中溶胀30分钟，并且冷却到-10℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM(12体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将切离溶液收集在含有吡啶(TFA的2-3当量)的烧瓶中。当加热到25℃时，树脂与1％TFA/DCM(10x体积)一起搅拌5分钟，并且加入吡啶(2-3当量)。再过5分钟后，收集溶液。树脂用DCM洗涤4次(10体积)。将所有的DCM洗液与水合并(水/DCM＝1/4)。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。将该片段用水洗涤，并且在真空下在30℃-35℃干燥。切离步骤再重复一次。获得总共2.36g的Fmoc-(Aib35)GLP-1(23-35)-OH(92％的产量)。
实施例5
A.制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂
制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂。本实施例所用的试剂的量在下表中列出：
Figure A20078002326500421
将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Aib-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用400mL DMF洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供45.32g负载的树脂。分析表明负载因子为0.30mmol/g。
B.固相合成
使用15.0g以0.30mmol/g负载的Fmoc-Aib-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(150mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DCM洗涤2次(每次洗涤用6体积)和用NMP洗涤3次(每次洗涤用6体积)。
然后，将树脂用在NMP中的20％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用6体积)至阴性氯醌检测。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(1.7当量)和6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBT，1.7当量)，在10℃-5℃溶解在2.6x体积的NMP中，然后与DIEA(1.9-3.0当量)合并。将TBTU或HBTU(1.7当量)在10℃-5℃溶解在1.33x体积的NMP中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中。混合烧瓶用加入到反应器中的1.33x体积DCM润洗，然后将其与树脂在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测，以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。
由于在2-甲基丙氨酸(Aib)和2-CTC树脂之间的可能的支撑(buttressing)效应，对于促使前两个氨基酸偶联反应(Lys(Boc)-34和Val-33)完成存在相当大的困难。因此，对于(Lys(Boc)-34，Val-33)的这两次偶联反应进行3次(即，偶联之后是两次再偶联)。此外，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用乙酸酐末端-封端未反应的与树脂结合的物质。通过在层析纯化过程中将杂质移开远离需要的产物，这提高了后续的纯化的效率。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure A20078002326500431
Figure A20078002326500441
Figure A20078002326500451
C.从构建的树脂上切离片段
将由上文构建的树脂在DCM洗涤7次(每次洗涤用6体积)，以去除NMP残留物，并且将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM(12体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将切离溶液收集在含有吡啶(TFA的1.3当量)的烧瓶中。当容器加热到25℃时，树脂用DCM洗涤9次(10体积)，并引流到切离溶液中。将DCM溶液与水(6体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。洗涤该片段，并且在真空下在30℃-35℃干燥。对于本实施例，切离步骤再重复一次。获得总共6.78g的Fmoc-(Aib35)GLP-1(23-35)-OH(68.1％的产量)，纯度为87.3％AN。
实施例6
A.制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂
制备负载Fmoc-Aib的2CTC树脂。本实施例所用的试剂的量在下表列出：
Figure A20078002326500452
Figure A20078002326500461
将2-CTC树脂装入到500mL肽反应器中，并且用400mL DCM溶胀30分钟。将沉积层排干，并且加入在8体积的DMF∶DCM(87.5∶12.5)中的Fmoc-Aib-OH和DIEA溶液。将混合物在氮气条件下在25℃的温度搅动2小时。
将沉积层排干，并且用400mL DMF洗涤。然后，将2-CTC树脂上任何剩余的活性位点用400mL MeOH∶DIEA(9∶1)溶液末端-封端1小时。将沉积层排干，用400mL DMF洗涤一次，用200mL DMF洗涤一次，用350mL DCM洗涤4次。将所述树脂通过用3X350mL IPA洗涤而消溶胀。将树脂干燥至恒定重量，以提供47.56g负载的树脂。分析表明负载因子为0.37mmol/g。
B.固相合成
使用25.0g以0.37mmol/g负载的Fmoc-Aib-2-CTC树脂开始进行固相合成。将树脂在25℃在DCM(250mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DCM洗涤2次(每次洗涤用6体积)，并用NMP洗涤三次(每次洗涤用6体积)。
然后，将树脂用在NMP中的20体积％的哌啶处理2次(每次处理用6体积)，以去除Fmoc保护基团。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤6次(每次洗涤用6体积)至阴性氯醌检测。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸和6-氯-1-羟基-苯并三唑(6-Cl-HOBT)，在10℃-5℃溶解在3.2x体积的NMP(或者对于Lys-34、Val-33和Gln-23是DMF)中，然后与DIEA合并。将TBTU在10℃-5℃溶解在1.6x体积的NMP(或者对于Lys-34、Val-33和Gln-23是DMF)中。然后将两种溶液合并。将得到的溶液加入到反应容器中，并且将烧瓶用加入到反应器中的1.6x体积DCM润洗，其与树脂在25℃-27℃搅拌2-3小时。取出样品进行开氏检测，以检测反应是否完成。如果偶联反应在3小时(阳性开氏检测)后是不完全的，则将反应容器排干，并用活化氨基酸的新鲜溶液进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(每次洗涤用6体积)。然后，对于片段中剩余的氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)的顺序)，重复Fmoc基团的去除和偶联反应循环。
由于在2-甲基丙氨酸(Aib)和2-CTC树脂之间的可能的支撑效应，对于促使前两个氨基酸偶联反应(Lys(Boc)-34和Val-33)完成存在相当大的困难。通过增加两种氨基酸的应用和将6-Cl-HOBT从1.7当量增加到2.5当量并将DIEA从1.9当量增加到3.0当量，而对Lys(Boc)-34，Val-33和Gln(trt)-23的偶联条件进行改进。用于偶联反应的溶剂还从NMP转换成DMF，以促使偶联反应完成。此外，在本实施例中，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用乙酸酐末端-封端未反应的与树脂结合的物质。通过在层析纯化过程中将杂质移开远离需要的产物，这提高了后续的纯化的效率。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure A20078002326500471
C.从构建的树脂上切离片段
将由上文构建的树脂在DCM洗涤6次(每次洗涤用6体积)，以去除NMP，并且将树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，加入1％TFA/DCM (10体积，在-5℃～-10℃)的冰冷溶液，并且在0℃搅拌30分钟。将切离溶液收集在含有吡啶(TFA的1.3当量)的烧瓶中。当容器加热到25℃时，树脂用DCM洗涤7次(6体积)，并引流到切离溶液中。将DCM溶液与水(10体积)合并。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托，在28℃)。当DCM被去除时，片段从水中沉淀出来。洗涤该片段，并且在真空下在30℃-35℃干燥。对于本实施例，切离步骤再重复一次以获得完全的切离。获得总共12.36g的Fmoc-(Aib35)GLP-1(23-35)-OH(59.35％的产量)，纯度为84.3％AN。
实施例7
1.树脂洗涤
用预负载的Fmoc-Gly-O-2-CTC树脂(负载0.18-0.65mmol/g)，或Fmoc-Aib-O-2-CTC(负载0.25-0.65mmol/g)开始，应用标准Fmoc化学。首先将树脂在10x体积的DCM中溶胀30-60分钟。然后，将DCM排干，并且将树脂用10x体积的NMP洗涤3-5次(每次5分钟)。
2.通用合成循环：
使用依据本实施例7部分A洗涤的树脂，通过～10x在NMP中的20％哌啶(v/v)的溶液处理2次而完成Fmoc的去除。处理持续15-30分钟/次。在每次处理后，将哌啶/NMP溶液排干。然后，将树脂用NMP洗涤4-5次(10x体积，5分钟/次)。
为了制备偶联溶液，称重用Fmoc保护的氨基酸(AA)、和HOBt(以1.5-2.0当量)，在10℃溶解在4x体积的NMP中，并且与DIEA(1.5-2.0当量)合并。将HBTU(1.5-2.0当量)在10℃溶解在3x体积NMP中。然后将两种溶液合并，并且与3x体积DCM一起搅拌1-2分钟。将得到的溶液添加到反应容器中，并且在搅动条件下与树脂混合1.5-5小时。取出样品进行开氏检测，以检测反应是否完成。未完成的偶联将进行再偶联。在偶联反应完成后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤5次(10体积，5分钟/次)。
A.按照通用合成步骤，利用相同的通用合成步骤，逐步构建具有天然序列的片段Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC，利用通用合成步骤，将SEQ IDNO.7所述的片段偶联到在本部分A中制备得到的片段Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC上。
B.按照通用合成步骤，逐步构建片段Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC。然而，Fmoc去除条件变为在NMP中的10％哌啶和2％DBU(v/v)，替代在NMP中的20％哌啶(v/v)。另外，在AA14[Fmoc-Ser(tBu)-]位置和AA13[Fmoc-Thr(tBu)-]位置的处理时间延长到1.5小时，以推动反应完成。利用相同的通用合成步骤，将SEQ ID NO.7所述的片段偶联到利用通用合成步骤得到的Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC上。
C.按照通用合成步骤，利用Fmoc去除溶液，在NMP中的10％哌啶和2％DBU(v/v)，逐步构建片段Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC。然后，利用通用合成步骤，将SEQ ID NO.7所述的片段偶联到获得的Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC片段上。
D.按照通用合成步骤，逐步构建片段Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC。然后，利用通用合成步骤，将SEQ ID NO.7所述的片段偶联到获得的Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC上。
E.按照上文部分D的通用合成步骤，除了在下表中的不同之外，逐步构建片段Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC。然后，利用通用合成步骤，将SEQ ID NO.7所述的片段偶联到得到的Fmoc-(X17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC片段上。
下表总结本实施例步骤A-E的详情：
  Ex.   规格   负载mmol/g   Fmoc去除条件   在位置17-18的假脯氨酸   AA的当量   纯度HPLC  产量
  A   5g   0.24   20％哌啶/NMP   无   2.0   30％  42％*
  B   20g   0.30   10％哌啶/2％DBU/NMP   无   1.7   58％  62％
  C   5g   0.30   10％哌啶/2％DBU/NMP   有   2.0   84％  74％
  D   5g   0.30   20％哌啶/NMP   有   2.0   75％  80％
  E   20g   0.42   20％哌啶/NMP   有   2.0   89％  86％
F.片段切离：
关于在本实施例中合成的任何肽片段，为了实现片段切离，将构建的肽-树脂在10x体积DCM中溶胀30分钟，并且冷却到-10℃。排干DCM，并且加入1％TFA/DCM溶液(10x体积)并搅拌30分钟。切离溶液收集在含有吡啶(相对于TFA，2-3当量)的烧瓶中。当温热到25℃时，树脂用1％TFA/DCM(10x体积)处理5分钟，然后加入吡啶(相对于TFA为2-3当量)。再搅拌5分钟后，收集溶液。然后，将树脂用10x体积DCM洗涤4次(5分钟/次)。将所有洗涤和切离的溶液合并并且与水混合(水/DCM体积比例＝～1/4)。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(350托/28℃)。当DCM被去除时，肽片段从水中沉淀出来，并且过滤。将该肽片段用水洗涤，并且在真空下在30℃干燥。
实施例8-溶液合成：添加Arg
将(Aib35)GLP-1(23-35)片段(携带表A所述的侧链保护，并且携带在N端的Fmoc保护(9.11g，3.94mmol)溶解在DMSO(90mL)中。
对于这一溶液，装入HOBt(2.42g，4当量)，HBTU(5.98g，4当量)，DIEA(3.44mL，5当量)，和H-Arg(2HCl)-NH2(3.88g，4当量)与10mL的DMSO。对反应液进行搅拌，并且通过HPLC监测。4小时后，反应未完成，因此加入2mL DIEA。反应过夜进行。然后，将哌啶(5mL)加入到反应混合物中。Fmoc去除在2小时内进行。反应混合物用冰水(800mL)终止，并搅拌40分钟。过滤形成的白色固体，用水(400mL)洗涤，并且干燥过夜，以提供片段(9.65g，重量产率109％)(Aib35)GLP-1(23-36)。
实施例9
将携带表A所述的侧链保护基团和在N端Fmoc保护的片段(Aib8，X17-18)GLP-1(7-22)(7.73g，2.88mmol)溶解在DMSO(65mL)中。对于这一溶液，装入HOBt(0.73g，4.77mmol)，HBTU(1.46g，3.85mmol)，DIEA(0.71mL，7.40mmol)，和片段(Aib35)GLP-1(23-36)(8.5g，3.45mmol)与20mL DMSO。对反应液进行搅拌，并且通过HPLC监测。3小时后，偶联完成。然后，将哌啶(5mL)加入到反应混合物中。Fmoc去除在2小时内进行。反应混合物用冰水(800mL)终止，并搅拌30分钟。过滤形成的白色固体，用水(400mL)洗涤，并且干燥过夜，以提供被保护的肽(Aib8，X17-18，Aib35)GLP-1(7-36)。
实施例10-完全去保护
将按照实施例9制备的肽(16.24g)用TFA/DTT/水(100mL/5g/2.0mL)溶液处理2小时，并且将得到的溶液导入冰浴中的MTBE(800mL)中。在30分钟的搅拌后，过滤形成的白色固体，用MTBE(400mL)洗涤，并且干燥，以提供粗肽产物(16.0g，重量产率138％)。以下将得到的去保护的肽叫作“粗”肽。
实施例11-纯化
粗肽的纯化是在
Figure A20078002326500521
C4，10微米，2.0x25cm的柱上进行的，产生具有98+％纯度和～60％包含的(contained)/包含的(contained)产率的纯化的肽。纯化包括在pH 2的第一次经过层析纯化，然后是在pH 9经过第二次。这种纯化后，纯化的肽可以以多种方式进一步处理或加工。例如，从经过第二次层析得到的纯化的汇集液可以被冻干，或通过浓缩柱并且通过沉淀分离。两种分离都将产生需要的肽(乙酸盐)。
作为两次经过层析过程的概述，将粗肽以5mg/ml(被包含的基础)溶解在10％乙腈/水(0.2M乙酸)的混合物中。利用乙腈/THF/水/TFA梯度，进行重复的1000mg注射(被包含的基础)，汇集～95％纯度的级分。还在～70％纯度汇集“再循环级分”，其代表～34％的回收。利用相同的乙腈/THF/水/TFA梯度，再注射再循环级分，并且将～85％纯度的汇集液与主汇集液合并。对于第一次经过层析纯化包含的(contained)/包含的(contained)的产率是70％。
然后，将合并的经过第一次层析的汇集液(pH2)进一步在相同的C4柱上但是使用乙腈/THF/水/醋酸铵(pH8.8)梯度进行第二次经过层析纯化。将级分合并在一起，产生～85％第二次经过层析回收的98+％纯度。两次纯化步骤的总产率是60％(包含的(contained)/包含的(contained))。
然后，使用相同的
Figure A20078002326500523
C4柱但是使用甲醇/水/醋酸铵分步梯度，浓缩合并的经过第二次层析的汇集液(pH8.8)。将级分合并在一起，并且准备进行分离。
A.粗肽溶液制备：
将8g粗肽溶解在500ml 90％0.2N乙酸/10％乙腈的溶液中。过滤溶液，第一次通过0.45微米Durapore滤器(47mm直径)(Millipore)，然后通过Supor EKV盘叠微米滤器(Supor EKV disk stack micron filter)(0.65/0.2mm直径)(Pall Filters)。粗注射溶液通过HPLC分析，并且发现含有5.02mg(wt％)被包含的肽/ml。(500mlx5.02mg/ml＝2512mg被包含的肽)。
B.层析-第一次在pH～2经过层析：
在下述条件下，用粗溶液进行4次重复的注射：
柱：由Kromasil供应，由C4填充，10微米，尺寸为2.0x25cm
检测器：设定为280nm的紫外检测器(8nm带宽，350/20nm ref)
柱温：常温
流速：13.0ml/min(～50bar背压)
流动相：
A＝0.1％三氟乙酸/15％乙腈/85％水的混合物
B＝0.1％三氟乙酸/15％四氢呋喃/70％乙腈/15％水的混合物
梯度：梯度以100％A流动相开始，并且持续0.1分钟。然后，通过泵C将样品手工上样到柱上(参见下文关于泵C的描述)。在样品上样后，运行从100％A到83％A的线性梯度，持续1分钟。然后，流动相保持在83％A再持续11分钟。然后，第二线性梯度运行至73％A持续10分钟。然后，流动相保持在73％A再持续15分钟。然后完成运行，并且然后是10分钟的100％B流动，然后是以100％A再平衡柱20分钟。
使用分离的等度(isocratic)HP 1100泵，以9.0ml/min上样样品)(泵-C)。通过初始11分钟的等度保持在83％A然后线性梯度至73％A再持续10分钟，而将较早洗脱的杂质与主峰分离。然后，在15分钟保持在73％A的过程中，洗脱主肽峰。在这一15分钟保持在73％A的过程中，收集级分。
C.第一次层析在pH～2的再循环
再循环汇集液是从确定具有低于可以加入到合并的汇集液的纯度的级分获得的。将这些级分单独合并，并且用等体积的水稀释。从这种独立合并的汇集液将再循环注射液注射回柱子中。使用相同的层析条件，并且合并可接受纯度的级分，用等体积的水稀释，并且加入到经过第一次层析合并的汇集液中。
D.在pH 8.8的经过第二次制备层析：
将最终合并的经过第一次层析的汇集液通过在pH 8.8的再层析进一步纯化。对于第二次层析使用pH 8.8，显著改变杂质的洗脱顺序，使得能够以更高的回收率进行更好的清除。对于所述第二次层析步骤所用的条件如下：
柱：由Kromasil供应，由C4填充，10微米，尺寸为2.0x25cm
检测器：设定为280nm的紫外检测器(8nm带宽，350/20nm ref)
柱温：常温
流速：13.0ml/min(～50bar背压)
流动相：
A＝15％乙腈/85％水的混合物，含有2g/l的醋酸铵和1mL/l的浓缩的氢氧化铵
B＝15％四氢呋喃/60％乙腈/25％水的混合物，含有2g/l的醋酸铵和1mL/l的浓缩的氢氧化铵
梯度：梯度以100％A流动相开始，并且持续0.1分钟。然后，通过泵C将样品手工上样到柱上。在样品上样后，运行从100％A到67％A的线性梯度，持续2分钟。然后，流动相保持在67％A再持续33分钟然后完成运行，并且然后是5分钟的100％B流动，然后是以100％A再平衡柱15分钟。
使用分离的等度HP1100泵，以9.0ml/min上样样品)(泵-C)。在30分钟上样步骤后，从30.2-32分钟，运行从100％A-67％A的短梯度。主肽峰在33分钟保持在67％A的过程中洗脱下来。从柱上样后20分钟开始收集级分，并且在主峰完全洗脱后终止收集。级分收集大约15分钟。汇集可接受的级分，并且用等体积的水稀释。在这一阶段的纯化中可以进行再循环，但是废弃的级分通常不含有足够的肽，不能保证再循环注射。如果进行很多次注射，这可能变得可行，并且将废弃的级分汇集在一起用于再循环。
E.浓缩运行：
将最终合并的经过第二次层析的汇集液上样到相同的柱上，并且使用不同的流动相快速洗脱，以浓缩肽进行分离。本步骤所用的条件如下：
柱：由Kromasil供应，由C4填充，10微米，尺寸为2.0x25cm
检测器：设定为280nm的紫外检测器(8nm带宽，350/20nm ref)
柱温：常温
流速：13.0ml/min(～50bar背压)
流动相：
A＝10％甲醇/90％20mM醋酸铵的混合物
B＝90％甲醇/10％20mM醋酸铵的混合物
梯度：梯度以100％A流动相开始，并且持续0.1分钟。然后，通过泵C将样品手工上样到柱上。在样品上样后，流动相保持在100％A持续5分钟。然后，将流动相立即逐步调整到100％B再持续20分钟。然后，完成运行，并且然后是以100％A再平衡柱15分钟。
使用分离的等度HP1100泵，以9.0ml/min上样样品(泵C)。在45分钟的上样步骤后，使用100％A短暂保持5分钟，然后运行到100％B的梯度步骤，持续20分钟，以洗脱肽。在到100％B梯度的步骤后2分钟，主峰开始洗脱下来。接下来的12分钟的级分包含肽，并且汇集在一起用于分离。
实施例12-冻干
称重1升宽口FLPE瓶。向该瓶中加入在水性乙腈/醋酸铵中的(Aib8，X17-18，Aib35)GLP-1(7-36)醋酸盐(acetate)的纯化汇集液(210ml)。将容器用去离子水3x5mL润洗，并且将润洗液加入到汇集液中。涡旋这一溶液以均化，然后封住，并且在液氮中将外壳(shell)冷却。冷冻的瓶打开盖子，并且瓶嘴覆盖以橡皮带保持在原位的双层Kimwipe。将瓶置于冻干仪的真空室内，并且冻干。冷凝器温度为-89℃，压力为19微米。
在24小时后，将真空室通风，以检测进展；仍然存在明显的冰块。重新开始冻干。
又过18小时后，从冷冻仪取出该瓶，并且检测重量。重量不稳定，由于产物的吸湿性质，重量很快增加。将staticky产物迅速转移到称重的液闪瓶中，称重，获得0.822g肽。
实施例13：沉淀纯化的肽
在烧瓶中，将在2mL的在MeOH/水(体积比9∶1)中的20mM的醋酸铵中的100.5mg纯(Aib8，X17-18，Aib35)GLP-1(7-36)乙酸盐的溶液用1mL的在MeOH/水(体积比9∶1)中的20mM的醋酸铵稀释。在搅拌下，在20℃-25℃，将20mL异丙醇(IPA)缓慢加入到烧瓶中。加入15mL IPA后，瓶装混合物变得浑浊。在20℃-25℃搅拌持续过夜。过滤沉淀的产物，并且用5mL IPA洗涤，然后在真空下在25℃干燥直至恒定的重量。获得90.9mg肽(90.42％回收率)。
实施例14：分离纯化的肽
在烧瓶中，将在10mL的在MeOH/水(体积比9∶1)中的20mM的醋酸铵中的497.7mg纯(Aib8，X17-18，Aib35)GLP-1(7-36)乙酸盐的溶液用6mL的在MeOH/水(9∶1)的20mM的醋酸铵稀释。在搅拌下，在20℃-25℃，将40mL异丙醇(IPA)在35分钟内缓慢加入到烧瓶中。加入2mL IPA后，瓶装混合物变得浑浊。在20℃-25℃搅拌持续1小时。过滤沉淀的产物，并且用5mL IPA洗涤，然后在真空下在25℃干燥直至恒定的重量。获得458.4mg肽(92％回收率)。
实施例15：分离纯化的肽
在烧瓶中，在20℃-25℃，通过浓缩柱向在150mL的在MeOH/水(9∶1)中的20mM的醋酸铵中的～1000mg纯化的(Aib8，X17-18，Aib35)GLP-1(7-36)乙酸盐的搅拌溶液中缓慢加入900mL IPA。这种添加在45分钟内完成。加入260mL IPA后，瓶装混合物变得浑浊。在20℃-25℃搅拌持续40分钟。过滤沉淀的产物，并且用5mL IPA洗涤，然后在真空下在20℃-25℃干燥直至恒定的重量。获得746mg肽(74.6％回收率)。
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
     克里斯托夫·R·罗伯茨
<120>促胰岛素肽合成
<130>Case 23831
<150>US 60/815,919
<151>2006-06-23
<160>13
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>37
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1               5                   10                  15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
            20                  25                  30
Val Lys Gly Arg Gly
        35
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>3
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
<210>4
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是Aib
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa是Aib
<400>4
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
            20                  25                  30
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<400>5
His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
            20                  25                  30
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<400>6
His Xaa Glu Xaa
1
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是Aib
<400>7
His Xaa Glu Gly
1
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa是假脯氨酸二肽的氨基酸(残基7-8)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa是假脯氨酸二肽的氨基酸(残基7-8)
<400>8
Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<400>9
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa
1               5                   10
<210>10
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa是Aib
<400>10
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa
1               5                   10
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa is假脯氨酸二肽的氨基酸(残基11-12)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa是假脯氨酸二肽的氨基酸(残基11-12)
<400>11
His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
<210>12
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<400>12
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
1               5                   10
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽片段
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa是假脯氨酸二肽的氨基酸(残基11-12)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa是假脯氨酸二肽的氨基酸(残基11-12)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa是非手性氨基酸
<400>13
His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
            20                  25                  30
？？
？？
？？
？？
Page 5

Claims (30)

1.一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤中的一步或多步：
h)提供包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段，其中X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H和E中的每一个任选地包含侧链保护；
i)提供包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
j)将所述第一片段与所述第二片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，其中该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
k)提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的第四肽片段，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
l)将所述第四肽片段与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.12)的第五肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
m)将所述第五片段与所述第三片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.13)的促胰岛素肽，该序列的所述残基任选地包含侧链保护。
2.按照权利要求1所述的方法，所述方法包括步骤a)-f)。
3.按照权利要求1或2所述的方法，所述方法包括下述步骤：
n)去除侧链保护基团，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.5)的促胰岛素肽及其负体，其中在位置8、10和35的符号X分别独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
4.权利要求1所述的一种制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的第一肽片段，其中X8是与Aib相对应的氨基酸残基，X10是与甘氨酸对应的氨基酸残基，并且H和E中的每一个任选地包含侧链保护；
b)提供包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的第二肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
c)将所述第一片段与所述第二片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
d)提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的第四肽片段，其中X35是与Aib相对应的氨基酸残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；
e)将所述第四肽片段与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.12)的第五肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；和
f)将所述第五片段与所述第三片段偶联，然后去除侧链保护基团，以提供式HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.5)的促胰岛素肽及其负体，其中X8和X35是与Aib相对应的氨基酸残基，并且X10是与甘氨酸相对应的氨基酸残基。
5.权利要求1所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)制备包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的肽片段，其中X8和X10分别是非手性的氨基酸残基，或者所述片段是其包括X8和X10残基的负体，H、E、X8和X10中的每一个任选地包含侧链保护；并且
将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
6.按照权利要求1或5所述的方法，其中X8是与甲基丙氨酸相对应的氨基酸残基。
7.按照权利要求1或5所述的方法，其中X10是与甘氨酸相对应的氨基酸残基。
8.具有氨基酸序列HX8EX10(SEQ ID NO.6)的肽片段，其中X8和X10分别是非手性的氨基酸残基，H、E、X8和X10中的每一个任选地包含侧链保护。
9.权利要求8的肽片段，其中X8是与Aib相对应的氨基酸残基，X10是与甘氨酸相对应的氨基酸残基。
10.按照权利要求5所述的方法，其中所述促胰岛素肽包括氨基酸序列(SEQ.ID No.5)
HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R
及其负体，其中在位置8、10和35的符号X分别表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且其中所述氨基酸残基中的一个或多个任选地包含侧链保护。
11.按照权利要求10所述的方法，其中X8和X35中的至少一个是Aib残基。
12.按照权利要求10所述的方法，其中X10是甘氨酸残基。
13.权利要求1所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
b)制备包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ.ID No.8)的肽片段，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基；并且
将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
14.按照权利要求13所述的方法，其中所述促胰岛素肽包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG QAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.13)及其负体，其中符号X8，X10，和X35每一个独立地表示非手性氨基酸残基，并且X17-18是假脯氨酸残基，所述氨基酸残基任选地包含侧链保护。
15.按照权利要求1或13所述的方法，其中X17-18具有下式：
Figure A2007800232650004C1
其中Φ表示任何氨基酸残基，任选地包含侧链保护，并且R1和R2分别独立地是适当的二价连接部分。
16.按照权利要求15所述的方法，其中Φ表示任选地包含侧链保护的Ser残基。
17.按照权利要求15所述的方法，其中R2是-CH2-。
18.按照权利要求15所述的方法，其中R1是
其中R3和R4分别独立地是单价部分，其选自H或低级烷基；或者R3和R4还可以是环结构的共同成员。
19.按照权利要求18所述的方法，其中R3和R4分别是甲基。
20.包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ.ID NO.8)的肽或其负体，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基；所述氨基酸残基任选地包含侧链保护。
21.权利要求1所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
c)将包括氨基酸序列HX8EX10(SEQ IDNO.6)的所述第一肽片段与包括氨基酸序列TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.8)的所述第二肽片段偶联，以提供包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEG(SEQ ID NO.11)的第三肽片段，在所述第一肽片段中，X8和X10分别是非手性氨基酸残基，H和E中的每一个任选地包含侧链保护；在所述第二肽片段中，其中由符号X17-18表示的残基是假脯氨酸的二肽残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；在所述第三肽片段中，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；并且
将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
22.权利要求1所述的制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
d)制备包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的肽片段或其负体，其中X35是非手性氨基酸残基，该序列的所述残基任选地包含侧链保护；并且
将所述肽片段结合到促胰岛素肽中。
23.按照权利要求22所述的方法，其中X35是甲基丙氨酸的氨基酸残基。
24.按照权利要求22所述的方法，其还包括下述步骤：
e)将包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVKX35(SEQ ID NO.9)的肽片段或其负体与精氨酸偶联，以提供包括氨基酸序列QAAKEFIAWLVK X35R(SEQ ID NO.12)的肽片段，该序列的所述残基任选地包含侧链保护。
25.按照权利要求24所述的方法，其中R不包含侧链保护。
26.按照权利要求22所述的方法，其中所述促胰岛素肽包括氨基酸序列HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R(SEQ ID NO.13)及其负体，其中符号X8，X10，和X35分别独立地表示非手性氨基酸残基，该序列的所述氨基酸残基任选地包含侧链保护；并且其中X17-18是假脯氨酸残基。
27.按照权利要求22的方法，其中所述促胰岛素肽包括氨基酸序列(SEQ.ID No.5)
HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R
及其负体，其中在位置8，10和35的符号X分别独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且其中所述氨基酸残基中的一个或多个任选地包含侧链保护。
28.按照权利要求1-7，13或21-25所述的方法，其中所述促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
及其负体。
29.按照权利要求28所述的方法，其中所述促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
及其负体，其是在C端酰胺化的。
30.本发明前文所述的新颖方法和肽。
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