KR20190103185A - 리라글루티드의 합성방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시된 리라글루티드의 효율적인 고체상 합성에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pct00003

본 발명은 고체상 접근법을 이용한 순차적 커플링에 의한 리라글루티드의 효율적인 제조 방법에 관한 것이다. 이것은 리라글루티드의 백본을 제조하기 위해 보호된 아미노산의 순차적 커플링을 포함하고, 선형 서열의 완성시 γ-글루탐산 및 팔미트산의 첨가함으로써 라이신 측쇄로부터 합성을 연장시키고 이어서 보호기를 제거하고, 고체 지지체로부터 펩타이드를 절단하고 얻어진 미가공 리라글루티드의 정제를 포함한다. 본 발명은 커플링 동안에 무기염을 이용하며, Fmoc-탈보호 단계 후에 DMF 용액에서 HOBt로 세척하여 펩타이드의 응집을 억제하고 반응이 완료되도록 하여 결실 순서를 피하고 공정 수율을 향상시킨다.

Description

리라글루티드의 합성방법
본 발명은 화학식 1로 표시된 리라글루티드의 효율적인 고체상 합성에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pct00001
리라글루티드 (VICTOZA®)는 2형 당뇨병을 가진 성인의 혈당 조절을 개선하기 위한 식이요법 및 운동의 보조제로 이용되는 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1) 수용체 작용제이다.
리라글루티드는 34번 위치의 라이신이 아르기닌으로 치환되고 글루타모일 스페이서를 통해 26번 위치의 라이신에 팔미토일 그룹이 결합된, 자연적으로 발생한 인간 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1(7-37))의 지속작용 유사체이다.
Novo Nordisk가 개발한 리라글루티드 (VICTOZA®)는 2010년 미국에서 피하주사로서 최초 승인을 받았다.
미국 특허 제 6,268,343 호는 리라글루티드 및 이의 제조 방법을 개시하고 있다. 여기서 재조합 기술은 Arg34-GLP-1(7-37)-OH 제조와 이어지는 Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu와의 반응에 관여한다.
US 7,273,921 B2 및 US 6,451,974 B1은 리라글루티드를 얻기 위한 Arg34-GLP-1(7-37)-OH의 아실화 방법을 개시하고 있다.
US 9,260,474 B2는 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리라글루티드의 고체상 합성을 개시한다.
a) 리라글루티드의 펩타이드 백본의 서열에 기초한 N-말단 보호 및 측쇄 보호를 갖는 아미노산의 순차적 커플링, 여기서 Fmoc-Lys(Alloc)-OH는 라이신에 이용된다;
b) 라이신의 측쇄에서 Alloc의 탈보호 단계;
c) palmitoyl-Glu-OtBu의 커플링 또는 글루탐산(glutamic acid)과 염화 팔미토일(palmitoyl chloride)의 라이신 측쇄로의 연속된 커플링 단계; 및
d) 보호 그룹의 제거 및 수지의 절단을 통한 미가공 리라글루티드의 수득.
WO 2014/199397 A2는 순차적 커플링 접근법 및 분획 접근법을 이용하여 리라글루티드의 고체상 합성을 개시하며, 여기서 Fmoc-Lys(dde)-OH는 라이신에 이용된다.
WO 2016/059609 A1은 리라글루티드를 얻기 위해 구리 작용제를 이용한 Arg34-GLP-1(7-37)-OH의 아실화 과정을 개시한다.
리라글루티드 제조를 위한 종래의 방법은 단점을 갖고 있다. 그 방법은 복잡한 기술과 높은 비용으로 리라글루티드의 대규모 생산에 적합하지 않다; Alloc이 라이신 측쇄 보호기로 이용되는 과정에서, Alloc의 탈 보호는 비교적 값비싼 Pd(PPh3)4와 같은 금속 촉매를 필요로 한다. 또한, 촉매는 습기에 민감하며, 반응은 제어된 조건에서 수행되어야 하고 최종 산물의 중금속 함량을 고려해야 한다. 따라서, 그 과정은 상업적으로 실행 가능하지 않거나 또는 지속해서 실행하기에는 문제가 된다.
고체상 합성 동안, 이용된 조건 하에서 펩타이드가 응집하는 견고한 경향이 관찰된다. 이것은 다음과 같은 이유 때문이다:
a) 증가하는 펩타이드 서열은 펩티딜 수지의 붕괴를 초래하는 β-시트 종류의 구조를 형성하기 쉽고,
b) 접힌 펩타이드 사슬을 유발하는 소수성 아미노산이 존재한다.
이러한 조건에서, 펩티딜 수지로의 시약의 확산은 제한적이며, 커플링 및 탈보호 반응은 느리고 불완전하며, 따라서 펩타이드 불순물이 생성되어 정제의 어려움을 초래하고 수율이 낮아진다.
따라서, 반복적인 번거롭고 긴 정제 단계를 피함으로써 고수율, 확장성, 비용 효율이 높은, 친환경적 그리고 상업적으로 실행 가능한 리라글루티드의 제조를 위한 효율적인 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 신규하고 효과적인 커플링 조건 및 무기염을 이용하여, 상기 화학식 1의 리라글루티드를 제조하기 위한 간단하고 견고하며 상업적으로 실행 가능한 순차적 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예는 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조를 위한 합성 방법을 포함한다:
A) 커플링제의 존재하에 C-말단 글리신의 수지 고체상 지지체로 로딩하는 단계;
B) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
C) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
D) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 라이신의 측쇄에 γ-글루탐산 및 팔미트산을 순차적 방식으로 커플링 시키는 단계;
E) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
F) 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
상기 제조 과정을 도 1에 나타내었다.
이용된 접근법은 순차적 접근에 의한 리라글루티드의 고체상 펩타이드 합성이며, 일반적인 커플링제 및 첨가제와 함께 커플링하는 동안 무기염을 포함한다. 상기 방법은 커플링 및 탈보호 반응의 완성 및 라세미화의 감소를 제공함으로써 표적 분자에 매우 가까운 이성질체 불순물을 조절하여 펩타이드의 정제 과정을 용이하게 한다.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, 상기 A) 단계에서, wang 수지는 수지 고체상 지지체로서 이용되고, 커플링제로서 DIC 및 용매로서 MDC를 이용하여 Fmoc-Gly-OH에 커플링 된다.
고체상 지지체로서 2-클로로트리틸(2-chlorotrityl, CTC)의 이용은 커플링이 느리고 15개의 아미노산 서열 후에 반응이 완료되지 않으며 CTC 수지에 부착된 펩타이드가 불안정하고 커플링/세척 사이클 동안에 이용된 약산성 조건에서 침출되는 경향이 있기 때문에 이용이 제한적이다. 리라글루티드의 합성에는 여러 단계가 포함되므로 각 단계에서 부분적인 침출은 전체 수율을 감소시킨다.
본 발명을 더욱 개선하기 위하여, 상기 B) 단계에서 하기 단계를 포함한다:
B1) 피페리딘 / DMF 또는 피페리딘, DBU, DMF 혼합물을 이용하여 Fmoc-Gly-수지로부터 Fmoc 보호기를 탈 보호하여 H-Gly-수지를 얻는다.
B2) 로딩된 수지를 세척한다.
B3) 커플링제, 커플링 첨가제, 무기염 및 염기의 존재 하에서 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 를 H-Gly-수지에 커플링 한다.
B4) B1, B2 및 B3의 반복 단계를 통해, 리라글루타이드 백본이 합성되고, 여기서, B3 단계에서는 보호된 아미노산이 순차적으로 결합되어 리라글루타이드 백본을 얻는다.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, 상기 B) 단계 및 D) 단계에서 커플링제는 HBTU, COMU, DEPBT 또는 DIC로 이루어진 군으로부터 선택했다. 커플링 첨가제는 oxyma pure 또는 HOBt로 이루어진 군으로부터 선택했고, 염기는 DIPEA, NMM 또는 TMP로부터 선택하고 무기염은 염화마그네슘, 염화아연 또는 염화구리로 이루어진 군으로부터 선택했다.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, B2) 단계에서 말한 바와 같이, 로딩된 수지를 DMF 또는 아이소프로판올에서 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, B) 단계에서 말한 바와 같이, 라이신에 대한 보호기로서 이용되는 Mtt 그리고 C) 단계에서 말한 바와 같이, 보호기 Mtt는 TFA/MDC 또는 HFIP/TES/TFE/MDC를 이용하여 라이신 측쇄로부터 제거했다.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, 상기 D) 단계에서, HBTU, COMU, DEPBT 또는 DIC로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링제의 존재하에 결합된 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu) 측쇄; oxyma pure 또는 HOBt로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링 첨가제; DIPEA, NMM 또는 TMP로부터 선택된 염기 및 염화마그네슘, 염화아연 또는 염화구리로 이루어진 군으로부터 선택된 무기염.
본 발명의 또다른 실시 양태는 하기 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 합성 과정을 포함한다:
A) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
B) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
C) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
D) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
E) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
F) 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
본 발명을 더욱 개선하기 위해, D) 단계에서 말한 바와 같이, HBTU, COMU, DEPBT 또는 DIC로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링제의 존재 하에 결합 된 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu) 측쇄; oxyma pure 또는 HOBt로 이루어진 군으로부터 선택된 커플링 첨가제; DIPEA, NMM 또는 TMP로부터 선택된 염기 및 염화마그네슘, 염화아연 또는 염화구리로 이루어진 군으로부터 선택된 무기염.
그러나 본 발명의 또다른 실시 양태는 하기 단계를 포함하는 리라글루티드의 제조를 위한 합성 과정을 포함한다.
i) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
ii) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
iii) DMF내의 피페리딘 또는 피페리딘/DBU/DMF 혼합물을 이용하여 각각의 로딩된 아미노산의 Fmoc기를 탈보호 시키는 단계;
iv) 각 Fmoc 탈보호 단계 후에 DMF내의 HOBt를 이용하여 세척하는 단계;
v) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
vi) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 팔미토일-글루탐산 (Pal-Glu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
vii) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계.
또한, 상기 실시 양태의 개선으로서, 9번 내지 13번 아미노산 [i.e. Fmoc-Glu(OtBu)9, Fmoc-Gly10, Fmoc-Thr(tBu)11, Fmoc-Phe12, Fmoc-Thr(tBu)13]은 약 30-45 oC의 고온에서 결합하여 리라글루티드 백본을 형성한다.
본 발명에서 이용된 “ACN"은 아세토니트릴(Acetonitrile)을, “Boc”는 tert-부틸옥시카보닐(tert-Butyloxycarbonyl)을, “COMU”는 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리에나미노옥시)디메틸아미노-몰폴리노-카베니움 헥사플루오로포스페이트(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)dimethylamino-morpholino-carbenium hexafluorophosphate)를 의미하며, “DBU”는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데카-7-엔(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)을, “DEPBT”는 3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one을, “DIC”는 N,N'-diisopropylcarbodiimide을, “DMAP”는 Dimethylamino pyridine을, “DMF”는 N,N'-Dimethylformamide을, “DIPEA”는 Diisopropylethylamine를, “Fmoc”은 9-fluorenylmethoxycarbonyl을, “HBTU”는 O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl uronium hexafluorophosphate를 의미한다.
또한, 본 발명에서 이용된 “HOBt”는 N-Hydroxybenzotriazole를, “HFIP”는 1,1,1,3,3,3-Hexafluro-2-propanol를, “Mtt”는 Methyltrityl를, “NMM”은 N-methylmorpholine를 의미하며, “NMP”는 N-Methyl-2-pyrrolidone를, “TES”는 Triethylsilane를, “TFE”는 Trifluroethanol를 의미하고, “TFA”는 Trifluoroacetic acid를, “Pbf”는 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofurane를, “Pd(PPh3)4”는 Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)를 의미하며, “ t Bu”는 tert-Butyl을, ”TIS”는 Triisopropyl Silane을, “Trt”는 Trityl를 의미하고, “TMP”는 2,4,6-Trimethylpyridine를 의미한다.
도 1은 본 발명에 따른 리라글루티드(화학식 1)의 고체상 합성 방법의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 리라글루티드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 나타내어진다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: MgCl 2 를 이용한 리라글루티드의 합성
1단계: Fmoc-Gly 37 -Wang 수지의 합성
Wang 수지 (0.3-0.6 mmol/g, 적재 하중)를 펩타이드 합성 용기에 로딩하고, 10 v의 MDC로 2회 세척하고, 세척액을 따라내고, 10 v의 MDC를 첨가한 뒤 1시간 동안 팽창되도록 유지했다. Fmoc-Gly-OH (3.0 - 5.0 eq.)를 MDC에 용해시키고, 최소량의 DMF를 첨가하여 투명한 용액을 수득하고, 혼합물을 반응 용기로 옮겼다. 반응 용기에 DIPC (3.0 - 6.0 eq.) 그리고 이어서 DMAP (0.01- 0.1 eq.)를 첨가하고 실온에서 1.0 - 3.0 시간 동안 교반 했다. 반응물을 배수시키고 아미노산 로딩된 수지를 MDC에 이어 DMF로 2번 세척했다. 미반응 기능 부위의 캡핑은 아세트산 무수물 및 DIPEA를 이용하여 수행했다.
2단계: Fmoc-Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
3단계: Fmoc-Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Gly-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산의 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
4단계: Fmoc-Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
5단계: Fmoc-Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Val-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
6단계: Fmoc-Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Leu-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
7단계: Fmoc-Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Trp(Boc)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
8단계: Fmoc-Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ala-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
9단계: Fmoc-Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ile-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
10단계: Fmoc-Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Phe-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
11단계: Fmoc-Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
12단계: Fmoc-Lys(Mtt)26-Glu(OtBu)27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp(Boc)31-Leu32-Val33-Arg(Pbf)34-Gly35-Arg(Pbf)36-Gly37-Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Lys(Mtt)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
13단계: Fmoc-Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ala-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
14단계: Fmoc-Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ala-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
15단계: Fmoc-Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Gln(Trt)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
16단계: Fmoc-Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Gly-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
17단계: Fmoc-Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
18단계: Fmoc-Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Leu-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
19단계: Fmoc-Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Tyr(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
20단계: Fmoc-Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ser(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
21단계: Fmoc-Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ser(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
22단계: Fmoc-Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Val-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
23단계: Fmoc-Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
24단계: Fmoc-Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ser(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
25단계: Fmoc-Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Thr(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 상승된 주위 온도 30-45 ℃에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
26단계: Fmoc-Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Phe-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 상승된 주위 온도 30-45 ℃에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
27단계: Fmoc-Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Thr(tBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 상승된 주위 온도 30-45 ℃에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
28단계: Fmoc-Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Gly-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 상승된 주위 온도 30-45 ℃에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
29단계: Fmoc-Glu(OtBu) 9 -Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 상승된 주위 온도 30-45 ℃에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
30단계: Fmoc-Ala 8 -Glu(OtBu) 9 -Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 4.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Ala-OH (2.0 - 4.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
31단계: Boc-His(Trt) 7 -Ala 8 -Glu(OtBu) 9 -Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Mtt) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (3.0 - 5.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (3.0 - 5.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (6.0 -10.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Boc-His(Trt)-OH (3.0 - 5.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
32단계: Boc-His(Trt) 7 -Ala 8 -Glu(OtBu) 9 -Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Fmoc-Glu-OtBu) 26 -Glu(OtBu) 27 -
Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
펩타이드의 분지는 MDC에서 0.5-2.0% TFA, 15-20 사이클 x 10v로 처리하여 Lys26 측쇄의 Mtt 보호기를 제거함으로써 수행했다. 펩티딜 수지를 DMF에서 MDC 2x 10 v, 2x 10v, 2 x 10 v DMF 및 5 - 10.0% DIPEA로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 5.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 5.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -10.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Fmoc-Glu-OtBu (2.0 - 5.0 eq.)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
33단계: Boc-His(Trt) 7 -Ala 8 -Glu(OtBu) 9 -Gly 10 -Thr(tBu) 11 -Phe 12 -Thr(tBu) 13 -Ser(tBu) 14 -Asp(OtBu) 15 -Val 16 -Ser(tBu) 17 -Ser(tBu) 18 -Tyr(tBu) 19 -Leu 20 -Glu(OtBu) 21 -Gly 22 -Gln(Trt) 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(Palmitoyl-Glu-OtBu) 26 -Glu(OtBu) 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp(Boc) 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg(Pbf) 34 -Gly 35 -Arg(Pbf) 36 -Gly 37 -Wang 수지의 합성
로딩된 아미노산의 Fmoc-탈보호는 DMF에서 15-25% 피페리딘을 이용하여 5분 및 10분 동안 2회 수지를 세척함으로써 수행했다. 이어서 수지를 DMF에서 3-5*8 v 0.01 - 0.1 M HOBt로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DIC (2.0 - 5.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 4.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -8.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 MDC를 이용하여 핵사데카노익산 (2.0 - 5.0 eq.)을 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
34단계: H-His 7 -Ala 8 -Glu 9 -Gly 10 -Thr 11 -Phe 12 -Thr 13 -Ser 14 -Asp 15 -Val 16 - Ser 17 -Ser 18 -Tyr 19 -Leu 20 -Glu 21 -Gly 22 -Gln 23 -Ala 24 -Ala 25 -Lys(γ-Glu-palmitoyl) 26 -Glu 27 -Phe 28 -Ile 29 -Ala 30 -Trp 31 -Leu 32 -Val 33 -Arg 34 -Gly 35 -Arg 36 -Gly 37 - OH의 합성
loaded peptidyl 수지를 DMF 2 x 10 v, MDC 2x 10v, MeOH 2x 10v, 및 MTBE 3 x 10 v로 세척했다. 펩타이드의 총 절단은 TFA, 페놀, TIS, H2O 혼합제 혼합물을 이용하여 수행했다. 펩타이드-TFA 혼합제를 농축시키고 냉각된 MTBE 5-15 v에 첨가했다. 침전된 화합물을 원심 분리 및/또는 여과를 통해 분리하고 VTD로 건조시키고 정제를 위해 회수했다(공정 수율 18.25%, 순도 51.3%).
실시예 2: CuCl 2 를 이용한 리라글루티드의 합성
이 공정은 실시예 1에서 기술한 것과 동일하며, 변화는 오직 모든 개별적 아미노산의 순차적 커플링 동안 촉매제로서 MgCl2 대신 CuCl2가 이용된다는 것이다(공정 수율 17.84%, 순도 51.16%).
실시예 3: Mtt 보호기의 탈보호를 위한 HFIP-TES-TFE 혼합제를 이용한 리라글루티드의 합성
이 공정은 실시예 1에서 기술한 것과 동일하며, 변화는 오직 Lys(Mtt)26 제거에 있으며, 여기서 MDC 10 - 30 v에서 5.0 - 40.0 % HFIP, TES 2.0 -10.0 %, TFE 5.0-10 %를 이용이었고 혼합물을 2 - 6 시간 동안 교반하였다(실제 공정 수율 21.23%, 순도 51.7%).
실시예 4: 리라글루티드의 합성
이 공정은 실시예 1에서 기술한 것과 동일하며, 단지 변화는 커플링 동안 무기염이 이용되지 않았다는 것이다(공정 수율 6.79%, 순도 34.4%).
실시예 5: 무기염을 이용하지 않은 리라글루티드의 합성
이 공정은 실시예 1에서 기술한 것과 동일하며, 단지 변화는 커플링 동안 무기염을 이용하지 않고, DMF에서 0.1M HOBt 대신에 제공된 IPA 세척을 한다는 것이다(공정 수율 8.26%, 순도 39.1%).
실시예 6: Pal-Glu-OtBu 측쇄의 커플링을 이용한 리라글루티드의 합성
펩타이드의 분지는 MDC에서 0.5 -2.0% TFA, 15-20 사이클 x 10v로 처리하여 Lys26 측쇄의 Mtt 보호기를 제거함으로써 수행했다. 펩티딜 수지는 DMF에서 MDC 2x 10 v, 2x 10v, 2 x 10 v DMF, 및 5 -10.0 % DIPEA로 세척했다. HBTU, COMU, DEPBT, 및 DIC와 같은 커플링제, 바람직하게는 DEPBT (2.0 - 5.0 eq.)과 oxymapure, HOBt, 바람직하게는 oxymapure (2.0 - 5.0 eq.)과 DIPEA, NMM, TMP, 바람직하게는 DIPEA (5.0 -10.0 eq.)과 MgCl2, ZnCl2, 바람직하게는 MgCl2 (0.01 - 0.1 eq)과 용매로서 DMF/NMP 혼합물을 이용하여 Pal-Glu-OtBu 측쇄 (2.0 - 5.0 eq., 화학식 2에 나타냄)를 커플링했다. 반응은 질소 대기 및 실온에서 수행했다. Kaiser 시험에 의해 확인된 아미노산 커플링이 완료되면, 과량의 시약을 배수시키고 펩티딜 수지를 3 x 10 v DMF로 세척했다.
[화학식 2]
Figure pct00002
R1 = 알킬, 아릴, R2 = H
실시예 7: 리라글루티드의 합성
이 공정은 실시예 1에서 기술한 것과 동일하며, Mtt 제거는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 수행했다. 합성 과정 중 선형 펩타이드의 응집을 피하는 것에 더하여 페리딘의 완전한 제거를 보장하기 위해 추가적으로 각각의 Fmoc-탈보호 단계 후에 0.01-0.1 M HOBt/DMF로 세척을 했다(실제 공정 수율 27.0%, 순도 > 60.%).
실시예 8: 리라글루티드의 정제
미가공의 리라글루티드를 5-75 mg/ml의 농도로 5 - 40% ACN을 함유하는 희석된 탄산암모늄 용액에 용해시키고 사전-평형화된 100-10-C8 칼럼 (10mm x 250mm)에 로딩시켰다. 이어서0.2 CV 희석제를 처리하였다. 결합된 리라글루티드는 이동상의 단계 구배(A: 0.1% TFA in water; B: 0.1% TFA in ACN: IPA)를 이용하여 녹여서 분리했다. 순도가 92% 이상인 분획을 진공 하에 농축시킨 다음 등전점 침전시켰다. 침전물을 원심 분리에 의해 회수하였다. 회수된 침전물을 칼럼 100-10-8C 칼럼 (10mm x 250mm)에서 또다른 RP-HPLC 단계에 다시 적용하였다. 결합된 리라글루티드는 A: 묽은 아세트산암모늄; B: ACN으로 구성된 이동상의 경사 용리법을 이용하여 녹여서 분리했다. 98.5%이상의 분획을 모으고, 진공하에 농축시키고, 등전점에서 침전시킨 후 최종적으로 동결건조 시켰다.
실시예 9: 리라글루티드의 정제
미가공의 리라글루티드를 10-75 mg/ml의 농도의 묽은 암모니아 용액에 용해시키고 100-10-C8 칼럼 (10mm x250mm)에서 RP-HPLC-1 단계에 적용시켰다. 이어서 0.2 CV 희석제를 처리하였다. 결합된 리라글루티드는 이동상의 단계 구배(A: 0.1% TFA in water; B: 0.1% TFA in ACN: IPA)를 이용하여 녹여서 분리했다. 순도가 90% 이상인 분획을 진공 하에 농축시킨 다음 등전점 침전시켰다. 침전물을 원심 분리에 의해 회수하였다. 회수된 침전물을 칼럼 100-10-C8 칼럼 (10mm x 250mm)에서 RP-HPLC 단계에 다시 적용시켰다. 결합된 리라글루티드는 즉 A: 물 속의 TFA; B: 메탄올 내의 TFA로 구성된 이동상의 경사 용리법을 이용하여 녹여서 분리하였다. 이 단계는 특정 불순물의 감소에 도움이 되었다. 분획 93%이상을 모으고 아세트산암모늄으로 희석하고, 칼럼 100-10-C8 칼럼 (10mm x 250mm)의 RP-HPLC-3 단계로 로딩하였다. 결합된 리라글루티드는 즉 A: 아세트산암모늄; B ACN으로 구성된 이동상의 경사 용리법을 이용하여 녹여서 분리했다. 분획 98.5%이상을 모으고, 진공하에 농축시키고, 등전점에서 침전시킨 후 최종적으로 동결건조 시켰다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재하에 C-말단 글리신의 수지 고체상 지지체로 로딩하는 단계;
    b) 미반응 작용 부위를 캡핑하는 단계;
    c) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    d) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    e) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 라이신의 측쇄에 글루탐산 및 팔미트산을 커플링 하는 단계;
    f) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
    g) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재하에 C-말단 글리신의 수지 고체상 지지체로 로딩하는 단계;
    b) 아세트산무수물 및 유기 염기를 이용하여 미반응 작용 부위를 캡핑하는 단계;
    c) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    d) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    e) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 라이신의 측쇄에 글루탐산 및 팔미트산을 순차적 방식으로 커플링 하는 단계;
    f) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및
    g) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  3. 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) 라이신의 측쇄 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu-OtBu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
    e) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    f) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) 디클로로메탄에서 TFA를 이용하여 라이신의 측쇄 메틸트리틸(methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 커플링제인 HBTU, COMU, DEPBT, DIC 및 첨가제인 oxymapure, HOBt, 또는 상기 커플링제 및 첨가제의 조합물과 무기염의 존재 하에 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu-OtBu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
    e) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    f) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  5. 다음의 단계로 구성된, 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) DMF내의 피페리딘 또는 피페리딘/DBU/DMF 혼합물을 이용하여 각각의 로딩된 아미노산의 Fmoc기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 각 Fmoc 탈보호 단계 후에 DMF내의 HOBt를 이용하여 세척하는 단계;
    e) 라이신의 메틸트리틸(methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    f) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 팔미토일-글루탐산 에스테르(Pal-Glu-OtBu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
    g) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    h) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) DMF내의 피페리딘 또는 피페리딘/DBU/DMF 혼합물을 이용하여 각각의 로딩된 아미노산의 Fmoc기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 각 Fmoc 탈보호 단계 후에 DMF내의 HOBt를 이용하여 세척하는 단계;
    e) HFIP/TES/TFE/MDC를 이용하여 라이신의 측쇄 메틸트리틸(methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    f) 커플링제 및 무기염의 존재하에 팔미토일-글루탐산(Pal-Glu-OtBu) 측쇄를 라이신의 측쇄에 커플링 하는 단계;
    g) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    h) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  7. 다음의 단계로 구성된, 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) DMF내의 피페리딘 또는 피페리딘/DBU/DMF 혼합물을 이용하여 각각의 로딩된 아미노산의 Fmoc기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 각 Fmoc 탈보호 단계 후에 DMF내의 HOBt를 이용하여 세척하는 단계;
    e) 라이신의 메틸트리틸(methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    f) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 보호된 글루탐산 및 팔미트산을 라이신의 측쇄에 순차적 방식으로 커플링 하는 단계;
    g) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    h) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 다음의 단계로 구성된 리라글루티드의 제조 방법.
    a) 커플링제의 존재 하에 Nα-Fmoc-보호된 글리신(Fmoc-Gly-OH)을 수지 고체상 지지체에 커플링 하는 단계;
    b) 커플링제 및 무기염의 존재 하에, 리라글루티드의 백본 제조를 위해 Nα- 및 측쇄 보호 아미노산을 순차적으로 커플링 하는 단계;
    c) DMF내의 피페리딘 또는 피페리딘/DBU/DMF 혼합물을 이용하여 각각의 로딩된 아미노산의 Fmoc기를 탈보호 시키는 단계;
    d) 각 Fmoc 탈보호 단계 후에 DMF내의 HOBt를 이용하여 세척하는 단계;
    e) HFIP/TES/TFE/MDC을 이용하여 라이신의 메틸트리틸(methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 단계;
    f) 커플링제 및 무기염의 존재 하에 보호된 γ-글루탐산 및 팔미트산을 라이신의 측쇄에 순차적 방식으로 커플링 하는 단계;
    g) 수지로부터 보호기 제거 및 펩타이드 절단에 의해 미가공 리라글루티드를 수득하는 단계; 및.
    h) 선택적으로 미가공 리라글루티드를 정제하는 단계.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBTU, COMU, DEPBT, DIC 또는 이들의 조합으로부터 선택된 커플링제를 포함하는, 리라글루티드의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    oxymapure, HOBt 또는 이들의 조합으로부터 선택된 커플링 첨가제를 포함하는, 리라글루티드의 제조 방법.
  11. HBTU-oxyma pure, COMU-oxyma pure, DEPBT-oxyma pure 또는 DIC-oxyma pure로부터 선택된 커플링제 혼합물을 이용하여 Boc-Histidine과 커플링 하는 것을 포함하는 리라글루티드의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    DEPBT-oxyma pure를 이용하여 Boc-Histidine과 커플링 하는 것을 포함하는 리라글루티드의 제조 방법.
  13. HFIP/TES/TFE/MDC를 이용하여 라이신의 메틸트리틸(Methyltrityl) 보호기를 탈보호 시키는 것을 포함하는 리라글루티드의 제조 방법.
  14. 상승된 온도를 이용하여 아미노산 9 내지 13을 커플링 하는 것을 포함하는 리라글루티드의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아미노산 9 내지 13을 30-45oC의 온도에서 커플링 하는 것을 포함하는 리라글루티드의 제조 방법.
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