KR20190043609A

KR20190043609A - 프로인슐린 유도체

Info

Publication number: KR20190043609A
Application number: KR1020197009616A
Authority: KR
Inventors: 디미트리오스 가토스; 알렉산드라 아나스타시우; 클레오메니스 바를로스
Original assignee: 케미컬 앤드 바이오파마슈티컬 라보라토리즈 오브 파트라스 에스.에이.
Priority date: 2016-09-06
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2019-04-26
Also published as: US11230585B2; AU2017322552A1; BR112019004314A2; WO2018047062A1; IL265182A; AU2017322552B2; JP2019530473A; US20190263881A1; CA3035850A1; EP3509625A1; CN110234339A

Abstract

본 발명의 제1 측면은 식 (I)의 폴리펩타이드 화합물에 관한 것이다.
A-C-B (I)
상기 식에서,
A는 인슐린의 A 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;
B는 인슐린의 B 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;
C는 식 (X₁)_p - (X₂)_n - (X₃)_q의 펩타이드로서:
각각의 X₁ 및 X₃는 독립적으로 염기성 아미노산이고;
각각의 X₂는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고;
p는 1 또는 2이고;
q는 0, 1 또는 2이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 폴리펩타이드 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다. 다른 측면은 인슐린 및 그 유도체의 제조에 있어 폴리펩타이드 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

프로인슐린 유도체

본 발명은 프로인슐린 유도체에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 인슐린의 제조에 유용한 인버티드 (inverted) 프로인슐린 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 프로인슐린 유도체는 그 자체적으로도 치료학적 모이어티로서 잠재적인 유용성을 가진다.

인슐린 및 그 유도체는 당뇨병 치료에 가장 중요한 약물로서, 연간 판매량이 200억개를 웃돌며, 시장이 점차 커지고 있다.

인슐린은 췌장의 β-세포에 의해 분비되는 펩타이드 호르몬이다. 인슐린은 2개의 펩타이드 체인, A와 B로 이루어지며, 이들은 분자간 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있다. A 체인은 분자내 이황화 결합도 추가로 가지고 있다. 인간 인슐린은 구조 2를 가진다.

인슐린은 전형적으로 재조합 방식으로 제조된 프로인슐린을 출발물질로 하여 대량 (수백 kg)으로 제조된다. 프로인슐린을 폴딩한 다음, 연결성 C-펩타이드를 트립신 및 카르복시펩티다제 B를 사용해 효소적으로 제거하여, 성숙한 인슐린 펩타이드를 수득한다.

보다 구체적으로, 인슐린은, 24개의 아미노산으로 된 프리펩타이드와 그 다음에 오는 86개의 아미노산을 포함하는 프로인슐린으로 구성된, 단쇄 전구체, 즉 프리프로인슐린으로서 만들어진다. 프리프로펩타이드의 서열은 프리펩타이드-[B-체인]-Arg-Arg-[연결성 펩타이드]-Lys-Arg-[A-체인]으로, 여기서 연결성 펩타이드는 아미노산 31개로 구성된다. 프리펩타이드가 효소에 의해 제거된 후, 이황화 결합 3개가 형성되고, 프로인슐린이 만들어진다.

다음으로, Arg-Arg 부위와 Lys-Arg 부위에서 연결성 펩타이드를 효소적으로 절단함으로써, 성숙한 인슐린이 분리된다.

프로인슐린은, 수용체에 결합하기 위해 필요한 잔기들, 즉 A-체인의 N-말단 아미노 관능기와 B-체인의 C-말단 카르복시 관능기가 차단되어 있어, 인슐린 수용체에 대한 친화성이 천연 인슐린 보다 100배 낮다.

인슐린의 안정성과 용해 특성은 인슐린 치료제 측면에서 중요하다. 다수의 인슐린 유사체들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 인슐린 활성을 가진 단쇄 인슐린 유사체는 EP1193272에 개시되어 있다. 이 단쇄 인슐린은 아미노산 5-18개의 변형된 C-펩타이드를 가지고 있으며, 최대 42%의 인슐린 활성을 가진 것으로 기재되어 있다.

US 5,597,796에는, 2개 이상의 아미노산 잔기가 Glu 및/또는 Asp로 치환된, 인슐린 유사체가 개시되어 있다. 마찬가지로, US 20090069216 및 WO 2007/096332에는 변형된 B-체인과 연결성 펩타이드를 포함하는 속효성는 단쇄 인슐린이 개시되어 있다. 이 유사체들은 특히 경피 투여용으로 매우 적합하다. US 8,192,957에는 심방세동-저항성 인슐린 (fibrillation-resistant insulin) 및 인슐린 유사체가 개시되어 있다. 페길화 단쇄 인슐린은 US 2010/0216690에 개시되어 있으며, 아실화 단쇄 인슐린은 WO 2007/104738에 개시되어 있다.

WO 2005/054291에는, A-체인과 B-체인이 아미노산 5-11개의 연결성 펩타이드에 의해 연결된, 단쇄 인슐린 유사체가 개시되어 있다. 마찬가지로, WO 95/16708에는, A-체인과 B-체인이 아미노산 1-15개의 연결성 펩타이드로 연결되고, C-말단 아미노산 잔기가 Lys 또는 Arg 이외의 아미노산인, 단쇄 인슐린 유사체가 개시되어 있다. EP0427296에는 일반식 B(1-29)-X_n-Y-A(1-21)의 인간 인슐린 전구체가 개시되어 있는데, 일반식에서 X_n은 천연 아미노산 잔기를 n개 가진 펩타이드 체인으로서, n은 0-33이고, Y는 Arg 또는 Lys이다. 또한, EP0741188에는 현저한 인슐린 활성을 가진 일반식 b-BP-a의 단쇄 인슐린 유도체가 개시되어 있으며, 일반식에서 BP는 아미노산 10-14개로 이루어진 브릿징 펩타이드이고; 이 단쇄 인슐린은 인슐린 활성 뿐만 아니라 IGF-1 수용체에 대해 높은 친화성을 가진 것으로 기술되어 있다. 수많은 노력에도 불구하고, 화학적으로, 경제적으로 실현가능한 인슐린 제조 방법은 아직까지 개발되지 않았다. 지금까지 적용되어 온 방법들은 선형 A 체인과 B 체인의 무작위 혼합 및 이들의 공기에 의한 산화 (air oxidation), 설폰화된 A 체인과 B 체인의 혼합, 부위-특이적인 3개의 이황화 결합 형성, 및 단쇄 전구체의 생체모방성 폴딩 (biomimetic folding)을 포함한다 (Sohma, Y. and Kent, S. B. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 16313-16318; Tofteng, A. P.; Jensen, K. J.; Schaffer, L.; Hoeg-Jensen, T. Chem-BioChem 2008, 9, 2989-2996).

연결성 C-펩타이드를 가진 A-C-B '인버티드'-프로인슐린 역시 인슐린 유도체를 만들어내는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, EP0518587에는 A-C-B 프로인슐린 유도체가 개시되어 있는데, 여기서 링커 펩타이드 C는 식 X₁-X₂-P-X₃-X₄의 단편으로, X₁ 내지 X₄는 염기성 아미노산이고, P는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 아미노산 4-35개로 구성된 펩타이드이다 (또한, W. F. Heath et al, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 1, p419-425를 참조함). 일반적으로, 천연 또는 인버스 (inverse) 프로인슐린의 C-펩타이드는, 천연의 성숙형 프로인슐린 또는 리버스 (reverse) 프로인슐린으로 정확하게 폴딩되도록 하는데 필요한 유연성을 가지기 위해, 최소한의 길이를 가져야 하는 것으로, 파악된다.

본 발명은, 인슐린 제조에 이용가능하며 또한 그 자체로도 치료학적 모이어티로서 유용한, 대체 (alternative) 프로인슐린 유도체를 제공하고자 한다. 특히, 본 발명은 용해성, 활성, 수율, 순도 및/또는 합성의 용이성 측면에서 한가지 이상의 이점을 가진 프로인슐린 유도체를 제공하고자 한다.

본 발명은 프로인슐린 유도체, 보다 상세하게는 식 A-C-B의 인버티드 프로인슐린 유도체에 관한 것이다.

이에, 본 발명의 제1 측면은 식 (I)의 폴리펩타이드 화합물에 관한 것이다:

A-C-B (I)

상기 식에서,

A는 인슐린의 A 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;

B는 인슐린의 B 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;

C는 하기 식의 연결성 펩타이드이다:

(X₁)_p - (X₂)_n - (X₃)_q

상기 식에서,

각각의 X₁ 및 X₃는 독립적으로 염기성 아미노산이고;

각각의 X₂는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고;

p는 1 또는 2이고;

q는 0, 1 또는 2이고;

n은 0, 1, 2 또는 3이다.

본 발명의 인버티드 프로인슐린 유도체는, 더 짧은 연결성 펩타이드 ("슈퍼 미니" 인슐린)를 포함한다는 점에서, 당해 기술 분야에 공지된 것들과 차이가 있다. 놀랍게도, 본 출원인은, 아미노산을 7개 이하로 포함하는 C-펩타이드 (인버스 프로인슐린 A-Arg-B와 같이, 아미노산을 단 하나 가진 펩타이드 등) 및 이의 대응되는 보호된 또는 일부 보호된 유도체가 유용한 프로인슐린 전구체라는 것을, 발견하게 되었다.

본 발명의 펩타이드 화합물은 프로인슐린의 고상 화학 합성법을 개선한다는 관점으로 개발되었다.

이상적으로, 펩타이드는 문제가 되는 펩타이드 합성 단계, 예를 들어, 수지 상에서의 펩타이드 체인 연장 중에 β-턴 및 β-시트 형성을 유발하는 단계가 없어야 한다. 본 발명의 펩타이드는 천연적인 B-C-A 순서로 배열된 것이 아니라 A-C-B 순서의 배열된 인버티드 프로인슐린 유도체이다. 이들 인버티드 프로인슐린 유도체는 대응되는 B-C-A 프로인슐린 보다 합성이 용이한 것으로 확인된 바 있다.

바람직하게는, 본 발명의 인버티드 프로인슐린은 β-시트 및 β-턴의 형성을 교란하는 C-펩타이드 내 잔기 (예, 아미노산 X₂)를 포함한다. 이와 관련하여, 적절한 잔기로는 Pro, Hyp 및 슈도프롤린 등이 있다. C-펩타이드 내 이들 잔기를 삽입하여, 인버스 프로인슐린의 효과적인 합성을 가능하게 할 수 있다.

바람직하게는, C 펩타이드는 정제 단계에서 사용되는 용매에 대한 용해성을 높이는 잔기들을 포함한다. 이와 관련한 적절한 잔기로는 Pro, Hyp, 염기성 아미노산, 예를 들어, Arg 또는 Lys, 또는 산성 및 친수성 아미노산, 예를 들어 Glu 및 Ser 등이 있다.

고 순도의 프로인슐린을 수득하기 위해, 더 작은 보호된 펩타이드를 용액 중에 또는 고상에서 축합할 수 있다. 바람직하게는, 축합 반응에서 라세미화 (racemisation)를 방지하기 위해, 단편의 C-말단 아미노산은 전형적으로 Gly, Pro, β-Ala 및 구조에 올리고 또는 폴리-글리콜 파트를 포함하는 아미노산, 예를 들어, -NH-(CH₂CH₂O)_n'-CO- 구조 요소를 포함하는 아미노산으로부터 선택되며, 여기서 n'은 정수, 예를 들어 1-10, 더 바람직하게는 1-5의 정수이다.

바람직하게는, C-펩타이드의 절단을 용이하게 하기 위해, 하나 이상의 염기성 아미노산이 A-체인의 C-말단 및 B-체인의 아미노 말단에, 즉 p가 1 또는 2인 (X₁)_p 및 q가 1 또는 2인 (X₃)_q에 위치한다.

본원에서, 용어 "변이체"는, (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기로 치환되거나, (b) 2개 이상의 아미노산 잔기의 순서가 역전되거나, (c) 1, 2 또는 3개의 아미노산이 결손되거나, (d) 스페이서 기가 임의의 2개의 아미노산 잔기들 사이에 위치하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태 (peptoid form)이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 (N-C-C) 백본이 변형된 것이거나, (g) 하나 이상의 부가적인 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 (a) - (g)의 임의 조합인, 변형체를 포함한다. 바람직하게는, 변형체는 (a), (b) 또는 (c) 중 하나로 생성된다.

더 바람직하게는, 아미노산 잔기 1-5, 1-4 또는 1-3개는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 보다 더 바람직하게는, 아미노산 잔기 2개가 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 보다 더 바람직하게는, 아미노산 잔기 1개가 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 바람직하게는, 치환은 상동성 치환이다.

상동성 치환 (치환 및 교체 둘다 본원에서 기존 아미노산 잔기를 대체 잔기로 상호 교체하는 의미로 사용됨), 즉 유사한 것 간의 치환 (like-for-like substitution), 예를 들어 염기성에서 염기성, 산성에서 산성, 극성에서 극성으로의 치환 등이 발생할 수 있다. 또한, 비-상동적인 치환이 발생할 수도 있으며, 즉, 어느 한 클래스의 잔기에서 다른 클래스의 잔기로의 치환, 또는 다른 예로 오르니틴, 다이아미노부티르산 오르니틴, 노르루신 오르니틴, 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비-천연 아미노산을 수반하는 치환도 이루어질 수 있으며, 보다 상세한 리스트는 후술된다. 아미노산 잔기 2개 이상이 동시에 변형될 수도 있다.

본원에서, 아미노산은 하기 클래스로 분류되며;

염기성; H, K, R

산성; D, E

비-극성; A, F, G, I, L, M, P, V, W

극성; C, N, Q, S, T, Y,

(국제적으로 용인되는 단문자 아미노산 표시로 나타냄), 상동성 치환 및 비-상동성 치환은 이들 클래스를 이용하여 규정된다. 따라서, 상동적인 치환은 동일한 클래스 내에서의 치환을 지칭하는 것이고, 비-상동적인 치환은 서로 다른 클래스 간의 또는 비-천연 아미노산에 의한 치환을 지칭한다.

캐리어 모이어티 (carrier moiety)의 임의의 아미노산 잔기 2개 사이에 삽입될 수 있는 적절한 스페이서 기로는, 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에도, 메틸, 에틸 또는 프로필 기 등의 알킬 기 등이 있다. 변형의 다른 형태, 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태로 존재하는, 타입 (e)는, 당해 기술 분야의 당업자들이 잘 알 것이다. 의심의 여지를 피하기 위해, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환 기가 α-탄소가 아닌 잔기의 질소 원자에 위치하는 변이체 아미노산 잔기를 지칭하는 것으로 사용된다. 펩토이드 형태로 펩타이드를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134에 공지되어 있다. 타입 (f) 변형은 국제 출원 PCT/GB99/01855 (WO 99/64574)에 기술된 방법 등의 방법에 의해 만들 수 있다.

임의의 위치에서 독립적으로 아미노산 변형, 바람직하게는 타입 (a) 또는 (b)의 아미노산 변형이 이루어지는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 2개 이상의 상동적인 또는 비-상동적인 치환이 동시에 이루어질 수 있다. 추가적인 변형은 서열 내 다수의 아미노산의 서열을 반대로 뒤바꿈으로써 야기할 수 있다.

일 구현예에서, 대체 아미노산 잔기는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 잔기들로부터 선택된다.

대체 아미노산 잔기는 부가적으로 후술한 비-천연 아미노산들로부터 선택될 수 있다.

본원에서, 용어 "유도체"는 화학적 변형, 예를 들어 N-말단 및/또는 C-말단에서 아미노산 측쇄에 화학적 변형을 가진 인슐린을 지칭한다. 바람직하게는, 화학적 변형은 유사체의 흡수, 분포, 대사 및 배출 특징을 변형하기 위해 사용된다. 동물 인슐린의 화학적 변형에 기반한, 반-합성 인슐린, 예를 들어, 인간 종과는 상이한 단일 아미노산을 제거하고 인간 아미노산을 화학적으로 부가함으로써 돼지 인슐린을 반-합성 '인간' 인슐린으로 효소적으로 변환한 Novo Nordisk이, 얼마간 임상적으로 사용되었다.

바람직한 일 구현예에서, 인슐린은 등전점을 바꾸기 위해 화학적으로 변형된다. 정상적인 비-변형된 인슐린은 생리학적 pH에서 용해성이다. 대부분 석출되지만 혈류에서 천천히 용해되어 궁극적으로 신장에 의해 배출되는 용해성 평형 (solubility equilibrium) 상태로 존재하도록, 등전점이 변위된 (shifted), 인슐린의 변형된 유도체가 구축된 바 있다.

본원에서, 용어 "인슐린의 기능성 유도체"는 인슐린과 비슷한 또는 동일한 생물학적 기능을 수행하는 임의 분자를 지칭한다. 기능성 유도체는 화학적 구조 측면에서 인슐린과 구조적으로 유사하거나 또는 유사하지 않을 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 단쇄 인슐린 유사체는 동물 인슐린으로부터 유래된다.

여러가지 포유류에서 동물 인슐린의 아미노산 서열은 인간 인슐린 (인슐린 인간 INN)과 유사할 수 있다. 그러나, 척추동물들에도 상당한 가변성이 존재한다. 돼지 인슐린은 인간 종과 아미노산 단 한개 차이만 존재하며, 소 인슐린은 아미노산 3개 차이를 가진다. 이들 2종 모두 인간 수용체에 대략적으로 동일한 강도의 활성을 나타낸다. 소 인슐린 및 돼지 인슐린은, 생합성 인간 인슐린 (인슐린 인간 rDNA)를 이용할 수 없었던 시기에, 최초로 임상적으로 사용된 인슐린 유사체 (동물 췌장으로부터 배출되어 생성된, 천연)이다. 상어 및 일부 어류 종으로부터 유래된 인슐린 역시 유효할 수 있다.

다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단쇄 인슐린 유사체는 인간 인슐린 또는 이의 유사체로부터 유래된다. 더 바람직하게는, 인슐린은 생합성 인슐린 (인슐린 인간 rDNA)이다. 바람직한 일 구현예에서, 인슐린은 인슐린 Glargin (Lantus), 인슐린 Lispro (Humalog), 인슐린 Detemir (Levemir), 인슐린 Aspart (novolog), 인슐린 Degludec 및 바이오틴화된 (biotinylated) 인슐린으로부터 선택되는 유도체이다.

본 발명의 다른 구현예는 토끼, 원숭이, 말, 랫 I, 랫 II, 돼지, 소-양, 개, 기니아피그, 친칠라 (chinchilla) 또는 오리 ACB-프로인슐린 분자를 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, A 체인은 인슐린의 A 체인의 천연 아미노산 서열이다. 바람직한 일 구현예에서, B 체인은 인슐린의 B 체인의 천연 아미노산 서열이다. 바람직하게는, 이들 종들의 ACB-프로인슐린 분자의 아미노산 서열은 A 체인의 천연 아미노산 서열 및 B 체인의 천연 아미노산 서열이다. 본 발명의 다른 구현예들은 전술한 종들로부터 유래되는 프로인슐린 분자의 기능성 유사체에 관한 것일 수 있다.

이에, 바람직한 일 구현예에서, A 체인은 인슐린의 A 체인의 변이체 또는 기능성 유도체이다. 다른 바람직한 구현예에서, B 체인은 인슐린의 B 체인의 변이체 또는 기능성 유도체이다. 다른 바람직한 구현예에서, A 체인은 인슐린의 A 체인의 변이체 또는 기능성 유도체이고, B 체인은 인슐린의 B 체인의 변이체 또는 기능성 유도체이다.

천연 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다.

본원에서, 용어 "비-천연 아미노산" 또는 "비천연 아미노산"은 α 및 α-이중 치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 천연 아미노산의 할라이드 유도체, 예를 들어 트리플루오로티로신, p-Cl-페닐알라닌, p-F-페닐알라닌, p-Br-페닐알라닌, p-NO₂-페닐알라닌, 페닐글리신, 사르코신, 페니실라민 (penicillamine), D-2-메틸트립토판, 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, p-I-페닐알라닌, L-알릴-글리신, β-알라닌, β-아스파르트산, β-사이클로헥실알라닌, 시트룰린, 호모세린, 호모시스테인, 피로글루탐산, L-α-아미노 부티르산, L-γ-아미노 부티르산, L-α-아미노 이소부티르산, α-사이클로헥실글리신, 다이아미노부티르산, 다이아미노피멜산, N-ε-다이니트로페닐-라이신, L-1-나프틸알라닌, L-2-나프틸알라닌, 3-(2-피리딜)-L-알라닌, 3-(3-피리딜)-L-알라닌, 3-(4-피리딜)-L-알라닌, N-ε-메틸-라이신, N,N-ε-다이메틸-라이신, N,N,N-ε-트리메틸-라이신, 3-머캅토프로피온산, L-ε-아미노 카프로익산, 7-아미노 헵타노익산, 6-아미노 헥사노익산, L-메티오닌 설폰, 오르니틴, L-노르루신, L-노르발린, p-니트로-L-페닐알라닌, L-하이드록시프롤린, γ-글루탐산, γ-아미노 부티르산 L-티오프롤린, 페닐알라닌 (Phe)의 메틸 유도체, 예를 들어 4-메틸-Phe, 펜타메틸-Phe, L-Phe (4-아미노), L-Tyr (메틸), L-Phe (4-이소프로필), L-Tic (1,2,3,4테트라하이드로이소-퀴놀린-3-카르복실산), L-다이아미노프로피온산 및 L-Phe (4-벤질)을 포함한다.

유익하게는, 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입은 펩타이드의 효소적 안정성 증가를 유도한다.

본 발명의 인슐린 유사체는 L 또는 D 형태의 아미노산을 포함하며, 즉, 하나 이상의 잔기가, 바람직하게는 모든 잔기가 L 또는 D 형태일 수 있다.

본 발명의 펩타이드에서, 각각의 X₁ 및 X₃는 독립적으로 염기성 아미노산이다. 연결성 펩타이드에 존재하는 염기성 아미노산은 펩타이드가 트립신 및 카르복시펩티다제에 의해 절단될 수 있게 한다.

본 발명의 펩타이드에서, 각각의 X₂는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이다. X₂가 시스테인 잔기일 경우, 당해 기술 분야의 당업자는 후속적인 산화적 폴딩 시 원치 않는 S-S 결합 형성을 피하기 위해 보호가 필요함을 알 것이다. 적합한 시스테인 보호기는 당해 기술 분야의 당업자에게 익숙할 것이며, Acm 및 Trt를 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, X₂는 시스테인 이외의 아미노산이다.

바람직한 일 구현예에서, 각각의 X₂는 독립적으로 염기성 아미노산, Gly, β-Ala, Pro, Hyp, 슈도프롤린, 산성 아미노산 및 친수성 아미노산으로부터 선택된다.

바람직한 일 구현예에서, X₂는 슈도프롤린 (pseudoproline)이다. 슈도프롤린은 펩타이드의 FMOC 고상 합성 중에 응집을 최소화하는 다이펩타이드를 인공적으로 구축한다. 슈도프롤린은 프롤린-유사 고리 구조를 가진 세린- (Oxa) 또는 트레오닌-유래 옥사졸리딘 [Oxa(5-Me)] 및 시스테인-유래 티라졸리딘 (THz)이다 (하기 참조).

C2-치환된 슈도프롤린의 선행 잔기와의 cis-아미드 결합에서의 선호성으로 인해, 이를 삽입하면 펩타이드 백본의 킹크 구조 (kink conformation)가 형성되며, 따라서 펩타이드 응집, 자기-조합 (self-association), 또는 β-구조 형성이 방지된다. 그래서, 슈도프롤린은 동시적으로 2가지 기능을 충족시킨다: 첫째, 이는 Ser, Thr 및 Cys에 대한 일시적인 측쇄 보호를 제공하며, 두번째로 펩타이드 합성시 그리고 이후 체인 조립 (chain assembly)시 용매화 (solvation) 및 커플링 속도를 높이기 위한 가용화 빌딩 블록 (solubilizing building block)으로서 작용한다.

슈도프롤린은 유리 아미노산을 알데하이드 또는 케톤과 반응시킴으로써 수득된다. 슈도프롤린 다이펩타이드는 다른 아미노산 유도체와 동일한 방식으로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 슈도프롤린은 Ser-X, Thr-X 또는 CysX 기로부터 유래되며, 여기서 X는 천연 또는 비-천연 아미노산이다. 세린- 및 트레오닌-함유 펩타이드의 FMOC 고상 펩타이드 합성 (SPPS)에 슈도프롤린 (옥사졸리딘) 다이펩타이드의 일상적인 사용은 미정제 산물의 품질 및 수율을 현저하게 개선한다. 펩타이드를 탈-보호화하면, 슈도프롤린은 X가 천연 또는 비-천연 아미노산인 X-Ser, X-Thr 또는 X-Cys 형태의 통상적인 다이펩타이드가 된다.

바람직한 일 구현예에서, X₂는 Hyp이다. 본원에서, Hyp는 (2S,4R)-4-하이드록시프롤린 또는 L-하이드록시프롤린을 지칭하며, 이는 하기 구조를 가진 단백질을 형성하지 않는 아미노산 (non-proteinogenic amino acid)이다:

바람직한 일 구현예에서, X₂는 산성 또는 친수성 아미노산이다. Asp 및 Glu는 산성 아미노산의 예이고, Ser, Cys, Asn, Gln 및 Thr은 친수성 아미노산의 예이다. 바람직하게는, 산성 또는 친수성 아미노산은 Ser, Asp 및 Glu으부터 선택된다.

바람직한 일 구현예에서, X₂는 염기성 아미노산이다. 더 바람직하게는, 염기성 아미노산은 Lys, Arg, Orn 및 His으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 염기성 아미노산은 Arg이다.

특히 바람직한 일 구현예에서, 각각의 X₂는 독립적으로 Gly 및 Arg으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, X₂는 Gly이다.

바람직한 일 구현예에서, X₁ 및 X₃는 둘다 Arg이다.

바람직한 일 구현예에서, p 및 q는 둘다 1이다.

다른 바람직한 구현예에서, p 및 q는 둘다 2이다.

바람직한 일 구현예에서, n은 1 또는 2이다.

특히 바람직한 일 구현예에서, n은 1이다.

특히 바람직한 일 구현예에서, p 및 q는 둘다 2이고, n은 1이다.

바람직한 일 구현예에서, n 및 q는 둘다 0이고, p는 1이며, 즉 A 체인과 B 체인 사이에 염기성 아미노산 1개가 존재한다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는, X₁은 Arg 또는 Lys이고, 더 바람직하게는, Arg이다.

다른 바람직한 구현예에서, X₁ 및 X₃는 둘다 Arg이고, p 및 q는 둘다 2이다.

다른 바람직한 구현예에서, X₂는 Gly이고, n은 1이다.

특히 바람직한 일 구현예에서, A 체인과 B 체인은 펩타이드 RRGRR에 의해 연결되며, 즉 C는, X₁가 Arg이고, X₂가 Gly이고, X₃가 Arg이고, p와 q가 둘다 2이고, n이 1인, 펩타이드이다.

바람직한 일 구현예에서, A는 천연 인슐린의 A 체인, 바람직하게는 인간 인슐린의 A 체인 또는 이의 변이체이며, 여기서: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기로 치환되거나, (b) 2개 이상의 아미노산 잔기의 순서가 역전되거나, (c) 1, 2 또는 3개의 아미노산이 결손되거나, (d) 스페이서 기가 임의의 아미노산 잔기 2개 사이에 존재하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 (N-C-C) 백본이 변형된 것이거나, (g) 하나 이상의 부가적인 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 (a)-(g)의 임의 조합을 가진다.

바람직한 일 구현예에서, 천연 A 체인에서 아미노산 1-5개가 치환되며, 바람직하게는, 1-4개, 더 바람직하게는 1-3개, 보다 더 바람직하게는, 아미노산 1 또는 2개가 치환된다. 바람직한 일 구현예에서, 하나의 아미노산이 치환된다.

특히 바람직한 일 구현예에서, A-체인은 A-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-21개를 포함한다.

특히 바람직한 일 구현예에서, A-체인은 A-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-21개로 구성된다.

특히 바람직한 다른 구현예에서, A-체인은 A-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-20개를 포함한다.

특히 바람직한 일 구현예에서, A-체인은 A-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-20개로 구성된다.

바람직한 일 구현예에서, B는 천연 인슐린의 B 체인, 바람직하게는 인간 인슐린의 B 체인 또는 이의 변이체이며, 여기서: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기로 치환되거나, (b) 2개 이상의 아미노산 잔기의 순서가 역전되거나, (c) 1, 2 또는 3개의 아미노산이 결손되거나, (d) 스페이서 기가 임의의 아미노산 잔기 2개 사이에 존재하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 (N-C-C) 백본이 변형된 것이거나, (g) 하나 이상의 부가적인 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 (a)-(g)의 임의 조합을 가진다.

바람직한 일 구현예에서, 천연 B 체인의 아미노산 1-5개가 치환되며, 바람직하게는, 1-4개, 더 바람직하게는 1-3개, 보다 더 바람직하게는, 아미노산 1 또는 2개가 치환된다. 바람직한 일 구현예에서, 하나의 아미노산이 치환된다.

특히 바람직한 일 구현예에서, B-체인은 B-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-29개를 포함한다.

특히 바람직한 일 구현예에서, B-체인은 B-체인의 N-말단으로부터 카운팅하여 인간 인슐린 아미노산 1-29개로 구성된다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 하나 이상의 아미노산에 의해 연장된다. 예를 들어, 특히 바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 C-말단에 2개의 부가적인 아미노산, 예를 들어, Arg-Arg을 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, 인슐린의 B-체인은 C-말단에 부가적인 천연 또는 비천연 아미노산 20개 이하를 더 포함한다. 바람직하게는, B-체인은 C-말단에 부가적인 천연 또는 비천연 아미노산을 1-10개, 또는 더 바람직하게는 1-5개 더 포함한다. 특히 바람직한 일 구현예에서, B-체인은 C-말단에 부가적인 천연 또는 비천연 아미노산을 1, 2 또는 3개 더 포함한다. 또한 더 바람직하게는, B-체인은 C-말단에 부가적인 천연 아미노산을 1, 2 또는 3개 더 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 천연 서열로부터 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 하나의 아미노산 변형은 A21, B9, B10, B12, B16, B17, B20, B25, B26, B27, B28 또는 B30 위치에서 존재하며, 여기서 A는 인슐린의 A 체인을 의미하고, B는 인슐린의 B 체인을 의미한다.

바람직하게는, 단일한 아미노산 치환은 하기로부터 선택된다:

Gly A21, Glu A21, hSer A21, Thr B10, Asp B25, Ser A21, Leu A21, Gly A22, Asp B10, His B25, Ala A21, Met A21, Ala A22, Arg B10, Glu B26, His A21, Tyr A21, Asp B9, Ile B12, Glu B27, Asp A21, Val A21, Asn B9, His B16, Asp B28, Thr A21, Ile A21, His B9, Gln B17, Ala B30, Gln A21, Trp A21, Glu B10, Gln B20, des-B30, Thr30-NH₂ 및 Ala30-NH₂.

바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 천연 서열로부터 2개의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 2개의 아미노산 변형은 A21 및 B10, A21 및 B10, A21 및 B27, B27 및 B16, B5 및 B10, B12 및 B13, B14 및 B17, B28 및 B29, A121 및 B27, B10 및 B30, B29 및 B30, B12 및 B30, B10 및 B2, B10 및 B28, B10 및 A13, B27 및 A13, B27 및 A21, B27 및 B1, B27 및 B9, 또는 A21 및 B30 위치에 존재한다.

바람직하게는, 2개의 아미노산 치환은 하기로부터 선택된다:

Ser A21 및 Asp B10

Asp A21 및 Lys B27

Thr A21 및 Asp B10

Gly A21 및 Arg B27

Ala A21 및 Asp B10

Asp B5 및 Asn B10

Thr A21 및 Thr B10

Glu B12 및 Gln B13

Ala A21 및 Thr B10

Ser B14 및 Asp B17

His A21 및 Thr B10

Ser A21 및 Arg B27

His A21 및 Asp B10

Thr A21 및 Arg B27

Asp A21 및 Asp B10

Ala A21 및 Arg B27

Gly A21 및 Thr B10

Gly A21 및 Asp B10

His A21 및 Lys B27

Glu B27 및 Glu B16

Ser A21 및 Thr B10

Lys B28 및 Pro B29

Asp A21 및 Thr B10

His A21 및 Arg B27

Gly A21 및 Arg B10

Asp A21 및 Arg B27

Ser A21 및 Arg B10

Glu B12 및 des B30

Thr A21 및 Arg B10

Gly A21 및 Lys B27

Gly A21 및 Ala B30

Ser A21 및 Lys B27

Ser A21 및 Ala B30

Thr A21 및 Lys B27

Thr A21 및 Ala B30

Ala A21 및 Lys B27

Ala A21 및 Ala B30

des B29 및 des B30

hSer A21 및 Ala B30

Asp B10 및 Ser B2

Ala A21 및 Arg B10

Asp B10 및 Asp B28

His A21 및 Arg B10

Glu B10 및 Glu A13

Asp A21 및 Arg B10

Glu B27 및 Ser A13

Asp B10 및 des-B30

Glu B27 및 Asp A21

Thr B10 및 des-B30

Glu B27 및 Glu B1

Arg B10 및 des-B30

Glu B27 및 Asp B9.

바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 천연 서열로부터 3개의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 3개의 아미노산 변형은 하기로부터 선택된다:

Gly A21 + Lys B27 + Gln A17

Ser A21+ Lys B27 + Gln A17

Thr A21+ Lys B27 + Gln A17

Ala A21 + Lys B27 + Gln A17

His A21+ Lys B27 + Gln A17

Asp A21 + Lys B27 + Gln A17

Gly A21 + Lys B27 + Gln B13

Ser A21 + Lys B27 + Gln B13

Thr A21 + Lys B27 + Gln B13

Ala A21 + Lys B27 + Gln B13

His A21 + Lys B27 + Gln B13

Asp A21 + Lys B27 + Gln B13

Gly A21 + Arg B27 + Gln A17

Ser A21 + Arg B27 + Gln A17

Thr A21 + Arg B27 + Gln A17

Ala A21 + Arg B27 + Gln A17

His A21 + Arg B27 + Gln A17

Asp A21 + Arg B27 + Gln A17

Gly A21 + Arg B27 + Gln B13

Ser A21 + Arg B27 + Gln B13

Thr A21 + Arg B27 + Gln B13

Ala A21 + Arg B27 + Gln B13

His A21 + Arg B27 + Gln B13

Asp A21 + Arg B27 + Gln B13

Asp B10 + His A8 + His B25

Glu B10 + Glu A3 + Glu B22

Glu B27 + Ser B5 + Asp B5

Glu B27 + His A5 + Asp B9

Glu B27 + Asp A21 + Asp B9

des B28 + des B29 + des B30

Gly A21 + Asp B10 + Ala B30

Ser A21 + Asp B10 + Ala B30

Thr A21 + Asp B10 + Ala B30

Ala A21 + Asp B10 + Ala B30

His A21 + Asp B10 + Ala B30

Asp A21 + Asp B10 + Ala B30

Gly A21 + Thr B10 + Ala B30

Ser A21 + Thr B10 + Ala B30

Thr A21 + Thr B10 + Ala B30

Ala A21 + Thr B10 + Ala B30

His A21 + Thr B10 + Ala B30

Asp A21 + Thr B10 + Ala B30

Gly A21 + Arg B10 + Ala B30

Ser A21 + Arg B10 + Ala B30

Thr A21 + Arg B10 + Ala B30

Ala A21 + Arg B10 + Ala B30

His A21 + Arg B10 + Ala B30

Asp A21 + Arg B10 + Ala B30

Gly A21 +Asp B10 + des B30

Ser A21 +Asp B10 + des B30

Thr A21 + Asp B10 + des B30

Ala A21 + Asp B10 + des B30

His A21 + Asp B10 + des B30

Asp A21 + Asp B10 + des B30

Gly A21 + Thr B10 + des B30

Ser A21 + Thr B10 + des B30

Thr A21 + Thr B10 + des B30

Ala A21 + Thr B10 + des B30

His A21 + Thr B10 + des B30

Asp A21 + Thr B10 + des B30

Gly A21 + Arg B10 + des B30

Ser A21 + Arg B10 + des B30

Thr A21 + Arg B10 + des B30

Ala A21 + Arg B10 + des B30

His A21 + Arg B10 + des B30

Asp A21 + Arg B10 + des B30

Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Asp B10 + Lys B28+ Pro B29

Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Gly A21+ Glu B28 + Pro B29

Ser A21 + Glu B28 + Pro B29

Thr A21 + Glu B28 + Pro B29

Ala A21 + Lys B28 + Pro B29

His A21 + Lys B28 + Pro B29

Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Glu B28 + Pro B29 + des B30

Asp A21 + Lys B28 + ProB29

Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Lys B28 + Pro B29 + des B30

Arg B27 + Gly A21 + Thr B30NH₂

바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 천연 서열로부터 아미노산 변형 4개를 포함한다. 바람직하게는, 4개의 아미노산 변형은 하기로부터 선택된다:

Ser A21 + Arg B27 + Gln A17 + Gln B13

Thr A21 + Arg B27 + Gln A17 + Gln B13

Ala A21 + Arg B27 + Gln A17+ Gln B13

Asp A21 + Arg B27 + Gln A17 + Gln B13

His A21 + Arg B27 + Gln A17 + Gln B13

Glu B10 + His A8 + His B4 + His B27

Gly A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

Ser A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

Thr A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

Ala A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

Asp A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

His A21 + Lys B27 + Gln A17 + Gln B13

Gly A21 + Arg B27 + Gln A17 + Gln B13

des B27 + des B28 + des B29 + des B30

Gly A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

Ser A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

Thr A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

Ala A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

His A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

Asp A21 + Asp B10 + Glu B28 + Pro B29

Gly A21 + Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

Ser A21 + Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

Thr A21 + Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

Ala A21 + Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

His A21 + Thr B10 + Glu B28 + Pro B29

Asp A21 + Thr E10 + Glu B28 + Pro B29

Ala A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Ala A21 + Asp B10 + Lys B28 + Pro B29

His A21 + Asp B10 + Lys B28 + Pro B29

Asp A21 +Asp B10 + Lys B28 + Pro B29

Gly A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Ser A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Thr A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Gly A21 + Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

Ser A21 + Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

His A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Asp A21 + Arg B10 + Glu B28 + Pro B29

Gly A21 + Asp B10 + Lys B28 + Pro B29

Ser A21 + Asp B10 + Lys B29 + Pro B29

Thr A21 + Asp B10 + Lys B28 + Pro B29

Ser A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Thr A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Ala A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

His A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Asp A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Gly A21 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Ser A21 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Thr A21 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Ala A21 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

His A21 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Asp A21 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Thr A21 + Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

Ala A21+ Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

His A21 + Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

Asp A21 + Thr B10 + Lys B28 + Pro B29

Gly A21 + Arg B10 + Lys B28 + Pro B29

Gly A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Ser A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Thr A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Ala A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

His A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Thr B10 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Arg B10 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Asp B10 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Thr B10 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Arg B10 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

des B27 + des B29 + des B29 + des B30

Asp A21 + Glu B28 + Pro B29 + des B30

Gly A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Ser A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Thr A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Ala A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

His A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Asp A21 + Lys B28 + Pro B29 + des B30

Asp B10 + Glu B28 + Pro B29 +Ala B30

Thr B10 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Arg B10 + Glu B28 + Pro B29 +Ala B30

Asp B10 + Lys B28 + Pro B29 +Ala B30

Thr A21 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

His A21 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Asp A21 + Glu B28 + Pro B29 + Ala B30

Gly A21 + Lys B28+ Pro B29 + Ala B30

Ser A21 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Thr B10 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Arg B10 + Lys B28 + Pro B29 + Ala B30

Asp B10 + Glu B28 + Pro B29 + des B30.

바람직한 일 구현예에서, 펩타이드는 천연 서열로부터 5개의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 5개의 아미노산 변형은 하기 위치에 존재한다:

B26, B27, B28, B29 및 B30, 예를 들어, des B26 + des B27 + des B28 + des B29 + des B30.

바람직한 일 구현예에서, C는 서열번호 1에 나타낸 서열의 펩타이드이다.

RRGRR [서열번호 1]

바람직한 일 구현예에서, A는 서열번호 2에 나타낸 서열의 펩타이드이다.

¹GIVEQCCTSICSLYQLENYCG²¹ [서열번호 2]

상기 서열에서, 각각의 아미노산은 비-보호되거나 또는 선택적으로 보호되며, 예를 들어, 아미노산 측쇄는 관능기를 포함한다. 바람직한 보호기는 ^tBu, Acm, O^tBu, Trt, Mmt, Mtt 및 Pbf와 같은 산 절단성 보호기 (acid cleavable protecting group)를 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, A는 각각의 아미노산이 선택적으로 보호된 서열번호 2의 펩타이드로 구성된다.

다른 바람직한 구현예에서, A는 서열번호 8에 나타낸 서열의 펩타이드를 포함한다.

¹GIVEQCCTSICSLYQLENYCN²¹ [서열번호 8]

상기 서열에서, 각각의 아미노산은 비-보호되거나 또는 선택적으로 보호되며, 예를 들어, 아미노산 측쇄는 관능기를 포함한다. 바람직한 보호기는 ^tBu, Acm, O^tBu, Trt, Mmt, Mtt 및 Pbf와 같은 산 절단성 보호기를 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, A는 각각의 아미노산이 선택적으로 보호된 서열번호 8의 펩타이드로 구성된다.

바람직한 일 구현예에서, B는 서열번호 3 나타낸 서열의 펩타이드를 포함한다.

¹FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT³⁰ [서열번호 3]

더 바람직한 구현예에서, B는 각각의 아미노산이 선택적으로 보호된 서열번호 3의 펩타이드로 구성된다.

바람직한 일 구현예에서, 폴리펩타이드 화합물은 서열번호 4의 폴리펩타이드이다:

바람직한 일 구현예에서, 폴리펩타이드 화합물은 서열번호 4-7로부터 선택된다:

서열번호 4-7에서, C 는 보호기로 보호된 시스테인을 의미하고, C는 비-보호된 시스테인을 의미한다.

바람직한 일 구현예에서, 시스테인 보호기는 Acm 또는 Trt이다.

바람직한 일 구현예에서, 폴리펩타이드 화합물은 식 I.1의 화합물이다:

상기 식에서, PG₁및 PG₂는 각각 독립적으로 시스테인 보호기이고, C-SH는 비-보호된 시스테인이다. 바람직하게는, PG₁및 PG₂는 각각 독립적으로 Acm 또는 Trt이다.

아미노산에 적합한 보호기는 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙할 것이다. 그 예들은, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991; 및 P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994에서 확인할 수 있다.

본원에서, Acm은 S-아세토미도메틸 보호기를 지칭한다. S-Acm 보호기를 함유한 펩타이드에 요오드를 처리하면, 설프하이드릴 보호기의 제거와 이황화 결합 형성이 동시에 이루어진다.

본원에서, Trt는 트리페닐메틸 보호기를 지칭한다. Trt 보호기는 산-불안정 (acid labile) 기이며, 산성 조건에서 (예, TFA를 처리하여) 제거할 수 있다.

더 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드 화합물은 식 (I.1a)의 화합물이다:

상기 식에서, C-SH는 비-보호된 시스템을 표시한다.

프로인슐린 유도체의 제조 방법

본 발명의 프로인슐린 유도체는 전통적인 합성 방법 (예, 고상 방법) 또는 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다

바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 고상 펩타이드 합성을 이용해 상기와 같이 정의되는 폴리펩타이드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 첨부된 실시예 파트에서 보다 상세하게 합성 방법을 기술한다.

합성은 고상 지지체로서 2-클로로트리틸 수지를 이용해 Fmoc/tBu-보호 반응식에 따라 수행할 수 있다. Cys 잔기 보호에 Trt 또는 Trt/Acm 보호기를 사용할 수있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 화합물은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 보다 상세한 설명은 예를 들어 EP0518587A의 교시 내용을 참조한다.

본 발명의 일 측면은 따라서 전술한 바와 같이 정의되는 펩타이드 화합물을 코딩하는 DNA 서열에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 전술한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 상기와 같이 정의되는 폴리펩타이드 화합물의 재조합 제조 방법에 관한 것이다:

(i) 상기와 같이 정의되는 폴리펩타이드 화합물을 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 단계,

(ii) 상기 DNA 서열을 숙주 세포에서 기능하는 프로모터-오퍼레이터 영역을 포함하는 적절한 벡터에 삽입하는 단계,

(iii) 상기 DNA 서열의 전사 및 번역을 달성하고 상기 DNA 서열이 상기 프로모터-오퍼레이터 영역의 전사 통제 하에 놓이도록 상기 DNA 서열을 상기 벡터 내에 위치시키는 단계,

(iv) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,

(v) 형질전환된 숙주 세포를 유전자의 전사 및 번역을 유도하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및

(vi) 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 회수 및 정제하는 단계.

본 발명의 다른 측면은, 하기 단계를 포함하는, 인슐린 또는 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:

(iv) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,

(v) 형질전환된 숙주 세포를 유전자의 전사 및 번역을 유도하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계,

(vi) 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 회수 및 정제하는 단계, 및

(vii) 상기 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계.

프로인슐린 유도체 및 이의 중간산물의 산화적 폴딩 방법

(i) 본 발명에 따른 폴리펩타이드 화합물을 제조하는 단계, 및

(ii) 상기 폴리펩타이드를 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계.

본원에 기술된 수득되는 인버스 "슈퍼 미니" 프로인슐린의 폴딩은 한단계 또는 2 단계로 수행될 수 있다. C-펩타이드의 제거는 트립신 및/또는 카르복시펩티다제 B에 의해 통상적인 방식으로 수행될 수 있다. 첨부된 실시예 파트에서는 가능한 3가지 조합으로 Trt 6개, 또는 Acm 2개와 Trt 4개를 사용해 보호된 Cys의 측쇄를 가진 ACB-프로인슐린 유도체의 합성 방법을 기술한다. 이의 폴딩 효율을 이후 비교하고, 제조된 산물의 특성을 HPLC로 분석한다.

그 결과, A-C-B 프로인슐린 펩타이드는 고 순도 및 수율로 제조될 수 있는 것으로 확인되었다. 2-단계 산화 공정이 특히 효과적인 것으로 확인되었다. 이 방식으로, 체인-브릿징 C-펩타이드를 효소적으로 제거함으로써, 폴딩된, 단쇄 인슐린 전구체를 생반응성 2-쇄 인슐린으로 변환할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 인슐린 또는 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:

(i) A-C-B 폴리펩타이드를 제조하는 단계, 및

바람직한 구현예에서, A 및 B는 식 (I)에서 정의된 바와 같이 정의되고, C는 인슐린의 연결성 펩타이드, 또는 이의 변이체이다. 다른 바람직한 구현예에서, C는 식 (I)에서 정의되는 펩타이드, 즉 (X₁)_p-(X2)_n-(X₃)_q-이다.

바람직한 일 구현예에서, 인슐린의 A 체인의 7번 시스테인 잔기와 인슐린 B 체인의 7번 시스테인 잔기가 각각 보호기로 보호된다.

바람직한 일 구현예에서, A 체인의 6번, 11번 및 20번 시스테인 잔기가 비-보호되고, B 체인의 19번 시스테인 잔기가 비-보호된다.

다른 바람직한 구현예에서, A 체인의 6번, 11번 및 20번과, B 체인의 19번 시스테인 잔기들은 비-보호되고, A 체인의 7번 및 B 체인의 7번 시스테인 잔기들은 각각 보호기로 보호된다.

바람직하게는, 보호기는 Acm 또는 Trt이고, 더 바람직하게는 Acm이다.

특히 바람직한 일 구현예에서, 공정은 하기 단계를 포함하는 펩타이드 화합물의 단계적 산화적 폴딩 방법을 포함한다.

(i) 상기와 같이 정의되는 펩타이드를 산화시켜, 제1 중간산물을 형성하는 단계;

(ii) 제1 중간산물을 산화하여, 제2 중간산물을 형성하는 단계; 및

(iii) 제2 중간산물을 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계.

바람직하게는, 펩타이드는 상기와 같이 정의되는 식 I.1 또는 I.1a의 화합물이다.

바람직한 일 구현예에서, 단계 (i), 1차 산화 단계는 펩타이드에 DMSO를 처리하여 제1 중간산물을 형성하는 단계를 포함한다. 그런 후, 남아있는 보호기를 제거하고, 수득되는 중간산물을 추가적인 (2차) 산화 단계에 투입하여 제2 중간산물을 형성한다. 중간산물의 보호기들은 임의의 적절한 방법으로 제거할 수 있다. 따라서, 출발 펩타이드에 오르소고날 (orthogonal) 시스테인 보호기를 병합하여, 산화적 폴딩 프로세스가 우선적인 방식으로 이루어지게 할 수 있다.

더 바람직하게는, 단계 (i)은 Gly 완충제 중에 DMSO 처리, 더 바람직하게는 0.1M Gly 완충제 중에 20% DMSO 처리를 포함한다. 바람직하게는, 혼합물의 pH는 9 보다 높으며, 더 바람직하게는, 10 보다 높으며, 더더 바람직하게는 약 10.5이다. 바람직하게는, 산화는 적어도 4시간 동안, 더 바람직하게는 적어도 8시간, 더 바람직하게는 적어도 21시간, 보다 더 바람직하게는, 1일 동안 이루어진다. 바람직하게는, 반응은 실온에서 수행된다.

바람직한 일 구현예에서, 단계 (ii) 2차 산화 단계는 아세트산/물 중에서 제1 중간산물에 요오드를 처리하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 2차 산화 단계는 약 4:1 비율의 AcOH/물 중에서 요오드를 사용해 수행된다. 바람직하게는, 반응은 적어도 30분, 더 바람직하게는 적어도 1시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 반응은 실온에서 수행된다.

바람직한 일 구현예에서, 절단 단계 (iii)는 제2 중간산물에 트립신을 처리하는 것을 포함한다.

바람직하게는, C 펩타이드의 절단은 실온에서 수행된다. 바람직하게는, 반응은 트리스-완충제 중에 트립신을 사용해 수행된다. 바람직하게는, pH는 7.5 보다 높으며, 더 바람직하게는 약 8이다. 바람직하게는, 반응은 약 5분간 수행된다.

특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 공정은 후술한 반응식 1에 나타낸 바와 같다:

본 발명의 다른 측면은 인슐린 또는 그 유도체의 제조에 있어 상기에서 정의되는 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 산화적 폴딩 공정에서의 중간산물 폴리펩타이드 화합물에 관한 것이다.

즉, 일 구현예에서, 본 발명은 식 (I.1)의 폴리펩타이드에 관한 것이다:

상기 식에서, PG₁및 PG₂는 각각 독립적으로 시스테인 보호기, 바람직하게는 Acm 또는 Trt, 더 바람직하게는 Acm이다.

이에, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 식 (I.1a)의 폴리펩타이드 화합물에 관한 것이다:

다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 식 (II.1)의 폴리펩타이드에 관한 것이다:

이에, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 식 (II.1a)의 펩타이드 화합물에 관한 것이다:

다른 구현예에서, 본 발명은 식 (III.1)의 펩타이드 화합물에 관한 것이다:

식 I.1, I.1a, II.1 및 II.1a의 펩타이드들은 인슐린의 제조시 유용한 중간산물들이다.

약학적 조성물

본 발명의 일 측면은 본 발명의 프로인슐린 유도체를 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체 또는 이들의 혼합물과 혼합하여 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프로인슐린 유도체 (이의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 및 약제학적으로 허용가능한 용매화물 등)는 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제와의 혼합물로, 특히 인간 테라피를 위해 투여될 것이다. 약학적 조성물은 인간 의학 및 수의학에서의 인간용 또는 동물용일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 통상적인 약제학적 담체 및 부형제와 혼합될 수 있으며, 정제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. ACB-프로인슐린 화합물을 포함하는 조성물은 전형적으로 활성 성분을 약 0.1 내지 90 중량%로, 보다 일반적으로는 약 10 내지 30%로 포함할 것이다. 본 조성물은 통상적인 담체 및 부형제, 예를 들어 옥수수 전분 또는 젤라틴, 락토스, 슈크로스, 미세결정 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 다이칼슘 포스페이트, 소듐 클로라이드 및 알긴산을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 통상적으로 사용되는 붕해제로는 크로스카멜로스, 미세결정 셀룰로스, 옥수수 전분, 소듐 전분, 글리콜레이트 및 알긴산 등이 있다.

본원에 기술된 약학적 조성물의 다양한 여러가지 형태에 적합한 부형제의 예들은 Excipients, 2^nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller에서 찾아볼 수 있다.

치료학적 용도로 허용가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.

적합한 담체의 예로는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 있다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물 등이 있다.

약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도한 투여 경로 및 표준 약학 실무에 따라 선택될 수 있다. 약학적 조성물은, 실제, 또는 담체, 부형제 또는 희석제와 더불어, 임의의 적절한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)을 포함할 수 있다.

적절한 결합제의 예로는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들어 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 (free-flow) 락토스, beta-락토스, 옥수수 감미제, 천연 건, 합성 검, 예를 들어, 아카시아, 트라가칸트 또는 소듐 알기네이트, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.

포함될 수 있는 정제 결합제로는 아카시아, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 (Povidone), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 슈크로스, 전분 및 에틸셀룰로스가 있다.

적절한 윤활제의 예로는 소듐 올리에이트, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트 또는 그외 메탈릭 스테아레이트 (metallic stearates), 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 스테아르산, 실리콘 플루이드, 탈크, 왁스, 오일 및 콜로이드형 실리카 등이 있다.

보존제, 안정화제, 색소 및 심지어 착향제도 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예로는 소듐 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르 등이 있다. 항산화제 및 현탁화제 역시 사용될 수 있다. 적절한 착향제로는 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 착향제 등이 있다. 투약 형태의 외양을 더욱 매력적이게 만들거나 또는 제품의 식별을 돕기 위해 착색제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.

정맥내 (IV) 사용하는 경우, 본 발명의 화합물의 수용성 형태를 통상적으로 사용되는 정맥내 유체들 중 하나에 용해하고, 주입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 유체, 예를 들어, 생리 식염수, 링거액 또는 5% 덱스트로스 용액이 사용될 수 있다.

근육내 조제물의 경우, 본 발명의 화합물의 적절한 용해성 염 형태의 무균성 조성물 (sterile formulation), 예를 들어, 하이드로클로라이드 염을 발열원 제거 수 (pyrogen-free water)(증류 처리됨), 생리식염수 또는 5% 글루코스 용액에 용해시켜, 투여할 수 있다. 화합물의 적절한 불용성 형태는 수성 베이스 또는 약제학적으로 허용가능한 오일 베이스, 예를 들어, 에틸 올리에이트와 같은 장쇄 지방산의 에스테르 중의 현탁액으로서 제조 및 투여할 수 있다.

경구로 사용하는 경우, 증류수 또는 탈이온수 등의 희석제 중에 제형화된 ACB-프로인슐린의 적절한 염 형태의 무균성 조성물, 예를 들어, 하이드로클로라이드 염이 특히 유용하다.

다른 예로, 화합물의 단위 투약 형태는, 무균성의 기밀 밀봉된 (sterile hermetically sealed) 앰플 안에 든, 적절한 희석제 중의, 화합물, 바람직하게는 이의 염 형태의 화합물의 용액일 수 있다. 단위 용량 내 화합물의 농도는 화합물의 구체적인 형태와 용해성 및 의사에 의해 요청된 투여량에 따라 예를 들어 약 1% 내지 약 50%로 다양할 수 있다.

염/에스테르

본 발명의 프로인슐린 유도체는 염 또는 에스테르로서, 특히 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르로 존재할 수 있다.

본 발명의 프로인슐린 유도체의 약제학적으로 허용가능한 염으로는 적절한 이의 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 포함한다. 적절한 약제학적 염에 대한 리뷰는 Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)에서 확인할 수 있다. 염은, 예를 들어, 미네랄 산, 예로, 황산, 인산 또는 할로겐화수소산과; 강한 유기 카르복시산, 예를 들어, 아세트산과 같이, 비-치환 또는 (예, 할로겐으로) 치환된 탄소수 1-4의 알칸카르복시산과; 포화 또는 불포화된 다이카르복시산, 예를 들어, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 프탈산 또는 테트라프탈산과; 하이드록시카르복시산, 예를 들어, 아스코르브산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트라산과; 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산과; 벤조산과; 또는 유기 설폰산, 예를 들어, 메탄- 또는 p-톨루엔 설폰산과 같이 비-치환 또는 (예, 할로겐으로) 치환된 아릴-설폰산 또는 (C₁-C₄)-알킬-과 함께 형성된다.

에스테르는 관능기가 에스테르화되는 지에 따라 유기산 또는 알코올/하이드록사이드를 이용해 제조된다. 유기산으로는 카르복시산, 예를 들어, 아세트산과 같이 비-치환 또는 (예, 할로겐으로) 치환된 탄소수 1-12의 알칸카르복시산; 포화 또는 불포화된 다이카르복시산, 예를 들어, 옥산산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 프탈산 또는 테트라프탈산; 하이드록시카르복시산, 예를 들어, 아스코르브산, 글리콜산, 락트산, 말산, 타르타르산 또는 시트리산; 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산; 벤조산; 유기 설폴산, 예를 들어, 메탄- 또는 p-톨루엔 설폰산과 같이 비-치환 또는 (예, 할로겐으로) 치환된, (C₁-C₄)-알킬- 또는 아릴-설폰산 등이 있다. 적합한 하이드록사이드로는 무기 하이드록사이드, 예를 들어 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드, 알루미늄 하이드록사이드 등이 있다. 알코올로는 비-치환 또는 (예, 할로겐으로) 치환된 탄소수 1-12의 알칸알코올 등이 있다.

거울상이성질체/호변이성질체

전술한 본 발명의 모든 측면들에서, 본 발명은, 적절한 경우, 본 발명의 프로인슐린 유도체의 모든 거울상이성질체 및 호변이성질체를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는 광학 특성 (하나 이상의 키랄 탄소 원자) 또는 호변이성질체 특징을 가진 화합물을 알 것이다. 해당되는 거울상이성질체 및/또는 호변이성질체는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 분리/제조할 수 있다.

입체이성질체 및 기하이성질체

본 발명의 프로인슐린 유도체들 중 일부는 입체이성질체 및/또는 기하이성질체로서 존재할 수 있다 - 예를 들어, 이는 하나 이상의 비대칭적인 및/또는 기하학적 센터를 가질 수 있으며, 그래서 2 이상의 입체이성질체 및/또는 기하학적 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 유사체의 모든 개별 입체이성질체 및 기하이성질체, 및 이들의 혼합물의 사용을 포함한다. 청구항에서 사용되는 용어들은, 형태들이 적절한 기능성 활성 (반드시 동일한 정도는 아니더라도)을 보유하는 한, 이러한 형태들을 포괄한다.

또한, 본 발명은 프로인슐린 유도체의 모든 적절한 동위원소 변형 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 동위원소 변형은 하나 이상의 원소가 원자 번호는 동일하지만 원자 질량이 자연계에서 통상적으로 발견되는 원자 질량과 다른 원자로 치환된 것으로 정의된다. 물질 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 병합될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소, 예를 들어, 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F 및 ³⁶Cl을 포함한다. 특정한 동위원소 변형, 예를 들어, ³H 또는 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 병합된 변형은, 약물 및/또는 물질의 조직 분포 실험에 유용하다. 삼중수소, 즉, ³H, 및 탄소-14, 즉, ¹⁴C 동위원소들은 특히 제조 용이성 및 검출성 측면에서 특히 바람직하다. 나아가, 중수소 즉, ²H와 같은 동위원소로 치환하면, 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체내 반감기 증가 또는 필요 투여량 감소로 인해 특정한 치료학적 이점을 부여할 수 있으며, 따라서 일부 경우에 바람직할 수 있다. 본 발명의 유사체의 동위원소 변형 및 본 발명의 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 적합한 시약에 대한 적절한 동위원소 변형을 이용해 통례적인 방식으로 제조할 수 있다.

용매화물

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물의 용매화물 형태를 포함한다. 청구항에 사용된 용어들은 이러한 형태를 포괄한다.

다형체

또한, 본 발명은 다양한 결정질 형태, 다형체 형태 및 (무)수화물 형태의 본 발명의 화합물에 관한 것이다. 화학적 화합물을 이러한 화합물의 합성 공정에 사용되는 용매로부터 정제 및/또는 단리하는 방법을 일부 변경시킴으로써, 이러한 임의의 형태들로 단리될 수 있음은, 약학 산업에서 잘 확립되어 있다.

프로드럭

또한, 본 발명은 프로드럭 형태의 본 발명의 프로인슐린 유도체를 포함한다. 이러한 프로드럭은 일반적으로 하나 이상의 적절한 기가 인간 또는 포유류 개체에 투여시 변형이 되돌려지는 복구가 이루어질 수 있도록 변형된, 본 발명의 유사체이다. 이러한 복구는, 생체내에서 복구를 수행하기 위해 프로드럭과 함께 제1 물질이 투여될 수도 있지만, 일반적으로 개체에 본래 존재하는 효소에 의해 수행된다. 이러한 변형의 예로는 에스테르 (예, 전술한 임의의 에스테르)를 포함하며, 이 경우 복구는 에스테라제 등을 이용해 수행될 수 있다. 그외 시스템들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있을 것이다.

투여

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 근육내, 복막내, 동맥내, 척추강내, 기관지내, 피하, 진피내, 정맥내, 코, 볼 또는 설하 투여 경로용으로 적합할 수 있다.

경구 투여의 경우, 압축정, 환제, 정제, 젤리 (gellules), 점적제 및 캡슐제로 특히 사용된다. 바람직하게는, 이들 조성물은 용량 당 활성 성분을 1 - 250 mg, 더 바람직하게는 10 - 100 mg으로 포함한다.

다른 투여 형태로는, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 피하, 진피내, 복막내 또는 근육내 주사할 수 있으며; 무균성 또는 멸균가능한 용액으로부터 제조되는, 용액 또는 에멀젼을 포함한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 좌제, 페서리, 현탁제, 에멀젼, 로션, 연고, 크림, 젤, 스프레이, 용액 또는 살포제 형태일 수 있다.

경피 투여의 또 다른 수단은 피부 패치를 사용하는 것이다. 예를 들어, 활성 성분을 폴리에틸렌 글리콜 또는 액체 파라핀으로 구성된 크림에 혼합할 수 있다. 활성 성분은 또한 필요에 따라 안정제 및 방부제와 함께 백색 왁스 또는 백색 연질 파라핀 베이스로 구성된 연고에 1 - 10 중량%의 농도로 혼합할 수 있다.

주사용 형태는 용량 당 활성 성분을 10 - 1000 mg, 바람직하게는 10 - 250 mg으로 포함할 수 있다.

조성물은 단위 투약 형태, 즉, 단위 용량을 함유한 개별 파트 형태로 또는 단위 용량을 복수개 또는 단위 용량의 하위-단위로 함유한 개별 파트 형태로 제형화될 수 있다.

투여량

당해 기술 분야의 당업자라면 과도한 실험없이도 개체에게 투여할 본 조성물들 중 하나의 조성물의 적절한 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, 의사는 개별 환자에게 가장 적합한 실제 투여량을 결정하게 될 것이며, 이는 사용되는 구체적인 화합물의 활성, 그 화합물의 대사 안정성과 작용 기간, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식습관, 투여 방식과 시기, 배출율, 약물 조합, 특정 증상의 중증도 및 치료 중인 개체 등의 다양한 인자들에 따라 결정될 것이다. 본원에 언급된 투여량은 평균적인 사례를 예로 든 것이다. 물론, 더 높거나 낮은 투여량 범위가 유리한 개별 사례들도 존재하며, 이 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

치료학적 용도

본 발명의 다른 측면은 의약제로서 사용하기 위한 전술한 프로인슐린 유도체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 당뇨병 치료 또는 예방 또는 고혈당 치료 또는 예방에 사용하기 위한 전술한 프로인슐린 유도체에 관한 것이다.

바람직하게는, 당뇨병은 2형 진성 당뇨병이다.

본 발명의 다른 측면은 당뇨병 치료 또는 예방 또는 고혈당 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어 전술한 프로인슐린 유도체에 관한 것이다.

본원에서, "약제의 제조"라는 표현은 추가의 치료학적 물질에 대한 스크리닝 프로그램에서의 사용 또는 상기한 약제의 임의 제조 단계에서의 사용 외에도, 약제로서 직접 본 발명의 유사체를 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 측면은, 전술한 단쇄 인슐린 유사체를 치료학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 당뇨병을 치료하거나 또는 고혈당을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 방법은 유기체에 ACB-프로인슐린을 약 10 - 1000 ㎍/kg 용량의 양으로 투여하는 것을 포함한다. 더 바람직한 용량은 활성 화합물 약 10 - 100 ㎍/kg이다. 성인의 경우 전형적인 1일 용량은 약 0.5 - 100 mg이다.

이 방법을 실시함에 있어, 본 발명의 화합물은 매일 1회 또는 매일 다회로 투여할 수 있다. 치료 용법이 장기간의 투여를 필요로 할 수 있다. 투여되는 1회 용량 또는 투여되는 총 용량은 질환의 특성과 중증도, 환자의 나이와 전반적인 건강 상태 및 환자의 화합물에 대한 허용성에 따라 결정될 것이다.

치료 방법을 실시하는 편리한 방법은 본 발명의 화합물을 정맥내 주입을 통해 투여하는 것이다. 이 과정에서, 화합물의 적절한 용해성 염에 대한 무균성 제형을 생리 유체, 예를 들어, 5% 덱스트로스 용액에 투입하고, 제조된 용액을 천천히 IV로 주입한다. 다른 예로, IV 주입의 피기백 (piggy-back) 방법도 이용할 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 추가로 설명한다:
도 1은 본 발명에 따른 ACB-프로인슐린 펩타이드 1-4를 도시한 것이다.
도 2는 펩타이드 4 (C(Acm)⁷C(Acm)³³)의 (DMSO를 이용한) 1차 산화 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 C= RRGRR을 가진 환원된 미-정제 산물 C(Acm)⁷C(Acm)³³) 리버티드 프로인슐린 (A), DMSO를 이용한 산화 후 수득한 산물 (B) 및 (C = RRGRR을 가진 bis-산화된 ACB-프로인슐린) 정제된 산물 (C)의 HPLC 프로파일 및 ESI-MS를 도시한 것이다.
도 4는 C= RRGRR을 가진 펩타이드 4 (C(Acm)⁷C(Acm)³³) 리버티드 프로인슐린의 (I₂를 이용한) 제2 산화 단계 및 트립신분해에 의한 C-펩타이드 절단을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5는 C-펩타이드 RRGRR을 가진 미-정제 인버티드 프로인슐린 (A); 정제 후 산물 (B); 트립신 절단 후 수득된 생산 혼합물 (D); 및 최종 정제된 Gly^A21, Arg^{A22, A23}] 인슐린 유도체 (E)의 HPLC 프로파일 및 대응되는 MS-스펙트럼을 도시한 것이다.

본 발명은 아래 비-제한적인 실시예들을 들어 추가적으로 설명된다.

실시예

약어

Acm 5-아세토미도메틸

Boc t-부틸옥시카르보닐

CTC 클로로트리틸 클로라이드

NMP N-메틸피롤리돈

DCM 디클로로메탄

TFA 트리플루오로아세트산

RE 회전식 증발기

DEE 다이에틸 에테르

DIC N,N'-다이이소프로필카르보디이미드

HOBt 하이드록시벤조트리아졸

HOSu N-하이드록시숙신이미드

Hyp (2S,4R)-4-하이드록시프롤린 또는 L-하이드록시프롤린

DMF 다이메틸포름아미드

EDAC 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드

RT 실온

DTT 다이티오트레이톨

DMSO 다이메틸설폭사이드

MMt 모노메톡시트리틸

Trt 트리틸

DIPEA/DIEA N,N-다이이소프로필에틸아민

Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐

MeOH 메탄올

AcOH 아세트산

TFE 트리플루오로에틸 알코올

Dde N-(1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스일리덴)에틸)

IPA 이소프로필 알코올

TES 트리에틸실란

실시예 1

A-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-B 프로인슐린 (ACB-프로인슐린)의 고상 합성

일반 공정:

A1. 로딩된 2-클로로트리틸 수지의 제조

CBL-Patras 사의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (CTC-Cl) (2 g; 1.6 mmol/g 로딩)를, 60 ml 펩타이드 합성 반응기에 넣고, 다이클로로메탄 (DCM) 15 ml을 사용해 25℃에서 15분간 팽윤시켰다. 수지를 여과하고, DCM 10 ml 중의 1 mmol Fmoc-아미노산 및 8 mmol 다이이소프로필에틸아민 (DIEA) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 교반하였다. 메탄올 (MeOH) 1 ml을 첨가하여 1시간 반응시켜, 2-CTC 수지의 남아있는 활성 부위를 중화하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA (85:10:5) 혼합물 10 ml로 3번, 그리고 NMP 10 ml로 3번 헹구었다. 헹군 후, 수지에 30분간 NMP 중의 피페리딘 25 부피% 10 ml을 2회 처리하였다. 수지를 NMP 10 ml로 5회 헹구었다. 수지를 이소프로판올 (IPA) 10 ml로 3회 세척하여 비-팽윤시키고, 중량이 일정해질 때까지 건조시켰다. 사용한 아미노산의 70-95% mmol이 수지에 결합되었다.

B. 고상 합성, 일반 프로토콜

고상 합성을 24℃에서 수행하였으며, 실시예 1의 파트 A에 언급된 바와 같이 아미노산 1.0 g을 CTC 수지로 에스테르화하였다. 전체 합성 공정 중에 다음과 같은 프로토콜을 사용하였다.

B1. 수지의 팽윤

수지를 다공성 폴리프로필렌 프리트가 장착된 20 ml 플라스틱 시린지에 넣고, NMP 7 ml을 2회 처리한 다음 여과하였다.

B2. 아미노산의 활성화

아미노산 (3.0 당량) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 (4.0 당량)을 10 ml 바이얼에서 2.5 부피배의 NMP에 용해하고, 0℃로 냉각시켰다. 그런 후, DIC (3.0 당량)를 첨가하고, 혼합물을 15분간 교반하였다.

B3. 커플링 반응

B2에서 준비한 용액을 B1 반응기에 투입하였다. 반응기를 1 부피배의 DCM으로 1회 세척하고, 반응기에 투입하여 25-30℃에서 1-3시간 교반하였다. 반응 완료를 확인하기 위해 카이저 검사를 수행하였다. 커플링 반응이 3시간 후 완료되지 않았을 경우 (카이저 검사 양성), 반응 혼합물을 여과하고, 활성화된 아미노산의 신선한 용액과 다시 커플링 반응을 수행하였다. 커플링 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, NMP로 6회 세척하였다 (5 부피배/세척).

B4. Fmoc 기의 제거

B3에서 수득한 수지를 여과한 다음 25 부피%의 피페리딘이 함유된 용액 5 ml을 30분간 처리하였다. 수지를 NMP로 3 x 5 ml 세척하였다.

B5. 펩타이드 체인의 연장

각 아미노산을 조립한 후, 바람직한 펩타이드 체인이 형성될 때까지 B1-B5 단계를 반복하였다.

각 아미노산 또는 아미노산 단편의 커플링에 다음과 같은 Fmoc-아미노산을 사용하였다: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH 및 Fmoc-Cys(Acm)-OH; 및 그 다음으로 Boc-아미노산: Boc-Gly-OH.

C. CTC-수지 상에, N-말단에 Fmoc 또는 Boc 기를 가진 보호된 ACB 프로인슐린 펩타이드 및 이의 보호된 단편을 절단하는 일반적인 방법

B1-B5에 기술된 바와 같이 제조한 수지-결합된 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 5 ml NMP로 4회, 5 ml IPA로 3회, 마지막으로 7 ml DCM으로 5회 세척하여, 임의의 남아있는 NMP 또는 그외 염기성 성분들을 완전히 제거하였다. 그런 후, 수지를 0℃로 냉각시키고, DCM으로부터 여과하여, DCM/TES (95:5) 중의 1.0-1.5% TFA 용액 10 ml로 5℃에서 6회 처리하였다.

그런 후, 혼합물을 0℃에서 20분 교반하고, 여과하였다. 이후, 수지를 DCM 10 ml을 사용해 3회 세척하였다. 여과물에 피리딘 (TFA 대비 1.3 당량)을 첨가하여 TFA를 중화하였다. DCM 중의 절단 용액을 동일 부피의 물과 혼합하였다. 수득한 혼합물은 감압 하에 증발시켜, DCM을 제거하였다 (350 Torr, 28℃). DCM 제거 후, 펩타이드 또는 펩타이드 단편이 석출되었다. 수득한 펩타이드를 물 및 에테르로 세척하고, 15 Torr 진공 하에 30-35℃에서 건조하였다. 다른 예로, DCM을 진공 하에 제거하고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 보호된 펩타이드를 석출시켰다.

실시예 2

보호된 ACB-프로인슐린의 탈보호

일반적인 방법: 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득한 보호된 ACB-프로인슐린 (100 mg, 0.01 mmol)에 TFA/TES/DTT/DCM (93:3:3:3) 10 ml을 5℃에서 3시간, 22℃에서 1시간 동안 처리하였다. 수득된 용액을 진공 농축한 다음, 탈보호된 펩타이드에 다이에틸에테르를 첨가하여 석출시키고, 다이에틸에테르 10 ml로 3회 세척하였다. 중량이 일정해질 때까지, 형성된 고형물을 진공 건조하였다 (25℃, 15 Torr). 수율: 60 mg.

실시예 3

ACB-프로인슐린 조산물의 한단계 (랜덤) 산화적 폴딩 (모두 Cys 없음)

실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한 탈보호된 ACB-프로인슐린 조산물 (모두 Cys이 없음) 10 mg을 DMSO 2 ml에 용해하였다. 이 용액에, 0.1 M Gly 완충제 pH 10.5를 첨가 (8 ml)한 다음, 용액이 투명해질 때까지 Gnd.HCl 고체 (1.9 g, 약 2 M)를 첨가하였다. 용액을 밤새 RT에 두었다. 정치하는 중에 소량의 석출물이 형성되었다. 상층액 (CF₃CO₂H로 pH 2까지 산성화)의 HPLC 분석을, Waters 996 PDA 검출기가 구비된 Waters Alliance 2695 시스템에서, Purospher RP-8, 125 x 4 mm, 5 μm 컬럼 (Merck) 및 10% B -> 60% B의 선형 농도 구배 (A = 1% TFA/물, B = 1% TFA/아세토니트릴), 유속 1 ml/min을 사용해 수행하였으며, 삼산화 이성질체들로 된 복합 혼합물이 형성되었음을 확인하였다.

실시예 4

[Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린의 산화적 폴딩

실시예 2에 기술된 바와 같이 제조한 탈보호된 [Cys(Acm)7,33]-ACB-프로인슐린 조산물 10 mg을 DMSO 2 ml에 용해하였다. 이 용액에, 0.1 M Gly 완충제 pH 10.5를 첨가 (8 ml)한 다음, 용액이 투명해질 때까지 Gnd.HCl 고체 (1.9 g, 약 2 M)를 첨가하였다. 용액을 밤새 RT에 두었다. 정치하는 중에 소량의 석출물이 형성되었다. 상기 실시예 4에서 기술된 바와 같이 수행한, 상층액 (CF₃CO₂H로 pH 2까지 산성화)의 HPLC 분석에서, Waters-Micromass ZQ4000 시스템에서의 ESI-MS 분석에 의해 검증된 바와 같이, 비스-산화된 산물이 주 산물로 형성된 것으로 확인되었다. M 계산치 6558.56 Da, M 실측치 6558.36 Da.

실시예 5

비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린의 정제

상기 실시예 4에 언급된 바와 같이 수득한 비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린 용액을, 0.2 멤브레인 시린지 필터를 통해 여과한 후, Purospher RP-18 세미-분취용 컬럼, 10 x 250 mm (Merck)에 2회로 나누어 로딩하였다; A 상 = 1% TFA/물, B 상 = 1% TFA/아세토니트릴; 등용매 용리 (isocratic) 30% B, 5분, 및 이후 선형 농도 구배 30% B -> 40% B, 30분간, 유속 4 ml/min. 수집한 주 산물 분획들을 액체 질소에서 냉동시키고, 동결건조하였다. 정제 수율은 30%였다.

실시예 6

스타필로코커스 아우레우스 B8 프로테아제 핑거프린팅에 의한 비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린에서 이황화 결합-페어링 확인

정제된 비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린 100 ㎍을 0.1 M 암모늄 아세테이트, pH 4.0 150 ㎕에 용해하였다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 중의 스타필로코커스 아우레우스 B8 프로테아제 (서열분석 등급, Sigma-Aldrich 사에서 구입) 용액 50 ㎕ (5 ㎍)을 첨가하고, 25℃에서 효소 분해하였다. 분해 진행은 Purospher RP-8 HPLC 컬럼에 용액 20 ㎕를 주입하고, 30분간 10% B -> 60% B로 농도 구배를 실시하여, 모니터링하였다. 54시간 후, 출발 물질 펩타이드가 거의 사라졌다. 관찰된 피크들에 대한 ESI-MS 분석에서, 비스-산화된- [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린의 적절한 이황화 결합 형성이 검증되었다.

실시예 7

요오드를 이용한 비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린의 산화

실시예 5에 기술된 바와 같이 수득한, 정제된, 동결건조한 비스-산화된 [Cys(Acm)7, 33]-ACB-프로인슐린 (2 mg)을 아세트산/물 4:1 v/v 혼합물 (1 ml)에 용해하였다. 이 용액을 10분에 걸쳐 아세트산/물 4:1 (1 ml) 중의 요오드 (4 mg) 용액에 교반 하에 첨가하였다. 간헐적으로 교반하면서 RT에서 1시간 세워둔 후, 물 중의 1 M 아스코르브산 수용액 2 방울을 첨가하여, 과량의 요오드를 중화하였다 (탈색). 그런 후, 이 용액을 Purospher RP-8, 125X4 mm HPLC 컬럼 (Merck)에 나누어 로딩하고, 30분간 10% B -> 60% B의 농도 구배 및 유속 1 ml/min을 적용해 정제하였다. 수집한 주 산물 분획들을 액체 질소에서 냉동시키고, 동결건조하였다. 수율: 70 %. ESI-MS: M 계산치 6414.39 Da, M 실측치 6413.83 Da.

실시예 8

ACB-프로인슐린의 트립신 절단

ACB-프로인슐린 500 ㎍을, 2 M 우레아 및 트립신 (Sigma, 약간 흐린 용액) 5 ㎍이 함유된 0.1 M Tris.HCl 완충액 pH 7.9 500 ㎕에 RT에서 용해하였다. 트리플루오로아세트산 (5 ㎕)을 첨가하여 산성화함으로써, 5분 후 반응을 정지시켰다. 용액을 원심분리한 다음, 실시예 7에 언급된 바와 같이 Purospher RP-8 컬럼에 100 ㎕ 씩 로딩하고, 주 산물을 분리하였다. 주 산물을 ESI-MS로 분석하였으며, 이는 [GlyA21]- 인슐린 + Arg 잔기 2개인 것으로 확인되었다 (ESI-MS: M 계산치 6062.97 Da, M 실측치 6062.28 Da). 이황화 결합을 TCEP를 사용해 환원하고, 2개의 체인을 LC-MS 분석한 결과, [GlyA21, ArgA22, ArgA23]-인슐린으로 식별되는 산물이 생성되었다.

본 발명에 대해 기술된 측면들에 대한 다양한 수정 및 변형들이 본 발명의 범위 및 사상으로부터 이탈하지 않으면서 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 구현예들을 들어 기술되었지만, 청구된 본 발명이 이러한 구체적인 구현예들로 과도하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제, 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명한 본 발명을 수행하는 기술된 방식에 대한 다양한 수정들은 첨부된 청구항 범위에 속하는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Chemical & Biopharmaceutical Laboratories of Patras SA <120> Proinsulin derivatives <130> P110478PCT <140> PCT/IB2017/055336 <141> 2017-09-05 <150> GR 20160100458 <151> 2016-09-06 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide <400> 1 Arg Arg Gly Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insulin chain <400> 2 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(56) <223> amino acid may be unprotected or optionally protected <400> 4 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 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Claims

식 (I)의 폴리펩타이드 화합물:
A-C-B (I)
상기 식에서,
A는 인슐린의 A 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;
B는 인슐린의 B 체인, 또는 이의 기능성 유도체 또는 변이체이고;
C는 식 (X₁)_p - (X₂)_n - (X₃)_q의 펩타이드로서,
각각의 X₁ 및 X₃는 독립적으로 염기성 아미노산이고;
각각의 X₂는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고;
p는 1 또는 2이고;
q는 0, 1 또는 2이고;
n은 0, 1, 2 또는 3임.
제1항에 있어서,
각각의 X₂가 독립적으로 염기성 아미노산, Gly, β-Ala, Pro, Hyp, 슈도프롤린, 산성 아미노산 또는 친수성 아미노산으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 화합물.
제2항에 있어서,
상기 산성 아미노산 또는 친수성 아미노산이 Ser, Asp 및 Glu으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 염기성 아미노산이 Lys, Arg, Orn 및 His으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 X₂가 독립적으로 Gly 및 Arg으로부터 선택되는, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X₁과 X₃가 둘다 Arg인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
p 및 q가 둘다 2인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
n이 1 또는 2인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
n이 1인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
A가 천연 인슐린, 바람직하게는 인간 인슐린의 A 체인 또는 이의 변이체이고,
(a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기로 치환되거나, (b) 2개 이상의 아미노산 잔기의 순서가 역전되거나, (c) 1, 2 또는 3개의 아미노산이 결손되거나, (d) 스페이서 기가 임의의 2개의 아미노산 잔기 사이에 존재하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태 (peptoid form)이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 (N-C-C) 백본이 변형된 것이거나, (g) 하나 이상의 부가적인 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 (a)-(g) 중 임의 조합을 포함하는, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
B가 천연 인슐린, 바람직하게는 인간 인슐린의 B 체인 또는 이의 변이체이고,
(a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기로 치환되거나, (b) 2개 이상의 아미노산 잔기의 순서가 역전되거나, (c) 1, 2 또는 3개의 아미노산이 결손되거나, (d) 스페이서 기가 임의의 2개의 아미노산 잔기 사이에 존재하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 (N-C-C) 백본이 변형된 것이거나, (g) 하나 이상의 부가적인 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 (a)-(g) 중 임의 조합을 포함하는, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
C가 서열번호 1에 나타낸 서열의 펩타이드인, 폴리펩타이드 화합물:
RRGRR [서열번호 1]
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
A가 서열번호 2에 나타낸 서열의 펩타이드인, 폴리펩타이드 화합물:
¹GIVEQCCTSICSLYQLENYCG²¹ [서열번호 2]
상기 서열번호 2에서, 각 아미노산은 비-보호되거나, 또는 선택적으로 보호됨.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
B가 서열번호 3에 나타낸 서열의 펩타이드인, 폴리펩타이드 화합물:
¹FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT³⁰ [서열번호 3]
상기 서열번호 3에서, 각 아미노산은 비-보호되거나, 또는 선택적으로 보호됨.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 4-7로부터 선택되는, 폴리펩타이드 화합물:

상기 서열번호 4-7에서, C 는 보호기로 보호된 시스테인이고, C는 비-보호된 시스테인임.
제15항에 있어서,
시스테인 보호기가 Acm 또는 Trt인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
식 (I.1)의 화합물인, 폴리펩타이드 화합물:

상기 식에서, PG₁및 PG₂는 각각 독립적으로 시스테인 보호기임.
인슐린 또는 그 유도체의 제조 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을 제조하는 단계, 및
(ii) 상기 폴리펩타이드를 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
제18항에 있어서,
인슐린의 A 체인의 7번 시스테인 잔기와 인슐린 B 체인의 7번 시스테인 잔기가 각각 보호기로 보호된, 제조 방법.
제19항에 있어서,
상기 보호기가 Acm 또는 Trt이고, 더 바람직하게는 Acm인, 제조 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서,
상기 방법이 상기 폴리펩타이드 화합물의 단계적 산화적 폴딩 (stepwise oxidative folding)을 포함하며,
상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 제조 방법:
(i) 제19항에 따른 폴리펩타이드를 산화시켜, 제1 중간산물을 형성하는 단계;
(ii) 상기 제1 중간산물을 산화하여, 제2 중간산물을 형성하는 단계; 및
(iii) 상기 제2 중간산물을 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계.
제21항에 있어서,
단계 (i)은 제19항에 따른 폴리펩타이드를 DMSO로 처리하는 것을 포함하는, 제조 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서,
상기 단계 (ii)는 상기 제1 중간산물을 아세트산/물 중의 요오드 (iodine in acetic acid/water)로 처리하는 것을 포함하는, 제조 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (iii)는 상기 제2 중간산물을 트립신로 처리하는 것을 포함하는, 제조 방법.
식 (II.1)의 폴리펩타이드 화합물:

상기 식에서, PG₁ 및 PG₂는 각각 독립적으로 시스테인 보호기임.
식 (III.1)의 폴리펩타이드 화합물:
인슐린 또는 그 유도체의 제조에 있어, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물의 용도.
활성 성분으로서 제1항 내지 제17항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합하여 포함하는, 약학적 조성물 (pharmaceutical formulation).
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을 코딩하는 DNA 서열.
제29항의 DNA 화합물을 포함하는 재조합 DNA 벡터.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물의 재조합에 의한 제조 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 단계,
(ii) 상기 DNA 서열을 숙주 세포에서 기능하는 프로모터-오퍼레이터 영역을 포함하는 적절한 벡터에 삽입하는 단계,
(iii) 상기 DNA 서열의 전사 및 번역을 달성하고 상기 DNA 서열이 상기 프로모터-오퍼레이터 영역의 전사 통제 하에 놓이도록, 상기 DNA 서열을 상기 벡터 내에 위치시키는 단계,
(iv) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,
(v) 형질전환된 숙주 세포를 유전자의 전사 및 번역을 유도하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및
(vi) 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드 생산물을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
고상 펩타이드 합성을 이용한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물의 제조 방법.
인슐린 또는 그 유도체의 제조 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 단계,
(ii) 상기 DNA 서열을 숙주 세포에서 기능하는 프로모터-오퍼레이터 영역을 포함하는 적절한 벡터에 삽입하는 단계,
(iii) 상기 DNA 서열의 전사 및 번역을 달성하고 상기 DNA 서열이 상기 프로모터-오퍼레이터 영역의 전사 통제 하에 놓이도록, 상기 DNA 서열을 상기 벡터 내에 위치시키는 단계,
(iv) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,
(v) 형질전환된 숙주 세포를 유전자의 전사 및 번역을 유도하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계,
(vi) 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드 생산물을 회수 및 정제하는 단계, 및
(vii) 상기 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드 생산물을 절단하여, C-펩타이드를 제거하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
제1항 내지 제17항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
의약에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드 화합물.
제1항 내지 제17항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
당뇨병의 치료에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드 화합물.
제35항에 있어서,
2형 진성 당뇨병의 치료에 사용기 위한 것인, 폴리펩타이드 화합물.
당뇨병 치료 또는 고혈당 치료 또는 예방 방법으로서,
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 화합물을 치료학적 유효량으로 상기 치료 또는 예방이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.