JPS6212723A - 魚類の成長ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンおよびそれを用いる魚類の
成長促進法に関する。成長ホルモンはを推動物の脳下垂
体前葉より分泌され、骨の発端速度を調節して体重の増
加を促進する働きをもつポリペプチドである。従って、
本発明は魚類の養殖産業分野において広い用途が期待さ
れる。

従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、ニー・ジェイ・レピイス
（１１，Ｊ、Ｌｅｗｉｓ）　　らによってジャーナル・
オプ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、　　８０　、４４２９　
（１９５８）にエイａｘｘａバートリー（Ａ、　Ｓ、１
ａｒｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）。

１００、７５４（１９６６）に、シー・エイチ・リー（
Ｃ１Ｈ，Ｌｉ）らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストリイ・アンド・バイオロジクス・（サプルメント
）（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
（Ｓｕｐｐｌ、））　、ユ、３２７（１９６２）に報告
されている。

魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離の報告
として次のようなものがある。

ティラビアよりの単離例：エフ・ダブリュ・ファーマー
（Ｓ、稠、Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジェネラル・アンドコン
パラティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ。

εｎｄｏｃｒｉｎ、）、　３０．９Ｈ１９７６）。

チョウザメよりの単離例：エフ・ダブリニ・ファーマー
（Ｓ、　Ｗ、Ｆａｒｍｅｒ）ら、エンドクリノロシイ（
Ｅｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、　　１０８．３７７（１
９８１）コイよりの単離例：エイ・エフ・クック（Ａ、
Ｆ。

（ｏａｋ）　ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ
・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、Ｃａｍｐ、εｎｄａｃ
ｒＩｎ、）。

５０、３３５（１９８３）。

シロサケよりの単離例：本発明者ら、特願昭発明の解決
課題および解決手段 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用である。

魚類の成長ホルモンは上記のごとく魚類の脳下垂体から
採取された例が知られているが、魚類の成長促進に供す
るためには、さらに優れた成長ホルモンの開発が要望さ
れている。

本発明者は、優れた成長ホルモンを得るべく研究を行っ
た結果、ウナギ脳下垂体の器官培養液から優れた成長ホ
ルモンが得られることを見出し本発明を完成した。

発明の構成 本発明は、ウナギ科（Ａｎｇｕｉｌｌａ）の魚類の脳下
垂体の器官培養液より抽出精製して得られる魚類の成長
ホルモンを提供する。

ウナギ科の魚類としてはいかなる種類も用いることがで
きるが、好適な例としてはウナギ（＾ｎｇｕ−ｉ１１ａ
　ｊａｐｏｎｉｃａ）が用いられる。脳下垂体は切り落
としたウナギの頭から無菌的に取り出し、培養液に入れ
て培養する。

培養液としては、アールの電解質を含むイーグルのＭＥ
Ｍ培養液〔エイチ・イーグ／ｌ／（Ｈ，ｔ！ａｇｌｅ）
：　サイエンス（ｓｃｉｅｎｃｅ）、　　１３０．４３
２．　（１９５９））　、培養液Ｎα１９９〔ジェイ・
エフ・モーガン（Ｊ、　Ｆ。

Ｍｏｒｇａｎ）　ら：プロシーディング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・エクスペリメンタル・バイオロジ
ーやアンド舎メディスン（Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、Ｂｘｐ
。

Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、）、７３．１　（１９５０））　ｑ
−ウェイマウスのＭＢ７５２／１培養液〔シー・ウェイ
マウス（Ｃ，Ｉｌａｙｍｏｕｔｈ）：ジャーナル・オブ
・ナショナル・カンサー・インスティテニート（Ｊ、Ｎ
ａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ、　　Ｉｎ５ｔ、、ｊ３゜１００
３　（１９５９）　）などにペニシリンＧ（８０〜１２
０ｕ／ｍｌ好ましくは１００１１／ｍｌ　）　、ストレ
プトマイシン（８０〜１２０　ｕ／ｍｌ好ましくは１０
ｈｇ／ｍｌ　）　、ファンギゾン（０，２０■〜０．３
０尾好ましくは０．２５■／ｍｌ　）などの抗生物質お
よび適量の重炭酸す）　ＩＪウムを加え、ｐＨ７〜８、
好ましくはｐ　Ｈ７，３〜７．４で、浸透圧２５０〜３
００ｍ口ｓｍ、好ましくは２７０〜２９０ｍ口ｓｍに調
製したものを用いる。

培養は、９０〜９９％、好ましくは９５％の０２および
１−１０％、好ましくは５％のＣ０ｆｆ１を気相に充満
し、１５〜２０℃好ましくは１８℃で行う。培養液を１
週間ごとに交換し、約１０週間培養する。

集めた培養液を、限外濾過、ゲル濾過、クロマトフオー
カシングなど通常のポリペプチド精製に用いられる方法
を用いて精製し、成長ホルモンポリペプチドを採取する
。たとえば、培養液をアミコン社製のグイアフロ限外濾
過膜（ＹＭ−５）を用いて濃縮する。濃縮液を０．０１
〜０．０５Ｍ、好ましくは０．０２５　Ｍイミダゾール
塩酸（ｐＨ７〜８、好ましくはｐ　Ｈ７，４＞で平衡化
したセファデックスカラムにかけ、同じ溶媒で溶出する
。分光光度計を用い２８０ｎｍで溶出液を測定し、吸収
のあった両分を集め再び限外−過膜で濃縮する。濃縮し
た分画をクロマトフオーカシングにかける。

０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．０２５　Ｍイミダ
ゾ−ル塩酸（ｐＨ７〜８、好ましくはｐ　Ｈ７，４”）
で平衡化したＰＢＥ９４カラムをポリバッファー７４−
塩酸（ｐＨ４〜６、好ましくはｐ　Ｈ５，０）で溶出す
る。２８０ｎｍに吸収のある画分を集め、ポリバッファ
ーを除くために０．０１〜０．０７Ｍ。

好ましくは０．０５　Ｍ酢酸アンモニウムで平衡化した
セファデックスカラムにかけ、同溶媒で溶出し、２８０
ｎｍに吸収のある両分を集める。これを凍結乾燥して本
発明の成長ホルモンを白色粉末として得る。

本発明におけるウナギの成長ホルモンの純度は、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動で検定
する。

アミノ酸組成は本物質を２０％定沸点塩酸中で１１０℃
で２２時間加水分解し、ＬＫＢ社製４４００型アミノ酸
自動分析計で分析する。

本発明の成長ホルモンのアミノ酸組成の例を第一表に示
す。

第一表　アミノ酸組成（注１） 注１．　数値はモル当たり残基数を示す。

注２．　　Ｃｙｓ、　Ｔｒｐは加水分解中の分解のため
定量できなかった。

また該成長ホルモンのＮ末端アミノ酸配列の分析はアプ
ライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢ　ｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社製４７０Ａ型シーケンサ−およびスペ
クトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ
）社製高速液体クロマトグラフィーとの組合せによって
実施する。また全アミノ酸配列の分析は、該成長ホルモ
ンを臭化シアンやリジルエンドペプチダーゼを用いて分
解したペプチドフラグメントを同装置で分析することに
よって実施する。　　　　　゛分子量、等電点などの分
析は実施例に示した方法で行う。成長ホルモン活性はニ
ジマスを用い実施例に示した方法で測定する。本発明の
成長ホルモンは硬骨魚類（Ｏｓｔｅｉｃｈｔｈｙｅｓ）
たとえばニシン類、ウナギ類、スズキ類、カレイ類、フ
グ類などの成長を促進することができ、これらの魚類の
養殖に有用である。

本発明実施例で得られる成長ホルモンＧＨ−ＩふよびＧ
Ｈ−ＩＩの理化学的性質は以下のとおりである。

ＧＨ−Ｉ （ｉ）アミノ酸組成：第一表Ａに記載のとちり（ｉｉ）
下記のアミノ酸配列を有する Ｈ、Ｎ−Ｖａ　Ｉ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−
３ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−＾ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ二Ｇ
Ｉｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｘ、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘ、−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ
、−１１ｅ−Ｐｒｏイｈｒ−Ｐｒ。

−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｘ４−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−＾ｓｐ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｇ　１ｙ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｔｌ−Ｌｅｕ
−Ｍｅｔ−ＬＹＳ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＡＳｐ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−＾
５ｐ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−＾５ｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｈｉ
ｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
ロＨ ｘ、、　Ｘａ４’！　Ａｓｐまた１ｔｓｅｒテある。Ｘ
、、　Ｘ、ハ未同定アミノ酸を示す。

（ｉｉｉ＞分子量：約２３．０００ （ｉｖ）等電点：６゜３ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。酸性および中性水溶液
に不溶または難溶。

（ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉ）
物質の色形状：白色粉末 （ｖｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バン
ド ＧＨ−ＩＩ （りアミノ酸組成：第一表已に記載のとおり（ｉｉ）Ｎ
末端右よびＣ末端は下記アミノ酸配列を有する Ｎ末端： ）１．Ｎ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｖａｌ−＾
ｓｎ−＾ｒｇ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｎ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−
Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ
　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−＾
ｒｇ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ− Ｃ末端ニ ーＭｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
−Ｇ　１ｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
ｒｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１１
ｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−＾ｒｇ
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＩａ
−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−＾５ｐ−Ｎｅｔ−
Ｈｉｓ−乙ｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−（ｉｉｉ　）分子量：約２
３．０００ （ｉｖ）等電点：６．７ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。酸性および中性水溶液
に不溶または難溶。

（ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉｉ
　）物質の色形状：白色粉末 （ｖｊｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バン
ド 本発明実施例では、成長ホルモンとしてＧＨ−■および
ＧＨ−ｎが例示されているが、これらに限らずウナギ科
魚類の脳下垂体の器官培養液より抽出して得られ、魚類
の成長ホルモン活性を有するものはすべて本発明に含ま
れる。

実施例 （１）　　ウナギの成長ホルモンの精製切り落としたウ
ナギの頭から無菌的に取り出した２６０個の脳下垂体を
２０個ずつ３ｍｌの培養液に入れた。培養液はアールの
電解質を含むイーグルのＭＥＭ培養液〔ディフコ社製、
ティーシー・ミニマルメディウム・イーグル・アール・
ビーニスニス・ドライド（ＴＣＭｉｎｉｍａｌ　Ｍｅｄ
ｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ、　Ｅａｒｌｅ。

ＢＳＳ、　Ｄｒｉｅｄ）を９．０６ｇ／ｊ７の割合で蒸
留水に溶かしたもの〕に、抗生物質（ペニシリンＧ　１
００Ｕ　／ｍｌ、ストレプトマイシン１００■／ｍｌお
よびファンギゾン０．２５■／ｍｌ）と重炭酸ソーダ適
量（粉末）を加えｐＨを７．３〜７．４、浸透圧を２７
０〜２９０ｍ０５ｍに調整したものである。これを９５
％０２，５％ＣＯ２を充満した中で１８℃でインキユベ
ートした。培養液は一週藺毎に交換し集めた培養液は一
２０℃で凍結保存した。この条件で１０週間培養を続け
７５０１１１１の培養液を得た。

これをアミコン社製のグイアフロ限外濾過膜（ＹＭ−５
）を用いて１０．５ｍｌに濃縮した。濃縮液を０．０２
５Ｍイミダゾール塩酸（ｐ　Ｈ７，４）で平衡化したセ
ファデックスＧ７５カラム（２，６４８６９ｃｍ＞（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製）に通塔し、同溶
媒を用い２４．０ｍｌ／時間の流速で溶出した。溶出液
は３ｍｌずつ集め分光光度計を用い２８０ｎｍで検出し
た（第１図）。第１図ピークＡの両分（分画番号６５〜
？　？）　４２ｍｌを集め、上述の限外Ｐ過膜で６ｍｌ
に濃縮した。この濃縮液をさらにクロマトフオーカシン
グで分画した。

ＰＢＥ９４カラム（ＩＸ４２ｃｍ）を用い、０．０２５
Ｍイミダゾール塩酸（ｐ　Ｈ７，４）で平衡化しポリバ
ッファー７４−塩酸（ｐＨ５，０）（ファルマシア社製
）で２３．６ｍｌ／時間の流速で溶出した。溶出液は２
．Ｑｍｌずつ分画し２８０ｎｍで検出した（第２図）。

第２図ピーク１０両分（分画番号５７〜　　　　　　　
　１６５）およびピーク２０両分（分画番号７２〜８１
）をそれぞれ集め、上述の限外−過膜で濃縮し６．Ｏｍ
ｌと５．５ｍｌにした。このｐＨ１液をそれぞれポリバ
フファーを除くため再度ゲルｐ過を行った。０．０５Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ８，０）で平衡化したセファデ
ックスＧ７５カラム（２，６Ｘ３５ｃｍ　）に通塔し同
溶媒で２４．０ｍｌ／時間の流速で溶出した。溶出液は
３．Ｑｍｌずつ分画し２８０ｎｍの吸収のある分画を集
め凍結乾燥した。ピーク１の画分からは１゜３５ｍｇ、
ピーク２の画分からは２．００ｍｇの白色粉末が得られ
た。前者を以下ＧＨ−ＩＩと呼ぶ。また後者を以下ＧＨ
−Ｉと呼ぶ。

（２）分子量の測定 ＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（１０％アクリルアミド１０．１％５Ｄ
Ｓ）で上記成長ホルモンを展開した。

標準物質としてビイ−・ディー・エイチ・ケミカルズ（
Ｂ、Ｄ、ＨｌＣｈｅｍｉｃａｌｓ）社製の標準蛋白マー
カー（分子量１４．３に、２８．６に、４２．９ｋ）を
使用して得られる検量線によると、ＧＨ−Ｉ、ＧＨ−ｎ
のいずれも分子量は約２３．０００と算出された（第３
図）。また同時にＧＨ−ＩＳＧＨ−ｎのいずれも単一バ
ンドを与え、純度がほぼ１００％であることを示した。

（３）等電点 アンホライン（ｐ　Ｈ３，５〜９．５）を用いた等電点
電気泳動を行い、０Ｈ−ＩＳＧＨ−ｎのいずれもが単一
バンドを与えることを認めた。ゲルを切断し蒸留水で一
晩抽出しｐＨを測定して得られた検量線より等電点はＧ
Ｈ−Ｉが６．３、ＧＨ−ＩＩが６．７と計算されたく第
４図）。

（４）アミノ酸配列の分析 ウナギより得られた上記成長ホルモンＧＨ−１を３０■
、（１，Ｈ−ｎを２５■用い、０．１％ラウリル硫酸ナ
トリウム水溶液に溶かして４７０Ａシーケンサ−〔アプ
ライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ　）社製〕と高速液体クロマトグラフィー〔ス
ペクトラフィジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ
　）社製５Ｐ８１００）で分析した。下記のようにＧＨ
−１はＮ末端より４１残基、０Ｈ−ＩＩは４０残基決定
することができた。

ＧＨ−１： ）１２Ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−３ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３
ｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−＾ｒｇ−＾１ａ−Ｇｌ
ｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−１ｉｓ−Ａｒｇ− ＧＨ−ｎ Ｈ，Ｎ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ＝Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−ｅｕ− 次にＧＨ−１１ｍｇを１ｍＭの０．１　Ｍ　）リス塩酸
、６Ｍ塩酸グアニジン、２ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む緩衝
液（ｐＨ８，３）に溶かし窒素ガスを１５分間吹き込ん
だ。この溶液に２０ｍのメルカプトエタノールを加え、
暗所室温で４時間還元した。次に３ｍｇのモノヨード酢
酸を９．５ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に溶かして加
えた。暗色で１５分間反応させた後、酢酸を加えてｐＨ
３とし反応を止めた。この反応液を高速液体クロマトグ
ラフィーにおいて０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平
衡化したＴＳＫゲルＴＭＳ２５０カラム（０，４ｘ５ｃ
ｍ、　１０μ）（東洋曹達社製）に通し反応試薬および
塩を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で溶出した。その
後０．１％トリフルオロ酢酸を含むインプロパツール：
水＝９０：１０の溶媒で溶出し凍結乾燥して０、９５　
ｍｇの白色粉末を得た。これを１００倍モルの臭化シア
ンを含む７０％蟻酸溶液１ｍｌに溶かし、暗色で１８時
間分解し、凍結乾燥した。この臭化シアン分解物を０．
１％トリフルオロ酢酸水溶液Ｑ、１ｍｌに首かし、高速
液体クロマトグラフィーにおいてＴＳＫゲル０ＤＳ１２
ＯＴカラム（０，４ｘ２５ｃｍ、５μ）を用い、０．１
％トリフルオロ酢酸共存下インプロパツール５％〜６０
％のグラジェント溶出を行った（第５図）。検出は２２
０ｎｌｌｌ。

流速は０．４５ｍ１／分である。第５図のピークＡ〜Ｄ
について上述の４７０Ａシーケンサ−と高速液体クロマ
トグラフィーで分析を行い下記の配列を決定した。

成分Ａ： Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＤＨ 成分Ｂ： Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−＾ｓｐ− 成分Ｃ： Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−１１ｅ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａ
ｌ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
−＾５ｎ−Ｐｈｅ−＾ｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ− 成分Ｄ： Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１
１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅ、ｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− これらの配列は羊の成長ホルモンの配列〔シー・エイチ
・シー（Ｃ０Ｈ０Ｌｉ）ら、インターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロナイン・リサー
チ（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ
ｅｓ、）。

４、１５１　（１９７２）による〕との相同性と臭化シ
アンがＭｅｔの後を選択的に切断することから−Ｍｅｔ
−Ｄ−Ｍｅｔ−Ｃ−Ｍｅｔ−Ｂ−Ｍｅｔ−Ａのように並
べることができ　　　　　　　　　　ｉし °′（”””°°４１°“′”″″６°ゞ°　　　　　
　　１１−りＥはＧＨ−Ｉ（７）Ｎ末端から０配列を持
・　　　　　　　　　　１ていた。そこでこれを０．０
１　Ｍ　）　！Ｊス塩酸、４Ｍ尿素を含む緩衝液（１）
Ｈ９，１）５０Ａ１！に溶かし、　　　　　　　　　　
［リジルエンドペプチダーゼ０．１６Ａｇを加え３７℃
　　　　　　　　　　Ｉで１６時間反応させた。この反
応液を高速液体クロマトグラフィーにおいてＢｉｏ　Ｒ
ａｄハイボアｃ　、　、　　　　　　　　　　　１Ｊ（
０，４Ｘ　２５ｃｍ）のカラムを用い０．１％トリフル
　　　　　　　　　　ｉオロ酢酸存在下アセトニトリル
０〜７０％のグラ　　　　　　　　　　］・ジ・ント溶
出を行、た（第６図）。検出は２１０　　　　　　　　
　　’′ｎｍ、流速は１ｍ１７分である。第６図のピー
クａ−１ｄを上述の装置で分析し下記の配列を検出した
。

成分ａ：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ｊ。

Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ成分
ｂ： Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ成分Ｃ： Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａ　Ｉａ−Ｐｈｅ−
３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ成分ｄ： ｄからは２つの配列が検出された。

ｄｉ　　　Ｔｈｒ−Ｘ、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｘ、−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ、−１１ｅ−
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓｄ２
　　５ｅｔ−Ｘ、−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−１１ｅ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１
１ｅ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ Ｘ、、　Ｘ、はＡｓｐまたはＳｅｔである。Ｘ、、　Ｘ
、は未同定アミノ酸を示す。

羊成長ホルモンの配列との相同性とリジルエンドペプチ
ダーゼがＬｙｓの後を選択的に切断することから、ｂ　
−ｄｉ　−ａ　−ｄ２−　ｃの順に並べることができた
。またｂのＮ末端からの配列は既に決定したＧＨ−Ｉｏ
）Ｎ末端からの配列のうち３０番目のＧｌｕからの配列
と一致していた。従って一部未確定な残基を除きＮ末端
より１００残基の配列を決定できた。そして前の臭化シ
アン分解ペプチドの結果とあわせ、一部未確定な残基を
除き、１９０残基の全配列を決定できた。

ＧＨ−ｎについても、ＧＨ−Ｉと全く同じ条件て臭化シ
アン分解を行ったところＧＨ−ＩのＣ末端側の４つのペ
プチドに対応するペプチドフラグメントが得られた。ま
たその配列も全く一致しておりＣ末端側９０残基の配列
はＧＨ−１と全く同じであることがわかった。

実施例２゜ 魚類成長ホルモン活性の測定 ニジマスの稚魚（平均体重１３ｇ）を一群１５尾ずつに
分け、水温１５℃の循環式タンクで飼育した。餌は配合
飼料（まず４Ｃ，日本配合飼料社製）をはじめの９日間
は１日に体重の４％、その後は３％を２回に分けて与え
た。ウナギ成長ホルモンＧＨ＝ＩＳＯＨ−Ｉ［は少量の
０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で溶解後、０．９％
塩化ナトリウム水溶液を加えて１■１５ρとなるように
した。

これを体重１ｇあたりｌｌ１ｇ１ｌ腔内に注射した。対
照群には０．９％塩化ナトリウム水溶液のみを投与した
。注射は５日ごとに５回行い同時に体重を測定した。体
重増加率を第７図に示す。この結果は本発明の２種類の
成長ホルモンがいずれもニジマスの成長を促進すること
を明らかに示している。

発明の効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプチドが供
給される。このポリペプチドは魚類の成長を促進させる
ので魚類の養殖に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はウナギ脳下垂体器官培養液の限外濾過濃縮液の
セファデックスＧ−７５でのゲル濾過の溶出パターンを
示す。 第２図はゲル濾過分画Ａのクロマトフオーカシングによ
る分画を示す。 第３図は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳
動距離からウナギの成長ホルモンの分子量を算出した図
を示す。標準タンパクマーカーはビーディーエイチ・ケ
ミカルズ（Ｂ口ＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ）社製ｐｒｏｄｕ
ｃｔ　　Ｎα４４２２３　２０を用いた。分子量１４．
３に、２８゜６におよび４２．９　ｋはそれぞれモノマ
ー、ダイマー、およびトリマーに相当する。 第４図は等電点電気泳動によるウナギ成長ホルモンの算
出を示す。 第５図はウナギ成長ホルモンＧＨ−１の還元カルボキシ
メチル化物の臭化シアン分解物の高速液体クロマトグラ
フィーによる分離を示す。 第６図は第５図の臭化シアンフラグメントＥのリジルエ
ンドペプチダーゼによる分解物の高速液体クロマトグラ
フィーによる分離を示す。 第７図はウナギ成長ホルモンＧＨ−ＩまたはＧＨ−ＩＩ
をニジマスに投与したときの体重増加の促進を示す図で
ある。 １５　図 Ｃ 時間（分） ０　　　　　　１０　　　　　２０　　　　　３０　　
　　　　　　　　　　ｉ日数

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウナギ科の魚類の脳下垂体の器官培養液より抽出
   精製して得られる魚類の成長ホルモン。
2. （２）下記の理化学的性質を有するポリペプチドである
   魚類の成長ホルモン （ｉ）アミノ酸組成：第一表Ａに記載のとおり（ｉｉ）
   下記のアミノ酸配列を有する 【アミノ酸配列があります】 Ｘ＿１、Ｘ＿４はＡｓｐまたはＳｅｒである。Ｘ＿２、
   Ｘ＿３は未同定アミノ酸を示す。 （ｉｉｉ）分子量：約２３，０００ （ｉｖ）等電点：６．３ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。中性および酸性水溶液
   に不溶または難溶 （ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉｉ
   ）物質の色形状：白色粉末 （ｖｉｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バ
   ンド
3. （３）下記の理化学的性質を有するポリペプチドである
   魚類の成長ホルモン （ｉ）アミノ酸組成：第一表Ｂに記載のとおり（ｉｉ）
   Ｎ末端およびＣ末端は下記アミノ酸配列を有する Ｎ末端： 【アミノ酸配列があります】 Ｃ末端： 【アミノ酸配列があります】 （ｉｉｉ）分子量　約２３，０００ （ｉｖ）等電点　６．７ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。酸性および中性水溶液
   に不溶または難溶 （ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉｉ
   ）物質の色形状：白色粉末 （ｖｉｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バ
   ンド
4. （４）ウナギ科魚類の脳下垂体の器官培養液より抽出精
   製して得られる魚類の成長ホルモンを魚類に投与して、
   該魚類の成長を促進させることを特徴とする魚類の成長
   促進方法。
5. （５）魚類の成長ホルモンが下記の理化学的性質を有す
   るポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 （ｉ）アミノ酸組成：第一表Ａ記載のとおり（ｉｉ）下
   記のアミノ酸配列を有する 【アミノ酸配列があります】 Ｘ＿１、Ｘ＿４はＡｓｐまたはＳｅｒである。Ｘ＿２、
   Ｘ＿３は未同定のアミノ酸を示す。 （ｉｉｉ）分子量：約２３，０００ （ｉｖ）等電点：６．３ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。酸性および中性水溶液
   に不溶または難溶。 （ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉｉ
   ）物質の色形状：白色粉末 （ｖｉｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バ
   ンド
6. （６）魚類の成長ホルモンが下記の理化学的性質を有す
   るポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 （ｉ）アミノ酸組成：第一表Ｂに記載のとおり（ｉｉ）
   Ｎ末端およびＣ末端は下記アミノ酸配列を有する Ｎ末端： 【アミノ酸配列があります】 Ｃ末端： 【アミノ酸配列があります】 （ｉｉｉ）分子量：約２３，０００ （ｉｖ）等電点：６．７ （ｖ）アルカリ性水溶液に可溶。酸性および中性水溶液
   に不溶または難溶。 （ｖｉ）塩基性酸性の区別：酸性ポリペプチド（ｖｉｉ
   ）物質の色形状：白色粉末 （ｖｉｉｉ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：単一バ
   ンド
7. （７）成長ホルモンを投与する魚類が硬骨魚類に属する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第４、５または６項記
   載の方法。
8. （８）魚類がニシン類、ウナギ類、スズキ類、カレイ類
   、またはフグ類に属することを特徴とする特許請求の範
   囲第７項記載の方法。