JP2529693B2 - 鎖の結合法 - Google Patents

鎖の結合法

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JP2529693B2 JP62156391A JP15639187A JP2529693B2 JP 2529693 B2 JP2529693 B2 JP 2529693B2 JP 62156391 A JP62156391 A JP 62156391A JP 15639187 A JP15639187 A JP 15639187A JP 2529693 B2 JP2529693 B2 JP 2529693B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトリラキシンのＡおよびＢ鎖、またはヒ
トリラキシンのＡおよびＢ鎖類似体を結合させて、生物
学的に活性なヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類似
体を有用な収率で製造するための方法、さらに詳しく
は、pHが約7.0以上であり、かつヒトリラキシンのＢ鎖
を穏やかに変性させる条件下で、還元型のヒトリラキシ
ンＡおよびＢ鎖、またはそれらの類似体を結合させるこ
とからなる方法に関する。反応期間中、混合物を空気中
の酸素に徐々にさらしながら温度を約15〜30℃に維持す
ることにより、これらの条件は、生物学的に活性なヒト
リラキシンまたはその類似体を生成させるための環境を
提供するものである。また、本発明は生物学的に活性な
ヒトリラキシン類似体に関する。さらに、本発明はヒト
リラキシンまたはその類似体を唯一の活性薬物とする分
娩用医薬組成物に関する。
先行技術 ヒトリラキシンは、分娩前の産路変形に関与する卵巣
ペプチドであり、従って出産の過程を容易にする［ハイ
ソウ（Hisaw,F.L.,Pros.Soc.Exp.Biol.Med.,23,661−66
3（1926））、シュワーベ等（Schwabe,C.et al.,Bioche
m.Biophys.Res.Somm.,75,503−570（2977））、および
ジェイムス等（James,R.et al.,Nature,267,544−546
（1977））］。リラキシンは妊娠中のホルモンとして多
く見られるが、妊娠していない女性ならびに弾性におい
ても検出される［ブリアント−グリーンウッド（Bryant
−Greenwood,G.D.,Endocrine Reviews,3,62−90（198
2））およびバイス（Weiss,G.,Ann.Rev.Physiol.,46,43
−52（1984））］。
ブタ、ラット、トラ、サメ、ツノザメおよびヒト由来
のリラキシンのアミノ酸配列が確かめられている。この
ホルモンは、ジスルフィド結合で結合した２本のペプチ
ド鎖（ＡおよびＢと称せられる）からなり、Ａ鎖に鎖内
ジスルフィド環（インスリンのものと類似している）を
有している。しかし、リラキシンとその他のほとんどの
ペプチドホルモン（インスリンを含む）との間の、驚く
べき、そして重要な差異は、種間でその構造がかなり異
なっているということである。たとえば、ブタ、ラット
およびヒトリラキシンは、アミノ酸位置が50％以上異な
っている。異なる種のリラキシン間で免疫学的な交差反
応性が乏しいこと、およびそれらの特異的な生物学的活
性において多数の相違が観察されることは、このような
差異によって説明される。
相換えDNA法の適用により、ヒトリラキシンをコード
している遺伝子が単離され、その特徴が調べられるよう
になった［ハドソン等（Hudson,P.et al.,Nature,301,6
28−631（1984））およびハドリン等（Hudson,P.et a
l.,The EMBO Journal,3,2333−2339（1984））］。cDNA
およびゲノムクローンからのヌクレオチド配列の分析に
より、ヒトリラキシン構造の構成が、25残基のシグナル
ペプチド、次いで約32〜33アミノ酸のＢ鎖、約105アミ
ノ酸のＣペプチド、および24アミノ酸のＡ鎖からなるこ
とがわかる。ヒトリラキシンの場合、イントロンがＣペ
プチドのコード化領域を遮断している。このＣペプチド
（インスリンのＣペプチドよりかなり長い）の生理学的
な役割、ならびにＡおよびＢ鎖の末端からのＣペプチド
の除去に応答しうる酵素の性質については未解決の問題
である。
ヒトリラキシンの場合、２種類の別個の遺伝子配列が
同定されている（同上）。これら遺伝子のうちの１つ
（H2）だけが妊娠中に卵巣で発現され、他の遺伝子が別
の組織部位で発現されるのかどうか、あるいはそれが偽
遺伝子を表すのかどうかについてはわかっていない。こ
の２種類のヒトリラキシンの遺伝子は互いに、かなりの
ヌクレオチドおよびアミノ酸相同性を、特にＢおよびＣ
ペプチドにおいて示す。しかし、配列が相違するやや顕
著な領域が、特にＡおよびＢ両鎖のアミノ末端領域にお
いて存在している（第１図参照）。H2リラキシンが卵巣
で合成され、発現されるという事実は、これが妊娠生理
に包含される配列であることを示唆する。最近の報告で
は、ジョンストン等［Johnston,P.D.et al.、ペプチ
ド：構造と機能、Proc.Ninth American Peptide Sympos
ium、Deber,C.M.、Hruby,V.I.およびKopple,F.D.編（Pi
erce Chem.社、1985）］が、合成ヒトリラキシン（H2）
およびある種のヒトリラキシン類似体について生物学的
な活性を試験し、生物学的な活性に必要なリラキシンの
核、ならびに生物学的な活性に影響することのない、メ
チオニンのある種のアミノ酸への置換を明らかにした。
第１図は、種々の種由来のリラキシンの既知のアミノ
酸配列を比較したものである。６個のシステイン残基お
よびこれに接するグリシン残基に加えて、Ｂ鎖中７位の
イソロイシン、12および16位のアルギニン、および32位
のロイシンだけが保存されている。システイン残基は、
明らかに、全体のジスルフィド結合の立体配置を維持す
るのに必須である［ブルンデル等（Blundell,T.et a
l.）;Biology of Relaxin and its Role in the Huma
n、Bigazzi,M.、Greenwood,F.C.およびGaspari,F.編、1
4−21頁（Excerpta Medica,Amsterdam,1983）］。リラ
キシン分子（すなわち、リラキシンタンパク質の活性部
分を含有しているＡおよびＢ鎖）中の大部分の位置にお
ける、アミノ酸配列の種間の相違はかなりのものであ
る。このことは、インスリンを含む実際上その他のすべ
てのペプチドホルモン類の状況と際だって対照的であ
る。このリラキシン構造の別の特徴は、Ｂ鎖のアミノお
よびカルボキシ末端領域、ならびにその程度は少ないが
Ａ鎖のアミノ末端で見られる長さの違いである。
リラキシンの科学的な合成は、主として単離したＢ鎖
の構造的特徴および異常な溶解性の結果から、特に困難
であった［トレジャー等（Tregear,G.W.et al.）;Biolo
gy of Relaxin and its Role in the Human、Bigazzin,
M.、Greenwood,F.CおよびGaspari.F.編、42−55頁（Exc
erpta Medica,Amsterdam,1983）］。
上記のように、ヒトリラキシンおよび事実上哺乳動物
リラキシンは、一般的に言ってインスリンとある構造上
の類似性を有している。インスリンおよびリラキシンの
両者は、２本の鎖の間に鎖内および鎖間ジスルフィド結
合を有している［ジェイムス等（James,R.et al.,Natur
e,267,544（1977）、ならびにシュワーベおよびマクド
ナルド（Schwabe,C.and McDonald,J.R.,Science,197,91
4（1977））］。インスリンに対して用いてうまくいた
合成法［ブッセおよびカーペンター（Busse,W.D.and Ca
rpenter,F.H.,Biochemistry15,1649,（1976））、カツ
ォヤニス等（Katsoyannis,P.G.et al.,Biochemistry,6,
2656（1967）、ならびにクン等（Kung,Y.T.et al.,Scie
ntia Sinica,15,544（1966））］が、リラキシンに対し
ても適用できるものと推定された。トレジャー等［Treg
ear,G.et al.:Relaxin、Bryant−Greenwood,G.D.、Nial
l,H.D.およびGreenwood,F.C.編、Elsevier,New York,19
81］は、システイン・スルヒドリル類の選択保護を利用
する個別鎖（セパレート チェイン）アプローチを用い
てリラキシンを合成しようとした。このインスリン法に
よって調製された合成ペプチドは検出可能なリラキシン
様の生物学的反応性を有するが、その特異的な活性およ
び結合の収率は極めて低かった（同上）。ブタリラキシ
ンにおいて結合収率が低いことの理由の１つは、完全な
長さのブタ鎖がpH10.5の溶液において溶解しないという
ことによっていた。トレジャー等（上記）は、先行技術
であるシンスリン結合法を、２つの点で、すなわち混合
したブタリラキシンペプチド鎖をアセトンで沈澱させて
還元剤を除去すること、および酸化工程中に0.5M NaCl
を加えることで変更を加えた。この結果、ブタリラキシ
ンの収率が改善された（欧州特許出願No.83.304662.6お
よび欧州特許出願No.83307553.4をも参照）。
チャンス等［Chance et al.:米国特許No.4,421,685
（1983年12月20日発行）］は、還元および酸化反応を１
工程で行うべく、インスリンのＡおよびＢ鎖のＳ−スル
ホネート化形を、水性溶性中、コントロールされたpHお
よび温度下で、チオール還元剤と混合することによって
インスリンまたその類似体を製造する方法を開示してい
る。この方法は、前記のインスリン合成法に優る改良法
として提供されたものであるが、ヒトリラキシンの合成
には適用できないことがわかった。
発明の概要 ここに本出願人等は、特定の反応条件下、ヒトリラキ
シンの還元鎖をコントロールされた条件下で結合させる
ことによって、有用なレベルのヒトリラキシンまたはそ
の類似体を製造することができることを見い出した。す
なわち、本発明の目的は、ヒトリラキシンのＡおよびＢ
鎖（その出所、たとえば化学合成によるものであるが、
または組換えDNA法によるものであるかを問わない）を
結合させて有用な収率の生物学的に活性なヒトリラキシ
ンを製造するための方法を提供することである。
本発明の別の態様は、生物学的に活性なヒトリラキシ
ン類似体を製造することである。
本発明のさらに別の態様は、分娩用にヒトリラキシン
またはその類似体を用いることである。
本発明は、ヒトリラキシンのＡ鎖またはその類似体と
ヒトリラキシンのＢ鎖またはその類似体を結合させて生
物学的に活性なヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類
似体を製造するための方法に関する。特に本方法は、還
元型のヒトリラキシンＡ鎖またはその類似体と還元型の
ヒトリラキシンＢ鎖またはその類似体を、pHが約7.0以
上であることを含む、ヒトリラキシンのＢ鎖を穏やかに
変性させる条件下で混合し、反応期間中、空気中の酸素
に少しずつさらしながら反応を行うことからなる。
図面の説明 第１図は、ヒトリラキシンH1およびH2と、ヒトインス
リンならびにブタ（Ｐ）およびラット（Ｒ）リラキシン
の相同性の欠如を示すものである。数字はH2リラキシン
に基づいて付されている。リラキシン類のジスルフィド
は、A10−A15、A11−B11およびA24−B23である。
第２（ａ）図および第２（ｂ）図は、インビトロでの
鎖結合反応のそれぞれH2（B33 A24）BLyS4 BAla25および
H2（B33 A24）のプロファイルについてのHPLC経時変化
を示している。潜在的に重要なＡ鎖の分子内酸化された
中間体、およびヒトリラキシン類似体またはヒトリラキ
シンの生成を示す結合反応の経時変化が描かれている。
遺伝子２のＡおよびＢ鎖ペプチドの、H2ヒトリラキシン
類似体またはH2ヒトリラキシンへの変換が描かれてい
る。シンクロパック（Synchropak）RP−C4クロマトグラ
フィーを用いた（4.6×250mm;300A°）。0.05％TFA、H2
0緩衝液中、アセトニトリルの直線勾配（500分で15→60
％）として、これを1ml/分で流した。
第３図は、鎖結合したヒト遺伝子２のリラキシンH2
（B2−33 A24）BLyS4 BAla25および天然のヒトリラキシ
ンの生物学的活性（MPS）を示している。
第４図は、種々用量のヒトリラキシン類似体、すなわ
ちH2（B2−33 A24）BLyS4 BAla25およびH2（B33 A24）BL
yS4 BAla25を投与した後の、霊長類における改良型ビシ
ョップ・スコアー（Bishop score）を示している。
詳細な説明 本明細書で用いる「ヒトリラキシン」または「ヒトリ
ラキシン類似体」なる語句は、産路を変形させて出産の
過程を容易にすることが知られている機能的なタンパク
質を指す。産路の変形には、頚部の熟成、妊娠子宮の内
膜を厚くすることおよびこの領域への血管新生の増加、
ならびにコラーゲン合成に及ぼす影響、などの生理学的
な作用も含まれているものと解する。ヒトリラキシンは
女性の胸部にも見い出されるが、これは乳汁分泌と関係
しているのであろう。また、ヒトリラキシンはヒト精液
にも見い出されるが、これはヒト精子の移動度を高める
のであろう。頚部にリラキシンの効果が付与されると、
ヒトリラキシンはヒト頚部に入り込む精子の能力を増大
させるのであろう。ヒトリラキシンの結合組織に作用す
ると、皮膚の弾性を改善することもある。
上記の機能的な定義に加えて、ヒトリラキシン類似体
には、構造的に、ＡおよびＢ鎖を含むヒトリラキシンの
基本的な構造を有している多数のタンパク質が含まれ
る。このヒトリラキシン類似体は、生物学的なリラキシ
ン様の活性が保持されるように注意しながら、ヒトリラ
キシンのＡおよび／またはＢ鎖中の１またはそれ以上の
アミノ酸残基を置換、削除、付加あるいは修飾すること
によって、天然のヒトリラキシンと異なったものとなっ
ている。このようなヒトリラキシン類似体の例には、完
全な長さのＡ鎖およびカルボキシ末端を短くしたＢ鎖を
有する、H1（B2−27 A24）BAla25、H2（B2−25 A24）、
H2（B33 A24）、H2（B33 A24）BLys4 BAla25、H2（B2−3
3 A24）BLys4 BAla25、H2（B2−33 A24）Aピロ−Glu1 BLy
s4 BAla25およびH2（B33 A24）Aピロ−Glu1 BLys4 BAla25
が含まれるが、これらに限定はされない。ここで用いる
用語は以下のようである。H1、H2はヒトリラキシンをコ
ードしている２種類のヒト遺伝子を指す。H2はヒト卵巣
で発現されることがわかっているが、H1はゲノムクロー
ンとしてだけ見い出される。ＡおよびＢはヒトリラキシ
ンのそれぞれの鎖を表す。ＡまたはＢに続く数字は鎖の
長さ、すなわちＡ−またはＢ−鎖を構成しているアミノ
酸の数を表す。アミノ酸は通常の３文字表示で表す。ア
ミノ酸の前の下文字はアミノ酸が位置しているＡ−また
はＢ−鎖を表し、アミノ酸の後の肩文字は鎖上の位置を
表す。
リラキシンのＡ−およびＢ−鎖またはその類似鎖は、
液相あるいは固相法を含む古典的なタンパク質合成法に
よって、または組換えDNA法を用いて、または天然のヒ
トリラキシンからの調製によって、または上記の組合わ
せによって、たとえば鎖の１本を化学合成で、他方を組
換えDNA法で調製することによって得ることができる。
個々のペプチド鎖を固相法によって合成した［バラニー
およびメリーフィールド（Barany,G.and Werrifield,R.
B.）、The Peptides、2、Gross,E.およびMeienhofer,J.
編、Academic Press、ニューヨーク、１−284（198
0）］。保護されたＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニルア
ミノ酸は、ペニンスラ・ラボラトリーズ社（Peninsula
Laboratories Inc.）から購入した。以下に挙げる側鎖
保護、すなわちArgトシル、Asnキサンチル、Aspベンジ
ルエステル、Cysメトキシベンジル、Glnキサンチル、Gl
uベンジルエステル、Hisトシル、Lys o−クロロベンジ
ルオキシカルボニル、Serベンジル、Thrベンジル、Tyr
2,6−ジクロロベンジルを用いた。最初のアミノ酸を、
ジメチルホルムアミド中、フッ化カリウムを用いてクロ
ロメチルポリスチレン（１％ジビニルベンゼン）上にエ
ステル化した。置換レベルは0.6m当量/gとした。アミノ
酸を、塩化メチレン中、蒸留ジシクロヘキシルカルボジ
イミドでカップリングさせた。アルギニン、アスパラギ
ン、グルタミン、ロイシン、およびシステイン残基を、
50/50塩化メチレン／ジメチルホルムアミド中でカップ
リングさせた。ｔ−ブチルオキシカルボニル基の除去
は、45％トリフルオロ酢酸、５％アニソール、５％エタ
ンジチオールおよび45％塩化メチレンを用いて行った。
カップリングさせる前の中和は、塩化メチレン中、10％
トリエチルアミンを用いて行った。樹脂からの切り出
し、およびすべての保護基の除去は、無水の液体フッ化
水素を用い、アニソールおよびメチルエチルスルフィド
の存在下（20:3:1 v/v/v）、０℃で１時間処理すること
によって行った。10％酢酸水溶液を用いて粗製のＡ−鎖
を樹脂から取り出し、これを凍結乾燥した。粗製のＢ−
鎖は、始めに80％アセトニトリル水溶液で、次に30％酢
酸水溶液で洗浄することによって樹脂から取り出し、次
いで水で希釈し、凍結乾燥した。これらの粗製ペプチド
を100mモルのジチオトレイトールに溶解し、次いで多量
の10％アセトニトリルおよび0.1％トリフルオロ酢酸の
水溶液中に希釈した。これらの溶液を、ビダックC18（V
ydac C18:300A°15−20ミクロン）を詰めた５×55cmの
カラムにかけ、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液で洗浄し
た後、アセトニトリルの勾配溶液で溶離した。ペプチド
のフラクションを集め、凍結乾燥し、アミノ酸組成配列
決定および分析用逆相HPLCによって分析した。インスリ
ンまたはブタリラキシン用の先行技術で用いられていた
ような、スルホン化またはその他の誘導体化［ミーンズ
およびフィーニー（Means,G.E.and Feeney,R.E.,Chemic
al Modification of Proteins（1971））］によっては
システイン残基を保護しなかった。本発明方法に従っ
て、ヒトリラキシンのＡ−およびＢ−鎖をその還元型に
保つことによって、改善された収率およびペプチドの溶
解性が得られる。この還元型の、凍結乾燥されたＡ−お
よびＢ−鎖を、スルホン化誘導体に変換することまたは
他のシスチンチオールのブロック剤を用いることなく、
直接すべての再結合反応に用いた。
本発明方法を実施するに際し、ヒトリラキシンのＡ−
およびＢ−鎖、または類似のＡ−およびＢ−鎖を結合さ
せてヒトリラキシンまたはヒトリラキシン類似体を形成
させるには、一方の鎖と他方の鎖の比率を広範囲に変化
させてこれを行うことができる。もちろんこの結合は、
ＡであろうがＢであろうが、量の少ない方の鎖によって
本質的に制限される。過剰のＢ−鎖は鎖の結合を抑制
し、Ｂ−鎖と等しいか、またはわずかに過剰のＡ−鎖量
（モル）であることが好ましい。必須ではないが、いず
れの場合においても、通常Ａ−鎖のＢ−鎖に対する比は
約1:0.5〜約3.0:1（重量比）である。Ａ−鎖のＢ−鎖に
対する比率、約1:1〜約2.5:1（重量比）を用いて本発明
を実施するのがさらに好ましい。また、この好ましい範
囲内の、ある範囲が特定のリラキシン類似体の製造に特
に有利であることを見いだした。すなわち、ヒトリラキ
シンのＡ−およびＢ−鎖を結合させて脱メチオニンリラ
キシンを製造する際には、Ａ−鎖のＢ−鎖に対する比は
約1.2:1〜約2:1の範囲内であることが好ましい。
最適レベルで本発明方法を実施するのに重要な別のパ
ラメーターは反応溶媒中のタンパク質濃度である。広範
囲のタンパク質濃度を用いて本方法をうまく行うことが
できる。しかし一般的には、タンパク質濃度は反応溶媒
1mlあたり約0.1〜約10mgの範囲であろう。好ましくは、
タンパク質濃度は約0.5〜約5mg/mlの範囲内であろう。
また、この後者の範囲内において、最適タンパク質濃度
が製造されるヒトリラキシンに依存して変わることをこ
こでも見い出した。
本発明の方法は水性溶媒中で行なわれる。溶媒のpH
（室温で測定）は、通常約7.0〜約12の範囲である。約
7.5〜約11.0であることが好ましく、約8.0〜約10.6の範
囲内に保つのが最適である。適当な緩衝剤を加えること
によって溶媒のpHを所望の範囲内に保つことができる。
代表的な緩衝剤は、たとえばクリシネート、カーボネー
ト、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ピロホ
スフェートおよびpHを上記の範囲内にコントロールしう
るその他同様の試薬である。一般的かつ好ましい緩衝剤
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（pH8〜
９）およびグリシネート（pH9.5〜11.0）である。
混合反応は、約15〜約30℃の温度で、好ましくは約20
〜約25℃で、最も好ましくは室温で行なわれる。
緩衝剤の濃度は、一般的には約0.025M〜約0.2Mの範囲
である。好ましくは約0.05M〜約0.15Mであり、最も好ま
しくは約0.1Mである。
本方法の条件の１つは、空気中の酸素に暴露すること
をコントロールしうる環境下で行うことである。始めに
すべての溶液をN2置換し、密閉した容器中で反応液を直
接空気（この容器を開くことによって）に、または酸素
（溶媒中にバブリングすることによって）に暴露するこ
とによってコントロールされた酸化が達成されることを
見い出した。
本方法の別の条件は、ヒトリラキシンＢ−鎖が穏やか
に変性される条件下で反応を行うことである。当分野で
知られている変性剤、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、
およびその他のカオトロピック試薬類、塩類、洗浄剤
類、および有機溶媒（アセトニトリル、アルコール類、
ジメチルホルムアミド等を）を用いることができる。尿
素およびアセトニトリルが好ましく、数％（体積比;10
％以下）の有機溶媒は、ヒトリラキシンＢ−鎖を穏やか
に変性する条件にする。
ヒトリラキシンのＡ−およびＢ−鎖を、遊離システイ
ン還元型で、適当な水性溶媒中でいっしょにする。始め
にＡ−鎖を、次いでＢ−鎖（pH2の新鮮な5mg/ml水中貯
蔵品から）を加えることによって反応を開始した。NaOH
でpHを調節して適当な値にする。再結合リラキシンの生
成を最大にするため、各反応をRP−４逆相分析用HPLC
［Snyder,L.R.およびKirkland,J.J.、Introduction to
Modern Liquid Chromatography（1979）］でモニター
し、氷酢酸を加えてpH4とすることによって停止させ
る。次いでこの混合物を16,318gで30分間遠心し、上清
をプレパラティブ逆相HPLC（同上）で精製する。有用な
収率のヒトリラキシンを製造するためには室温で結合反
応を行うことが重要であることがわかった。高速液体ク
ロマトグラフィーによる分析は、シンクロパックRP−４
（Synchropak;4.6×250mm、300A°）逆相カラムを用い
て行った。プレパラティブHPLCによる精製は、シンクロ
パックRP−４（１×50cm、300A°）またはハンドパック
のビダックRP−４あるいはRP−18（５×50cm、300A°）
逆相カラムのいずれかを用いて行った。分析HPLCはウォ
ーターズシステム（Water's System）を用いて、プレパ
ラティブHPLCはウォーターズシステムあるいはプレップ
500（Prep500）を用いて行った。
反応が終了したら、ヒトリラキシンまたはリラキシン
類似体産物を、タンパク質単離の分野で認められている
多種多様の方法のうちのいずれかによって単離すること
ができる。最も普通に用いられるリラキシンの精製法は
クロマトグラフィー法である。この方法を、本発明方法
によって得られるヒトリラキシンの回収に、容易に適用
することができる。この方法には、ゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィーあるいは逆相HPLCが含まれうる。
精製法の例を挙げると以下のようである。すなわち、
合計0.5〜1gのリラキシンペプチドを含む反応液上清を1
5〜20ミクロンのビダックC4 300A°（５×50cm）カラ
ムにかけた。0.1％TFA水中の、20〜40％アセトニトリル
勾配（１分毎に0.5％変える）を用いて精製を行った。
流速は20ml/分であり、1.0分毎のフラクションを集め
た。これらを、分析用５ミクロンのビダックC4 300A°
（4.6×250mm）カラムでモニターした（0.1％TFA水中の
25％アセトニトリルでイソクラティックに溶離）。主産
物を含むフラクションを集め、これを後の分析用に凍結
乾燥した。
ヒトリラキシンおよびヒトリラキシン類似体を生物検
定で試験した。ネズミの恥骨結合検定（MPS）には、体
重18〜20gのチャールズ・リバー（Charles River）白CF
W雌マウスを用いる［ルイス（J.St.Louis,Can.J.Physio
l.Pharmacol.,59,507−512（1981））］。エストラジオ
ールプライミング液は、ピーナツ油0.1mlにエストラジ
オール17β−シクロペンチルプロピオネート５μｇを加
えたものである。ヒトリラキシン投与液は、ベンゾプル
プリン4Bの１％水溶液中、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0
および80.0μg/mlの濃度とする。マウスを少なくとも６
日間隔離室に入れ、18〜20gになったときに、各マウス
にエストラジオールプライミング液を皮下注射する。正
確に７日後、マウスに適当なヒトリラキシン投与液0.2m
lを皮下注射する。ヒトリラキシン駐車の後、18〜20時
間の間に頚部を脱臼させてマウスを殺した。恥骨間の靱
帯を露出させ、マイクロメーターで測定した。
体重200〜300gの、チャールズ・リバー白スプラーグ
・ドーレイ（Sprague−Dawley）由来の雌ラットを、ラ
ットの子宮収縮検定（RUC）に用いる。エストラジオー
ルプライミング液は、ピーナツ油0.1mlにエストラジオ
ール17β−シクロペンチルプロピオネート200μｇを加
えたものである。ヒトリラキシン貯蔵液は、滅菌注射用
水（Invenex）中、0.1mg/mlの濃度とする。ラットを少
なくとも６日間隔離室に入れ、各ラットにエストラジオ
ールプライミング液を皮下注射する。エスロラジオール
注射の後、16〜20時間の間に二酸化炭素で窒息させてラ
ットを殺す。子宮を解剖して取り出し、先端を裂き、子
宮を横から動物あたり４つの片に分ける。各組織を、通
気ホルマンズ・リンガー（Holmans Ringer）溶液35mlを
入れた、37℃に維持した、カバー付き水浴中に浮遊させ
る。このリンガー溶液を、塩化ナトリウムの20％を等モ
ル量の塩化カリウムに置換した溶液に置き換えると、こ
の組織は収縮を起こす。安定なプラトーに到達した後、
この水浴にある濃度のリラキシンを加える。標準曲線用
に水浴に加えたブタリラキシンの量は、水浴中の35mlあ
たりリラキシン0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4および1
2.8μｇである。
非ヒト霊長類の妊娠において、ヒトリラキシンが誘導
する頚部熟成について試験した。妊娠齢130〜160日の、
期間を合わせたアカゲザル（Rhesus monkey）でヒトリ
ラキシンを試験した。この群の妊娠期間は168±６日で
ある。この動物に、つなぎ用の綱を付けたジャケットを
着せた。この綱を付けたジャケットは、大腿血管、また
は頚動脈および内部頚静脈血管中に入れた内在カテーテ
ルに常時接近することを可能にした。大部分の動物にお
いては、羊膜嚢内に圧力変換器を入れ、子宮表面に電極
を接続して、子宮収縮活性の測定を可能にした。連続静
脈内注入で１時間にわたってリラキシンを投与し、注入
に続く15分から最初の１時間はときどき、次いで24時間
は規則的に、注入前、注入中、および注入後の血液試料
を採取した。リラキシンの投与量は10〜100μｇの範囲
とし、頚部に関する構造、不顕化、位置、拡張および胎
児位置、ならびに子宮下区の特性について評価した。ほ
とんどの場合、２人の観察者が別々にそれぞれの頚部を
調べ、評価した。対照群は、同様の方法で処置し、食塩
水を注入したサルであるか、または群中に保たれている
が１週間間隔で行なわれる頚部試験を施されていないサ
ルであった。
タンパク質を単離するためウェスタンブロットおよび
尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。低分子
量15％ポリアクリルアミドゲル、尿素、スラブゲルは、
ベセスダ・リサーリ・ラボラトリーズ（Bethesda Resea
rch Laboratories）の分子量標準用のパンフレットに従
って行った。この方法にいくつかの修飾を施した。この
ゲルを、４℃の冷却室中、100V（一定）で15時間泳動さ
せる。試料は、10mMリン酸ナトリウム（pH7.2）、7M尿
素、0.01％ブロモフェノール ブルー、および還元試料
に対しては新たに調製した50mM DTT中で調製する。充填
の前に、１〜10μｇの全ペプチドを90℃で２〜３分間イ
ンキュベートする。充填する前に、ゲルを90℃で２〜３
分間インキュベートする。0.2％ホルムアルデヒド、20
％エタノールおよび6.2％酢酸（すべてv/v）の溶液中で
15〜30分間脱染色し、固定した後、このゲルを、クーマ
ッシーブルー［Coomassie Blue;25％エタノール中のク
ーマッシーブルーＲ−250（90ml:0.25％w/v）および酢
酸（10ml）中にゲルを1.5時間浸漬する］で見えるよう
にし、銀染色［オークレイ等（Oakley,B.R.et al.,Anal
ytical Biochem.,105,361−363（1980））］し、ウェス
タン分析［トウビン等（Towbin,H.et al.,PNAS,76,4350
−4354（1979））］する。
エディー等［Eddie,L.W.et al.,The Lancet,1,1344−
1346（1986）］の記載のようにして、アルミニウム（al
umn）沈澱させた遊離ペプチドか、またはフロインドア
ジャバント中の遊離ペプチドでニュージーランド白ウサ
ギを免疫化することによって、Ａ−およびＢ−鎖に特異
的な抗体を、生成させた。力価は実質的に同一であり、
それぞれの免疫化からの抗血清を、Ａ−鎖についてはbb
力価で、Ｂ−鎖についてはccc力価で集めた。ニトロセ
ルロースフィルターに対する２時間〜一晩インンキュベ
ーションにおいて、これらを500倍に希釈して用いた。
次いで、洗浄したフィルターを、125I−タンパク質Ａに
対して２時間インキュベートし、乾燥し、Ｘ−線フィル
ムに感光させた。
以下に実施例を挙げて本発明方法をさらに詳しく説明
するが、これらは説明のためにだけ挙げるものであっ
て、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例１ 天然のヒトリラキシンH2（B33 A24） 還元型のリラキシンＡ−鎖（10mg）を、還元型の固体
凍結乾燥粉体として反応混合物に加えた。還元型のリラ
キシンＢ−鎖（5.63mg）も固体凍結乾燥粉体として加え
た。
始めにリラキシンＡ−鎖を、次いでリラキシンＢ−鎖
を、上記からの固体凍結乾燥粉体として加え、10mlのバ
イアル中、室温（〜25℃）でＡおよびＢリラキシン鎖の
溶液を混合した。NaOHを用いてpHを10.5に調節した。再
結合リラキシンの生成を最大にするため、この反応をRP
−４逆相分析用HPLCでモニターした。天然型のH2のＢ−
鎖が不溶性であることから、そのＡ−鎖との再結合には
本発明による次の条件、すなわち最終反応液0.1Mグリシ
ン（pH10.5）、1mM EDTA、2.5mM DTT、３％１−プロパ
ノール、３％アセトニトリル、および1M尿素を必要とし
た。この反応液を空気にさらし、室温で28時間攪拌し
た。前記のようにして、リラキシンの生成を分析用逆相
HPLCでモニターし、停止させた。高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）による分析は、リラキシンの収量が1.87
mg（すなわち、Ｂ−鎖の19.5％導入）であることを示し
た。
この混合物を、プレパラティブRP−４逆相HPLC（１×
25cm）RP−４シンクロパック300Aで精製した。このピー
クを集め、HPLC溶媒から直接用いた。このヒトリラキシ
ンは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分析
HPLC、アミノ末端配列決定および生物検定により、完全
に純粋であることがわかった。
実施例２ ヒトリラキシン類似体H2（B33 A24）BLys4 BA
la25 還元型のヒトリラキシンＡ−鎖（200mg）を水（pH2.
0）40mlに溶解した。還元型のヒトリラキシンＢ−鎖（B
33BLys4Ala25）（100mg）を水（pH2）20mlに溶解した。
上記の新鮮な水（pH2）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、165m
lのバイアル中、室温（〜25℃）でＡ−およびＢ−鎖類
似体の溶液を混合した。NaOHでpHを約8.0に調節した。
結合ヒトリラキシン類似体の生成を最大にするため、こ
の反応をRP−４逆相HPLCでモニターした。このヒトリラ
キシン類似体用に、本発明による次の条件、すなわち反
応B0.1Mトリス（pH8.0）、1mM EDTA、2mM DTT、24℃を
用いた。この反応液を空気にさらして激しく攪拌した。
氷酢酸を加えてpH4とすることによってこの結合反応を
停止させた。
この混合物を、プレパラティブHPLC ビダックC4 300
°Ａ（５×50cm）で精製した。ヒトリラキシン類似体の
ピーク（溶出体積：約140ml）を集め、凍結乾燥して35m
gのリラキシン（すなわり、Ｂ−鎖、20.3％）を回収し
た。このヒトリラキシン類似体は、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HP
LC（第2a図参照）および生物検定により、完全に純粋で
あることがわかった。
実施例３ ヒトリラキシン類似体 H2（B2−33 A24）BL
ys4 BAla25 還元型のヒトリラキシンＡ−鎖（41.5mg）を水（pH2.
0）8mlに溶解した。アミノ末端から最初のアミノ酸を削
除した還元型のヒトリラキシンＢ−鎖（B2−33 BLys4 BA
la25）（23mg）を水（pH2）4mlに溶解した。
上記の新鮮な水（pH2）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、33ml
のバイアル中、室温（〜25℃）でＡ−およびＢ−鎖類似
体の溶液を混合した。NaOHでpHを8.0に調節した。結合
ヒトリラキシン類似体の生成を最大にするため、この反
応をRP−４逆相HPLCでモニターした。このリラキシン類
似体用に、本発明による次の条件、すなわち反応D 0.1M
トリス（pH8）、25℃；初めの１〜２時間はN2を通し、N
2雰囲気下で攪拌する、を用いた。次いで、この反応液
を空気にさらして激しく攪拌した。氷酢酸を加えてpH4
とすることによってこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブHPLC ビダックC4 300
°Ａ（５×80cm）で精製した。リラキシン類似体のピー
ク（溶出体積：約140ml）を集め、凍結乾燥して16mgの
ヒトリラキシン類似体（すなわち、Ｂ−鎖、40.3％）を
回収した。このリラキシン類似体は、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、
HPLC（第2a図参照）および生物検定により、完全に純粋
であることがわかった。
実施例４ ヒトリラキシン類似体 H2（B2−33 A24）A
ピロ−Glu1 BLys4 BAla25 還元型のヒトリラキシンＡ−鎖（41.5mg）を水（pH2.
0）8mlに溶解した。アミノ末端から最初のアミノ酸を削
除した還元型のヒトリラキシンＢ−鎖（Ｂ−233 BLys4 B
Ala25）（23mg）を水（pH2）4mlに溶解した。
上記の新鮮な水（pH2）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、33ml
のバイアル中、室温（〜25℃）でＡ−およびＢ−鎖類似
体の溶液を混合した。NaOHでpHを8.0に調節した。結合
ヒトリラキシン類似体の生成を最大にするため、この反
応をRP−４逆相HPLCでモニターした。このリラキシン類
似体用に、本発明による次の条件、すなわち反応D 0.1M
トリス（pH8）、25℃；初めの１〜２時間はN2を通し、N
2雰囲気下で攪拌する、を用いた。次いで、この反応液
を空気にさらして激しく攪拌した。氷酢酸を加えてpH4
とすることによってこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブHPLC ビダックC4 300
°Ａ（５×80cm）で精製した。リラキシン類似体のピー
ク（溶出体積：約140ml）を集め、凍結乾燥して7.5mgの
ヒトリラキシン類似体（すなわち、Ｂ−鎖、18.9％）を
回収した。このリラキシン類似体は、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、
HPLC（第2a図参照）および生物検定により、完全に純粋
であることがわかった。
実施例５ ヒトリラキシン類似体 H2（B33 A24）Aピロ
−Glu1 BLys4 BAla25 還元型のヒトリラキシンＡ−鎖（200mg）を水（pH2.
0）40mlに溶解した。還元型のヒトリラキシンＢ−鎖（B
33 BLys4 BAla25）（100mg）を水（pH2）20mlに溶解し
た。
上記の新鮮な水（pH2）中貯蔵品から、Ａ−鎖を始め
に、修飾型のＢ−鎖を次いで加えることによって、165m
lのバイアル中、室温（〜25℃）でＡ−およびＢ−鎖類
似体の溶液を混合した。NaOHでpHを約8.0に調節した。
結合ヒトリラキシン類似体の生成を最大にするため、こ
の反応をRP−４逆相HPLCでモニターした。このヒトリラ
キシン類似体用に、本発明による次の条件、すなわち反
応B 0.1Mグリシン酸ナトリウム（pH8.0）、1mM EDTA、2
mM DTT、24℃、を用いた。この反応液を空気にさらして
激しく攪拌した。氷酢酸を加えてpH4とすることによっ
てこの結合反応を停止させた。
この混合物を、プレパラティブHPLC ビダックC4 300
°Ａ（５×50cm）で精製した。ヒトリラキシン類似体の
ピーク（溶出体積：約140ml）を集め、凍結乾燥して16m
gのリラキシン（すなわち、Ｂ−鎖、9.3％）を回収し
た。このヒトリラキシン類似体は、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、アミノ酸分析、アミノ末端配列決定、HP
LC（第2a図参照）および生物検定により、完全に純粋で
あることがわかった。
実施例６ 生物学的検定 ラットの子宮収縮インビトロ生物検定は、電気的な刺
激による収縮の存在下で平滑筋を弛緩させるヒトリラキ
シンの能力を測定するものである［ルイス（J.St.Loui
s,Can.J.Physiol.Pharmacol.,59,507−512（198
1））］。ネズミの恥骨結合帯インビトロ生物検定は、
結合組織に及ぼすリラキシンの変形効果を測定するもの
である［シュタイネッツ等（Steinetz,B.G.et al.,Endo
crinology,67,102（1960））］。H2（B2−33 A24）、H2
（B32 A24）BLys4 BAla25、H2（B33 A24）BLys4 BAla25、
および上記H2（B2−33 A24）BLys4 BAla25、Ａピロ−Glu
1およびH2（B33 A24）BLys4 BAla25 Ａピロ−Glu1のピロ
−Glu型の生物学的な服量反応を比較したところ、MPSお
よびRUCの両検定において生物学的な活性が示された。
ヒトリラキシン類似体およびヒトリラキシンについての
このMPSのデータを第３図に示す。
このMPS服量反応は、天然のヒトリラキシンとH2（B2
−33 A24）BLys4 BAla25が等価であることを示している
（第３図）。しかし、ブタリラキシンは他のリラキシン
と比較したとき、その反応は類似していないようであ
る。ヒト類似体および天然配列のヒトリラキシンのすべ
ては、MPS生物検定において実質的に区別することがで
きない。
用いうる精製H2（B33 A24）量の故に、投与範囲の高
い方で比較することもできた。この結果は、天然のヒト
リラキシンとヒトリラキシン類似型の活性が同等である
ことを示す。ヒトリラキシンの服量反応曲線の傾きは、
類似体のそれとは異なることもある。
RUC生物検定においては、ヒトリラキシンとヒトリラ
キシン類似体の傾きは同じである。
実施例７ 霊長類の妊娠におけるヒトリラキシン 前記の方法を用い、妊娠齢130〜160日の、期間を合わ
せたアカゲザルにおいて、２種類のヒトリラキシン類似
体、H2（B33 A24）BLys4 BAla25およびH2（B2−33 A24）
BLys4 BAla25を試験した。
観察されたパラメーターに改良型ビショップ・スコア
ーを用いると、投与量の異なる７種の別個の注入による
平均の頚部変化は3.7単位であった。これらのデータを
第５図に示すが、ここには100、50および10μｇ用量の
個々の注入、ならびに他のすべての10μｇ注入の平均お
よび２種類の対照が示されている。非注入の対照サルは
ポイントあたり２〜15測定（それぞれが少なくとも４匹
のサルを表す２つのポイントを除いて）であり、その平
均がプロットされていることに注意。通常、頚部は、妊
娠期間が進行するに従って比較的低用量のリラキシンに
対して、またはこの期間の初期にリラキシンを繰り返し
投与することに対して、より感受性となった。高用量の
リラキシン（100または50μｇ）は妊娠期間の比較的初
期（130〜140d）であっても、頚部熟成に有意の変化
（スコアーで１〜10の変化を誘起する）を与えることが
できた。この頚部の変化は、子宮の筋電図活性はたは子
宮内圧における矛盾のないすべての変化とは独立して起
こるようであった。これらの結果は、妊娠期間の最後の
第３期の霊長類において頚部熟成を引き起こすのに、結
合ヒトリラキシンが極めて効果的であることを示してい
る。
既知の方法を用いて本発明のヒトリラキシンおよびヒ
トリラキシン類似体を配合し、ヒトリラキシンまたはそ
の類似体を薬学的に許容しうる担体と混合した薬学的に
有用な組成物を調製することができる。その他の必要な
ヒトタンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）を含
む適当な担体およびその配合については、通常の製剤に
関する専門書［たとえば、マーチン（E.W.Martin）によ
るRemington's Pharmaceutical Sciences］に記載され
ている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒトリラキシンおよびその他のリラキシン、
ならびにヒトインスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列
を示す配列図であり、第2a図および第2b図は、それぞれ
H2（B33 A24）BLys4 BAla25およびH2（B33 A24）につい
ての鎖結合反応の経時変化（HPLC測定）を示すグラフで
あり、第３図は、ヒトリラキシン、ヒトリラキシン類似
体およびブタリラキシンについて測定したMPS服量反応
曲線を示すグラフであり、第４図は、ヒトリラキシン類
似体を妊娠齢の異なるアカゲザルに投与した後に測定し
た改良型ビショップ・スコアーを示すグラフである。

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトリラキシンのＡ鎖またはその類似体と
    ヒトリラキシンのＢ鎖またはその類似体を結合させてヒ
    トリラキシンまたはヒトリラキシン類似体を製造する方
    法であって、該方法は遊離システイン還元型のヒトリラ
    キシンＡ鎖またはその類似体と遊離システイン還元型の
    ヒトリラキシンＢ鎖またはその類似体を混合することを
    含んでなるものであり、該方法においては該ヒトリラキ
    シンＢ鎖またはその類似体は、pH7.0〜12の水性媒体中
    で、ヒトリラキシンまたはヒトリラキシン誘導体が形成
    するようなコントロールされた空気暴露条件下で、１以
    上の変性剤にさらされる方法。
  2. 【請求項２】還元型のヒトリラキシンＡ鎖および還元型
    のヒトリラキシンＢ鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキ
    シン（H2）のアミノ酸配列を有するものである第（１）
    項記載の方法。
  3. 【請求項３】還元型のヒトリラキシンＡ鎖および還元型
    のヒトリラキシンＢ鎖のそれぞれが、天然のヒトリラキ
    シン（H1）のアミノ酸配列を有するものである第（１）
    項記載の方法。
  4. 【請求項４】還元型のヒトリラキシンＢ鎖が該Ａ鎖の類
    似体である第（１）項記載の方法。
  5. 【請求項５】還元型のヒトリラキシンＢ鎖が該Ｂ鎖の類
    似体である第（１）項記載の方法。
  6. 【請求項６】還元型のヒトリラキシンＢ鎖が、少なくと
    も25から33個のアミノ酸を有するものであり、該鎖中の
    少なくとも１個のメチオニンが置換されている第（１）
    項記載の方法。
  7. 【請求項７】還元型のヒトリラキシンＢ鎖が、32個のア
    ミノ酸まで短くしたものであり、該鎖の４位にリジンお
    よび25位にアラニンを有している第（１）項記載の方
    法。
  8. 【請求項８】該混合を15〜30℃の温度で行う第（１）項
    記載の方法。
  9. 【請求項９】該混合を室温で行う第（１）項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】還元型のヒトリラキシンＡ鎖が、該鎖の
    １位にピロ−Gluを有するものである第（１）項記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】変性剤がカオトロピック試薬または有機
    溶媒またはそれらの混合物である第（１）項記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】カオトロピック試薬が尿素またはグアニ
    ジン塩酸塩であり、有機溶媒がアセトニトリル、アルコ
    ールまたはジメチルホルムアミドである第（11）項記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】カオトロピック試薬が尿素であり、有機
    溶媒がアセトニトリルまたは１−プロパノールまたはそ
    の両方であって10％（体積比）以下の量である第（11）
    項記載の方法。
  14. 【請求項１４】リラキシンＡ鎖のリラキシンＢ鎖に対す
    る比が1:0.5〜3.0:1（重量比）である第（１）項記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】リラキシンＡ鎖のリラキシンＢ鎖に対す
    る比が1:1〜1.5:1（重量比）である第（１）項記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】リラキシン濃度が反応溶媒1mlあたり 0.
    1:1〜10mgの範囲である第（１）項記載の方法。
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