HU205948B - Process for producing human relaxin and theyr analogues of the same activity - Google Patents
Process for producing human relaxin and theyr analogues of the same activity Download PDFInfo
- Publication number
- HU205948B HU205948B HU872804A HU280487A HU205948B HU 205948 B HU205948 B HU 205948B HU 872804 A HU872804 A HU 872804A HU 280487 A HU280487 A HU 280487A HU 205948 B HU205948 B HU 205948B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- chain
- relaxin
- reduced
- human
- human relaxin
- Prior art date
Links
- BJRCFZKVYNDCJE-WBSNEMHCSA-N 99489-95-9 Chemical compound C([C@@H]1NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N2)[C@@H](C)CC)=O)CSSC[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC1=O)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)C(C)C)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 BJRCFZKVYNDCJE-WBSNEMHCSA-N 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000103 Relaxin Chemical class 0.000 claims description 64
- 102000003743 Relaxin Human genes 0.000 claims description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 2
- PFFIDZXUXFLSSR-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-N-[2-(4-methylpentan-2-yl)-3-thienyl]-3-(trifluoromethyl)pyrazole-4-carboxamide Chemical compound S1C=CC(NC(=O)C=2C(=NN(C)C=2)C(F)(F)F)=C1C(C)CC(C)C PFFIDZXUXFLSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 abstract description 10
- 101500024628 Homo sapiens Relaxin B chain Proteins 0.000 abstract description 7
- 101500024640 Homo sapiens Relaxin B chain Proteins 0.000 abstract description 7
- 101500024627 Homo sapiens Relaxin A chain Proteins 0.000 abstract description 6
- 101500024645 Homo sapiens Relaxin A chain Proteins 0.000 abstract description 6
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 abstract description 2
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 abstract description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 12
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- -1 N-t-butoxycarbonyl amino Chemical class 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 5
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 5
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 5
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001091088 Homo sapiens Prorelaxin H2 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N Estradiol Cypionate Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H](C4=CC=C(O)C=C4CC3)CC[C@@]21C)C(=O)CCC1CCCC1 UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N 0.000 description 2
- 241000447437 Gerreidae Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000049116 human RLN2 Human genes 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251129 Galeocerdo Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001091094 Homo sapiens Prorelaxin H1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100034949 Prorelaxin H2 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000251135 Scyliorhinidae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229940047135 glycate Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000049117 human RLN1 Human genes 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/64—Relaxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/04—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for inducing labour or abortion; Uterotonics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgya új eljárás humán relaxin és relaxinhatással rendelkező humán relaxin-analógok előállítására a humán relaxin vagy valamely analógja redukált alakban levő A-láncának és a humán relaxin vagy valamely, az előzővel egyező vagy attól különböző analógja redukált alakban levő B-láncának kémiai összekapcsolása útján. Az összekapcsolást 7 és 12 közötti pH-értékű vizes közegben, előnyösen 15 és 30 °C közötti hőmérsékleten, oxigéntartalmú atmoszférában, célszerűen levegőn végezzük; a természetes humán relaxin aminosav-szekvenciájával egyező termék előállítása esetén enyhe denaturáló szert tartalmazó vizes közegben dolgozunk.
Az új eljárás széles körű alkalmazhatósága és technológiailag egyszerű volta folytán nem csak a humán relaxin és már ismert analógjai, hanem új, eddig le nem írt, relaxin-hatással rendelkező relaxin-analógok előállítására is előnyösen alkalmazható. A találmány kiterjed az ilyen relaxin-analógok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is.
A humán relaxin petefészek-eredetű peptid, amely a szaporodási szervek átalakulásáért felelős a szülés előtt, így megkönnyítve a szülési folyamatot [Hisaw F. L.: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 23, 661-663 (1926); Schwabe C. és munkatársai; Biochem. Biophys. Rés. Comm. 75, 503-570 (1977); James R. és munkatársai: Natúré, 267, 544-546 (1977)]. Bár a relaxin zömmel a terhesség hormonja, kimutatták nem terhes nőstényekben, valamint hímekben is [Bryant-Greenwood G. D.: Endocrine Reviews 3, 62-90 (1982) és Weiss G.: Ann, Rév. Physiol. 46, 43-52 (1984)].
A sertésből, patkányból, tigriscápából, macskacápából és emberből kapott relaxin aminosav-szekvenciáját meghatározták. A hormon két peptidláncot tartalmaz, amelyeket A-nak és B-nek neveznek, diszulfid-kötésekkel összekötve egy láncok közti diszulfid hurokkal az A-láncban az inzulinnal analóg módon. Egy meglepő és fontos különbség azonban a humán relaxin és legtöbb más peptid hormon között, az inzulint is beleértve, hogy jelentős szerkezeti változások vannak a fajok között. így pl. a sertés, patkány és humán relaxinok az aminosav-helyek több mint 50%-ában különböznek. Ezek a különbségek megmagyarázzák a szegényes immunológiai kereszt-reaktivitást a különböző fajok relaxinjai között, valamint a megfigyelt különbségek nagy számát ezek fajlagos biológiai aktivitásában.
A rekombináns DNS-technológia alkalmazása elvezetett a humán relaxinokat kódoló gének izolálásához és jellemzéséhez [Hudson P. és munkatársai: Natúré 301,628-631 (1984) és Hudson P, és munkatársai; The EMBO Journal 3, 2333-2339 (1984)]. A cDNS-ből és genom kiónokból számlázó nukleotid szekvencia elemzése feltárja a humán relaxin szerkezeti felépítését; ez magában foglal egy 25 gyökből álló szignál pepiidet, ezt követi a B-lánc mintegy 32-33 aminosavval, egy C pepiid mintegy 105 aminosavval, és az A-lánc 24 aminosavval. Humán relaxin esetében egy intron szakítja meg a C peptid kódoló területét. A C peptid, amely jelentősen hosszabb, mint az inzulin C peptidje, fiziológiai szerepe, és a C peptidnek az A- és
B-láncok végeiről való eltávolításáért felelős enzimek természete megoldatlan kérdés.
Humán relaxin esetében két külön génszekvenciát azonosítottak. Ezeknek a géneknek csak egyike (H2) fejeződik ki a petefészekben a terhesség alatt, és nem világos, vajon a másik gén egy másik szöveti helyen fejezódik-e ki, vagy vajon ez pszeudo-gént képvisel? A két humán relaxin gén jelentős nukleotid- és aminosavhomológiát mutat egymáshoz, különösen a B és C pepiidben. Vannak azonban a szekvenciaeltérésnek jelentős területei is, főleg mind az A- mind a B-láncok amino-terminális területeiben (lásd az 1. ábrát). Az a tény, hogy a H2 relaxin szintetizálódik és fejeződik ki a petefészekben, azt sugallja, hogy ez az a szekvencia, amely érdekelt a terhesség fiziológiájában. Egy nem régi közleményben [Johnston P. D. és munkatársai: a „Peptides: Structure and Function” (Peptidek: Szerkezet és működés) című kiadványban, Proc. Ninth American Peptide Symposium (szerkesztők: Deoer C. M., Hruby V. 1. és Kopple E. D., kiadó: Pierce Chem. Co.) (1985)] szintetikus humán relaxint (H2) és bizonyos humán relaxin-analógokat vizsgáltak biológiai aktivitásra. Ezek meghatároztak egy lényeges relaxinrészt, amely a biológiai aktivitáshoz szükséges, valamint bizonyos aminosav-helyettesítéseket metionin helyett, amelyek nem hatnak a biológiai aktivitásra.
Az 1. ábra összehasonlítja a különböző fajokból származó relaxinok ismert aminosav-szekvenciáít. A hat cisztein-gyökön és a szegélyező glicin-gyökökön kívül csak a B-lánc 7. helyénél levő izoleucin, a 12. és 16. helyeknél levő arginin és a 32. helynél levő leucin őrződik meg. Világos, hogy a cisztein-gyökök lényegesek az általános diszulfid-kötés konfigurációjának fenntartásához [Blundell T. és munkatársai: a „Biology of Relaxin and its Role in the Humán” (A relaxin biológiája és szerepe az emberben) c. kiadványban, 14-21 (1983) (szerkesztők: Bigazzi M., Greenwood F. C. és Gaspari E, kiadó: Excerpta Medica, Amszterdam)]. A faj szerinti változatok az aminosav-szekvenciában a legtöbb helynél a relaxin molekulában, azaz az A- és B-láncukban, amelyek a relaxin fehérje aktív részeit tartalmazzák, feltűnőek. Ez éles ellentétben van azzal a helyzettel, amely jóformán az összes többi peptid hormoncsaládnál áll fenn, beleértve az inzulint is. A relaxin szerkezetnek egy másik vonása a hosszban való eltérés, amely a B-lánc amino- és karboxil-terminális területeinél és kisebb mértékben az A-lánc aminoterminálisánál látható.
A relaxin kémiai szintézise különösen nehéz, főleg az izolált B-lánc szokatlan szerkezeti jellemzői miatt [Tregear G. W. és munkatársai: a „Biology of Relaxin and its Role in the Humán” (A relaxin biológiája és szerepe az emberben) c. kiadványban, 42-55 (1983) (szekesztők: Bigazzi M., Greenwood E C. és Gaspari E, kiadó: Excerpta Medica, Amszterdam)].
Amint fentebb tárgyaltuk, a humán relaxin és tulajdonképpen az emlős relaxinok általában bizonyos, szerkezeti hasonlóságot mutatnak az inzulinhoz. Mind az inzulin, mind a relaxin rendelkeznek láncon kívüli és láncon belüli diszulfid-kötésekkel a két lánc
HU 205 948 B között [James R. és munkatársai: Natúré 267, 544 (1977) és Schwabe C. és McDonald J. R.: Science 197, 914 (1977)]. Ez feltételezhetővé tette, hogy az a szintetikus stratégia, amelyet az inzulinnál sikeresen alkalmaztak [Busse W. D. és Carpenter F. H.: Biochemistry 75, 1649 (1976); Katsoyannis P. G. és munkatársai: Biochemistry 6, 2656 (1967) és Kung Y. T. és munkatársai: Scientia Sinica 75, 544 (1966)], alkalmazható lesz a relaxinhoz is. Treagar G. és munkatársai [a Relaxin c. kiadványban (szerkesztők: BryantGreenwood G. D., Niall H. D. és Greenwood F. C., kiadó: Elsevier, New York) (1981)] megkísérelték a relaxin szintézisét, az egyedi lánc megközelítést végezve, a cisztein szulfhidrilek szelektív védelmét alkalmazva, és úgy találták, hogy az inzulinmódszerekkel készített szintetikus peptidek kimutatható relax inszerű aktivitással bírnak, a fajlagos aktivitásuk és az összetett hazamuk azonban nagyon kicsiny. A sertés relax innál a gyenge összetett hozam egyrészt a teljes hosszúságú sertés B-lánc oldhatatlanságának tulajdonítható a pH 10,5 értékű oldatban. Treager és munkatársai (fentebb idézett munka) módosították a korábbi inzulinkombinációs módszert két tekintetben: a kevert sertés relaxin peptid láncokat acetonnal csapták ki, hogy eltávolítsák a redukáló-szereket; és 0,5 mól/1 NaCl-t adtak az oxidációs lépés során (lásd még a 83 304 662 és 83 307 553 számú európai szabadalmi leírásokat).
Change és munkatársai (4 421 685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, nyilvánosságra került 1983. december 20-án) módszert mutatnak be inzulin vagy analógja előállítására az inzulin A- és B-láncok S-szulfonált formájának kombinálásával valamilyen tiol-redukáló szerrel, vizes közegben, szabályozott pH-nál és hőmérsékletnél olyan módon, hogy a redukciós és oxidációs reakciókat egyetlen lépésben hajtják végre. Ezt a módszert P. Hudson és munkatársai [Natúré, 507,628-631 (1983); 4 758 516 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] megkísérelték a humán relaxin szintézisére, hasonlóképpen az A-lánc és a B-lánc lúgos közegben, ditiotreitol jelenlétében történő összekapcsolása útján alkalmazni, azonban csak igen gyenge hozamot tudtak elérni, amint ezt az alábbi 5. példa után közölt összehasonlító adatok számszerűen is szemléltetik.
A fentiekkel szemben meglepő módon azt találtuk, hogy mind a természetes humán H2-relaxin A- és Bláncának aminosav-szekvenciájával egyező láncú humán relaxin, mind enne az A- és/vagy B-láncban egyes aminosavak kicserélése vagy elhagyása útján létrehozott és ilyen alakban is relaxin-aktivitást mutató analógjai egyszerű módon és jó hozamokkal állíthatók elő az A-lánc és a B-lánc összekapcsolása útján, ha ezt a két láncot redukált, vagyis szabad ciszteincsoportú alakban alkalmazzuk kiindulási anyagként, és ezt a két, természetes eredetű vagy kémiai szintézissel, illetőleg rekombináns DNS-technológiával előállított, redukált alakban levő láncot 7 és 12 közötti pH-értékű vizes közegben, oxigéntartalmú gázatmoszférában, előnyösen levegőn vagy fokozatosan növelt oxigéntartalmú nitrogén-atmoszférában, 15 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten elegyítjük egymással.
Emellett a természetes humán relaxin aminosavszekvenciájával egyező A- és B-láncú relaxin előállítása esetén jó hozam elérése érdekében előnyösnek találtuk a kapcsolási reakciónak enyhén denaturáló hatású vizes közegben történő lefolytatását. Enyhén denaturáló hatású közegen az olyan denaturáló hatású szert vagy ilyen hatású oldószert tartalmazó vizes közeget értjük, amely a relaxin B-láncát denaturálni képes, ugyanakkor azonban a kapcsolási reakcióban keletkező relaxin vagy relaxin-analóg termékre nem fejt ki denaturáló hatás, vagyis megnöveli a módosítatlan B-lánc oldhatóságát és ezzel a rakciókészségét is a kapcsolási reakcióban, a kapcsolási reakció útján keletkező humán reakció stabilitását azonban nem befolyásolja. A természetes relaxin aminosav-szekvenciájától eltérő, módosított szekvenciájú relaxin-analógoknak a találmány szerinti eljárással történő előállítása esetén azonban az enyhén denaturáló hatású vizes közeg alkalmazásának nem tapasztaltuk számottevő előnyét, ezért az alábbi kiviteli példáinkban a megváltoztatott szekvenciájú relaxin-analőgok előállítása során általában denaturáló adalékot nem tartalmazó vizes közeggel dolgoztunk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a csatolt ábrákat.
Az 1. ábra a Hl és H2 humán relaxin és a humán inzulin, ill. a sertés (P) és patkány (R) relaxinok közötti analógia hiányát szemlélteti. A számozási rendszer a H2 relaxinra vonatkozik. A relaxinok diszulfidjai a következők: A10-A15; All-Bll és A24-B23.
A 2(a) ábra a H2(B33 Α24)ΒΥ4ΒΑΙ“Μ HPLC időbeli lefolyását mutatja be, a 2(b) ábra pedig az in vitro lánckombinációs reakció profilját a H2(B33 A24)-hez. A kombinálási reakció, amely humán relaxin-analóg vagy humán relaxin és az A-lánc egy potenciálisan fontos intramolekuláris oxidált intermediere képződését mutatja, időbeli lefolyását írjuk le. A gén-2 A- és B-peptid-láncok átalakulását ábrázoljuk H2 humán relaxin-analóggá vagy H2 humán relaxinná. A kromatográfíához Synchropak RP-C4-et (4,6x250 mm; 300Á alkalmazunk. Acetonitril lineáris gradiensét (15-+60% 500 perc alatt) 0,05%-os vizes trifluor-ecetsav pufferral futtatva 1 ml/perc sebességgel.
A 3. ábra a kombinált láncú humán gén-2 relaxin H2(B2-33 A24)BL>'s‘,BAla55 és a természetes humán relaxin bioaktivitását (MPS) mutatja be.
A 4. ábra a módosított Bishop-féle pontozást mutatja be terhesekben H2(B2-33 A24)BY4BAla“ és H2(B33 Α24)ΒΥ4ΒΑΙο?ί humán relaxin-analógok különböző dózisainak beadására.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
Ahogyan itt alkalmazzuk, a „humán relaxin” vagy „humán relaxin-analóg” olyan funkcionális fehérjére vonatkozik, amelyről ismert, hogy átalakítja a szaporítási szerveket, hogy megkönnyítse a szülési folyamatot. A szaporítási szervek átalakításán olyan fiziológiai akciókat értünk, mint pl. a méhnyak érése; a terhes méh nyálkahártyájának elvastagodása, valamint ennek
HU 205 948 B a területnek a megnövekedett véredény-ellátottsága; és hatása kollagén szintézisre. Humán relaxint találtak a női mellben is, és ez kapcsolatban lehet a tejképződéssel. Humán relaxint találtak a humán ondófolyadékban is, és ez növelheti a humán spermák mozgékonyságát. A relaxin adott hatását a méhre figyelembe véve, a humán relaxin fokozhatja a spermának azt a képességét, hogy behatoljon a női méhbe. A humán relaxin javíthatja a bőr rugalmasságát a kötőszövetekre való hatása révén.
A humán relaxin-analóg a fentebb leírt funkcionális meghatározáson kívül szerkezetileg egy sor olyan fehérjét jelent, amelyek mindegyike a humán relaxin alapszerkezetével rendelkezik, beleértve egy A- és egy B-láncot. A humán relaxin-analóg különbözik a természetben előforduló humán relaxintól egy vagy több aminosavgyök helyettesítésével, kiiktatásával, hozzáadásával vagy módosításával a humán relaxinnak vagy az A- és/vagy a Bláncában azzal a feltétellel, hogy a biológiai relaxinszerű aktivitás megmarad. Az ilyen humán relaxin-analógok között találjuk az alábbiakat (de nemcsak ezekre korlátozódnak): teljes hosszúságú A-lánc és karboxi-terminálisán rövidített B-lánc; Hl(B2-27 A24)BAla25; H2(B2-25 A24); H2(B33 A24); H2(B33 A24)BLys4BAla“; H2(B2-33 A24)BL^4BAla25; H2(B2-33 A24)APir°-Glu'BL>'s4BA,a“; és H2(B33 A24)APiro·Glu'BL>'s4BAI:>1,, A nómenklatúra a következő: a Hl és a H2 a két humán génre vonatkozik, amelyek humán relaxint kódolnak. A H2-ről úgy találták, hogy a humán petefészekben fejeződik ki, míg a Hl-et csak genom klónként találták meg. Az A és B a humán relaxin megfelelő láncaira vonatkozik. Az A-t vagy B-t követő számok a lánc hosszára vonatkoznak, azaz az Avagy B-láncban levő aminosavak számára. Az aminosavakat szokásos hárombetűs jelzéseikkel jelöljük. Az aminosavakat megelőző index az A- vagy B-láncot jelöli, amelyben az aminosav elhelyezkedik, míg az aminosavat követő index a láncban levő helyre vonatkozik.
A humán relaxin A- és B-láncot és a relaxin-analógok A- és B-láncait (amelyek aminosav-szekvenciáit pl. Hudson etc. és Blundeil etc. fentebb idézett munkái ismertetik) az ismert peptidszintézis módszerekkel, akár az oldószeres vagy szilárd fázisú technikával, akár rekombináns DNS-technológiával állíthatjuk elő, akár természetes humán relaxinból készíthetjük. A szintetikus felépítést előnyösen a szilárd fázisú módszerrel [Bárány G. és Merrifield R. B. a „The Peptides” c. kiadványban, 2, 1-284 (szerk. Gross E. és Meienhofer J.; Academic Press, New York)] végezzük. A szintézis során az egyes aminosavakat, ill. szekvencia-részeket a szükséghez képest védett alakban alkalmazzuk. A védett N-t-butoxi-karbonil-aminosavakat a Peninsula Laboratories, Inc.-től szerezzük be. A következő oldallánc-védőcsoportokat alkalmazzuk: Arg: tozil; Asn: xantil; Asp: benzil-észter; Cys: metoxi-benzil; Gin: xantil; Glu: benzil-észter; His: tozil; Lys: o-klór-benziloxi-karbonil; Ser: benzil; Thr: benzil; Tyr: 2,6-diklórbenzil. Az első aminosavat klónnetil-polisztirolra (1% divinil-benzollal) észterezzük kálium-fluoriddal dimetil-formamidban. A helyettesítés szintje 0,6 milliékvivalens/g. Az aminosavakat (desztillált) diciklohexilkarbodiimiddel kapcsoljuk össze diklór-metánban. Az arginin-, aszparagin-, glutamin-, leucin- és ciszteingyököket mciilén-klorid/dimetil-formamid 50 : 50 keverékben kapcsoljuk. A t-butoxi-karbonil-csoportok eltávolítását 45% trifluor-ecetsav, 5% anizol, 5% etán-ditiol és 45% metilén-klorid elegyével végezzük. Az összekapcsolások előtt semlegesítést végzünk 10% trietil-aminnal metilén-kloridban. A gyantáról való lehasítást és az összes védőcsoport eltávolítását vízmentes, folyékony hidrogénfluoriddal végzett kezeléssel hajtjuk végre anizol és metil-etil-szulfid jelenlétében (20 : 3 : 1 térfogat/térfogat), 0 °C hőmérsékleten egy órán át. A nyers A-láncot a gyantáról 10%-os vizes ecetsav-oldattal távolítjuk el, majd liofilezzük. A nyers B-láncot a gyantáról először 80%-os vizes acetonitrillel, majd 30%-os vizes ecetsavval végzett mosással távolítjuk el, ezt követi a hígítás vízzel és a liofilezés. A nyers peptideket 100 mmól/l-es ditiotreitol-oldatban oldjuk fel, majd nagy térfogatra hígítjuk fel 107c-os vizes acetonitrillel, amely 0,1% trifluor-ecetsavat is tartalmaz. Ezeket az oldatokat 5x55 cm-es, Vydoc C18-cal (300 A, 15-20 mikron) töltött oszlopokra terheljük, 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavval mossuk, és acetonitril-gradienssel eluáljuk. A peptid-frakciókat összegyűjtjük, liofilezzük, és aminosav-összetétellel, szekvenciaelemzéssel és analitikai fordított fázisú HPLCvel elemezzük. A cisztein-gyököket nem védjük szulfonálással vagy más származékképzéssel [Means G. E. és Feeney R. E.: Chemical Modification of Proteins (1971)], ahogyan ez a korábbi, inzulinnál vagy sertés relaxinnál alkalmazott módszereknél is történt. Javult hozamot és peptidoldhatóságot kapunk a jelen találmány szerinti módszerrel, a humán A- és B-láncokat redukált formájukban tartva. A redukált és liofilezett Aés B-láncokat közvetlenül használjuk az összes rekombinációs reakcióhoz a szulfonált származékká való átalakítás nélkül, vagy más cisztein-tiol blokkoló szer alkalmazása nélkül.
A jelen találmány eljárásának kivitelezésében a humán relaxin A- és B-láncok vagy analóg A- és B-láncok kombinácóját az egyik lánc másik lánchoz viszonyított jelentősen különböző mennyiségi arányaival érhetjük el. A két lánc kapcsolási reakciójának hozamát tennészetesen a kisebb moláris mennyiségben jelen lévő (A vagy B) lánc határozza meg. Emellett azonban a B-lánc számottevő feleslege gátló hatású lehet a lánc-kapcsolási reakcióra, ezért előnyös, ha az A-lánc a B-lánccal egyező moláris mennyiségben vagy csekély feleslegben van jelen a kapcsolási reakcióelegyben. Általában az A-láncnak a B-lánchoz viszonyított tömegaránya 1:0,5 és 3,0: 1 között, előnyösen 1 : 1 és
2,5 : 1 között lehet. Ezen az előnyös tartományon belül bizonyos tartományok különösen előnyösek bizonyos relaxin-analógok előállításához. így pl. a humán relaxin A- és B-láncok kombinációjában dez-metionin relaxin előállítására előnyös, ha az A-lánc és B-lánc aránya a mintegy 1.2 : 1 és mintegy 2: 1 közti tartományban van.
Egy másik paraméter, amely befolyással lehet a találmány szerinti eljárással) kapott hozamra, a fehérjék
HU 205 948 Β (polipeptidek, tehát az A-lánc és a B-lánc) optimális koncentrációja a kapcsolási reakcióközegben. A kapcsolási reakciót sikeresen lehet a fehérjekoncentrációk széles tartományában végrehajtani, előnyösen azonban 0,1-10 mg/1, különösen 0,5-5 mg/1 fehérjekoncentrációval dolgozunk. Az adott esetben optimális fehérjekoncentráció attól is függ, hogy milyen relaxint vagy relaxln-analógot kívánunk előállítani.
A találmány szerinti kapcsolási reakciót vizes közegben hajtjuk végre. A közeg szobahőmérsékleten mért pH-ja a mintegy 7,0 és mintegy 12 közti tartományban van. Előnyösen a mintegy 7,5 és mintegy 11,0 közötti tartományban van, és optimálisan a mintegy 8,0 - mintegy 10,6 közti tartományban kell tartani. A közeg pH-ját a kívánt tartományban megfelelő pufferoló szerek hozzáadásával lehet fenntartani. Tipikus pufferoló szerek pl. a glicinátok, karbonátok, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, pirofoszfátok és más hasonló szerek, amelyek elvégzik a pH szabályozását a fentebb leírt tartományon belül. Az általában használt és előnyös pufferoló szer a trisz-(hidroxi-metil)-aminometán (pH 8 és 9 között) és a glicinát (pH 9,5 és 11,0 között).
A keverési reakciót mintegy 15 °C és mintegy 30 °C közti hőmérsékleten, előnyösen mintegy 20 °C és mintegy 25 °C közti hőmérsékleten, és legelőnyösebben szobahőmérsékleten hajtjuk végre.
A pufferoló szer koncentrációja előnyösen a mintegy 0,025 mól/1 és mintegy 0,2 mól/1 közti tartományban van. A koncentráció előnyösen mintegy 0,05 mól/1 és 0,15 mól/1 közti tartományban van, és legelőnyösebben 0,1 mól/1.
A találmány szerinti eljárást levegőn vagy előnyösen olyan környezetben hajtjuk végre, amelyben az oxigéntartalmú gáznak való kitevés szabályozható. Úgy találjuk, hogy a szabályozott oxidációt az összes oldat N2vel kiinduláskor végzett átöblítésével, majd a reakciókeverék zárt tartályban a reakció kezdetekor N2-vel való átöblítésével és még a zárt tartályban a reakciókeverék levegőnek való kitevésével érhetjük el, ez utóbbi lépést közvetlenül a tartály kinyitásával vagy oxigénnek a közegbe vagy közegen át történő buborékoltatásával hajtjuk végre.
A humán relaxin A- és B-Iáncával egyező relaxin szintézise során - amint ezt fentebb már említettük előnyösnek bizonyult, hogy a reakciót olyan körülmények közt hajtsuk végre, hogy ez enyhén denaturáló legyen a humán relaxin B-láncra. Olyan denaturáló szereket alkalmazhatunk, mint pl. a karbamid, guanidin-hidroklorid és más kaotróp szerek, sók, detergensekés szerves oldószerek (acetonitril, alkoholok, dimetil-formamid stb.); mindezek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Előnyösen karbamid, acetonitril és néhány térfogatszázalék (kevesebb, mint 10%) szerves oldószer létrehozza a humán relaxin B-lánc számára enyhén denaturáló körülményeket.
A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során tehát az előállítani kívánt humán relaxin vagy relaxinanalóg A-láncát és B-láncát vizes, előnyösen 2 körüli pH-értékű közegben elegyítjük egymással, a természetes humán relaxinnal egyező termék előállítása esetén előnyösen valamely enyhe denaturáló szer jelenlétében, míg módosított A- és/vagy B-láncú relaxin-analóg előállítása esetén az enyhez denaturáló szer alkalmazására nincs szükség. Az A-lánc és a B-lánc elegyítését előnyösen úgy végezzük, hogy először az A-lánc oldatát adjuk részletekben hozzá; a kapcsolási reakció azonban más elegyítés! sorrend esetén is végbemegy. Az elegyítés megtörténte után az elegyet - előnyösen nátrium-hidroxid oldattal - 7 és 12 közötti pH-értékre semlegesítjük, illetőleg lúgosítjuk, a meginduló reakciót RP-4 fordított fázisú analitikai HPLC-vel követjük [Synder L. R. és Kirkland J. J.: az „Introduction to Modem Liquid Chromatography” (Bevezetés a modem folyadékkroniatográfiába) című kiadványban (1979)], a rekombináns relaxin maximális képződését figyelve, és a reakciót jégecet hozzáadásával állítjuk le, pH 4 értéket állítva be. A keveréket ezután centrifugáljuk 16 318 g-nél 30 percen át, és a felülúszót preparatív fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk. Megfigyelhető, hogy a kombinációs reakció kivitelezésénél fontos, hogy szobahőmérsékleten történjék; így a humán relaxint hasznos hozammal állítjuk elő. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás analitikai munkákat Synchropak RP-4 fordított fázisú oszlopot (4,6x250 mm, 300 A) alkalmazva végezzük. A preparatív munkákat vagy Synchropak RP-4 (1x50 cm, 300 Á) vagy kézzel töltött Vydac RP-4 vagy RP-18 (5x50 cm, 300 A) fordított fázisú oszlopokat alkalmazva végezzük. Analitikai HPLC-t Water’s-rendszert alkalmazva is végezhetünk. Preparatív HPLC-t, Water’srendszert vagy Prep 500-at alkalmazva is végezhetünk.
Amikor a reakció időtartama befejeződött, a humán relaxin vagy relaxin-analóg terméket sokféle módszer bármelyikével izolálhatjuk, amelyek mindegyike ismert a fehérjeizolálás szakterületén. A legáltalánosabban alkalmazott technikák a relaxin tisztításához a kromatográfiás technikák. Ezek könnyen alkalmazhatók a jelen találmány szerinti eljárásból kapott humán relaxin kinyerésére. Az ilyen technikák közt találjuk a gélszűrést, az ioncserélő kromatográfiát vagy a fordított fázisú HPLC-t.
A tisztítási folyamatra egyik példa a reakció felülúszóinak, amelyek összesen 0,5-1 g relaxin peptidet tartalmaznak, ráterhelése 15-20 mikronos Vydac C4 300 Á (5x50 cm) oszlopra. A tisztítást úgy érjük el, hogy 20-40% acetonitril-gradienst (0,5% változás/perc) alkalmazunk 1% TFA-t (trifluor-ecetsav) tartalmazó H2O-ban. Az átáramlási sebesség 20 ml/perc, és 0,1 percenként szedünk frakciókat. Ezeket izokratikusan követjük 25%-os acetonitrilben (1% TFA-t tartalmazó H2O-ban) analitikai (5 mikronos) Vydac C4 300 Á oszlopon (4,6x250 mm). A fő teiméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és további elemzéshez liofí lezzük.
A humán relaxint és humán relaxin-analógokat biológiai vizsgálatokban értékeljük. Az egér ágyéki szimfízis-vizsgálat (MPS) Charles River hím albínó CFW egereket (18-20 g tömeg) alkalmaz [St. Louis J.: Can.
HU 205 948 Β
J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512 (1981)]. Az ösztradiol beindító oldat 5 pg ösztradiol-17 β-ciklapentilpropionát 0,1 ml földimogyoró olajban. A humán relaxin adagok oldatai 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; és 80,0 pg/ml koncentrációjúak benzopurin 4B 1%-os vizes oldatában. Amikor az egerek már legalább hat napot karanténban töltöttek, és 18-20 g tömegűek, mindegyikük megkapja szubkután injekció formájában az ösztradiol beindító oldatot. Pontosan két nappal később az egereket szubkután injektáljuk a megfelelő humán relaxin dózis 0,2 ml-es oldatával. A humán relaxin injektálását követő 18-20 óra között az egereket a nyakcsigolya kicsavarásával elpusztítjuk. Az ágyék közti ínszalagot feltárjuk és mikrométerrel megmérjük.
Charles River, albínó, Sprague-Dawley eredetű nőstény patkányokat (200-300 g tömegűek) alkalmazunk a patkány méh-összehúzódási vizsgálathoz. Az ösztradiol beindító oldat 200 pg ösztradiol 17-ciklopentilpropionát 0,1 ml földimogyoró olajban. A humán relaxin törzsoldat 0,1 mg/ml koncentrációjú, steril injekciós vízben (Invenex). Amikor a patkányok már legalább hat napot karanténban töltöttek, mindegyikük megkapja szubkután injekció formájában az ösztradiol beindító oldatot. Az ösztradiol injekció beadásától számított 1620 óra múlva a patkányokat széndioxidos fullasztással elpusztítjuk. A méheket kivágjuk, a végeket levágjuk, és oldalról felvágjuk, egy állat méhéből négy darabot készítve. Minden szövetet vízköpennyel ellátott fürdőben szuszpendálunk, a fürdő 37 °C hőmérsékletű, és 35 ml levegőztetett Holman-féle Ringer-oldatot tartalmaz. A szövetet összehúzódásra késztetjük olyan módon, hogy a Ringer-oldatot olyan oldattal helyettesítjük, amelyben a 20% nátrium-klorid ekvimoláris mennyiségű kálium-kloriddal van helyettesítve. Miután állandósult szintet értünk el, különböző relaxinkoncentrációkat adunk a fürdőhöz. A standard görbe felvételéhez sertés relaxin különböző adagjait adjuk a fürdőhöz, ezek a következők: 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 6,4; és 12,8 pg relaxin 35 ml fürdőben.
A méhnyakérés humán relaxin által előidézett indukcióját vizsgáljuk nem-ember főemlős terhességében. A humán relaxint pároztatott Rhesus majmokban vizsgáljuk a 130. és 160. napok közti vemhességi korban. A vemhességi időtartam a csoportban 168 ±6 nap. Az állatokat hozzászoktatjuk, hogy kabátot viseljenek pányvákkal. A pányvázott kabátok lehetővé teszik vagy a combcsonti véredényekbe vagy a nyaki és belső nyaki véredényekbe elhelyezett bent maradó katéterek folyamatos hozzáférhetőségét. A legtöbb állatban nyomásátalakítót helyezünk el az amnion-tömlőn belül, és elektródok kapcsolódnak a méh felületére, lehetővé téve a méhen belüli összehúzó aktivitás mérését. A relaxint folyamatos intravénás (IV) infúzióként adjuk be egy órán át, vérmintákat veszünk a korábbiak szerint az infúzió során és utána 15 perces időközönként az első órán át az infúziót követően, majd szabályosan 24 óránként. A relaxin adagjai a 10 pg és 100 pg közti tartományban vannak, és a méhnyak állapotát pontozzuk szöveti állagra, satnyulásra, helyzetre, tágulásra és az embrió elhelyezkedésére a méhnyakhoz viszonyítva. A legtöbb esetben két vizsgáló vizsgálja az egyes méhnyakakat, és egymástól függetlenül pontoznak. A kontrollok olyan majmok, amelyek hasonló beavatkozáson mentek át, de fiziológiás sóoldattal kaptak infúziót, vagy olyan majmok, amelyek a közösségben maradtak, de nem mentek át a méhnyak-vizsgálatok hetenként végzett műveletein.
Western-foltképzést és poliakrilamid gél elektroforézist hajtunk végre, hogy a fehérjét izoláljuk. Kis molekulatömegű, 15%-os poliakrilamidot, karbamidot és lap-géleket alkalmazunk a Bethesda Research Laboratories által kibocsátott ismertetőben a molekulatömeg-standardokhoz megadott eljárást követve. Ennek az eljárásnak számos módosítását alkalmazzuk. A géleket hideg szobában +4 °C hőmérsékleten futtatjuk 15 órán át 100 Volt állandó értéken. A mintákat 10 mmól/1 nátrium-foszfátot (pH 7,2), 7 mól/liter karbamidot, 0,01% brómfenolkéket és redukált mintáknál 50 mmól/1 frissen készített DTT-t tartalmazó oldatban készítjük. A teljes pepiidből 1-10 pg-ot 90 °C hőmérsékleten inkubálunk 2-3 percig a ráterhelés előtt. A géleket Coomassie Blue-val [a géleket 1,5 órán át áztatjuk olyan keverékben, amely 10 ml ecetsavat és 90 ml (0,25%-os tömeg/térfogat alapon) Coomassie Blue R-250-et (25%-os etanolban) tartalmaz]; ezüst festéssel [Oakley B. R. és munkatársai: Analytical Biochein. 105, 361-363 (1980)], miután rögzítjük és festékmentesítjük 0,2% formaldehidet, 20% etanolt és 6,2% ecetsavat (mind térfogat/térfogat értékek) tartalmazó oldatban 15-30 percen át; valamint Westemelemzéssel [Towbin H. és munkatársai: PNAS, 76, 4350-4354 (1979)] tesszük láthatóvá.
Az A- és B-láncokra fajlagos antitesteket váltunk ki, új-zélandi fehér nyulakat immunizálva szabad peptidekkel, vagy timsóval kicsapott formában, vagy Freund-féle adjuvánsban, amint ezt Eddie L. W. és munkatársai leírták [The Láncét /, 1344-1346 (1986)]. Atiterek lényegében azonosak, és az antiszérumokat az egyes immunizálásokból összegyűjtjük bb titerrel az A-láncoknál és ccc titerrel a B-láncoknál. Ezeket 500szoros hígításban alkalmazzuk az inkubálásban nitrocellulóz szűrőkön 2 órától egy éjszakán át terjedő időtartományon belül. A mosott szűrőket azután 125I A fehérjével inkubáljuk 2 órán át, szárítjuk, és röntgensugár-filmre helyezzük.
A jelen találmány szerinti módszer illusztrálására az alábbi példákat adjuk meg. Ezek az itt felsorolt példák csak a bemutatás célját szolgálják, és nem akarják korlátozni a jelen találmány oltalmi körét.
1. példa
Természetes humán relaxin
H2(B33 A24) mg liofilizett por alakú redukált relaxin A-láncot 1 ml desztillált vízben oldunk, az oldatot egy 10 ml-es fiolába visszük, majd szobahőmérsékleten fokozatosan hozzáadjuk 5,63 mg Iiofilezett por alakú relaxin B-lánc ml olyan vizes oldattal külön elkészített oldatát, amely a reakcióelegy 2 rríl végső térfogatára számítva 0,1 mól/1 glicint, 2,5 mmól/1 DDT-t, 3 tf% propan-16
HU 205 948 B olt, I mmól/1 etilén-diamin-tetraécetsavat, 3 tf% acetonitrilt és 1 mól/1 karbamidot tartalmaz.
A pH-értéket nátrium-hidroxiddal 10,5-re állítjuk be, és a reakcióelegyet nyitott edényben szobahőmérsékleten 28 órán át keverjük. A relaxin képződését analitikai fordított fázisú HPLC-vel követjük, és a fentebb leírtak szerint állítjuk le. Az elemzés nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) 1,87 mg hozamot vagy 19,5% B-lánc beépülést jelez.
A keveréket preparatív RP-4 fordított fázisú HPLCvel (1x25 cm; RP-4 Synchropak 300A) tisztítjuk. A csúcsot összegyűjtjük és közvetlenül a HPLC-oldószerből használjuk fel. A humán relaxint egészen tisztának ítéljük meg poliakrilamidgél-elektroforézissel, aminosav-elemzéssel, HPLC-vel, aminoterminális szekvenciaelemzéssel és biológia értékméréssel,
2. példa
Humán relaxin-analóg
H2(B33 A24)BLysJ BAla23
Redukált humán relaxin A-láncot (200 mg) feloldunk 40 ml H2O-ban (pH 2,0). Redukált humán relaxin B láncot (B33 BLys4BAla23) (100 mg) feloldunk 20 ml H2O-ban (pH 2).
Az A- és B-lánc analóg-oldatokat 165 ml-es üvegedényben egyesítjük szobahőmérsékleten (~25 °C), először az A-láncot adva be, majd ezt követően a módosított B-láncot az előbbiekben elkészített vizes, pH 2 értékű törzsoldatokból. A reakciót RP-4 fordított fázisú HPLC-vel követjük a kombinált humán relaxin-analóg maximális képződését figyelve. Ehhez a humán relaxin-analóghoz a következő körülményeket alkalmazzuk a jelen találmánnyal összhangban: 0,1 mól/1 triszt (pH 8,0), 1 mmól/1 EDTA-t, 2 mmól/1 DTT-t tartalmazó reakcióközeg („B”), 24 °C hőmérséklet. A reakciókeveréket élénken keverjük levegőn, nyitott edényben. A kombinálási reakciót jégecet hozzáadásával állítjuk le, pH 4 értéket állítva be.
A keveréket preparatív HPLC-vel tisztítjuk [Vydac C4 300 A° (5x50 cm)]. A humán relaxin-analóg csúcsot (elúciós térfogat: mintegy 140 ml) összegyűjtjük és liofilezzük; 35 mg relaxint nyerünk ki, vagyis 20,3% B-lánc beépülést érünk el. A humán relaxin-analógot egészen tisztának ítéljük meg poliakrilamid gélelektroforézissel, aminosav-elemzéssel, amino-terminális szekvenciaelemzéssel, HPLC-vel (lásd 2A ábra) és biológiai értékméréssel.
3. példa
Humán relaxin-analóg
H2(B2-33 A24)BLys4BAla25
Redukált humán relaxin A-láncot (41,5 mg) feloldunk 8 ml H2O-ban (pH 2,0). 23 mg redukált humán relaxin B-láncot (B2-33 BLys4BAla2S), amelyről az első aminosav ki van iktatva az amino-terminálisról, feloldunk 4 ml H2O-ban (pH 2).
Az A- és B-lánc analóg oldatokat egyesítjük egy 33 ml-es üvegedényben szobahőmérsékleten (-25 °C), először az A-láncot adva be, majd ezt követően a módosított B-láncot az előbbiekben előkészített vizes, pH 2 értékű törzsoldatokból.. A pH-t 8,0-ra állítjuk be NaOH-val. A reakciót RP-4 fordított fázisú HPLC-vel követjük a kombinált humán relaxin-analóg maximális képződését figyelve. Ehhez a humán relaxin-analóghoz a következő körülményeket alkalmazzuk a jelen találmánnyal összhangban: 0,1 mól/1 trisz (pH 8) reakcióközeg („D”); 25 °C; öblítés N2-vel, és keverés N2 atmoszférában az első 1-2 órában. A reakciókevéréket ezután élénken keverjük levegőn, nyitott edényben. A kombinálási reakciót jégecet hozzáadásával állítjuk le, pH 4 értéket állítva be.
A keveréket preparatív HPLC-vel tisztítjuk [Vydac C4 300 A (5x80 cm)]. A humán relaxin-analóg csúcsot (elúciós térfogat: mintegy 140 ml) összegyűjtjük és liofilezzük; 16 mg humán relaxin-analógot nyerünk ki, vagyis 40,3% B-lánc beépülést érünk el. A humán relaxin-analógot egészen tisztának ítéljük meg poliakrilamid gélelektroforézissel, aminosav-elemzéssel, amino-terminális szekvenciaelemzéssel, HPLC-vel (lásd 2A ábra) és biológiai értékméréssel.
4. példa
Humán relaxin-analóg
H2(B2-33 A24)APir°-G1y'BL>s4BAla23
Redukált humán relaxin A-láncot (41,5 mg) feloldunk 8 ml H2O-ban (pH 2,0). 23 mg redukált humán relaxin B-láncot (B2-33 BLys4BAla2S), amelyből az első aminosav az aminosav-terminálisról ki van iktatva, feloldunk 4 ml H2O-ban (pH 2).
Az A- és B-lánc analóg-oldatokat egyesítjük egy 33 ml-es üvegedényben szobahőmérsékleten (-25 °C), először az A-láncot adva be, ezt követően a módosított B-láncot az előbbiekben elkészített vizes, pH 2 értékű törzsoldatokból. A pH-t 8,0-ra állítjuk be NaOHval. A reakciót RP-4 fordított fázisú HPLC-vel követjük a kombinált humán relaxin-analóg maximális képződését figyelve. Ehhez a humán relaxin-analóghoz a következő körülményeket alkalmazzuk a jelen találmánnyal összhangban: 0,1 mól/1 trisz (pH 8) reakcióközeg („D”); 25 °C; öblítés N2-vel és keverjük N2 atmoszférában az első 1-2 órában. A reakciókeveréket ezután élénken keverjük levegőn, nyitott edényben. A kombinálási reakciót jégecet hozzáadásával állítjuk le, pH 4 értéket állítva be.
A keveréket praperatív HPLC-vel tisztítjuk [Vydac C4 300 A (5x80 cm). A relaxin-analóg csúcsot (elúciós térfogat: mintegy 140 ml) összegyűjtjük és liofilezzük;
7,5 mg humán relaxin-analógot nyerünk ki, vagyis 19,8% B-lánc beépülést érünk el. A relaxin-analógot egészen tisztának ítéljük meg poliakrilamid gélelektroforézissel, aminosav-elemzéssel, az amino-terminális szekvencia elemzésével, HPLC-vel (lásd a 2A ábrát) és a biológiai értékméréssel.
5. példa
Humán relaxin-analóg
H2(B33 A24)APir°-Gly'BL>'s'!BAla23
Redukált humán relaxin A-láncot (200 mg) feloldunk 40 ml H2O-ban (pH 2,0). 100 mg redukált relaxin
HU 205 948 Β
B-láncot (B33Bl-vsJBai·®') feloldunk 20 ml H,O-ban (pH 2).
Az A- és B-lánc analóg-oldatokat egyesítjük egy 165 ml-es üvegedényben szobahőmérsékleten -25 ’C), először az A-láncot adva be, ezt követően a módosított B-láncot az előbbiekben elkészített vizes, pH 2 értékű törzsoldatokból. A pH-t 8,0-ra állítjuk be NaOH-val. A reakciót RP-4 fordított fázisú HPLC-vel követjük, a kombinált humán relaxin-analóg maximális képződését figyelve. Ehhez a humán relaxin-analóghoz a következő körülményeket alkalmazzuk a jelen találmánnyal összhangban: 0,1 mól/1 glicinátot (pH 8), 1 mmól/1 EDTA-t és 2 mmól/1 DTT-t tartalmazó reakcióközeg („B”), 24 ’C. A reakciókeveréket élénken keverjük levegőn, nyitott edényben. A kombinálási reakciót jégecet hozzáadásával állítjuk le, pH 4 értéket állítva be.
A keveréket preparatív HPLC-vel tisztítjuk [Vydac C4 300 A (5x50 cm)]. A humán relaxin-analóg csúcsot (eluálási térfogat: mintegy 140 ml) összegyűjtjük és liofilezzük; 16 mg relaxint nyerünk ki, vagyis 9,3% B-lánc beépülést érünk el. A humán relaxin-analógot egészen tisztának ítéljük meg poliakrilamid gélelektroforézissel, aminosav-elemzéssel, amino-terminális szekvenciaelemzéssel, HPLC-vel (lásd 2A ábra) és a biológiai értékméréssel.
A fenti 1-5. példában leírt új eljárást az így előállított relaxin elérhető hozama szempontjából a 4 758 516 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett (az inzulin hasonló módon, az Aés B-lánc kapcsolásával történő előállítási eljárását követő) relaxin-előállítási eljárással hasonlítjuk össze. Ezzel az eljárással a szerzők a leírás (16. hasáb 11. sortól) legfeljebb 1,5 és 6,0% közötti hozamot értek el. Ezzel szemben a fenti 1-5. példa szerint 19,5%, 20,3%, 40,3%, 18,9%, illetőleg 9,3% hozamot kaptunk, ami az ismert eljárás hozamát többszörösen felülmúlja.
6. példa
Biológiai értékmérések
A patkány méhösszehúzódás in vitro biológiai mérése a humán relaxinnak azt a képességét méri, hogy elernyeszti a sima izmot elektromosan stimulált összehúzódások jelenlétében [St. Louis J.: Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512 (1989)]. A rágcsáló ágyéki szimfizis ínszalag in vivő biológiai mérése a relaxin átalakító hatását méri a kötőszövetekre [Steinetz B. G. és munkatársai: Endocrinology 67, 102 (1960)]. A H2(B2-33 A24); H2(B32 A24)BLys'‘BA!a2'1; H2(B33 A24)BLys4BAla1', valamint a fentebb említett piro-Glu formák, mint a H2(B2-33 A24)B1-y-,JBAl!,1'Apir°-Glyl é.s H2(B33 A24)BLys'‘BAI;'25Apiro'Glyl biológiai dózisválasz összehasonlításai biológiai aktivitást jeleznek mind az MPS-, mind a RUC-vizsgálatokban. A humán relaxinanalóghoz és humán relaxinhoz tartozó MPS-adatokat a 3. ábra mutatja be.
Az MPS-dózisválaszok azonos értékűségct jeleznek a humán relaxinhoz és a H2(B2-33 A24)Blys'‘BAla1'höz (3. ábra). A sertés relaxin azonban, úgy tűnik, nem ad párhuzamos választ a többi relaxinokhoz iviszonyít8 va. Az összes humán analógok és természetes szekvenciáját humán relaxinok lényegében megkülönböztethetetlenek az MPS biológiai vizsgálatban.
A rendelkezésre álló tisztított H2(B33 A24) mennyisége miatt csak a dózistartomány felső végénél tudunk összehasonlítást végezni. Az eredmények megalapozzák az aktivitás hasonlóságát a natív humán relaxinhoz és a humán relaxin-analóg formáihoz. A humán relaxin dózisválasz-görbe meredeksége különbözhet az analógok hasonló görbéitől.
Az RUC biológiai mérésben a humán relaxin és a humán relaxin-analógok meredekségei azonosak.
7. példa
Humán relaxin főemlős terhességben
Két humán relaxin-analógot [H2 (B33 A24)BLys4BAla“ és H2 (B2-33 A24)BLysJBAla25] vizsgálunk pároztatott Rhesus majmokban a 130. és 160. napok közti vemhességi korban a korábban ismertetett módszereket alkalmazva.
Módosított Bishop-féle pontozást alkalmazva a megfigyelt paraméterekhez, az átlagos méhnyaki változás 7 különböző adagit infúziónál 3,7 egység. Ezeket az adatokat a 4. ábrában adjuk meg, ahol a 100, 50 és 10 pg-os adagokkal végzett egyes infúziókat mutatjuk be, valamint minden további 10pg-os infúzió átlagát és a kontroll két fajtáját. Megjegyzendő, hogy az infúziónak alá nem vetett kontroll majmok 2-15 meghatározást jelentenek pontonként (kivéve két pontot, ahol legalább 4 majmot tekintünk reprezentatívnak), és az átlag van berajzolva. Általában a méhnyak érzékenyebb a relaxin kisebb adagjaira ahogy a terhesség előrehalad, vagy a relaxin ismételt beadására ennek a periódusnak a korai szakaszában. A relaxin nagy adagjai (100 vagy 50 pg) képesek jelentős változást elérni a méhnyakérésben (a pontozásban 1-10 értékű válotozást indukálva), még a terhesség viszonylag korai szakaszában is (130-140. napok). A méhnyaki változások, úgy tűnik, függetlenek bármilyen megegyező változástól a méh elektromiográfiás aktivitásában vagy a méhen belüli nyomásban. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a kombinált humán relaxin nagyon hatásos a méhnyak érésének előidézésében főemlősökben a terhesség utolsó harmadában.
A jelen találmány szerinti humán relaxint és humán relaxin-analógokat ismert módszereket alkalmazva lehet kiszerelni, hogy gyógyászatilag hasznos kompozíciókat kapjunk, pl. olyanokat, amelyekben humán relaxin vagy analógja gyógyászatilag elfogadható hordozóval van összekeverve. A megfelelő hordozók és készítményeik, beleértve egyéb szükséges emberi fehérjéket, pl. humán szérum albumint, különböző szabványos készítményekről szóló tanulmányokban vannak leírva, pl. a „Remington’s Pliarmaceutical Sciences” c. kiadványban (szerkesztő: Martin E. W.).
A leírásban alkalmazott rövidítések:
TFA: tri fi uör-ecetsa v EDTA: etilén-diamin-telraecetsav DTT: ditio-treitol
MPS: egér ágyéki szimfízis-vizsgáiat
HU 205 948 B
HPLC: nagynyomású folyadékkromatográfia
Rövidítések a rajzokon:
SEM: kísérleti hibahatár (3. ábra)
L., F. és E.: a kísérletben alkalmazott majmok megjelölése (4. ábra)
Claims (13)
1. Eljárás humán relaxin és relaxin aktivitást mutató analógjai, előnyösen a H2(B33 A24(BLys4BAla25 H2(B233 A24) BLys4BAla“, H2(B2-33 A24)APir°-Gly'BLys4BAla25, és H2(B33 A35(Apir<>Gly'BLys4BAla2S relaxin-analógok előállítására, a humán relaxin vagy relaxin-analóg Aláncának és a humán relaxin vagy relaxin-analóg B-láncának kapcsolása útján, azzal jellemezve, hogy az Alánc redukált, szabad ciszteincsoportú alakját oxigéntartalmú atmoszférában 7,0 és 12 közötti pH-értékű vizes közegben reagáltatjuk a B-lánc redukált, szabad ciszteincsoportú alakjával, kívánt esetben enyhe denaturáló szer, előnyösen karbamid és vízzel elegyedő szerves oldószer jelenlétében.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán relax in-2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a természetes H2 humán relaxinnak megfelelő redukált A-lánc és redukált B-lánc kapcsolását enyhe denaturáló szer jelenlétében végezzük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás H2(B33 A24) gLys^Aia23 előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, redukált A- és B-láncot alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás H2(B2-33 A24) BLys4gAiaa előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, redukált A- és B-láncot alkalmazzuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás H2(B2-33 A24) y^piro-GiylgLys',gAia előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, redukált A- és B-láncot alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás H2(B33 A24) ^piro-Giu'gLys4gAia25 előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, redukált A- és B-láncot alkalmazzuk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált A-láncot, illetőleg a redukált B-láncot tartalmazó oldatokat 15 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten elegyítjük egymással.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált A-láncot, illetőleg a redukált B-láncot tartalmazó oldatokat szobahőmérsékleten elegyítjük egymással.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált relaxin A-láncot a redukált B-lánchoz viszonyítva ekvimolekuláris menynyiségben vagy feleslegben alkalmazzuk.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-láncot a B-lánchoz viszonyítva 1 : 0,5 és 3,0 : 1 közötti tömegarányban alkalmazzuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A-láncot a B-lánchoz viszonyítva 1: 1 és 2,5: 1 tömegarányban alkalmazzuk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a reakcióközeg térfogatára számítva 0,1 mg/ml és 10 mg/ml közötti relax inkoncentrációval dolgozunk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióközeg térfogatára számítva 0,5 mg/ml és 5 mg/ml közötti relaxinkoncentrációval dolgozunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/877,819 US4835251A (en) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | Method of chain combination |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT44045A HUT44045A (en) | 1988-01-28 |
| HU205948B true HU205948B (en) | 1992-07-28 |
Family
ID=25370787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU872804A HU205948B (en) | 1986-06-23 | 1987-06-19 | Process for producing human relaxin and theyr analogues of the same activity |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4835251A (hu) |
| EP (1) | EP0251615B1 (hu) |
| JP (1) | JP2529693B2 (hu) |
| KR (1) | KR960007604B1 (hu) |
| CN (1) | CN1029784C (hu) |
| AU (1) | AU617291B2 (hu) |
| CA (1) | CA1336223C (hu) |
| DE (1) | DE3783273T2 (hu) |
| DK (1) | DK173649B1 (hu) |
| HU (1) | HU205948B (hu) |
| IE (1) | IE59683B1 (hu) |
| IL (1) | IL82921A (hu) |
| PH (1) | PH23407A (hu) |
| PT (1) | PT85134B (hu) |
| ZA (1) | ZA874482B (hu) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| EP0470976B1 (en) * | 1989-05-04 | 1993-03-31 | Genentech, Inc. | Processes and compositions for the isolation of human relaxin |
| US5166191A (en) * | 1991-08-19 | 1992-11-24 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in cardiovascular therapy |
| US5478807A (en) * | 1991-08-19 | 1995-12-26 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in the treatment of bradycardia |
| US5911997A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-15 | Connetics Corporation | Relaxin-like factor and methods and uses thereof |
| US5612051A (en) * | 1995-11-17 | 1997-03-18 | Yue; Samuel K. | Method of treating involuntary muscle dysfunction with relaxin hormone |
| US6709659B1 (en) * | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
| US5994148A (en) * | 1997-06-23 | 1999-11-30 | The Regents Of University Of California | Method of predicting and enhancing success of IVF/ET pregnancy |
| US6251863B1 (en) | 1998-09-08 | 2001-06-26 | Samuel K. Yue | Method of preventing and treating symptoms of aging and neurodegenerative dysfunctions with relaxin |
| US20050032683A1 (en) * | 2000-10-04 | 2005-02-10 | Amento Edward P. | Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists or antagonists |
| US20050186526A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-08-25 | Bas Medical, Inc. | Methods and systems for enabling and stabilizing tooth movement |
| AU2003903124A0 (en) * | 2003-06-20 | 2003-07-10 | Mark Del Borgo | Analogues of heteromeric proteins |
| JP4836942B2 (ja) * | 2004-04-30 | 2011-12-14 | コーセラ， インコーポレイテッド | リラキシンの調節による胎仔の発育の制御のための方法および組成物 |
| US20060052304A1 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Bas Medical, Inc. | Method for remodeling bone and related sutures |
| WO2007115414A1 (en) * | 2006-04-11 | 2007-10-18 | University Of Guelph | Modified h2 relaxin for tumor suppression |
| GR1006759B (el) * | 2008-12-22 | 2010-04-20 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras) | Εξελιγμενη χημικη μεθοδος συνθεσης της ανθρωπινης ρηλαξινης |
| GR1006941B (el) | 2009-06-01 | 2010-08-27 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Πεπτιδικη συνθεση (peptide synthesis) |
| GR1007010B (el) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Ινσουλινοειδη πεπτιδια |
| CA2808596C (en) | 2010-08-17 | 2020-12-15 | Ambrx, Inc. | Modified relaxin polypeptides and their uses |
| WO2013177529A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Angion Biomedica Corp. | Relaxin-like compounds and uses thereof |
| US9381231B2 (en) | 2012-10-09 | 2016-07-05 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of relaxin to restore maternal physiology in pregnancies conceived by assisted reproductive technologies |
| JP6289937B2 (ja) * | 2014-02-27 | 2018-03-07 | 学校法人東海大学 | リラキシンの製造方法 |
| EP2946788A1 (en) | 2014-05-23 | 2015-11-25 | Immundiagnostik AG | Method and composition for treating heart failure with preserved ejection fraction |
| US20190038713A1 (en) | 2015-11-07 | 2019-02-07 | Multivir Inc. | Compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer |
| EP3551226A1 (en) | 2016-12-12 | 2019-10-16 | MultiVir Inc. | Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases |
| WO2020036635A2 (en) | 2018-03-19 | 2020-02-20 | Multivir Inc. | Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer |
| CN114174348A (zh) | 2019-07-31 | 2022-03-11 | 伊莱利利公司 | 胰岛素类似物及其使用方法 |
| WO2021113644A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Multivir Inc. | Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4421685A (en) * | 1980-03-27 | 1983-12-20 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin |
| ZA811970B (en) * | 1980-03-27 | 1982-11-24 | Lilly Co Eli | Process for producing an insulin |
| US4656249A (en) * | 1982-06-10 | 1987-04-07 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Peptides with relaxin activity |
| EP0287820B1 (en) * | 1982-08-12 | 1992-07-08 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Human relaxin analogues |
| AU562962B2 (en) * | 1982-08-12 | 1987-06-25 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Molecular cloning and characterisation of the gene sequence coding for human relaxin |
| AU562713B2 (en) * | 1982-12-13 | 1987-06-18 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Cloning for human relaxin |
| IL70414A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-10 | Florey Howard Inst | Polypeptide having human h2-relaxin activity,double-stranded dna fragments coding therefor,vectors containing the dna fragments and methods for preparing the polypeptide,dna fragments and vectors |
-
1986
- 1986-06-23 US US06/877,819 patent/US4835251A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-19 HU HU872804A patent/HU205948B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 DK DK198703130A patent/DK173649B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 IL IL82921A patent/IL82921A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 PH PH35432A patent/PH23407A/en unknown
- 1987-06-22 ZA ZA874482A patent/ZA874482B/xx unknown
- 1987-06-22 PT PT85134A patent/PT85134B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 IE IE165587A patent/IE59683B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 DE DE8787305508T patent/DE3783273T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 EP EP87305508A patent/EP0251615B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 KR KR1019870006320A patent/KR960007604B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-23 CN CN87104447A patent/CN1029784C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-23 JP JP62156391A patent/JP2529693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-23 AU AU74620/87A patent/AU617291B2/en not_active Expired
- 1987-06-23 CA CA000540413A patent/CA1336223C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1029784C (zh) | 1995-09-20 |
| EP0251615A3 (en) | 1989-12-13 |
| DK173649B1 (da) | 2001-05-21 |
| ZA874482B (en) | 1989-02-22 |
| DK313087A (da) | 1987-12-24 |
| DE3783273D1 (de) | 1993-02-11 |
| EP0251615B1 (en) | 1992-12-30 |
| PH23407A (en) | 1989-07-26 |
| US4835251A (en) | 1989-05-30 |
| CN87104447A (zh) | 1988-02-10 |
| JP2529693B2 (ja) | 1996-08-28 |
| HUT44045A (en) | 1988-01-28 |
| IL82921A (en) | 1992-01-15 |
| IE871655L (en) | 1987-12-23 |
| DE3783273T2 (de) | 1993-05-27 |
| DK313087D0 (da) | 1987-06-19 |
| EP0251615A2 (en) | 1988-01-07 |
| AU7462087A (en) | 1987-12-24 |
| CA1336223C (en) | 1995-07-04 |
| KR960007604B1 (ko) | 1996-06-07 |
| JPS6366198A (ja) | 1988-03-24 |
| PT85134B (pt) | 1990-03-30 |
| AU617291B2 (en) | 1991-11-28 |
| PT85134A (en) | 1987-07-01 |
| KR880000463A (ko) | 1988-03-26 |
| IE59683B1 (en) | 1994-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU205948B (en) | Process for producing human relaxin and theyr analogues of the same activity | |
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| EP0177819B1 (en) | Growth hormone releasing factor analogs and process therefore | |
| US8106017B2 (en) | Peptides for promoting hair growth and improving wrinkle and cosmetic compositions comprising the same | |
| US5023321A (en) | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin | |
| Weidemann et al. | Cloning and sequence analysis of cDNA for precursor of a crustacean hyperglycemic hormone | |
| US6025467A (en) | Parathyroid hormone derivatives and their use | |
| HU200192B (en) | Process for production of grf-analog-peptides | |
| US4871670A (en) | Molecular cloning and characterization of a gene sequence coding for human relaxin | |
| AU636301B2 (en) | Cyclic grf-analogs ii | |
| EP0542937A1 (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| NZ206534A (en) | Molecular cloning and characterisation of gene sequence coding for human relaxin | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| NZ209357A (en) | Polypeptides,(44 amino acid residue) having growth hormone releasing properties; growth promoting compositions | |
| JPH0273100A (ja) | 医薬用化合物 | |
| HU199508B (en) | Process for producing grf analogues and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| US5179195A (en) | Human relaxin polypeptides | |
| JPS63122699A (ja) | ペプチド | |
| IE842199L (en) | Grf and analogs | |
| US5145962A (en) | Human pro relaxin polypeptides | |
| AU8237187A (en) | Derivatives of atrial natriuretic peptides | |
| US5320953A (en) | Process for synthesizing human H1-prorelaxin, H1-relaxin and fusion proteins thereof | |
| JP2715472B2 (ja) | 環式ペプチド | |
| JPH0393796A (ja) | Ｇｈｒｈ類似化合物 | |
| IE58669B1 (en) | Molecular cloning and characterization of a gene sequence coding for human relaxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |