DK173649B1 - Fremgangsmåde til kædekombination til fremstilling af biologisk aktivt humant relaxin eller analoge deraf - Google Patents
Fremgangsmåde til kædekombination til fremstilling af biologisk aktivt humant relaxin eller analoge deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK173649B1 DK173649B1 DK198703130A DK313087A DK173649B1 DK 173649 B1 DK173649 B1 DK 173649B1 DK 198703130 A DK198703130 A DK 198703130A DK 313087 A DK313087 A DK 313087A DK 173649 B1 DK173649 B1 DK 173649B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- chain
- relaxin
- human relaxin
- process according
- human
- Prior art date
Links
- BJRCFZKVYNDCJE-WBSNEMHCSA-N 99489-95-9 Chemical compound C([C@@H]1NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N2)[C@@H](C)CC)=O)CSSC[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC1=O)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)C(C)C)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 BJRCFZKVYNDCJE-WBSNEMHCSA-N 0.000 title claims description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 108090000103 Relaxin Proteins 0.000 claims description 43
- 102000003743 Relaxin Human genes 0.000 claims description 41
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 24
- 101500024628 Homo sapiens Relaxin B chain Proteins 0.000 claims description 15
- 101500024640 Homo sapiens Relaxin B chain Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 101500024627 Homo sapiens Relaxin A chain Proteins 0.000 claims description 10
- 101500024645 Homo sapiens Relaxin A chain Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 claims description 6
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 claims description 6
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 claims description 5
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 11
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 9
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- -1 N-t-butyloxycarbonyl amino Chemical class 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 5
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001091088 Homo sapiens Prorelaxin H2 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N Estradiol Cypionate Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H](C4=CC=C(O)C=C4CC3)CC[C@@]21C)C(=O)CCC1CCCC1 UOACKFBJUYNSLK-XRKIENNPSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012891 Ringer solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000049116 human RLN2 Human genes 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- RZLZXKPCGOYHPS-UHFFFAOYSA-N 3h-dithiole;ethanol Chemical compound CCO.C1SSC=C1 RZLZXKPCGOYHPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- YVQRJFLHBROXON-UHFFFAOYSA-N Arthraxin Natural products C=12C(=O)C(O)=C(CC(O)C)OC2=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 YVQRJFLHBROXON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251128 Galeocerdo cuvier Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001091094 Homo sapiens Prorelaxin H1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000405425 Hura Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100034949 Prorelaxin H2 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 244000191761 Sida cordifolia Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N di-isopropyl sulphide Natural products CC(C)SC(C)C XYWDPYKBIRQXQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- SUXCALIDMIIJCK-UHFFFAOYSA-L disodium;4-amino-3-[[4-[4-[(1-amino-4-sulfonatonaphthalen-2-yl)diazenyl]-3-methylphenyl]-2-methylphenyl]diazenyl]naphthalene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(N=NC3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)N=NC=3C(=C4C=CC=CC4=C(C=3)S([O-])(=O)=O)N)C)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 SUXCALIDMIIJCK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004247 glycine and its sodium salt Substances 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000049117 human RLN1 Human genes 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N methylsulfanylethane Chemical compound CCSC WXEHBUMAEPOYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229940029258 sodium glycinate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetate Chemical compound [Na+].NCC([O-])=O WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/64—Relaxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/04—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for inducing labour or abortion; Uterotonics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i DK 173649 B1
Denne opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til kom-5 bination af humant relaxin A- og B-kæder eller humant re-laxin A- og B-kæde-analoge til dannelse af nyttige udbytter af biologisk aktivt humant relaxin eller biologisk aktiv humant relaxin-analog. Især angår opfindelsen kombinationen af de reducerede humant relaxin A- og B-kæder 10 eller analoge deraf under betingelser, som inkluderer en pH-værdi over ca. 7,0, og som er mildt denaturerende med hensyn til humant relaxin B-kæden. Disse betingelser tilvejebringer et miljø for dannelsen af biologisk aktivt humant relaxin eller en biologisk aktiv analog deraf ved, 15 at blandingen holdes ved en temperatur på fra omkring 15 til omkring 30 °C med gradvis udsættelse for luftoxygen under reaktionens forløb. Det humane relaxin eller de analoge deraf, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes ved en fremgangsmåde til frem-20 bringelse af fødsel under anvendelse af det humane relaxin eller den analoge deraf som det eneste aktive middel.
Humant relaxin er et ovarielt peptid, som er ansvarligt for omformning af fødselsvejen før parturitio og således letter fødselsprocessen; Hisaw, F.L., Pros. Soc. Exp.
25 Biol. Med. 23, 661-663 (1926); Schwabe, C. et al. Bio- chem. Biophys. Res. Comm. 7j>, 503-570 (1977); James, R. et al., Nature 267, 544-546 (1977). Selvom det overvejende er et graviditetshormon, er relaxin også blevet detek-teret i den ikke-gravide hun såvel som i hannen; Bryant-30 Greenwood, G.D., Endocrine Reviews 3, 62-90 (1982) og
Weiss, G., Ann. Rev. Physiol. 4_6, 43-52 (1984).
Aminosyresekvenserne af relaxin fra gris, rotte, tigerhaj, rødhaj og menneske er blevet fastslået. Hormonet be- 2 DK 173649 B1 står af to peptidkæder, betegnet som A og B, sammenføjet af disulfidbindinger med en intern disulfid løkke i A-kæden på en måde, som er analog med A-kæden i insulin. Imidlertid er en overraskende og vigtig forskel mellem 5 relaxin og de fleste andre peptidhormoner, inklusive insulin, den betydelige strukturvariation mellem arter.
F.eks. er grise-, rotte- og humant relaxin forskellige i over 50% af aminosyrepositionerne. Disse forskelle forklarer den ringe immunologiske krydsreaktivitet mellem lo relaxiner fra forskellige arter og også et antal af de iagttagne forskelle i deres specifikke biologiske aktivitet .
Anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi har ført til isoleringen og karakteriseringen af generne, som koder 15 for humane relaxiner; Hudson, P et al., Nature 301, 628-631 (1984) og Hudson, P. et al., The EMBO Journal 3, 233-2339 (1984). Analyse af nuclotidsekvensen fra cDNA og ge-nomiske kloner afslører, at den strukturelle organisation af humant relaxin inkludere et signalpeptid på 25 rester, 20 efterfulgt af en B-kæde på omkring 32-33 aminosyrer, et C-peptid på omkring 105 aminosyrer og en A-kæde på 24 aminosyrer. I tilfælde af humant relaxin afbryder en in-tron kodeområdet for C-peptidet. Den fysiologiske rolle af peptidet, som er betydeligt længere end insulins C-25 peptid, og arten af de enzymer, som er ansvarlige for fjernelse af C-peptidet fra enderne af A- og B-kæden, er uløste emner.
I tilfælde af humant relaxin er to separate gensekvenser blevet identificeret; ibid. Kun ét af disse gener (H2) 30 udtrykkes i ovariet under graviditet, og det er uklart, om det andet gen udtrykkes i et andet vævssted, eller om det repræsenterer et pseudo-gen. De to humane relaxinge-ner viser betydelig nucleotid- og aminosyre-homologi med 3 DK 173649 B1 hinanden, især i B- og C-peptidet. Imidlertid er der nogle bemærkelsesværdige områder af sekvensdivergens, især i det aminoterminale område af både A- og B-kæderne; se fig. 1. Den kendsgerning, at H2-relaxin syntetiseres og 5 udtrykkes i ovariet, tyder på, at dette er den sekvens, som er involveret i graviditetens fysiologi. I en nylig artikel i Peptides: Strukture and Function, Proc. Ninth American Peptide Symposium, Deber, C.M., Hruby, V.l. and Koppie, F.D. (eds.) (Pierce Chem. Co., 1985) afprøvede lo P.D. Johnston et al. syntetisk humant relaxin (H2) og visse humane relaxin-analoge for biologisk aktivitet. De definerede en relaxin-kerne, som er nødvendig for biologisk aktivitet, såvel som visse aminosyreudskiftninger af methionin, som ikke påvirkede biologisk aktivitet; ibid.
15 Fig. 1 sammenligner de kendte aminosyresekvenser af rela-xiner fra forskellige arter. Foruden de seks cystein-rester og flankerende glycinrester er kun isoleucinet i position 7 i B-kæden, argininet i positionerne 12 og 16, og leucinet i position 32 blevet bevaret. Cysteinresterne 20 er klart nødvendige for opretholdelse af den samlede bi-sulfidbindingskonfiguration; Blundell, T. et al. i Bigaz-zi M., Greenwood, F.C., Gaspari, F. (eds.) Biology of Relaxin and its Role in the Human, Excerpta Medica, Amsterdam, 1983) side 14-21. Artsvariationen i aminosyresekven-25 sen i de fleste positioner i relaxinmolekylet, dvs. i A-og B-kæderne, som udgør den aktive portion af relaxinpro-teinet, er betydelig. Dette er i udpræget kontrast til situtationen med praktisk taget alle andre peptidhormon-familier, inklusive insulin. Et andet træk i rela-30 xinstrukturen er den variation i længde, som ses i B-kædens amino- og carboxylterminale områder og i mindre grad i A-kædens aminoterminus.
4 DK 173649 B1
Den kemiske syntese af relaxin har været særlig vanskelig, stort set som resultat af den isolerede B-kædes usædvanlige opløseligheds- og strukturegenskaber; Tregear, G.W. et al. i Bigazzi, M., Greenwood, F.C. and 5 Gaspari, F. (eds.), Biology of Relaxin and its Role in the Human, (Excerpta Medica, Amsterdam, 1983), side 42-55.
Som omtalt ovenfor har humant relaxin og faktisk patte-dyrrelaxin almindeligvis nogen strukturel lighed med in-10 sulin. Både insulin og relaxin har inter- og intra-kæde-disulfidbindinger mellem de to kæder; James, R. et al Nature 267; 544 (1977) og Schwabe, C. and McDonald, J.R.
Science 197, 914 (1977). Det blev antaget at syntesestrategier, som blev anvendt med held for insulin, Busse, WD.
15 and Carpenter, F.H., Biochemistry _15, 1649 (1976), Kat- soyannis, P.G. et al., Biochemistry 6, 2656 (1967) og
Kung, Y.T. et al., Scientia Sinica JL5, 544 (1966), også ville være anvendelige på relaxin. Tregear, G. et al. i Relaxin, G.D. Bryant-Greenwood, Niall, H.D. and Green-20 wood, F.C. (eds.), Elsevier, New York, 1981, forsøgte at syntetisere relaxin under anvendelse af separat-kæde-forsøget under anvendelse af selektiv beskyttelse af cy-stein-sulfhydrylgrupperne. De fandt, at de syntetiske peptider, som blev fremstillet ved insulinmetoderne, hav-25 de detekterbare relaxin-lignende bioreaktivitet, men den specifikke aktivitet og kombinationsudbytterne var meget lave; ibid side 151. Én grund til de ringe kombinationsudbytter for svinerelaxin var uopløseligheden af svine-fuld-længde-B-kæden i opløsning ved pH 10,5. Tregear et 30 al., ovenfor, modificerede den tidligere insulinmetodologi i to henseender: ved udfældning af de blandede svine-relaxin-peptidkæder med acetone for at fjerne det reducerende middel; og ved tilsætning af 0,5M NaCl under oxidationstrinnet. Resultaterne var forbedrede udbytter af 5 DK 173649 B1 svinerelaxiner; se også EP patentansøgning publikation nr. 101 309 og EP patentansøgning publikation nr.
112 149.
Chance et al., US patentskrift nr. 4 421 685, udstedt den 5 20. december 1983, angiver en fremgangsmåde til fremstil ling af insulin eller en analog deraf ved at kombinere den S-sulfonerede form af insulin A- og -B-kæderne med et thiolreducerende middel i et vandigt medium under kontrolleret pH og temperatur, for således at udføre reduk-10 tions- og oxidationsreaktionerne i et enkelt trin. Selvom denne fremgangsmåde udgjorde en forbedring i forhold til den tidligere nævnte insulinsyntese, fandtes den ikke at være anvendelig til syntese af humant relaxin.
Det har nu vist sig, at der under specifikke reaktionsbe-15 tingelser kan produceres nyttige niveauer af humant relaxin eller analoge deraf ved kombinering af de reducerede kæder af humant relaxin under styrede betingelser. Det er således et formål for den foreliggende opfindelse at angive en fremgangsmåde til kombination af A- og B-kæderne 20 af huraantrelaxin, uanset deres oprindelse, f.eks. kemisk syntese eller rekombinant-DNA-teknologi, til fremstilling af nyttige udbytter af biologisk aktivt humant relaxin.
Et andet aspekt af opfindelsen er at tilvejebringe biologisk aktive analoge af humant relaxin.
25 SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN
Den foreliggende opfindelse er rettet mod en fremgangsmåde til kombinationen af en humant relaxin-A-kæde eller en analog deraf og en humant relaxin-B-kæde eller en analog deraf til fremstilling af biologisk aktivt humant relaxin 30 eller en humant relaxin-analog. Især omfatter fremgangsmåden kombinationen af den reducerede humane relaxin-A- 6 DK 173649 B1 kæde eller analog og den reducerede humane relaxin-B-kæde eller analog under betingelser, som inkluderer en pH-værdi på over ca. 7,0, der er mildt denaturerende med hensyn til den humane relaxin-B-kaede, og udførelse af re-5 aktionen med gradvis udsættelse for luftoxygen under reaktionens forløb.
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE
Fig. 1 viser manglen på homologi af humant relaxin Hl og H2 med humant insulin og svine (P)~ og rotte (R)-relaxi-10 ner. Nummereringsystemet er i forhold til H2-relaxin. Disulfiderne for relaxinerne er: A10-A15, All-Bll og A24-B23.
Fig. 2A viser HPLC-tidsforløbet for H2(B33 A24) sLys4 bA-la25- og fig. 2B for H2 (B33 A24) -profilen af in vitro kæ-15 dekombinationsreaktionen. Tidsforløbet af kombinationsreaktionen, som viser dannelsen af humant relaxin-analog eller humant relaxin og et potentielt vigtigt intra molekylært oxideret mellemprodukt af A-kæden, er beskrevet. Omdannelsen af gen-2 A- og B-kædepeptiderne til H2 humant 20 relaxin-analog og H2 humant relaxin er skitseret. Chroma-tografi under anvendelse af en Synchropak RP-C4 (4,6 x 250 mm; 300 Å) . En lineær gradient af acetonitril (15—>60% i løbet af 500 minutter) i en 0, 05% TFA, H;0-puffer løbende med 1 ml/min.
25 Fig. 3 viser bioaktiviteten (MPS) af kædekombineret humant gen-2 relaxin H2 (B2-33 A24) BLys4 uAla25 og naturligt humant relaxin.
Fig. 4 viser den modificerede Bishop score i primat efter indgivelse af forskellige doser af humant relaxin-analo-30 ge, H2 (B2-33 A24) BLys4 sAla25 og H2 (B33 A24) sLys4 fcAla25.
7 DK 173649 B1
DETALJERET BESKRIVELSE
I denne beskrivelse med krav henfører "humant relaxin" eller "humant relaxin-analog" til et funktionelt protein, som vides at omforme fødselsvejen for at lette fødsels-5 processen. Omformning af fødselsvejen forstås at inkludere sådanne fysiologiske funktioner som modning af cervix, fortykkelse af endometriet i den gravide uterus såvel som forøget vaskularisering til dette område, og indvirkning på collagensyntesen. Humant relaxin er også blevet fundet 10 i hunnens bryst og kan være forbundet med lactation. Humant relaxin er også blevet fundet i human sædvæske og kan forhøje mobiliteten af humane spermatozoer. I betragtning af relaxins virkning på cervix kan humant relaxin tænkes at forhøje spermas evne til at gennemtrænge 15 den humane cervix. Humant relaxin kan tænkes at forbedre hudelasticitet i betragtning af dets virkning på bindevæv.
Humant relaxin-analoge skal foruden den ovenfor beskrevne funktionelle definition forstås strukturelt at inkludere 20 et antal proteiner, som hvert har den grundlæggende struktur af humant relaxin, inklusive en A- og B-kæde.
Den humant relaxin-analoge adskiller sig fra det naturligt forekommende humane relaxin ved udskiftning, deletion, tilføjelse eller modificering af én eller flere 25 aminosyrerester i A- og/eller B-kæden af humant relaxin med den forudsætning, at biologisk relaxinlignende aktivitet bevares. Eksempler på sådanne humant relaxin-analoge inkluderer, men er ikke begrænset til: en fuld-længde-A-kæde og carboxylterminalt forkortet B-kæde; 30 Hl(B2-27 A24) eAla25; H2(B2-25 A24) ; H2(B33 A24); H2(B33 A24) BLys4 »Ala25; H2 (B2-33 A24) aLys4 =Ala2‘; H2 (B2-33 A24) Apyro-Glu1 ELys4 uAla25 og H2(B33 A24) Apyro-Glu1 BLys4 2Ala25. Nomenklaturen er som følger: Hl, H2 henfører til 8 DK 173649 B1 de to humane gener, som koder for humant relaxin. H2 har vist sig at udtrykkes i det humane ovarie, medens Hl kun er blevet fundet som en genomisk klon. A og B henfører til de respektive kæder af humant relaxin. Tallene efter 5 A eller B henfører til kædens længde, dvs. Antallet af aminosyrer, som udgør A- eller B-kæden. Aminosyrer betegnes ved deres almindelige 3-bogstavssymbol. Det nedrykkede bogstav forud for aminosyren betegner den A- eller B-kæde, hvori aminosyren er lokaliseret, medens det opryk-10 kede efter aminosyren henfører til positionen i kæden.
Relaxin-A- og -B-kæderne eller analoge kæder kan opnås ved klassiske proteinsyntesemetoder, herunder enten opløsnings- eller fast-fase-teknik, eller under anvendelse af rekombinant -DNA-teknologi eller ved præparation ud 15 fra naturligt humant relaxin eller en kombination af de ovenstående, f.eks. kemisk syntese af den ene kæde og re-kombinant-DNA-fremstilling af den anden. De individuelle peptidkæder blev syntetiseret via fast-fase-syntetisk metodologi, Barany, G. and Merrifield, R.B. (1980) i The 20 Peptides 2, 1-284, Gross, E. and Meienhofer, J. Eds. Ace-demic Press, New York. Beskyttede N-t-butyloxycarbonyl-aminosyrer blev købt af Peninsula Laboratories Inc. Der anvendtes den følgende sidekædebeskyttelse: Arg, tosyl;
Asn, xanthyl; Asp, benzylester; Cys, methoxybenzyl; Gin, 25 xanthyl; Glu, benzylester; His, tosyl; Lys, o-chlorben-zyloxycarbonyl; Ser, benzyl; Thr, benzyl; Tyr, 2,6-dichlorbenzyl. De første aminosyrer blev esterificeret på chlormethylpolystyren (1% divinylbenzen) med kaliumfluorid i dimethylformamid. Substitutionsniveauer var 0,6 30 mækv/g. Aminosyrerne blev koblet med dicyclohexylcarbodi-imid (destilleret) i dichlormethan. Arginin, asparagin, glutamin, leucin og cysteinrester blev koblet i 50:50 methylenchlorid/dimethylformamid. Fjernelse af t-butyl-oxycarbonylgrupperne blev gennemført med 45% trifluor- 9 DK 173649 B1 trifluoreddikesyre, 5% anisol, 5% ethanoldithiol og 45% methylenchlorid. Neutralisering før koblingerne blev udført med 10% triethylamin i methylenchlorid. Spaltning fra harpiksen og fjernelse af alle de beskyttende grupper 5 blev gennemført ved behandling med vandfrit flydende hydrogenfluorid i nærvær af anisol og methylethylsulfid (volumenforhold 20:3:1) ved 0 °C i 1 time. Rå A-kæde blev fjernet fra harpiksen med 10 % vandig eddikesyre og lyophiliseret. Rå B-kæde blev fjernet fra harpiksen ved 10 vaskning først med 80% vandigt acetonitril og derpå med 30% vandig eddikesyre efterfulgt af fortyndning med vand og lyophilisering, De råpeptider blev opløst i 100 mmol dithiothreitol og derpåfortyndet i et stort volumen 10% vandigt acetonitril, 0,1% trifluoreddikesyre. Disse op-15 løsninger blev sat på 5 x 50 cm kolonner pakket med Vydac C18 {300 Å 15-20 pm) , vasket med 0,1% vandig trifluored-dikesyre og elueret med en gradient af acetonitril. Peptidfraktionerne blev hældt sammen, lyophiliseret og analyseret ved aminosyresammensætning, sekvensbestemmelse og 20 analytisk revers-fase-HPLC. Cysteinresterne blev ikke beskyttet ved sulfonering eller andre derivatiseringer,
Means, G.E. and Feeney, R.E., Chemical Modification of Proteins (1971) , som det var tilfældet med den hidtige insulin- eller svinerelaxin-metodologi. Forbedrede udbyt-25 ter og peptidopløselighed opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved at holde de humane relaxin-A- og -B-kæder i deres reducerede form. De reducerede og lyophiliserede A- og B-kæder blev anvendt direkte til alle rekombinationsreaktioner uden omdannelse til det sulfonerede deri-30 vat eller anvendelse af andre cystinthiolblokerende midler .
Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan kombinationen af humant relaxin-A- og -B-kæde eller analog A- og B-kæde til dannelse af humant relaxin eller hu 10 DK 173649 B1 mant relaxin-analog opnås over et bredt område af forhold mellem den ene kæde og den anden. Kombinationen er selvfølgelig i sig selv begrænset af den kæde, hvad enten det er A eller B, som er til stede i den mindste mængde.
5 Overskud af B-kæde inhiberer kædekombinationen, medens molære mængder af A-kæde enten i svagt overskud eller lige så stort som af B-kæde foretrækkes. I hvert fald er det almindelige forhold mellem A-kæde og B-kæde på vægtbasis fra omkring 1:0,5 til omkring 3,0:1, selvom det ik-10 ke er nødvendigt. Det foretrækkes stærkt at udføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af et vægtforhold mellem A-kæde og B-kæde i området fra omkring 1:1 til omkring 2,5:1. Det er også blevet opdaget, at der inden for dette foretrukne område er visse områder, som 15 er særlig fordelagtige til fremstilling af en bestemt relaxin-analog. Således foretrækkes det ved kombinationen af humant relaxin-A- og -B-kæde til fremstilling af desmethionin-relaxin at forholdet mellem A-kæde og B-kæde er inden for området fra omkring 1,2:1 til omkring 2:1.
20 En anden parameter, som er væsentlig for udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen i et optimalt niveau er proteinkoncentrationen i reaktionsmediet. Fremgangsmåden kan udføres med held over et bredt område af proteinkoncentrationer. Almindeligvis vil proteinkoncentrationen 25 imidlertid ligge i området fra omkring 0,1 til omkring 10 mg pr. ml reaktionsmedium. Fortrinsvis vil proteinkoncentrationen være i området fra omkring 0,5 til omkring 5 mg/ml. Igen er det blevet opdaget inden for dette sidstnævnte område, at den optimale proteinkoncentration vari-30 ere afhængigt af det fremstillede humane relaxin.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres i et vandigt medium. Mediets pH-værdi målt ved stuetemperatur vil almindeligvis være i området fra omkring 7,0 til omkring DK 173649 B1 π 12. Fortrinsvis vil den være fra omkring 7,5 til omkring 11,0, og optimalt vil den blive holdt inden for området fra omkring 8,0 til omkring 10,6. Mediets pH-værdi kan holdes i det ønskede område ved tilsætning af et egnet 5 puffermiddel. Typiske puffermidler er f.eks. glycinat, carbonat, tris(hydroxymethyl)aminomethan, pyrophosphat og andre lignende midler, som frembringer pH-kontrol inden for det foran beskrevne område. Det almindelige og foretrukne puffermiddel er tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH 10 8-9) og glycinat (pH 9,5 - 11,0).
Blandingsreaktionen udføres ved en temperatur på fra omkring 15 til omkring 30 °C, og fortrinsvis fra omkring 20 til omkring 25 °C, og mest fortrinsvis ved stuetemperatur.
15 Koncentrationen af puffermiddel ligger almindeligvis i området fra omkring 0,025 M til omkring 0,2 M. Fortrinsvis er koncentrationen fra omkring 0,05 til omkring 0,15 M, og mest fortrinsvis omkring 0,1 M.
Én af betingelserne for fremgangsmåden ifølge opfindelsen 20 er, at den udføres i et miljø, hvor udsættelsen for luftoxygen kan styres. Det blev fundet, at styret oxidation kunne opnås ved N;-skylning af alle opløsninger fra begyndelsen; at reaktionsblandingen skulle N:· skylles i en lukket beholder ved reaktionens start; og at reaktions-25 blandingen, medens den var i en lukket beholder, skulle udsættes for luft direkte ved åbning af beholderen eller for oxygen ved bobling ind i og igennem mediet.
En anden betingelse for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at reaktionen skal udføres under betingelser, som er 30 mildt denaturerende med hensyn til human B-kæden. Sådanne denatureringsmidler som urinstof, guanidinhydrochlorid og andre kaotrope midler, salte, detergenser og organiske 12 DK 173649 B1 opløsningsmidler (acetonitril, alkoholer, dimethylforma-mid, osv.), som kendes af fagmanden, kunne anvendes. Fortrinsvis gør urinstof og acetonitril og nogle få volumenli (mindre end 10 vol.-%) organiske opløsningsmidler be-5 tingeiserne mildt denaturerende for den humane relaxin-B-kæde.
De humane relaxin-A- og -B-kæder bringes sammen i det passende vandige medium i reducerede fri cystein-former. Reaktionerne blev startet ved først at tilsætte A-kæde 10 efterfulgt af B-kæde fra friske 5 mg/ml lageropløsninger i vand ved pH 2. pH-værdien indstilles til den passende værdi med NaOH. Hver reaktion kontrolleres ved analytisk RP-4 revers-fase-HPLC, Snyder, L.R. and Kirkland, J.J. i Introduction to Modern Liquid Chromatography (1979), for 15 maximal dannelse af rekombineret relaxin og stoppes ved tilsætning af iseddike pH 4. Blandingen centrifugeres derpå ved 16 318 g i 30 minutter, og supernatanten renses ved præparativ revers-fase-HPCL; ibid. Det blev iagttaget, at udførelse af kombinationsreaktionen ved stuetem-20 peratur var vigtig for at producere anvendelige udbytter af humant relaxin. Arbejde med analytisk højydelses-væskechromatografi blev udført under anvendelse af en Synchropak RP-4 (4,6 x 250 mm, 300 Å) revers-fase-kolonne. Præparativt arbejde blev udført under anvendelse 25 af enten Synchropak RP-4 (1 x 50 cm, 300 Å) eller en håndpakket Vydac RP-4 eller RP-18 (5 x 50 cm), 300 Å re-vers-fase-kolonne. Analytisk HPLC blev udført under anvendelse af et Water’s System. Præparativ HPLC blev udført under anvendelse af Water's System eller Prep 500.
30 Når først reaktionsperioden er blevet fuldført kan humant relaxin- eller relaxinanalogt produkt isoleres ved enhver af en lang række forskellige metoder, som alle kendes inden for feltet proteinisolering. Den mest almindeligt an- 13 DK 173649 B1 vendte teknik til relaxin-rensning er kromatografisk teknik. Denne er let anvendelig til udvinding af humant relaxin fra fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Den inkluderer gelfiltrering, ionbytterkromatografi eller revers-5 fase-HPLC.
Et eksempel på et rensningsskema var at sætte reaktions-supernatanterne med i alt 0,5-1 g relaxinpeptid på en (15-20 pm) Vydac C4 300 Å (5 x 50 cm) kolonne. Rensningen blev opnået under anvendelse af en 20-40% acetonitrilgra-10 dient (0,5% ændring pr. minut) i vand, 0,1% TFA. Strømningshastigheden var 20 ml/min og der blev opsamlet 1,0 minuts fraktioner. Disse blev kontrolleret isokratisk 25% acetonitril, vand, 0,1% TFA på en analytisk (5 pm) Vydac C4 300 Å (4,6 x 250 mm) kolonne. Fraktionerne indeholden-15 de overvejende produkter blev hældt sammen og lyophilise-ret til yderligere analyse.
Det humane relaxin og de humant relaxin-analoge blev prøvet ved bioassays. Musesymphyse-(MPS)-assayet under anvendelse af Charles River albino CFW hunmus med en vægt 20 på 18-20 g, J. St. Louis, Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512 (1081). Estradiol-grundbehandlingsopløsningen er 5 pg i estradiol-17p-cyclopentylpropionat i 0,1 ml jord-nøddeolie. Humant relaxin-dosisopløsninger er i koncentrationer på 2, 5, 5,0, 10, 0, 20,0, 40, 0 og 80,0 pg/ml i 25 en 1% opløsning af benzopurpurin 4B i vand. Når musene er blevet huset i mindst 6 dage i karantæne og vejer 18-20 g, gives hver en subkutan injektion af estradiol-grundbehandlingsopløsning. Nøjagtigt 7 dage senere injiceres musene subkutant med 0,2 ml af den passende humant 30 relaxin-dosisopløsning. Mellem 18 og 20 timer efter injektionen af humant relaxin aflives musene ved at få brækket halsen. Det interpubiske ligament blottes og måles med et mikrometer.
14 DK 173649 B1
Charles River albino Sprague-Dawley-afledte hunrotter med en vægt på 200-300 g anvendes til rotte-uterus-kontrak-tilitets-(RUC)-assayet. Estradiol-grundbehandlingsopløs-ningen er 200 pg estradiol-17p-cyclopentylpropionat i 0,1 5 ml jordnøddeolie. Humant relaxin-lageropløsningen er ved en koncentration på 0,1 mg/ml i sterilt injektionsvand (Invenex). Når rotterne er blevet huset i mindst 6 dage i karantæne, gives hver en subkutan injektion af estradiol-grundbehandlingsopløsning. Mellem 16 og 20 timer efter 10 estradiolinjektionen aflives rotterne ved carbondioxidkvælning. Uteri udskæres, hornene splittes og deles lateralt, fire stykker uterus pr. dyr. Hvert væv suspenderes i et vandbad indeholdende 35 ml beluftet Holmans Ringer opløsning holdt ved 37 °C af en kappe. Vævet bringes til 15 at kontrahere ved erstatning af Ringer-opløsningen med en, hvori 20% natriumchlorid er erstattet med en ækvimo-lær mængde kaliumchlorid. Efter at der er nået et konstant plateau sættes en koncentration af relaxin til badet. Med henblik på standardkurven er de doser af svine-20 relaxin, som sættes til badet, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 og 12,8 pg relaxin pr. 35 ml bad.
Humant relaxins induktion af cervikal modning ved en ik-ke-human primatgraviditet blev prøvet. Humant relaxin blev prøvet i tidsparrede Rhesus-aber med drægtighedsal-25 dre fra 130 til 160 dage. Drægtighedsperioden i kolonien er 168 ± 6 dage. Dyrene blev vænnet til at bære jakker med tøjr. De tøjrede jakker muliggjorde kontinuert adgang til indsatte katetere anbragt enten i femoralkarrene eller i carotid- og indre-jugular-karrene. I de fleste dyr 30 anbragtes en tryktransducer i amnionsækken, og elektroder forbundet med uterus-overfladen tillod måling af uteruskontraktionsaktivitet. Relaxin blev indgivet som en kontinuert i.v. infusion igennem 1 time, med blodprøver taget før, under og efter infusionen med intervaller fra 15 15 DK 173649 B1 minutter igennem den første time efter infusionen og derpå regelmæssigt i 24 timer. Doserne af relaxin var i området fra 10 pg til 100 pg, og cervixen blev bedømt for tekstur, udslettelse, position, dilatation og fetalposi-5 tion i forhold til cervixen såvel som kvaliteten af det nedre uterus segment. I de fleste tilfælde undersøgte to iagttagere hver cervix og bedømte den uafhængigt. Kontroller var aber, som var blevet opereret på lignende måde og blev infuseret med saltopløsning (én) eller aber, 10 som blev holdt i kolonien, men ikke opereret, og på hvilke der gennemførtes cervikale undersøgelser med ugentlige intervaller.
Western-blots og urinstof-polyacrylamidgel-elektroforese for at isolere protein blev gennemført under anvendelse 15 gelplader af 15% polyacrylamid med lav molekylvægt indeholdende urinstof ifølge den procedure, som er angivet Bethesda Research Laboratories i deres brochure til molekylvægtstandarder. Nogle modifikationer af den procedure er blevet anvendt. Gelerne føres i køleskab, 4 °C i 15 20 timer ved 100 V konstant spænding. Prøver præpareres i·10 mM natriumphosphat, pH 7,2, 7M urinstof, 0,01% bromphe-nol-blåt og til reducerede prøver 50 mM frisk fremstillet dithiothreitol (DTT). 1-10 pg totalt peptid inkuberes ved 90 °C i 2-3 minutter før påsætning. Gelerne inkuberes ved 25 90 °C i 2-3 minutter før påsætningen. Gelerne visualise res med Coomassie-blåt (gelen udblødes i 1,5 time i 10 ml eddikesyre + 90 mol (0,25 vægt/vol.-%) Coomassie Blue R-250 i 25% ethanol), sølvfarvning (Oakley, B.R. et al. Analytical Biochem. (1980) 105, 361-363), efter fiksering 30 og affarvning i en opløsning af 0,2 vol.-% formaldehyd, 20 vol.-% ethanol og 6,2 vol.-% eddikesyre i 15-30 minutter og Western-analyse Towbin, H. et al. PNAS (1979) 76; 4350-4354).
16 DK 173649 B1
Antistoffer specifikke for A- og B-kæderne blev frembragt ved immunisering af hvide New Zealand kaniner med de frie peptider enten alun-udfældede eller i FreundTs adjuvant som beskrevet i Eddie, L.E. et al. (1986) The Lancet 1, 5 1344-1346. Titerne var i hovedsagen de samme, og antisera fra hver immunisering blev hældt sammen med bb-titer for A-kæden og cc-titer for B-kæden. Disse blev anvendt i 500 x fortynding ved inkubationen overfor nitrocellulosefiltrene 2 timer til natten over. De vaskede filtre inku-10 beres derpå over for 125 I-protein A i 2 timer, tørres og anbringes mod røntgenfilm.
De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
EKSEMPLER
15 Eksempel 1
Naturligt humant relaxin H2 {B33 A24)
Reduceret relaxin-A-kæde (10 mg) blev tilsat til reaktionsblandingen som et reduceret fast lyophiliseret pulver.
20 Reduceret relaxin-B-kæde (5,63 mg) blev også tilsat som et fast lyofiliseret pulver.
A- og B-relaxinkæde-opløsningerne blev kombineret i en 10 ml ampul ved stuetemperatur (ca. 25 °C) ved først at tilsætte relaxin-A-kæden efterfulgt af relaxin-B-kæden som 25 de ovennævnte faste lyophiliserede pulvere. pH-værdien blev indstillet til 10,5 med NaOH. Reaktionen kontrolleret ved analytisk RP-4 revers fase-HPLC for maximal dannelse af rekombineret relaxin. På grund af uopløseligheden af den naturlige form af H2-B-kæden krævede dens re-30 kombination med A-kæden de følgende betingelser i overensstemmelse med opfindelsen: slutreaktion i 0,1 M gly- 17 DK 173649 B1 cin, pH 10,5, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 3 % 1-propanol, 3 % acetonitril og 1 M urinstof. Reaktionsblandingen blev omrørt åben til luften i 28 timer ved stuetemperatur. Rela-xindannelse blev kontrolleret ved analytisk revers fase-5 HPLC (se fig. 2B) og stoppet som beskrevet ovenfor. Analyse ved HPLC viste et relaxinudbytte på 1,87 mg, eller 19,5% inkorporering af B-kæde.
Blandingen blev renset ved præparativ RP-4 revers-fase-HPPLC (1 x 25 cm) RP-4 Synchropak 300 Å. Toppen blev 10 hældt sammen og anvendt direkte ud af HPLC-opløsnings-midlet. Det humane relaxin blev bedømt til at være helt rent ved polyacrylamidgel-elektroforese, aminosyreanaly-se-HPLC, aminoterminal sekvensbestemmelse og bioassay.
Eksempel 2 15 Humant relaxin-analog H2 (B33 A24) ELys4 sAla1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Reduceret humant relaxin-A-kæde (200 mg) blev opløst i 40 ml vand (pH 2,0). Reduceret humant relaxin-B-kæde (B33 ELys4 Ala'5) (100 mg) blev opløst i 20 ml vand (pH 2) .
A-kæde- og B-kæde-analog-opløsningerne blev kombineret i 2 en 165 ml ampul ved stuetemperatur (-25 °C) ved, at man 3 først tilsatte A-kæden efterfulgt af den modificerede B- 4 kæde fra de førnævnte friske lageropløsninger i vand, 5 pH2. pH-værdien blev indstillet til ca. 8,0 med NaOH. Re- 6 aktionen blev kontrolleret ved RP-4 revers fase-HPLC for 7 maximal dannelse af kombineret humant relaxin-analog. Til 8 denne humant relaxin-analoge anvendtes de følgende betin 9 gelser i overensstemmelse med opfindelsen: reaktion B 0,1 10 M "Tris”, pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 24 °C. Reaktions- 11 blandingen blev omrørt kraftig åben til luften. Kombina- 18 DK 173649 B1 tionsreaktionen blev stoppet ved tilsætning af iseddike til pH 4.
Blandingen blev renset ved præparativ HPLC Vydac C4 300 Å 5 x 50 cm). Humant relaxin-analog-toppen (elueringsvolu-5 men ca. 140 ml) blev hældt sammen og lyophiliseret med en udvinding af 35 mg relaxin, eller 20,3 % inkorporering af B-kæde. Den humant relaxin-analoge blev bedømt til at være helt ren ved polyacrylamidgel-elektroforese, aminosy-reanalyse, aminoterminal sekvensbestemmelse, HPLC (se 10 fig. 2A) og bioassay.
Eksempel 3
Humant relaxin-analog H2 (B2-33 A24) ELys4 BAla25
Reduceret humant relaxin-A-kæde (41,5 mg) blev opløst i 8 15 ml vand (pH 2,0). Reduceret humant relaxin-B-kæde (B2-33 eLys4 sAla"5) (23 mg) med den første aminosyre deleteret fra aminoterminus blev opløst i vand (pH 2).
A- og B-kæde-analog-opløsningerne blev kombineret i en 33 ml ampul ved stuetemperatur (ca. 25 °C) ved, at man først 20 tilsatte A-kæden efterfulgt af den modificerede B-kæde fra de førnævnte friske lageropløsninger i vand, pH 2. pH-værdien blev indstillet 8,0 med NaOH. Reaktionen blev kontrolleret ved RP-4 revers-fase-HPLC for maximal dannelse af kombineret humant relaxin-analog. Til denne re-25 laxin-analoge anvendtes de følgende betingelser i overensstemmelse med opfindelsen: reaktion D 0,1 M "Tris”, pH 8, 25 °C; skylning med N:- og omrøring under Nu-atmosfære i de første 1-2 timer. Reaktionsblandingen blev derpå omrørt kraftigt åben til luften. Kombinationsreaktionen 30 blev stoppet ved tilsætning af iseddike til pH 4.
19 DK 173649 B1
Blandingen blev renset ved præparativ HPLC Vydac C4 300 Å (5 x 80 cm). Relaxin-analog-toppen (elueringsvolumen ca.
140 ml) blev hældt sammen og lyophiliseret med en udvinding af 16 mg humant relaxin-analog, eller 40,3 % inkor-5 porering af B-kæde. Den relaxin-analoge blev bedømt til at være helt ren ved polyacrylamidgel-elektroforese, ami-nosyreanalyse, aminoterminalsekvensbestemmelse, HPLC (se fig. 2A) og bioassay.
Eksempel 4 10 Humant relaxin-analog H2 (B2-33 A24) ^pyro-Glu1 ELys4 eAla·"’5
Reduceret humant relaxin-A-kæde (41,5 mg) blev opløst i 8 ml vand (pH 2,0). Reduceret humant relaxin-B-kæde (B2-33 eLys4 sAla25) (23 mg) med den første aminosyre deleteret 15 fra aminoterminus blev opløst i 4 ml vand (pH 2).
A- og B-kæde-analog-opløsningerne blev kombineret i en 33 ml ampul ved stuetemperatur (ca. 25 °C) ved, at man først tilsatte A-kæden efterfulgt af den modificerede B-kæde fra de førnævnte friske lageropløsninger, pH 2. pH-20 værdien blev indstillet til 8,0 med NaOH. Reaktionen blev kontrolleret ved RP-4 revers-fase-HPLC for maximal dannelse af kombineret human-relaxin-analog. Til denne relaxin-analoge anvendtes de følgende betingelser i overensstemmelse med opfindelsen: reaktion D 0,1 M "Tris", pH 8, 25 25 °C; skylning med N: og omrøring under N;-atmosfære i de første 1-2 timer. Reaktionen blev derpå omrørt kraftigt åben til luften. Kombinationsreaktionen blev stoppet ved tilsætning af iseddike pH 4.
Blandingen blev renset ved præparativ HPLC Vydac C4 300 Å 30 ( 5 x 80 cm) . Relaxin-analog-toppen (elueringsvolumen ca.
140 ml) blev hældt sammen og lyophiliseret med en udvin- 20 DK 173649 B1 ding af 7,5 mg humant relaxin-analog, eller 18,9 % inkorporering af B-kæde. Den relaxin-analoge blev bedømt til at være helt ren ved polyacrylamidgel-elektroforese, ami-nosyreanalyse, aminoterminalsekvensbestemmelse, HPLC (se 5 fig. 2A) og bioassay.
Eksempel 5
Humant relaxin-analog H2 (B33 A24) Apyro-Glu1 BLys4 eAla1 2 3 4 5 6
Reduceret humant relaxin-A-kæde (200 mg) blev opløst i 40 10 ml vand (pH 2,0). Reduceret humant relaxin-B-kæde (B33 oLys4 BAla"5) (100 mg) blev opløst i 20 ml vand (pH 2) .
A- og B-kæde-analog-opløsningerne blev kombineret i en 165 ml ampul ved stuetermperatur (ca. 25 °C) ved, at man først tilsatte A-kasden efterfulgt af den modificerede B-15 kæde fra de førnævnte friske lageropløsninger i vand, pH 2. pH-værdien blev indstillet til 8,0 med NaOH. Reaktionen blev kontrolleret ved RP-4 revers fase-HPLC for maximal dannelse af kombineret humant-relaxin-analog. Til denne relaxin-analoge anvendtes de følgende betingelser i 20 overensstemmelse med opfindelsen: reaktion B 0,1 M na-triumglycinat, pH 8, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 24 °C. Reaktionblandingen blev omrørt kraftigt åben til luften. Kombinationsreaktionen blev stoppet ved tilsætning af iseddike til pH 4.
Blandingen blev renset ved præparativ HPLC Vydac C4 300 Å 2 (5 x 50 cm). Humant relaxin-analog-toppen (elueringsvolu- 3 men ca. 140 ml) blev hældt sammen og lyophiliseret med en 4 udvinding af 16 mg relaxin, eller 9,3 % inkorporering af 5 B-kæde. Den humant relaxin-analoge blev bedømt til at væ- 6 re helt ren ved polyacrylamidgel-elektroforese, aminosy- reanalyse, aminoterminalsekvensbestemmelse, HPLC (se fig.
2A) og bioassay.
21 DK 173649 B1
Eksempel 6
Biologiske assays 5 Bioassayet for rotte-uterus-kontraktilitet (RUC) in vitro måler humant relaxins evne til at afslappe glatmuskel i nærvær af elektrisk stimulerede kontraktioner, J. St.
Louis, (1981) Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512.
Bioassayet for muse-symfyse-(MPS)-ligament in vivo måler 10 relaxins omformende virkning på bindevæv, Steinetz, B.G. et al. (1960) Endocrinology _67, 102. Biologiske dosis- respons-sammenligninger af H2 (B2-33 A24) , H2 (B32 A24) ELys4 &Alai5, H2 (B33 A24) BLys4 sAla1 2 3 4 5 6 og pyro-Glu-formerne af de foranstående H2 (B2-33 A24) BLys4 BAla1 ^pyro-Glu1 15 og H2 (B33 A2 4) BLys4 sAla1 APyro-Glu1 viste biologisk aktivitet ved både MPS- og RUC-assayene. MPS-dataene for en humant relaxin-analog og humant relaxin er vist i fig. 3.
MPS-dosis-responsene viser lige stor styrke for naturligt humant relaxin og H2 (B2-33 A24) BLys4 eAla1, fig. 3.
20 Imidlertid viser svinerelaxin sig at have et ikke-parallelt respons i forhold til de andre relaxiner. Alle de humant relaxin-analoge og humant relaxin med den naturlige sekvens kan stort set ikke skelnes fra hverandre ved MPS-bioassayet.
På grund af mængden af renset H2(B33 A24), som er til rå 2 dighed, kunne den kun sammenlignes ved den høje ende af 3 dosisområdet. Resultaterne fastslår ligheden af aktivitet 4 for det native humane relaxin og de analoge former af hu 5 mant relaxin. Hældningen af dosis-respons-kurven for det 6 humane relaxin kan være forskellig fra hældningen af kurven for de analoge.
22 DK 173649 B1
Ved RUC-bioassayet er hældningerne for humant relaxin og de humant relaxin-analoge identiske.
Eksempel 7
Humant relaxin ved primatdrægtighed 5 To humant relaxin-analoge, H2 (B33 A24) BLys4 sAla*5 og H2 (B2-33 A24) BLys4 sAla25, er blevet prøvet på tidsparrede Rhesus-aber ved drægtighedsaldre på 130-160 dage under anvendelse af den ovenfor beskrevne metodologi.
Under anvendelse af en modificeret Bishop score for de ίο iagttagne parametre var den gennemsnitlige cervixændring for 7 separate infusioner af forskellige doser 3,7 enheder. Disse data er vist i fig. 4, hvor de individuelle infusioner med 100, 50 og 10 pg doser er vist, såvel som et gennemsnit af alle andre 10 pg infusioner og de to 15 slags kontroller. Bemærk at de ikke-infuserede kontrolaber varierer fra 2-15 bestemmelser pr. punkt (undtagen at to punkter hvert er repræsentativt for mindst fire aber), og gennemsnittet er afsat. Alment var cervixen mere følsom for lavere doser af relaxin, efterhånden som drægtig-20 heden skred frem, eller for gentagen indgivelse af relaxin tidligt i denne tidsperiode. Høje doser af relaxin (100 eller 50 pg) var i stand til at frembringe væsentlige ændringer i cervixmodning (idet de inducerede en ændring på 1-10 i score) selv ved relativt tidlige tidspe-25 rioder i drægtigheden (130-140 dage). Cervixændringerne viste sig at ske uafhængigt af nogen fast ændring i elek-tromyografisk uterusaktivitet eller intrauterint tryk.
Disse resultater viser, at kombineret humant relaxin er højeffektivt til frembringelse af cervixmodning hos pri-30 mater under den sidste tredjedel af drægtighed.
23 DK 173649 B1
Det humane relaxin og de humant relaxin-analoge ifølge opfindelsen kan sammensættes ved kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, således at det humane relaxin eller de analoge deraf kombineres med 5 en farmaceutisk acceptabel bærer. Egnede medier og deres sammensætning, inklusive andre nødvendige humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er beskrevet i standardsammensætningsafhandlinger, f.eks. Remington1s Pharmaceutical Sciences af E.W. Martin.
10
Claims (20)
- 24 DK 173649 B1
- 1. Fremgangsmåde til kombination af en A-kæde af humant relaxin eller en analog deraf og en B-kæde af humant re-5 laxin eller en analog deraf til fremstilling af humant relaxin eller en humant relaxin-analog, kendetegnet ved/ at den reducerede fri cystein-form af A-kæden og den reducerede fri cystein-form af B-kæden blandes i et vandigt medium, hvorefter pH øges til en pH-værdi på 10 fra omkring 7,0 til omkring 12 under styret udsættelse for oxygen ved en temperatur på 15-30 °C og under betingelser, der er mildt denaturerende for relaxin-B-kæden, til dannelse af humant relaxin eller humant relaxin-analog .
- 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin A-kæden og den reducerede form af humant relaxin B-kæden hver har den aminosyresekvens, som repræsenteres af naturligt forekommende humant relaxin (H2).
- 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin A-kæden og den reducerede form af humant relaxin B-kæden hver har den aminosyresekvens, som repræsenteres af naturligt forekommende humant relaxin (Hl).
- 4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin A-kæden er en analog af den nævnte A-kæde. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin B-kæden er 30 en analog af den nævnte B-kæde. 25 DK 173649 B1
- 6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin B-kæden har mindst 25 og op til og med 33 aminosyrer med en udskiftning i stedet for mindst én methioninrest i kæden.
- 7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin B-kæden er afkortet til 32 aminosyrer med en lysinrest i position 4 og en alaninrest i position 25 af kæden.
- 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at blandingen gennemføres ved stuetemperatur.
- 9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin A-kæden har en pyro-Glu-rest i position 1 af kæden.
- 10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at den molære mængde relaxin A-kæde er lige så stor eller større end den molære mængde relaxin B-kæde.
- 11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vægtforholdet mellem relaxin A-kæden og relaxin B-kæden er fra omkring 1:0,5 til omkring 3,0:1.
- 12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vægtforholdet mellem relaxin A-kæden og relaxin B-kæden er fra omkring 1:1 til omkring 2,5:1.
- 13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at relaxinkoncentrationen er fra omkring 0,1 til om- 25 kring 10 mg pr. ml reaktionsmedium.
- 14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at relaxinkoncentrationen er fra omkring 0,5 til omkring 5 mg pr. ml reaktionsmedium. 26 DK 173649 B1
- 15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blandingen finder sted i nærvær af et denatureringsmiddel .
- 16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet 5 ved, at denatureringsmidlet er et kaotropt middel eller et organisk opløsningsmiddel eller en blanding deraf.
- 17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det kaotrope middel er urinstof eller guanidin-hydrochlorid, og det organiske opløsningsmiddel er aceto- 10 nitril, en alkohol eller dimethylformamid.
- 18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det kaotrope middel er urinstof, og det organiske opløsningsmiddel er acetonitril eller 1-propanol eller begge dele i en mængde på mindre end 10 vol.-%.
- 19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-18, kendetegnet ved, at den reducerede fri cystein-form af A-kæden har en pyro-Glu-rest i position 1, og den reducerede fri cystein-form af en carboxylter-minalt forkortet B-kæde har 25-33 aminosyrer, hvori, hvis 20 B-kæde-analogen har 33 aminosyrer, mindst én methionin-rest i kæden er udskiftet med en anden aminosyre.
- 20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den reducerede form af humant relaxin B-kæden er afkortet til 32 aminosyrer med en lysinrest i position 4 25 og en alaninrest i position 25 af kæden.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/877,819 US4835251A (en) | 1986-06-23 | 1986-06-23 | Method of chain combination |
| US87781986 | 1986-06-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK313087D0 DK313087D0 (da) | 1987-06-19 |
| DK313087A DK313087A (da) | 1987-12-24 |
| DK173649B1 true DK173649B1 (da) | 2001-05-21 |
Family
ID=25370787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198703130A DK173649B1 (da) | 1986-06-23 | 1987-06-19 | Fremgangsmåde til kædekombination til fremstilling af biologisk aktivt humant relaxin eller analoge deraf |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4835251A (da) |
| EP (1) | EP0251615B1 (da) |
| JP (1) | JP2529693B2 (da) |
| KR (1) | KR960007604B1 (da) |
| CN (1) | CN1029784C (da) |
| AU (1) | AU617291B2 (da) |
| CA (1) | CA1336223C (da) |
| DE (1) | DE3783273T2 (da) |
| DK (1) | DK173649B1 (da) |
| HU (1) | HU205948B (da) |
| IE (1) | IE59683B1 (da) |
| IL (1) | IL82921A (da) |
| PH (1) | PH23407A (da) |
| PT (1) | PT85134B (da) |
| ZA (1) | ZA874482B (da) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| EP0470976B1 (en) * | 1989-05-04 | 1993-03-31 | Genentech, Inc. | Processes and compositions for the isolation of human relaxin |
| US5166191A (en) * | 1991-08-19 | 1992-11-24 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in cardiovascular therapy |
| US5478807A (en) * | 1991-08-19 | 1995-12-26 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in the treatment of bradycardia |
| US5911997A (en) * | 1995-06-07 | 1999-06-15 | Connetics Corporation | Relaxin-like factor and methods and uses thereof |
| US5612051A (en) * | 1995-11-17 | 1997-03-18 | Yue; Samuel K. | Method of treating involuntary muscle dysfunction with relaxin hormone |
| US6709659B1 (en) * | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
| US5994148A (en) * | 1997-06-23 | 1999-11-30 | The Regents Of University Of California | Method of predicting and enhancing success of IVF/ET pregnancy |
| US6251863B1 (en) | 1998-09-08 | 2001-06-26 | Samuel K. Yue | Method of preventing and treating symptoms of aging and neurodegenerative dysfunctions with relaxin |
| US20050032683A1 (en) * | 2000-10-04 | 2005-02-10 | Amento Edward P. | Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists or antagonists |
| US20050186526A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-08-25 | Bas Medical, Inc. | Methods and systems for enabling and stabilizing tooth movement |
| AU2003903124A0 (en) * | 2003-06-20 | 2003-07-10 | Mark Del Borgo | Analogues of heteromeric proteins |
| JP4836942B2 (ja) * | 2004-04-30 | 2011-12-14 | コーセラ， インコーポレイテッド | リラキシンの調節による胎仔の発育の制御のための方法および組成物 |
| US20060052304A1 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Bas Medical, Inc. | Method for remodeling bone and related sutures |
| WO2007115414A1 (en) * | 2006-04-11 | 2007-10-18 | University Of Guelph | Modified h2 relaxin for tumor suppression |
| GR1006759B (el) * | 2008-12-22 | 2010-04-20 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras) | Εξελιγμενη χημικη μεθοδος συνθεσης της ανθρωπινης ρηλαξινης |
| GR1006941B (el) | 2009-06-01 | 2010-08-27 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Πεπτιδικη συνθεση (peptide synthesis) |
| GR1007010B (el) | 2009-10-08 | 2010-10-07 | Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), | Ινσουλινοειδη πεπτιδια |
| CA2808596C (en) | 2010-08-17 | 2020-12-15 | Ambrx, Inc. | Modified relaxin polypeptides and their uses |
| WO2013177529A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Angion Biomedica Corp. | Relaxin-like compounds and uses thereof |
| US9381231B2 (en) | 2012-10-09 | 2016-07-05 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of relaxin to restore maternal physiology in pregnancies conceived by assisted reproductive technologies |
| JP6289937B2 (ja) * | 2014-02-27 | 2018-03-07 | 学校法人東海大学 | リラキシンの製造方法 |
| EP2946788A1 (en) | 2014-05-23 | 2015-11-25 | Immundiagnostik AG | Method and composition for treating heart failure with preserved ejection fraction |
| US20190038713A1 (en) | 2015-11-07 | 2019-02-07 | Multivir Inc. | Compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer |
| EP3551226A1 (en) | 2016-12-12 | 2019-10-16 | MultiVir Inc. | Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases |
| WO2020036635A2 (en) | 2018-03-19 | 2020-02-20 | Multivir Inc. | Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer |
| CN114174348A (zh) | 2019-07-31 | 2022-03-11 | 伊莱利利公司 | 胰岛素类似物及其使用方法 |
| WO2021113644A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Multivir Inc. | Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4421685A (en) * | 1980-03-27 | 1983-12-20 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin |
| ZA811970B (en) * | 1980-03-27 | 1982-11-24 | Lilly Co Eli | Process for producing an insulin |
| US4656249A (en) * | 1982-06-10 | 1987-04-07 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Peptides with relaxin activity |
| EP0287820B1 (en) * | 1982-08-12 | 1992-07-08 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Human relaxin analogues |
| AU562962B2 (en) * | 1982-08-12 | 1987-06-25 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Molecular cloning and characterisation of the gene sequence coding for human relaxin |
| AU562713B2 (en) * | 1982-12-13 | 1987-06-18 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Cloning for human relaxin |
| IL70414A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-10 | Florey Howard Inst | Polypeptide having human h2-relaxin activity,double-stranded dna fragments coding therefor,vectors containing the dna fragments and methods for preparing the polypeptide,dna fragments and vectors |
-
1986
- 1986-06-23 US US06/877,819 patent/US4835251A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-19 HU HU872804A patent/HU205948B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 DK DK198703130A patent/DK173649B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 IL IL82921A patent/IL82921A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-06-19 PH PH35432A patent/PH23407A/en unknown
- 1987-06-22 ZA ZA874482A patent/ZA874482B/xx unknown
- 1987-06-22 PT PT85134A patent/PT85134B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 IE IE165587A patent/IE59683B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-22 DE DE8787305508T patent/DE3783273T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 EP EP87305508A patent/EP0251615B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-22 KR KR1019870006320A patent/KR960007604B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-06-23 CN CN87104447A patent/CN1029784C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-23 JP JP62156391A patent/JP2529693B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-23 AU AU74620/87A patent/AU617291B2/en not_active Expired
- 1987-06-23 CA CA000540413A patent/CA1336223C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1029784C (zh) | 1995-09-20 |
| EP0251615A3 (en) | 1989-12-13 |
| ZA874482B (en) | 1989-02-22 |
| DK313087A (da) | 1987-12-24 |
| DE3783273D1 (de) | 1993-02-11 |
| EP0251615B1 (en) | 1992-12-30 |
| PH23407A (en) | 1989-07-26 |
| US4835251A (en) | 1989-05-30 |
| CN87104447A (zh) | 1988-02-10 |
| JP2529693B2 (ja) | 1996-08-28 |
| HUT44045A (en) | 1988-01-28 |
| IL82921A (en) | 1992-01-15 |
| IE871655L (en) | 1987-12-23 |
| DE3783273T2 (de) | 1993-05-27 |
| DK313087D0 (da) | 1987-06-19 |
| EP0251615A2 (en) | 1988-01-07 |
| AU7462087A (en) | 1987-12-24 |
| CA1336223C (en) | 1995-07-04 |
| KR960007604B1 (ko) | 1996-06-07 |
| JPS6366198A (ja) | 1988-03-24 |
| PT85134B (pt) | 1990-03-30 |
| AU617291B2 (en) | 1991-11-28 |
| HU205948B (en) | 1992-07-28 |
| PT85134A (en) | 1987-07-01 |
| KR880000463A (ko) | 1988-03-26 |
| IE59683B1 (en) | 1994-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173649B1 (da) | Fremgangsmåde til kædekombination til fremstilling af biologisk aktivt humant relaxin eller analoge deraf | |
| FI92210B (fi) | Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisten GRF-analogien valmistamiseksi | |
| EP0105759B1 (en) | Human pancreatic grf | |
| US4517181A (en) | Mammalian PGRF | |
| HU200192B (en) | Process for production of grf-analog-peptides | |
| JPH0674279B2 (ja) | 成長ホルモン放出性因子類似体及びその製造方法 | |
| JP2003238594A (ja) | 新規アミリン作動薬ペプチドおよびその使用 | |
| US4610976A (en) | Porcine GRF | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| CA1247604A (en) | Ovine growth hormone releasing factor | |
| HU199508B (en) | Process for producing grf analogues and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| US4734399A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| JP2758901B2 (ja) | Ｇｒｆ類似体▲ｖｉｉ▼ | |
| JPH09506616A (ja) | 拮抗活性を有するｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ▲下２▼の類似体 | |
| EP0137689B1 (en) | Grf analogs | |
| KR0163033B1 (ko) | Grf 유사체 viia | |
| KR900006711B1 (ko) | 펩티드의 제조방법 | |
| MacWright et al. | Isolation and characterization of pepsin-solubilized human basement membrane (type IV) collagen peptides | |
| JPH0393796A (ja) | Ｇｈｒｈ類似化合物 | |
| CZ3004U1 (cs) | Peptidy a farmaceutické prostředky s jejich obsahem |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |