PT85134B - Metodo para combinacao de cadeias de relaxina humana - Google Patents
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Description
Este invento proporciona um método para a combinação das cadeias A e B da relaxina humana ou de análogos das cadeias A e B da relaxina humana para produzir quantidades úteis de relaxina humana ou de um análogo da relaxina humana biologicamente activos. Em particular o invento compreende a combinação das cadeias A e B da relaxina humana reduzidos ou seus análogos em condições que incluem um pH superior a cerca de 7,0 e que são suavemente ! desnaturantes em relação à cadeia B da relaxina humana. Estas condições proporcionam um meio para a formação de relaxina humana ou de um seu análogo biologicamente activos através da manutenção da mistura a uma temperatura entre cerca de 15°C e 30°C com exposição gradual ao oxigénio do ar no decurso da reacção. Este invento também proporciona anáalogos biologicamente activos da relaxina humana. Este |
I invento proporciona ainda um método de realização de um i parto usando relaxina humana ou um seu análogo como único I agente activo.
A relaxina humana é um peptideo I <3©do ovário responsável pela remodelação do sistema repro- > dutor antes do parto, facilitando deste modo o processo do nascimento. Hisaw, F.L., Pros. Soc. Exp. Biol. med. 23 661-663 (1926); Schwabe, C. et al., Biochem. Biophys. Res-Comm. 75, 503-570 (1977); James R. et al, nature 267 544-546 (1977). Se bem que seja predominantemente uma hormona de gravidez a relaxina também foi detectada em fêmeas não grávidas e nos machos. Bryant-Greenwood, G.D., Endocrine reviews, 3, 62-90 (1982) e Weiss, G. Ann. Rev. Physiol. 46 43-52 (1984). ;
í t i
As sequências de aminoácidos da t ι
relaxina de porco, rato, tubarão tigre,cação e homem foram já determinadas. A hormona consiste em duas cadeias peptii dicas, referidas como A e ligadas por pontes dissulfu- | reto com uma ansa dissulfureto intra-cadeia na cadeia A ; de modo análogo à insulina. No entanto, uma diferença suri preendente e importante entre a relaxina e a maior parte das outras hormonas peptidicas, incluindo insulina é a considerável variação estrutural entre as espécies. Por exemplo, as relaxinas de porco, rato e homem diferem em cerca de 50% das posições de aminoácidos. Estas diferenças i explicam a fraca reactividade imunológica cruzada entre i relaxinas de diferentes espécies e também uma série de di- j ferenças observadas relativamente à sua actividade bioló- | gica especifica. j
A aplicação da tecnologia de DNA recombinante conduziu ao isolamento e caracterização dos genes codificadores das relaxinas humanas, Hudson, P. et al Nature 301, 628-631 (1984) e Hudson, P. et al, The EMBO Journal 3^ 2333-2339 (1984). A análise da sequência de nucleotideos de clones de cDNA e de clones genómicos revelou a organização estrutural da relaxina humana a qual inclui um peptideo sinal de 25 residuos, seguido de uma cadeia B de cerca de 32 a 33 aminoácidos, um peptideo C de cerca de 105 aminoácidos e uma cadeia A de 24 aminoácidos,. No caso da relaxina humana um intrão interrompe a região codificadora do peptideo C. O papel fisiológico do peptideo C que é consideravelmente maior do que o peptideo C da insulina e a natureza das enzimas responsáveis pela remoção do peptideo C dos extremos das cadeias A e B são desconhecidos . '
No caso da relaxina humana foram identificadas duas sequências genéticas separadas,id. Apenas um destes genes (f^) é expresso no ovário durante '
a gravidez e não é claro se o outro gene é expresso num | outro tecido ou se ele representa um pseudogene. Os dois !
genes da relaxina humana apresentam homologia considerável j de nucleotideos e aminoácidos ou em relação ao outro particularmente no peptideo Ce B. No entanto existem algumas regiões notáveis de divergência de sequências, particularmente na região terminal amino das cadeias A e B. Ver Figura 1. 0 facto de a relaxina ser sintetizada e expressa no ovário sugere que esta é a única sequência envolvida na fisiologia da gravidez. Num artigo recente Johnton, P.D. j et al., em Peptides Structure and Function proc. Ninth American peptide Symposium, Deber, C.M. Hruby, V.I., e i
Kopple, F.D. (eds.) (Pierce Chem. Co., 1985) testaram re- i laxina humana H2 sintética e certos análogos da relaxina humana relativamente à actividade biológica. Eles definiorarti um núcleo de relaxina necessário â actividade biológica assim como determinada substituições de metionina por determinados aminoácidos que não afectam a actividade bioló- i gica. Id.
A Figura 1 compara as sequências de aminoácidos conhecidos das relaxinas de diferentes espécies. Além dos seis residuos de cisteina e residuos glicina delimitantes, apenas a isoleucina na posição 7 da cadeia B, a arginina nas posições 12 e 16 e a leucina na posição 32 foram conservadas. Os residuos de cisteina são claramente essenciais para a manutenção da configuração global devida a ligações dissulfureto. Blundell,T. et al.,Em: Bigazzi, M. Greenwood, F.C., Gaspari, F (eds.) Biology and its Role in the Human (Excerpta medica, Amsterdam, 1983) pág. 14-21. A variação entre espécies na sequência de aminoácidos na maior parte das posições na molécula de relaxina,i.e., nas cadeias A e B que incluem a porção activa da proteína relaxina é notável. !
Isto contrasta com a situação de virtualmente todas as outras familias de hormonas peptidicas incluindo a insulina. Uma outras caracteristica da estrutura da relaxina é a variação no comprimento observado nas regiões terminais amino e carboxilo da cadeia B e num grau mais baixo no externo amino da cadeia A.
A sintese quimica da relaxina foi particularmente dificil principalmente devido â solubilidade invulgar e caracteristicas estruturais da cadeia B isolada. Tregear, G.W., et al., Em: Bigazzi, M; Greenwood, F.C. and Gasparr,F. (eds), Biology of Relaxin and its Role in the Human, (Excerpta Medica, Amsterdam, 1983), pág. 42-55.
Conforme discutido atrás a relaxina humana e de facto a relaxina mamífera de um modo geral tem alguma semelhança estrutural com a insulina. Tanto a insulina como a relaxina possuem ligações dissulfureto intere intra-cadeias entre as duas cadeias James,R. et al. , Nature 267; 544 (1977) e Schwabe,C. e McDonald J.R. Science 197 914 (1977). Presumiu-se que as estratégicas de sintese usadas com êxito para a insulina, Busse, W.D. e carpenter, F.H., Biochemistry 15., 1649 (1976), katsoyannis, P.G. et al., Biochemistry £, 2656 (1967) e Kung, Y.T. et al., Scientia Sinica 15, 544 (1966), também seriam aplicáveis à relaxina Tregear, G. et al., Em; relaxin G.D. Bryant-Greenwood, Niall H.D. e Greenwood, F.C. (eds.), Elsevier, New York, 1981, tentaram sintetizar a relaxina usando a via das cadeias separadas com protecção selectiva dos sulfidrilos da cisteina. Eles encontraram que os peptideos sintéticos preparados pelos métodos da insulina tinham bio-reactividade do tipo relaxina detectável, no entanto a actividade especifica e rendimentos de combinação eram muito baixos.Id., em 151. Uma rzaão para os fracos rendimentos de combinação no caso da relaxina porcina era a insolubilidade da cadeia B porcina
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completa em solução a pH 10,5. Tregear et al., supra modificaram a anterior metodologia de combinação da insulina em dois aspectos: por precipitação da mistura de cadeias peptidicas da relaxina porcina com acetona para remover o agente redutor; e por adição de 0,5 M NaCl durante o passo de oxidação. Os resultados foram melhores rendimentos de relaxina porcina. Ver também Pedido de Patente Europeia No.83.304662,6 e Pedido de patente Europeia No.83307553.4.
Chance et al., Patente U.S.No. 4 421 685 saida em 20 de Dezembro de 1983 divulgam um método para produção de insulina ou de um seu análogo por combinação j da forma S-sulfonada das cadeias A e B e da insulina com um agente redutor tiol num meio aquoso com pH e temperatura contro lados de modo a efectuar-se as reacções de redução e oxidação num único passo. Este método se bem que apresentado como um melhoramento sobre a sintese da insulina previamente referida verificou-se não ser aplicável à sintese da relaxina humana.
Descobriu-se agora que em condições de reacção especificas podem ser produzidos niveis úteis de relaxina humana ou seus análogos por combinação das cadeias reduzidas da relaxina humana em condições controladas. É portanto um objectivo do presente invento proporcionar um método para combinação das cadeias A e B da relaxina humana, independentemente da sua origem, e.g. sintese química ou tecnologia de DNA recombinante para produzir niveis úteis de relaxina humana biologicamente activa.
Um outro aspecto do invento é produzir análogos biologicamente activos da relaxina humana.
Ainda um outro aspecto do invento é a utilização da relaxina humana ou um seu análogo para realização do parto.
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Sumário do Invento presente invento dirige-se a um método de combinação da cadeia A da relaxina humana ou um seu análogo e uma cadeia B da relaxina humana ou um seu análogo para produzir relaxina humana ou um análogo da relaxina humana biologicamente activos. Em particular o método compreende combinação da cadeia A reduzida da relaxina humana ou um seu análogo e da cadeia B reduzida da relaxina humana ou um seu análogo em condições que incluem um pH superior a cerca de 7,0 igual é suavemente desnaturante em relação à cadeia B da relaxina humana e realização da reacção com expos ção gradual ao oxigénio do ar no decurso da reacção.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 mostra a ausência de homologia da relaxina humana e H2 como insulina humana e as relaxinas porcina (P) e de rato (R). O sistema de numeração é relativo à relaxina . As ligações dissulfureto para as relaxinas são: A10-A15, All-Bll e A24-B23.
A Figura 2(a) mostra os tempos de HPLC para H? (B33 A24) gAla25 θ F^gUra 2(b) para
H? (B33 A24) da reacção de combinação de cadeias in vitro. É descrita a cinética da reacção de combinação mostrando a formação de análogos da relaxina humana ou a relaxina humana e um intermediário da cadeia A oxidado intramolecularmente e potencialmente importante. A conversão dos peptideos da cadeia A e B do gene 2 em análogo da relaxina humana H? e da relaxina humana H2 está delineada. Cromatografia usando uma Synchropak RP-C4 (4,6x250 nm) 300 Â). Um gradiente linear
de acetonitrilo (15 - - 60% em 500 minutos) num tampão de 0,05% de TFA em f^O a um fluxo de 1 ml/min.
A Figura 3 mostra a bioactividade T c /1 O C (MPS) da relaxina humana do gene 2 H2(B2-33 A24) B Ala e relaxina natural humana combinadas.
A Figura 4 mostra a pontuação de Bishop modificada em primata após administração de várias doses de análogos da relaxina humana, H„ (B2-33 Ao.) „Lis
4 25 24 B BAlaZD e H2 (b33 A^) BLis BAla .
Descrição Detalhada
Como aqui é usado relaxina humana ou análogo da relaxina humana refere-se a uma proteina funcional que se sabe remodelar o sistema reprodutor de modo a facilitar o processo do nascimento. A remodelação do sistema reprodutor inclui acções fisiológicas tais como amadure cimento do cervix; espessamento do endométrico do útero grávido assim como uma maior vasularização nesta área; e um efeito sobre a síntese de colagénio. Também se encontrou relaxina humana na numa das fêmeas e pode estar associada à lactação. Também se encontrou relaxina humana no liquido seminal humano e poderá aumentar a mobilidade do espermatozoa. Dado o efeito da relaxina sobre o cervix, a relaxina humana poderá aumentar a capacidade do esperma para penetrar no cervix humano. A relaxina humana poderá melhorar a elasticidade da pele face aos seus efeitos sobre tecido conjuntivo.
O análogo da relaxina humana,
além da definição funcional descrita acima, estruturalmente inclui uma série de proteínas, cada uma das quais tem a estrutura básica da relaxina humana incluindo uma cadeia A e B. 0 análogo da relaxina humana difere da relaxina humana natura por substituição, delecção, adição ou modificação, de um ou mais resíduos de aminoácidos em cada uma das cadeias A e/ou B da relaxina humana com a condição de a actividade biológica do tipo relaxina ser mantida. Exemplos de tais análogos da relaxina humana incluem mas não estão limitados a: cadeia A de tamanho completo e cadeia B encurtada no extremo carboxilo; Hl (b2-27 a24)BAla25; H2 (B2-25 A24); H2(B33 A24);
H2 (B33 A24)nLis4 „Ala25; H2 (B2-33 A-24) ^Lis4 Ala25; H2
Ί Δ o c (b2-33 a24) „piro-Glu „ Lis^ _ ala ; e H2 (B33 A24) piro1 4 A 2 5
-Glu nLis r>Ala . A nomenculatura é como se segue: Hl, £J £5
H2 refere-se aos dois genes humanos que codificam a relaxina humana. Encontrou-se que H2 é expresso no ovário humano enquanto Hl só foi encontrado como clone genómico, A e B refere-se às respectivas cadeias da relaxina humana. Os numeros que se seguem a A ou B referem-se ao comprimento da cadeia, i.e., numero de aminoácidos compreendendo a cadeia A ou B. Os aminoácidos são designados pela sua notação habitual de três letras. 0 indice que precede o aminoácido designa a cadeia A ou B em que o aminoácido está situado enquanto que o expoente após o aminoácido se refere à posição na cadeia.
As cadeias A e B da relaxina ou cadeias análogas podem ser obtidas por métodos clássicos de sintese de proteínas, incluindo técnicas em solução ou em fase sólida ou usando tecnologia de DNA recombinante ou por preparação a partir da relaxina humana natural ou uma combinação das técnicas acima e.g. sintese quimica de uma cadeia e produção por DNA recombinante da outra,. As cadeias peptidicas individuais foram sintetizadas via metodologia de sintese em fase sólida, Barany, G. e merrifield, R.B. (1980) em The peptides 2, 1-284.
Gross, E. e Meienhofer, J. Eds .,
Academic Press,New York. Os aminoácidos protegidos com N-t-butiloxicarbonilo foram adquiridos a península Laboratoires Inc. usou-se a seguinte protecçao de cadeias laterais: Arg, tosilo; Asn, xantilo; Asp. éter benzilico; Cis, metoxibenzilo; Gin., xantilo; Glu, éster benzilico; His, tosilo; Lis, o-clorobenziloxicarbonilo; Ser, benzilo; Tre, benzilo; Tir,
2,6-diclorobenzilo. Os primeiros aminoácidos foram esterificados com clorometilpolistireno (1% divinilbenzeno) com fluoreto de potássio em dimetilformamida. Os niveis de substituição foram de 0,6 meq/g. os aminoácidos foram acolplados com diciclo-hexilcarbodiimida (destilada) em diclorometano. Os | resíduos de arginina, asparagina, glutamina, leucina e cis- I teina foram acoplados em 50/50 de cloreto de metileno/dime- j tilformamida. A remoção dos grupos t-butiloxicarbonilo foi conseguida com 45% de ácido trifluoroacético, 5% de anisolo 5% de etanoditiol e 45% de cloreto de metileno. A neutralização antes dos acoplamentos foi feita com 10% trietilamina em cloreto de metileno. A separação da resina e remoção de todos os grupos protectores foi conseguida por tratamento com fluoreto de hidrogénio liquido anidro na presença de anisolo e metiletilsulfureto (20:3:1 v/v/v) a O°C durante : uma hora. A cadeia A bruta foi removida da resina com 10% de ácido acético aquoso e liofilizada. A cadeia B bruta foi removida da resina por lavagem primeiro com 80% de acetonitri-lo aquoso e depois com 30% de ácido acético aquoso seguido de diluição com água e liofilização. os peptideos brutos foram dissolvidos em ditiotreitol 100 mM e depois diluídos
As fracções com peptideos foram reunidas, liofilizadas e analizados quanto à composição em
aminoácidos, sequênciação e HPLC analítica em fase reversa. Os residuos de cisteina não foram protegidos por sulfonação ou outras derivatizações, Means G.E. e Feeney, R.E. Chemical Modification of Proteins (1971) como foi o caso da metodologia anterior para a insulina ou relaxina porcina. Obteve-se melhores rendimentos e solubilidade dos peptideos de acordo com o método do presente invento mantendo as cadeias A e B da relaxina humana na sua forma reduzida. As cadeias A e B reduzidas e liofilizeadas foram usadas directamente para todas as reacções de recombinação sem conversão no derivado sulfonado ou uso de outros agentes dos grupos tiol de cistina.
Ao efectuar-se o processo deste invento a combinação das cadeias A e B da relaxina humana ou análogos da cadeia A e B para formar relaxina humana ou um análogo da relaxina humana pode ser conseguida numa gama larga de proporções de uma cadeia em relação â outra. A combinação, certamente, é inerentemente limitada pela cadeia, A e B presente em menor quantidade. Execesso de cadeia B inibe a combinação de cadeias enquanto que quantidades molares da cadeia A quer um ligeiro excesso ou iguais às de B são preferidas. Em qualquer dos casos, se bem que não essencial, a proporção habitual de cadeia A para cadeia B, numa base de peso, é de cerca de 1:0,5 até cerca de 3,0:1. É preferido efectuar o processo deste invento usando uma proporção de pesos da cadeia A para cadeia B na gama de cerca de 1:1 até cerca de 2,5:1. Também se descobriu que dentro des ta gama preferida certas gamas são especialmente vantajosas para a produção de um análogo particular da relaxina. Assim na combinação das cadeias A e B da relaxina humana para produzir relaxina sem metionina prefere-se que a proporção de cadeia A para cadeia B esteja dentro da gama de cerca de 1,2:1 a cerca de 2:1.
-12Um outro perimetro que é signiI ficativo para a efectuação do processo deste invento num nível óptimo é a concentração proteica no meio da reacção. 0 processo pode ser satisfatoriamente efectuado numa gama larga de concentrações proteicas, geralmente, no entanto, a concentração proteica variará entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg por ml do meio de reacção. De preferência a concentração proteica estará na gama de cerca de 0,5 a cerca de 5 mg por ml. De novo foi descoberto, dentro desta última gama, que a concentração proteica óptima varia de acordo com a relaxina humana produzida.
O processo deste invento é efectuado num meio aquoso. O pH do meio medido à temperatura ambiente variará geralmente entre cerca de 7,0 e cerca de 12. De preferência, ele será de cerca de 7,5 até cerca de 11,0 e o ótimo será mantê-lo dentro da gama de cerca de 8,0 até cerca de 10,6. O pH do meio pode ser mantido na gama pretendida pela adição de um agente tamponante adequado. São agentes tamponantes tipicos por exemplo glicinato, carbonato, tris (hidroximetil)aminometano, pirofosfato e outros agentes similares que fazem controle de pH dentro da gama atrás descrita. O agente tamponante comum e preferido é tris(hidroximetil)aminometano (pH 8 a 9) e glicinato (pH 9,5 a 11,0).
A mistura de reacção é efectuada a uma temperatura de cerca de 152 c até cerca de 302 C e de preferência de cerca de 20°C até cerca de 252c e mais preferido ainda à temperatura ambiente.
A concentração do agente tamponante varia geralmente entre cerca de 0,025M e cerca de 0,2M. De preferência a concentração vai de cerca de 0,05M até cerca de 0,15M e mais preferencialmente cerca de 0,lM.
Uma das condições do método do invento é que se efectua num ambiente em que a exposição ao oxigénio do ar pode ser controlada. Encontrou-se que a oxidação controlada pode ser conseguida gaseando com N2 todas as soluções inicialmente; a reacção deve ser gaseada com N2 num recipiente fechado no inicio da reacção; e enquanto num recipiente fechado a reacção seja exposta directamente ao ar através da abertura do recipiente fazendo borbulhar oxigénio para e através do meio.
Uma outra solução do método do invento é que a reacção seja efectuada em condições tais que sejam suavemente desnaturantes em relação à cadeia B da relaxina humana. Podem ser usados agentes desnaturantes conhecidos dos familiarizados com a matéria como seja ureia, hidrocloreto de guanidina e outros agentes caotrópicos, sais, detergentes e solventes orgânicos 5acetonitrilo, alcoóis, dimetilformamida, etc.). De preferência, a ureia e o acetonitrilo e poucos por cento baseado em volume (menos de 10%) de solventes orgânicos tornam as condições suavemente desnaturantes para a cadeia B da relaxina humana.
As cadeias A e B da relaxina humana são misturadas no meio aquoso adequado nas formas de cisteinas livres reduzidas. As reacções foram iniciadas adicionando primeiro a cadeia A seguido da cadeia B de stocks frescos a 5 mg/ml em H2O a pH2. O pH ajustou-se ao valor apropriado com naOH, Controlou-se cada reacção por HPLC analítica de fase reversa em Rp-4, Snyder, L.R. e Kirkland, J.J. em Introdution to Modern Liquid Chromatography (1979) para formação máxima de relaxina recombinada e passou-se pela adição de ácido acético glacial até pH 4. A mistura foi então centrifugada a 16 318 g durante 30 minutos e o sobrenadante purificado por HPLC preparativa em fase reversa. Observou-se que efectuar a reacção de recombinação à temperatura ambiente era impor-14-
tante para produzir rendimentos úteis da relaxina humana. 0 trabalho de cromatohrafia liquida de alta resolução analítica foi feito usando uma coluna de fase reversa Synchropak RP-4 (4,6 x 250 mm, 300 S). O trabalho preparativo foi feito usando colunas de fase reversa Synchropak RP-4 (1x50 cm, 300 $) em Vydac RP-4 ou RP-18 (5 x 50 cm), 300 8 preparadas manualmente. HPLC analítica foi feita usando um sistema Water. HPLC preparativa foi feita usando um sistema Water ou Prep 500.
Após completado o tempo de reacção o produto relaxina humana ou análogo da relaxina humana pode ser isolado por qualquer um de uma grande variedade de métodos, todos eles são reconhecidos no campo do isolamento de proteínas. As técnicas mais vulgarmente empregues para a purificação de relaxina são as técnicas cromatográficas. Estas são facilmente aplicáveis na recuperação de relaxina humana obtida pelo processo deste invento. Elas podem incluir ! filtração em gel, cromatografia de permuta iónica ou HPLC de j fase reversa. |
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Um exemplo de um esquema de puri- ! ficação consistiu na aplicação dos sobrenadantes de reacção totalizando 0,5 a 1 grama do peptideo relaxina numa coluna (5x 50 cm). Vydac 300 2 (15-20 microns). A purificação foi conseguida usando um gradiente de 20 a 40% de açetonitrilo (mudança de 0,5% por minuto) em Hg0' θ,1% TFA. O fluxo foi de 25 ml/min e colheram-se fracções de 10 minutos. Estas foram controladas isocráticamente com 25% açetonitrilo, HgO, 0,1% TFA numa coluna analítica (4,6 x 250 mm) Vydac C4 300 8 (5 microns). As fracções contendo os principais produtos foram reunidos e liofilizadas para posterior análise.
A relaxina humana e os análogos da relaxina humana foram testados em bioensaios. No ensaio da sinfise púbica murina (MP5) usou-se ratinhos fêmea CFW albinos de Charles River pesando 18-20 g, J. St. Louis, Can. J. Physiol. Pharmacol. 59 , 507-512 (1981). A solução indutora de estradiol é 5 qg de estradiol 17p~ciclopentilpropionato em 0,1 ml de óleo de amendoim. As soluções dose de relaxina humana são em concentrações de 2,5, 5,0, 10,0, 20,0, 40,0 e 80,0 qg/ml numa solução a 1% de benzopurpurina 4B em água. Após os ratinhos terem estados engaiolados durante pelo menos seis dias em quarentena e pesando 18-20 g, cada um recebeu uma injecção subcutânea de solução indutora de estradiol. Exactamente sete dias mais tarde os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 0,2 ml da solução dose adequada de relaxina humana. Entre 18 e 20 horas após a injecção de relaxina humana os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical. Expôs-se o ligamento interpúbico e mediu-se com um micrómetro.
Ratos fêmea albinos derivados de Sprague-Dawley Charles River pesando 202-300 gramas foram usados para o ensaio de contractilidade uterina de rato (RVC). A solução indutora de estradiol é de 200 çg de estradiol 17B-ciclopentilpropionato em 0,1 ml de óleo de amendoim. A solução stock de relaxina humana está numa concentração de 0,1 mg/ml em água estéril para injecção (Invenex). Os ratos após terem estado engaiolados durante pelo menos seis dias em quarentena receberam cada um, uma injecção subcutânea de solução indutora de estradiol. Entre 16 e 20 horas após a injecção de estradiol os ratos foram mortos por asfixia com dióxido de carbono. Os úteros foram dissecados, as trompas cortadas a meio e divididas lateralmente, quatro pedaços de útero por animal. Cada tecido foi suspenso num banho de jactos de água mantido a 37° C contendo 35 ml de Solução de Holmans Ringer arejada.
Provocou-se a contracção substituindo a solução de Ringer por uma em que 20 por cento do cloreto de sódio foi substituído por uma quantidade equimolar de cloreto de potássio. Após atingido um patamar estável adicionou-se ao banho uma concentração de relaxina. Para a curva padrão as doses de relaxina porcina adicionadas ao banho foram de 0,2;
0,4; 0,8, 1,6, 3,2, 6,4 e 12,8 gg de relaxina por 35 ml.
A indução de espessamento cervical com relaxina humana foi testada em gravidez de primata não humano. Testou-se a relaxina humana em macacos Rhesus com o tempo de acasalamento controlado nas idades gestacionais de
130 a 160 dias. O fim da gestação na colónia é de 168 í 6 dias. Os animais foram adaptados ao uso de coletes comtéteros. Os coletes com teteros permitiram o acesso contínuo a catéteros internos colocados nos vasos femurais ou na carótida e vasos jugulares internos. Na maior parte dos animais colocou-se um transdutor de pressão dentro do saco aminiótico e ligaram-se electrodos à superfície uterina permitindo a medição da actividade contráctil uterina. Administrou-se relaxina como uma infusão IV continua durante uma hora, tendo-se obtido amostras de sangue antes, durante e após a infusão com inte valos de 15 minutos ao longo da primeira hora após infusão e depois regularmente durante 24 horas. As doses de relaxina variaram entre 10 gg e 100 gg e avaliou-se o cervix quanto à textura, apagamento, posição, dilatação e posição fetal relativa ao cervix, assim como a qualidade do segmento inferior uterino. Na maior parte dos casos, em observadores examinaram cada cervix e avaliaram-no independentemente. As testemunhas foram macacos operados e a quem se fez infusão de soro fisiológico (um) ou macacos mantidos na colónia mas não operados com exames cervicais efectuados com intervalos semanais.
Fizeram-se transferências Western e electroforese em gel de poliacrilamida e ureia para isolar
-17proteina. Usaram-se géis para baixos pesos moleculares com 15% de poliacrilamida e ureia seguindo o processo descrito por Bethesda Research Laboratories na sua brochura para padrões de peso molecular. Usaram-se algumas modificações daquele processo. Os géis correram na câmara fria, 42C, durante 15 horas a uma voltagem constante de 100 volts. Prepararam-se amostras em fosfato de sódio 10 mM pH 7,2, ureia 7M, 0,01% de azul de bromofenol e para as amostras reduzidas DTT 50 mM preparado de fresco. Entre 1 e 10 qg de peptideo total foi incubado a 90°C durante 2-3 minutos antes da aplicação. Incubaram-se os géis a 90QC durante 2-3 minutos antes da aplicação. Os géis foram visualizados por Coomassie Blue (gel lavado durante 1,5 horas em 10 ml de ácido acético mais 90 ml (0,25% peso/volume) de Coomassie Blue R-250 em 25% de etanol) coloração em prata (Oakley, B.R. et al., Analytical Biochem. (1980) 105, 361-363), após fixação e descoloração numa solução de 0,2% de formaldeido, 20% de etanol e 6,2% de ácido acético (tudo volume/volume) durante 15-30 minutos e análise Western (Towbin, H. et al. , PNAS (1979) 76 , 4350-4353).
Induziu-se anticorpos específicos contra as cadeias A e B por imunização de coelhos brancos da Nova Zelândia com os peptideos livres precipitados com alum ou em adjuvante de Freund conforme descrito em Eddie, L.W. et al., (1986) The Lancet 1, 1344-1346. os titulos foram essencialmente os mesmos e os anti-soros de cada imunização foram reunidos com titulo bb para a cadeia A e com titulo ccc para a cadeia B. Estes foram usados numa diluição de 500 vezes na incubação contra os filtros de nitrocelulose 2 horas a
125 horas. Os filtros lavados incubaram-se então contra I-proteina A durante 2 horas, secaram-se e colocaram-se contra filme de raios X.
Como ilustração do método do invento são dados os exemplos que se seguem. Estes exemplos são estabelecidos com fins ilustrativos apenas e não se pretendem como limitantes do âmbito deste invento.
EXEMPLO 1
Relaxina humana natural
H2(B33-A24)
A cadeia A reduzida da relaxina (10 mg) foi adicionada como pó liofilizado, sólido e reduzido à mistura de reacção. A cadeia B reduzida da relaxina (5,63 mg) foi também adicionada como pó sólido liofilizado.
As soluções das cadeias A e B da relaxina foram combinadas numa ampola de 10 ml à temperatura ambiente (v25QC) adicionando primeiro a cadeia A da relaxina seguido da cadeia B da relaxina na forma de pós sólidos liofilizados descritos atrás. O pH foi ajustado a 10,5 usando naOH. A reacção foi controlada por HPLC analítica de fase reversa em RP4 para se obter formação máxima de relaxina recombinada. Devido à insolubilidade da forma natural da cadeia B de H2, a sua recombinação com a cadeia A de acordo com o invento necessitou das condições finais dereacção que se seguem 0,1 M glicina, pH 10,5, 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 3% 1-propanol, 3% acetonitrilo e 1 mM ureia.
A reacção foi agitada aberta ao ar durante 28 horas à temperatura ambiente. A formação de
relaxina foi controlada por HPLC analitica de fase reversa e terminada como descrito atrás. A análise por cromatografia liquida de alta resolução (HPLC) indicou um rendimento de relaxina de 1,87 mg ou 19,5% de incorporação da cadeia B.
A mistura foi purificada por
HPLC preparativa de fase reversa em RP-4 (1 x 25 cm) RP-4 Synchropak 300A. 0 pico foi reunido e usado directamente do solvente de HPLC. A relaxina humana pareceu estar muito pura por electroforese em gel de poliacrilamida, análise de aminoácidos por HPLC, sequenciação terminal amino e bioensaio.
EXEMPLO 2 i I
Análogo da relaxina humana ,
H2(B33 A24)BLis4 BAla25
Dissolveu-se a cadeia A reduzida da relaxina humana (200 mg) em 40 ml de H_O (pH 2,0). DissolZ 4 25 veu-se a cadeia B reduzida da relaxina humana (B33O Lis Ala ) tí (100 mg) em 20 ml de H^O (pH 2).
Combinaram-se as soluções de análogos da cadeia A e B num recipiente de 165 ml à temperatura ambiente ( ~25°C) adicionando primeiro a cadeia A seguido da cadeia B modificada dos stocks precedentes frescos em H2O, pH 2. O pH foi ajustado a cerca de 8,0 com NaOH. Controlou-se a reacção por HPLC de fase reversa em RP-4 para formação máxima do análogo da relaxina humana. Para este análogo da relaxina humana e de acordo com o presente invento usaram-se as seguintes condições:
reacção B Ο,ΙΜ Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 242C.
A reacção foi agitada vigorosamente aberta ao ar. A reacção de combinação foi parada pela adição de ácido acético glacial para pH 4.
Precipitou-se a mistura por HPLC preparativa Vydac C4 300 & (5 x 50 cm). O pico de análogo da relaxina humana (volume de eluição de cerca de 140 ml) foi reunido e liofilizado com uma recuperação de 35 mg de relaxina ou 20,3% de incorporação de cadeia B. O análogo da relaxina humana pareceu estar bastante puro pela electroforese em gel de poliacrilamida, análise de aminoácidos sequenciação amino terminal, HPLC (ver Figura 2a) e bioensaio.
EXEMPLO 3
Análogo da relaxina humana
H2 (B2-33 A24) Lis4 nAla25 tí£5
Dissolveu-se a cadeia A reduzida da relaxina humana (41,5 mg) em 8 ml de H„0 (pH 2,0). A caZ 425 deia B reduzida da relaxina humana (B2-33 _Lis DAla ) tíD (23 mg) com o primeiro aminoácido retirado do extremo amino foi dissolvida em 4 ml de H2O (pH 2).
As soluções de análogos da cadeia A e B foram combinadas numa ampola de 33 ml à temperatura (~252C) adicionando primeiro a cadeia A seguido da cadeia B modificada dos stocks precedentes frescos em H2O, pH2.
pH foi ajustado a 8,0 com NaOH.
A reacção foi controlada por HPLC de fase reversa em RP-4 para formação máxima do análogo de relaxina humana combinada, j Para este análogo da relaxina e de acordo com o presente invento usaram-se as condições que se seguem: reacção D O,1M Tris, pH 8,0, 252 C; gaseado com N2 e agitado em atmosfera de N2 durante 1-2 horas iniciais. A reacção foi então vigorosamente agitada aberta ao ar. A reacção de combinação foi pesada pela adição de ácido acético glacial para pH4.
A mistura foi purificada por
HPLC preparativa Vydac C4 300 8 (5 x 80 cm). O pico do análo- ; go da relaina (volume de eluição cerca de 140 ml) foi reuni- ' do e liofilizado com uma recuperação de 16 mg de análogo da relaxina humana ou 40,3 % de incorporação da cadeia Β. O j análogo da relaxina pareceu estar muito puro por electroforese em gel de poliacrilamida análise de aminoácidos, sequenciação terminal amino, HPLC (ver Figura 2a) e o bioensaio.
EXEMPLO 4
Análogo da relaxina humana
425
H2 (B2-33 A24)a piro-Glu nLis nAla
A tíJd
Dissolveu-se a cadeia A reduzida da relaxina humana (41,5 mg) em 8 ml de H„O (pH 2,0). DissolZ4 veu-se a cadeia B reduzida da relaxina humana (B2-33 DLis
25,
Ala ) com o primeiro aminoácido do extremo amino eliminado (23 mg) em 4 ml de H2O (pH2).
As soluções de análogos da cadeia A e B foram combinadas num recipiente de 33 ml à temperatura ambiente (~25°C) adicionando primeiro a cadeia A seguido da cadeia B modificada dos stocks precedentes frescos em H20, pH2. 0 pH foi ajustado a 8,0 com NaOH. Controlou-se a reacção por HPLC de fase reversa em Rp-4 para formação máxima do análogo da relaxina humana combinada, para este análogo da relaxina e de acordo com o presente invento usaram-se as condições que se seguem: reacção D O,1M Tris, pH 8, 25° C; gaseado com N2 e agitado em atmosfera de N2 durante 1-2 horas iniciais. A reacção foi então agitada vigorosamente aberta ao ar. A reacção de combinação foi parada pela adição de ácido acético i glacial para pH4.
A mistura foi purificada por HPLC I preparativa Vydac C4 300 S (5x80 cm). O pico de análogo da relaxina (volume de eluição cerca de 140 ml) foi reunido e liofilizado com uma recuperação de 7,5 mg de análogo da relaxina humana ou 18,9% de incorporação da cadeia B. O análogo da relaxina pareceu estar muito puro por electroforese em gel de poliacrilamida, análise de aminoácidos, sequenciação terminal amino, HPLC (ver Figura 2a) e o bioensaio.
EXEMPLO 5
Análogo da relaxina humana
425
H2 (B33 A24). piro-Glu D Lis „Ala
A bb
A cadeia A reduzida da relaxina humana (200 mg) foi dissolvida em 40 ml de H„O (pH 2,0). A Z 425 cadeia B reduzida da relaxina humana (B33 _Lis _Ala ) bb
(100 mg) foi dissolvida em 20 ml de í^O (pH2).
I
Combinaram-se as soluções de aná- i logos das cadeias A e B num recipiente de 165 ml à temperatura ! ambiente (~25°C) adicionando primeiro a cadeia A seguido da j cadeia B modificada dos stocks precedentes frescos em f^O j pH 2. O pH foi ajustado a cerca de 8,0 com NaOH. A reacção ] foi controlada por HPLC da fase reversa em RP-4 para a formação máxima do análogo relaxina humana combinada. Para este análogo da relaxina humana e de acordo com o presente invento usaram-se as condições que se seguem: reacção B O,1M glicinato de sódio, pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 24°C. A reacção foi agitada vigorosamente aberta ao ar. A reacção de combinação foi parada pela adição de ácido acético glacial para pH4.
i i
A mistura foi purificada por HPLC j preparativa Vydac C4 300 § (5 x 50 cm). O pico de análogo da 1 relaxina humana (volume de eluição cerca de 140 ml) foi reu! nido e liofilizado com uma recuperação de 16 mg de relaxina | ou 9,3% de incorporação da cadeia B. O análogo da relaxina humana paraceu estar bastante puro por electroforese em gel de poliacrilamida, análise de aminoácidos, sequenciação terminal amino, HPLC (ver Figura 2a) e o bioensaio.
EXEMPLO 6
Ensaios biológicos lidade uterina de rato para relaxar o musculo
O bioensaio in vitro da contractimede a capacidade da relaxina humana liso na presença de contracções estimu-
-24ladas eléctricamente, J. St. Louis, (1981) Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507-512. O bioensaio in vivo do ligamento da sinfese púbica murina mede o efeito de remodelação da relaxina sobre o tecido conjuntivo, Steinetz, B.G. et al., (1960) Endocrinology 67, 102. As comparações de dose-res-
425 posta biológica de H2(B2-33 A 24), H2 (B32 A24)nLis DAla
25BB
H2 (B33 A24) Lis Ala e as formas piro-Glu das precedentes 7? o c /19 R
H2 (B2-33 A24)nLis „Ala Apiro-Glu e H„ (B33 A24)nLis „Ala d d A Zdd piro-Glu indicaram actividade biológica em ambos os ensaios A
MPS e RVC. Os resultados de MPS para um análogo da relaxina humana e para a relaxina humana estão apresentados na Figura 3.
As doses-respostas de MPS indicam equipotência para a relaxina humana natural e H2 (B2-33 A24)
25 „Lis „Ala , Figura 3. No entanto, a relaxina porcina parece D D ter uma resposta não paralela relativa às de outras relaxinas. Todos os análogos humanos e sequência natural da relaxina humana praticamente não se distinguem no bioensaio MPS.
devido à quantidade de H2 (B33 a24) purificada disponível poderá apenas ser comparado no extremo alto da gama de dosagem, os resultados estabelecem a semelhança de actividade da relaxina humana nativa e das formas análogos da relaxina humana. 0 declive da curva de dose resposta para a relaxina humana devem diferir do dos análogos.
No bioensaio RVC os declives da relaxina humana e os análogos da relaxina humana são idênticos .
EXEMPLO 7
Relaxina humana em gravidez de primatas
Dois análogos da relaxina humana H2(B33 A24)T>Lis4 oAla25 e H2 (B2-33 A24) Lis4 Ala25 foram tesb b tados em macacos Rhesus com controlo de alturas de acasalamento nas idades gestacionais de 130 a 160 dias usando a metodologia descrita atrás.
Usando uma pontuação de Bishop modificada para os parâmetros observados, a alteração cervical média para 7 infusões separados de vários doses foi de 3,7 unidades. Estes resultados estão apresentados na Figura 5, onde estão mostradas as infusões individuais a doses de 100, 50 e 10 gg assim como uma média de todas as outras infusões de 10 gg e os dois tipos de testemunhas. Note-se que os macacos testemunhas não submetidos a infusão variam de 2 a 15 determinações por ponto (excepto para dois pontos cada um representativo de pelo menos 4 macacos) e a média representai gráficamente. Em geral, a cervix era mais sensível a doses mais baixas de relaxina à medida que a gestação progedia ou à administração repetida de relaxina numa fase inicial deste periodo de tempo. Doses altas de relaxina (100 ou 50 gg) foram capazes de efectuar alterações significativas no amadurecimento cervical (induzindo uma alteração de 1 a 10 na pontuação) mesmo em períodos de tempo relativamente precoces na gestação (130-140d). As alterações cervicais pareceram ocorrer independentemente de qualquer alteração consistente na actividade electromiográfica uterina ou na pressão intrauterina. Estes resultados indicam que a relaxina humana combinada é altamente eficaz na provocação de espessamento cervical em primatas durante o último terço da gestação.
A relaxina humana e os análogos da relaxina humana do presente invento podem ser formulados usando métodos conhecidos para preparar composições farmacêuticamente úteis de modo a que a relaxina humana ou um seu análogo seja combinado com um veiculo farmacêuticamente aceitável. Veiculos farmaceuticamente aceitáveis e sua formulação incluindo outras proteínas humanas necessárias e.g. albumina do soro bovina estão descritas em tratados de formulações padrão e.g. Pharmaceutical Sciences de Remington por
Claims (6)
- -27REIVINDICÃÇÕES:11. - Método para combinação de uma cadeia A de relaxina humana ou seu análogo e de uma cadeia B de relaxina humana ou seu análogo para produzir relaxina humana ou análogo de relaxina humana caracterizado por compreender a mistura da forma reduzida da cadeia A e da forma reduzida da cadeia B num meio aquoso tendo um pH entre cerca de 7,0 a cerca de 12 e em condições que são suavemente desnaturantes para a cadeia B da relaxina humana de modo a que se forme relaxina humana ou análogo da relaxina humana.21. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia A da relaxina humana e a forma reduzida da cadeia B da relaxina humana terem cada uma a sequência de aminoácidos representada pela relaxina humana natural (f^).31. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a forma reduzida da cadeia A da relaxina humana e a forma reduzida da cadeia B da relaxina humana terem cada uma a sequência de aminoácidos representada pela relaxina humana natural (H^).41. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia A da relaxina humana ser um análogo da referida cadeia A.51. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia BS S [ S q;-28da relaxina humana ser um análogo da referida cadeia B.
- 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia B da relaxina humana ter pelo menos vinte cinco e até trinta e três aminoácidos inclusivé com uma substituição de pelo menos uma metionina na referida cadeia.
- 7â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia B da relaxina humana ser encurtada para trinta e dois aminoácidos com uma lisina na posição 4 e alanina na posição 25 da referida cadeia.
- 8a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida mistura ser conduzida a uma temperatura entre cerca de 15°C e cerca de 30°C.
- 9a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida mistura ser conduzida à temperatura ambiente.
- 10a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a forma reduzida da cadeia A da relaxina humana ter uma piro-Glu na posição 1 da referida cadeia.
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