CN110381997A - 用于治疗和预防癌症和感染性疾病的包含病毒基因治疗和免疫检查点抑制剂的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗和预防癌症和感染性疾病的包含病毒基因治疗和免疫检查点抑制剂的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本文中提供了用于治疗个体中的癌症的方法和组合物，所述方法包括向个体施用有效量的至少一种免疫检查点抑制剂和包含一种或更多种病毒的病毒组合物，所述一种或更多种病毒经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因。本文中还提供了用于治疗个体中的癌症的方法和组合物，所述方法包括向个体施用有效量的包含两种或更多种病毒的病毒组合物，所述两种或更多种病毒经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因。本文中还提供了通过将上述药剂与其他癌症治疗组合施用来增强抗肿瘤效力的方法。

Description

用于治疗和预防癌症和感染性疾病的包含病毒基因治疗和免 疫检查点抑制剂的方法和组合物
本申请要求于2016年12月12日提交的美国临时申请序列号62/433,075、2016年12月22日提交的美国临时申请序列号62/438,273、2017年1月9日提交的美国临时申请序列号62/444,160的优先权权益，各申请的全部内容在此通过引用并入。
发明背景
1.技术领域
本发明一般涉及生物学和医学领域。更具体地，其涉及组合经遗传改造的病毒的方法和组合物，所述病毒诱导局部和/或远位效应。
2.背景技术
目前用于癌症的治疗涉及局部区域治疗(如外科手术或放射)，以及全身施用的药剂(如化学治疗和单克隆抗体)。
在转移性癌症的治疗中，远位效应是不常见的现象，在远位效应中肿瘤的局部治疗引起经治疗的肿瘤和局部治疗范围之外的另外的肿瘤的消退。这一现象最初是在1953年由提出术语“远位”(‘ab’-远离、‘scopus’-靶)的医生R.H.Mole定义为放射治疗，是指距经治疗体积一定距离但在同一生物体内的治疗作用(Mole，1953)。
尽管在局部和全身癌症治疗二者中都取得了进展，但估计在美国每年将有约500,000个人死于癌症。因此，对于可以提高局部和远位效力的改进的癌症治疗存在未满足的需求。
发明内容
在某些实施方案中，本公开内容提供了通过施用病毒组合物来治疗癌症的治疗对象中的癌症的方法。在一个实施方案中，本公开内容提供了治疗对象中的癌症的方法和组合物，所述方法包括向对象施用有效量的经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的两种或更多种病毒。在某些方面，腺病毒死亡蛋白是过表达的。在一些特定方面，经改造成包含N1L缺失的病毒是牛痘病毒。在一些方面，经改造成包含细胞色素p450基因的病毒是单纯疱疹病毒。在某些方面，经改造成包含基质降解蛋白和/或腺病毒死亡蛋白的病毒是腺病毒。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了治疗对象中的癌症的方法和组合物，所述方法包括向对象施用有效量的(a)经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒，和(b)至少一种免疫检查点抑制剂。在某些方面，施用多于一种检查点抑制剂。在一些特定方面，施用一种、两种、三种或所有四种病毒。在某些方面，腺病毒死亡蛋白是过表达的。在一些特定方面，经改造成包含N1L缺失的病毒是牛痘病毒。在一些方面，经改造成包含细胞色素p450基因的病毒是单纯疱疹病毒。在某些方面，经改造成包含基质降解蛋白和/或腺病毒死亡蛋白的病毒是腺病毒。
在一个特定方面，以上实施方案中的病毒组合物可包含以下病毒中的一种、两种、三种或四种：(a)经改造成表达松弛素基因的病毒，(b)经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒，(c)经改造成使N1L基因缺失的牛痘病毒，和(d)经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒。
在一个实施方案中，本公开内容提供了用于治疗或预防对象中的癌症或感染性疾病的方法和组合物，所述方法包括向对象施用有效量的(a)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的牛痘病毒，所述病毒包含N1L基因缺失，和(b)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的至少第二病毒(优选腺病毒)。在某些方面，肿瘤相关抗原是间皮素、黑素瘤相关基因(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、突变的Ras，或突变的p53。在某些方面，病原体相关抗原是由感染性病毒、细菌、真菌、朊病毒，或寄生生物表达的抗原。在一些方面，由牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是相同的。在另一些方面，由牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是不同的。在某些方面，在施用表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的N1L缺失的牛痘病毒之前施用第二病毒(优选腺病毒)。在某些方面，向对象施用病毒组合物多于一次，例如提供初始引发免疫接种之后进行一次或更多次加强免疫接种。在一些方面，进一步向对象施用肿瘤抑制免疫基因治疗(参见，PCT/US2016/060833，其通过引用整体并入本文)。
在一些方面，以上实施方案的病毒包含腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。在某些方面，病毒包含一种或更多种腺病毒。
在一些方面，基质降解蛋白是松弛素、透明质酸酶，或饰胶蛋白聚糖。在一些特定方面，基质降解蛋白是松弛素。
在某些方面，细胞色素p450基因是细胞色素p450 2B1基因。在一些特定方面，细胞色素p450 2B1基因是大鼠细胞色素p450 2B1基因。
在一些方面，病毒组合物诱导局部和/或远位效应。在一些方面，病毒组合物诱导局部和远位效应。
在某些方面，病毒是有复制能力的(replication competent)或溶瘤的。在某些方面，病毒是复制缺陷型的(replication incompetent)。在某些方面，病毒组合物包含有复制能力的和复制缺陷型病毒的组合。
在一些方面，经改造成表达松弛素的病毒和/或经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)的病毒是腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，或口炎病毒。在一些特定方面，经改造成表达松弛素的病毒和/或经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)的病毒是腺病毒。
在一些特定方面，经治疗的对象是哺乳动物或人。在某些方面，提供治疗以预防或治疗恶性前或恶性过度增殖性病症。在预防的某些方面，对象是健康对象。在预防的另一些方面，对象包含恶性病变，例如如白斑病(leukoplakia)或发育不良性病变。在预防的另一些方面，对象处于发生癌症的风险中，例如，通过作为吸烟者或具有癌症家族史。在某些方面，治疗是针对初始或复发的过度增殖性病症。在一些方面，施用治疗以增强或逆转对另一种治疗的抗性。在某些方面，对于特定的过度增殖性病症患者群体，历史上已知对治疗的抗性。在某些方面，在个体过度增殖性病症患者中观察到对治疗的抗性。
在某些方面，施用于对象的病毒被改造成表达松弛素。在一些方面，松弛素是全长松弛素。在另一些方面，松弛素是保留生物活性的松弛素分子的片段(例如，描述于美国专利No.5,023,321中)。在一些特定方面，松弛素是重组人松弛素(H2)或具有松弛素样活性的其他活性剂，例如竞争性地从受体中置换结合的松弛素的活性剂。
在某些方面，经改造成过表达ADP的病毒是被称为VRX-007的血清5型腺病毒(即，经改造成使大部分E3区缺失并过表达E3-11.6K腺病毒死亡蛋白(ADP)的溶瘤腺病毒载体)。还可修饰VRX-007以表达其他治疗基因。先前描述了VRX-007的构建(Doronin 2003；Tollefson 1996；Lichtenstein 2004)。
在某些方面，经改造成使N1L缺失的牛痘病毒来源于Western Reserve、Wyeth和Lister毒株。已经产生了这些毒株中的每一种的多种缺失突变体。在某些方面，采用的N1L缺失衍生物VVL 15N1L描述于Wang等，2015(专利WO2015/150809A1)中。还可修饰VVL 15N1L载体以表达包括但不限于IL-12和/或松弛素的治疗基因。在一些方面，VVL 15N1L载体还与免疫检查点抑制剂和PI3K抑制剂组合。在一个特定方面，施用PI3Kδ或PI3Kγ/δ抑制剂以增强病毒载体的静脉内施用。在一种特定方法中，在静脉内施用VVL 15N1L载体之前(例如数小时)向对象施用PI3Kδ抑制剂。
在某些方面，如(Aghi等，1999)中进一步描述的，经改造成表达大鼠细胞色素p4502B1基因的单纯疱疹病毒具有缺失的ICP6基因并被称为rRp450。该载体编码环磷酰胺(CPA)敏感性大鼠细胞色素p450 2B1和更昔洛韦(GCV)敏感性单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的表达。细胞色素p450和HSV-TK基因的表达分别导致CPA和GCV前药转化为其治疗活性代谢物。在一些特定方面，rRp450与CPA和GCV组合施用。
在某些方面，至少一种检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR，或A2aR的抑制剂。在一些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一些方面，抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。在某些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)抗体。在一些实施方案中，抗KIR抗体是利瑞单抗(lirilumab)。在一些方面，PD-L1的抑制剂是杜伐单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或avelumab。在一些方面，PD-L2的抑制剂是rHIgM12B7。在一些方面，LAG3抑制剂是IMP321或BMS-986016。在一些方面，A2aR的抑制剂是PBF-509。
在一些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)轴结合拮抗剂。在某些方面，PD-1轴结合拮抗剂选自PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。在一些方面，PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在某些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PDL1和/或PDL2的结合。特别地，PD-1结合拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗、匹地利珠单抗(pidillizumab)、AMP-514、REGN2810、CT-011、BMS 936559、MPDL328OA或AMP-224。
在一些方面，病毒组合物经瘤内、动脉内、静脉内、血管内、胸膜内、腹膜内、气管内、鞘内、肌内、通过内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域、立体定向，或者通过直接注射或灌注施用。在一些方面，施用是通过连续输注、瘤内注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射，或鞘内注射进行的。在一些方面，病毒组合物经皮内、皮下、肌内、腹膜内、经口、通过吸入或通过其他形式的黏膜暴露施用。
在某些方面，在至少一种免疫检查点抑制剂之后向对象施用病毒组合物。在某些方面，在至少一种免疫检查点抑制剂之前向对象施用病毒组合物。在某些方面，与至少一种免疫检查点抑制剂同时向对象施用病毒组合物。在一些方面，病毒组合物被局部施用于对象并对未经治疗的远端肿瘤诱导远位效应。在一些方面，病毒组合物和至少一种免疫检查点抑制剂对未用病毒组合物注射的远端肿瘤诱导远位效应。
在某些方面，癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖器癌、呼吸道癌、造血癌、肌肉骨骼癌、神经内分泌癌、上皮癌、肉瘤、中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在一些方面，癌症是转移性的。
在某些方面，病毒组合物以约103至约1013个病毒颗粒施用。在一些方面，病毒组合物经静脉内、动脉内、血管内、胸膜内、腹膜内、气管内、瘤内、鞘内、肌内、通过内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域、立体定向或者通过直接注射或灌注施用于对象。在某些方面，向对象施用病毒组合物多于一次。病毒组合物可施用于经治疗对象中的一个或更多个肿瘤。
在一些方面，病毒组合物还被改造成表达治疗性核酸。在某些方面，治疗性核酸是肿瘤抑制基因、免疫刺激基因、放射增强基因，或化学治疗增强基因。在某些方面，治疗性核酸还可调节另一些基因(例如siRNA或miRNA)的表达。在一些方面，治疗基因编码具有相似或改进功能的p53和/或IL-24或其变体。在另一些方面，恢复或增强p53或IL-24功能的方法且这些方法是本领域已知的，并且也考虑用于本发明的实施方案中。
在某些方面，施用包括局部或区域注射。在另一些方面，施用是通过连续输注、瘤内注射、静脉内或动脉内注射进行的。
在一些方面，所述方法还包括施用至少一种另外的抗癌治疗。在某些方面，至少一种另外的抗癌治疗是手术治疗、化学治疗(例如，施用蛋白激酶抑制剂或EGFR靶向治疗)、栓塞治疗、化学栓塞治疗、放射治疗、冷冻治疗、高热治疗、光治疗、放射消融治疗、激素治疗、免疫治疗、小分子治疗、受体激酶抑制剂治疗、抗血管生成治疗、细胞因子治疗或生物治疗例如单克隆抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因治疗。在一些特定方面，至少一种另外的抗癌治疗是蛋白激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂。在一个具体方面，蛋白激酶抑制剂是布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)抑制剂(例如，依鲁替尼、阿卡替尼(acalabrutinib)(ACP-196)、ONO-4059、司培替尼(spebrutinib)(CC-292)、HM-71224、CG-036806、GDC-0834、ONO-4049、RN-486、SNS-062、TAS-5567、AVL-101、AVL-291、PCI-45261、HCI-1684、PLS-123，或BGB-3111)。在一些方面，一种或更多种BTK抑制剂与病毒组合物组合施用。在某些方面，一种或更多种BTK抑制剂与病毒组合物和至少一种免疫检查点抑制剂组合施用。在一些方面，至少一种另外的抗癌治疗是HDM2(也称为MDM2)和/或HDM4的抑制剂(例如，小分子抑制剂)，例如以逆转其对p53活性的抑制。在一些具体方面，HDM2的小分子抑制剂是HDM201、顺式-咪唑啉(例如，Nutlin)、苯二氮卓(BDP)、螺-羟吲哚(spiro-oxindole)。
在一些方面，免疫治疗包含细胞因子。在一些具体方面，细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(例如IL-2)，和/或干扰素(例如IFN-α)。增强肿瘤靶向免疫应答的另外的方法包括另外的免疫检查点抑制。在一些方面，免疫检查点抑制包括抗CTLA4、抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗TIM-3、抗LAG-3、抗A2aR或抗KIR抗体。在一些方面，免疫治疗包括共刺激受体激动剂，例如抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD137抗体、抗CD40抗体，和抗CD27抗体。在某些方面，免疫治疗包括抑制调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cell，MDSC)和癌症相关成纤维细胞(CAF)。在另外的一些方面，免疫治疗包括刺激固有免疫细胞，例如天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和树突细胞。另外的免疫刺激治疗可包括IDO抑制剂、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂、干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)激动剂、Toll样受体(TLR)激动剂(例如，TLR7、TLR8或TLR9)、肿瘤疫苗(例如，全肿瘤细胞疫苗、肽和重组肿瘤相关抗原疫苗)和过继性细胞治疗(adoptive cellular therapy，ACT)(例如，T细胞、天然杀伤细胞、TIL和LAK细胞)。在某些方面，可使用这些试剂的组合，例如组合免疫检查点抑制剂、检查点抑制加T细胞共刺激受体的激动作用以及检查点抑制加TILACT。在某些方面，另外的抗癌治疗包括抗PD-L1免疫检查点抑制剂(例如Avelumab)、4-1BB(CD-137)激动剂(例如Utomilumab)和OX40(TNFRS4)激动剂的组合。
在一些方面，化学治疗包含DNA损伤剂。在一些实施方案中，DNA损伤剂是γ辐照、X射线、UV辐照、微波、电子发射、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、卡培他滨、依托泊苷(VP-16)、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)或过氧化氢。在一些具体方面，DNA损伤剂是5FU或卡培他滨。在一些方面，化学治疗包含顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP-16)、他莫昔芬、泰索帝、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、HDAC抑制剂或其任何类似物或衍生物变体。
在一些方面，至少一种另外的抗癌治疗是有复制能力的或复制缺陷型病毒。在某些方面，有复制能力的或复制缺陷型病毒是腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、EB病毒、流感病毒或呼肠孤病毒。在一些具体方面，有复制能力的或复制缺陷型病毒是单纯疱疹病毒。在一些方面，有复制能力的或复制缺陷型病毒被改造成表达转基因，例如肿瘤抑制物(例如，p53)和/或细胞因子(例如，IL-24)。在一些实施方案中，细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因于(GM-CSF)。在一些实施方案中，有复制能力的或复制缺陷型病毒被进一步限定为talimogene laherparepve(T-VEC)(例如IMLYGICTM)。在一些实施方案中，另外的有复制能力的或复制缺陷型病毒在局部/远位病毒组合物和免疫检查点抑制剂之前、同时或之后施用。
在一些方面，至少一种另外的癌症治疗是蛋白激酶抑制剂或抑制参与蛋白激酶或生长因子信号传导途径之受体的单克隆抗体。例如，蛋白激酶或受体抑制剂可以是EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Abl、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。在一些具体方面，蛋白激酶抑制剂是PI3K抑制剂。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是PI3Kδ抑制剂。例如，蛋白激酶或受体抑制剂可以是阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、博舒替尼、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福他替尼(Fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼(Lenvatinib)、木利替尼(Mubritinib)、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼(Pegaptanib)、雷珠单抗、鲁索替尼(Ruxolitinib)、塞卡替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、AP23451、威罗菲尼、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司、地磷莫司、Alvocidib、金雀异黄素、司美替尼、AZD-6244、瓦他拉尼、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016或其混合物。在某些方面，蛋白激酶抑制剂是AKT抑制剂(例如，MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新或哌立福新)。在某些方面，根据实施方案使用的EGFR靶向治疗包括但不限于EGFR/ErbB1/HER、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3和/或ErbB4/HER4的抑制剂。广泛的这样的抑制剂是已知的并且包括但不限于针对受体和EGFR结合抗体或适配体具有活性的酪氨酸激酶抑制剂。例如，EGFR抑制剂可以是吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼单抗、AEE788、CI-1033、HKI-272、HKI-357，或EKB-569。蛋白激酶抑制剂可为BRAF抑制剂(例如达拉菲尼)或MEK抑制剂(例如曲美替尼)。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含(a)经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒；和(b)至少一种免疫检查点抑制剂。在某些方面，腺病毒死亡蛋白是过表达的。在一些特定方面，经改造成包含N1L缺失的病毒是牛痘病毒。在一些方面，经改造成包含细胞色素p450基因的病毒是单纯疱疹病毒。在某些方面，经改造成包含基质降解蛋白和/或腺病毒死亡蛋白的病毒是腺病毒。
在一个特定方面，一种或更多种病毒选自经改造成表达松弛素基因的病毒、经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成使N1L基因缺失的牛痘病毒，和经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒。
在一些方面，以上实施方案的病毒包含腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。在某些方面，病毒包含一种或更多种腺病毒。
在一些方面，基质降解蛋白是松弛素、透明质酸酶，或饰胶蛋白聚糖。在一些特定方面，基质降解蛋白是松弛素。
在某些方面，细胞色素p450基因是细胞色素p450 2B1基因。在一些特定方面，细胞色素p450 2B1基因是大鼠细胞色素p450 2B1基因。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的两种或更多种病毒。在一些方面，所述组合物包含三种或四种病毒。
在一个特定方面，两种或更多种病毒选自经改造成表达松弛素基因的病毒、经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成使N1L基因缺失的牛痘病毒，和经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒。
在一些方面，病毒包含腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。在某些方面，病毒包含一种或更多种腺病毒。
在一些方面，基质降解蛋白是松弛素、透明质酸酶，或饰胶蛋白聚糖。在一些特定方面，基质降解蛋白是松弛素。
在某些方面，细胞色素p450基因是细胞色素p450 2B1基因。在一些特定方面，细胞色素p450 2B1基因是大鼠细胞色素p450 2B1基因。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含(a)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原和N1L基因缺失的牛痘病毒；和(b)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的至少第二病毒。在某些方面，组合物还包含免疫佐剂，例如已知提高抗-抗原免疫应答的佐剂。在一些方面，肿瘤相关抗原是间皮素、黑素瘤相关基因(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、突变的Ras，或突变的p53。在一些方面，病原体相关抗原是由感染性病毒、细菌、真菌、朊病毒，或寄生生物表达的抗原。在一个方面，表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的第二病毒是腺病毒。在多个方面，由牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原和由第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是相同或不同的。
本发明的其他目的、特征和优点将由以下详细描述而变得明显。然而，应当理解，虽然指出了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中提供的具体实施方案的详细描述参考这些附图中的一个或更多个，可更好地理解本发明。
图1：Ad-松弛素+抗PD-1局部效力：肿瘤体积。示出了接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照、抗PD-1、Ad-松弛素，或Ad-松弛素+抗PD-1的组合的啮齿动物中肿瘤体积随时间的图。在抗PD-1治疗期间存在严重的肿瘤进展，其中逆转由Ad-松弛素治疗诱导的抗PD-1抗性。与单独的抗PD-1或Ad-松弛素治疗相比，Ad-松弛素+抗PD-1处理具有协同增强的效力。到第8天，与单独的抗PD-1或Ad-松弛素治疗相比，用Ad-松弛素+抗PD-1的组合治疗诱导肿瘤体积的大幅降低。T检验统计分析确定了与单独的Ad-松弛素(p值0.0254)或单独的抗PD-1(p值0.0231)相比，Ad-松弛素+抗PD1的抗肿瘤作用是显著的。与单独的Ad-松弛素和抗PD-1治疗的适度作用相比，组合的Ad-松弛素和抗PD-1的效力提高是超过加和的，这与用PBS对照的处理无统计学差异。
图2：Ad-松弛素+抗PD-1远位效力：对侧肿瘤体积。其原发性肿瘤已接受Ad-松弛素或Ad-松弛素+抗PD-1处理的组合的啮齿动物中随时间的对侧肿瘤体积。在未接受病毒治疗注射的对侧(继发性)肿瘤中也观察到通过T检验的统计学显著的远位效应，与用单独的抗PD-1处理的原发性肿瘤的生长速率相比肿瘤生长降低。这些发现表明病毒处理(单独的Ad-松弛素和Ad-松弛素+抗PD1)诱导了远位效应。与用单独的抗PD-1处理的原发性肿瘤的生长速率相比，其原发性肿瘤已用单独的Ad-松弛素处理的动物中的对侧肿瘤显示出显著延迟的肿瘤生长(p＝0.0273)。与在抑制原发性肿瘤生长中观察到的协同效应一致，在其原发性肿瘤用组合的Ad-松弛素+抗PD-1处理的小鼠中观察到对对侧肿瘤生长的甚至更强的远位效应(p＝0.0009)。
图3：Ad-松弛素+抗PD1效力：存活。用PBS、抗PD-1、Ad-松弛素或Ad-松弛素+抗PD-1的组合处理的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。与用单独的抗PD-1处理相比，在其原发性肿瘤用组合的Ad-松弛素+抗PD-1处理的小鼠中通过对数秩检验显示存活统计学显著的提高(p＝0.0010)。组合的Ad-松弛素+抗PD-1组的中值存活的提高大于对于单独的Ad-松弛素和单独的抗PD-1观察到的分开效应的加和。与单独的抗PD-1相比，用单独的Ad-松弛素处理的小鼠的存活没有统计学显著的提高。多于加和的Ad-松弛素+抗PD-1的提高的存活的结果与在对于组合的Ad-松弛素+抗PD-1治疗的抑制原发性肿瘤生长和对对侧肿瘤生长的更大的远位效应中观察到的协同效应一致，并且反映了组合治疗的出乎意料的协同效应。
图4：VRX-007过表达腺病毒死亡蛋白+抗PD-L1效力：肿瘤体积。在ADS免疫活性动物肿瘤模型中评价免疫检查点抑制剂抗PD-L1处理与腺病毒死亡蛋白(ADP)基因治疗组合的效力。VRX-007是经改造成过表达ADP基因的腺病毒。比较了四个处理组，包括PBS载剂对照(N＝10)、抗PD-L1免疫检查点抑制剂(N＝10)、VRX-007(N＝4)和VRX-007+抗PD-L1(N＝4)。通过比较治疗开始之后15天(或在动物处死时)的肿瘤体积相对于基线值的百分比变化来评价治疗效力。Kruskal-Wallis单因素方差分析(秩的单因素ANOVA)显示了处理组之间的统计学显著性差异(p值＝0.0258)。组合的VRX-007+抗-PD-L1治疗(p＝0.0047)的统计学显著的抗肿瘤作用是出乎意料且具有出人意料的协同作用，因为VRX-007(p＝0.1232)和抗PD-L1(p＝0.5866)单独地与用载剂对照的处理无统计学差异。组合的VRX-007和抗PD-L1的效力提高多于加和，并且组合的处理在统计学上也优于单独的抗PD-L1治疗(p＝0.0157)。此外，T检验统计学分析显示，与单独的VRX-007相比，VRX-007+抗PD1的抗肿瘤作用是显著的(单侧p值＝0.0356)。组合的VRX-007+抗PD-L1治疗的效力和协同作用是出乎意料的，因为两种处理均未显示出单独的统计学显著的效力。
具体实施方式
众所周知，肿瘤在其开始和进展期间进化以逃避被免疫系统破坏。虽然最近使用免疫检查点抑制剂来逆转这种抗性已经显示出一些成功，但大多数患者对这些治疗没有响应。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于改变肿瘤的微环境以克服抗性和增强抗肿瘤免疫应答的方法和组合物。在一个实施方案中，提供了用于通过施用单独的病毒组合物或其与至少一种免疫检查点抑制剂组合来治疗癌症的方法。病毒组合物可包含经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒。在一种方法中，胞外基质降解治疗是松弛素基因治疗，例如腺病毒松弛素。特别地，腺病毒松弛素经瘤内或动脉内施用。
在示例性方法中，病毒组合物可包含经改造成表达松弛素基因的病毒、经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成使N1L基因缺失的牛痘病毒，和/或经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒。
特别地，病毒组合物是有复制能力的或溶瘤的。在某些方面，病毒组合物是复制缺陷型的或包含有复制能力的和复制缺陷型病毒的组合。特别地，病毒组合物诱导局部和/或远位效应。
在一种方法中，在施用病毒组合物以诱导适应性抗肿瘤免疫应答之前，将病毒组合物与免疫检查点抑制剂(例如抗PD1抗体或抗KIR抗体)组合施用以增强固有抗肿瘤免疫。作为替代地，病毒组合物可与免疫检查点抑制剂同时施用。
此外，治疗方法可以包括另外的抗癌治疗(例如细胞因子或化学治疗)以增强本文中提供的组合治疗的抗肿瘤作用。例如，细胞因子可以是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且化学治疗可以是5-氟尿嘧啶(5FU)或卡培他滨或环磷酰胺或PI3K抑制剂。
在本研究中，局部区域病毒组合物治疗逆转了对全身免疫检查点抑制剂治疗的抗性，显示出与免疫检查点抑制剂治疗的出乎意料的协同效应，并且组合治疗对未经病毒组合物处理的远端肿瘤诱导优异的远位效应。当与化学治疗、细胞因子治疗和已知调节源自骨髓的抑制细胞(MDSC)、T-Reg和树突细胞的试剂组合时，发现这些出乎意料的全身治疗效果增强。因此，本公开内容提供了通过增强固有和适应性抗肿瘤免疫应答以及克服对免疫检查点治疗的抗性和诱导远位全身治疗效果来治疗癌症的方法。
I.定义
如本文中使用的，就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
如本文说明书中使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文权利要求中使用的，当与词语“包含”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
在权利要求中使用术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出其仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，然而本公开内容还支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文中使用的，“另一个”可意指至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于表明值包括用于确定该值的装置、方法的误差的固有变化，或存在于研究对象中的变化。
如本文中使用的，“野生型”是指生物体基因组中遗传基因座处的核酸的天然存在的序列，以及由这样的核酸转录或翻译的序列。因此，术语“野生型”也可指由核酸编码的氨基酸序列。由于遗传基因座在个体群体中可能具有多于一个序列或等位基因，因此术语“野生型”涵盖所有这样的天然存在的等位基因。如本文中使用的，术语“多态”意指在群体个体中的遗传基因座处存在变异(即，存在两个或更多个等位基因)。如本文中使用的，“突变体”是指为重组DNA技术的结果的核酸或其编码的蛋白质、多肽或肽的序列的变化。
当关于细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸使用时，术语“外源”是指已通过人工或自然手段引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸，或多核苷酸；或者当关于细胞使用时，该术语是指分离并随后通过人工或自然手段引入其他细胞或生物体中的细胞。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者其可以是天然存在于生物体或细胞中的核酸的一个或更多个另外的拷贝。外源细胞可来自不同的生物体，或者其可来自同一生物体。作为非限制性实例，外源核酸是处于与其在天然细胞中不同的染色体位置的核酸，或者以另外的方式侧接与自然界中存在的不同的核酸序列的核酸。
“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体在最低限度上包含指导一种或更多种期望的细胞类型、组织或器官中的基因表达的一种或更多种转录调控元件(例如启动子、增强子或其结构功能上的等同物)。还可包含另外的元件，例如转录终止信号。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“载体”)是指包含待递送至宿主细胞(体外或体内)的多核苷酸的大分子或分子的复合物。
“质粒”(常见类型的载体)是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而复制。在某些情况下，其为圆形的和双链的。
“复制起点”(“ori”)是例如嗜淋巴细胞疱疹病毒中当存在于细胞中的质粒中时能够维持质粒中的连接序列和/或DNA合成启动处或附近的位点的DNA序列。作为一个实例，对于EBV的ori包括FR序列(30bp重复的20个不完全拷贝)，优选DS序列；然而，EBV中的其他位点结合EBNA-1，例如，Rep*序列可以替代DS作为复制起点(Kirshmaier和Sugden，1998)。因此，EBV的复制起点包括FR、DS或Rep*序列或者通过核酸修饰或由其得到的合成组合的任何功能上等同的序列。例如，本发明也可使用EBV的经遗传改造的复制起点，例如通过单个元件的插入或突变，如Lindner等，2008年中具体描述的。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当置于适当的调控序列的控制下时转录并且任选地还翻译成基因产物(例如，多肽)(在体外或体内)的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可为单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。基因可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，和合成的DNA序列。转录终止序列将通常位于基因序列的3’处。
术语“控制元件”统指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、剪接点等，其共同提供接受者细胞中的编码序列的复制、转录、转录后加工，和翻译。并非所有这些控制元件都需要存在，只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录，和翻译即可。
在本文中以其普通意义使用的术语“启动子”是指包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的基因。其可包含调控蛋白质和分子可能结合的遗传元件(例如RNA聚合酶和其他转录因子)，以启动核酸序列的特异性转录。短语“有效地定位”、“有效地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或定向以控制该序列的转录起始和/或表达。
“增强子”意指这样的核酸序列：当定位成接近启动子时，其相对于在不存在增强子结构域的情况下由启动子产生的转录活性赋予提高的转录活性。
关于核酸分子的“有效地连接”或“共表达”意指两个或更多个核酸分子(例如，待转录的核酸分子、启动子，和增强子元件)以例如允许核酸分子转录的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“有效地连接”或“共表达”意指两个或更多个肽和/或多肽分子以例如产生具有融合的每个肽和/或多肽组分的至少一种特性的单一多肽链(即，融合多肽)的方式连接。融合多肽优选为嵌合的，即由异源分子构成。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性的百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可以通过本领域已知的技术来确定。例如，可以通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序，通过两个多肽分子之间的序列信息的直接比较来确定同源性。作为替代地，可以通过多核苷酸在促进在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交，随后用单链特异性核酸酶消化，并进行消化片段的尺寸确定来确定同源性。如使用上述方法确定的，当至少约80％，优选至少约90％，最优选至少约95％的核苷酸或氨基酸分别在限定长度的分子上匹配时，两个DNA或两个多肽序列彼此是“基本上同源的”。
术语“核酸”通常是指DNA、RNA或其衍生物或模拟物的至少一个分子或链，所述分子或链包含至少一个核碱基，例如，存在于DNA(例如腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)或RNA(例如A、G、尿嘧啶“U”和C)中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。术语“寡核苷酸”是指长度为约3至约100个核碱基的至少一个分子。术语“多核苷酸”是指长度大于约100个核碱基的至少一个分子。这些定义通常是指至少一个单链分子，但在具体的实施方案中还将涵盖与所述至少一个单链分子部分、基本上或完全互补的至少一个另外的链。因此，核酸可涵盖至少一个双链分子或至少一个三链分子，其包含含有所述分子的链的特定序列的一个或更多个互补链或“互补体”。
在整个本申请中使用的术语“治疗益处”是指促进或提高患者关于其癌症的医学治疗的幸福感(well-being)的任何事物。这种治疗益处的非穷举的实例的列表包括延长患者的生命任何一段时间；降低或延迟疾病的赘生物发展；降低过度增殖；降低肿瘤生长；延迟转移；降低癌细胞或肿瘤细胞的增殖速率；在任何经处理的细胞或受经处理的细胞影响的任何细胞中诱导凋亡；以及降低可以归因于患者病症的患者的疼痛。
“有效量”至少是引起特定疾病的可测量的改善或预防所需的最小量。本文中的有效量可根据例如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引起期望的应答的能力的因素而变化。有效量也是其中治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性用途，有益或期望的结果包括这样的结果，例如，消除或降低风险、减轻严重程度，或延迟疾病发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其在疾病发展期间呈现的并发症和中间病理学表型。对于治疗用途，有益的或期望的结果包括临床结果，例如降低由疾病引起的一种或更多种症状、提高患有疾病的人的生活质量、降低治疗疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物的效果(例如通过靶向)、延缓疾病的进展，和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可具有如下作用：降低癌细胞的数量；降低肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓或期望地停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并期望地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与疾病相关的一种或更多种症状。有效量可以以一次或更多次施用来施用。出于本发明的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床环境中所理解的，有效量的药物、化合物或药物组合物可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物结合来实现。因此，在施用一种或更多种治疗剂的情况下，可考虑“有效量”，并且如果在单一药剂与一种或更多种另外的药剂结合的情况下可实现或实现了期望的结果，则可认为以有效量提供单一药剂。
如本文中使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除任何常规介质或试剂与活性成分不相容之外，还考虑到其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可以并入组合物中。
术语“药物制剂”是指这样的制剂：其处于例如允许活性成分的生物活性有效的形式，并且其不包含对将施用所述制剂的对象具有不可接受的毒性的另外的组分。这样的制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载剂、添加剂)是可以合理地施用于对象哺乳动物以提供有效剂量的所采用的活性成分的赋形剂。
如本文中使用的，术语“治疗/处理”是指旨在改变临床病理过程期间所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。可期望的治疗效果包括降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果一种或更多种与癌症相关的症状得到缓解或消除，包括但不限于降低癌细胞的增殖(或破坏)、减弱由疾病引起的症状、提高患有疾病的人的生活质量、降低治疗疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的存活，则个体被成功“治疗/处理”。
“抗癌”剂能够负面地影响对象中的癌细胞/肿瘤，例如通过促进癌细胞的杀伤、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、降低向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展，或提高患有癌症的对象的寿命。
本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如，构成该群体的单个抗体除了可能以较小量存在的可能的突变(例如，天然存在的突变)以外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特性不是分离的抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的过程来获得。例如，选择过程可以是从多个克隆(例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆，或重组DNA克隆库)中选择唯一的克隆。应当理解，可以进一步改变选定的靶结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力、以使靶结合序列人源化、以提高其在细胞培养中的产生、以降低其体内免疫原性、以产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特导性以外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常未被其他免疫球蛋白污染。
术语“免疫检查点”是指免疫系统中的分子(例如蛋白质)，其向其组分提供抑制信号以平衡免疫反应。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1和PD-L2以及另外的LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll，2012.Nature Rev Cancer 12：252-264；Mellman等，2011.Nature 480：480-489)。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指这样的分子：其抑制PD-1轴结合配偶体(bindingpartner)与其一个或更多个结合配偶体相互作用，以去除由PD-1信号传导轴上的信号传导导致的T细胞功能障碍，结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-L1和/或PD-L2)相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其一个或更多个结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、具抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由通过PD-1介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍降低(例如，增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是MDX-1106(纳武单抗)。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是MK-3475(派姆单抗)。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是CT-011(匹地利珠单抗)。在另一个具体方面，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂减少由通过PD-L1介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍降低(例如，增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体方面，抗PD-L1抗体是YW243.55.S70。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是MDX-1105。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是MPDL3280A。在另一个具体方面，抗PD-L1抗体是MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其一个或更多个结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1结合。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由通过PD-L2介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍降低(例如增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫黏附蛋白。
“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此免疫检查点蛋白抑制剂特别是人免疫检查点蛋白抑制剂。
“胞外基质降解蛋白”是指作用于细胞基质完整性的任何蛋白质，特别是对所述基质的至少一种成分或使这些多种成分结合的键发挥全部或部分降解或去稳定作用的蛋白质。
“远位效应”在本文中是指肿瘤的局部治疗范围以外的肿瘤萎缩。例如，用本文中提供的病毒组合物的局部治疗与用免疫检查点治疗的全身治疗组合可以导致远端未用病毒组合物注射的肿瘤的远位效应。
II.病毒组合物
本公开内容的实施方案涉及病毒组合物，其包含经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒。在一些特定方面，病毒组合物包含经改造成表达松弛素基因的病毒、经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成使N1L基因缺失的牛痘病毒，和/或经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒。可向对象施用这些病毒中的一种、两种、三种或四种以诱导局部和/或远位效应。病毒组合物可与免疫检查点抑制剂组合施用。
A.表达胞外基质蛋白的病毒
在一个方面，基因治疗(例如，病毒分布)的递送和肿瘤穿透通过降解肿瘤细胞胞外基质(ECM)或其组分的蛋白质或试剂来增强。
胞外基质(ECM)是由细胞分泌的胞外分子的集合，其为周围细胞提供结构和生物化学支持。因为多细胞性独立地演化为不同的多细胞谱系，因此ECM的组成在多细胞结构之间变化；然而，细胞黏附、细胞至细胞通信和分化是ECM的常见功能。可被胞外基质降解蛋白靶向的ECM的组分包括胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸、纤连蛋白和层黏连蛋白。
1.松弛素
可以用于本文中提供的方法的一种胞外基质降解蛋白是松弛素。松弛素是与胰岛素和胰岛素样生长因子结构相关的6kDa肽激素。其主要在黄体和子宫内膜中产生，并且其血清水平在妊娠期间大幅提高(Sherwood等，1984)。当胶原蛋白过表达时，松弛素是胶原蛋白表达的有效抑制剂，但与其他胶原蛋白相比，其不显著改变胶原蛋白表达的基础水平。其促进多种MMP(例如MMP2、MMP3和MMP9)的表达以降解胶原蛋白，使得结缔组织和基底膜降解以导致产道的胞外基质的破坏。除此之外，在松弛素作为抑制剂起作用以防止胶原蛋白过表达的肺、心脏、皮肤、肠、乳腺、血管和精管中也观察到由松弛素促进MMP1和MMP3表达(Qin，X.，等，1997a；Qin，X.，等，1997b)。
施用松弛素蛋白或编码松弛素蛋白的核酸可以诱导胶原蛋白(肿瘤细胞周围的胞外基质的主要组分)降解以破坏结缔组织和基底膜，从而导致胞外基质的降解。特别地，当施用于被结缔组织紧密包围的肿瘤组织时，与松弛素组合施用肿瘤抑制基因治疗表现出改善的抗肿瘤效力。
如美国专利No.5,023,321中所述，松弛素蛋白可以是全长松弛素或保持生物活性的松弛素分子的一部分。特别地，松弛素是重组人松弛素(H2)或具有松弛素样活性的其他活性剂，例如从受体中竞争性地置换结合的松弛素的试剂。松弛素可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备，优选如美国专利No.4,835,251中所述。松弛素类似物或其衍生物描述于美国专利No.5,811,395中，肽合成描述于美国专利公开No.US20110039778中。
Kim等(2006)描述了可用于本文中提供的方法的示例性腺病毒松弛素。简单地说，通过将松弛素基因插入到E3腺病毒区域中来产生表达松弛素的有复制能力的(Ad-ΔE1B-RLX)腺病毒。
2.透明质酸酶
在一些实施方案中，可以施用任何能够水解通常存在于胞外基质中的多糖(例如透明质酸)的物质。特别地，用于本发明的胞外基质降解蛋白可以是透明质酸酶。透明质酸是脊椎动物胞外基质的普遍存在的成分。这种基于葡糖醛酸和葡糖胺[D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-葡糖胺(1-b-4)]的线性多糖能够通过其形成非常黏稠溶液的特性对基质的物理化学特性产生影响。透明质酸也与位于细胞表面上的多种受体和结合蛋白相互作用。其参与许多生物过程，例如受精、胚胎发育、细胞迁移和分化、创伤愈合、炎症、肿瘤生长和形成转移瘤。
透明质酸被透明质酸酶水解并且其水解导致胞外基质的解体。因此，预期，任何具有透明质酸酶活性的物质均适用于本发明的方法，例如如Kreil(Protein Sci.，1995，4：1666-1669)中所述的透明质酸酶。透明质酸酶可以是来源于哺乳动物、爬行动物或膜翅目昆虫透明质酸聚糖水解酶，来源于水蛭唾液腺的透明质酸聚糖水解酶，或来源于细菌，特别是链球菌、肺炎球菌和梭菌透明质酸裂解酶的透明质酸酶。透明质酸酶的酶活性可以通过常规技术评估，例如Hynes和Ferretti(Methods Enzymol.，1994，235：606-616)或Bailey和Levine(J.Pharm.Biomed.Anal.，1993，11：285-292)中所述的技术。
3.饰胶蛋白聚糖
饰胶蛋白聚糖(一种小的富含亮氨酸的蛋白聚糖)是胞外基质的普遍存在的组分，并且优先发现与胶原原纤维相关。饰胶蛋白聚糖与胶原原纤维结合并延迟单个三螺旋胶原蛋白分子的侧向组装，从而导致原纤维的直径降低。另外，饰胶蛋白聚糖可以调节胞外基质组分(例如纤连蛋白和血小板应答蛋白)与细胞的相互作用。此外，饰胶蛋白聚糖能够通过诱导基质金属蛋白酶胶原酶来影响胞外基质重塑。这些观察结果表明，如Choi等(GeneTherapy，17：190-201，2010)和Xu等(Gene Therapy，22(3)：31-40，2015)所述，饰胶蛋白聚糖在多个水平上调节胞外基质的产生和组装并因此在重塑结缔组织方面具有突出作用。
Choi等(Gene Therapy，17：190-201，2010)描述了可用于本文中提供的方法中的示例性腺病毒饰胶蛋白聚糖。简单地说，通过将饰胶蛋白聚糖基因插入到E3腺病毒区域中来产生表达饰胶蛋白聚糖的有复制能力的(Ad-ΔE1B-DCNG)腺病毒。Xu等(Gene Therapy，22(3)：31-40，2015)描述了可用于本文中提供的方法中的另一种示例性腺病毒饰胶蛋白聚糖。类似地，通过将饰胶蛋白聚糖基因捅入到E3腺病毒区域中来产生表达饰胶蛋白聚糖的有复制能力的(Ad.dcn)腺病毒。
所述方法中还可使用另外的示例性腺病毒，其涉及如美国专利No.8,067,567中所述的经修饰的TERT启动子溶瘤腺病毒、PCT/KR2011/004693中所述的HRE-E2F-TERT杂合启动于溶瘤腺病毒、如美国专利申请No.11/816,751中所述的表达饰胶蛋白聚糖基因的病毒、如美国专利申请No.#10/599,521中所述的表达松弛素基因的病毒；所有这些都通过引用并入。
B.过表达ADP的病毒
本公开内容的某些实施方案涉及经改造成过表达腺病毒死亡蛋白(ADP)(即E311.6K蛋白)的病毒。
当病毒是重组腺病毒时，可以以多种方式实现ADP的过表达(例如，描述于US20100034776；通过引用并入本文)。一般来说，去除任何E3mRNA的剪接位点的E3区中的任何类型的缺失将导致ADP的mRNA过表达，因为更多的E3前mRNA分子将被加工成ADP的mRNA。在Ad载体中实现ADP过表达的其他方法包括但不限于：在位于ADP基因侧面的位点处插入前mRNA剪接和切割/聚腺苷酸化信号；从插入Ad基因组中的多个位点中的另一个启动子(例如人巨细胞病毒启动子)表达ADP；在另一个Ad MRNA的基因后面插入ADP基因以及ADP序列5′侧的允许内部启动ADP的翻译的序列，例如Ad三联前导序列或病毒内部核糖体初始序列。
由根据本公开内容的载体表达的ADP是包含天然存在的全长ADP氨基酸序列或其变体的任何多肽，其赋予表达ADP的载体以裂解包含载体的细胞使得复制的载体拷贝从受感染的细胞中释放出来的能力。优选的全长ADP包含由Ad1、Ad2、AdS或Ad6编码的ADP氨基酸序列。ADP变体包括天然存在的腺病毒死亡蛋白的片段和缺失突变体，以及包含保守氨基酸替换的全长分子、片段和缺失突变体，条件是这样的变体在由细胞内的载体表达时保持裂解细胞的能力。
在某些方面，经改造成过表达ADP的病毒是被称为VRX-007的血清5型腺病毒(即，经改造成使大部分E3区缺失并过表达E3-11.6K腺病毒死亡蛋白(ADP)的溶瘤腺病毒载体)。还可修饰VRX-007以表达其他治疗基因。先前描述了VRX-007的构建(Doronin 2003；Tollefson 1996；Lichtenstein 2004)。
C.具有N1L缺失的牛痘病毒
本公开内容的某些实施方案涉及具有N1L缺失的牛痘病毒。在某些方面，经改造成使N1L缺失的牛痘病毒来源于Westem Reserve、Wyeth和Lister毒株。已经产生了这些毒株中的每一种的多种缺失突变体。在某些方面，采用的N1L缺失衍生物VVL 15N1L描述于Wang等，2015(PCT公开No.WO2015/150809A1)中。还可修饰VVL 15N1L载体以表达包括但不限于IL-12和/或松弛素的治疗基因。在一些方面，VVL 15N1L载体还与免疫检查点抑制剂和PI3K抑制剂组合。在一个特定方面，施用PI3Kδ或PI3Kγ/δ抑制剂以增强病毒载体的静脉内施用。在一种特定方法中，在静脉内施用VVL 15N1L载体之前(例如数小时)向对象施用PI3Kδ抑制剂。
D.表达细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒
在一些方面，本公开内容的实施方案涉及表达细胞色素p450 2B1基因的病毒(例如，单纯疱疹病毒)。在某些方面，经改造成表达大鼠细胞色素p450 2B1基因的单纯疱疹病毒具有缺失的ICP6基因并且被称为rRp450，如(Aghi等，1999)中进一步描述的。该载体编码环磷酰胺(CPA)敏感性大鼠细胞色素p450 2B1和更昔洛韦(GCV)敏感性单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的表达。细胞色素p450和HSV-TK基因的表达分别导致CPA和GCV前药转化为其治疗活性代谢物。在一些特定方面，rRp450与CPA和GCV组合施用。可使用的疱疹病毒的另外的实例描述于美国专利No.6,602,499中；其通过引用并入本文。
III.核酸
核酸可通过本领域普通技术人员已知的任何技术来制备。合成核酸(特别是合成寡核苷酸)的非限制性实例包括使用例如EP 266,032中所述的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术通过体外化学合成或者通过如Froehler等，1986和美国专利No.5,705,629所述的脱氧核苷H-膦酸酯中间体制备的核酸。酶促产生的核酸的非限制性实例包括由扩增反应例如PCRTM(参见例如美国专利No.4,683,202和美国专利No.4,682,195)或美国专利No.5,645,897中所述的寡核苷酸合成中的酶产生的核酸。生物学上产生的核酸的非限制性实例包括活细胞中的重组核酸产生，例如细菌中的重组DNA载体产生(参见例如Sambrook等1989)。
无论序列本身的长度如何，核酸均可与其他核酸序列(包括但不限于启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、编码片段等)组合，以产生一种或更多种核酸构建体。核酸构建体之间的总长度可变化很大。因此，可采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选受到在预期的重组核酸方案中制备或使用的容易性的限制。
A.通过表达载体的核酸递送
本文中提供的载体被主要设计为在可调控真核启动子(即组成型、诱导型、阻遏型、组织特异性)的控制下表达治疗基因(例如，免疫刺激基因(例如IL-12)和/或前药转换基因(如细胞色素p450)和/或来源于病毒的裂解促进基因(如ADP))和/或胞外基质降解基因(例如，松弛素)。在一些方面，治疗基因可在载体中共表达。在另一方面，治疗基因可与胞外基质降解基因共表达。此外，如果没有其他原因，则载体可包含可选择的标记以促进其体外操作。
本领域技术人员将具备通过标准重组技术(参见例如Sambrook等，2001和Ausubel等，1996，二者均通过引用并入本文)构建载体的良好能力。载体包括但不限于质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)，例如反转录病毒载体(例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)；慢病毒载体(例如来源于HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)；包括其有复制能力的、复制缺陷型和无肠(gutless)形式的腺病毒(AD)载体；腺相关病毒(AAV)载体；猿猴病毒40(SV-40)载体；牛乳头瘤病毒载体；EB病毒载体；疱疹病毒载体；牛痘病毒载体；哈维鼠肉瘤病毒载体；鼠乳腺肿瘤病毒载体；劳斯肉瘤病毒载体；细小病毒载体；脊髓灰质炎病毒载体；水疱性口炎病毒载体；马拉巴病毒载体和B组腺病毒enadenotucirev载体。
1.病毒载体
编码治疗基因的病毒载体可在本公开内容的某些方面中提供。在产生重组病毒载体时，非必需基因通常用异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替换。病毒载体是利用病毒序列以将核酸和可能的蛋白质引入细胞中的一种表达构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞和整合到宿主细胞基因组中以及稳定且有效地表达病毒基因的能力使其成为将外来核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。以下描述了可用于递送本发明的某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。
慢病毒是复杂的反转录病毒，除了常见的反转录病毒基因gag、pol和env以外，其还包含具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域中是公知的(参见例如Naldini等，1996；Zufferey等，1997；Blomer等，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达二者。例如，美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒-其中合适的宿主细胞用携带包装功能的两种或更多种载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat，其通过引用并入本文。
a.腺病毒载体
递送肿瘤抑制物和/或胞外基质降解基因的一种方法涉及使用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体具有低的整合到基因组DNA中的能力，但这种特征被由这些载体提供的高基因转移效率抵消。腺病毒表达载体包括包含腺病毒序列的构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达其中已经克隆的重组基因构建体。
腺病毒生长和操作是本领域技术人员已知的，并且在体外和体内表现出广泛的宿主范围。该病毒组可以以高滴度(例如，每ml 109-1011个噬斑形成单位)获得，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外源基因是附加型的，并且因此对宿主细胞具有低遗传毒性。在用野生型腺病毒的疫苗接种研究中(Couch等，1963；Top等，1971)尚未报道副作用，证明了其作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。
腺病毒(36kb，线性、双链DNA病毒)的遗传组构的了解允许用高至7kb的外源序列替换大片段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与反转录病毒相比，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加型方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒是结构上稳定的，并且在大量扩增之后未检测到基因组重排。
腺病毒特别适合用作基因转移载体，因为其中等尺寸的基因组、易于操作、高滴度、宽的靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端均包含100至200个碱基对反向重复序列(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含被病毒DNA复制开始分开的不同转录单位。E1区(E1A和E1B)编码负责调控病毒基因组和一些细胞基因转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。包括大部分病毒衣壳蛋白的晚期基因的产物仅在由主要晚期启动子(major late promoter，MLP)产生的单个初级转录物的显著加工之后表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期期间特别有效，并且由该启动子产生的所有mRNA具有5’-三联前导(tripartite leader，TPL)序列，这使得它们成为用于翻译的特定mRNA。
本文中提供的重组腺病毒可以由穿梭载体与原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间的可能的重组，因此可由该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑分离病毒的单个克隆并检查其基因组结构。
腺病毒载体可为有复制能力的、复制缺陷型或条件缺陷型的，不认为腺病毒载体的性质对于本发明的成功实践是至关重要的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A至F中的任一种。亚群C的5型腺病毒是用以获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒载体的特定的起始材料。这是因为5型腺病毒是关于其已知大量的生物化学和遗传信息的人腺病毒，并且其历史上已被用于采用腺病毒作为载体的大多数构建体。然而，可类似地利用其他血清型的腺病毒。
可以将核酸引入腺病毒载体中的已从其中移除编码序列的位置。例如，复制缺陷型腺病毒载体可以移除E1-编码序列。编码目的基因的多核苷酸也可被插入来代替E3置换型载体中的缺失的E3区(如Karlsson等(1986)所述的)或者插入到其中辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区中。
复制缺陷型腺病毒载体的产生和增殖可以用辅助细胞系进行。命名为293的一种独特的辅助细胞系由人胚肾细胞通过Ad5 DNA片段转化并组成型地表达E1蛋白(Graham等，1977)。由于E3区从腺病毒基因组中是不必要的(Jones和Shenk，1978)，因此腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、E3或这两个区域中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。
辅助细胞系可来源于人细胞，例如人胚肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质或上皮细胞。作为替代地，辅助细胞可来源于对人腺病毒容许的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，特定的辅助细胞系是293。
用于产生重组腺病毒的方法是本领域已知的，例如美国专利No.6740320，其通过引用并入本文。此外，Racher等(1995)已经公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进的方法。在一种方式中，天然细胞聚集体通过将单个细胞接种到包含100至200ml培养基的1升硅化转瓶(Techne，Cambridge，英国)中来生长。在以40rpm搅拌后，用台盼蓝估计细胞生存力。在另一种方式中，如下采用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，英国)(5g/l)。将重悬于5ml培养基中的细胞接种物添加到250ml锥形瓶中的载体(50ml)中并在偶尔搅拌的情况下静置1至4小时。然后用50ml新鲜培养基替换培养基并开始摇动。为了病毒产生，使细胞生长至约80％汇合，在这之后更换培养基(至最终体积的25％)并以0.05的MOI添加腺病毒。将培养物静置过夜，随后使体积增加至100％并开始摇动另外的72小时。
b.反转录病毒载体
另外，病毒组合物可包含反转录病毒载体。反转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于在受感染的细胞中通过反转录过程将其RNA转变为双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得的DNA作为原病毒稳定地整合到细胞染色体中并指导病毒蛋白质的合成。整合导致在接受者细胞及其后代中保留病毒基因序列。反转录病毒基因组包含三个基因gag、pol和env，其分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。从gag基因上游发现的序列包含用于将基因组包装到病毒粒子中的信号。两个长的末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5’和3’端。这些包含强启动子和增强子序列并且也是整合到宿主细胞基因组中所需要的(Coffin，1990)。
为于构建反转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入到病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因但无LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将包含cDNA以及反转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装成病毒颗粒，然后所述病毒颗粒分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集包含重组反转录病毒的培养基，任选地浓缩并用于基因转移。反转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等，1975)。
关于使用缺陷型反转录病毒载体的担心是在包装细胞中可能出现野生型有复制能力的病毒。这可以从重组事件产生，其中来自重组病毒的完整序列插入来自整合在宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游。然而，这样的包装细胞系是可用的，其应当大幅降低重组的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
c.腺相关病毒载体
腺相关病毒(AAV)是用于本公开内容的具有吸引力的载体系统，因为它具有高的整合频率并且其可以感染不分裂的细胞，从而使其可用于将基因递送到哺乳动物细胞中(Muzyczka，1992)。AAV具有广泛的宿主感染范围(Tratschin，等，1984；Laughlin，等，1986；Lebkowski，等，1988；McLaughlin，等，1988)，这意味着其可适用于与本发明一起使用。关于rAAV载体的产生和使用的细节描述于美国专利No.5,139,941和美国专利No.4,797,368中。
AAV是依赖性细小病毒，其需要与另一种病毒(腺病毒或疱疹病毒家族成员)共感染以在培养细胞中进行生产性感染(Muzyczka，1992)。在缺乏与辅助病毒共感染的情况下，野生型AAV基因组通过其末端整合到人19号染色体中，在此处其作为原病毒以潜伏状态驻留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV不限于用于整合的19号染色体，除非AAVRep蛋白也表达(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV原病毒的细胞被辅助病毒双重感染时，AAV基因组被从染色体或重组质粒中“拯救”，并建立正常的生产性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。
通常，重组AAV(rAAV)病毒通过共转染包含侧接两个AAV末端重复序列的目的基因的质粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自通过引用并入本文)和包含不具有末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒(例如pIM45)(McCarty等，1991)来制备。细胞也被腺病毒或携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的质粒感染或转染。以这样的方式制备的rAAV病毒储液被必须与rAAV颗粒物理分离(例如，通过氯化铯密度离心)的腺病毒污染。作为替代地，可以使用包含AAV编码区的腺病毒载体或者包含AAV编码区和一些或全部腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可以使用携带rAAV DNA的作为整合的原病毒的细胞系(Flotte等，1995)。
d.其他病毒载体
其他病毒载体可用作本公开内容中的构建体。可采用来源于病毒例如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)和疱疹病毒的载体。它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis，VEE)病毒的分子克隆菌株已经作为用于异源病毒蛋白表达的有复制能力的疫苗载体进行遗传精制(Davis等，1996)。研究表明，VEE感染刺激有效的CTL应答，并且已经提出VEE可以是用于免疫接种的极其有用的载体(Caley等，1997)。
在另一些实施方案中，核酸被容纳在经改造成表达特异性结合配体的感染性病毒内。因此病毒颗粒将与靶细胞的同源受体特异性地结合并将内容物递送至细胞。最近基于反转录病毒的化学修饰通过将乳糖残基化学添加到病毒包膜中而开发了一种旨在允许反转录病毒载体的特导性靶向的新方法。这种修饰可以通过唾液酸糖蛋白受体允许肝细胞的特异性感染。
例如，设计了重组反转录病毒的靶向，其中使用了针对反转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。抗体通过使用链霉抗生物素蛋白经由生物素组分偶联(Roux等，1989)。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，他们证明了在体外用亲嗜性病毒感染带有这些表面抗原的多种人细胞(Roux等，1989)。
2.调控元件
包含在可用于本公开内容的载体中的表达盒特别包含(以5’至3’方向)与蛋白质编码序列有效地连接的真核转录启动子、包含间插序列的剪接信号以及转录终止/聚腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白质编码基因转录的启动子和增强子由多种遗传元件构成。细胞机器能够收集和整合由每个元件传送的调控信息，允许不同的基因进化不同的、通常复杂的转录调控模式。用于本发明的上下文中的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。
a.启动子/增强子
本文中提供的表达构建体包含驱动肿瘤抑制物和/或胞外基质降解基因表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。该序列的最著名的实例是TATA框，但在一些缺少TATA框的启动子(例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30至110bp区域中，尽管已经显示许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。为了使编码序列“受启动子的控制”，将转录阅读框的转录起始位点的5’端定位于所选择的启动子的“下游”(即3’)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此反向或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以提高至50bp。根据启动子，其表现出单个元件可以合作地或独立地发挥作用以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，所述增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是与位于该序列下游或上游的核酸序列天然相关的增强子。作为替代地，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子的控制下来获得某些优点，所述重组或异源启动子是指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子也指通常不与其天然环境中的核酸序列相关的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，和从任何其他病毒或者原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”(即包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变)的启动子或增强子。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列以外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)结合本文中公开的组合物来产生序列(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，预期还可以采用指导非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)中的序列转录和/或表达的控制序列。
自然地，采用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知晓启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见例如Sambrook等1989，通过引用并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的，和/或在合适的条件下可用于指导引入的DNA片段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产方面是有利的。启动子可为导源的或内源的。
此外，还可以使用任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB，通过epd.isb-sib.ch/上的万维网)来驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可能的实施方案。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体，则真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如，SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等，1989)、GADPH启动子(Alexander等，1988，Ercolani等，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等，1989；Richards等，1984)；以及多联响应元件启动子，例如环化AMP响应元件启动子(cre)、血清响应元件启动子(ste)、佛波醇酯启动子(TPA)和最小的TATA框附近的响应元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，Genbank登录号X05244中描述的人生长激素最小启动子，第283至341位核苷酸)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC获得，目录号ATCC 45007)。在某些实施方案中，启动子是CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、MHC I类或MHC II类启动子，然而，可用于驱动治疗基因表达的任何其他启动子可应用于本发明的实践。
在某些方面，本公开内容的方法还涉及提高启动子的活性且不管其方向如何，甚至在相对长的距离(距目标启动子高至数千碱基)上具有顺式作用的潜力的增强子序列，即核酸序列。然而，增强子功能不一定限于这样的长距离，因为它们也可紧靠给定的启动子发挥作用。
b.起始信号和连锁表达
特定的起始信号也可用于本公开内容中提供的表达构建体中，以用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须位于期望的编码序列的阅读框“框内”以确保整个捅入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以为天然的或合成的。可通过包含适当的转录增强子元件来提高表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件用于产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点处开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框连接。各自被IRES分开的多个开放阅读框架可以一起转录，产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框均是核糖体可及的以进行有效翻译。可以使用单个启动子/增强子来有效地表达多个基因以转录单个信息(参见美国专利No.5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。
此外，某些2A序列元件可以用于在本公开内容中提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，切割序列可以用于通过连接开放阅读框来共表达基因以形成单个顺反子。示例性的切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)(Minskaia和Ryan，2013)。
c.复制起点
为了在宿主细胞中扩增载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(通常称为“ori”)，例如，对应于如上所述的EBV的oriP或者在编程中具有类似或提高的功能的经遗传改造的oriP的核酸序列，其是启动复制的特定核酸序列。作为替代地，可以采用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
3.选择和可筛选标记
在一些实施方案中，可通过在表达载体中包含标记来体外或体内鉴定包含本公开内容的构建体的细胞。这样的标记将赋予细胞可识别的变化，允许容易鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予允许选择的特性的标记。正选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而负选择标记是其中其存在阻止其选择的标记。正选择标记的一个实例是抗药性标记。
通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件实施而区分转化体的表型的标记以外，还考虑了其他类型的标记，包括例如其基础是比色分析的GFP的可筛选标记。作为替代地，可利用可筛选酶作为负选择标记，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知晓如何使用免疫标记，可能与FACS分析结合。所使用的标记不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记的另外的实例对于本领域技术人员而言是公知的。
B.其他核酸递送方法
除了编码治疗基因和/或胞外基质降解基因的核酸的病毒递送以外，以下是重组基因递送至给定宿主细胞的另外的方法，并且因此在本公开内容中被考虑。因此，其他形式的基因治疗可与治疗性病毒组合物组合，所述基因治疗包括基因编辑方法，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应基核酸酶(TALEN)，和CRISPR-Cas系统。
如本文中所述的或如本领域普通技术人员已知的，核酸例如DNA或RNA的引入可使用用于细胞转化的核酸递送的任何合适的方法。这样的方法包括但不限于DNA的直接递送，例如通过离体转染(Wilson等，1989，Nabel等，1989)，通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利No.5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请No.WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利No.5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,05，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)；以及这样的方法的任意组合。通过应用例如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可稳定地或瞬时地转化。
1.电穿孔
在本公开内容的某些特定实施方案中，通过电穿孔将基因构建体引入目标过度增殖细胞中。电穿孔包括使细胞(或组织)和DNA(或DNA复合物)暴露于高压放电。
使用电穿孔转染真核细胞已经是相当成功的。已经用人κ-免疫球蛋白基因(Potter等，1984)转染小鼠前B淋巴细胞，并且已经用氯霉素乙酰转移酶基因(Tur-Kaspa等，1986)以这种方式转染大鼠肝细胞。
预期来自不同来源的过度增殖细胞的电穿孔条件可被优化。人们可能特别希望优化例如电压、电容、时间和电穿孔介质组成的参数。其他常规调整的执行将是本领域技术人员已知的。参见例如Hoffman，1999；Heller等，1996。
2.脂质介导的转化
在另一个实施方案中，肿瘤抑制物和/或胞外基质降解基因可被包埋在脂质体或脂质制剂中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包埋脂质双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)复合的基因构建体。
脂质介导的核酸递送和体外外源DNA表达已经是非常成功的(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)证明了培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中脂质介导的递送和外源DNA表达的可行性。
基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因治疗的替代方案。尽管许多细胞培养研究已经记录了基于脂质的非病毒基因转移，但通过基于脂质的制剂的全身基因递送受到限制。非病毒基于脂质的基因递送的主要限制是构成非病毒递送载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分解释了体外和体内基因转移结果之间的差异。造成这种相互矛盾的数据的另一个因素是在存在和不存在血清蛋白的情况下脂质载体稳定性的差异。脂质载体与血清蛋白之间的相互作用对脂质载体的稳定性特性具有显著影响(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质吸引并结合带负电荷的血清蛋白。与血清蛋白有关的脂质载体被溶解或被巨噬细胞摄取，导致它们从循环中去除。目前的体内脂质递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射以避免与循环中的阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质载体和血浆蛋白的相互作用是造成体外(Felgner等，1987)与体内基因转移(Zhu等，1993；Philip等，1993；Solodin等，1995；Liu等，1995；Thierry等，1995；Tsukamoto等，1995；Aksentijevich等，1996)的效率之间的差异的原因。
脂质制剂的进展已经提高了体内基因转移的效率(Templeton等1997；WO 98/07408)。由等摩尔比的1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和胆固醇构成的新的脂质制剂显著增强全身体内基因转移，约150倍。DOTAP：胆固醇脂质制剂形成称为“夹心脂质体”的独特结构。据报道，这种制剂是内陷双层或“花瓶”结构之间的“夹心”DNA。这些脂质结构的有益特征包括正ρ、由胆固醇导致的胶体稳定性、二维DNA包装和提高的血清稳定性。专利申请No.60/135,818和60/133,116讨论了可与本发明一起使用的制剂。
在(I)反相蒸发、(II)脱水-再水化、(III)洗涤剂透析和(IV)薄膜水合之后，脂质制剂的生产通常通过脂质体混合物的超声或连续挤出来实现。一旦制造，脂质结构可以用于包封在循环时有毒(化学治疗剂)或不稳定(核酸)的化合物。脂质包封导致这样的化合物的较低的毒性和较长的血清半衰期(Gabizon等，1990)。许多疾病治疗正使用基于脂质的基因转移策略来增强常规或建立新的治疗，特别是用于治疗过度增殖性疾病的治疗。
IV.免疫检查点抑制剂
本公开内容提供了将免疫检查点的阻断与病毒组合物组合的方法。免疫检查点是免疫系统中上调信号(例如，共刺激分子)或下调信号的分子。可通过免疫检查点阻断靶向的抑制性检查点分子包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制物(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如国际专利公开WO2015016718；Pardoll，2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本发明的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知，lambrolizumab也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗为人所知。
预期可使用本领域已知刺激免疫应答的任何免疫检查点抑制剂。这包括直接或间接刺激或增强抗原特异性T淋巴细胞的抑制剂。这些免疫检查点抑制剂包括但不限于靶向免疫检查点蛋白和涉及PD-L2、LAG3、BTLA、B7H4和TIM3的途径的药物。例如，本领域已知的LAG3抑制剂包括可溶性LAG3(WO2009044273中公开的IMP321或LAG3-Ig)以及阻断人LAG3的小鼠或人源化抗体(例如，WO2008132601中公开的IMP701)或阻断人LAG3的完全人抗体(例如EP 2320940中公开的)。通过使用针对BTLA的阻断剂提供了另一个实例，包括但不限于阻断人BTLA与其配体相互作用的抗体(例如WO2011014438中公开的4C7)。通过使用中和B7H4的试剂提供了另一个实例，包括但不限于人B7H4(WO2013025779和WO2013067492中公开的)或可溶性重组形式的B7H4(例如US20120177645中公开的)的抗体。通过中和B7-H3的试剂提供了另一个实例，包括但不限于中和人B7-H3的抗体(例如US 20120294796中作为BRCA84D公开的MGA271和衍生物)。通过靶向TIM3的试剂提供了另一个实例，包括但不限于靶向人TIM3的抗体(例如，如WO 2013006490 A2中公开的或由Jones等，2008公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2)。
另外，可将多于一种免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体)与局部/远位病毒组合物组合使用。例如，可以施用局部/远位病毒组合物和免疫检查点抑制剂(例如，抗KIR抗体和/或抗PD-1抗体)以增强固有抗肿瘤免疫，然后施用局部/远位病毒组合物和免疫检查点抑制剂(例如，抗-PD-1抗体)以诱导适应性抗肿瘤免疫应答。
A.PD-1轴拮抗剂
T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体、程序性死亡1多肽(PD-1)的诱导且持续表达同时发生。因此，本文中提供了PD-1和通过与PD-1相互作用来传导信号的其他分子(例如程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2))的治疗性靶向。PD-L1在许多癌症中过表达并且通常与不良预后相关(Okazaki T等，2007)。因此，本文中提供了与局部/远位病毒组合物治疗组合抑制PD-L1/PD-1相互作用，以增强CD8+T细胞介导的肿瘤杀伤。
本文中提供了用于治疗或延缓个体中的癌症进展的方法，所述方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂与局部/远位病毒组合物的组合。本文中还提供了在有此需要的个体中增强免疫功能的方法，所述方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和局部/远位病毒组合物。
例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.US8735553、US8354509和US8008449中，所有均通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，例如描述于美国专利申请No.US20140294898、US2014022021和US20110008369中，所有均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附蛋白(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外或PD-1结合部分的免疫黏附蛋白)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck3475、lambrolizumab、和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1结合拮抗剂包括也称为CT-011的匹地利珠单抗、也被称为AMP-514的MEDI0680和REGN2810。
在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L1拮抗剂，例如也称为MEDI4736的杜伐单抗、也称为MPDL3280A的阿特珠单抗或也称为MSB00010118C的avelumab。在某些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L2拮抗剂，例如rHIgM12B7。在一些方面，免疫检查点抑制剂是LAG-3拮抗剂，例如但不限于IMP321和BMS-986016。免疫检查点抑制剂可以是腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂，例如PBF-509。
在一些方面，本文中所述的抗体(例如抗PD-1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体)还包含人或鼠恒定区。在另一方面，人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。在另一具体方面，人恒定区是IgG1。在另一方面，鼠恒定区选自IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。在另一具体方面，抗体具有降低的或最小的效应物功能。在另一具体方面，最小效应物功能由原核细胞中的产生引起。在另一具体方面，最小效应物功能由“无效应物Fc突变”或无糖基化引起。
因此，本文中使用的抗体可以为无糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指糖部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中仟一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。从抗体去除糖基化位点方便地通过改变氨基酸序列来完成，使得上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)之一被去除。改变可通过用另一个氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守替换)替换糖基化位点中的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基来进行。
可使用本领域已知的方法来制备抗体或其抗原结合片段，例如，通过包括以下的过程：在适用于产生这样的抗体或片段的条件下，培养包含编码任何前述适用于表达的形式的抗PDL1、抗PD-1或抗-PDL2抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞，并回收抗体或片段。
B.CTLA-4
可以在本文中提供的方法中靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4在T细胞表面上发现并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时发挥“关闭”开关的作用。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA4也在调节性T细胞中发现并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白，或寡肽。
可以使用本领域公知的方法来产生适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)。作为替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，在以下中公开的抗CTLA-4抗体可以用于本文中公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也被为曲美木单抗；以前的ticilimumab)；美国专利No.6,207,156；Hurwitz等，1998；Camacho等，2004；以及Mokyr等，1998。每个上述公开物的教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.US8017114中描述了人源化CTLA-4抗体；全部通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如，WO01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与CTLA-4上的相同表位结合和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括例如美国专利No.US5844905、US5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752(所有均通过引用并入本文)中所述的CTLA-4配体和受体，以及例如美国专利No.US8329867(通过引用并入本文)中所述的免疫黏附蛋白。
C.杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)
用于本发明的另一种免疫检查点抑制剂是抗KIR抗体。可以使用本领域公知的方法来产生适用于本发明的抗人KIR抗体(或来源于其的VH/VL结构域)。
作为替代地，可以使用本领域公认的抗KIR抗体。抗KIR抗体可以与多种抑制性KIR受体交叉反应并增强具有这些受体中的一种或更多种的NK细胞的细胞毒性。例如，抗KIR抗体可与KIR2D2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3中的每一个结合，并且通过降低、中和和/或逆转由任何或所有这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制来增强NK细胞活性。在一些方面，抗KIR抗体不结合KIR2DS4和/或KIR2DS3。例如，可以使用WO2006/003179(其教导在此通过引用并入)中所述的单克隆抗体1-7F9(也称为IPH2101)、14F1、1-6F1和1-6F5。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合KIR的抗体。可以使用的另外的本领域公认的抗KIR抗体包括例如WO 2005/003168、WO 2005/009465、WO 2006/072625、WO 2006/072626、WO 2007/042573、WO 2008/084106、WO 2010/065939、WO 2012/071411和WO/2012/160448中公开的抗KIR抗体。
示例性的抗KIR抗体是利瑞单抗(也被为BMS-986015或IPH2102)。在另一些实施方案中，抗KIR抗体包含利瑞单抗的重链和轻链互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)或可变区(variable region，VR)。因此，在一个实施方案中，抗体包含利瑞单抗的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2，和CDR3结构域，以及利瑞单抗的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与利瑞单抗具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性。
V.治疗方法
本文中提供了用于治疗、延缓个体中的癌症进展或预防个体中的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的单独的或与至少一种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)组合的病毒组合物。
在一些实施方案中，在治疗停止之后，治疗导致个体中的持续响应。本文中所述的方法可用于治疗其中期望提高免疫原性(例如提高用于癌症治疗的肿瘤免疫原性)的病症。本文中还提供了提高例如患有癌症的个体中的免疫功能的方法，所述方法包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂(例如，PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)和局部/远位病毒组合物治疗。在一些实施方案中，个体是人。
预期用于治疗的癌症的实例包括肺癌、头领癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺中的肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤，和膀胱癌。
在一些实施方案中，个体患有对一种或更多种抗癌治疗具有抗性(已被证明具有抗性)的癌症。在一些实施方案中，对抗癌治疗的抗性包括癌症复发或难治性癌症。复发可以指在治疗之后在原始部位或新部位再次出现癌症。在一些实施方案中，对抗癌治疗的抗性包括在用抗癌治疗进行治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。
个体可患有表达(例如在诊断测试中已显示出表达)PD-L1生物标志物的癌症。在一些实施方案中，患者的癌症表达低PD-L1生物标志物。在一些实施方案中，患者的癌症表达高PD-L1生物标志物。可以使用选自以下的方法在样品中检测PD-L1生物标志物：FACS、Western印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH，及其组合。
本文中所述的任何方法(例如，包括施用有效量的单独的或与至少一种免疫检查点抑制剂组合的病毒组合物治疗的组合治疗)的效力可在本领域已知的多种模型(例如临床或临床前模型)中进行测试。合适的临床前模型在本文中举例说明并且可进一步包括但不限于ID8卵巢癌、GEM模型、B16黑素瘤、RENCA肾细胞癌、CT26结肠直肠癌、MC38结肠直肠癌，和癌症的Cloudman黑素瘤模型。
在本公开内容方法的一些实施方案中，癌症具有低水平的T细胞浸润。在一些实施方案中，癌症没有可检测的T细胞浸润。在一些实施方案中，癌症是非免疫原性癌症(例如，非免疫原性结肠直肠癌和/或卵巢癌)。不受理论束缚，相对于在组合施用之前，组合治疗可提高T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞)引发、活化和/或增殖。
在本公开内容的方法的一些实施方案中，个体中的经活化的CD4和/或CD8 T细胞的特征在于相对于在组合施用之前产生γ-IFN的CD4和/或CD8 T细胞和/或增强的细胞裂解活性。可通过本领域已知的任何方式测量γ-IFN，包括例如涉及细胞固定、透化，和用针对γ-IFN的抗体染色的胞内细胞因子染色(ICS)。细胞裂解活性可通过本领域已知的任何方式测量，例如，使用用混合的效应物和靶细胞的细胞杀伤测定。
本公开内容可用于作为免疫系统的靶标或作为免疫系统对外来靶标的应答的一部分而参与免疫反应的任何人细胞。所述方法包括离体方法、体内方法，和包括将多核苷酸或载体注入宿主细胞中的多种其他方法。所述方法还包括直接注射到肿瘤或肿瘤床以及肿瘤的局部或区域中。
A.施用
本文中提供的治疗包括施用有效量的单独的或与至少一种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)组合的病毒组合物。组合治疗可以以本领域已知的任何合适的方式施用。例如，免疫检查点抑制剂(例如PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)和病毒组合物可顺序(在不同时间)或同时(在同一时间)施用。在一些实施方案中，一种或更多种免疫检查点抑制剂在与局部/远位病毒组合物治疗或其表达构建体分开的组合物中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂在与局部/远位病毒组合物治疗相同的组合物中。在某些方面，在至少一种免疫检查点抑制剂之前、同时或之后，向对象施用编码p53的核酸和/或编码MDA-7的核酸。
一种或更多种免疫检查点抑制剂和病毒组合物组分治疗可通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，局部/远位病毒组合物治疗静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些方面，施用是通过连续输注、瘤内注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射，或鞘内注射进行的。可施用有效量的免疫检查点抑制剂和局部/远位病毒组合物治疗来预防或治疗疾病。免疫检查点抑制剂和/或局部/远位病毒组合物治疗的合适剂量可基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判断来确定。在一些实施方案中，与至少一种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)和局部/远位病毒组合物治疗的组合治疗是协同的，由此相对于作为单一药剂的至少一种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1轴结合拮抗剂和/或CTLA-4抗体)的有效剂量，组合中的局部/远位病毒组合物治疗的有效剂量降低。
例如，无论通过一次施用还是更多次施用，施用于人的免疫检查点抑制剂(例如抗体)和/或编码p53和/或MDA-7的核酸或其表达构建体的治疗有效量将为约0.01至约50mg/kg患者体重。在一些实施方案中，使用的抗体为：例如，每天施用约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg、或约0.01至约1mg/kg。在一些实施方案中，抗体以15mg/kg施用。然而，其他剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中，本文中所述的抗PDL1抗体在21天周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。剂量可作为单剂量或作为多剂量(例如，2或3剂量)施用，例如输注。这种治疗的进展容易通过常规技术进行监测。
对于离散的、固体的、可及的肿瘤特别考虑瘤内注射或注入肿瘤脉管系统。局部、区域或全身施用也可能是适当的。对于＞4cm的肿瘤，待施用的体积将为约4ml至10ml(特别是10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1ml至3ml的体积(特别是3ml)。作为单剂量递送的多次注射包含约0.1ml至约0.5ml体积。例如，腺病毒颗粒可有利地通过向肿瘤施用多次注射来接触。
治疗方案也可变化，并且通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展，以及患者的健康和年龄。显然地，某些类型的肿瘤将需要更为有力的治疗，而在同时，某些患者不能容忍更繁重的方案。临床医生将最适合基于治疗性制剂的已知效力和毒性(如果有的话)做出这样的决定。
在某些实施方案中，被治疗的肿瘤可以至少在最初是不可切除的。用治疗性病毒构建体进行的治疗可由于边缘处的收缩或通过消除某些特别侵入的部分而提高肿瘤的可切除性。在治疗后，切除可以是可能的。切除之后的另外的治疗将用于消除肿瘤部位的微小残留疾病。
治疗可包括多种“单位剂量”。单位剂量被定义为包含预定量的治疗性组合物。待施用的量以及特定途径和制剂在临床领域技术人员的技能范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，但可包括在设定时间段内连续输注。本发明的单位剂量可方便地就病毒构建体的噬斑形成单位(pfu)而言来描述。单位剂量范围为103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu和更高。作为替代地，根据病毒种类和可获得的滴度，将向患者或患者细胞递送1至100、10至50、100至1000或者多至约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014，或1×1015或更高的感染性病毒颗粒(vp)。
B.可注射组合物和制剂
在本公开内容中用于将本文中提供的病毒组合物和/或免疫检查点抑制剂递送至过度增殖细胞的一种方法是通过肿瘤内注射。然而，如美国专利5,543,158、美国专利5,641,515和美国专利5,399,363(所有通过引用并入本文)中所述，本文中公开的药物组合物可以可替选地肠胃外、静脉内、皮内、肌内、经皮或甚至腹膜内施用。
核酸构建体的注射可通过注射器或用于溶液注射的任何其他方法来递送，只要表达构建体可以通过注射所需的特定规格的针即可。已经描述了新的无针注射系统(美国专利5,846,233)，其具有限定用于保持溶液的安瓿室的喷嘴和用于将溶液推出喷嘴至递送部位的能量装置。还已经描述了用于基因治疗的注射器系统，其允许精确地以任何深度多次注射预定量的溶液(美国专利5,846,225)。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468)。在所有情况下，该形式必须为无菌的并且必须是达到存在容易注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，和/或植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来完成。在许多情况下，将优选包含等张剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
对于以水溶液形式的肠胃外施用，例如，如果需要，溶液应当适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可将一剂量溶解在1ml等张NaCl溶液中，并添加到1000ml皮下灌注液中或在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第22版)。根据被治疗的对象的状况，剂量的一些变化将必然发生。无论如何，负责施用的人将确定个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA生物制品标准局(FDA Officeof Biologics standards)要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
通过所需量的活性化合物与上面列举的多种其他成分(根据需要)并入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将多种灭菌的活性成分并入包含基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的所期望成分的粉末。
本文中公开的组合物可配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且所述酸加成盐是与无机酸例如盐酸或磷酸或者例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如钠、钾、铵、钙，或铁的氢氧化物，以及例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。在配制时，将溶液以与剂量制剂相容的方式并以例如治疗上有效的量施用。制剂容易以多种剂量形式例如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。
C.另外的抗癌治疗
为了提高本文中提供的病毒组合物和在一些方面至少一种免疫检查点抑制剂的有效性，可以将它们与至少一种另外的在治疗癌症方面有效的药剂组合。更一般地，这些其他组合物将以有效杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及使细胞与病毒组合物和药剂或更多种因子同时接触。这可通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含病毒组合物而另一种包含第二药剂。作为替代地，病毒组合物可接触增殖细胞并且另外的治疗可影响免疫系统或肿瘤微环境的其他细胞以增强抗肿瘤免疫应答和治疗效力。
至少一种另外的抗癌治疗可以是但不限于手术治疗、化学治疗(例如，施用蛋白激酶抑制剂或EGFR靶向治疗)、放射治疗、冷冻治疗、高热治疗、光治疗、放射消融治疗、激素治疗、免疫治疗、小分子治疗、受体激酶抑制剂治疗、抗血管生成治疗、细胞因子治疗或生物治疗例如单克隆抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因治疗。不受限制地，生物治疗可以是基因治疗，例如肿瘤抑制基因治疗、细胞死亡蛋白基因治疗、细胞周期调节基因治疗、细胞因子基因治疗、毒素基因治疗、免疫基因治疗、自杀基因治疗、前药基因治疗、抗细胞增殖基因治疗、酶基因治疗，或抗血管生成因子基因治疗。
基因治疗可在其他药剂治疗之前或之后间隔数分钟或数周进行。在其他药剂和表达构建体单独应用于细胞的实施方案中，通常应确保每次递送时间之间的有效时间段没有期满，使得药剂和表达构建体仍能够对细胞发挥有利的组合作用。在这样的情况下，可以预期，可在彼此约12至24小时内并且更优选地在彼此约6至12小时内使细胞与两种形式接触。在一些情况下，可能期望显著延长治疗的时间段，然而，在各次施用之间间隔数天(例如，2、3、4、5、6或7)至数周(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。
可采用多种组合，病毒组合物和在一些实施方案中免疫检查点抑制剂是“A”，第二试剂(即化学治疗)是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
1.化学治疗
癌症治疗通常还包括具有基于化学和放射的治疗二者的多种组合治疗。组合化学治疗包括例如顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤、替莫唑胺(Temazolomide)(水性形式的DTIC)、或者前述物质的任何类似物或衍生物变体。化学治疗与生物治疗的组合被称为生物化学治疗。化学治疗也可以以低的连续剂量施用，这被称为节拍化学治疗(metronomic chemotherapy)。
另一些组合化学治疗包括例如烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)，和乌瑞替哌(uredopa)；亚乙基亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲三聚蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀，和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤菌素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素类，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(trichothecene)(特别是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；胍基胞嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类(taxoid)，例如紫杉醇和多西紫杉醇吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂；及任何上述物质的可药用盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，本文中提供的组合物可与组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合使用。在某些实施方案中，本文中提供的组合物可与吉非替尼组合使用。在另一些实施方案中，可将本发明实施方案与格列卫组合实践(例如，可将约400mg/天至约800mg/天的格列卫施用于患者)。在某些实施方案中，一种或更多种化学治疗剂可与本文中提供的组合物组合使用。
2.放射治疗
引起DNA损伤且已经广泛使用的其他因素包括通常称为y-射线、X-射线的因素和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。其他形式的DNA损伤因素也是已知的，例如微波和UV辐照。很可能所有这些因素均对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围从对于延长的时间段(3至4周)的50伦琴至200伦琴的每日剂量到2000伦琴至6000伦琴的单剂量变化。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可用作治疗的效应物或者其可募集其他细胞以实际上产生细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作当靶向剂。作为替代地，效应物可以是携带与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞，以及经修饰以表达嵌合抗原受体的这些细胞类型的经遗传改造的变体。
癌症免疫治疗领域的技术人员将理解，可将其他互补性免疫治疗添加至上述方案以进一步提高其效力，包括但不限于提高髓源性固有免疫系统细胞的数量的GM-CSF，消除抑制固有和适应性免疫的调节性T细胞的低剂量环磷酰胺或PI3K抑制剂(例如，PI3Kδ抑制剂)和5FU(例如，卡培他滨)，去除抑制性髓源性抑制细胞的P13K抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，PI3K抑制剂包括但不限于LY294002、哌立福新、BKM120、Duvelisib、PX-866、BAY 80-6946、BEZ235、SF1126、GDC-0941、XL147、XL765、Palomid 529、GSK1059615、PWT33597、IC87114、TG100-15、CAL263、PI-103、GNE-477、CUDC-907，和AEZS-136。在一些方面，PI3K抑制剂是PI3Kδ抑制剂，例如但不限于Idelalisib、RP6530、TGR1202，和RP6503。另外的PI3K抑制剂公开于美国专利申请No.US20150291595、US20110190319，以及国际专利申请No.WO2012146667、WO2014164942、WO2012062748，和WO2015082376中。免疫治疗还可包括施用白介素(例如IL-2)或干扰素(例如INFα)。
可以与局部/远位病毒组合物治疗和免疫检查点抑制剂组合的免疫治疗的实例是免疫佐剂(例如，牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳族化合物)(美国专利5,801,005；美国专利5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)；细胞因子治疗(例如，干扰素α、β和γ；白介素(IL-1、IL-2)、GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)；基因治疗(例如，TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)以及单克隆抗体(例如，抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。赫赛汀(曲妥珠单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(小鼠-人)单克隆抗体。其具有抗肿瘤活性并且已被批准用于治疗恶性肿瘤(Dillman，1999)。已经显示用赫赛汀和化学治疗的癌症的组合治疗比单个治疗更有效。因此，预期一种或更多种抗癌治疗可与本文中所述的Ad-mda7治疗一起采用。
可与局部/远位病毒组合物治疗和免疫检查点抑制剂组合的另外的免疫治疗包括共刺激受体激动剂、固有免疫细胞的刺激物，或固有免疫的激活剂。共刺激受体激动剂可以是抗OX40抗体(例如，MEDI6469、MEDI6383、MEDI0562和MOXR0916)；抗GITR抗体(例如，TRX518和MK-4166)；抗CD137抗体(例如，Urelumab和PF-05082566)；抗-CD40抗体(例如，CP-870,893和Chi Lob 7/4)；或抗CD27抗体(例如，伐利单抗(Varlilumab)，也称为CDX-1127)。固有免疫细胞的刺激物包括但不限于KIR单克隆抗体(例如，利瑞单抗)；细胞毒性抑制受体的抑制剂(例如，NKG2A，也称为KLRC和CD94，例如单克隆抗体莫那珠单抗(monalizumab)，和抗CD96，也称为TACTILE)；以及Toll样受体(TLR)激动剂。TLR激动剂可以是BCG、TLR7激动剂(例如，poly0ICLC和咪喹莫特)、TLR8激动剂(例如，雷西喹莫特(resiquimod))，或TLR9激动剂(例如，CPG7909)。固有免疫细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和树突细胞)的激活剂包括IDO抑制剂、TGFβ抑制剂、IL-10抑制剂。固有免疫的示例性激活剂是Indoximod。在一些方面，免疫治疗是干扰素基因刺激因子(STING)激动剂(Corrales等，2015)。
预期用于本公开内容的方法的其他免疫治疗包括由Tchekmedyian等，2015(通过引用并入本文)所述的免疫治疗。免疫治疗可包括抑制调节性T细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(MDSC)和癌症相关成纤维细胞(CAF)。在一些实施方案中，免疫治疗是肿瘤疫苗(例如，全肿瘤细胞疫苗、肽和重组肿瘤相关抗原疫苗)，或过继性细胞治疗(ACT)(例如，T细胞、天然杀伤细胞、TIL和LAK细胞)。T细胞可用嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)改造为特定的肿瘤抗原。如本文中使用的，嵌合抗原受体(或CAR)可指对目的抗原具有特异性的任何经改造的受体，所述受体当在T细胞中表达时赋予CAR在T细胞上的特异性。一旦使用标准分子技术产生，与例如过继性细胞转移的技术一样，可将表达嵌合抗原受体的T细胞引入患者中。在一些方面，T细胞是个体中相对于组合施用之前以产生“γ-IFN”的CD4和/或CD8T细胞和/或增强的细胞裂解活性为特征的活化的CD4和/或CD8T细胞。CD4和/或CD8 T细胞可表现出提高的选自IFN-γ、TNF-α和白介素的细胞因子的释放。CD4和/或CD8 T细胞可以是效应记忆T细胞。在某些实施方案中，CD4和/或CD8效应记忆T细胞的特征在于具有CD44高CD62L低的表达。
在某些方面，两种或更多种免疫治疗可与局部/远位病毒组合物治疗和免疫检查点抑制剂组合，所述免疫检查点抑制剂包括与T细胞共刺激受体的激动剂组合或与TIL ACT组合的另外的免疫检查点抑制剂。其他组合包括T细胞检查点阻断加共刺激受体激动剂、T细胞检查点阻断以改善固有免疫细胞功能、检查点阻断加IDO抑制、或检查点阻断加过继性T细胞转移。在某些方面，免疫治疗包括抗PD-L1免疫检查点抑制剂(例如Avelumab)、4-1BB(CD-137)激动剂(例如Utomilumab)利OX40(TNFRS4)激动剂的组合。免疫治疗可与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂例如5-氮杂胞苷和恩替诺特(entinostat)组合。
免疫治疗可以是癌症疫苗，其包含一种或更多种癌抗原，特别是蛋白质或其免疫原性片段；编码所述癌抗原的DNA或RNA，特别是蛋白质或其免疫原性片段；癌细胞裂解物和/或来自肿瘤细胞的蛋白质制剂。如本文中使用的，癌抗原是存在于癌细胞中的抗原物质。原则上，在癌细胞中产生的由于突变而具有异常结构的任何蛋白质均可以发挥癌抗原的作用。原则上，癌抗原可以是突变的癌基因和肿瘤抑制基因的产物、其他突变基因的产物、过表达或异常表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌抗原、癌胚抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白，或细胞类型-特异性分化抗原。癌抗原的实例包括ras和p53基因的异常产物。其他实例包括组织分化抗原、突变蛋白质抗原、致癌病毒抗原、癌-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。组织分化抗原是对某种类型的组织具有特异性的那些抗原。突变蛋白质抗原有可能对癌细胞更具特异性，因为正常细胞不应含有这些蛋白质。正常细胞将在其MHC分子上显示正常的蛋白质抗原，而癌细胞将显示突变形式。一些病毒蛋白涉及形成癌症，并且一些病毒抗原也是癌抗原。癌-睾丸抗原是主要在睾丸的生殖细胞中表达，但也在胎卵巢和滋养层中表达的抗原。一些癌细胞异常地表达这些蛋白质，并且因此呈递这些抗原，从而允许被对这些抗原具有特异性的T细胞攻击。这种类型的示例性抗原是CTAG1 B和MAGEA1以及Rindopepimut(靶向表皮生长因子受体(EGFR)vIII变体的14聚体皮内可注射肽疫苗)。当与如本文中所述的CD95/CD95L信号传导系统的抑制剂组合使用时，Rindopepimut特别适用于治疗胶质母细胞瘤。此外，通常以非常低的量产生但其产生在癌细胞中显著提高的蛋白质可能引发免疫应答。这样的蛋白质的一个实例是酶酪氨酸酶，其是黑色素产生所必需的。通常，酪氨酸酶以很小的量产生，但其水平在黑素瘤细胞中非常高。癌胚抗原是另一类重要的癌抗原。实例是α胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。这些蛋白质通常在胚胎发育的早期阶段产生，并在免疫系统完全发育时消失。因此，针对这些抗原不产生自身耐受性。异常蛋白质也由感染了致癌病毒(例如EBV和HPV)的细胞产生。被这些病毒感染的细胞包含被转录的潜伏病毒DNA，并且所得的蛋白质产生免疫应答。癌症疫苗可包括肽癌症疫苗，其在一些实施方案中是个性化肽疫苗。在一些实施方案中，肽癌疫苗是多价长肽疫苗、多肽疫苗、肽混合物疫苗、混合肽疫苗，或肽脉冲树突细胞疫苗。
免疫治疗可以是抗体，例如多克隆抗体制剂的一部分，或者可以是单克隆抗体。抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、抗体片段、双特异性抗体或单链抗体。如本文中公开的抗体包括抗体片段，例如但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdfv)以及包含VL或VH结构域的片段。在一些方面，抗体或其片段特异性结合表皮生长因子受体(EGFR1、Erb-B1)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)、TRAIL受体、上皮细胞黏附分子、癌胚抗原、前列腺特异性膜抗原、黏蛋白-1、CD30、CD33，或CD40。
可与本文中提供的组合物组合使用的单克隆抗体的实例包括但不限于曲妥珠单抗(抗-HER2/neu抗体)；帕妥珠单抗(抗HER2mAb)；西妥昔单抗(表皮生长因子受体EGFR的嵌合单克隆抗体)；帕尼单抗(抗EGFR抗体)；尼妥珠单抗(抗EGFR抗体)；扎鲁木单抗(Zalutumumab)(抗EGFR mAb)；耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(抗EGFR mAb)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化抗EGF受体双特异性抗体)；利妥昔单抗(嵌合鼠/人抗CD20mAb)；阿托珠单抗(obinutuzumab)(抗CD20mAb)；奥法木单抗(ofatumumab)(抗CD20mAb)；托西莫单抗(Tositumumab)-I131(抗CD20mAb)；替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(抗CD20mAb)；贝伐单抗(抗VEGF mAb)；雷莫芦单抗(Ramucirumab)(抗VEGFR2 mAb)；雷珠单抗(抗-VEGF mAb)；阿柏西普(Aflibercept)(与IgG1 Fc融合的VEGFR1和VEGFR2的胞外结构域)；AMG386(与IgG1 Fc融合的血管生成素-1和-2结合肽)；达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(抗-IGF-1R mAb)；吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33mAb)；阿仑单抗(抗Campath-1/CD52 mAb)；布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(抗CD30 mAb)；卡妥索单抗(Catumaxomab)(靶向上皮细胞黏附分子和CD3的双特异性mAb)；Naptumomab(抗5T4 mAb)；吉妥昔单抗(Girentuximab)(抗碳酸酐酶ix)；或法鲁珠单抗(Farletuzumab)(抗叶酸受体)。其他实例包括抗体例如PanorexTM(17-1A)(鼠单克隆抗体)；Panorex(@(17-1A)(嵌合鼠单克隆抗体)；BEC2(抗独特型mAb，模拟GD表位)(具有BCG)；Oncolym(Lym-1单克隆抗体)；SMART M195 Ab、人源化13′1 LYM-1(Oncolym)、Ovarex(B43.13，抗独特型小鼠mAb)；与腺癌上的EGP40(17-1A)泛癌抗原结合的3622W94 mAb；Zenapax(SMART抗Tac(IL-2受体)；SMART M195 Ab，人源化Ab，人源化)；NovoMAb-G2(泛癌特异性Ab)；TNT(组蛋白抗原的嵌合mAb)；TNT(组蛋白抗原的嵌合mAb)；Gliomab-H(单克隆抗体-人源化Ab)；GNI-250Mab；EMD-72000(嵌合EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化IL.L.2抗体)；以及MDX-260双特异性靶标GD-2、ANA Ab、SMART IDIO Ab、SMART ABL364 Ab或ImmuRAIT-CEA。抗体的实例包括美国专利No.5,736,167、美国专利No.7,060,808，和美国专利No.5,821,337中公开的抗体。
抗体的另一些实例包括扎木单抗(Zanulimumab)(抗-CD4mAb)、凯利昔单抗(Keliximab)(抗-CD4 mAb)；伊匹单抗(MDX-101；抗-CTLA-4 mAb)；曲米单抗(Tremilimumab)(抗CTLA-4 mAb)；达利珠单抗(Daclizumab)抗CD25/IL-2R mAb)；巴利昔单抗(抗CD25/IL-2R mAb)；MDX-1106(抗PD1 mAb)；GITR的抗体；GC1008(抗TGF-β抗体)；metelimumab/CAT-192(抗TGF-β抗体)；乐地单抗(lerdelimumab)/CAT-152(抗-TGF-β抗体)；ID11(抗-TGF-β抗体)；地诺单抗(Denosumab)(抗-RANKL mAb)；BMS-663513(人源化抗4-1BB mAb)；SGN-40(人源化抗CD40mAb)；CP870,893(人源化抗CD40mAb)；英夫利昔单抗(嵌合抗TNF mAb)；阿达木单抗(人源化抗TNF mAb)；赛妥珠单抗(Certolizumab)(人源化Fab抗TNF)；戈利木单抗(golimumab)(抗TNF)；依那西普(与IgG1 Fc融合的TNFR的胞外结构域)；贝拉西普(Belatacept)(与Fc融合的CTLA-4的胞外结构域)；阿巴西普(与Fc融合的CTLA-4的胞外结构域)；贝利单抗(Belimumab)(抗B淋巴细胞刺激物)；莫罗单抗(Muromonab)-CD3(抗CD3mAb)；奥昔珠单抗(Otelixizumab)(抗CD3mAb)；替利珠单抗(Teplizumab)(抗CD3mAb)；托珠单抗(Tocilizumab)(抗IL6R mAb)；REGN88(抗IL6R mAb)；优特克单抗(Ustekinumab)(抗IL-12/23mAb)；Briakinumab(抗IL-12/23mAb)；那他珠单抗(natalizumab)(抗α4整联蛋白)；维多珠单抗(Vedolizumab)(抗α4 β7整联蛋白mAb)；T1 h(抗CD6 mAb)；依帕珠单抗(Epratuzumab)(抗CD22 mAb)；依法珠单抗(Efalizumab)(抗CD11a mAb)；和阿塞西普(与Fc融合的跨膜激活剂和钙调节配体相互作用子的胞外结构域)。
a.被动免疫治疗
存在许多用于癌症的被动免疫治疗的不同方法。它们可大致分为以下：单独注射抗体；注射与毒素或化学治疗剂偶联的抗体；注射与放射性同位素偶联的抗体；注射抗独特型抗体；以及最后清除骨髓中的肿瘤细胞。
优选地，将人单克隆抗体应用于被动免疫治疗，因为它们在患者中产生很少或不产生副作用。已经将神经节苷脂抗原的人单克隆抗体病变内施用于患有皮肤复发性黑素瘤的患者(Irie&Morton，1986)。在每日或每周病变内注射后，在10名患者中的6名中观察到衰退。在另一项研究中，由两种人单克隆抗体的病变内注射实现了中等的成功(Irie等，1989)。
施用针对两种不同抗原的多于一种单克隆抗体或甚至具有多种抗原特异性的抗体可能是有利的。治疗方案还可包括施用淋巴因子或其他免疫增强剂，如Bajorin等(1988)所述。在本说明书的其他部分中进一步详细描述了人单克隆抗体的开发。
b.主动免疫治疗
在主动免疫治疗中，抗原肽、多肽或蛋白质，或自体或同种异体的肿瘤细胞组合物或“疫苗”通常与独特的细菌佐剂一起施用(Ravindranath&Morton，1991；Morton&Ravindranath，1996；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。在黑素瘤免疫治疗中，那些引发高IgM应答的患者通常比那些不引发或引发低IgM抗体的患者存活得更好(Morton等，1992)。IgM抗体通常是短暂抗体，并且规则的例外似乎是抗神经节苷脂或抗糖类(anticarbohydrate)抗体。
c.过继免疫治疗
在过继免疫治疗中，在体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴细胞，通过淋巴因子(例如IL-2)激活或用基因转导以使肿瘤坏死，并再施用(Rosenberg等，1988；1989)。为了达到这一点，将免疫有效量的经活化的淋巴细胞与如本文中所述的佐剂并入的抗原肽组合物组合施用于动物或人患者。经活化的淋巴细胞将最优选是早期从血液或肿瘤样品分离并在体外活化(或“扩增”)的患者自身的细胞。这种免疫治疗形式已经产生了数个黑素瘤和肾癌消退的病例，但响应者的百分比与没有应答的相比较少。最近，当这样的过继免疫细胞治疗已被并入表达嵌合抗原受体(CAR)的经遗传改造的T细胞(称为CAR T细胞治疗)中时，观察到更高的应答率。类似地，已分离自体和同种导体二者的自然杀伤细胞，扩增并经遗传修饰以表达受体或配体以促进其结合和杀伤肿瘤细胞。
4.其他药剂
预期其他药剂可与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂，或提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β，和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES，和其他趋化因子。还预期，细胞表面受体或其配体(例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)的上调将通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌效应而增强本文中提供的组合物的凋亡诱导能力。通过提高GAP连接的数量来提高细胞间信号传导将提高对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖效应。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明的效力。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期，可以将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗效力。
在另一些实施方案中，其他药剂可以是一种或更多种溶瘤病毒，例如经改造成表达除p53和/或IL24(例如细胞因子)以外的基因的溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、E-B病毒、流感病毒和呼肠孤病毒。在一个特定实施方案中，其他药剂是talimogene laherparepvec(T-VEC)，其是经遗传改造成表达GM-CSF的溶瘤单纯疱疹病毒。Talimogene laherparepvec，HSV-1[毒株JS1]ICP34.5-/ICP47-/hGM-CSF(先前称为OncoVEXGM CSF)是瘤内递送的溶瘤免疫治疗，其包含在实体瘤中选择性复制的免疫增强型HSV-1。(Lui等，Gene Therapy，10：292-303，2003；美国专利No.7,223,593和美国专利No.7,537,924；通过引用并入本文)。在2015年10月，美国FDA批准了以商品名IMLYGICTM的T-VEC用于治疗具有不能手术的肿瘤的患者中的黑素瘤。例如，IMLYGICTM包装说明书(Amgen，2015)和美国专利公开No.US2015/0202290中描述了T-VEC的施用特征和方法；二者均通过引用并入本文。例如，talimogene laherparepvec通常通过以下施用：在第1周的第1天，以至多4.0ml的106个噬斑形成单位/mL(PFU/mL)的剂量瘤内注射到可注射的皮肤、皮下和结节肿瘤中，接着在第4周的第1天以及之后每2周(±3天)以至多4.0ml的108个PFU/mL的剂量施用。待注入肿瘤中的talimogene laherparepvec的推荐体积取决于肿瘤的尺寸，并且应当根据注射体积准则确定。虽然T-VEC已经在黑素瘤患者中显示出临床活性，但许多癌症患者对T-VEC治疗无响应或停止响应。在一个实施方案中，局部/远位病毒组合物和至少一种免疫检查点抑制剂可在T-VEC治疗之后、期间或之前施用，例如以逆转治疗抗性。示例性溶瘤病毒包括但不限于Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12、CavatakTM、CG0070、DNX-2401、G207、HF10、IMLYGICTM、JX-594、MG1-MA3、MV-NIS、OBP-301、Toca 511、Oncorine，和RIGVIR。其他示例性溶瘤病毒描述于例如国际专利公开No.WO2015/027163、WO2014/138314、WO2014/047350，和WO2016/009017中；全部通过引用并入本文。
在某些实施方案中，激素治疗也可与本发明实施方案结合使用或与先前描述的任何其他癌症治疗组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌，或宫颈癌，以降低水平或阻断某些激素(例如睾酮或雌激素)的作用。这种治疗通常作为治疗选择或降低转移风险与至少一种其他癌症治疗组合使用。
在一些方面，至少一种另外的抗癌治疗是HDM2(也称为MDM2)和/或HDM4的抑制剂(例如，小分子抑制剂)，例如以阻断p53活性。在一些具体方面，HDM2的小分子抑制剂是HDM201、顺式-咪唑啉(例如，Nutlin)、苯二氮卓(BDP)和螺-羟吲哚。用于本发明方法的其他示例性HDM2和/或HDM4抑制剂描述于例如Carry等，2013；Patel和Player，2008；美国专利No.8,846,657；国际专利公开No.WO2014123882；美国专利No.9,073,898和国际专利公开No.WO2014115080中；全部通过引用并入本文。
在一些方面，另外的抗癌剂是抑制参与蛋白激酶或生长因子信号传导途径的受体的蛋白激酶抑制剂或单克隆抗体，例如EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Abl、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。蛋白激酶或生长因子信号传导途径抑制剂的非限制性实例包括：阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、博舒替尼、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福他替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、雷珠单抗、鲁索替尼、塞卡替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、AP23451、威罗菲尼、MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新、哌立福新、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、Alvocidib、金雀异黄素、司美替尼、AZD-6244、瓦他拉尼、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016或其混合物。在某些方面，另外的抗癌剂是酪氨酸激酶抑制剂，例如布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一些方面，本文中采用的小分子BTK抑制剂是指抑制(例如，不可逆地)BTK蛋白的化学合成分子，其通常具有500道尔顿或更低的分子量。示例性BTK抑制剂包括依鲁替尼、阿卡替尼(ACP-196)、ONO-4059、司培替尼(CC-292)、HM-71224、CG-036806、GDC-0834、ONO-4049、RN-486、SNS-062、TAS-5567、AVL-101、AVL-291、PCI-45261、HCI-1684、PLS-123，和BGB-3111。用于本发明方法的另外的BTK抑制剂描述于例如PCT公开No.WO2014210255、WO2016087994、WO2013010380、WO2015061247、WO2013067274，和WO1999054286以及美国专利No.6,160,010；所有这些都通过引用整体并入本文。
在一些方面，PI3K抑制剂选自由以下组成的PI3K抑制剂的组：buparlisib、艾代拉里斯(idelalisib)、BYL-719、dactolisib、PF-05212384、pictilisib、copanlisib、copanlisib二盐酸盐、ZSTK-474、GSK-2636771、duvelisib、GS-9820、PF-04691502、SAR-245408、SAR-245409、sonolisib、Archexin、GDC-0032、GDC-0980、apitolisib、pilaralisib、DLBS 1425、PX-866、voxtalisib、AZD-8186、BGT-226、DS-7423、GDC-0084、GSK-21 26458、INK-1 1 17、SAR-260301、SF-1 1 26、AMG-319、BAY-1082439、CH-51 32799、GSK-2269557、P-71 70、PWT-33597、CAL-263、RG-7603、LY-3023414、RP-5264、RV-1729、taselisib、TGR-1 202、GSK-418、INCB-040093、Panulisib、GSK-105961 5、CNX-1351、AMG-51 1、PQR-309、17β-羟基渥曼青霉素、AEZS-129、AEZS-136、HM-5016699、IPI-443、ONC-201、PF-4989216、RP-6503、SF-2626、X-339、XL-499、PQR-401、AEZS-132、CZC-24832、KAR-4141、PQR-31 1、PQR-316、RP-5090、VS-5584、X-480、AEZS-126、AS-604850、BAG-956、CAL-130、CZC-24758、ETP-46321、ETP-471 87、GNE-317、GS-548202、HM-032、KAR-1 139、LY-294002、PF-04979064、PI-620、PKI-402、PWT-143、RP-6530、3-HOI-BA-01、AEZS-134、AS-041 164、AS-252424、AS-605240、AS-605858、AS-606839、BCCA-621 C、CAY-10505、CH-5033855、CH-5108134、CUDC-908、CZC-1 9945、D-106669、D-87503、DPT-NX7、ETP-46444、ETP-46992、GE-21、GNE-123、GNE-151、GNE-293、GNE-380、GNE-390、GNE-477、GNE-490、GNE-493、GNE-614、HMPL-518、HS-104、HS-106、HS-1 16、HS-173、HS-196、IC-486068、INK-055、KAR 1 141、KY-12420、渥曼青霉素、Lin-05、NPT-520-34、PF-04691503、PF-06465603、PGNX-01、PGNX-02、PI620、PI-103、PI-509、PI-516、PI-540、PIK-75、PWT-458、RO-2492、RP-5152、RP-5237、SB-201 5、SB-2312、SB-2343、SHBM-1009、SN 32976、SR-13179、SRX-2523、SRX-2558、SRX-2626、SRX-3636、SRX-5000、TGR-5237、TGX-221、UCB-5857、WAY-266175、WAY-266176、EI-201、AEZS-131、AQX-MN100、KCC-TGX、OXY-1 1 1A、PI-708、PX-2000，和WJD-008。
预期，另外的癌症治疗可以包括靶向以下物质的抗体、肽、多肽、小分子抑制剂、siRNA、miRNA或基因治疗：例如，表皮生长因子受体(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)，ErbB-2(HER2/neu)，ErbB-3/HER3，ErbB-4/HER4，EGFR配体家族；胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白(IGFBP)、IGFR配体家族(IGF-1R)；来源于血小板的生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族：TRK受体家族；肝配蛋白(EPH)受体家族；AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族，血管生成素1，2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族；盘状结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子α(TGF-α)、TGF-α受体；转化生长因子-β(TGF-β)、TGF-β受体；白介素13受体α2链(1L13Rα2)、白介素-6(IL-6)、IL-6受体、白介素-4、IL-4受体、细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)和II类(干扰素/1L-10家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)家族、TNF-α、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNTRSF)、死亡受体家族、TRAIL-受体；癌-睾丸(CT)抗原，谱系特异性抗原，分化抗原，α-辅肌动蛋白-4，ARTC1，断点簇区域-Abelson(Bcr-abl)融合产物，B-RAF，胱天蛋白酶-5(CASP-5)，胱天蛋白酶-8(CASP-8)，β-连环蛋白(CTNNB1)，细胞分裂周期27(CDC27)，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，CDKN2A，COA-1，dek-can融合蛋白，EFTUD-2，延伸因子2(ELF2)，Ets变体基因6/急性髓细胞性白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白，纤连蛋白(FN)，GPNMB，低密度脂质受体/GDP-L岩藻糖：β-D半乳糖2-α-L岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白，HLA-A2，HLA-A2基因中的α2结构域的α-螺旋的第170位残基上的精氨酸与异亮氨酸交换(HLA-A*201-R170I)，MLA-A11，热激蛋白70-2突变(HSP70-2M)，KIAA0205，MART2，黑素瘤普遍存在的突变1，2，3(MUM-1，2，3)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，neo-PAP，1类肌球蛋白，NFYC，OGT，OS-9，pml-RARα融合蛋白，PRDX5，PTPRK，K-ras(KRAS2)，N-ras(NRAS)，HRAS，RBAF600，SIRT2，SNRPD1，SYT-SSX1或SYT-SSX2融合蛋白，丙糖磷酸异构酶，BAGE，BAGE-1，BAGE-2，3，4，5，GAGE-1，2，3，4，5，6，7，8，GnT-V(异常N-乙酰基葡糖氨基转移酶V，MGAT5)，HERV-K-MEL，KK-LC，KM-HN-1，LAGE，LAGE-1，黑素瘤上的CTL-识别抗原(CAMEL)，MAGE-A1(MAGE-1)，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-AS，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-3，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-C1，MAGE-C2，黏蛋白1(MUC1)，MART-1/Melan-A(MLANA)，gp100，gp100/Pme117(S1LV)，酪氨酸酶(TYR)，TRP-1，HAGE，NA-88，NY-ESO-1，NY-ESO-1/LAGE-2，SAGE，Sp17，SSX-1，2，3，4，TRP2-1NT2，癌胚抗原(CEA)，Kallikfein 4，乳腺珠蛋白-A，OA1，前列腺特导性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原，TRP-1/gp75，TRP-2，脂肪分化相关蛋白(adipophilin)，nielanorna 2中缺失的干扰素可诱导蛋白(AIM-2)，BING-4，CPSF，细胞周期蛋白D1，上皮细胞黏附分子(Ep-CAM)，EpbA3，成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)，糖蛋白250(gp250肠羧基酯酶(iCE)，α-胎蛋白(AFP)，M-CSF，mdm-2，MUCI，p53(TP53)，PBF，FRAME，PSMA，RAGE-1，RNF43，RU2AS，SOX10，STEAP1，生存素(BIRCS)，人端粒酶反转录酶(hTERT)，端粒酶，Wilms肿瘤基因(WT1)，SYCP1，BRDT，SPANX，XAGE，ADAM2，PAGE-5，LIP1，CTAGE-1，CSAGE，MMA1，CAGE，BORIS，HOM-TES-85，AF15q14，HCA66I，LDHC，MORC，SGY-1，SPO11，TPX1，NY-SAR-35，FTHLI7，NXF2 TDRD1，TEX 15，FATE，TPTE，免疫球蛋白独特型，Bence-Jones蛋白，雌激素受体(ER)，雄激素受体(AR)，CD40，CD30，CD20，CD19，CD33，CD4，CD25，CD3，癌抗原72-4(CA 72-4)，癌抗原15-3(CA 15-3)，癌抗原27-29(CA 27-29)，癌抗原125(CA 125)，癌抗原19-9(CA 19-9)，β-人绒毛膜促性腺激素，1-2微球蛋白，鳞状细胞癌抗原，神经元特异性烯醇化酶，热激蛋白gp96，GM2，沙格司亭，CTLA-4，707丙氨酸脯氨酸(707-AP)，T细胞识别的腺癌抗原4(ART-4)，癌胚抗原肽-1(CAP-1)，钙激活氯离子通道-2(CLCA2)，亲环蛋白B(Cyp-B)，人印戒肿瘤-2(HST-2)，人乳头瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6，HPV-E7，主要或次要衣壳抗原，其他)，EB病毒(EBV)蛋白(EBV潜在膜蛋白-LMP1、LMP2；其他)，乙型或丙型肝炎病毒蛋白，和HIV蛋白。
VI.制品或药盒
提供了包含病毒组合物的制品(article of manufacture)或药盒(kit)，并且在一些实施方案中本文中还提供了至少一种免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体和/或抗CT1A-4抗体)。制品或药盒还可以包含包装说明书，所述包装说明书包括与病毒组合物结合使用至少一种检查点抑制剂以治疗或延缓个体中的癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文中所述的任何免疫检查点抑制剂和病毒组合物可包含在制品或药盒中。
在一些实施方案中，至少一种免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体和/或抗CTLA-4抗体)和病毒组合物在同一容器或单独的容器中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。容器可由多种材料形成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关的标签可表明使用指导。制品或药盒还可包括从商业和使用者立场来看期望的其他材料，包括另外的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器，和具有使用说明书的包装说明书。在一些实施方案中，制品还包含一种或更多种另外的药剂(例如，化学治疗剂和抗肿瘤(anti-neoplastic)剂)。一种或更多种药剂的合适容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
VII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1-用于诱导局部和远位效应以及逆转对先前免疫治疗的抗性的松弛素病毒治疗与免疫检查点抑制剂治疗组合
在免疫活性的动物肿瘤模型中证实松弛素病毒治疗对于诱导对先前的免疫治疗具有抗性的肿瘤的局部和远位效应的效力。利用以下治疗方法、剂量和时间表：
动物、肿瘤接种和测量：利用C57BL/6(B6)小鼠(6至8周龄)。向动物的右胁腹皮下注射B16F10黑素瘤细胞(ATCC，5×105个细胞/小鼠)以形成“原发性肿瘤”。当肿瘤尺寸达到大约50mm3时开始原发性局部肿瘤治疗，并且这被称为治疗第1天。通过评价随后植入的未接受病毒治疗注射的对侧肿瘤的生长来确定远位治疗效果。通过测量肿瘤的长度(L)和宽度(w)来监测肿瘤生长，并使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝0.523L(w)2。监测动物长至60天，并且当肿瘤达到约2000mm3时将其处死。
病毒载体：所用的表达松弛素的病毒如由Kim等，2006所述。简单地说，通过将松弛素基因插入E3腺病毒区域中产生表达松弛素的有复制能力的(Ad-ΔE1B-RLX)腺病毒。以48小时间隔瘤内施用四个剂量的病毒载体。每个病毒剂量在50μl体积中包含5×1010个病毒颗粒。
免疫检查点抑制剂：为了模拟免疫检查点抑制剂治疗期间肿瘤进展的常见临床状况，在第1天腹膜内开始抗PD1治疗，以10mg/kg的剂量，并且每3天施用直至第31天。在一些实验中，为了评估对先前的免疫治疗具有抗性的肿瘤中肿瘤抑制物治疗的效果，在抗PD-1治疗的肿瘤进展之后开始肿瘤抑制物治疗，其中在抗PD-1治疗开始之后2至3天给予第一肿瘤抑制物治疗剂量。在另一些实验中，肿瘤抑制物治疗与作为初始治疗的免疫检查点抑制剂同时开始。这些研究在已知对免疫检查点抑制剂治疗具有高度抗性的肿瘤中进行。已知B16F10黑素瘤模型对免疫治疗具有高度抗性。在这些模型中，类似于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照处理，肿瘤在免疫检查点抑制剂治疗中发展。特异性产生用于体内使用的抗小鼠PD-1抗体(CD279)购自BioXcell(目录#BE0146)，如抗PD-L1抗体和免疫调节剂抗LAG-3抗体一样。出乎意料的是，局部区域松弛素病毒治疗逆转了对全身免疫检查点抑制剂治疗的抗性，显示出与免疫检查点抑制剂治疗的出乎意料的协同作用，并且组合治疗对未经病毒治疗进行治疗的远端肿瘤诱导优异的远位效应。当与外科手术、放射、化学治疗、细胞因子治疗和已知调节髓源性抑制细胞(MDSC)、T-Reg和树突细胞的药剂组合时，发现这些出乎意料的治疗效果得到了增强。
在先前的免疫治疗中进展的肿瘤中的Ad-松弛素加检查点抑制剂：通过肿瘤体积(在原发性肿瘤和对侧肿瘤中)和存活评估Ad-松弛素与抗PD-1组合的治疗效力。关于原发性肿瘤体积(图1)，在用抗PD-1单一治疗进行治疗的动物中存在严重的肿瘤进展，与在PBS处理的对照中观察到的生长具有很小的差异。相比之下，当用组合治疗(Ad-松弛素+抗PD-1)处理动物时，观察到抗PD-1抗性的逆转。到第8天，与单独的抗PD-1或Ad-松弛素治疗相比，用Ad-松弛素+抗PD-1的组合治疗诱导了肿瘤体积的大幅降低。T检验统计分析确定了与单独的Ad-松弛素(p值0.0254)或单独的抗PD-1(p值0.0231)相比，Ad-松弛素+抗PD1的抗肿瘤作用是显著的。与单独的Ad-松弛素和抗PD-1治疗的适度作用相比，组合的Ad-松弛素和抗PD-1的效力提高是超过加和的，这与PBS对照的处理无统计学差异。
远位效力Ad-松弛素+抗PD-1示于图2中，其中在原发性肿瘤已接受Ad-松弛素或Ad-松弛素+抗PD-1处理的组合的啮齿动物中评估随时间的对侧肿瘤体积。在未接受病毒治疗注射的对侧(继发性)肿瘤中也观察到通过T检验的统计学显著的远位效应，与用单独的抗PD-1处理的原发性肿瘤的生长速率相比肿瘤生长降低。这些发现表明病毒处理(单独的Ad-松弛素和Ad-松弛素+抗PD1)诱导了远位效应。与用单独的抗PD-1处理的原发性肿瘤的生长速率相比，其原发性肿瘤已用单独的Ad-松弛素处理的动物中的对侧肿瘤显示出显著延迟的肿瘤生长(p＝0.0273)。与在抑制原发性肿瘤生长中观察到的协同效应一致，在其原发性肿瘤用组合的Ad-松弛素+抗PD-1处理的小鼠中观察到对对侧肿瘤生长的甚至更强的远位效应(p＝0.0009)。
组合的Ad-松弛素+抗PD1治疗的存活效力提高示于图3中，其描绘了用PBS、抗PD-1、Ad-松弛素或Ad-松弛素+抗PD-1的组合处理的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。与用单独的抗PD-1处理相比，在其原发性肿瘤用组合的Ad-松弛素+抗PD-1处理的小鼠中通过对数秩检验显示存活统计学显著的提高(p＝0.0010)。组合的Ad-松弛素+抗PD-1组的中值存活的提高大于对于单独的Ad-松弛素和单独的抗PD-1观察到的分开效应的加和。与单独的抗PD-1相比，用单独的Ad-松弛素处理的小鼠的存活没有统计学显著的提高。多于加和的Ad-松弛素+抗PD-1的提高的存活的结果与在对于组合的Ad-松弛素+抗PD-1治疗的抑制原发性肿瘤生长和对对侧肿瘤生长的更大的远位效应中观察到的协同效应一致，并且反映了组合治疗的出乎意料的协同效应。
重要的是应当指出，对侧肿瘤未注射任何治疗剂。总的来说，这些结果证明，将局部区域治疗与结合免疫检查点抑制剂治疗的指定病毒组合逆转对全身免疫检查点抑制剂的抗性，表现出出乎意料的与免疫检查点抑制剂治疗的协同作用，并且组合治疗对未经病毒治疗进行治疗的远端肿瘤诱导优异的远位效应。
实施例2-用于逆转对免疫治疗的抗性的VRX-007(经改造成过表达ADP的腺病毒)与免疫检查点抑制剂治疗组合
在免疫活性动物肿瘤模型中评价免疫检查点抑制剂治疗与腺病毒死亡蛋白(ADP)基因治疗组合的效力。VRX-007是经改造成过表达ADP基因的腺病毒。利用以下治疗方法、剂量和时间表：
动物、肿瘤接种和测量：ADS免疫活性肿瘤模型(Zhang等，2015)用于这些研究。为了评估和比较VRX-007和VRX-007+抗PD-L1处理在大的、成熟的(well established)肿瘤中的作用，经VRX-007处理的组中的动物具有尺寸大于100mm3的肿瘤。比较了四个处理组，包括PBS载剂对照(N＝10)、抗PD-L1免疫检查点抑制剂(N＝10)、VRX-007(N＝4)和VRX-007+抗PD-L1(N＝4)。每天以109个噬斑形成单位(plaque forming unit，pfu)的剂量肿瘤内给予VRX-007基因治疗，总共3次施用。用抗PD-L1处理的组中的动物每三天接受腹膜内(i.p.)注射200μg。抗小鼠PD-L1抗体(CD274)购自BioXcell(目录#BE0101)。
通过比较治疗开始之后15天(或在动物处死时)的肿瘤体积相对于基线值的百分比变化来评价治疗效力(图4)。由于VRX-007处理组中动物的数量少，因此使用Kruskal-Wallis单因素方差分析(秩的单因素ANOVA)，并显示处理组之间的统计学显著性差异(p值＝0.0258)。组合的VRX-007+抗PD-L1治疗(p＝0.0047)的统计学显著的抗肿瘤作用是出乎意料且具有出人意料的协同作用，因为VRX-007(p＝0.1232)和抗PD-L1(p＝0.5866)单独地与用载剂对照的处理无统计学差异(图4)。组合的VRX-007和抗PD-L1的效力提高是多于加和的，并且组合的处理在统计学上也优于单独的抗PD-L1治疗(p＝0.0157)。此外，T检验统计学分析显示，与单独的VRX-007相比，VRX-007+抗PD1的抗肿瘤作用是显著的(单侧p值0.0356)。因此，组合的VRX-007+抗PD-L1治疗的效力和协同作用是出乎意料的，因为两种处理均未显示出单独的统计学显著的效力。
基于以上实施例1和实施例2中的结果，病毒组合物治疗的临床应用作为初始癌症治疗应用，或者它们在对包括免疫治疗例如TVEC或免疫检查点抑制剂治疗，或细胞因子或白介素或过继性细胞治疗或放射或化学治疗或小分子治疗的其他治疗产生抗性之后施用。
概述：实施例中描述的动物研究使用高度侵袭性的癌症模型，已知其对检查点抑制剂治疗具有抗性。出乎意料的是，局部区域施用病毒组合物治疗逆转了对全身免疫检查点抑制剂治疗的抗性，显示出与免疫检查点抑制剂治疗的出乎意料的协同作用，并且组合治疗对未用病毒组合物治疗处理的远端肿瘤诱导优异的远位效应。当与包括放射、外科手术、化学治疗、细胞因子治疗、靶向治疗和已知调节髓源性抑制细胞(MDSC)(5FU)、T-Reg(CTX)和树突细胞(抗PD-1和抗LAG-3)的药剂的另外的治疗组合时，发现这些出乎意料的全身治疗效果得到了增强。
考虑到本公开内容，本文中公开的和要求保护的所有方法可以在无需过度实验的情况下进行和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，将变化应用于本文中所述的方法和步骤或方法的步骤的顺序。更具体地，明显的是，化学上和生理学上均相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说明显的所有这样的类似替代和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其提供了对本文中所述的那些的补充的示例性程序性细节或其他细节而言，通过引用明确地并入本文。
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Claims (119)

1.治疗对象中的癌症的方法，其包括向所述对象施用有效量的：
(a)经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒；和
(b)至少一种免疫检查点抑制剂。
2.治疗对象中的癌症的方法，具包括向所述对象施用有效量的经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的两种或更多种病毒。
3.治疗或预防对象中的癌症或感染性疾病的方法，其包括向所述对象施用有效量的：
(a)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的牛痘病毒，所述病毒包含N1L基因缺失；和
(b)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的至少第二病毒。
4.权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是间皮素、黑素瘤相关基因(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、突变的Ras，或突变的p53。
5.权利要求3所述的方法，其中所述病原体相关抗原是由感染性病毒、细菌、真菌、朊病毒，或寄生生物表达的抗原。
6.权利要求3所述的方法，其中由所述牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由所述第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是相同的。
7.权利要求3所述的方法，其中由所述牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由所述第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是不同的。
8.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病毒诱导局部和/或远位效应。
9.权利要求2或权利要求3所述的方法，其还包括施用至少一种免疫检查点抑制剂。
10.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中施用两种、三种，或四种病毒。
11.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病毒包含腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。
12.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病毒包含一种或更多种腺病毒。
13.权利要求3所述的方法，其中表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的所述第二病毒是腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。
14.权利要求13所述的方法，其中所述表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的第二病毒是腺病毒。
15.权利要求14所述的方法，其中在施用表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的N1L缺失的牛痘病毒之前施用所述腺病毒。
16.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述腺病毒死亡蛋白基因是过表达的。
17.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基质降解蛋白基因是松弛素、透明质酸酶，或饰胶蛋白聚糖。
18.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基质降解蛋白基因是松弛素。
19.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞色素p450基因是细胞色素p4502B1基因。
20.权利要求19所述的方法，其中所述细胞色素p4502B1基因是大鼠细胞色素p4502B1基因。
21.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中经改造成包含N1L缺失的病毒是牛痘病毒。
22.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中经改造成包含细胞色素p450基因的病毒是单纯疱疹病毒。
23.权利要求16所述的方法，其中经改造成包含基质降解蛋白和/或腺病毒死亡蛋白基因的病毒是腺病毒。
24.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述病毒还被改造成表达治疗性核酸。
25.权利要求24所述的方法，其中所述治疗性核酸编码p53和/或IL-24。
26.权利要求1或权利要求2所述的方法，其还包括恢复或增强p53和/或IL-24功能。
27.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述至少一种检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR，或A2aR的抑制剂。
28.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)轴结合拮抗剂。
29.权利要求28所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂选自PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。
30.权利要求28所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
31.权利要求29所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PDL1和/或PDL2的结合。
32.权利要求29所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求29所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂是纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、AMP-514、REGN2810、CT-011、BMS 936559、MPDL328OA或AMP-224。
34.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。
35.权利要求34所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美本单抗或伊匹单抗。
36.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)抗体。
37.权利要求36所述的方法，其中所述抗KIR抗体是利瑞单抗。
38.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中施用多于一种检查点抑制剂。
39.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是全身施用的。
40.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述病毒是有复制能力的或溶瘤的。
41.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述病毒是复制缺陷型的。
42.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述病毒包含有复制能力的和复制缺陷型病毒的组合。
43.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述病毒和/或至少一种检查点抑制剂经瘤内、动脉内、静脉内、血管内、胸膜内、腹膜内、气管内、鞘内、肌内、通过内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域、立体定向，或者通过直接注射或灌注施用。
44.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述病毒经瘤内施用。
45.权利要求3所述的方法，其中所述病毒经皮内、皮下、肌内、腹膜内、经口、通过吸入，或通过其他形式的黏膜暴露施用。
46.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖器癌、呼吸道癌、造血癌、肌肉骨骼癌、神经内分泌癌、上皮癌、肉瘤、中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。
47.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
48.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中所述病毒和/或至少一种免疫检查点抑制剂诱导远位效应。
49.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中向所述对象施用所述病毒和/或至少一种免疫检查点抑制剂多于一次。
50.权利要求1或权利要求9所述的方法，其中在所述至少一种免疫检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述病毒。
51.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中施用包括局部或区域注射。
52.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中施用是通过连续输注、瘤内注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射，或鞘内注射进行的。
53.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述对象是人。
54.权利要求3所述的方法，其中所述对象是健康对象。
55.权利要求3所述的方法，其中所述对象包含恶性前病变。
56.权利要求55所述的方法，其中所述恶性前病变是白斑病或发育不良性病变。
57.权利要求3所述的方法，其中所述对象处于发生癌症的风险中。
58.权利要求57所述的方法，其中所述对象是吸烟者。
59.权利要求57所述的方法，其中所述对象具有癌症家族史。
60.权利要求3所述的方法，其还包括施用有效量的免疫佐剂。
61.权利要求1或权利要求2或权利要求3所述的方法，其还包括施用至少一种另外的抗癌治疗。
62.权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌治疗是手术治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、免疫治疗、小分子治疗、受体激酶抑制剂治疗、抗血管生成治疗、细胞因子治疗、冷冻治疗或生物治疗。
63.权利要求62所述的方法，其中所述生物治疗是单克隆抗体、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因治疗。
64.权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌治疗是蛋白激酶抑制剂。
65.权利要求64所述的方法，其中所述蛋白激酶抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。
66.权利要求65所述的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂被进一步限定为布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。
67.权利要求66所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自依鲁替尼、阿卡替尼(ACP-196)、ONO-4059、司培替尼(CC-292)、HM-71224、CG-036806、GDC-0834、ONO-4049、RN-486、SNS-062、TAS-5567、AVL-101、AVL-291、PCI-45261、HCI-1684、PLS-123，和BGB-3111。
68.权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌治疗是HDM2和/或HDM4的抑制剂。
69.权利要求68所述的方法，其中所述HDM2的抑制剂是HDM201。
70.权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌治疗是有复制能力的或复制缺陷型病毒。
71.权利要求70所述的方法，其中所述有复制能力的或复制缺陷型病毒是腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、EB病毒、流感病毒或呼肠孤病毒。
72.权利要求70所述的方法，其中所述有复制能力的或复制缺陷型病毒被改造成表达治疗性核酸。
73.权利要求72所述的方法，其中所述治疗性核酸编码p53和/或IL-24。
74.权利要求70所述的方法，其中所述有复制能力的或复制缺陷型病毒是单纯疱疹病毒。
75.权利要求70所述的方法，其中所述有复制能力的或复制缺陷型病毒被改造成表达细胞因子。
76.权利要求75所述的方法，其中所述细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
77.权利要求70所述的方法，其中所述有复制能力的或复制缺陷型病毒被进一步限定为talimogene laherparepvec(T-VEC)。
78.权利要求61所述的方法，其中所述至少一种另外的抗癌治疗是蛋白激酶或生长因子信号传导途径抑制剂。
79.权利要求78所述的方法，其中所述蛋白激酶或所述生长因子信号传导途径抑制剂是阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、博舒替尼、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福他替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、雷珠单抗、鲁索替尼、塞卡替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、AP23451、威罗菲尼、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司、Alvocidib、金雀异黄素、司美替尼、AZD-6244、瓦他拉尼、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00或GW572016。
80.权利要求78所述的方法，其中所述蛋白激酶抑制剂是PI3K抑制剂。
81.权利要求80所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是PI3Kδ抑制剂。
82.权利要求62所述的方法，其中所述免疫治疗包括细胞因子。
83.权利要求82所述的方法，其中所述细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
84.权利要求82所述的方法，其中所述细胞因子是白介素和/或干扰素。
85.权利要求84所述的方法，其中所述白介素是IL-2。
86.权利要求84所述的方法，其中所述干扰素是IFNα。
87.权利要求62所述的方法，其中所述免疫治疗包含共刺激受体激动剂、固有免疫细胞的刺激物，或固有免疫的激活剂。
88.权利要求87所述的方法，其中所述共刺激受体激动剂是抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD137抗体、抗CD40抗体，或抗CD27抗体。
89.权利要求87所述的方法，其中所述免疫细胞的刺激物是细胞毒性抑制受体的抑制剂或免疫刺激性Toll样受体(TLR)的激动剂。
90.权利要求89所述的方法，其中所述细胞毒性抑制受体是NKG2A/CD94或CD96TACTILE的抑制剂。
91.权利要求89所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR7激动剂、TLR8激动剂，或TLR9激动剂。
92.权利要求62所述的方法，其中所述免疫治疗包含PD-L1抑制剂、4-1BB激动剂，和OX40激动剂的组合。
93.权利要求62所述的方法，其中所述免疫治疗包含干扰素基因刺激因子(STING)激动剂。
94.权利要求87所述的方法，其中所述固有免疫的激活剂是IDO抑制剂、TGFβ抑制剂，或IL-10抑制剂。
95.权利要求62所述的方法，其中所述化学治疗包含DNA损伤剂。
96.权利要求94所述的方法，其中所述DNA损伤剂是γ辐照、X射线、UV辐照、微波、电子发射、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、卡培他滨、依托泊苷(VP-16)、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)，或过氧化氢。
97.权利要求94所述的方法，其中所述DNA损伤剂是5FU或卡培他滨。
98.权利要求62所述的方法，其中所述化学治疗包含顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP-16)、他莫昔芬、泰索帝、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤，或其任何类似物或衍生物变体。
99.药物组合物，其包含(a)经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的一种或更多种病毒；和(b)至少一种免疫检查点抑制剂。
100.权利要求99所述的组合物，具中所述一种或更多种病毒选自经改造成表达松弛素的病毒、经改造成过表达所述腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成所述N1L基因缺失的牛痘病毒，和经改造成表达所述大鼠细胞色素p4502B1基因的单纯疱疹病毒。
101.药物组合物，其包含经改造成包含N1L基因缺失、基质降解蛋白基因、腺病毒死亡蛋白(ADP)基因，和/或细胞色素p450基因的两种或更多种病毒。
102.权利要求101所述的组合物，其中所述两种或更多种病毒选自经改造成表达松弛素的病毒、经改造成过表达所述腺病毒死亡蛋白(ADP)基因的病毒、经改造成所述N1L基因缺失的牛痘病毒，和经改造成表达所述大鼠细胞色素p4502B1基因的单纯疱疹病毒。
103.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述病毒包含腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、水疱性口炎病毒，和/或口炎病毒。
104.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述病毒包含一种或更多种腺病毒。
105.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述腺病毒死亡蛋白是过表达的。
106.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述基质降解蛋白是松弛素、透明质酸酶，或饰胶蛋白聚糖。
107.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述基质降解蛋白是松弛素。
108.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中所述细胞色素p450基因是所述细胞色素p450 2B1基因。
109.权利要求108所述的组合物，其中所述细胞色素p4502B1基因是大鼠细胞色素p4502B1基因。
110.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中经改造成包含所述N1L缺失的病毒是牛痘病毒。
111.权利要求99或权利要求101所述的组合物，其中经改造成包含所述细胞色素p450基因的病毒是单纯疱疹病毒。
112.权利要求105所述的组合物，其中经改造成包含所述基质降解蛋白和/或腺病毒死亡蛋白的病毒是腺病毒。
113.药物组合物，其包含(a)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原和N1L基因缺失的牛痘病毒；和(b)表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的至少第二病毒。
114.权利要求113所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原是间皮素、黑素瘤相关基因(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、突变的Ras，或突变的p53。
115.权利要求113所述的组合物，其中所述病原体相关抗原是由感染性病毒、细菌、真菌、朊病毒，或寄生生物表达的抗原。
116.权利要求113所述的组合物，其中表达至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原的所述第二病毒是腺病毒。
117.权利要求113所述的组合物，其中由所述牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由所述第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是相同的。
118.权利要求113所述的组合物，其中由所述牛痘病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原与由所述第二病毒表达的至少一种肿瘤相关或病原体相关抗原是不同的。
119.权利要求113所述的组合物，其还包含免疫佐剂。
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