KR100523028B1 - 개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 - Google Patents

개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 Download PDF

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Abstract

사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열, 이 전사 조절서열에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 (a) 상기 재조합 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터{hTERT Promoter With Enhanced Tumor-Specificity and Strength And Recombinant Vector Comprising Thereof}
본 발명은 개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 전사 조절서열 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 보다 자세하게는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열 및 상기 전사 조절서열에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
아데노바이러스는 생체내·외 유전자 전달효율이 높고 세포분열상태와 무관하게 유전자 전달과 발현이 가능하며 높은 역가의 바이러스로 생산되고 사람에게 암을 유발하지 않는다는 여러 장점들이 부각되면서 암을 대상질환으로 하는 유전자 치료에 그 사용빈도가 크게 증가하고 있다(Graham, F.L. ‘Adenovirus vectors for high-efficiency gene transfer into mammalian cells.’ Immunol. Today, 2000,21,426-8, Castell, J.V. et al. ‘Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes : analysis of the biochemical functionality of tarnsduce cells.’ Gene Ther., 1997,4,455-64). 암은 유전자 요법(gene therapy)으로 치료할 경우, 장기적이고 지속적인 치료 유전자의 발현을 필요로 하지 않고 바이러스에 의해 유도되는 숙주의 면역반응이 크게 문제되지 않거나 오히려 장점이 될 수도 있기 때문에 아데노바이러스가 암치료용 유전자 전달체로 각광을 받고 있다.
그러나 기존의 암치료용 재조합 아데노바이러스는 대부분이 증식 불가능한 제 1세대 바이러스로 이들을 유전자 전달체로 이용하는 경우는 일차 감염세포 또는 극히 일부의 주변세포들에만 항암효과를 유발할 수 있어, 임상적인 실용성면에서 많은 제약이 있다(Vile, R.G. et al. ‘Cancer gene therapy : hard lession and new courses.’ Gene Ther., 2000,7,2-8, Paillard, F. Cancer gene therapy annual conference. 1997 : trends and news, Hum. Gene Ther., 1998,4,283-6, Lattime, E.C. et al. ‘Selectively replicating viruses as therapeutic agents against cancer.’ in : D. Kirn (Ed), Gene therapy of cancer, Academic Press, New York, 1999,235-50).
이를 극복할 수 있는 한 방안으로 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 McCormick 연구팀에 의해 처음 보고된 이후 종양세포 특이 살상 아데노바이러스의 가능성이 다각도로 연구되고 있다(Bischoff, J.R. et al. ‘An adenovirus mutant that replicates selectively in P53-deficient human tumor cells.’ Science, 1996,18,274(5286),373-6, Heise, C. et al. ‘ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents.’ Nat. Med., 1997,3(6),639-45). 종양 살상 아데노바이러스 전달체는 일차 감염세포의 세포 살상은 물론 이에 따른 바이러스의 증식으로 주변의 종양세포들도 이차적으로 감염하게 되어 그 치료효과가 도미노 현상과 같이 계속 퍼져 나갈 수 있어 치료효과를 현격히 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라, 주변의 정상세포에서는 종양 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 아데노바이러스에 대한 독성을 감소시키는 장점도 가지고 있다.
종양 특이적 증식가능 아데노바이러스는 크게 두가지 방법으로 개발되어지고 있다. 첫째, 종양 또는 조직 특이적 프로모터를 이용하여 암조직 내에서만 아데노바이러스의 복제에 필수적인 단백질인 E1A의 발현을 제한함으로써, 종양 특이적 증식가능 아데노바이러스를 개발할 수 있다. Rodriguez 연구팀은 1997년 전립선암에서 선택적으로 발현되는 전립선 특이항원(prostate-specific antigen:PSA)의 프로모터(promoter)/인핸서(enhancer) 부위를 E1A 유전자의 업스트림(upstream)에 위치한 내재 프로모터와 치환하여 삽입함으로써 PSA의 발현이 많이 일어나는 전립선암 세포 내에서만 선택적으로 아데노바이러스가 복제되게 할 수 있음을 보고하였다(Rodriguez, R. et al. ‘Prostate attenuated replication competent adenovirus(ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells.’ Cancer Res., 1997,1,57(13),2559-63). 이러한 전립선암 특이적 증식 가능 아데노바이러스인 CN706(Calydon Pharmaceuticals, CA, USA)은 현재 재발한 전립선암 환자들을 대상으로 제 1상 임상실험이 진행되고 있다. 또한, 전립선암 특이적 인핸서 부위를 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B의 업스트림에도 삽입하여 아데노바이러스의 두가지 초기 유전자들(E1A 및 E1B)의 발현을 PSA의 발현정도에 따라 조절될 수 있도록 하여 더욱 전립선암 특이적 증식 아데노바이러스를 개발하는 연구도 진행되고 있다(Yu, D.C. et al. ‘Identification of the transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2 and their use in the construction of cyldon virus 764, an attenuated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy.’ Cancer Res., 1999,1,59(7),1498-504). 이 외에도 alpha-fetorprotein(AFP), carcinoembryonic antigen(CEA), 및 MUC-1과 같이 특정 암세포에서만 활성화되는 유전자의 프로모터를 이용하여 종양 특이적 증식 아데노바이러스를 개발하고 있다(Kanai, F. et al. ‘Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Hepatology, 1996,53,963-7, Marshall, J.F. et al. ‘Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy.’ Semin. Oncol., 1996,23,154-8, Osaki, T. et al. ‘Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Cancer Res., 1994,54,5258-61, Kurihara, T. et al. ‘Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen.’ J. Clin. Invest., 2000,106,763-71).
종양 특이적 증식 아데노바이러스를 개발하기 위한 두번째 방안으로, 정상세포에서는 바이러스 복제를 활발히 일어나게 하는데 필수적이지만 암세포에서는 필수적이지 않은 아데노바이러스 유전자의 기능을 선택적으로 소실시킴으로써 종양 특이적으로 증식이 가능한 아데노바이러스를 개발하는 방법이 시도되고 있다(Whyte, P. et al. ‘Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins.’ Cell, 1989,56,67-75, Fueyo, J. et al. ‘A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo.’ Oncogen., 2000,19,2-12). 1996년 Bischoff 연구팀은 종양 억제 단백질인 p53과 결합하여 이를 불활성화시키는 기능을 하는 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B55kD이 소실된 아데노바이러스가 p53의 기능이 상실된 암세포에서만 특이적으로 증식할 수 있음을 처음으로 보고하였다. 야생형 아데노바이러스가 정상세포를 감염하면, 감염된 세포는 종양 억제 단백질인 p53을 활성화시켜 바이러스의 증식을 억제하는데 이때 E1B55kDa 단백질이 p53 단백질에 결합하여 p53의 기능을 억제하는 역할을 하며, 이에 따라 야생형 아데노바이러스는 활발하게 증식을 하여 궁극적으로 감염세포의 살상을 유도한다(Yew, P.R. et al. ‘Adenovirus E1B oncoprotein tethers a transcriptional repression domain to p53.’ Genes, 1994,8,190-202, Dobner, T. et al. ‘Blockage by adenovirus E4 or F6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor.’ Science, 1996,7,272(5267),1470-3.). 하지만 E1B55kD 유전자가 소실된 재조합 아데노바이러스가 정상세포를 감염시키면 이들 세포에 있는 p53에 의한 비활성화를 유도할 수 없어 바이러스의 증식이 억제되지만, p53의 기능이 억제되어 있는 여러 암세포들에서는 바이러스의 증식이 활발하게 일어나게 되어 궁극적으로 감염세포의 살상을 유도하게 된다. 이를 바탕으로 본 발명자들이 제조한 E1B55kD 유전자가 소실된 종양특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-1 기존의 일세대 아데노바이러스인 복제 불능 아데노바이러스보다 형질 도입면에 있어서 월등히 우수하였으며, 여러 종류의 인체 암세포주들에 대한 특이적 살상 능력을 검증한 바 있다(Lee, H. et al. ‘Oncolytic potential of E1B55kDa-deleted YKL-1 recombinant adenovirus: Correlation with p53 functional status.’ Int. J. Cancer, 2000,88,454-63).
그러나, E1B55kD 유전자는 p53을 불활성화시키는 기능 외에도, 아데노바이러스 mRNA의 세포질로의 이동 및 아데노바이러스의 구성 단백질의 합성을 촉진하는 중요한 기능을 하므로 효율적인 아데노바이러스 복제에 필수적이다. 따라서 E1B55kD 유전자가 소실된 복제 가능 아데노바이러스는 암세포내에서의 바이러스 증식이 제한되게 일어날 수 밖에 없어 세포살상능이 저하되고 이로 인한 생체내 항종양 효과가 감소하게 된다. 이를 보완하기 위하여 본 발명자들은 세포고사(apoptosis) 억제 역할을 하는 아데노바이러스의 E1B19kD가 소실된 Ad-ΔE1B19kD 아데노바이러스를 제작하여 세포살상능이 훨씬 증가되고 생체내 항종양 효과가 증대될 수 있음을 보고하였다(Kim, J. et al. ‘Evaluation of E1B gene attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy.’ Cancer Gene Therapy, 2002,9,725-736). 그러나, 아데노바이러스의 복제를 효과적으로 일어나게 하기 위해서 재도입한 E1B55kD 유전자로 인하여 아데노바이러스의 증식에 따른 세포사는 증가되었지만, 암세포 특이적 복제능은 소실되어 이를 암을 대상으로 하는 유전자 치료에 이용하기 위해서는 종양 특이성을 부여할 필요성이 확인되었다.
사람의 텔로미어 역전사 효소(human telomere reverse transcriptase : hTERT)는 염색체 복제동안 텔로미어(telomere)의 길이를 일정하게 유지하는데 관여하는 효소인 텔로머라제의 구성요소로서, 세포노화, 암, 세포불멸에 관여하는 것으로 알려졌다(Counter, C.M. et al. ‘Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cell which express telomerase activity.’ EMBO J. 1992,11,1921-29, Kim, N.W. et al. ‘Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.’ Science, 1994,21,66,2011-5, Harley, C.B. et al. ‘Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.’ Nature, 1990,345,458-60). 텔로머라제의 활성은 사람의 경우 난소와 고환의 생식세포 및 임파구에서 관찰되나 그 외 정상 체세포에서는 관찰되지 않고 있다(Wright, W.E. et al. ‘Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.’ Dev. Genet. 1996,18,173-9). 따라서 정상 체세포는 제한된 회수의 세포분열 후에는 텔로미어의 길이가 일정길이 이하로 감소되어 더 이상 분열하지 못하고 사멸하게 된다(Yasumoto, S. et al. ‘Telomerase activity in normal human epithelial cells.’ Oncogene. 1996,13,433-9). 반면에, 암진행 전단계인 양성 종양 세포 및 암세포에서는 telomerase의 활성이 증가된다(Broccoli, D. et al. ‘Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells.’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995,92,9082-6.). 난소암에서 텔로머라제의 활성 증가가 최초로 보고된 이후, 혈액암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 유방암 등 거의 모든 인체 암에서 텔로머라제의 활성 증가가 관찰되고 있다(Counter, C.M. et al. ‘Telomerase activity in human ovarian carcinoma.’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994,91,2900-4, Counter, C.M. et al. ‘Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lympho-cytes.’ J. Virol., 1994,68,3410-4, Shay, J.W. et al. ‘A survey of telomerase activity in human cancer.’ Eur. J. Cancer, 1997,33,787-91, Harle-Bachor, C. et al. ‘Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes.’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996,93,6476-81).
텔로머라제의 기능에 필수적인 역할을 하는 hTERT의 발현은 텔로머라제의 활성과 관련되어 있으며, 최근에는 텔로머라제의 발현이 hTERT 프로모터의 활성, 즉 hTERT의 mRNA의 양에 따라 조절된다는 것이 밝혀졌다. hTERT의 활성을 조절하기 위한 최소의 프로모터의 크기는 181bp이며, 야생형 hTERT 프로모터에는 2개의 c-Myc 결합부위와 5개의 Sp1 결합부위가 포함되어 있다. 정상세포에 비해 암세포에서 월등히 높게 발현되는 발암단백질(oncoprotein)인 c-Myc 및 Sp1와 상기된 결합부위의 결합은 hTERT의 프로모터를 활성화시킨다는 것이 보고되었으며, 1999년 Takakura 연구팀은 c-Myc의 과다발현에 의해 hTERT 프로모터의 활성이 증가되는 것을 관찰하였다(Cerni, C. ‘Telomeres, telomerase, and myc.’ An update. Mutat. Res., 2000,462,31-47, Greenberg, R.A. et al. ‘Telomerase reverse transcriptase gene is direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation.’ Oncogene, 1999,18,1219-26, Takakura, M. et al. ‘Cloning of human telomerase reverse transcriptase gene promoter and identification of proximal core promoter essential for transcriptional activation of hTERT in immortalized and cancer cells.’ Cancer Res., 1999,59,551-9).
Shoji 연구팀은 hTERT 프로모터를 이용하여 암세포 특이적 유전자 발현을 유도하여 캐스파제-8(Caspase-8)과 같은 세포고사(apoptosis)를 유도하는 독성 유전자를 암세포에서만 발현시킬 수 있었다(Shoji, K. et al. ‘A novel telomerase-specific gene therapy : gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter.’ Human Gene Therapy, 2000,11,1397-406.). 그러나 hTERT 프로모터만으로는 충분한 암세포 특이성을 달성하는데 한계가 있었다.
본 발명자들은 이러한 문제들을 해결하기 위해서, hTERT 프로모터에 c-Myc 결합부위 및/또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열을 제조하고 이를 도입한 재조합 벡터 특히, 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하기에 이르렀다.
하나의 관점으로서, 본 발명은 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열에 관한 것이다.
다른 관점으로서, 본 발명은 상기 전사 조절서열에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공하고자 한다.
또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 사람 텔로미어 역전사 효소(hTERT) 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위(binding site) 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위(binding site)를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열을 제공한다. 본 발명은 하나의 양태로서, hTERT 프로모터에 1개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열을 제공한다.
일반적으로, 전사 조절서열(transcriptional regulatory sequence)은 이에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 조절하는 서열을 총칭하며, 대표적인 예에는 프로모터 및 인핸서가 포함된다. 그러나 본 발명의 명세서에 있어서, 전사 조절서열은 프로모터로 이용되는 것이 바람직하며, 따라서 상기 전사 조절서열이 임의의 유전자의 전사를 조절하기 위해서는 서로 인접하게 위치해야만 할 것이다. 본 발명의 실시예에서 m-hTERT 프로모터는 본 발명에 따른 전사 조절서열의 하나의 양태로서 제공된 것이다.
본 발명에서는 hTERT 프로모터로서 사람의 게놈으로부터 유래된 야생형 hTERT 프로모터(서열번호 1)를 이용하는 것이 가장 바람직하지만, 포유동물에서 유래된 hTERT 프로모터 뿐만 아니라 생물학적 기능이 유지되는 범위 안에서 변이된, 인공적으로 합성된 hTERT 프로모터도 이용될 수 있다. 용어 ‘생물학적 기능이 유지되는 범위’란 어떠한 hTERT 프로모터에 RNA 폴리머라제 뿐만 아니라 c-Myc 발암단백질 및 Sp1 발암단백질이 결합할 수 있고, 이에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자의 발현을 유도할 수 있는 상태를 의미한다. 예를 들면, 상기 hTERT 프로모터 내에 함유된 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위는 당업계에 공지된 여타의 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위와 치환될 수 있다. 한편, hTERT 프로모터는 당업계에 공지된 방법을 이용하면 용이하게 제조될 수 있는데 예를 들면 사람의 게놈을 주형으로 하고 적절한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 자동 DNA 합성기(예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 이용하면 제조할 수 있다.
상기 c-Myc 결합부위는 c-Myc 발암단백질이 결합하는 올리고뉴클레오타이드로서, c-Myc 결합부위의 콘센수스 서열은 cacgtg(서열번호 2)이다. 본 발명에 따른 전사 조절서열에는 c-Myc 발암단백질이 결합하는 모든 공지된 서열이 도입될 수 있다. 그러한 c-Myc 결합부위는 다수개 존재하며, 예를 들면, cacgcg(서열번호 3), catgcg(서열번호 4) 등이 있다. 또한, 상기 Sp1 결합부위는 Sp1 발암단백질이 결합하는 올리고뉴클레오타이드로서, Sp1 결합부위의 콘센수스 서열은 gggcgg(서열번호 5)이다. 본 발명에 따른 전사 조절서열에는 Sp1 발암단백질이 결합하는 모든 공지된 서열이 도입될 수 있다. 그러한 Sp1 결합부위는 다수개 존재하며, 예를 들면, ccgccc(서열번호 6), ctccgcctc(서열번호 7), cccagcccc(서열번호 8), gggcgg(서열번호 9), ggggcgg(서열번호 10), cccccgcccc(서열번호 11) 등이 있다.
용어 ‘콘센수스 서열(consensus sequence)’이란 동일하지 않지만 관련된(related) 다수개의 서열을 정의하는데 사용되는 뉴클레오타이드 서열로서, 콘센수스 서열의 각각의 위치(position)는 실제 서열의 그 위치에서 가장 빈번하게 발견되는 뉴클레오타이드를 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 전사 조절서열에 있어서, 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열은 hTERT 프로모터의 5’-말단 또는 3’-말단에 연결되거나 hTERT 프로모터의 생물학적 기능이 유지되는 범위 안에서 hTERT 프로모터 내부에 포함될 수도 있다. 그러나, 본 발명에서 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열은 hTERT 프로모터의 3’-말단에 연결되는 것이 바람직할 것이다. 한편, hTERT 프로모터와 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위를 포함하는 염기서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고 뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 따른 전사 조절서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자를 암세포에서만 특이적으로 고효율로 발현할 수 있기 때문에 암치료를 목적으로 하는 유전자 비히클(vehicle)로서, 통상적으로 사용되는 벡터에 모두 도입될 수 있다. 여기서 벡터는 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터를 포함한다.
따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 바이러스 벡터는 암세포 또는 정상 세포에 도입된 후, 암세포에서만 특이적으로 자신을 복제함으로써 암세포를 고효율로 살상할 수 있다. 또한, 본 발명은 다른 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 바이러스 벡터는 복제 불능인 것과 복제 가능인 것을 모두 포함한다. 복제 불능 재조합 바이러스 벡터는 암세포 또는 정상 세포에 도입된 후, 암세포에서만 특이적으로 치료학적 트랜스 유전자를 발현함으로써, 암을 치료할 수 있는 반면에, 복제 가능 재조합 바이러스 벡터는 바이러스의 복제에 따른 세포 살상효과 및 치료학적 트랜스 유전자의 발현에 의한 세포 살상효과가 함께 유도됨으로써, 항암 효과가 배가될 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 또 다른 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 비바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 비바이러스 벡터는 암세포 또는 정상 세포에 도입된 후, 암세포에서만 특이적으로 치료학적 트랜스 유전자를 발현함으로써, 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘바이러스’는 ‘바이러스 벡터’와 동일하게 사용되고 있으며, 단백질 합성 또는 에너지 생성 메카니즘을 가지고 있지 않은 절대적인 세포내 기생 물질(obligate intracelluar parasite)을 총칭한다. 바이러스 게놈은 지질막으로 된 단백질 성분의 코팅 구조체내에 함유된 RNA 또는 DNA이다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스의 예로는, 바쿨로비리디아에 (baculoviridiae), 파르보비리디아에(parvoviridiae), 피코르노비리디아에 (picornoviridiae), 헤레페스비리디아에(herepesviridiae), 폭스비리디아에 (poxviridiae), 아데노비리디아에(adenoviridiae), 피코트르나비리디아에 (picotrnaviridiae) 등이 포함된다. 용어 ‘재조합 바이러스’는, 키메라 바이러스 (또는 멀티머 바이러스), 즉 하나 이상의 바이러스 서브타입으로부터 유래한 상보적인 코딩 서열을 사용하여 작제된 벡터를 포함한다 (Feng et al. Nature Biotechnology, 15,866-870.).
본 발명의 명세서에서 용어 ‘비바이러스 벡터’는 전술한 바이러스 벡터를 제외한 통상적으로 유전자 치료요법에서 사용되는 모든 벡터를 의미하며, 그러한 예에는 진핵세포에서 발현가능한 다양한 플라스미드 및 리포좀 등이 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘작동가능하게 연결된(operably linked)’은 핵산서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동가능하게 연결되는 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 임의의 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 유전자와 작동가능하게 연결되어 있다고 말한다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘바이러스 복제에 필요한 유전자’는 바이러스의 게놈을 구성하는 모든 유전자를 의미하며, 이들은 초기 유전자와 후기 유전자로 분류된다. 초기 유전자는 바이러스 증식 과정의 초기, 특히 바이러스 게놈의 복제가 개시되기까지 사이에 발현이 시작되는 바이러스 유전자로서, 바이러스 게놈의 복제에 관계한다. 초기 유전자중 어떤 것은 숙주세포가 가지고 있는 메카니즘을 그대로 이용하여 그 정보가 RNA에 전사되지만 어떤 것은 초기 유전자 산물의 일부가 생성되지 않으면 전사되지 않는다. 이와 같이 초기 유전자 중에서도 점진적인 정보발현이 일어나고, 특히 바이러스 감염 후에 숙주 효소에 의해서 즉시 전사되는 유전자를 전초기 유전자(very early gene)라고 부르기도 한다. 후기 유전자는 숙주 세포에 바이러스가 감염될 때 바이러스 게놈의 복제가 개시된 후에 발현되는 바이러스 유전자로서, 외각단백질의 구조를 결정하는 유전자이다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘치료학적 트랜스 유전자(therapeutic transgene)’는 암세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자 등이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)’는 표적 세포내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제 인자 유전자에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자 (Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질 (adenomatous polyposis coil protein)(Albertsen et al. 미국특허공보 US 5,783,666호), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci., 1998, 95,3042-3047), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘항원성 유전자(antigenic gene)’는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53 (Levine, A., 국제특허출원공개 WO 94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포독성 유전자(cytotoxic gene)’는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)’ 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 (국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO 96/30385호) 등이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘사이토카인 유전자(cytokine)’는 세포내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 사이토카인의 예로는, GM-CSF, 인터류킨 (특히, IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(특히, 인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘케모카인 유전자(chemokine gene)’ 는 분열 촉진 활성, 화학 주성 활성 또는 염증 활성을 가지는 세포에서 방출되는 구조적으로 관련성이 있는 저분자량의 사이토카인 그룹을 의미한다. 주로, 이들은 4개의 보존된 시스테인 잔기를 공유하는 70 내지 100개의 아미노산 잔기로 이루어진 양이온성 단백질이다. 이들 단백질들은, 2개의 아미노 말단 시스테인의 간격을 기준으로 하여 2개의 그룹으로 구분할 수 있다. 첫째 그룹에서는 1개의 잔기(cys-x-cys)만큼 떨어져 있고, 두 번째 그룹에서는 바로 인접해 있다(cys-cys). 'cys-x-cys 케모카인' 그룹에 속하는 단백질을 예로 들면, 혈소판 인자 4 (PF4), 혈소판 기본 단백질 (PBP), 인터류킨-8 (IL-8), 흑색종 성장 자극 활성 단백질 (MGSA), 대식구 염증성 단백질 2 (MIP-2), 마우스의 Mig (m119), 닭의 9E3 (또는 pCEF-4), 돼지의 폐포 대식구 화학 주성 인자 I 및 II (AMCF-I 및 -II), 전구 B 세포 성장 촉진 인자 (PBSF) 및 IP10 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 'cys-cys 케모카인' 그룹에 속하는 단백질을 예로 들면, 단핵구 화학 주성 단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학 주성 단백질 3 (MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4 (MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4 (MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론 (p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘친-세포사멸 유전자(pro-apoptotic gene)’는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)’는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS (USA), 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.
상기된 바와 같이 본 발명에 따른 전사 조절서열은 유전자 비히클로서 통상적으로 사용되는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터에 도입될 수 있지만 아데노바이러스 벡터가 유전자 비히클로서 적합한 것으로 인식되고 있으며 실제로 이의 사용빈도가 증가하고 있으므로 본 발명에 따른 전사 조절서열은 아데노바이러스 벡터에 도입하는 것이 특히 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명은 hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 아데노바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 명세서에서 용어 복제 가능 아데노바이러스 벡터는 복제에 반드시 필요한 유전자가 보존된 아데노바이러스 벡터를 의미하며, 이들은 암세포내에서 자신을 복제하여 세포를 살상함으로써 암을 치료할 수 있다. 또 다른 용어 복제 불능 아데노바이러스 벡터는 복제에 반드시 필요한 특히, 감염의 초기 단계에 필요한 유전자가 제거된 아데노바이러스 벡터를 의미하는데, 이들은 주로 치료학적 트랜스 유전자를 포함하고 있으며, 암세포에서 이들을 발현함으로써 암을 치료할 수 있다. 그러나 전술한 바와 같이, 본 발명은 치료학적 트랜스 유전자를 포함하면서 동시에 복제 가능한 바이러스 벡터를 포함한다. 즉, 본 발명의 명세서에서 복제 불능 아데노바이러스 벡터란, 치료학적 트랜스 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 하나의 양태로서 제공된 복제 불능 아데노바이러스 벡터를 의미하는 것이다.
본 발명의 명세서에서 용어 ‘아데노바이러스’는 ‘아데노바이러스 벡터’와 동일하게 사용되고 있으며, ‘아데노비리디아에’ 속에 속하는 바이러스를 의미한다. 용어 ‘아데노비리디아에’는, ‘마스트아데노바이러스’ 속의 동물성 아데노바이러스 (인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 쥐 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하며, 이에 한정되지 않는다)를 총체적으로 일컫는다. 특히, 인간의 아데노 바이러스는 A-F 아속 (subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형 (Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형이 포함되며 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 양태에서의 아데노바이러스는, 인간의 아데노바이러스 제2 또는 제5 혈청형(serotype)에서 유래한 것이다.
아데노바이러스의 혈청형에 따라서 약간의 차이는 있지만, 일반적으로 아데노바이러스 게놈은 E1A, E1B, E2, E3 및 E4를 포함한 초기 유전자와 L1, L2, L3 L4 및 L5를 포함한 후기 유전자로 이루어져 있다. 초기 유전자에 있어서, E1A 유전자는 바이러스 감염 후 즉시(0-2h) 여타의 바이러스 유전자에 앞서 발현된다. E1A 단백질은 전사 조절인자(transcriptional regulatory factor)로서 작용하며, 여타의 초기 유전자의 발현에 반드시 필요하다. E1A 유전자의 결실은 바이러스 DNA 복제에 필요한 유전자 산물이 생산되지 못하기 때문에 바이러스의 감염이 진행되지 못한다. E1B 단백질은 후기 유전자 mRNA를 핵으로부터 세포질로 이동시키는데 필수적이다. E1B 발현의 결함은 바이러스 후기 유전자의 미비한 발현과 숙주 세포 단백질 합성의 불완전한 차단으로 이어진다. E4 유전자는 다수의 전사 산물을 포함하고 있는데, E4 전사 단위(transcriptional unit)의 오픈 리딩 프레임 3 및 6은 E1B의 55kD 단백질과 E2F-1 및 DR-1로 이루어진 이종이형체(heterodimer)의 결합에 의한 주요 후기 전사 단위 mRNA(late transcriptional unit mRNA)의 축적을 증가시킨다. 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 3 및 6으로부터 유래된 단백질에 결함이 있다면, 플라크(plaque)는 야생형 바이러스의 그것보다 10-6 이하의 효율로 생산된다. L1, L2, L3, L4 및 L5를 포함한 후기 유전자는 아데노바이러스의 구조 단백질을 암호화하고 있다.
초기 유전자 및 후기 유전자는 모두 아데노바이러스의 효율적인 복제에 필요하다. 따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 아데노바이러스의 초기 유전자 및 후기 유전자 중에서 하나 이상의 유전자에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 초기 유전자 및 후기 유전자 중에서도 특히, 초기 유전자가 바이러스 게놈의 복제에 관여하므로, 본 발명은 보다 바람직한 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 아데노바이러스의 초기 유전자에 작동가능하게 연결된 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 초기 유전자 중에서도 특히, E1A 유전자는 전사 인자로서, 이의 결합에 의해서 여타의 바이러스 유전자들이 발현하게 됨으로 바이러스의 복제에는 가장 중요한 요소라고 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 더욱 바람직한 양태로서, hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 염기서열이 연결된 전사 조절서열이 아데노바이러스의 E1A 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 전사 조절서열이 아데노바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터는 c-Myc 발암단백질 또는 Sp1 발암단백질의 존재에 의해서 텔로머라제가 활성화된 암세포내로 유입된 후, 자신을 고효율로 증식함으로써 암세포를 살상하는 반면, 정상 세포에 유입된 아데노바이러스 벡터는 증식이 거의 불가능하기 때문에 세포에 별다른 영향을 미치지 못할 것이다.
이처럼 바이러스 증식에 의해 암세포를 살상하는 재조합 아데노바이러스 벡터에 관련된 보다 바람직한 양태는 E1B19kD 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이다. E1B19kDa 단백질은 강력한 세포고사(apoptosis) 억제제로서, E1B19kDa 단백질은 아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1A에 의해 유도되는 세포고사를 억제하며, 사람의 여러 종양 세포들에서 p53에 의하여 유도되는 세포고사도 억제시킨다. 또한, 성장 인자의 제거, 방사선 치료 또는 항암제에 의해 유도되는 세포고사를 억제하는데 있어서도 E1B19kDa 단백질은 Bcl-2와 기능적으로 같은 역할을 할 수 있다. 따라서, E1B19kD 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스는 바이러스 증식에 의한 세포괴사(cell lysis) 뿐만 아니라 감염된 세포내에서 세포고사(apoptosis)를 함께 유발하여 효율적으로 암세포를 살상시키고 주위 암세포로 확산되어지는 효과 또한 탁월하다. 이로 인하여, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 암세포에서 특이적으로 고효율로 증식하여 암세포만을 선택적으로 살상하는 능력이 훨씬 더 우수할 것이다.
아데노바이러스 증식에 의한 암세포의 살상 뿐만 아니라 아데노바이러스 벡터에 치료학적 트랜스 유전자를 클로닝하고 이를 암세포에서 발현하게 함으로써 암을 치료할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 hTERT 프로모터에 c-Myc 결합부위 및/또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 상기 치료학적 트랜스 유전자는 암세포에서만 특이적으로 고효율로 발현할 수 있는 반면, 정상 세포에서는 발현이 불가능하므로 세포독성이나 부작용을 유발하지 않을 것이다.
통상적으로 치료학적 트랜스 유전자는 아데노바이러스의 E1 유전자 또는 E3 유전자를 대신하여 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, 상기 전사 조절서열이 아데노바이스의 E1 유전자를 대신하여 도입된 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 복제 불가능한 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 재조합 아데노바이러스 벡터는 바이러스의 복제에 필수적인 E1 유전자가 결실되었므로 바이러스의 복제는 불가능하며 단지 치료학적 트랜스 유전자의 발현에 의해서 종양이 치료될 수 있다. 또한, 본 발명은 다른 양태로서, 상기 전사 조절서열이 아데노바이러스의 E3 유전자를 대신하여 도입된 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 복제 가능한 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 이러한 재조합 아데노바이러스 벡터는 복제 가능하므로 아데노바이러스의 복제에 따른 세포 살상효과와 치료학적 트랜스 유전자의 발현에 의한 세포 살상효과가 함께 유도되어 항종양 효과가 배가될 수 있다. 그러나, E1 및 E3 유전자가 결실된 아데노바이러스가 다른 벡터와는 대조적으로 유전자 전달 효율이 상당히 높고 넓은 스펙트럼의 세포 유형에서 트랜스 유전자를 발현하기 때문에 바람직한 양태는 아데노바이러스로서 E1 및 E3 유전자가 결실된 복제 불능의 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 전사 조절서열이 E1A 유전자를 대신하여 도입된 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결되고 E1 및 E3 유전자가 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
전술한 재조합 벡터를 제조하기 위해서는 이들을 적절한 숙주세포에 도입해야한다. 따라서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 벡터를 숙주 세포로 도입하는 바람직한 방법에는 예를 들면 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 혹은 감염(infection) 등이 포함된다. 한편, 숙주세포는 재조합 벡터에 따라서 선택가능하며, 바람직한 숙주세포는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 있어서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 hTERT 프로모터에 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열을 함유하는 셔틀벡터를 작제하고 상기 셔틀벡터를 아데노바이러스 벡터와 유전자 상동 재조합시키고, 이에 따라 수득된 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 적절한 세포에 형질전환 또는 형질감염시킴으로써 생산된다. hTERT 프로모터에 c-Myc 결합부위 또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열을 포함하는 셔틀벡터를 제작할 때 사용되는 플라스미드는 원핵성 또는 진핵성이든, 공지되거나 시판되고 있는 어떠한 것도 사용가능하다. 또한, 재조합 아데노바이러스를 생산하기 위한 재조합 플라스미드의 숙주 세포도 당업자에게 잘 알려져 있으며 대표적인 예로는 Ad5의 뉴클레오타이드 1-4344에 의해 형질전환된 사람 배 신장 세포주 293(E1A/B+) 및 Ad5의 뉴클레오타이드 79-5789를 함유한 사람 배 망막모세포종 세포 911가 포함된다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터는 다양한 암세포, 특히, 텔로머라제가 활발하게 발현되는 간암 세포, 폐암 세포, 자궁 경부암 세포 및 뇌종양 세포를 포함하는 암세포만 특이적으로 고효율로 살상할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이들을 활성성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 (a) hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 바이러스의 복제에 필요한 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 본 발명의 약제학적 조성물은 이에 포함되는 재조합 바이러스 벡터가 상술한 바와 같이 다양한 암세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명은 (a) hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 본 발명의 약제학적 조성물은 이에 함유된 재조합 바이러스 벡터에 도입된 치료학적 트랜스 유전자가 암세포내에서 발현됨으로써 도입된 치료학적 트랜스 유전자에 따라 다양한 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, HLA-B7, IL-2, IFN, GM-CSF, IL-12, TNF-α, MDR-1, HSV-tk 등의 치료학적 트랜스 유전자를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하여 흑색종, 유방암, 폐암, 신경모세포종, 신장 세포종, 난소암, 뇌종양, 두경부 종양, 난소암 및 중피종을 치료하는데 사용될 수 있다.
전술한 약제학적 조성물에 관한 바람직한 양태는 바이러스 벡터로 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 따라서, 본 발명은 (a) hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 아데노바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 (a) hTERT 프로모터에 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및/또는 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 비바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “치료”는 질병 또는 질환의 완치, 억제 및 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유전자 요법에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암 및 두경부암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약제학적 조성물은 1×105 - 1×1015 pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 재조합 아데노바이러스는 약 1×1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 재조합 벡터를 함유한 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터를 함유한 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 재조합 벡터를 함유한 약제학적 조성물은 실온에서의 안정성을 증가시키고, 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명(shelf-life)을 연장하기 위해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 이차 건조 공정은 압력을 강하하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계는 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 동결건조 방법은 다음의 순서와 같다: (1) 동결건조 현미경 분석법을 사용하여 제제의 붕괴 온도(collapse temperature)를 결정한다(Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm., 1990,62,165-186); (2) 바이알을 실온하의 동결-건조기 선반에 놓고 이후에 -1℃에서 약 30분 동안 평형화시킨다; (3) 선반을 -55℃로 냉각시키고 이 온도를 2시간동안 유지한다; (4) 약 -32℃의 생성물 온도 또는 붕괴 온도보다 5℃ 낮은 온도에서 이차 건조를 실시한다; (5) 35℃에서 이차 건조를 실시한다. 챔버 압력을 55 내지 120 mmHg로 조절한 후 건조를 완성한다; (6) 동결-건조기의 진공하에서 바이알을 마개로 막고 동결건조된 바이알을 크림프-밀봉하여 2℃ 내지 8℃에 저장한다.
동결건조된 제제에는 부형제(excipients) 및 동결건조보호제(lyoprotectant)가 포함될 수 있다. 부형제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 0.9% NaCl과 10 mM 인산나트륨(pH 7.0) 또는 10 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.0)의 완충액이 포함된다. 동결건조보호제는 동결 및 건조 공정동안에 생물학적 분자를 보호하고 최종 산물에 기계성(mechanical support)을 부여하는 역할을 하며 이들의 예로는 PBS(pH 7.0), PBS/4%, 12% 또는 15% 트레할로즈 등을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1
대상 암세포주 및 정상 세포주 및 이들의 배양
본 발명에서 사용된 세포주들은 인체 간암 세포주(SK-Hep1, Hep3B, HepG2), 뇌암 세포주(U251N, U343), 폐암 세포주(A549, H460), 자궁경부암 세포주(MCF7), 유방암 세포주(MCF7)와 같은 암세포주들과 인체 정상 세포주(WI38, IMR90, BJ)들이며, 모두 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. 상기 모든 세포주들은 10%의 우태아혈청(GIBCO BRL, NY)이 함유된 DMEM 배지(GIBCO BRL, NY)를 배양액으로 항생제 페니실린/스트렙토마이신 (GIBCO BRL, NY)을 첨가하여 5% CO2 의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.
실시예 2
본 발명에서 사용된 세포주들의 내재 텔로머라제의 활성도 측정
각 세포주의 내재 텔로머라제 활성도 측정은 TRAPEZE ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 텔로머라제 검출 키트(Oncor, Gaithsberg, MD)를 이용하였으며, 측정방법은 제조회사가 제시한 방법을 따라서 진행되었다. 먼저, 1x106개의 세포를 200 μl의 차가운 세포 용해용(lysis) 용액으로 용해시킨 다음, 10,000 xg에서 15분간 원심분리하여 세포 추출액을 분리하여 곧바로 -80℃에 보관하였다. 세포 추출액 중의 단백질의 농도는 단백분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 정량한 후 동량의 단백질을 다음의 TRAP 검정(telomeric repeat amplification protocol assay)에 이용하였다. 100 ng의 세포 추출액과 10 μl의 5xTRAP 반응 혼합물(reaction mix) 및 2 유니트(unit)의 Taq 폴리머라제를 첨가하여 50 μl의 반응액을 만든 뒤, TRAP 연장(extension)을 위해 상온에서 30분간 반응시킨 다음 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초로 33번 반복 실시하였으며, 각 샘플의 텔로머라제 활성을 알아보기 위해 PCR산물을 ELISA에 의하여 450 nm와 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3번 이상 반복 수행하여 그 평균값을 구하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 MCF-7 유방암 세포주를 제외한 모든 암세포주들, 즉 간암(Hep3B, SK-Hep1, HepG2), 폐암(H460, A549), 자궁경부암(C33A, HeLa), 뇌암(U251N)에서 텔로머라제 활성이 높은 반면 173We, BJ, IMR90, WI38과 같은 정상세포에서는 그 활성이 거의 관찰되지 않았다.
실시예 3
hTERT 프로모터 및 m-hTERT 프로모터의 제조
hTERT 프로모터를 제조하기 위해서, 정상 폐세포인 MRC5 세포주로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 뒤 하기의 프라이머 세트를 이용하여 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위가 존재하는 hTERT 프로모터를 PCR 증폭하였다. 센스 프라이머는 5'-cccaaagcttaggcc gattcgagatctctcc-3'(서열번호 12)으로서, 클로닝 상의 편의를 위해 PvuⅡ 제한효소부위를 삽입하였고(밑줄친 부분), 안티센스 프라이머는 5'-gaattcaagctt cgcggggtg gccggggcc-3'(서열번호 13)으로서, EcoRⅠ과 HindⅢ 제한효소 부위가 포함되어 있다(밑줄친 부분). MRC5의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 뒤 생성된 447bp 크기의 산물을 BglⅡ와 HindⅢ 제한효소로 처리한 뒤, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소를 발현하는 pSEAP-basic 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)에 삽입하여 pSEAP-TERT를 제조하였다.
hTERT 프로모터에 1개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 추가로 포함시킨 m-hTERT 프로모터(서열번호 14 : 도 1)를 제조하기 위해서, 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위가 존재하는 야생형 hTERT 프로모터에 1개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위가 들어있는 hTERT 프로모터를 결합하였다. 이를 위해, 먼저 1개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위가 포함된 pGL2-hTERT 벡터(한양대학교의 김철근 교수로부터 얻음)를 EcoRI과 HindIII로 절단한 뒤, 같은 종류의 제한효소로 처리된 pSEAP-TERT에 삽입하여 pSEAT-mTERT을 제조하였다.
실시예 4
재조합 아데노바이러스의 제조 및 생산.
A. 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-LacZ, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z의 제조 및 생산.
CMV 프로모터에 의해 LacZ 유전자의 발현이 조절되는 E1 아데노바이러스 셔틀벡터를 제조하기 위해서, LacZ를 발현하는 pcDNA-hygro-LacZ(CMV 프로모터에 의해서 조절되는 LacZ) 플라즈미드로부터 CMV 프로모터, LacZ 및 polA부위를 HindⅢ와 NaeⅠ으로 처리하여 분리한 다음 이를 E1 아데노바이러스 셔틀벡터인 pΔE1SP1A에 삽입하여 pΔE1SP1A/CMV-lacZ 셔틀벡터를 제조하였다.
hTERT 프로모터와 상기 프로모터에 c-Myc 결합부위 및 Sp1 결합부위를 포함한 m-hTERT 프로모터에 의해서 LacZ 발현이 조절되는 벡터를 제조하기 위해서는, pSEAP-TERT와 pSEAP-mTERT 플라즈미드로부터 BglⅡ와 EcoRⅠ을 이용하여 hTERT 프로모터와 m-hTERT 프로모터를 분리한 다음 이들을 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 처리하여 CMV 프로모터가 제거된 pΔE1SP1A/LacZ에 삽입하여 pΔE1SP1A/TERT-LacZ와 pΔE1SP1A/mTERT-LacZ 셔틀벡터를 각각 제조하였다.
제조된 각각의 셔틀벡터는 XmnI 제한효소로 절단한 뒤 BstBI 제한효소로 처리하여 단일가닥이 된 아데노바이러스 dl324BstB1(Swiss의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 얻음)과 함께 대장균 BJ5183에서 동시 형질 전환시켜 유전자 상동재조합을 유도하였다. 상동재조합된 플라즈미드 DNA는 PacI 제한효소로 처리한 뒤 293 세포주에 형질 전환하여 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z 재조합 아데노바이러스들을 생산하였다(도 2의 A). 생산된 재조합 아데노바이러스는 dl-mTERT-Z로 명명되었고 부다페스트 협약하에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2003년 2월 20일자로 기탁번호 KCCM-10471으로 국제기탁되었다..
B. 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19 및 Ad-mTERT-Δ19의 제조 및 생산.
hTERT와 m-hTERT 각각의 프로모터에 의하여 아데노바이러스의 복제가 조절되는 아데노바이러스들을 제조하기 위해서는, E1B19kD 부위가 결손된 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19를 주형 아데노바이러스 플라즈미드로 사용하였다. 먼저, pSEAP-TERT와 pSEAP-mTERT으로부터 BglⅡ와 EcoRⅠ을 이용하여 hTERT 프로모터와 m-hTERT 프로모터를 분리하여 BamHⅠ과 EcoRI으로 전처리된 pΔE1SP1A/ΔE1B19에 각각 삽입하여 pΔE1SP1A/hTERT-ΔE1B19와 pΔE1SP1A/mTERT-ΔE1B19 셔틀벡터를 각각 제조하였다.
제조된 셔틀벡터는 XmnI 제한효소로 처리한 뒤 BstBI 제한효소로 처리하여 단일가닥이 된 Ad-ΔE1B19와 함께 대장균 BJ5183에서 동시 형질 전환시켜 유전자 상동재조합을 유도하여, Ad-TERT-Δ19와 Ad-mTERT-Δ19 복제 가능 아데노바이러스들을 제조하였다(도 2의 B). 재조합 아데노바이러스의 생산, 농축 및 역가 결정은 293 세포주에서 실시하였다. 생산된 재조합 아데노바이러스는 Ad-mTERT-Δ19로 명명되었고 부다페스트 협약하에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2003년 2월 20일자로 기탁번호 KCCM-10470으로 국제기탁되었다.
실시예 5
복제 불능 재조합 아데노바이러스dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z의 유전자 발현양상 규명
hTERT 프로모터 및 m-hTERT 프로모터에 의한 유전자 발현이 세포내 텔로머라제 활성정도와 관련이 있는지를 검증하기 위하여, 표지 유전자로서 LacZ를 발현하는 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z를 이용하여 여러 암세포에서 LacZ 유전자 발현양상을 평가하였다. 24-웰 플레이트(well plate)에 2 x 105개의 암세포(C33A, U251N, MCF-7)와 정상세포(WI38, 173We)를 각각 분주한 뒤, 다음날 β-갈락토시다아제(galactosidase)를 발현하는 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z 아데노바이러스를 MOI 50으로 감염시키고 이틀 뒤 X-gal 염색을 실시하였다. β-gal의 활성은 고정액(1% 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드 in H2O)에서 5분간 세포들을 고정시킨 뒤, 염색용액(0.4 mg/ml X-gal, 4 mM 포타슘 페리시아나이드, 4 mM 포타슘 페로시아나이드, 2 mM MgCl2 in PBS)으로 37℃에서 4-16 시간동안 반응시켜 관찰하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이 CMV 프로모터의 경우는 세포내의 텔로머라제 활성과 무관하게 본 발명에서 이용된 모든 세포주들에서 LacZ 발현을 강하게 유도함으로써 암세포 특이성이 결여되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 암세포 특이적으로 유전자 발현을 조절할 수 있는 hTERT 또는 m-hTERT의 경우는 텔로머라제 활성이 높은 세포주에서만 LacZ의 발현을 유도함으로써 암세포 특이적 활성 프로모터임을 검증할 수 있었다. 또한 hTERT 프로모터에 c-Myc 결합부위 및 Sp1 결합부위가 추가로 포함된 m-hTERT의 경우는 텔로머라제 활성이 높은 세포주(C33A, U251N)에서는 야생형 프로모터인 hTERT보다 높은 유전자 발현을 유도할 수 있어 프로모터의 활성이 더욱 증가되었음을 확인하였으며, 텔로머라제 활성이 낮은 여러 세포주들(MCF-7, 173We, WI38)에서는 그 활성이 효과적으로 감소되어 암세포 특이성도 우수함을 검증할 수 있었다.
본 발명에서 제조한 hTERT 또는 m-hTERT 프로모터들에 의한 유전자 발현 효율과 암세포 특이성을 정량적으로 관찰하기 위하여, dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z 아데노바이러스를 여러 암세포주와 정상 세포주에 각각 여러 농도의 역가로 이틀 동안 감염시킨 후 세포를 용해시켜 β-gal의 활성을 측정하였다. 24-웰 플레이트에 2 x 105개의 암세포(H460, A549, C33A, SK-Hep1, HepG2, Hep3B, U343, U251N, MCF7)와 정상세포(173WE, CBHEL, MRC5, IMR90, W138, BJ)를 각각 분주한 뒤, 여기에 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z 아데노바이러스를 MOI 10, 50, 100으로 이틀 동안 감염시킨 후 Cheng과 Baltimore의 방법으로 β-gal의 활성을 측정하였다(Cheng,G. et al. ‘A co-inducer with TRAF2 of TNF-and CD40L-NK- kappaB activation.’Genes & Develop., 1996,10,963-973.). 먼저, 플레이트로부터 배지를 제거하고 Z 완충용액(60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-메르캅토에탄올)으로 세포를 떼어낸 뒤, 1 x 106개의 세포를 단백질 분해억제제(20 μM PMSF, 20 μM TLCK, 20 μM TPCK)가 포함된 100 μl의 세포 용해용 완충용액(β-메르캅토에탄올이 없는 Z 완충용액 플러스(plus) 1% NP-40)으로 세포를 용해시켰다. 세포 용출액을 원심분리하여 얻은 상등액 30 μl를 96-웰 플레이트에 각각 분주하고 여기에 ONPG(o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드) 4 mg을 6 ml의 Z 완충용액에 녹여 120 μl씩 분주하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5의 A 및 B에 나타낸 바와 같이 CMV 프로모터에 의하여 LacZ의 발현이 조절되는 경우, 세포를 감염시킨 바이러스의 역가에 비례하여 LacZ의 발현이 증가함을 알 수 있다. 특히 세포내 텔로머라제 활성과 관계없이 정상 세포주들을 포함한 모든 세포주들에서 LacZ의 발현을 매우 강하게 유도하였다. 이에 대조적으로, hTERT 또는 m-hTERT 프로모터의 경우는, 텔로머라제 활성이 높은 암세포주들, 즉 MCF-7 인체 유방암 세포주를 제외한 모든 암세포주들에서는 감염에 이용된 바이러스의 역가에 비례하여 LacZ의 발현을 유도하였으나 정상 암세포주들에서는 MOI 100의 높은 역가에서도 β-gal의 활성이 거의 관찰되지 않아 이들 두 종류의 프로모터들의 암세포 특이적 활성 조절능이 우수함을 확인하였다. 구체적으로, IMR90 정상 세포주의 경우 MOI 100에서 CMV 프로모터에 의해 발현되는 LacZ의 상대적인 양인 O.D.420의 값은 1.714인데 반하여 hTERT 또는 m-hTERT 프로모터에 의해 발현되는 LacZ의 상대적인 O.D.420 값은 0.101과 0.025로서 hTERT 프로모터인 경우 약 17배, m-hTERT 프로모터인 경우 약 68배정도 낮음을 알 수 있다. BJ 정상 세포주의 경우 MOI 500의 고농도의 바이러스에 의해 감염된 경우 CMV, hTERT 또는 m-hTERT 프로모터에 의해 발현되는 LacZ의 상대적인 O.D.420 값들이 0.548, 0.001. 0.001로서 hTERT 또는 m-hTERT 프로모터가 전혀 활성화되지 않음을 알 수 있다. 이러한 LacZ 발현의 큰 차이는 다른 정상 세포주들인 173We, CBHEL, WI38, MRC5등에서도 관찰되었다. 한편, 텔로머라제의 활성이 높은 여러 암세포주들에서는 m-hTERT 프로모터에 의해 발현되는 LacZ의 양이 야생형 프로모터인 hTERT 프로모터에 비해 훨씬 강하게 유도되어짐을 확인하였다. 즉, MOI 50의 dl-TERT-Z에 의해 감염된 SK-Hep1 세포주에서 발현된 LacZ의 상대적인 O.D.420 값은 0.182인데 반해 동량의 역가로 dl-mTERT-Z 아데노바이러스에 의해 감염된 경우에는 발현된 LacZ의 상대적인 O.D.420 값이 1.82로서 약 10배정도 강하게 유도되어졌으며, Hep3B 세포주에서도 약 10배정도(dl-TERT-Z: 0.135, dl-mTERT-Z; 1.322) 강하게 유도되어졌다(표 1). 이러한 일련의 실시예들을 통하여, 본 발명에서 제조된 m-hTERT 프로모터가 야생형 프로모터인 hTERT에 비하여 암세포에서는 훨씬 강하게 유전자 발현을 유도할 수 있어 더욱 강한 프로모터이지만 정상세포주에서는 활성이 일어나지 않아 암세포 특이성도 우수함을 확인할 수 있었다.
dl-CMV-Z dl-TERT-Z dl-mTERT-Z
MOI 10 50 100 10 50 100 10 50 100
H460 1.780 ±0.18 1.879 ±0.12 1.847 ±0.10 0.033 ±0.10 0.399 ±0.05 0.829 ±0.08 0.142 ±0.01 1.594 ±0.01 1.883 ±0.06
A549 1.658 ±0.09 1.65 ±0.08 1.706 ±0.09 0.010 ±0.04 0.178 ±0.06 0.384 ±0.07 0.062 ±0.01 0.650 ±0.02 1.011 ±0.07
U451N 1.733 ±0.05 1.765 ±0.05 1.768 ±0.04 0.267 ±0.16 1.042 ±0.12 1.291 ±0.03 0.939 ±0.13 1.785 ±0.04 1.815 ±0.08
U343 1.831 ±0.01 1.902 ±0.07 1.807 ±0.03 0.079 ±0.01 0.732 ±0.13 1.174 ±0.01 0.379 ±0.01 1.819 ±0.03 2.057 ±0.07
MCF7 2.027 ±0.07 1.844 ±0.03 1.892 ±0.08 0.022 ±0.03 0.020 ±.03 0.036 ±0.03 0.020 ±0.02 0.136 ±0.05 0.183 ±0.05
C33A 1.798 ±0.08 1.796 ±0.05 1.731 ±0.09 0.037 ±0.08 0.640 ±0.21 0.964 ±0.07 0.385 ±0.02 1.730 ±0.04 1.712 ±0.09
Hep3B 1.858 ±0.10 1.680 ±0.18 1.921 ±0.14 0.060 ±0.05 0.135 ±0.13 0.337 ±0.03 0.331 ±0.04 1.322 ±0.10 1.731 ±0.05
HepG2 1.647 ±0.01 1.714 ±0.06 1.662 ±0.07 0.038 ±0.01 0.231 ±0.02 0.402 ±0.04 0.652 ±0.11 1.705 ±0.05 1.716 ±0.11
SK-Hep1 1.916 ±0.06 1.941 ±0.01 1.933 ±0.04 0.047 ±0.01 0.182 ±0.04 0.373 ±0.01 0.435 ±0.05 1.82 ±0.04 1.994 ±0.02
173WE 0.059 ±0.02 0.647 ±0.12 1.453 ±0.04 0.003 ±0.02 0.025 ±0.12 0.040 ±0.01 0.021 ±0.03 0.026 ±0.01 0.035 ±0.03
CBHEL 0.117 ±0.01 0.928 ±0.01 1.642 ±0.03 0.006 ±0.01 0.005 ±0.01 0.007 ±0.01 0.069 ±0.10 0.061 ±0.01 0.103 ±0.01
IMR90 0.658 ±0.04 1.758 ±0.01 1.714 ±0.01 0.019 ±0.02 0.075 ±0.02 0.101 ±0.11 0.040 ±0.04 0.012 ±0.01 0.025 ±0.01
W138 0.376 ±0.05 1.43 ±0.22 2.012 ±0.31 0.001 ±0.01 0.001 ±0.03 0.034 ±0.05 0.045 ±0.02 0.035 ±0.05 0.093 ±0.04
BJ* 0.032 ±0.06 0.115 ±0.02 0.548 ±0.15 0.001 ±0.01 0.001 ±0.02 0.001 ±0.01 0.001 ±0.01 0.001 ±0.01 0.001 ±0.01
MRC5 0.721 ±0.12 1.696 ±0.03 1.683 ±0.05 0.011 ±0.01 0.044 ±0.02 0.059 ±0.01 0.013 ±0.01 0.060 ±0.06 0.053 ±0.03
실시예 6
복제 가능 재조합 아데노바이러스의 면역블로팅(immunoblotting)분석
복제가 암세포 특이적으로 일어나는지를 알아보기 위해, 대조군 바이러스인 Ad-ΔE1B19와 함께 인체 암세포주 및 정상 세포주에 각각 감염시킨 후 아데노바이러스에 의해 발현되는 E1 단백질의 발현 양상을 검증하였다. 6-웰 플레이트에 3 x 105 ∼ 1 x 106 개의 암세포주(C33A, A549, HeLa, SK-Hep1)및 정상 세포주(IMR90, MRC5, BJ)를 각각 분주한 후 다음날 Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-mTERT-Δ19를 암세포는 MOI 1로, 정상 세포주는 MOI 10으로 각각 감염시켰다. 바이러스 감염 후 2일 뒤에, 감염된 세포를 회수하여 세포 용해용 완충용액(50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.5% NP-40, 프로테아제 억제제: PMSF, TLCK, TPCK)로 세포들을 용해시켜 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 겔(gel)에 있는 단백질들을 PVDF 막(membrane)으로 전기이동(electro transfer)한 뒤 아데노바이러스 E1A 단백질을 특이적으로 인지하는 항체(sc-430; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)를 일차 항체로 혼성화(hybridization) 시키고 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 이차항체를 다시 혼성화시킨 후 ECL(Enhanced Chemi-Luminescence: sc-2048; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)을 이용하여 단백질의 발현양상을 규명하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이 Ad-ΔE1B19에 의해 감염된 경우는 암세포와 정상세포 모두에서 바이러스의 복제가 활발히 일어나 E1 단백질이 높이 발현된 반면, Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스에 의해 감염된 경우는 텔로머라제 활성이 높은 암세포주들에서만 발현이 되고 텔로머라제 활성이 미미한 정상세포주인 IMR90, MRC5, 및 BJ에서는 전혀 발현되지 않았다. 이러한 결과는 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스의 복제가 m-hTERT 프로모터에 의해 암세포 특이적으로 조절되어짐을 의미한다. 하지만, 야생형 hTERT 프로모터에 의하여 복제가 조절되는 Ad-TERT-Δ19의 경우는, 암세포들에서 복제가 활발히 일어나 E1 단백질이 높이 발현되었으나 정상세포주인 IMR90과 MRC5 세포주에서도 E1 단백질이 발현되어 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스에 비하여 암세포 특이적 복제능이 미약하게 조절됨을 알 수 있었다.
실시예 7
복제 가능 재조합 아데노바이러스의 세포살상능 검증
Ad-TERT-Δ19와 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능을 검증하기 위하여, 여러 종류의 암세포주들 및 정상 세포주들에 대조군 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19와 음성대조군 바이러스인 dl-CMV-Z 복제 불능 아데노바이러스를 각각 여러 농도의 역가로 감염시켜 세포살상 정도를 관찰하였다. 24-웰 플레이트에 2∼5 x 104개의 여러 종류의 암세포주(SK-Hep1, H460, C33A, U251N, A549, HeLa)와 정상 세포주(BJ, WI38, IMR90)를 각각 분주한 후 다음날 dl-CMV-Z, Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스를 MOI 0.01, 0.1, 1, 10, 100으로 각각 감염시켰다. MOI 0.1로 투여한 Ad-ΔE1B19 아데노바이러스가 세포를 거의 사멸시킨 시점에 모든 배지를 제거하고 플레이트 바닥에 남아있는 세포들을 0.5% 크리스탈 바이올렛(50% 메탄올)으로 고정하고 염색한 후 분석하였다.
도 7의 A에 나타낸 바와 같이 음성대조군인 dl-CMV-Z 복제 불능 아데노바이러스로 감염된 암세포들에서는 바이러스 복제가 전혀 일어나지 않아 세포 살상효과가 관찰되지 않았으나, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-mTERT-Δ19로 감염된 대부분의 암세포주들에서는 Ad-ΔE1B19와 거의 유사한 정도로 세포 살상을 유도하여 세포 살상능(potency)이 우수함을 확인할 수 있었다. 그러나 도 7의 B에 나타낸 바와 같이 정상 세포주인 BJ, WI38, IMR90에서는 Ad-TERT-Δ19의 경우 암세포에 대한 특이성이 전혀 없는 Ad-ΔE1B19와 거의 유사한 수준으로 정상 세포들을 살상시켰으나, Ad-mTERT-Δ19의 경우는 Ad-ΔE1B19에 비해 약 100배정도 낮은 세포 살상을 나타내어 Ad-mTERT-Δ19의 암세포에 대한 특이성(specificity)이 우수함을 확인하였다.
세포주의 텔로머라제 활성도에 따른 Ad-TERT-Δ19 및 Ad-mTERT-Δ19의 세포 살상능을 정량화하기 위해서, MTT 분석을 시행하였다. 암세포(SK-Hep1, H460, C33A, U251N, A549 및 HeLa)와 정상세포(BJ, WI38 및 IMR90)를 24-웰 플레이트에 70∼90% 컨플루언시(confluency)로 각각 분주한 후 다음날 dl-CMV-Z, Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스를 암세포는 MOI 10으로, 정상세포는 MOI 50으로 각각 감염시켰다. 일정시간 간격으로 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 2 mg/ml) 용액 200 μl씩을 웰(well)에 첨가하여 4 시간 동안 37℃ 항온기에서 반응시킨 후 1 ml의 DMSO(dimethyl sulphoxide)를 첨가하고 37℃ 에서 10분간 방치한 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 상대적 생존율을 측정하였다.
도 8A 및 B에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 사용된 모든 암세포들에서는 바이러스 감염 후 시간이 경과함에 따라 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19, 및 Ad-ΔE1B19가 유사한 수준으로 세포를 아주 빠르게 살상하는 반면, 정상세포주에서는 Ad-ΔE1B19 및 Ad-TERT-Δ19로 감염된 경우는 시간이 경과됨에 따라 세포 생존율이 급격하게 감소하지만(세포 생존율 5-20%), Ad-mTERT-Δ19로 감염된 경우에는 감염 후 9일이 지나도 약 90% 이상의 세포들이 생존함을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, Ad-mTERT-Δ19의 암세포 특이적 살상능이 우수함을 검증하였으며, 이는 또한 Ad-mTERT-Δ19의 경우 대조군 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19 및 야생형 hTERT에 의하여 복제가 조절되는 Ad-TERT-Δ19보다 정상세포에서의 안전성이 크게 증가하였음을 의미한다.
실시예 8
복제 가능 재조합 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과 검증
hTERT 프로모터에 의해 복제가 조절되는 아데노바이러스인 Ad-TERT-Δ19와 m-hTERT 프로모터에 의해 복제가 조절되는 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과를 비교 검증하기 위해, 인체 자궁암 세포주를 누드 생쥐에 접종한 후 형성된 종양에 Ad-TERT-Δ19와 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스를 양성 대조군 바이러스인 Ad-ΔE1B19와 함께 종양내 투여한 다음 종양의 크기를 관찰하였다. 생후 6-8주된 누드생쥐의 복벽에 피하로 1 x 107개의 인체 자궁암 세포주 C33A를 주사한 뒤, 종양이 50∼80 mm3 정도 성장하였을 때 5 x 108 plaque forming unit(PFU)의 Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-mTERT-Δ19 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 세 번 종양에 직접 주사한 후 종양의 성장을 관찰하였다. 종양의 용적은 캐리퍼스(caliper)를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정한 후 다음과 같은 공식으로 산출하였다(종양의 용적 = (단축 mm)2 x 장축 mm x 0.523).
도 9에 나타낸 바와 같이 음성대조군인 PBS를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 32일에 종양의 크기가 4,232±2,185 mm3로 종양이 급격히 성장하였으나 복제 가능 아데노바이러스(Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19, Ad-ΔE1B19)를 투여 받은 생쥐의 경우는 종양의 성장이 크게 지연됨을 확인할 수 있었다. 즉, Ad-ΔE1B19를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 32일에 종양의 크기가 44±38 mm3이고, Ad-TERT-Δ19는 229±168 mm3, 그리고 Ad-mTERT-Δ19는 18±20 mm3 정도로 뚜렷한 항종양 효과를 보였다 (p < 0.05). 또한, 바이러스 투여 후 60일에는 PBS를 투여한 모든 6마리의 쥐들이 죽어 더 이상 종양의 성장을 측정할 수 없었고, Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19, 또는 Ad-mTERT-Δ19를 투여한 경우는 종양의 크기가 각각 62±104 mm3, 550±368 mm3, 15±15 mm3로 m-hTERT에 의하여 복제가 조절되는 아데노바이러스인 Ad-mTERT-Δ19의 경우 Ad-ΔE1B19만큼 항종양 효과가 우수하였다(p < 0.05). 또한, Ad-mTERT-Δ19를 투여한 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 10일경에 5마리의 생쥐들 중 2마리에서 종양이 완전히 사라짐을 관찰할 수 있었고 2달이 지나도 종양의 재성장은 관찰되지 않았다.
실시예 9
h-TERT 또는 m-hTERT 프로모터의 생체내 활성 검증
hTERT 또는 m-hTERT 프로모터의 생체내 활성이 정상 조직에서 일어나는지를 알아보기 위해, hTERT 또는 m-hTERT 프로모터에 의하여 발현이 조절되는 LacZ 표지유전자가 삽입된 복제 불능 아데노바이러스인 dl-TERT-Z와 dl-mTERT-Z를 양성 대조군인 dl-CMV-Z와 함께 생쥐에 정맥 투여하였다. 생후 6-8주된 생쥐의 꼬리정맥에 5 x 1010 입자의 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z를 각각 100 μl씩 투여 후 3일 뒤에 쥐로부터 각 장기들(간, 심장, 폐, 비장, 신장, 위장, 정소, 근육)을 적출하였다. 적출된 각 조직을 4% 파라포름알데히드 용액에 넣은 뒤 4℃에서 4 ∼ 8시간동안 고정시킨 후 수크로스 용액에서 오버나이트(overnight)하여 탈수시켰다. 탈수된 조직은 O.C.T. 컴파운드(Sakura Finetec, Torrance, CA)로 동결박편한 뒤 8 ㎛의 두께로 절단하여 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스 위에 부착하여 X-gal 염색을 실시하였다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c에 나타낸 바와 같이 구성성(constitutive) 프로모터에 의하여 LacZ의 발현이 조절되는 아데노바이러스인 dl-CMV-Z를 정맥 투여한 경우 간조직에서의 LacZ 발현이 아주 높게 일어났으며, 비장, 위 및 신장에서도 LacZ 발현이 낮게 일어남을 관찰 할 수 있었다. 하지만 dl-TERT-Z와 dl-mTERT-Z를 투여한 경우에는 정맥 투여 후 가장 아데노바이러스가 많이 검출된다고 알려진 기관인 간조직에서 LacZ의 발현이 전혀 일어나지 않아 hTERT 또는 m-hTERT 프로모터의 활성이 정상 간세포에서 전혀 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 비장 조직에서는 dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z를 투여한 경우 dl-CMV-Z를 투여한 경우보다 훨씬 미약하게 LacZ의 발현이 일어나 비장세포에서도 hTERT와 m-hTERT 프로모터의 활성이 억제됨을 알 수 있었다. 위장조직에서는 dl-CMV-Z 또는 dl-TERT-Z를 투여한 경우 LacZ의 발현이 소량 검출되었으나 dl-mTERT-Z를 투여한 경우는 전혀 LacZ의 발현이 관찰되지 않았으며, 신장조직에서는 dl-CMV-Z를 투여한 경우 미약하게 LacZ의 발현이 미약하게 일어난 반면 dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z를 투여한 경우는 전혀 LacZ의 발현이 관찰되지 않아 m-hTERT 프로모터의 암세포 특이성이 우수함을 확인하였다.
종양 조직에서의 hTERT 또는 m-hTERT 프로모터의 활성을 비교 검증하기 위해서는 생후 6-8주된 누드생쥐의 복벽에 피하로 1 x 107개의 인체 자궁암 세포주 C33A를 주사한 뒤 종양이 100 mm3 정도 성장하였을 때, 5 x 108 plaque forming unit(PFU)의 dl-TERT-Z와 dl-mTERT-Z 아데노바이러스를 양성 대조군인 dl-CMV-Z와 함께 한번 생쥐에 종양내투여(intratumoral injection)하였다. 바이러스 투여 후 3일 뒤에 종양 조직을 적출한 뒤 상기 기재된 방법에 따라 X-gal 염색을 실시하였다.
종양 조직에 이들 바이러스를 투여한 경우에는 dl-TERT-Z 바이러스가 극히 일부의 암세포들에서만 LacZ의 발현을 유도한 반면 dl-mTERT-Z 바이러스가 종양 조직내의 많은 암세포들에서 LacZ의 발현을 유도하여 m-hTERT 프로모터의 활성이 h-TERT 프로모터에 비하여 암세포에서 훨씬 강하게 활성화됨을 알 수 있었다.
사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 c-Myc 결합부위 및/또는 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사 조절서열에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 암세포에서만 특이적이며 고효율로 상기 유전자를 발현함으로써 암세포만을 선택적으로 살상할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 해당하는 m-hTERT 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2의 A는 본 발명에 따른 복제 불능 재조합 아데노바이러스 벡터 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 및 dl-mTERT-Z의 모식도를 나타낸 것이고, 도 2의 B는 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 벡터 Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 및 Ad-mTERT-Δ19의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 이용되는 다양한 암세포주 및 정상 세포주의 상대적인 내재 텔로머라제의 활성도를 도시한 그래프이다.
도 4는 다양한 암세포주 또는 정상 세포주에서 본 발명에 따른 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z의 LacZ 유전자 발현양상을 보여주는 사진이다.
도 5의 A는 다양한 암세포주에서 본 발명에 따른 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z의 LacZ 유전자 발현양상을 정량화한 그래프이고, 도 5의 B는 정상 세포주에서 본 발명에 따른 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z의 LacZ 유전자의 발현양상을 정량화한 그래프이다(■:dl-CMV-Z, △:dl-TERT-Z, ○: dl-mTERT-Z).
도 6은 다양한 암세포주 또는 정상 세포주에서 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-mTERT-Δ19, Ad-TERT-Δ19 또는 Ad-ΔE1B19의 E1 유전자의 발현양상을 나타낸 것이다(1:C33A, 2:A549, 3:HeLa 4:SK-Hep1, 5:IMR90, 6:MRC5, 7:BJ).
도 7의 A는 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-ΔE1B19에 의해 감염된 다양한 암세포주의 살상정도를 나타낸 것이고, 도 7의 B는 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-ΔE1B19에 의해 감염된 다양한 정상 세포주의 살상정도를 나타낸 것이다(1:dl-CMV-Z, 2:Ad-ΔE1B19, 3:Ad-TERT-Δ19, 4:Ad-mTERT-Δ19).
도 8의 A는 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-ΔE1B19에 의해 감염된 다양한 암세포주의 살상정도를 정량화한 그래프이고, 도 8의 B는 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19또는 Ad-ΔE1B19에 의해 감염된 다양한 정상 세포주의 살상정도를 정량화한 그래프이다(■:dl-CMV-Z, □:Ad-ΔE1B19, ○:Ad-TERT-Δ19, △:Ad-mTERT-Δ19).
도 9는 종양이 형성된 누드 마우스에서 본 발명에 따른 복제 가능 재조합 아데노바이러스 Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19 또는 Ad-ΔE1B19의 종양 살상정도를 도시한 그래프이다(■:PBS, □:Ad-ΔE1B19, ○:Ad-TERT-Δ19, △:Ad-mTERT-Δ19).
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 마우스 정맥에 투여된 본 발명에 따른 복제 불능 재조합 아데노바이러스 dl-CMV-Z, dl-TERT-Z 또는 dl-mTERT-Z의 다양한 정상 조직 또는 암조직에서의 LacZ 유전자 발현양상을 나타낸 것이다.
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Claims (27)

  1. 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 추가로 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  2. 제 1항에 있어서, 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 추가로 1개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, c-Myc 결합부위가 서열번호 2, 서열번호3 또는 서열번호 4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Sp1 결합부위가 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  5. 제 1항에 있어서, 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터의 3’-말단에 추가로 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결되는 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 전사 조절서열이 서열번호 14의 핵산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 전사 조절서열.
  7. 제 1항에 따른 전사 조절서열이 바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노비리디아에 속으로부터 유래한 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 바이러스의 복제에 필요한 유전자가 아데노바이러스의 초기 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 초기 유전자가 E1A 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  11. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1B19kDa 유전자가 결실된 것임을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  12. 제 1항에 따른 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자가 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노비리디아에 속으로부터 유래한 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자가 아데노바이러스의 E1 유전자를 대신하여 도입되고 복제 불능인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자가 아데노바이러스의 E3 유전자를 대신하여 도입되고 복제 가능인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자가 E1A 유전자를 대신하여 도입되고 아데노바이러스의 E1 및 E3 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  18. 제 1항에 따른 전사 조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 비바이러스 벡터.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자가 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 비바이러스 벡터.
  20. 제 7항에 따른 재조합 바이러스 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포.
  21. 제 12항에 따른 재조합 바이러스 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포.
  22. 제 18항에 따른 재조합 비바이러스 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포.
  23. (a) 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 추가로 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사조절서열이 바이러스의 복제에 필요한 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노비리디아에 속으로부터 유래한 바이러스인 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  25. (a) 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 추가로 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노비리디아에 속으로부터 유래한 바이러스인 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  27. (a) 2개의 c-Myc 결합부위 및 5개의 Sp1 결합부위를 포함하는 사람 텔로미어 역전사효소 프로모터에 추가로 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상이 Sp1 결합부위를 포함하는 핵산서열이 연결된 전사조절서열이 치료학적 트랜스 유전자에 작동가능하게 연결된 재조합 비바이러스 벡터의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
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KR20200087726A (ko) * 2019-01-11 2020-07-21 주식회사 진캐스트 Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
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