KR100792183B1 - 유전자 발현을 증가시키는 합성 ｈＴＥＲＴ 프로모터 - Google Patents

유전자 발현을 증가시키는 합성 ｈＴＥＲＴ 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 발현을 증가시키는 합성 hTERT 프로모터에 관한 것으로 보다 구체적으로는, hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림(upstream)에는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 TPL 서열(tripartite leader sequencame, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터에 관한 것이다.
hTERT 프로모터, TPL, c-Myc, Sp1, 유전자 조절 요소

Description

유전자 발현을 증가시키는 합성 ｈＴＥＲＴ 프로모터{Synthetic Human Telomerase Reverse Transcriptase Promoter Enhancing Gene Expression}
도 1은 다양하게 변형된 hTERT 프로모터에 의해 유도된 루시퍼레이즈의 활성도를 나타낸 것이다. 여기서 H는 hTERT 염기 프로모터, E는 hTERT 프로모터의 조절 부위, T는 TPL 서열, SV40는 SV40 프로모터를 의미한다.
도 2는 다양한 인간 종양세포에서 합성 E3-H-T 프로모터에 의해 유전자 발현이 증가됨을 나타내는 것이다.
도 3은 hTERT 프로모터이 c-Myc 또는 Sp1에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는 것이다. 여기서 lane 1은 세포 추출물을 첨가하지 않은 DNA 프로브, lane 2는 세포 추출물과 프로브, lane 3 및 4는 세포 추출물과 c-Myc 항체와 프로브, lane 5 및 6은 세포 추출물과 Sp1 항체와 프로브를 처리한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 유전자 발현을 증가시키는 합성 hTERT 프로모터에 관한 것으로 보다 구체적으로는, 유전자 발현을 증가시키는 합성 hTERT 프로모터를 제작하여 상기 프로모터 중 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림(upstream)에는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 TPL 서열(tripartite leader sequencame, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터가 종양세포에서 유전자 발현을 증가시키며, c-Myc 또는 Sp1과 결합한다는 것을 규명하였다.
배경기술
종양 유전자 치료에 있어 유전자의 선택적이고 효과적인 발현은 만족스러운 임상 결과를 얻기 위해 중요하다. 종래 종양 특이적 유전자 조절 요소(cancer-specific gene regulatory element)에 대한 많은 연구가 있어 왔다. 예를 들어, 전립선 특이적 요소는 전립선암 특이적 유전자 발현을 유도한다 (Choo, R., et al., Int. J. Radiat . Oncol . Biol . Phys . 50(3):615-620,.2001, Rodriguez, R., et al., Cancer . Res. 57(13):2559-2563,1997). 암배 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 유전자 프로모터는 직장암(colorectal cancer) 및 폐암을 타겟으로 하는 유전자를 조절하는데 유용하다 (Osaki, T., et al., Cancer . Res. 54(20):5258-5261,1994, Kijima, T., et al., Cancer . Res. 59(19):4906-4911,1999). MUC-1(mucin-1) 및 E2F(elongation factor 2) 프로모터는 유방암 및 RB 유전자(retinoblastoma) 가 상대적으로 부족한 종양에 적용되어졌다 (Kurihara, T., et al., J. Clin . Invest . 106(6):763-771, 2000, Putzer, BM., et al ., J. Virol . 71(12):9538-9548, 1997). 그러나 이들 프로모터의 특이성은 특이적 인간 종양에 대한 유전자 조절 요소의 조합 때문에 일정한 종양 타입에 한정된다. 인간 텔로머레이즈 역전사 효소(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)는 인간 종양의 80% 이상에서 종양 특이적 유전자를 조절한다 (Kim, N.W., et al ., Science. 266(5193):2011-2015, 1994). 그러므로 hTERT는 종양 특이적 유전자 발현에 있어 중요한 연구 대상으로 여겨지고 있다. hTERT 프로모터의 종양 특이적 잠재성은 Bax(Bcl2-associated x-protein), p53, 캐스페이즈-8(caspase-8)을 코딩하는 유전자를 포함한 다양한 치료 유전자를 유도한다는 것이 증명되었다 (Koga, S., et al., Hum . Gene . Ther. 11(10):1397-1406, 2000). 그러나, 변형되지 않은 hTERT는 충분한 유전자 발현을 유도하기에는 너무 약하다. 프로모터 시퀀싱 및 기능 분석을 통해 181 bp 코어 프로모터가 Sp1 및 c-Myc의 다중 결합 모티프(multiple binding motif)를 코딩한다는 것을 밝혀냈다. 서브그룹 C 인간 아데노바이러스 트리파타이트 리더(subgroup C human adenovirus tripartite leader, TPL) 서열은 번역(translation)시 유전자 발현을 증가시키는 것으로 보고되고 있다. TPL은 약 200 bp로 아데노바이러스의 후기 유전자 발현을 촉진한다.
이에 본 발명자들은 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter)의 활성도를 향상시켜 유전자 발현을 조절하기 위하여, hTERT 코어 프로모터 서열(nt -200에서 nt -11)과 TPL을 hTERT 염기 프로모터에 융합한 후, 상기 프로모터가 다양한 종양세포에서 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림(upstream)에는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 TPL 서열(tripartite leader sequence, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 및 목적 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질감염된 세포주를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림에는 서열번호 2로 표시되는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 서열번호 3으로 표시되는 TPL 서열(tripartite leader sequence, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 종양세포에서 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 E3-H-T 프로모터를 함유하는 재조합 발현벡터로 형질감염시켜 정상 세포인 MRC-5(human lung fibroblast 세포주)와 인간 유방암세포(human breast cancer cell)인 MCF-7에서의 루시퍼레이즈의 활성도를 비교함으로써 행하여졌다.
본 발명은 또한, 상기 프로모터 및 목적 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질감염된 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 간암, 유방암, 자궁암, 갑상선암 및 망막모세포종(retinoblastoma)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 c-Myc 또는 Sp1과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. c-Myc 또는 Sp1과의 결합 여부는 E3-H-T 프로모터와 핵 추출물을 반응시켜 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 수행함으로써 행하여졌다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 본 발명에 따른 합성 hTERT 프로모터 제작
인간 유방암세포(human breast cancer cell, MCF-7, ATCC HTB-22), 간암세포(SK-Hep1(ATCC HTB-52), HepG2(ATCC HB-8065), Hep3B(ATCC HB-8064)), 자궁암세포(Hela cell, ATCC CCL2.2), 293 cell(ATCC CRL-1573), 인간 배아망막아세포(human embryonic retinoblast)로부터 유래한 망막모세포종(retinoblastoma)인 911 세포주(Van Der Eb, University of Leiden, Netherlands) 및 갑상선암세포인 ARO(undifferentiated thyroid, from Dr. Jhiang, Ohio State University, USA), FRO(follicular, from Dr. Jhiang, Ohio State University, USA), NPA(papillary carcinoma, from Dr. Jhiang, Ohio State University, USA)(Huang, W. & Flint, S.J. J. Virol., 72(1):225-235, 1998)를 10% fetal bovine serum, 2 mM L-글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 37℃, 5% CO2/95% 습도로 배양하였다.
변형된 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 프로모터가 인간 종양 세포에서 유전자 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, MCF-7 세포에서 다양하게 변형된 hTERT 프로모터를 제작하였다.
삭제
hTERT 프로모터의 조절하에서 루시퍼레이즈(luciferase)를 발현시키는 pGL2-H를 만들기 위하여, hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)를 코딩하는 플라스미드인 pT7-blue-hTERT(Logan, J. & Shenk, T. Proc . Natl . Acad . Sci . USA ., 81(12):3655-3659, 1984; Shin, J.M., et al ., Oncol Rep. 10(6):2063-2069, 2003)의 hTERT 염기 프로모터를 KpnI 및 HindⅢ로 자른 후, 루시퍼레이즈(luciferase)를 내재하고 있는 pGL2-C 벡터(Promega Co.)를 동일 효소로 잘라 결찰시켰다. pT7-blue-hTERT를 주형으로 하고 서열번호 4 및 5의 프라이머를 사용하여 hTERT 코어 프로모터 부위(nt -200에서 nt -11)를 PCR로 증폭하였다.
서열번호 4: 5'-GATTCGCGGGCACAGACGC-3'
서열번호 5: 5'-CGCGGAAAGGAAGGGGAGG-3'
PCR 산물을 pMOSblue(pMOSblue blunt-ending kit; Amersham Pharmacia)로 서브클론하였고, 서열을 ABI PRISM377 자동 DNA 서열기(ABI PRISM377 automatic DNA sequencer)를 이용하여 확인하였다.
pGL2-E-H, pGL2-E2-H 및 pGL2-E3-H를 만들기 위하여 하기의 방법으로 pSP72 서브클론벡터(Promega Co.)들을 제작하였다. pSP72(Promega Co.)를 KpnI 및 HindⅢ로 자른 후, pGL2-H(Promega Co.)를 동일 효소로 잘라 H(hTERT basic promoter) 단편을 삽입하여 pSP72-H를 제작하였다. pMOSblue-E(Amersham Pharmacia)의 E(hTERT 프로모터 조절 부위, hTERT promoter regulatory region) 단편을 HindⅢ로 자르고 blunt end로 만든 후 KpnI으로 자른 다음, EcoRV 및 KpnI으로 자른 pSP72-H 벡터(Promega Co.)에 결찰시켜 pSP72-E-H를 제작하였다. pMosblue-E(Amersham Pharmacia)를 NdeI 및 BamHI으로 잘라 blunt처리한 후, E 단편을 얻어내고, StuI으로 자른 pSP72-E-H 또는 pSP72-E2-H에 삽입하여 pSP72-E2-H 및 pSP72-E3-H을 제작하였다. 상기 pSP72-E-H, pSP72-E2-H 및 pSP72-E3-H 벡터를 BglⅡ 및 HindⅢ로 자르고, 루시퍼레이즈(luciferase)를 내재하고 있는 pGL2-C 벡터(Promega Co.)를 동일 효소로 잘라, 프로모터 부분을 절단한 pGL2-C 벡터에 삽입하여 각각 pGL2-E-H, pGL2-E2-H 및 pGL2-E3-H를 제작하여 E-H, E2-H, E3-H 프로모터로 루시퍼레이즈 발현이 조절되도록 하였다. 인간 아데노바이러스 5가 감염된 293 세포의 전체 RNA를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 프라이머를 사용하여 TPL(서브그룹 C 인간 아데노바이러스 트리파타이트 리더, subgroup C human adenovirus tripartite leader) 서열을 RT-PCR를 수행하여 수득하였다 (Lee, W.W., et al., Oncol . Rep., 10(4):845-849, 2003).
서열번호 6: 5'-ACTCTCTTCCGCATCGCTTGC-3'
서열번호 7: 5'-CTTGCGACTGTGACTGGTTAGACGCC-3
PCR산물은 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클론하여 서열을 확인하였다.
pGL2-H-T를 만들기 위하여, 루시퍼레이즈를 내재하고 있는 pGL2-H 벡터(Promega Co.)를 SpeI 및 PstI으로 절단하고, pCR2.1-T 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 SpeI 및 NSiI으로 절단하여 획득한 TPL DNA 조각을, 절단한 벡터에 삽입하여 pGL2-H-T를 확보하였다.
pGL2-E-H-T, pGL2-E2-H-T 및 pGL2-E3-H-T를 만들기 위하여, 하기의 방법으로 pSP72 서브클론벡터(Promega Co.)들을 제작하였다. pGL2-H-T벡터(Promega Co.)를 KpnI 및 PstI으로 절단하여 획득한 H(hTERT 염기 프로모터, hTERT basic promoter)-T(tripartite leader sequence, TPL) DNA 조각을, 동일한 효소로 자른 pSP72(Promega Co.)에 결찰시켜 pSP72-H-T를 확보하였다. 상기 pSP-H-T에 E를 삽입하기 위해서, pMosblue-E(Amersham Pharmacia)를 NdeI로 자르고 blunt처리한 후 다 시 BamHI으로 잘라 E(hTERT 프로모터의 조절 부위, hTERT promoter regulatory region) DNA 조각을 얻어내고, 이를 KpnI으로 잘라 blunt처리한 다음, BamHI으로 처리된 pSP72-H-T(Promega Co.)에 삽입하여 pSP72-E-H-T를 확보하였다. E를 순차적으로 추가 삽입하기 위하여, pMosblue-E(Amersham Pharmacia)를 NdeI 및 BamHI으로 잘라 blunt처리한 후, E DNA 조각을 얻어내고, StuI으로 자른 pSP72-E-H-T 또는 pSP72-E2-H-T에 삽입하여 pSP72-E-H-T, pSP-E2-H-T 및 pSP-E3-H-T를 제작하였다. 상기 pSP72-E-H-T, pSP-E2-H-T 및 pSP-E3-H-T의 프로모터 부분을 BglⅡ 및 HindⅢ로 자르고, 루시퍼레이즈를 내재하고 있는 pGL2-C 벡터(Promega Co.)를 동일 효소로 잘라, 프로모터 부분을 절단한 pGL2-C 벡터에 삽입하여 각각 pGL2-E-H-T, pGL2-E2-H-T 및 pGL2-E3-H-T를 제작하였다.
실시예 2. 합성 hTERT 프로모터의 루시퍼레이즈 활성도 측정
상기 프로모터의 루시퍼레이즈 활성도를 조절하는 능력을 측정하기 위해, Lipofectamine plus reagent(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 이용하여 0.8 ㎍ pGL2 발현 벡터(Promega Co.), 0.2 ㎍ pGKβgal(from Dr. Jung, Harvard Medical School)을 MCF-7 세포(ATCC HTB-22)에 형질감염(transfection)시켰다. 2일 후, 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 씻고, 200 ㎕ repoeter lysis buffer(Luciferase assay kit; Promega, Madison, WI)로 용해시켰다. 루시퍼레이즈 활성도는 Luminometer(LS50B; Perkin Elmers Corp)로 측정하였으며, β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성도로 표준화하였다.
그 결과, E3-H-T 프로모터를 함유하는 재조합 발현벡터로 형질감염시킨 경우 대조군(hTERT 염기 프로모터를 포함하는 pGL2발현벡터로 형질감염시킨 세포)보다 8.5±2.3배 루시퍼레이즈 활성도가 증가하였다 (도 1). 이것은 hTERT 프로모터의 조절 부위를 3배 첨가함으로써 hTERT 염기 프로모터의 유전자 발현 능력을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 다양한 인간 종양세포에서 합성 E3-H-T 프로모터의 유전자 발현 능력 측정
다양한 인간 종양세포에서 합성 E3-H-T 프로모터가 유전자 발현을 조절하는지 여부를 측정하였다. 합성 E3-H-T 프로모터를 함유하는 pGL2 발현벡터를 간암세포인 SK-Hep1, Hep3B(hepatocellular carcinoma), HepG2(hepatoblastoma), 유방암세포인 MCF-7, 자궁암세포인 Hela, 갑상선암세포인 ARO(undifferentiated thyroid), FRO(follicular), NPA(papillary carcinoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)인 911 세포주에 형질감염시켜 루시퍼레이즈 활성도를 상기 실시예 2의 방법으로 측정하였다.
그 결과, hTERT 염기 프로모터에 비하여 합성 E3-H-T 프로모터를 함유하는 pGL2 발현벡터를 형질감염시킨 경우 루시퍼레이즈의 활성도가 증가하였다 (도 2). 특히 SK-Hep1에서는 1,000배이상 루시퍼레이즈의 활성도가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 합성 E3-H-T 프로모터가 다양한 종양세포에서 hTERT 염기 프로모터의 유전자 발현 능력을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. 합성 E3-H-T 프로모터의 종양 특이적 유전자 발현 여부 측정
정상세포인 MRC-5 및 인간 유방암세포(human breast cancer cell)인 MCF-7에서 상기 실시예 2에서 제작된 프로모터의 루시퍼레이즈의 활성도를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 방법으로 비교하였다. 그 결과, 합성 E3-H-T 프로모터를 함유하는 pGL2 발현벡터를 형질감염시킨 경우, MRC-5에서는 유전자 발현이 증가되지 않았으나, MCF-7에서는 유전자 발현이 증가되었다 (도 3). 이로써 합성 E3-H-T 프로모터에 의해 종양세포에서만 유전자 발현이 증가됨을 알 수 있다.
실시예 5. 합성 E3-H-T 프로모터가 c-Myc 또는 Sp1에 결합하는지 여부 측정
E3-H-T 프로모터의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)가 c-Myc(cellular-myelocytomatosis viral oncogene homolog) 및 Sp1(transcription factor specificity protein 1) 전사 요소와 결합하는지 여부를 확인하게 위하여 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다.
hTERT 프로모터의 조절 부위(E)와 Sp1 결합 부위를 가지는 E3-H-T 프로모터의 110 bp SmaI subfragment의 5'말단을 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(T4 polynucleotide kinase, Promega, USA)를 이용하여 라벨하였다. c-Myc 및 Sp1을 추출하기 위하여 1×107 293T 세포를 모아 용해한 다음, 핵 추출물을 회수하였다. 라벨된 hTERT 프로브(probe) 1 ng 을 핵 추출물 12 ㎕와 함께 반응 부피가 25 ㎕가 되도록 하여 실온에서 20분 동안 배양하였다. 한편, 반응물에 c-Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 Sp1 항체(Santa Cruz Biotechnology) 1 ㎍을 처리 전후에 첨가하였다. 6% PAGE로 전기영동한 후 방사선 사진촬영(autoradiography)을 수행하였다.
그 결과, c-Myc 또는 Sp1는 hTERT 프로모터의 조절 부위(E)와 결합하였으며(lane 2), c-Myc 또는 Sp1 항체는 hTERT 프로모터의 조절 부위(E)와의 결합을 효과적으로 방해하였다 (lane 3-6, 도 4). 이는 종양 세포에서 E3-H-T 프로모터의 결합 모티프(binding motif)가 c-Myc 또는 Sp1에 결합함을 보여준다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 유전자 발현을 증가시키는 합성 hTERT 프로모터를 제작하여 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림(upstream)에는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 TPL 서열(tripartite leader sequence, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터를 제공하는 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 표시되는 hTERT 염기 프로모터(hTERT basic promoter, H)의 업스트림에는 서열번호 2로 표시되는 3개의 hTERT 프로모터 조절 부위(hTERT promoter regulatory region, E)를 부착하고, 다운스트림(downstream)에는 서열번호 3으로 표시되는 TPL 서열(tripartite leader sequence, T)을 부착한 E3-H-T 프로모터.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 종양세포에서 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제1항의 프로모터 및 목적 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터.
  5. 제4항의 발현벡터로 형질감염된 세포주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포주는 간암, 유방암, 자궁암, 갑상선암 및 망막모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 c-Myc 또는 Sp1과 결합하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
KR1020060048209A 2006-05-29 2006-05-29 유전자 발현을 증가시키는 합성 ｈＴＥＲＴ 프로모터 KR100792183B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6627190B2 (en) * 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
KR20040077002A (ko) 2003-02-27 2004-09-04 윤채옥 개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
KR20060004852A (ko) 2004-07-10 2006-01-16 고려대학교 산학협력단 종양 특이적 자살유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는아데노바이러스 발현 벡터

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