DE602004011487T2 - Modifizierter tert-promotor mit verbesserter tumorspezifität und stärke sowie diesen enthaltender rekombinanter vektor - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Transkriptionsregulationssequenz mit erhöhter Tumorspezifität und Stärke und einen rekombinanten Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz umfasst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Transkriptionsregulationssequenz, die einen humanen Telomerreverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere SpI-Bindungsstellen umfasst, und einen rekombinanten Vektor, der ein bestimmtes Gen umfasst, das mit der Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft ist.
  • Stand der Technik
  • Der Adenovirus besitzt bekanntlich mehrere Vorteile bei der hocheffizienten Gentransfervermittlung in vivo und in vitro, bei der Übertragung exogener Gene in eine Vielzahl von Zelltypen und beim Ermöglichen der Expression der Gene, ohne Rücksicht auf den Zellteilungszustand der Zielzellen, was ein Virus mit hohem Titer erzeugt und in Menschen keinen Krebs hervorruft. Aufgrund dieser Vorteile hat die Verwendung von Adenovirus bei der klinischen Krebsgentherapie stark zugenommen (Graham, F. L., 'Adenovirus vectors for high-efficiency gene transfer into mammalian cells'. Immunol. Today, 2000, 21, 426–8; Castell, J. V. et al., 'Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes: analysis of the biochemical functionality of transduce cells". Gene Ther., 1997, 4, 455–64). Wenn Krebs unter Verwendung der durch Adenovirus vermittelten Gentherapie behandelt wird, ist keine Langzeitexpression von therapeutischen Genen erforderlich, und eine durch das Virus oder virale Proteine ausgelöste Wirts-Immunreaktion ist nicht hochsignifikant oder kann in einigen Fällen sogar förderlich sein. Somit wird der Adenovirus als ein Gentransfervehikel zur Krebstherapie attraktiv.
  • Allerdings zeigen die meisten herkömmlichen rekombinanten Adenoviren zur Krebstherapie, die als replikationsinkompetente Viren der ersten Generation bekannt sind, Antitumoraktivität in nur primär infizierten Zellen oder in einer sehr kleinen Anzahl von umgebenden Zellen (Vile, R. G. et al., 'Cancer gene therapy: hard lession and new courses'. Gene Ther., 2000, 7, 2–8; Paillard, F., Cancer gene therapy annual conference. 1997: trends and news, Hum. Gene Ther., 1998, 4, 283–6; Lattime, E. C. et al., 'Selectively replicating viruses as therapeutic agents against cancer'. in: D. Kirn (Hrsg.), Gene therapy of cancer, Academic Press, New York, 1999, 235–50).
  • Um solche Probleme zu beheben, berichtete die Forschungsgruppe von McCormick über einen ersten rekombinanten Adenovirus, der selektiv in Tumorzellen repliziert und gegebenenfalls die Tumorzellen abtötet. Danach wurde eine Vielzahl von Anstrengungen unternommen, um modifizierte Adenoviren zu entwickeln, die eine tumorspezifische Zytolyse hervorrufen (Bischoff, J. R. et al., 'An adenovirus mutant that replicates selectively in P53-deficient human tumor cells'. Science, 1996, 18, 274 (5286), 373–6; Heise, C. et al., 'ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents'. Nat. Med., 1997, 3(6), 639–45). Die onkolytischen adenoviralen Vektoren besitzen einen Dominoeffekt auf die Krebstherapie, in dem sie eine Antitumoraktivität nicht nur in primär infizierten Zellen aufweisen, sondern durch Replikation auch in sekundär infizierenden umgebenden Tumorzellen, wodurch die therapeutische Wirksamkeit gegen Krebs deutlich erhöht wird. Auch umfassen die onkolytischen adenoviralen Vektoren weiterhin den Vorteil, dass sie in umgebenden normalen Zellen replikationsgehemmt sind und somit in den normalen Zellen eine geringe Zytotoxizität besitzen.
  • Tumorspezifische replikationskompetente Adenoviren wurden bisher hauptsächlich durch zwei Verfahren wie folgt entwickelt. Erstens können tumorspezifische replikationskompetente Adenoviren durch Regulieren der Krebsgewebeexpression von E1A-Protein, welches zur Replikation von Adenovirus essenziell ist, unter Verwendung von tumor- oder gewebespezifischen Promotoren entwickelt werden. Rodriguez, R. et al berichteten im Jahr 1997, dass, wenn der Stromaufwärts-Promotor des E1A-Gens durch die Promotor/Enhancer-Region des Prostataspezifischen Antigens (PSA) ersetzt wird, das in Prostatakrebszellen selektiv exprimiert wird, sich Adenovirus selektiv in PSA-positiven Prostatakrebszellen repliziert (Rodriguez, R. et al., 'Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells'. Cancer Res., 1997, 1, 57 (13), 2559–63). Das Prostataabgeschwächte replikationskompetente Adenovirus (ARCA) CN706 (Calydon Pharmaceuticals, CA, USA) befindet sich unter einem Phase-I-klinischen Versuch in Patienten, die an rekurrentem Prostatakrebs leiden. Zusätzlich wurden bereits einige Versuche unternommen, um potentere Prostatakrebs-spezifische replikative Adenoviren zu entwickeln. Beispielsweise kann die Expression der beiden frühen Gene, E1A und E1B, des Adenovirus gemäß des Expressionsniveaus von PSA durch zusätzliches Einführen einer prostataspezifischen Enhancerregion stromaufwärts von dem E1B-Gen, welches eines der frühen Gene des Adenovirus ist, reguliert werden (Yu, D. C. et al., 'Identification of the transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2 and their use in the construction of cyldon virus 764, an attenuated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy'. Cancer Res., 1999, 1, 59 (7), 1498–504). Weiterhin wurde durch den Einsatz von Promotoren von Genen, die nur in speziellen Tumorzellen aktiviert waren, wie Alphafetoprotein (AFP), carcinoembryonales Antigen (CEA) und MUC-1, tumorspezifische replikationskompetente Adenoviren entwickelt (Kanai, F. et al., 'Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirusmediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene'. Hepatology, 1996, 53, 963–7; Marshall, J. F. et al., 'Tissue specific promotors in targeting systemically delivered gene therapy'. Semin. Oncol., 1996, 23, 154–8; Osaki, T. et al., 'Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene'. Cancer Res., 1994, 54, 5258–61; Kurihara, T. et al., 'Selectivity of a replicationcompetent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen'. J. Clin. Invest, 2000, 106, 763–71).
  • Bei der zweiten Strategie zur Entwicklung von tumorspezifischen replikationskompetenten Adenoviren wurden einige Versuche unternommen, tumorspezifische replikationskompetente Adenoviren durch selektives Knock-out von adenoviralen Genen zu entwickeln, die für eine aktive virale Replikation in normalen Zellen essenziell sind, jedoch in Tumorzellen nicht essenziell sind (Whyte, P. et al., 'Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins'. Cell, 1989, 56, 67–75; Fueyo, J. et al., 'A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo'. Oncogen, 2000, 19, 2–12). Bischoff, J. R. et al. berichteten zuerst im Jahre 1996, dass eine Adenovirusmutante, der das adenovirale frühe Protein E1B-55 kD fehlt, das an das Tumorsuppressorprotein p53 bindet und es dann inaktiviert, in der Lage ist, selektiv in p53-defizienten Tumorzellen zu replizieren. Wenn ein Wildtyp-Adenovirus normale Zellen infiziert, hemmen die infizierten Zellen die virale Proliferation durch Aktivierung des Tumorsuppressorproteins p53. Das E1B-55 kD-Protein ist für die p53-Aktivierung verantwortlich, welches an p53 bindet und seine Funktion hemmt. Als Ergebnis proliferiert das Wildtyp-Adenovirus aktiv in den normalen Zellen und zerstört gegebenenfalls die Zellen (Yew, P. R. et al., 'Adenovirus E1B oncoprotein tethers a transcriptional repression domain to p53'. Genes, 1994, 8, 190–202; Dobner, T. et al., 'Blockage by adenovirus E4 oder F6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor'. Science, 1996, 7, 272 (5267), 1470–3). Allerdings wird, wenn das E1B-55 kD-Gen-deletierte rekombinante Adenovirus normale Zellen infiziert, die virale Proliferation gehemmt, da die p53-Inaktivierung nicht induziert ist, wohingegen das Virus aktiv in mehreren Tumorzellen proliferiert, in denen die Funktion von p53 gehemmt ist, und löst gegebenenfalls den Zelltod der infizierten Zellen aus. Auf der Grundlage dieser Tatsache entwickelten die vorliegenden Erfinder das E1B–55 kD-Gen-deletierte tumorspezifische zytolytische Adenovirus YKL-1, von dem gezeigt wurde, dass es den herkömmlichen Adenoviren der ersten Generation überlegen ist, d. h. replikationsdefizient in der Transfektionseffizienz ist. YKL-1 besitzt auch eine onkolytische Wirkung gegen mehrere humane Tumorzellen (Lee, H. et al., 'Oncolytic potential of E1B55 kDa-deleted YKL-1 recombinant adenovirus: Correlation with p53 functional status'. Int. J. Cancer, 2000, 88, 454–63).
  • Zusätzlich zur Inaktivierung von p53 stimuliert das E1B55 kD-Protein den Transport der Adenovirus-mRNA in das Zytosol und synthetisiert die zusammengesetzten Proteine von Adenovirus, und ist somit für die Replikation der Adenoviren essenziell. Darum ist das E1B55 kD-Gen-deletierte replikationskompetente Adenovirus in Tumorzellen proliferationseingeschränkt und weist somit eine herabgesetzte Zytotoxizität auf, was zu einer verminderten in-vivo-Antitumor-Wirksamkeit führt. Um dieses Problem zu lösen, konstruieren die vorliegenden Erfinder ein Ad-ΔE1B19-Adenovirus, der um das Adenovirus-E1B19 kD-Gen deletiert ist, dessen Translationsprodukt eine Hemmung der Apoptose bewirkt, und haben gezeigt, dass das Ad-ΔE1B19-Adenovirus eine stark erhöhte zytolytische Wirkung und eine In-vivo-Antitumor-Wirkung besitzt (Kim, J. et al., 'Evaluation of E1B gene attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy'. Cancer Gene Therapy, 2002, 9, 725–736). Allerdings ist in diesem Fall das E1B55 kD-Gen nicht deletiert, um eine wirksame Replikation des Adenovirus zu erreichen. Der Zelltod wird durch die erhöhte Adenovirus-Replikation verstärkt, jedoch geht die tumorspezifische Replikationsaktivität verloren. Somit ist das Ad-ΔE1B19-Adenovirus erforderlich, damit eine Tumorspezifität zur Verwendung bei der Krebsbehandlung mittels Gentherapie vorliegt.
  • Die humane Telomer-reverse-Transkriptase(hTERT) ist eine Untereinheit des Telomerase-Holoenzyms, das an der gleichmäßigen Aufrechterhaltung der Telomer-Länge während der Chromosomenreplikation beteiligt ist, und von dem bekannt ist, dass es mit der Zellalterung, Tumorgenese und Zellimmortalisation zusammenhängt (Counter, C. M. et al., 'Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cell which express telomerase activity'. EMBO J. 1992, 11, 1921–29; Kim, N. W. et al., 'Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer'. Science, 1994, 21, 66, 2011–5; Harley, C. B. et al., 'Telomeres shorten during aging of human fibroblasts'. Nature, 1990, 345, 458–60). Die Telomeraseaktivität wird in Keimbahnzellen und Lymphozyten in humanen Eierstöcken und in den Hoden nachgewiesen, jedoch nicht in normalen somatischen Zellen gefunden (Wright, W. E. et al., 'Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.' Dev. Genet. 1996, 18, 173–9). Darum besitzen normale somatische Zellen Telomeren unterhalb einer Schwellenlänge nach einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen und zeigen gegebenenfalls einen Seneszenz (Yasumoto, S. et al., 'Telomerase activity in normal human epithelial cells'. Oncogene, 1996, 13, 433–9). Im Gegensatz dazu ist die Telomeraseaktivität in gutartigen Tumorzellen vor der Tumorprogression und in Krebszellen erhöht (Broccoli, D. et al., 'Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells'. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9082–6). Nach dem ersten Bericht darüber, dass die Telomeraseaktivität bei Eierstockkrebs erhöht ist, wurde eine erhöhte Telomeraseaktivität in fast allen humanen Krebsarten, einschließlich Blutkrebs, Magenkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Dickdarmkrebs, Hirnkrebs, Prostatakrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Brustkrebs nachgewiesen (Counter, C. M. et al., 'Telomerase activity in human ovarian carcinoma'. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1994, 91, 2900–4; Counter, C. M. et al., 'Stabilization of short telomeres and telomeres activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes'. J. Virol., 1994, 68, 3410–4; Shay, J. W. et al., 'A survey of telomerase activity in human cancer'. Eur. J. Cancer, 1997, 33, 787–91; Harle-Bachor, C. et al., 'Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes'. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 6476–81).
  • Die Expression von hTERT, die eine kritische Rolle bei der Telomerase-Funktion spielt, hängt mit der Telomerase-Aktivität zusammen. Neuere Daten legen nahe, dass die Telomerase-Expression gemäß der Aktivität des hTERT-Promotors reguliert wird, d. h. gemäß des mRNA-Niveaus von hTERT. Die minimale hTERT-Promotor-Region zur Regulierung der hTERT-Aktivität ist 181 bp lang. Der hTERT-Wildtyp-Promotor enthält zwei c-Myc-Bindungsstellen und fünf Sp1-Bindungsstellen. Gemäß einigen Berichten bindet das c-Myc-Onkoprotein, das in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen stark exprimiert ist, an den Transkriptionsfaktor Sp1. Diese Bindung aktiviert den hTERt-Promotor. Takakura M. et al. berichteten im Jahre 1999, dass die Aktivität des hTERT-Promotors durch Überexpression von c-Myc erhöht ist (Cerni, C., 'Telomeres, teolomerase, and myc'. An update, Mutat. Res., 2000, 462, 31–47; Greenberg, R. A. et al., 'Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation'. Oncogene, 1999, 18, 1219–26; Takakura, M. et al., 'Cloning of human telomerase reverse transcriptase gene promotor and identification of proximal core promotor essential for transcriptional activation of hTERT in immortalized and cancer cells'. Cancer Res., 1999, 59, 551–9).
  • Wie von Shoji K. et al. beschrieben, können Apoptose-induzierende toxische Gene, wie Caspase-8, nur in Tumorzellen durch Induktion der Expression von Krebszellenspezifischen Genen unter Verwendung des hTERT-Promotors exprimiert werden (Shoji, K. et al., 'A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promotor'. Human Gene Therapy, 2000, 11, 1397–406). Allerdings ist bei der Verwendung des hTERt-Promotors allein das Erreichen einer ausreichenden Tumorspezifität eingeschränkt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, stellen die vorliegenden Erfinder eine Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen humanen Telomer-reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine c-Myc-Bindungsstelle und/oder eine Sp1-Bindungsstelle umfasst, und konstruierten dann einen rekombinanten Vektor, insbesondere einen rekombinanten adenoviralen Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz trägt.
  • Bei einem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst.
  • Bei einem zweitem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der ein bestimmtes Gen umfasst, das mit der Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft ist.
  • Bei einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Verbindung eine Wirtszelle bereit, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert oder transfiziert ist.
  • Bei noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die (a) eine therapeutisch wirksame Menge des rekombinanten Vektors und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die obigen und weitere Ziele, Merkmale und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
  • 1 die Nukleotidsequenz eines m-hTERT-Promotors gemäß einer Ausführungsform für eine Transkriptionsregulationssequenz der vorliegenden Erfindung;
  • 2A eine schematische Karte der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren di-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • 2B eine schematische Karte der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 3 ein Graph, der die relative Aktivität von endogener Telomerase in verschiedenen Tumorzelllinien und normalen Zelllinien zeigt;
  • 4 eine Fotografie, die Expressionsmuster eines LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Tumorzelllinien und normalen Zelllinien zeigt;
  • 5A ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (H460) zeigt;
  • 5B ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (A549) zeigt;
  • 5C ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (C33A) zeigt;
  • 5D ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (SK-Hep1) zeigt;
  • 5E ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (HepG2) zeigt;
  • 5F ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (Hep3B) zeigt;
  • 5G ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (U343) zeigt;
  • 5H ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (U251N) zeigt;
  • 5I ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie (MCF7) zeigt;
  • 5J ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (173WE) zeigt;
  • 5K ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (CBHEL) zeigt;
  • 5L ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (MRC5) zeigt;
  • 5M ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (IMR90) zeigt;
  • 5N ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (WI38) zeigt;
  • 5O ein Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z (∎), dl-TERT-Z (o) und dl-mTERT-Z (Δ) gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie (BJ) zeigt;
  • 6 zeigt Expressionsmuster eines E1-Gens der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-mTERT-Δ19, Ad-TERT-Δ19 und Ad-ΔE1B19 gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Tumorzelllinien und normalen Zelllinien (1: C33A, 2: A549, 3: HeLA, 4: SK-Hepl; 5: W138, 6: BJ und 7: IMR90);
  • 7A zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie SK-Hep1 (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7B zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie H460 (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7C zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie C33A (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7D zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie U251N (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7E zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie A549 (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7F zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie (HeLa) (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7G zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie (BJ) (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7H zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie (W138) (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 7I zeigt die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Tumorzelllinie (IMR90) (1: dl-CMV-Z, 2: Ad-ΔE1B19, 3: Ad-TERT-Δ19 und 4: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8A einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (SK-Hep1) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8B einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (H460) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8C einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (C33A) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8D einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (U251N) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8E einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (A549) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8F einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (HeLa) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8G einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (BJ) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8H einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (W138) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 8I einen Graph, der die Ergebnisse der quantitativen Analyse der onkolytischen Wirkung auf die Tumorzelllinie (IMR90) zeigt, die mit den replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert ist (∎: dl-CMV-Z, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 9 einen Graph, der die onkolytische Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung auf Nacktmäuse mit entwickelten Tumoren zeigt (∎: PBS, ☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19 und Δ: Ad-mTERT-Δ19);
  • 10A, 10B und 10C Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen normalen In-vivo-Geweben;
  • 11A die Expressionsmuster des LacZ-Gens der replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z gemäß der vorliegenden Erfindung in In-vivo-Tumorgeweben;
  • 11B LacZ-Gen-Expressionionsmuster in der Leber von Mäusen, denen intratumoral die replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektoren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wurden;
  • 12A ein Graph, der die viralen Produktionsausbeuten der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung in der Tumorzelllinie HeLa zeigt (o: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19, Δ: Ad-mTERT-Δ19 und ∎: dl-CMV-Z);
  • 12B einen Graph, der die viralen Produktionsausbeuten der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung in der normalen Zelllinie BJ zeigt (☐: Ad-ΔE1B19, o: Ad-TERT-Δ19, Δ: Ad-mTERT-Δ19 und ∎: dl-CMV-Z);
  • 13 Ergebnisse der Immunhistochemie zum Vergleich der Replikationsfähigkeit in Tumorgeweben der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • 14 Ergebnisse der Hämatoxylin-Eosin-Färbung zum Vergleich der Toxizität auf normale Leber der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B9 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • 15A einen Graph, der die Maus-Überlebensfähigkeit je nach verabreichter Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intravenös verabreicht wurden;
  • 15B einen Graph, der die Maus-Überlebensfähigkeit je nach der verabreichten Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intraperitoneal verabreicht wurden;
  • 15C einen Graph, der die Maus-Überlebensfähigkeit je nach der verabreichten Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intratumoral verabreicht wurden,
  • 16A eine Fotografie, die die Toxizität gegenüber normalen Geweben je nach verabreichter Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intravenös verabreicht wurden,
  • 16B eine Fotografie, die die Toxizität gegenüber normalen Geweben je nach verabreichter Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intraperitoneal verabreicht wurden;
  • 16C eine Fotografie, die die Toxizität gegenüber normalen Geweben je nach verabreichter Menge der replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektoren Ad-ΔE1B19 und Ad-mTERT-Δ19 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wenn die adenoviralen Vektoren intratumoral verabreicht wurden.
  • Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen humanen Telomer-reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst. Unter einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine einzige c-Myc-Bindungsstelle und/oder fünf Sp1-Bindungsstellen umfasst.
  • Typischerweise geben transkriptionsregulatorische Sequenzen sämtliche Sequenzen an, die die Transkription von Genen regulieren, die in funktionsfähiger Weise damit verknüpft sind, wie Promotoren und Enhancer. Allerdings werden bei der vorliegenden Beschreibung die Transkriptionsregulationssequenzen vorzugsweise als Promotoren verwendet und sollten somit nebeneinander liegen, um die Transkription eines bestimmten Gens zu regulieren. Ein m-hTERT-Promotor wird als ein Aspekt der Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
  • Bei der vorliegenden Erfindung ist, am stärksten bevorzugt, der hTERT-Promotor ein hTERT-Promotor vom Wildtyp (SEQ ID NO: 1), der sich von einem humanen Genom ableitet. Ebenfalls kann als der hTERT-Promotor von einem Säuger abgeleiteter TERT(Telomer-reverse-Transkriptase)-Promotor oder mutierter TERT-Promotor, der insoweit künstlich synthetisiert ist, dass seine biologischen Funktionen aufrechterhalten werden, verwendet werden. Der Begriff "biologische Funktionenaufrechterhaltender Funktionsbereich" bezieht sich auf einen Zustand, wobei das onkogene c-Myc-Protein und das Sp1-Protein sowie RNA-Polymerase an jeden TERT-Promotor binden können und der in der Lage ist, die Expression eines bestimmten Gens auszulösen, das in funktionsfähiger Weise mit dem TERT-Promotor verknüpft ist. Beispielsweise kann die endogene c-Myc-Bindungsstelle oder die Sp1-Bindungsstelle in dem hTERT-Promotor durch andere c-Myc- oder Sp1-Bindungsstellen ersetzt sein, die im Fachgebiet bekannt sind.
  • Andererseits kann der hTERT-Promotor leicht durch ein im Fachgebiet bekanntes Verfahren, beispielsweise durch die Durchführung einer PCR unter Verwendung eines humanen Genoms als Matrize mit geeigneten Primern oder durch Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (im Handel von den Firmen BioSearch, Applied Biosystems etc. erhältlich) hergestellt werden.
  • Die "c-Myc-Bindungsstelle" ist ein Oligonukleotid, an das das onkogene c-Myc-Protein bindet, und umfasst die Konsensus-Sequenz von cacgtg (SEQ ID NO: 2). Sämtliche bekannten Sequenzen, an die das onkogene c-Myc-Protein bindet, können in die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Eine Vielzahl von c-Myc-Bindungsstellen ist identifiziert, die beispielsweise cacgcg (SEQ ID NO: 3) und catgcg (SEQ ID NO: 4) umfassen.
  • Des Weiteren ist die "Sp1-Bindungsstelle" ein Oligonukleotid, an das das onkogene Sp1-Protein bindet, und umfasst die Konsensus-Sequenz von gggcgg (SEQ ID NO: 5). Sämtliche bekannten Sequenzen, an die das onkogene Sp1-Protein bindet, können in die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Eine Vielzahl von Sp1-Bindungsstellen sind identifiziert, die beispielsweise umfassen ccgccc (SEQ ID NO: 6), ctccgcctc (SEQ ID NO: 7), cccagcccc (SEQ ID NO: 8), gggcgg (SEQ ID NO: 5), ggggcgg (SEQ ID NO: 9) und cccccgcccc (SEQ ID NO: 10) umfassen.
  • Wie hier verwendet, ist der Begriff "Konsensus-Sequenz" eine Nukleotidsequenz, die zur Definition einer Familie von Sequenzen verwendet wird, die nicht identisch, jedoch miteinander verwandt sind. Jede Position in der Konsensus-Sequenz zeigt das Nukleotid, das am häufigsten an der Position innerhalb der Familie vorkommt.
  • In der Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Nukleotidsequenz, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, mit einem 5'-Ende- oder einem 3'-Ende des hTERT-Promotors verknüpft sein oder in den hTERT-Promotor innerhalb des die biologischen Funktionen aufrechterhaltenden Bereichs eingebracht werden. Allerdings ist bei der vorliegenden Erfindung die Nukleotidsequenz, die eine c-Myc-Bindungsstelle und/oder eine Sp1-Bindungsstelle umfasst, vorzugsweise mit einem 3'-Ende des hTERT-Promotors verknüpft. Andererseits wird die Verknüpfung des hTERT-Promotors mit der Nukleotidsequenz, die eine c-Myc-Bindungsstelle und/oder eine Sp1-Bindungsstelle umfasst, durch Ligation an zweckmäßige Restriktionsenzymstellen erreicht. Im Falle, dass die Restriktionsenzymstellen nicht vorhanden sind, wird ein synthetischer Oligonukleotidadaptor oder -linker nach einem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren verwendet.
  • Da die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung es erlaubt, dass ein bestimmtes Gen damit zweckmäßigerweise verknüpft ist, um mit hoher Wirksamkeit auf eine Tumorzellen-spezifische Weise exprimiert zu werden, kann sie in einem Vektor verwendet werden, der im Allgemeinen als ein Genvehikel für die Krebstherapie eingesetzt wird. Vorliegend umfasst der Vektor virale Vektoren und nicht-virale Vektoren.
  • Daher stellt, unter einem Aspekt, die vorliegende Erfindung einen rekombinanten viralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem für die virale Replikation erforderlichen Gen in funktionsfähiger Weise verknüpft ist. Der virale Vektor wird in Tumorzellen oder normale Zellen eingebracht, repliziert sich selbst in einer Krebszelt-spezifischen Weise und tötet gegebene Tumorzellen mit hoher Wirksamkeit ab. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung, unter einem anderen Aspekt, einen rekombinanten viralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem therapeutischen Transgen in funktionsfähiger Weise verknüpft ist. Der virale Vektor schließt sowohl replikationsdefiziente als auch replikationskompetente ein. Nach Einbringen in Tumorzellen oder normale Zellen kann der replikationsdefiziente rekombinante virale Vektor den Krebs durch spezifische Expression des therapeutischen Transgens in der Tumorzelle behandeln. Im Gegensatz dazu kann der replikationskompetente rekombinante virale Vektor eine zusätzliche Antitumorwirkung aufweisen, in dem er sowohl durch virale Replikation als auch durch Expression des therapeutischen Transgens zytolytische Wirkungen zeigt. Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten nicht-viralen Vektor bereit, der eine Transkriptionsregulationssequenz einschließt, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem therapeutischen Transgen in funktionsfähiger Weise verknüpft ist. Nach Einbringen in Tumorzellen oder normale Zellen kann der nicht-virale Vektor den Krebs durch spezifische Expression des therapeutischen Transgens spezifisch in den Tumorzellen behandeln.
  • Vorliegend wird der Begriff "Virus" austauschbar mit "viraler Vektor" verwendet und bezieht sich auf jeden obligaten intrazellulären Parasiten ohne Proteinsynthese- oder Energieerzeugungs-Mechanismen. Das virale Genom besteht aus RNA oder DNA, umgeben von einer Lipid-Doppelschicht-Hüllstruktur, die aus Proteinen besteht. Beispiele für das Virus, das bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfassen Baculoviridiae, Parvoviridiae, Picornaviridiae, Herpesviridiae, Poxviridae, Adenoviridiae und Picotrnaviridiae. Der Begriff "rekombinantes Virus" umfasst chimäre Viren (oder multimere Viren), die durch Einsatz entsprechender codierender Sequenzen konstruiert werden, die sich von einem oder mehreren Virus-Subtypen ableiten (Feng et al., Nature Biotechnology 15, 866–870).
  • Der Begriff "nicht-viraler Vektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf sämtliche Vektoren, die im Allgemeinen in der Gentherapie verwendet werden, mit Ausnahme der zuvor genannten viralen Vektoren. Beispiele für einen solchen nicht-viralen Vektor sind eine Vielzahl von Plasmiden, die in der Lage sind, in eukaryotischen Zellen und Liposomen exprimiert zu werden.
  • Der Begriff "in funktionsfähiger Weise verknüpft", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verknüpfung von Polynukleotidsequenzen in einer funktionsfähigen Beziehung. Eine Nukleotidsequenz ist "in funktionsfähiger Weise verknüpft", wenn sie in eine funktionale Beziehung mit einer anderen Nukleotidsequenz gebracht wird. Bei der vorliegenden Erfindung ist eine Transkriptionsregulationssequenz mit einer codierenden Sequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft, wenn sie die Transkription der codierenden Sequenz beeinflusst.
  • Der Ausdruck "Gene, die zur viralen Replikation erforderlich sind", wie hier verwendet, bezieht sich auf sämtliche Gene, die virales Genom umfassen, die in "frühe Gene" und "späte Gene" klassifiziert sind. Die frühen Gene sind virale Gene, die in der frühen Phase der viralen Proliferation beginnen exprimiert zu werden, bis die Replikation des viralen Genoms stattfindet, und sind an der Replikation des viralen Genoms beteiligt. Unter den frühen Genen sind einige, die in RNA-Moleküle unter Verwendung des Wirtssystems transkribiert werden, wohingegen andere nicht transkribiert werden, wenn einige frühe Genprodukte nicht zuvor produziert worden sind. Wie vorstehend beschrieben, erfolgt durch die frühen Genen eine graduelle Informationsexpression, und insbesondere Gene, die durch Wirtsenzyme unmittelbar nach der Infektion transkribiert werden, werden auch "sehr frühe Gene" genannt. Die späten Gene sind virale Gene, die exprimiert werden, nachdem die Replikation des viralen Genoms ausgelöst wurde, wenn ein Virus eine Wirtszelle infiziert. Die späten Gene bestimmen die Struktur der äußeren Hüllproteine.
  • Der Begriff "therapeutisches Transgen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in Tumorzellen therapeutische Wirkungen erzeugt. Der Begriff therapeutisches Transgen umfasst, ist jedoch nicht begrenzt auf Tumorsuppressorgene, Chemokingene, Cytokingene, antigene Gene, zytotoxische Gene, zytostatische Gene, apoptotische Gene und anti-angiogene Gene.
  • Der Begriff "Tumorsuppressorgen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zielzelle in der Lage ist, den neoplastischen Phänotyp zu unterdrücken oder eine Apoptose auszulösen. Beispiele für die Tumorsuppressorgene, die zur Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen das p53-Gen, Rb-Gen, APC-Gen, DPC-4/Smad4-Gen, BRACH-1-Gen, BRCA-2-Gen, WT-1-Gen, Retinoblastomagen (Lee et al., Nature, 1987, 329 (642), MMAC-1 gene, adenomatous polyposis coli Protein (Albertsen et al., US-Patenschrift Nr. 5 783 666 ); deleted in colon carcinoma (DCC) gene, MMSC-2-Gen, NF-1-Gen, das nasopharyngeale Karzinom-Tumorsuppressor-Gen, das bei Chromosom 3p21.3 kartiert wird (Cheng et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 1998, USA 95, 3042–3047), das MTS1-Gen, CDK4-Gen, NF-1-Gen, NF-2-Gen und VHL-Gen.
  • Der Begriff "antigene Gene", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zielzelle zur Produktion eines Zelloberflächen-antigenen Proteins führt, das durch das Immunsystem erkannt werden kann. Beispiele antigener Gene umfassen karzinoembryonales Antigen (CEA), Prostata-spezifisches Antigen (PSA), α-Fetoprotein (AFP), p53 (Levine, A., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/02167 ). Um die Immunerkennung zu erleichtern, kann das antigene Gen mit dem MHC-Klasse-1-Antigen fusioniert sein.
  • Der Begriff "zytotoxisches Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle eine toxische Wirkung erzeugt. Beispiele für die zytotoxischen Gene umfassen Nukleotidsequenzen, die Pseudomonas-Exotoxin, Ricintoxin, Diphtherietoxin und dergleichen codieren.
  • Der Begriff "zytostatisches Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle einen Stopp im Zellzyklus hervorruft. Beispiele für die zytostatischen Gene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf p21, Retinoblastomgen, E2F-Rb-Fusionsproteingen, Gene, die Cyclin-abhängige Kinaseinhibitoren codieren, wie p16, p15, p18 und p19, Wachstumstope-spezifisches Homeobox (GAX)-Gen (internationale Patentveröffentlichungen Nrn. WO 97/16459 und WO 96/30385 ).
  • Der Begriff "Zytokingen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle ein Zytokin erzeugt. Beispiele für die Zytokine umfassen GM-CSF, Interleukine (speziell IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19 und IL-20), Interferon α-, β- und γ-Subtypen (insbesondere Interferon α-2b) und Fusionen, wie Interferon α-2α-1.
  • Der Begriff "Chemokingen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Gruppe strukturell verwandter niedermolekularer Zytokine, die von Zellen mit mitogener, chemotaktischer oder inflammatorischer Aktivität sezerniert werden. Sie sind primär kationische Proteine von 70 bis 100 Aminosäureresten, denen vier konservierte Cysteinreste gemeinsam sind. Diese Proteine können auf der Grundlage des Abstandes der beiden Amino-terminalen Cysteinreste in zwei Gruppen eingeteilt werden. In der ersten Gruppe sind die beiden Cysteinreste durch einen einzigen Rest getrennt (Cys-x-Cys), während in der zweiten Gruppe sie nebeneinander liegen (Cys-Cys). Beispiele für Proteine, die der "Cys-x-Cys"-Chemokingruppe angehören, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Plättchenfaktor 4 (PF4), plättchenbasisches Protein (PBP), Interleukin-8 (IL-8), Melanomwachstumstimulatorisches Aktivitätsprotein (MGSA), Makrophagen-inflammatorisches Protein 2 (MIP-2), Maus-Mig (m119), Hühner 9E3 (oder pCEF-4), Schweine-alveolare Makrophagen-chemotaktische Faktoren I und II (AMCF-I und -II), Prä-B-Zellen-Wachstums-stimulierender Faktor (PBSF) und IP10 Beispiele für Proteine, die der "Cys-Cys"-Gruppe angehören, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Monozyten-chemotaktisches Protein 1 (MCP-1), Monozyten-chemotaktisches Protein 2 (MCP-2), Monozyten-chemotaktisches Protein 3 (MCP-3), Monozytenchemotaktisches Protein 4 (MCP-4), Makrophagen-inflammatorisches Protein 1α (MIP-1α), Makrophagen-inflammatorisches Protein 1β (MIP-1β), Makrophageninflammatorisches Protein 1γ (MIP-1γ), Makrophagen-inflammatorisches Protein 3α (MIP-3α), Makrophagen-inflammatorisches Protein 3β (MIP-3β), Chemokin (ELC), Makrophagen-inflammatorisches Protein 4 (MIP-4), Makrophagen-inflammatorisches Protein 5 (MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-epsilon (p500), Thymus- und Aktivierungsreguliertes Chemokin (TARC), Eotaxin, I-309, humanes Protein HCC-1/NCC-2, humanes Protein HCC-3 und Mausprotein C10.
  • Der Begriff "proapoptisches Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression zum programmierten Zelltod der Zelle führt. Beispiele für die pro-apoptotischen Gene umfassen p53, Adenovirus (Ad) E3-11.6K (leitet sich von Ad2 und Ad5 ab) oder Adenovirus E3-10.5K (leitet sich von Ad ab), Adenovirus E4-Gen, Fas-Ligand, TNF-α, TRAIL, p53-Pathway-Gene und Gene, die Caspasen codieren.
  • Der Begriff "antiangiogenes Gen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression zur extrazellulären Sekretion von antiangiogenischen Faktoren führt. Antiangiogenese-Faktoren umfassen Angiostatin, Inhibitoren des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), wie Tie 2 (Proc. Nat'l. Acac. Sci. USA, 1998, 95, 8795–8800) und Endostatin.
  • Wie vorstehend beschrieben, kann die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in einen viralen Vektor oder einen nicht-viralen Vektor eingebracht werden, die im Allgemeinen als Genvehikel verwendet werden. Allerdings wird ein adenoviraler Vektor als ein geeignetes Genvehikel anerkannt und wird praktisch bereits zunehmend verwendet. Aus diesem Grund ist die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, um in einen adenoviralen Vektor eingebracht zu werden. Darum stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten adenoviralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem therapeutischen Transgen funktionsfähig verknüpft ist.
  • Der Begriff "replikationskompetenter adenoviraler Vektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen adenoviralen Vektor, bei dem Gene, die zur Replikation essenziell erforderlich sind, konserviert sind, und mit dem Krebs behandelt werden kann, indem er in Tumorzellen repliziert wird und gegebenenfalls die Tumorzellen abtötet. Ferner bezieht sich der Begriff "replikationsdefizienter adenoviraler Vektor" auf einen adenoviralen Vektor, dessen Gene deletiert sind, die im Wesentlichen zur Replikation erforderlich sind, insbesondere bei der frühen Phase der Infektion erforderlich sind. Der replikationsdefiziente adenovirale Vektor umfasst hauptsächlich ein therapeutisches Gen und mit diesem kann Krebs durch Expression des therapeutischen Gens in Tumorzellen behandelt werden. Allerdings umfasst, wie vorstehend beschrieben, die vorliegende Erfindung einen viralen Vektor, der ein therapeutisches Transgen umfasst, und der auch replikationskompetent ist. Das heißt, bei der vorliegenden Beschreibung bezieht sich "replikationsdefizienter adenoviraler Vektor" auf einen replikationsdefizienten adenoviralen Vektor, der als ein Aspekt des adenoviralen Vektors, der ein therapeutisches Transgen umfasst, vorgesehen ist.
  • Wie hier verwendet, werden die Begriffe "Adenovirus" und "adenoviraler Vektor" austauschbar verwendet und beziehen sich auf Viren, die der Gattung Adenoviridae angehören. Der Begriff "Adenoviridae" bezieht sich kollektiv auf tierische Adenoviren der Gattung Mastadenovirus, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, die Subgattungen human, bovin, ovin, equin, canin, porcin, murin und simian. Insbesondere umfassen humane Adenoviren die A-F-Subgattungen, sowie die individuellen Serotypen davon. Die A-F-Subgattungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die humanen Adenovirus-Typen 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad 11A und Ad 11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 und 91. Unter einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung leitet sich das Adenovirus von einem humanen Adenovirus des Serotyps 2 oder 5 ab.
  • Das adenovirale Genom unterscheidet sich etwas je nach den adenoviralen Serotypen, allerdings besteht es typischerweise aus den frühen Genen E1A, E1B, E2, E3 und E4 und den späten Genen L1, L2, L3, L4 und L5. In den frühen Genen wird das E1A-Gen vor den anderen viralen Genen unmittelbar nach der viralen Infektion (0–2 h) exprimiert. Das E1A-Protein dient als Transkriptionsregulationsfaktor und ist im Wesentlichen zur Expression von weiteren frühen Genen erforderlich. Die Deletion des E1A-Gen führt zu keiner Produktion von Genprodukten, die zur viralen DNA-Replikation benötigt werden und führt gegebenenfalls zu keiner weiteren Infektion. Das E1B-Protein ist für den Transport der mRNA-Transkripte der späten Gene in das Zytosol aus dem Nukleus essenziell. Eine defiziente E1B-Expression führt zu einer schwachen Expression der viralen späten Gene und zum unvollständigen Blockieren der Proteinsynthese der Wirtszellen. Das E4-Gen codiert mehrere transkriptionale Produkte. Die offenen Leseraster (ORFs) 3 und 6 der transkriptionalen Einheit E4 erhöhen die Akkumulation der mRNAs der späten Haupttranskriptionseinheit durch Binden an das E1B-55 kD-Protein und an das E2F-1/DR-1-Heterodimer. Im Falle von Läsionen in beiden Proteinen der E4-ORFs 3 und 6 bilden die mutanten Viren Plaques mit einer Effizienz von weniger als 10–6 im Vergleich zu derjenigen des Wildtyp-Virus. Die späten Gene, einschließlich L1, L2, L3, L4 und L5 codieren die Strukturproteine des Adenovirus.
  • Sowohl frühe als auch späte Gene sind zur wirksamen Replikation des Adenovirus erforderlich. Darum umfasst unter einem Aspekt die vorliegende Erfindung einen adenoviralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem oder mehreren Genen der frühen Gene und späteren Gene des Adenovirus in funktionsfähiger Weise verknüpft ist. Insbesondere, unter den frühen und späten Genen, da die frühen Gene an der Replikation des viralen Genoms beteiligt sind, stellt in einem bevorzugten Aspekt die vorliegende Erfindung einen adenoviralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der an eine Nukleotidsequenz gebunden ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem oder mehreren Genen der frühen Gene des Adenovirus in funktionsfähiger Weise verknüpft ist. Unter den frühen Genen dient insbesondere das E1A-Gen als ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von weiteren viralen Genen auslöst und somit das wichtigste Element bei der viralen Replikation ist. Darum stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten adenoviralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem Adenovirus-E1A-Gen in funktionsfähiger Weise verknüpft ist.
  • Der rekombinante adenovirale Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem Gen verknüpft ist, das zur adenoviralen Replikation gemäß der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, wird in Telomerase enthaltende Tumorzellen eingebracht, die in Gegenwart des c-Myc-Onkoproteins oder des Sp1-Proteins aktiviert wird, proliferiert sich selbst mit hoher Wirksamkeit und tötet gegebenenfalls die Tumorzellen ab. Im Gegensatz dazu ist im Falle des Einbringens in normale Zellen der adenovirale Vektor kaum in der Lage zu proliferieren und beeinflusst somit die normalen Zellen nicht.
  • Unter einem stärker bevorzugten Aspekt, der an einem rekombinanten adenoviralen Vektor mit der Auswirkung des Abtötens von Tumorzellen durch virale Replikation beteiligt ist, wird ein rekombinanter adenoviraler Vektor mit einer Deletion in dem Gen E1B-19 kD verwendet. Das E1B-19 kDa-Protein, das ein potenter Apoptoseinhibitor ist, hemmt bekanntlich die durch das Adenovirus-frühe Genprodukt E1A-Protein vermittelte Apoptose und hemmt auch die durch p53 in Tumorzellen induzierte Apoptose. Ebenfalls wird die funktionale Ähnlichkeit zwischen E1B-19 kDa und Bcl-2 insofern festgestellt, dass beide die Apoptose unterdrücken, die durch die Wachstumsfaktorentfernung, durch Radiotherapie oder Antitumormittel ausgelöst wird. Darum besitzt ein E1B-19 kD-Gen-deletiertes rekombinantes Adenovirus eine ausgezeichnete Tumorzellabtötungswirkung und eine breite onkolytische Wirkung auf umgebende Tumorzellen durch Auslösen von Zelllyse durch virale Proliferation sowie Apoptose in Adenovirus-infizierten Zellen. Somit kann aufgrund seiner hochwirksamen Proliferation auf tumorzellspezifische Weise der rekombinante adenovirale Vektor beim selektiven Abtöten von Tumorzellen wirksamer sein.
  • Zusätzlich zum Vorliegen der Tumorzellabtötungswirkung durch die adenovirale Proliferation kann mit dem adenoviralen Vektor Krebs durch das Enthalten eines therapeutischen Transgens durch eine Gen-Klonierungstechnik und dadurch, dass er dann in Tumorzellen exprimiert wird, behandelt werden. Darum stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten adenoviralen Vektor mit einer Transkriptionsregulationssequenz bereit, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz funktionsfähig mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist. Das therapeutische Transgen wird mit hoher Wirksamkeit spezifisch in Tumorzellen exprimiert, wohingegen es nicht in der Lage ist, in normalen Zellen exprimiert zu werden und somit keine Zytotoxizität oder Nebenwirkungen in den normalen Zellen aufweist.
  • Das E1- oder E3-Gen des Adenovirusgenoms ist typischerweise deletiert und durch ein therapeutisches Transgen ersetzt. Darum stellt die vorliegende Erfindung einen replikationsdefizienten rekombinanten adenoviralen Vektor bereit, der die Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die auf funktionsfähige Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist, das anstelle des Adenovirus-E1-Gens eingebracht wurde. Dieser rekombinante adenovirale Vektor ist aufgrund der Deletion des E1-Gens, das für die virale Replikation essenziell ist, replikationsdefizient und kann einen Tumor durch Expression des therapeutischen Transgens behandeln. Des Weiteren stellt unter einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung einen replikationskompetenten rekombinanten adenoviralen Vektor bereit, der die Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die mit einem therapeutischen Transgen auf funktionsfähige Weise verknüpft ist, welches anstelle des Adenovirus-E3-Gens eingebracht wurde. Dieser rekombinante adenovirale Vektor ist zur Replikation in der Lage und besitzt somit eine additive Antitumorwirkung durch Aufweisen der zytolytischen Wirkungen sowohl durch virale Replikation als auch Expression des therapeutischen Transgens. Da jedoch Adenoviren mit Deletionen sowohl in den Genen E1 als auch E3 eine Gentransferwirksamkeit besitzt, die weitaus höher ist als bei anderen Vektoren, und Transgene in einem breiten Spektrum von Zelltypen exprimiert, ist unter einem bevorzugten Aspekt ein Adenovirus ein E1/E3-deletierter replikationsinkompetenter Adenovirus. Darum stellt die vorliegende Erfindung einen E1/E3-deletierten rekombinanten adenoviralen Vektor bereit, der die Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die auf funktionsfähige Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist, das anstelle des Adenovirus-E1A-Gens eingebracht wurde.
  • Zur großtechnischen Herstellung der zuvor genannten rekombinanten Vektoren sollte jeder rekombinante Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden. Darum stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit dem rekombinanten viralen Vektor transformiert oder transfiziert wurde. Die bevorzugten Verfahren zum Einbringen des Vektors in eine Wirtszelle umfassen beispielsweise Calciumphosphattransfektion, DAEA-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvection, Mikroinjektion, durch kationisches Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape-Loading, ballistische Einbringung und Infektion. Andererseits kann die Wirtszelle in Abhängigkeit von den rekombinanten Vektoren gewählt werden, und erwünschte Wirtszellen sind im Fachgebiet bekannt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter adenoviraler Vektor durch Konstruktion eines Shuttle-Vektors, der eine Transkriptionsregulationssequenz aufweist, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine c-Myc-Bindungsstelle oder eine Sp1-Bindungsstellung umfasst, Erhalten eines rekombinanten Adenovirus-Plasmids durch homologe Rekombination zwischen dem Shuttle-Vektor und einem adenoviralen Vektor und Transformieren oder Transfizieren einer geeigneten Zelle mit dem rekombinanten Adenovirus-Plasmid hergestellt.
  • Ein Plasmid, das zur Konstruktion des Shuttle-Vektors verwendet wird, der eine Transkriptionsregulationssequenz trägt, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine c-Myc-Bindungsstelle oder eine Sp1-Bindungsstelle umfasst, kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein, und ist im Fachgebiet bekannt oder im Handel erhältlich. Des Weiteren ist die Wirtszelle für ein rekombinantes Plasmid, welches zur Produktion eines rekombinanten Adenovirus verwendet wird, den Fachleuten wohl bekannt, und ein Beispiel ist die humane embryonale Nierenzelllinie 293 (E1A/B+), die mit einer Nukleotidsequenz nt 1–4344, die Ad5 codiert, transformiert wurde, und eine humane embryonale Retinoblastomzelle 911, die eine Nukleotidsequenz nt 79–5789 von Ad5 enthält.
  • Der rekombinante virale Vektor oder der nicht-virale Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine hoch wirksame Abtötungswirkung spezifisch gegen verschiedene Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen, welche die Telomerase auf hohem Niveau exprimieren, einschließlich Leberkrebs, Lungenkrebs, Zervikalkrebs und Hirnkrebs. Darum soll die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitstellen, die den rekombinanten viralen oder nicht-viralen Vektor als aktiven Bestandteil umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten viralen Vektors mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz mit einem Gen in funktionsfähiger Weise verknüpft ist, das zur viralen Replikation erforderlich ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Da der rekombinante virale Vektor, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten ist, wie vorstehend beschrieben, onkolytische Wirkungen gegen eine Vielzahl von Tumorzellen aufweist, ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Krankheiten und tumorverwandter Krankheiten geeignet, einschließlich Magenkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, bronchogener Krebs, Nasopharyngealkrebs, Laryngealkrebs, Pankreaskrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs und Zervikalkrebs.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Bereitung bereit, umfassend (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten viralen Vektors mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Da das therapeutische Transgen, das in den rekombinanten viralen Vektor eingebracht wird, in Tumorzellen exprimiert wird, ist eine solche pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Typen von Krebs geeignet, beispielsweise Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, Neuroblastom, Nierenzellkarzinom, Eierstockkrebs, Hirnkrebs, Kopf- und Nackenkrebs und Mesotheliom.
  • Gemäß einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt der zuvor genannten pharmazeutischen Zusammensetzung, ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor.
  • Darum stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten adenoviralen Vektors mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem Gen verknüpft ist, das zur viralen Replikation erforderlich ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten adenoviralen Vektors mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz funktionsfähig mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines nicht-viralen Vektors mit einer Transkriptionsregulationssequenz, die einen hTERT-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und/oder ein oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist; und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Der Begriff "Behandlung", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine vollständige Heilung, Suppression oder Linderung von Krankheiten oder Störungen. Darum bedeutet der Begriff "therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet, eine Menge, die ausreicht, um die obige pharmazeutische Wirkung zu erzielen.
  • Der pharmazeutisch verträgliche Träger, der in der vorliegenden Zusammensetzung enthalten ist, die im Allgemeinen in pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird, umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärke, Gummiarabikum, Kaliumphosphat, Arginat, Gelatine, Kaliumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirupe, Methylcellulose, Methylhydroxybenzoat, Propylhydroxybenzoat, Talk, Magnesiumstearat und Mineralöle. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann weiterhin ein Gleitmittel, ein Befeuchtungsmittel, ein Süßungsmittel, ein Aromastoff, einen Emulgator, ein Suspendiermittel und ein Konservierungsmittel umfassen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung der herkömmlichen Verfahren verabreicht werden, die im Allgemeinen in der Gentherapie verwendet werden und wird vorzugsweise parenteral verabreicht, d. h. durch intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder lokale Verabreichung. Beispielsweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung intraperitoneal verabreicht werden, um Eierstockkrebs zu behandeln, und intravenös verabreicht werden, um Leberkrebs zu behandeln, direkt in eine sichtbare Tumormasse injiziert werden, um Brustkrebs und Kopf- und Nackenkrebs zu behandeln, direkt als Einlauf injiziert werden, um Dickdarmkrebs zu behandeln und direkt in einen Katheter injiziert werden, um Blasenkrebs zu behandeln. Bei der vorliegenden Erfindung ist die intravenöse Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung oder Verabreichung in eine Tumormasse besonders bevorzugt.
  • Eine geeignete Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von den pharmazeutischen Formulierungsverfahren, Verabreichungsverfahren, dem Alter des Patienten, Körpergewicht des Patienten, dem Geschlecht des Patienten, den pathogenen Zuständen und der Diät des Patienten, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg und der Ausscheidungsrate und Empfindlichkeit gegenüber einer verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung variieren, und die Fachärzte können eine wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung zur gewünschten Behandlung bestimmen. Im Allgemeinen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung 1 × 105 bis 1 × 1015 PFU/ml eines rekombinanten Adenovirus, und 1 × 1010 PFU eines rekombinanten Adenovirus, der typischerweise alle zwei Tage über zwei Wochen injiziert wird.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, kann zu einer Dosierungseinheitsformulierung unter Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen Trägers und/oder Exzipienten oder zu einer Mehrdosisformulierung formuliert werden, indem sie in einen Mehrdosis-Behälter eingebracht wird. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Extrakten, in Pulver, Granulatkörnern, Tabletten oder Kapseln formuliert sein und kann weiterhin ein Dispergiermittel oder einen Stabilisator umfassen, und die pharmazeutische Zusammensetzung kann eine Lösung in Öl oder in wässrigen Medien, Suspensionen oder Emulsionen sein.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, kann allein oder in Kombination mit einer typischen Chemo- oder Radiotherapie verwendet werden. Eine solche Kombinationstherapie kann bei der Behandlung von Krebs wirksamer sein. Die für die Kombinationstherapie geeigneten chemotherapeutischen Mittel umfassen Cisplatin, Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Busulfan, Nitrosoharnstoff, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, Etoposid, Tamoxifen, Taxol, Transplatin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat. Beispiele für die Radiotherapie, die für die Kombinationstherapie geeignet ist, umfassen Röntgenbestrahlung und Gammabestrahlung.
  • Um die Stabilität bei Raumtemperatur zu erhöhen, die Notwendigkeit einer kostenintensiven Lagerung bei niedriger Temperatur herabzusetzen und die Lagerungsbeständigkeit zu erhöhen, kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die einen rekombinanten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, lyophilisiert werden. Ein Verfahren zum Gefriertrocknen kann die Schritte des Einfrierens, des ersten und zweiten Trocknens einschließen. Nach dem Einfrieren wird die Zusammensetzung unter Druck erwärmt, um Dampf zu verdampfen. In einem zweiten Trocknungsschritt wird Restwasser aus dem trockenen Produkt entfernt.
  • Bei einem Aspekt kann das Gefriertrocknen der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß den folgenden Schritten erreicht werden: (1) Bestimmung der Zerfallstemperatur der pharmazeutischen Zusammensetzung durch eine mikroskopische Gefriertrocknungsanalyse (Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm. 62, 165–186, 1990); (2) Stellen eines Röhrchens auf das Regal eines Gefriertrockners bei Raumtemperatur und sein anschließendes Äquilibrieren für etwa 30 min bei –1°C; (3) Abkühlen des Regals auf –55°C und anschließendes Halten bei –55°C für 2 h; (4) Durchführen einer ersten Trocknung bei etwa –32°C Produkttemperatur oder bei einer Temperatur, die 5°C unterhalb der Zerfallstemperatur liegt; (5) Durchführen einer zweiten Trocknung bei 35°C unter einem Druck von 55 bis 120 mmHg; und (6) Abdecken des Röhrchens mit dem Deckel unter Vakuumbedingung des Gefriertrockners und Aufbewahren bei 2 bis 8°C nach Bördelversiegelung.
  • Die gefriergetrocknete pharmazeutische Zusammensetzung kann einen Exzipienten und ein Lyoschutzmittel einschließen. Nicht einschränkende Beispiele für den Exzipienten umfassen eine Pufferlösung, die 0,9% NaCl und 10 mM Natriumphosphat (pH 7,0) oder 10 mM Natriumcitrat (pH 7,0) enthält. Das Lyoschutzmittel, wofür Beispiele PBS (pH 7,0) und PBS/4%, 12% oder 15% Trehalose sind, wirkt zum Schutz von biologischen Molekülen, die in der Zusammensetzung enthalten sind, während des Gefriertrocknens und zum Bereitstellen einer mechanischer Stabilisierung für das Endprodukt.
  • Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen erläutert. Allerdings sind die folgenden Beispiele nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung angegeben, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf sie beschränkt.
  • BEISPIEL 1: Selektion von Tumorzelllinien und normalen Zelllinien und Zellkultivierung
  • Die folgenden Zelllinien wurden bei der vorliegenden Erfindung verwendet: Tumorzelllinien: humane Hepatom-Zelllinien (SK-Hep1, Hep3B und HepG2), humane Gliom-Zelllinien (U251N und U343), humane Lungenkarzinom-Zelllinien (A549 und H460), humane Zervixkarzinom-Zelllinien (C33A und HeLa), und humane Brustkrebs-Zelllinien (MCF7); und humane normale Zellen: 173We, CBHEL, MRC5, W138, IMR90 und BJ. Sämtliche Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen und in einem Inkubator bei 37°C unter 5% CO2 in DMEM-Medium, angereichert mit 10% fetalem Rinderserum (GIBCO BRL, NY) und Penicillin/Streptomycin (GIBCO BRL, NY) kultiviert.
  • BEISPIEL 2: Test auf endogene Telomerase-Aktivität in den Zelllinien
  • Die endogene Telomerase-Aktivität wurde in jeder Zelllinie unter Verwendung eines TRAPEZE ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-Telomerase-Test-Kits (Oncor, Gaithsberg, MD) gemäß der Anweisung des Herstellers wie folgt gemessen: Zuerst wurden 1 × 106 Zellen mit 200 μl vorgekühlter Zelllysis-Lösung lysiert und bei 10.000 × g 15 min zentrifugiert. Unmittelbar nach der Zentrifugation wurde der Zellextrakt bei –80°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Proteinbestimmungs-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt. Anschließend wurden die Proben mit einer gleichen Proteinkonzentration auf Telomerase-Aktivität durch einen Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Test bewertet. Ein 50-μl-Reaktionsgemisch wurde durch Mischen von 100 ng von jedem Zellextrakt mit 10 μl 5x-TRAP-Reaktionsmix und 2 Einheiten Taq-Polymerase hergestellt. Nach dem Vorinkubieren bei Raumtemperatur für 30 mm zur TRAP-Extension wurde mit dem Reaktionsgemisch eine PCR durchgeführt. Die PCR-Bedingungen umfassten 33 Zyklen von 30 sec bei 94°C und 30 sec bei 55°C. Zur Analyse der Telomerase-Aktivität einer jeden Probe wurde die Extinktion bei 450 nm und 650 nm durch ELISA gemessen. Sämtliche Tests wurden mehr als dreimal wiederholt, und die Mittelwerte wurden berechnet.
  • Wie in 3 gezeigt, zeigten sämtliche Tumorzelllinien mit Ausnahme der MCF-7-Brustkrebs-Zelllinie, das heißt die humanen Hepatom-Zelllinien (SK-Hep1, Hep3B und HepG2), die humanen Lungenkarzinom-Zelllinien (A549 und H460), die humanen Zervixkarzinom-Zelllinien (C33A und HeLa) und die humane Gliom-Zelllinie (U251N), eine hohe Telomerase-Aktivität. Im Gegensatz dazu wurde in den normalen Zelllinien 173We, BJ, IMR90 und W138 kaum Telomerase-Aktivität nachgewiesen.
  • BEISPIEL 3: Herstellung des hTERT-Promotors und des m-hTERT-Promotors
  • Um den Wildtyp-hTERT-Promotor (auch einfach als „hTERT-Promotor" bezeichnet) zu erhalten, wurde humane genomische DNA aus normalen MRC5-Zellen isoliert, die aus humanem Lungengewebe stammen. Zur Amplifikation des hTERT-Promotors, der zwei c-Myc-Bindungsstellen und fünf Sp1-Bindungsstellen enthält, wurde eine PCR unter Verwendung der humanen genomischen DNA als Template und eines Primer-Paares durchgeführt: Ein Sense-Primer 5'-cccaaagcttaggccgattcgagatctctcc-3' (SEQ ID NO: 11), der eine PvuII-Stelle (unterstrichen) zum einfachen Klonieren enthält; und ein Anti-Sense-Primer 5'-gaattcaagcttcgcggggtggccggggcc-3' (SEQ ID NO: 12), der eine EcoRI-Stelle und eine HindIII-Stelle (unterstrichen) enthält. Das 447 bp PCR-Produkt wurde mit BglII und HindIII behandelt und in einen pSEAP-Basis-Vektor (Clontech, Palo Alto, CA) inseriert, der alkalische Phosphatase exprimiert, wodurch sich ein pSEAP-TERT-Plasmid ergibt.
  • Um den m-hTERT-Promotor (SEQ ID NO: 13; und siehe 1) herzustellen, der den hTERT-Promotor umfasst und außerdem eine c-Myc-Bindungsstelle und fünf SpI-Bindungsstellen enthält, wurde der Wildtyp-hTERT-Promotor, der zwei c-Myc-Bindungsstellen und fünf SpI-Bindungsstellen enthält, mit einem hTERT-Promotor, der eine c-Myc-Bindungsstelle und fünf SpI-Bindungsstellen enthält, wie folgt verknüpft. Ein pGL2-hTERT-Vektor, der eine c-Myc-Bindungsstelle und fünf SpI-Bindungsstellen enthält, wurde mit EcoRI und HindIII verdaut. Das ausgeschnittene hTERT-Promotorfragment wurde in den pSEAP-TERT-Vektor inseriert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde, wodurch sich ein pSEAP-mTERT-Plasmid ergab.
  • BEISPIEL 4: Präparation und Herstellung von rekombinanten Adenoviren
  • A. Präparation und Herstellung der replikationsdefizienten rekombinanten Adenoviren dl-CMV-LacZ, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z.
  • Um einen E1-Adenovirus-Shuttle-Vektor herzustellen, der ein LacZ-Gen enthält, dessen Expression unter CMV-Promotor-Kontrolle steht, wurde pcDNA-hygro-LacZ, das LacZ exprimiert (Expression des LacZ-Gens stand unter CMV-Promotor-Kontrolle) mit HindIII und NaeI verdaut, und das Fragment der CMV-Promotor-LacZ-polA-Stelle wurde in einen E1-Adenovirus-Shuttle-Vektor pΔE1SP1A inseriert, was somit einen pΔE1SP1A/CMV-lacZ-Shuttle-Vektor ergab.
  • Zur Herstellung von Vektoren, die ein LacZ-Gen tragen, dessen Expression unter der hTERT-Promotor- und der m-hTERT-Promotor-Kontrolle steht, wurden zunächst die pSEAP-TERT und pSEAP-mTERT-Plasmide mit BglII und EcoRI verdaut. Die ausgeschnittenen hTERT-Promotor- und m-hTERT-Promotorfragmente wurden mit BamHI und EcoRI behandelt und einzeln in ein pΔE1SP1A/LacZ inseriert, das durch Ausschneiden des CMV-Promotors aus dem pΔE1SP1A/CMV-lacZ hergestellt wurde, was somit pΔE1SP1A/TERT-LacZ- bzw. pΔ1SP1A/mTERT-LacZ-Shuttle-Vektoren ergab.
  • Die hergestellten Shuttle-Vektoren wurden mit XmnI verdaut. Anschließend wurde E. coli BJ5183 mit jedem der Shuttle-Vektoren zusammen mit einem Adenovirus dl324BstB1 (ein Geschenk von Ph. Verca von der Universität Fribourg, Schweiz), das durch BstB1-Verdau linearisiert wurde, kotransfiziert, um homologe Rekombination zwischen den beiden Vektoren zu induzieren. Die homogen rekombinante Plasmid-DNA wurde mit PacI verdaut und in 293-Zellen eingeführt, um die rekombinanten Adenoviren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z (2A) herzustellen. Das hergestellte rekombinante Adenovirus dl-mTERT-Z wurde am 20. Feb. 2003 beim Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) mit der Zugriffsnummer KCCM-10471 hinterlegt.
  • B. Präparation und Herstellung der replikationskompetenten rekombinanten Adenoviren Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19
  • Um Adenoviren herzustellen, deren Replikation jeweils durch den hTERT-Promotor und den m-hTERT-Promotor reguliert wurde, wurde ein E1 B-19 kD-deletiertes replikationskompetentes Adenovirus Ad-ΔE1B19 als ein Template-Adenovirus-Plasmid verwendet. Zuerst wurden die pSEAP-TERT- und pSEAP-mTERT-Plasmide mit BglII und EcoRI verdaut.
  • Die ausgeschnittenen hTERT-Promotor- und m-hTERT-Promotorfragmente wurden mit BamHI und EcoRI behandelt und einzeln in ein BamHI/EcoRI-verdautes pΔE1SP1A/ΔE1B19 inseriert, womit pΔE1SP1A/hTERT-hE1B19 bzw. pΔE1SP1A/mTERT-ΔE1B19-Shuttle-Vektoren erzeugt wurden.
  • Die hergestellten Shuttle-Vektoren wurden mit XmnI verdaut. Anschließend wurde E. coli BJ5183 mit jedem der Shuttle-Vektoren zusammen mit einem Ad-ΔE1B19, das durch BstBl-Verdau linearisiert wurde, kotransfiziert, um homologe Rekombination zwischen den beiden Vektoren auszulösen, und somit die replikationskompetenten Adenoviren Ad-TERT-Δ19 bzw. Ad-mTERT-Δ19 erzeugt (2B). Die Herstellung, Konzentration und Bestimmung des Virustiters der rekombinanten Adenoviren wurden in der 293-Zelllinie durchgeführt. Das hergestellte rekombinante Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 wurde am 20. Februar 2003 beim Korean Culture Center of Microrganisms (KCCM) mit der Zugriffsnummer KCCM-10470 hinterlegt.
  • BEISPIEL 5: Untersuchung der Genexpressionsmuster von replikationsdefizienten rekombinanten Adenoviren
  • Um zu bestimmen, ob die Genexpression unter der hTERT-Promotor- oder der m-hTERT-Promotor-Kontrolle mit der Aktivität intrazellulärer Telomerase zusammenhing, wurden LacZ-Genexpressionsmuster in Tumorzelllinien unter Verwendung der replikationsdefizienten rekombinanten Adenoviren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z untersucht, die ein LacZ-Markergen trugen. Tumorzelllinien (C33A, U251N und MCF-7) und normale Zelllinien (W138 und 173We) wurden einzeln auf 24-Well-Platten in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung aliquotiert und mit den β-Galactosidase-exprimierenden Adenoviren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z oder dl-mTERT-Z bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 50 infiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt. Die β-Galactosidase(β-Gal)-Expression wurde durch den X-Gal-Assay untersucht. Kurz dargestellt wurden die Zellen in einer Fixierlösung (1% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd in H2O) 5 min fixiert und in einer Färbelösung (0,4 mg/ml X-Gal, 4 mM Kaliumferricyanid, 4 mM Kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl2, in PBS) bei 37°C 4–16 h inkubiert.
  • Wie in 4 gezeigt, waren alle der getesteten Zelllinien, wenn sie mit dem dl-CMV-Z infiziert wurden, hochgradig positiv für die Expression des LacZ-Genprodukts β-Galactosidase, unabhängig von der intrazellulären Telomerase-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen an, dass dem CMV-Promotor Tumorspezifität fehlt. Wenn allerdings die getesteten Zelllinien mit dem dl-TERT-Z bzw. dem dl-mTERT-Z infiziert wurden, die den hTERT-Promotor bzw. den m-hTERT-Promotor trugen, die in der Lage waren, die Genexpression in einer Tumorzell-spezifischen Weise zu regulieren, wurde die β-Galactosidase-Expression nur in Zelllinien mit hoher Telomerase-Aktivität nachgewiesen. Diese Ergebnisse belegten, dass der hTERT- und der m-hTERT-Promotor tumorspezifische Promotoren sind. Insbesondere war in den Zelllinien mit hoher Telomerase-Aktivität (C33A und U251N) im Vergleich mit dem Fall, in dem das LacZ-Gen sich unter dem hTERT-Promotor befand, β-Galactosidase auf höheren Niveaus exprimiert, wenn das LacZ-Gen unter der Kontrolle des m-hTERT-Promotors stand, welcher weiterhin eine c-Myc-Bindungsstelle und fünf SpI-Bindungsstellen enthält, was anzeigt, dass der m-hTERT-Promotor eine höhere Promotor-Aktivität als der hTERT-Promotor besitzt. Ebenfalls war in den Zelllinien mit niedriger Telomerase-Aktivität (MCF-7, 173We und W138) die β-Galactosidase-Expression im Fall der Infektion mit dl-mTERT-Z signifikant herabgesetzt, was anzeigt, dass der m-hTERT-Promotor eine ausgezeichnete Tumorspezifität besitzt.
  • Der hTERT- und der m-hTERT-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung wurden quantitativ auf Genexpressionseffizienz und Tumorspezifität bewertet. Nachdem die Adenoviren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z mehrere Tumorzelllinien und normale Zelllinien bei verschiedenen Titern für zwei Tage infizierten, wurden die Zellen lysiert, und die β-Gal-Aktivität wurde gemessen. Die Tumorzelllinien (H460, A549, C33A, SK-Hep1, HepG2, Hep3B, U343, U251N und MCF7) und die normalen Zelllinien (173WE, CBHEL, MRC5, IMR90, W138 und BJ) wurden einzeln auf 24-Well-Platten in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung aliquotiert und mit den Adenoviren dl-CMV-Z, dl-TERT-Z oder dl-mTERT-Z bei MOIs von 10, 50 und 100 infiziert. Die β-Gal-Aktivität wurde durch das Verfahren von Cheng und Baltimore gemessen (Cheng, G. et al. 'A co-inducer with TRAF2 of TNF- and CD40L-NK-kappaB activation.' Genes & Develop., 1996, 10, 963–973.). Kurz dargestellt wurden die Zellen, nachdem das Kulturmedium aus jeder Vertiefung entfernt worden war, unter Verwendung von Z-Puffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM (β-Mercaptoethanol) abgelöst. 1 × 106 Zellen wurden mit 100 μl Lysis-Puffer (β-Mercaptoethanol-freier Z-Puffer + 1% NP-40), angereichert mit Proteaseinhibitoren (20 μM PMSF, 20 μM TICK, 20 μM TPCK), lysiert. Nachdem jedes der Zelllysate zentrifugiert war, wurden 30 μl des Überstands auf 96-Well-Platten aliquotiert. 120 μl einer ONPG-Lösung, hergestellt durch Auflösen von 4 mg ONPG in 6 ml des Z-Puffers, wurden jeder Vertiefung zugesetzt, und die Platten wurden 30 min bei 37°C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 420 nm gemessen.
  • Wie in den 5A bis 5O gezeigt, erhöhte sich die LacZ-Gen-Expression mit den Virustitern bei Regulierung unter dem CMV-Promotor. Insbesondere zeigten alle der getesteten Zelllinien, einschließlich der normalen Zelllinien, unabhängig von der intrazellulären Telomerase-Aktivität, LacZ-Gen-Expression auf hohem Niveau. Im Gegensatz dazu exprimierten, wenn sie unter der hTERT-Promotor- oder m-hTERT-Promotor-Kontrolle waren, die Tumorzelllinien mit hoher Telomerase-Aktivität, das heißt, alle Tumorzelllinien mit Ausnahme der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7, das LacZ-Gen-Produkt β-Galactosidase zunehmend mit den Virustitern, wohingegen in den normalen Zelllinien sogar bei dem höchsten Titer von einer MOI 100 kaum β-Gal-Aktivität nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der hTERT- und der m-hTERT-Promotor ausgezeichnete Tumorspezifität besitzen. Im Einzelnen betrugen, im Falle der normalen Zelllinie IMR90, die mit jedem Adenovirus bei MOI 100 infiziert war, der OD420-Wert, der eine relative Menge an exprimierter β-Galactosidase wiedergab, 1,714, wenn das LacZ-Gen unter der CMV-Promotor-Kontrolle stand, wohingegen, wenn das LacZ-Gen unter dem hTERT-Promotor oder dem m-hTERT-Promotor reguliert wurde, die relativen OD420-Werte 0,101 bzw. 0,025 betrugen. In diesem Fall, im Vergleich zu dem Fall der CMV-Promotor-Kontrolle, nahmen unter der Kontrolle des hTERT- und des m-hTERT-Promotors die LacZ-Gen-Expressionsniveaus um etwa das 17fache bzw. etwa das 68fache ab. Im Falle der normalen Zelllinie BJ, die mit jedem Adenovirus bei MOI 500 infiziert war, betrugen, wenn das LacZ-Gen unter dem CMV-, hTERT- oder dem m-hTERT-Promotor reguliert war, die relativen OD420-Werte 0,548, 0,001 bzw. 0,001. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der hTERT- und der m-hTERT-Promotor in den normalen BJ-Zellen kaum aktiviert waren. Dieser große Unterschied in den LacZ-Gen-Expressionsniveaus zwischen dem CMV-Promotor und dem hTERT- und m-hTERT-Promotor wurde in den anderen normalen Zelllinien 173We, CBHEL, W138 und MRC5 festgestellt. Andererseits war in den Tumorzelllinien mit hoher Telomerase-Aktivität das LacZ-Gen auf viel höheren Niveaus unter der Kontrolle des m-hTERT-Promotors exprimiert als unter der Kontrolle des Wildtyp-hTERT-Promotors. Das heißt, wenn die SK-Hep1-Zellen mit dem dl-TERT-Z bei MOI 50 infiziert waren, betrug der relative OD420-Wert für das LacZ-Expressionsniveau 0,182. Im Gegensatz dazu betrug, wenn die SK-Hep1-Zellen mit einem gleichen Titer des dl-mTERT-Z infiziert waren, der relative OD420-Wert für das LacZ-Expressionsniveau 1,82, und dieses Niveau war etwa 10fach höher als im Falle der Infektion mit dem dl- TERT-Z. Zusätzlich wurde in Hep3B-Zellen im Vergleich mit dem Fall der m-hTERT-Promotor-Kontrolle das LacZ-Gen in etwa 10fach höheren Niveaus exprimiert, wenn es unter der m-hTERT-Promotor-Kontrolle stand (relative OD420-Werte: dl-TERT-Z: 0,135; dl-mTERT-Z: 1,322) (Tabelle 1). Wie vorstehend beschrieben, war im Vergleich zu dem Wildtyp-hTERT-Promotor der m-hTERT-Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung ein stärkerer Promotor, der in der Lage war, die Genexpression viel stärker zu induzieren. Zusätzlich besaß der m-hTERT-Promotor eine ausgezeichnete Tumorzellspezifität, da er in normalen Zelllinien kaum eine Promotor-Aktivität aufwies. <Tabelle 1>
    dl-CMV-Z dl-TERT-Z dl-mTERT-Z
    MOI 10 50 100 10 50 100 10 50 100
    H460 1.780 1.879 1.847 0.033 0.399 0.829 0.142 1.594 1.883
    ± 0.18 ± 0.12 ± 0.10 ± 0.10 ± 0.05 ± 0.08 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.06
    A549 1.658 1.65 1.706 0.010 0.178 0.384 0.062 0.650 1.011
    ± 0.09 ± 0.08 ± 0.09 ± 0.04 ± 0.06 ± 0.07 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.07
    U451N 1.733 1.765 1.768 0.267 1.042 1.291 0.939 1.785 1.815
    ± 0.05 ± 0.05 ± 0.04 ± 0.16 ± 0.12 ± 0.03 ± 0.13 ± 0.04 ± 0.08
    U343 1.831 1.902 1.807 0.079 0.732 1.174 0.379 1.819 2.057
    ± 0.01 ± 0.07 ± 0.03 ± 0.01 ± 0.13 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.03 ± 0.07
    MCF7 2.027 1.844 1.892 0.022 0.020 0.036 0.020 0.136 0.183
    ± 0.07 ± 0.03 ± 0.08 ± 0.03 ± 0.03 ± 0.03 ± 0.02 ± 0.05 ± 0.05
    C33A 1.798 1.796 1.731 0.037 0.640 0.964 0.385 1.730 1.712
    ± 0.08 ± 0.05 ± 0.09 ± 0.08 ± 0.21 ± 0.07 ± 0.02 ± 0.04 ± 0.09
    Hep3B 1.858 1.680 1.921 0.060 0.135 0.337 0.331 1.322 1.731
    ± 0.10 ± 0.18 ± 0.14 ± 0.05 ± 0.13 ± 0.03 ± 0.04 ± 0.10 ± 0.05
    HepG2 1.647 1.714 1.662 0.038 0.231 0.402 0.652 1.705 1.716
    ± 0.0 ±0.06 ± 0.07 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.04 ± 0.11 ± 0.05 ± 0.11
    SK-Hep1 1.916 1.941 1.933 0.047 0.182 0.373 0.435 1.82 1.994
    ± 0.06 ± 0.01 ± 0.04 ± 0.01 ± 0.04 ± 0.01 ± 0.05 ± 0.04 ± 0.02
    173WE 0.059 0.647 1.453 0.003 0.025 0.040 0.021 0.026 0.035
    ± 0.02 ± 0.12 ± 0.04 ± 0.02 ± 0.12 ± 0.01 ± 0.03 ± 0.01 ± 0.03
    CBHEL 0.117 0.928 1.642 0.006 0.005 0.007 0.069 0.061 0.103
    ± 0.01 ± 0.01 ± 0.03 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.10 ± 0.01 ± 0.01
    IMR90 0.658 1.758 1.714 0.019 0.075 0.101 0.040 0.012 0.025
    ± 0.04 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.02 ± 0.11 ± 0.04 ± 0.01 ± 0.01
    W138 0.376 1.43 2.012 0.001 0.001 0.034 0.045 0.035 0.093
    ± 0.05 ± 0.22 ± 0.31 ± 0.01 ± 0.03 ± 0.05 ± 0.02 ± 0.05 ± 0.04
    BJ* 0.032 0.115 0.548 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
    ± 0.06 ± 0.02 ± 0.15 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.01 ± 0.01
    MRC5 0.721 1.696 1.683 0.011 0.044 0.059 0.013 0.060 0.053
    ± 0.12 ± 0.03 ± 0.05 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.01 ±0.06 ±0.03
  • BEISPIEL 6: Immunoblot-Analyse der replikationskompetenten rekombinanten Adenoviren
  • Um zu bestimmen, ob die virale Replikation in einer tumorzellspezifischen Weise stattfand, wurden Tumorzelllinien und normale Zelllinien mit einer Kontrolle Ad-ΔE1B19 oder mit jedem der replikationskompetenten rekombinanten Adenoviren infiziert und wurden bezüglich der E1-Proteinexpressionsniveaus bewertet. Die Tumorzelllinien (C33A, A549, HeLa und SK-Hep1) und die normalen Zelllinien (IMR90, MRC5 und BJ) wurden einzeln auf 6-Well-Platten in einer Dichte von 3 × 105 bis 1 × 106 Zellen pro Vertiefung aliquotiert und am nächsten Tag mit dem Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 oder Ad-mTERT-Δ19 bei einer MOI von 1 für die Tumorzelllinien, oder bei einer MOI von 10 für die normalen Zelllinien, infiziert. Nach zwei Tagen der Virus-Infektion wurden die infizierten Zellen geerntet und mit einem Zelllysis-Puffer (50 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 0,5% NP-40, Proteaseinhibitoren: PMSF, TICK, TPCK) lysiert. Mit den Zelllysaten wurde SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) durchgeführt. Anschließend wurden die Proteine, die auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt waren, auf eine PVDF-Membran übergeführt und wurden mit einem Antikörper, als einem primären Antikörper, hybridisiert, der spezifisch das Adenovirus-E1A-Protein erkennt (sc-430; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA) und dann mit einem HRP (Meerrettich-Peroxidase)-konjugierten sekundären Antikörper hybridisiert. Jeder Blot wurde unter Verwendung eines ECL-Kits (Enhanced Chemi-Luminescence: su-2048; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA) zur Auswertung von Proteinexpressionsmustern entwickelt.
  • Wie in 6 gezeigt, replizierte im Falle des Ad-ΔE1B19 das Adenovirus aktiv in allen Tumorzellen und normalen Zellen, was zu hohen Expressionsniveaus des E1-Proteins führte. Wenn im Gegensatz dazu die Zellen mit dem Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 infiziert wurden, war das E1-Protein nur in den Tumorzelllinien mit hoher Telomerase-Aktivität exprimiert, und wurde in allen normalen Zelllinien (W138, BJ und IMR90) mit niedriger Telomerase-Aktivität überhaupt nicht exprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Replikation des Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 durch den m-hTERT-Promotor in tumorzellspezifischer Weise reguliert wird. Allerdings replizierte im Falle des Ad-TERT-Δ19, dessen Replikation durch den Wildtyp-hTERT-Promotor reguliert war, das Adenovirus aktiv in den Tumorzellen, was zu hohen Expressionsniveaus des E1-Proteins führte, während die E1-Proteinexpression in den normalen Zelllinien W138 und BJ festgestellt wurde. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Adenovirus Ad-TERT-Δ19 bezüglich der Replikation weniger tumorspezifisch ist als Ad-mTERT-Δ19.
  • BEISPIEL 7: Bewertung der zytolytischen Wirkung der replikationskompetenten rekombinanten Adenoviren
  • Um die tumorzellspezifische zytolytische Wirkung der Adenoviren Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 zu untersuchen, wurden mehrere Tumorzelllinien und normale Zelllinien mit den Adenoviren, unter Verwendung eines replikationskompetenten Adenovirus Ad-ΔE1B19 als Positiv-Kontrolle und eines replikationsdefizienten Adenovirus dl-CMV-Z als Negativ-Kontrolle, mit verschiedenen Titern, infiziert und anschließend wurde die Zelllebensfähigkeit getestet. Die Tumorzelllinien (SK-Hep1, H460, C33A, U251N, A549 und HeLa) und die normalen Zelllinien (BJ, W138 und IMR90) wurden einzeln auf 24-Well-Platten in einer Dichte von 2–5 × 104 pro Vertiefung aliquotiert und am nächsten Tag mit dem dl-CMV-Z, dem Ad-ΔE1B19, dem Ad-TERT-Δ19 oder dem Ad-mTERT-Δ19 bei verschiedenen MOIs von 0,01, 0,1, 1, 10 und 100 infiziert. Wenn das Adenovirus Ad-ΔE1B19 Zellen bei einer MOI von 0,01 oder 0,1 fast vollständig abgetötet hatte, wurden alle Kulturmedien entfernt, und die Zellen, die am Boden der Platten anhafteten, wurden fixiert und mit 0,5% Kristallviolett in 50% Methanol gefärbt.
  • Wie in den 7A bis 7F gezeigt, replizierte die Negativ-Kontrolle, replikationsdefizientes Adenovirus dl-CMV-Z, kaum in den Tumorzellen und zeigte somit keine onkolytische Wirkung. Im Gegensatz dazu töteten das Ad-TERT-Δ19 und das Ad-mTERT-Δ19 die meisten der getesteten Tumorzellen auf Niveaus ähnlich zu dem Ad-ΔE1B19 ab, was anzeigt, dass die beiden Adenoviren eine hochpotente onkolytische Wirkung besitzen. Allerdings tötete, wie in den 7G bis 7I gezeigt, in den normalen Zelllinien BJ, W138 und IMR90 das Ad-TERT-Δ19 die normalen Zellen auf Niveaus fast ähnlich zu dem Ad-ΔE1B19 ohne Tumorspezifität ab, wohingegen das Ad-mTERT-Δ19 eine etwa 100fach geringere zytolytische Wirkung zeigte als das Ad-ΔE1B19. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Ad-mTERT-Δ19 Tumorzellspezifität besitzt.
  • Zur quantitativen Auswertung der zytolytischen Wirkung des Ad-TERT-Δ19 oder des Ad-mTERT-Δ19 bezogen auf die Telomerase-Aktivität der Zelllinien wurde ein MTT-Assay wie folgt durchgeführt. Die Tumorzelllinien (SK-Hep1, H460, C33A, U251N, A549 und HeLa) und normale Zelllinien (BJ, W138 und IMR90) wurden einzeln auf 24-Well-Platten mit 70- bis 90prozentiger Konfluenz aliquotiert und am nächsten Tag mit den Adenoviren dl-CMV-Z, Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 oder Ad-mTERT-Δ19 bei einer MOI von 10 für die Tumorzellen und bei einer MOI von 50 für die normalen Zellen infiziert. 200 μl einer MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, 2 mg/ml)-Lösung wurde jeder Vertiefung in regelmäßigen Zeitintervallen zugesetzt. Nach Inkubation bei 37°C für 4 h wurde jeder Vertiefung 1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) zugesetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Die relative Zelllebensfähigkeit wurde durch Messen der Extinktion bei 540 nm analysiert.
  • Wie in den 8A bis 8F gezeigt, wurde bei allen der getesteten Tumorzelllinien festgestellt, dass das Ad-TERT-Δ19, das Ad-mTERT-Δ19 und das Ad-ΔE1B19 die Tumorzellen mit der Zeit auf einander ähnlichen Niveaus abtöteten. Im Gegensatz dazu zeigten die Zellen, wie in den 8G bis 8I gezeigt, in den normalen Zelllinien eine Zelllebensfähigkeit (5–20%), die im Falle der Infektion mit dem Ad-ΔE1B19 und dem Ad-TERT-Δ19 mit der Zeit scharf abfiel. Allerdings wurde im Falle der Infektion mit dem Ad-mTERT-Δ19 festgestellt, dass die normalen Zellen zu etwa mehr als 90% auch neun Tage nach der Infektion überlebt hatten. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Ad-mTERT-A19 eine ausgezeichnete tumorzellspezifische zytolytische Wirkung und eine stark verbesserte Stabilität in normalen Zelllinien aufweist im Vergleich zu der Positiv-Kontrolle von replikationskompetentem Adenovirus Ad-ΔE1B19, und zu dem Ad-TERT-Δ19, dessen Replikation durch den Wildtyp-hTERT-Promotor reguliert wird.
  • BEISPIEL 8: Bewertung der In-vivo-Antitumorwirkung der replikationskompetenten rekombinanten Adenoviren
  • Das Ad-TERT-Δ19-Adenovirus, dessen Replikation durch den Wildtyp-hTERT-Promotor reguliert wurde, und das Ad-mTERT-Δ19, dessen Replikation durch den m-hTERT-Promotor reguliert wurde, wurden bezüglich einer In-vivo-Antitumorwirkung bewertet. Die Adenoviren Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 wurden direkt in zwei Tumoren verabreicht, die in Nacktmäusen gebildet wurden, die mit einer humanen Zervixkarzinom-Zelllinie angeimpft wurden, unter Verwendung des Ad-ΔE1B19 als Positiv-Kontrolle, und die Tumorgröße wurde analysiert. Im Einzelnen wurden 1 × 107 Zellen der humanen Zervixkarzinom-Zelllinie C33A intraperitoneal in postnatale 6–8 Wochen alte Nacktmäuse injiziert. Wenn die Tumoren auf etwa 50–80 mm3 gewachsen waren, wurden das Ad-ΔE1B19, das Ad-TERT-Δ19 und das Ad-mTERT-Δ19 in einer Konzentration von 5 × 108 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) dreimal in Abständen von zwei Tagen direkt in die Tumoren injiziert, mit einer negativen Kontrolle, PBS. Anschließend wurde das Tumorwachstum überwacht. Das Volumen der Tumoren wurde durch Messen der Länge und der Breite unter Verwendung von Messschiebern und Berechnung des Tumorvolumens gemäß der folgenden Gleichung bestimmt: Tumorvolumen = (Breite mm)2 × lange Achse mm × 0,523.
  • Wie in 9 gezeigt, war in den Nacktmäusen, denen PBS als Negativ-Kontrolle verabreicht wurde, die Tumorgröße schnell auf 4,232 ± 2,185 mm3 angewachsen, am Tag 32 nach der intratumoralen Viren-Injektion. Im Gegensatz dazu nahm in den Nacktmäusen, denen die replikationskompetenten Adenoviren Ad-TERT-Δ19, Ad-mTERT-Δ19 und Ad-ΔE1B19 verabreicht wurden, das Tumorwachstum stark ab. Das heißt, am Tag 32 nach der intratumoralen Viren-Injektion betrug die Tumorgröße 44 ± 38 mm3 in den Nacktmäusen, denen Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde, während in den Nacktmäusen, denen Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurden, die Tumorgröße 229 ± 168 mm3 bzw. 18 ± 20 mm3 betrug (p < 0,05). Diese Ergebnisse zeigen an, dass die replikationskompetenten Adenoviren potente Antitumorwirkung besitzen. Zusätzlich konnte am Tag 60 nach der Viren-Verabreichung kein Tumorwachstum festgestellt werden, da alle sechs Nacktmäuse, denen nur PBS verabreicht wurde, getötet worden waren. Am Tag 60 wurde festgestellt, dass die Tumorgröße in den Nacktmäusen, denen das Ad-ΔE1B19, das Ad-TERT-Δ19 und das Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurde, 62 ± 104 mm3, 550 ± 368 mm3 bzw. 15 ± 15 mm3 betrug (p < 0,05). Wie aus diesen Daten hervorgeht, besaß das Adenovirus Ad-mTERT-Δ19, dessen Replikation durch den m-hTERT-Promotor reguliert war, eine ausgezeichnete Antitumorwirkung, die derjenigen des Ad-ΔE1B19 entsprach. Zusätzlich verschwanden im Falle der Verabreichung von Ad-mTERT-Δ19 in zwei von fünf Nacktmäusen die Tumoren vollständig am Tag 10 nach der Viren-Verabreichung und wuchsen sogar nach zwei Monaten nicht wieder heran.
  • BEISPIEL 9: Bewertung der Promotor-Aktivität der Promotoren hTERT und m-hTERT in normalen Geweben in vivo
  • Um die Promotor-Aktivität der Promotoren hTERT und m-hTERT in vivo in normalen Geweben zu bewerten, wurden die replikationsdefizienten Adenoviren dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z, die das LacZ-Markergen unter der Kontrolle des hTERT- bzw. des m-hTERT-Promotors trugen, intravenös und unter Verwendung des dl-CMV-Z als Positiv-Kontrolle, in Mäuse verabreicht. 100 μl von jedem der Adenoviren von 5 × 1010 PFU wurden in die Schwanzvene von 6–8 Wochen alten postnatalen Mäusen injiziert. Nach drei Tagen wurden aus den Mäusen Organe (Leber, Herz, Lunge, Milz, Niere, Magen, Hoden und Muskeln) entnommen. Jedes entnommene Organ wurde in 4% Paraformaldehyd bei 4°C 4–8 h fixiert und in Saccharoselösung über Nacht dehydratisiert. Das dehydratisierte Gewebe wurde in OCT-Verbindung (Sakura Finetec, Torrance, CA) kryo-eingebettet und in 8 μm dicke Schnitte geschnitten. Jeder Gewebeschnitt wurde auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern aufgebracht und mit X-Gal gefärbt.
  • Wie in den 10A, 10B und 10C gezeigt, wurde im Falle der intravenösen Verabreichung des Adenovirus dl-CMV-Z, welches das LacZ-Gen trägt, das sich unter der Regulierung des konstitutiven Promoters befand, das LacZ-Gen auf äußerst hohen Niveaus in der Leber exprimiert, während es auf niedrigen Niveaus in der Milz, dem Magen und der Niere exprimiert wurde. Im Falle der Verabreichung des dl-TERT-Z und des dl-mTERT-Z wurde allerdings das LacZ-Gen überhaupt nicht in der Leber exprimiert, die ein Organ darstellt, in welchem Adenoviren bei intravenöser Verabreichung in Organe bekanntlich äußerst reichlich nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Promotoren hTERT und m-hTERT keine Promotor-Aktivität in normalen Leberzellen besaßen. In der Milz war die LacZ-Gen-Expression im Falle der Verabreichung des dl-TERT-Z oder des dl-mTERT-Z im Vergleich mit dem Falle der Verabreichung von dl-CMV-Z sehr schwach, was anzeigt, dass die Promotor-Aktivität der Promotoren hTERT und m-hTERT auch in den Splenozyten unterdrückt war. Im Magen wurde im Falle der Verabreichung des dl-CMV-Z oder des dl-TERT-Z eine niedrige Expression des LacZ-Gens nachgewiesen, wohingegen im Falle der Verabreichung des dl-mTERT-Z keine Expression des LacZ-Gens festgestellt wurde. In der Niere wurde im Falle der Verabreichung des dl-CMV-Z eine schwache LacZ-Gen-Expression festgestellt, wohingegen im Falle der Verabreichung des dl-TERT-Z oder des dl-mTERT-Z keine Expression des LacZ-Gens festgestellt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass der m-hTERT-Promotor auch unter In-vivo-Bedingungen eine ausgezeichnete Tumorspezifität besitzt.
  • BEISPIEL 10: Bewertung der Promotor-Aktivität der Promotoren hTERT und m-hTERT in Tumorgeweben und normalen Geweben in vivo
  • Die Promotoren hTERT und m-hTERT wurden auf die Promotor-Aktivität in Tumorgeweben bzw. Lebergeweben in vivo bewertet. 1 × 107 Zellen der humanen Zervixkarzinom-Zelllinie C33A wurden subkutan in postnatale 6–8 Wochen alte Nacktmäuse injiziert. Wenn Tumoren bis etwa 100 mm3 gewachsen waren, wurden die Adenoviren dl-TERT-Z und dl-mTERT-Z den Mäusen einmal intratumoral in einer Konzentration von 5 × 108 PFU unter Verwendung des dl-CMV-Z als Negativ-Kontrolle injiziert. Nach drei Tagen wurden die Tumorgewebe und die Lebergewebe entnommen und mit X-Gal gemäß dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben gefärbt.
  • Wie in den 11A und 11B gezeigt, wurde in den Mäusen, die intratumoral mit dem dl-CMV-Z injiziert wurden, das LacZ-Gen auf hohen Niveaus in Tumorgeweben und auch in dem normalen Lebergewebe exprimiert. Im Gegensatz dazu wurde in den Mäusen, denen das dl-TERT-Z und das dl-mTERT-Z verabreicht wurden, eine hohe Expression des LacZ-Gens in Tumorgeweben nachgewiesen, wohingegen keine LacZ-Gen-Expression in dem normalen Lebergewebe nachgewiesen wurde. Zusätzlich induzierte das Adenovirus dl-TERT-Z die LacZ-Gen-Expression nur in einem sehr kleinen Teil der Tumorzellen, wohingegen das Adenovirus dl-mTERT-Z die LacZ-Gen-Expression in einem großen Teil der Tumorzellen in Tumorgeweben induzierte. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der m-hTERT-Promotor eine stärkere Promotor-Aktivität in Tumorzellen als der Wildtyp-hTERT-Promotor besitzt.
  • BEISPIEL 11: Vergleich der Virusproduktionsausbeute in Tumorzellen und normalen Zellen
  • Um die Virusproduktionsausbeute durch tumorzellspezifische Replikation durch den Promotor hTERT oder m-hTERT in Tumorzellen und normalen Zellen zu vergleichen, wurden Tumorzellen (HeLa-Zellen) und normale Zellen (BJ-Zellen) auf 6-Well-Platten in einer Dichte von 3 × 105 Zellen pro Vertiefung aliquotiert und am nächsten Tag mit dem Ad-ΔEiB19, dem Ad-TERT-Δ19, dem Ad-mTERT-Δ19 und dem replikationsdefizienten dl-CMV-Z als Negativ-Kontrolle bei einer MOI von 10 für 4 h infiziert. Anschließend wurde das Kulturmedium, das die Viren enthielt, entfernt und durch ein neues Medium ersetzt, und die Zellen und die Kulturüberstände wurden in regelmäßigen Zeitabständen gesammelt. Nach dreimaligem Einfrieren und Auftauen wurden die Virustiter in 293-Zellen durch das Verfahren der limitierenden Titration bestimmt.
  • Wie in den 12A und 12B gezeigt, wurden in den HeLa-Zellen, die mit dem Ad-mTERT-Δ19 infiziert waren, Viren aktiv mit ähnlicher Ausbeute wie im Falle der Infektion mit Ad-ΔE1B19 produziert. Im Gegensatz dazu war die Virusproduktionsausbeute, wenn die HeLa-Zellen mit dem Ad-TERT-Δ19 infiziert waren, deutlich herabgesetzt. Wenn allerdings die humanen normalen BJ-Zellen mit dem Ad-mTERT-Δ19 infiziert waren, wurde kaum eine Virusproduktion nachgewiesen, was anzeigt, dass dieses Adenovirus ebenfalls eine tumorzellspezifische Replikationsfähigkeit besitzt.
  • BEISPIEL 12: Bewertung der Replikationsfähigkeit der replikationskompetenten Adenoviren in Tumorgeweben
  • 1 × 107 Zellen der humanen Zervixkarzinom-Zelllinie C33A wurden subkutan in postnatale 6–8 Wochen alte Nacktmäuse injiziert. Wenn die Tumoren auf etwa 50–80 mm3 gewachsen waren, wurden die Adenoviren Ad-ΔE1B19, Ad-TERT-Δ19 und Ad-mTERT-Δ19 den Mäusen intratumoral in einer Konzentration von 5 × 108 PFU injiziert. Nach sieben Tagen wurden die Tumoren entnommen und in Paraffin eingebettet. Mit den Paraffinblöcken wurde Immunhistochemie mit einem Antikörper durchgeführt, der selektiv an die Adenovirus-Hexonregion bindet. Die Paraffinblöcke wurde mit dem Antikörper hybridisiert, der selektiv an das Adenovirus-Hexonprotein (AB1056F: Chemicon, Temecula, CA, USA) bindet, als primärem Antikörper hybridisiert und dann mit einem HRP (Meerrettich-Peroxidase)-konjugierten sekundären Antikörper zur Analyse der Expressionsmusters des Hexons hybridisiert.
  • Wie in 13 gezeigt, wurde Adenovirus in einem größeren Bereich der Tumorgewebe, in die das Ad-ΔE1B19 und das Ad-mTERT-Δ19 injiziert wurden, nachgewiesen, als im Falle der Injektion von dem Ad-TERT-Δ19. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Ad-mTERT-Δ19 in Tumorgeweben eine höhere Replikationsfähigkeit als das Ad-TERT-Δ19 besitzt.
  • BEISPIEL 13: Bewertung der Zytotoxizität der replikationskompetenten Adenoviren gegenüber der Leber
  • Als Erstes wurden Nacktmäuse mit der humanen Zervixkarzinom-Zelllinie C33A beimpft. In die in den Mäusen entwickelten Tumoren wurden jeweils die Adenoviren Ad-mTERT-Δ19 und Ad-ΔE1B19 injiziert. Nach sieben Tagen wurde den Mäusen das Lebergewebe entnommen und mit Hämatoxylin-Eosin zur histologischen Analyse gefärbt.
  • Wie in 14 gezeigt, durchliefen in der Leber der Mäuse, denen das Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde, viele Zellen eine Mitose, während die Nuklei vergrößert und dunkel gefärbt waren, was anzeigt, dass die Nuklei durch das Virus geschädigt waren. Zusätzlich wurden Kupfferzellproliferation, eine große Anzahl an inflammatorischen Zellen und Zellen, die Apoptose durchliefen, festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass in der Leber der Mäuse, denen das Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurde, obwohl die Nuklei etwas vergrößert waren, keine Zelle eine Mitose durchlief, und Kupfferzellen die normale Morphologie aufwiesen. Auch zeigte diese Leber keine reaktive Hepatitis und Entzündung. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 im Vergleich zu dem Ad-ΔE1B19 eine sehr niedrige Zytotoxizität in Lebergewebe aufweist.
  • BEISPIEL 14: Bewertung der Mortalität von Mäusen in Abhänigkeit von Verabreichungsmenge und -weg des Adenovirus
  • Das tumorspezifische replikationskompetente Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 und das Kontrollvirus Ad-ΔE1B19 wurden auf In-vivo-Toxizität abhängig von der über verschiedene Verabreichungswege verabreichten Menge bewertet.
  • A. Toxizität bei der intravenösen Verabreichung der Viren
  • Um die Toxizität der Verabreichung des Adenovirus in die Maus-Schwanzvene abhängig von der Verabreichungsmenge zu untersuchen, wurde postnatalen 6–8 Wochen alten Mäusen durch die Schwanzvene das Ad-Δ1E1B19 oder Ad-mTERT-Δ19 in verschiedenen Konzentrationen von 1 × 1010, 3 × 1010 bzw. 5 × 1010 PFU oder 100 μl PBS injiziert, und anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Mäuse untersucht (15A).
  • Wurden 1 × 1010 PFU des Ad-ΔE1B19 oder des Ad-mTERT-Δ19 intravenös verabreicht, überlebten alle der zehn getesteten Mäuse bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung. Das heißt, die systemische Verabreichung über den intravenösen Weg von 1 × 1010 PFU der Viren verursachte in Mäusen eine Mortalität von Null. Wenn systemisch 3 × 1010 PFU verabreicht wurden, überlebten im Falle des Ad-mTERT-Δ19 vier von fünf Mäusen bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung, wohingegen im Falle des Ad-ΔE1B19 alle fünf Mäuse innerhalb von 8 Tagen nach der Viren-Verabreichung getötet wurden. Das heißt, bei 3 × 1010 PFU war das Ad-ΔE1B19, dem Tumorspezifität fehlt, für die Mäuse toxisch, da 100% Mortalität gezeigt wurde, wohingegen das Ad-mTERT-Δ19 mit Tumorspezifität 20% Mortalität zeigte und somit erkennen ließ, dass es eine abgeschwächte Toxizität aufweist. Bei den 5 × 1010 PFU wurden sämtliche Mäuse, denen das Ad-ΔE1B19 oder das Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurde, innerhalb von 5 Tagen nach der Viren-Verabreichung getötet, was anzeigt, dass ein solch hoher Titer der Viren bei systemischer Verabreichung über den intravenösen Weg hochgradig toxisch ist.
  • B. Toxizität bei der intraperitonealen Verabreichung der Viren
  • Um die Toxizität der intraperitonealen Verabreichung von Adenoviren abhängig von der Verabreichungsmenge zu untersuchen, wurden postnatalen 6–8 Wochen alten Mäusen 1 ml des Ad-Δ19 oder des Ad-mTERT-Δ19 in Konzentrationen von 5 × 1010 und 1 × 1011 PFU intraperitoneal injiziert, und anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Mäuse untersucht (15B).
  • Bei intraperitonealer Verabreichung von 5 × 1010 PFU des Ad-Δ19 oder des Ad-mTERT-Δ19 überlebten alle zehn getesteten Mäuse bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung. Das heißt, die intraperitoneale Verabreichung der 5 × 1010 PFU der Viren verursachte in Mäusen eine Mortalität von Null. Bei intraperitonealer Verabreichung von 1 × 1011 PFU überlebten im Falle des Ad-mTERT-Δ19 vier der fünf Mäuse bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung, wohingegen im Falle des Ad-ΔE1B19 drei der fünf Mäuse bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung überlebten. Das heißt, das Ad-ΔE1B19, dem Tumorspezifität fehlt, zeigte eine Mortalität von 40%, wohingegen das Ad-mTERT-Δ19 mit Tumorspezifität eine Mortalität von 20% zeigte und somit erkennen ließ, dass es eine abgeschwächte Toxizität aufweist.
  • Im Falle der 5 × 1010 PFU wurde bei systemischer Verabreichung der Viren über den intravenösen Weg wie vorstehend beschrieben festgestellt, dass alle Mäuse innerhalb von 5 Tagen nach der Viren-Verabreichung getötet waren. Im Gegensatz dazu zeigte bei der gleichen PFU die intraperitoneale Verabreichung in Mäusen eine Mortalität von Null. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Adenovirus sicherer ist, wenn es über den intraperitonealen Weg statt über den intravenösen Weg verabreicht wird.
  • C. Toxizität bei der intratumoralen Verabreichung der Viren
  • Um die Toxizität der intratumoralen Verabreichung von Adenovirus abhängig von der Verabreichungsmenge zu untersuchen, wurden postnatalen 6–8 Wochen alten Mäusen B16F10-Zellen intraperitoneal injiziert. Wenn die Tumoren bis auf etwa 100 mm3 herangewachsen waren, wurden die Adenoviren Ad-ΔE1B19 und Ad-TERT-Δ19 den Mäusen in einer Konzentration von 5 × 1010 PFU und 1 × 1011 PFU intratumoral injiziert (15C).
  • Alle der zwanzig getesteten Mäuse überlebten bis zum Tag 15 nach der Viren-Verabreichung. Das heißt, die intratumorale Verabreichung der 5 × 1010 PFU der Viren verursachte in Mäusen eine Mortalität von Null. Bei intratumoraler Verabreichung mit den 1 × 1011 PFU wurden im Falle des Ad-ΔE1B19 zwei der zehn getesteten Mäuse am Tag 8 nach der Viren-Verabreichung getötet, während im Fall des Ad-mTERT-Δ19 zwei der zehn getesteten Mäuse bis zum Tag 15 nach der Verabreichung getötet wurden. Das heißt, für den Testzeitraum von 15 Tagen zeigten die beiden Fälle die gleiche Mortalität von 20%. Allerdings überlebten die Mäuse, denen das Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurde, für eine längere Zeit als die Mäuse, denen das Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde.
  • Zusammenfassend zeigte bei der intravenösen oder intraperitonealen Verabreichung das tumorspezifisch replizierende Ad-mTERT-Δ19 eine Reduktion in der Maus-Mortalität im Vergleich mit dem Adenovirus Ad-Δ19, dem die Tumorspezifität fehlt, was anzeigt, dass die In-vivo-Toxizität des Ad-mTERT-Δ19 durch solche Verabreichungswege geschwächt wird. Zusätzlich kann bei der gleichen PFU der Adenoviren die systemische Verabreichung über den intravenösen Weg eine höhere Toxizität der Adenoviren und letztendlich eine höhere Mortalität als die intraperitoneale und intratumorale Verabreichung verursachen.
  • BEISPIEL 15: Bewertung der Toxizität des Adenovirus in normalen Geweben in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg
  • Das tumorspezifische replikationskompetente Ad-mTERT-Δ19 und ein Kontrollvirus Ad-ΔEIB19 wurden auf die In-vivo-Toxizität abhängig vom Verabreichungsweg bezüglich der Pathologie bewertet. Postnatalen 6–8 Wochen alten Mäusen wurden über die Schwanzvene, intraperitoneal oder intratumoral 1 × 1010 PFU des Ad-mTERT-Δ19 oder des Ad-ΔE1B19 oder PBS verabreicht. Nach sieben Tagen wurden den Mäusen Organe (Niere, Leber, Lunge und Milz) entnommen, kryo-eingebettet und mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) zur histologischen Analyse gefärbt (16A bis 16C).
  • In der Leber der Mäuse, denen Ad-ΔE1B19 intravenös verabreicht wurde, wurde eine schwere Entzündung in der Umgebung der Leberpfortader festgestellt; Kupfferzellproliferation und Zellen, die Apoptose durchliefen, wurden ebenfalls festgestellt. Auch zeigte ein höherer Prozentsatz an Mitose und die vergrößerten und verdunkelten gefärbten Nuklei, dass der Nukleus durch das verabreichte Virus beschädigt wurde. Ferner wurden in den Retikulumzellen von lymphoiden Follikeln keine Lymphozyten festgestellt. Allerdings wurden in der Leber der Mäuse, denen Ad-mTERT-Δ19 systemisch über den intravenösen Weg verabreicht wurde, eine schwache Entzündung und leicht vergrößerte Nuklei festgestellt, jedoch wurden keine Zellen gefunden, die Mitose durchliefen. Auch in anderen Geweben wurden solche Abnormalitäten nicht festgestellt. Wenn das Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 oder Ad-ΔE1B19 nicht systemisch über den intravenösen Weg, sondern mit dem gleichen Titer intraperitoneal oder intratumoral verabreicht wurde, wurde festgestellt, dass sämtliche der entnommenen Gewebe sich in normalem Zustand befanden. Zusammengenommen wurde festgestellt, dass die systemische Verabreichung der Adenoviren eine schwere Toxizität im Vergleich mit der intraperitonealen oder intratumoralen Verabreichung verursacht. Zusätzlich wurde gefunden, dass das Adenovirus Ad-mTERT-Δ19, dessen Replikation auf tumorspezifische Weise reguliert war, eine viel niedrigere In-vivo-Toxizität gegenüber biologischen Geweben besitzt als das Ad-ΔE1B19.
  • BEISPIEL 16. Bewertung der Toxizität in Abhängigkeit von Verabreichungsmenge und -weg des Adenovirus mittels Bluttest
  • Die In-vivo-Toxizität der Adenoviren wurde weiterhin durch Analysieren von Blutproben, die aus den Mäusen gesammelt wurden, denen die Adenoviren verabreicht wurden, untersucht. Bei diesem Test wurden leberfunktionsbezogene Enzyme (GOT, GPT und T-Bilirubin), Nierenfunktionsparameter (Blutharnstoffstickstoff (BUN), Kreatin und Harnsäure), Gesamtcholesterin und Elektrolyte (Na+, K+ und Cl–) quantitativ gemessen (Tabellen 2 bis 4).
  • A. Verabreichung der Adenoviren mit 1 × 1010 oder 5 × 1010 PFU über verschiedene Wege
  • Wenn den Mäusen das Adenovirus Ad-mTERT-Δ19 oder Ad-ΔE1B19 mit 5 × 1010 PFU systemisch über die Schwanzvene verabreicht wurde, wurden die Mäuse innerhalb von 7 Tagen nach der Viren-Verabreichung getötet und konnten somit keiner Blutanalyse unterzogen werden. Wenn im Gegensatz dazu das Adenovirus mit dem gleichen Titer intraperitoneal oder intratumoral verabreicht wurde, trat am Tag 7 nach der Viren-Verabreichung eine schwere Lebertoxizität auf. In diesem Fall wurde allerdings keine Nierentoxizität festgestellt, und die Elektrolyte waren innerhalb normaler Spiegel vorhanden. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die intraperitoneale oder intratumorale Verabreichung der Adenoviren sicherer war als die intravenöse Verabreichung.
  • Bei systemischer Verabreichung in Mäuse in einer Konzentration von 1 × 1011 PFU wurde bewertet, ob die Adenoviren Lebertoxizität in den Mäusen hervorriefen. In Mäusen, denen das Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde, waren die GOT- und GPT-Spiegel deutlich erhöht, wobei die analysierbaren Maximalspiegel überschritten wurden. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse bei Verabreichung mit dem Ad-mTERT-Δ19 etwa 5- bis 16fach höhere GOT- und GPT-Spiegel als die normalen Spiegel. Allerdings wurde festgestellt, dass der Spiegel eines weiteren Leberfunktionsmarkerenzyms, T-Bilirubin, in den Mäusen, denen Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde, stark erhöht war, während es in den Mäusen, denen Ad-mTERT-Δ19 verabreicht wurde, im normalen Bereich lag.
  • Wenn den Mäusen das Adenovirus Ad-ΔE1B19 mit 5 × 1010 PFU intraperitoneal verabreicht wurde, zeigten die Mäuse zudem erhöhte GPT-Spiegel. Im Gegensatz dazu befanden sich in Mäusen, denen Ad-mTERT-Δ19 mit dem gleichen Titer intraperitoneal verabreicht wurde, die GPT-Spiegel im normalen Bereich. Wenn diese Adenoviren intratumoral verabreicht wurden, waren die GOT- und T-Bilirubin-Spiegel in Mäusen, denen das Ad-ΔE1B19 verabreicht wurde, erhöht. Diese Ergebnisse zeigen an, dass das tumorspezifische replikationskompetente Adenovirus im Vergleich mit dem Adenovirus ohne Tumorspezifität eine herabgesetzte Lebertoxizität in vivo aufweist. TABELLE 2: Analyse der Blutproben von Mäusen, denen Adenoviren mit 1 × 1010 PFU intravenös verabreicht wurde.
    Beschreibung Test Einheit PBS Ad-ΔE1B19 Ad-mTERT-Δ19
    Leberfunktionstest GOT U/L 176 > 1000 914
    GPT U/L 48 > 1000 792
    T-Bilirubin U/L 0,9 22,0 1,3
    Nierenfunktionstest BUN mg/dl 18,2 20,8 16,2
    Kreatin mg/dl 0,3 0,8 0,4
    Lipidtest Gesamt-Cholesterin mg/dl 110 257 124
    Elektrolyttest Na+ mÄq/dl 114 145 143
    K+ mÄq/dl 4,3 4,2 4,3
    Cl– mÄq/dl 96 97 98
    TABELLE 3 Analyse der Blutproben von Mäusen, denen Adenoviren mit 5 × 1010 PFU intraperitoneal verabreicht wurde.
    Beschreibung Test Einheit PBS Ad-ΔE1B19 Ad-mTERT-Δ19
    Leberfunktionstest GOT U/L 176 166 101
    GPT U/L 48 109 24
    T-Bilirubin U/L 0,9 0,6 0,5
    Nierenfunktionstest BUN mg/dl 18,2 24,8 18
    Kreatin mg/dl 0,3 0,3 0,2
    Lipidtest Gesamt-Cholesterin mg/dl 110 128 132
    Elektrolyttest Na+ mÄg/dl 144 143 144
    K+ mÄg/dl 4,3 4,3 4,3
    Cl– mÄg/dl 96 96 98
    TABELLE 4 Analyse der Blutproben von Mäusen, denen Adenoviren mit 5 × 1010 PFU intratumoral verabreicht wurde.
    Beschreibung Test Einheit PBS Ad-ΔE1B19 Ad-mTERT-Δ19
    Leberfunktionstest GOT U/L 176 372 132
    GPT U/L 48 45 19
    T-Bilirubin U/L 0,9 3,5 0,7
    Nierenfunktionstest BUN mg/dl 18,2 19,6 23,1
    Kreatin mg/dl 0,3 0,4 0,4
    Lipidtest Gesamt-Cholesterin mg/dl 110 117 130
    Elektrolyttest Na+ mÄq/dl 144 142 142
    K+ mÄq/dl 4,3 4,3 4,2
    Cl– mÄq/dl 96 98 98
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Wie vorstehend beschrieben, ist die Transkriptionsregulationssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage, Tumorzellen durch induzieren von tumorspezifischer, hocheffizienter Expression eines damit in funktionsfähiger Weise verknüpften Gens selektiv abzutöten. Darum ist die Transkriptionsregulationssequenz als Antikrebsmittel mit minimalen Nebenwirkungen geeignet. Sequenzprotokoll
    Figure 00610001
    Figure 00620001
    Figure 00630001
    Figure 00640001

Claims (28)

  1. Transkriptionsregulationssequenz mit einem humanen Telomer-reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor vom Wildtyp, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst.
  2. Transkriptionsregulationssequenz nach Anspruch 1, wobei der hTERT-Promotor mit der Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine c-Myc-Bindungsstelle und fünf Sp1-Bindungsstellen umfasst.
  3. Transkriptionsregulationssequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die c-Myc-Bindungsstelle aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOS: 2, 3 und 4 ausgewählt ist.
  4. Transkriptionsregulationssequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sp1-Bindungsstelle aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9 und 10, ausgewählt ist.
  5. Transkriptionsregulationssequenz nach Anspruch 1, wobei ein 5'-Ende oder ein 3'-Ende des hTERT-Promotors mit der Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst.
  6. Transkriptionsregulationssequenz nach Anspruch 1, wobei die Transkriptionsregulationssequenz die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 13 aufweist.
  7. Rekombinanter viraler Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, die in funktionsfähiger Weise mit einem für die Virusreplikation erforderlichen Gen verknüpft ist.
  8. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 7, wobei der virale Vektor ein Virus ist, der zur Familie der Adenoviridiae gehört.
  9. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 7 oder 8, wobei das zur Virusreplikation erforderliche Gen ein frühes Adenovirus-Gen ist.
  10. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 9, wobei das frühe Andenovirus-Gen ein E1A-Gen ist.
  11. Rekombinanter viraler Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Andenvirus eine Deletion in einem E1B-19 kDa-Gen aufweist.
  12. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 11, wobei der rekombinante virale Vektor KCCM-10470 ist.
  13. Rekombinanter viraler Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, die in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist.
  14. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 13, wobei das therapeutische Transgen aus der Gruppe, bestehend aus Tumorsuppressorgenen, antigenen Genen, zytotoxischen Genen, zytostatischen Genen, apoptotischen Genen und anti-angiogenen Genen, ausgewählt ist.
  15. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 13, wobei der virale Vektor ein Virus ist, der zu der Familie der Adenoviridiae gehört.
  16. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 14 oder 15, wobei das therapeutische Transgen anstelle eines Adenovirus-E1-Gens eingeführt wird, und der rekombinante virale Vektor replikationsdefizient ist.
  17. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 14 oder 15, wobei das therapeutische Transgen anstelle eines Andenovirus-E3-Gens eingeführt wird und der rekombinante virale Vektor replikationskompetent ist.
  18. Rekombinanter viraler Vektor nach Anspruch 14 oder 15, wobei das therapeutische Transgen anstelle eines Andenovirus-E1A-Gens eingeführt wird, und der rekombinante virale Vektor eine Deletion der Adenovirus-E1- und -E3-Gene aufweist.
  19. Rekombinanter nicht-viraler Vektor, der die Transkriptionsregulationssequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, die in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist.
  20. Rekombinanter nicht-viraler Vektor nach Anspruch 19, wobei das therapeutische Transgen aus der Gruppe, bestehend aus Tumorsuppressorgenen, antigenen Genen, zytotoxischen Genen, zytostatischen Genen, apoptotischen Genen und anti-angiogenen Genen, ausgewählt ist.
  21. Wirtszelle, die mit dem rekombinanten viralen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12 transformiert oder transfiziert ist.
  22. Wirtszelle, die mit dem rekombinanten viralen Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 18 transformiert oder transfiziert ist.
  23. Wirtszelle, die mit dem rekombinanten nicht-viralen Vektor nach Anspruch 19 oder 20 transformiert oder transfiziert ist.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten viralen Vektors, der eine Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die einen humanen Telomer-Reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem für die Virusreplikation erforderlichen Gen verknüpft ist, und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  25. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei der virale Vektor ein Virus ist, der zu der Familie der Adenoviridiae gehört.
  26. Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten viralen Vektors, der eine Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die einen humanen Telomer-Reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c-Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist, und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei der virale Vektor ein Virus ist, der zur Familie der Adenoviridiae gehört.
  28. Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten nicht-viralen Vektors, der eine Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die einen humanen Telomer-Reverse-Transkriptase(hTERT)-Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die eine oder mehrere c- Myc-Bindungsstellen und eine oder mehrere Sp1-Bindungsstellen umfasst, wobei die Transkriptionsregulationssequenz in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen verknüpft ist, und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7482158B2 (en) 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
KR100747646B1 (ko) 2005-02-25 2007-08-08 연세대학교 산학협력단 데코린 유전자를 포함하는 유전자 전달 시스템 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물
KR100792183B1 (ko) 2006-05-29 2008-01-07 울산대학교 산학협력단 유전자 발현을 증가시키는 합성 ｈＴＥＲＴ 프로모터
CA2715080C (en) 2007-09-28 2021-09-28 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
KR100969171B1 (ko) * 2008-02-29 2010-07-14 연세대학교 산학협력단 종양 특이적 발현이 개선된 유전자전달체
CN103571954A (zh) * 2013-10-28 2014-02-12 深圳市第二人民医院 Tert启动子的单核苷酸多态性序列在检测泌尿系统肿瘤中的应用
EP3150706B1 (de) * 2014-05-28 2019-07-10 National University Corporation Okayama University Konditionell replizierender adenovirus zur expression eines reic-gens
AU2017375958A1 (en) 2016-12-12 2019-07-04 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
KR20190138311A (ko) 2017-04-21 2019-12-12 베이롤 칼리지 오브 메드신 종양용해성 바이러스요법 및 면역요법
AU2019322487B2 (en) 2018-03-19 2024-04-18 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and CD122/CD132 agonists for the treatment of cancer
KR102310819B1 (ko) * 2019-01-11 2021-10-12 주식회사 진캐스트 Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000003104A1 (en) 1998-07-10 2000-01-20 Owen Lyell Livingston Modular walkway
DK1147181T3 (da) * 1999-02-04 2004-09-20 Geron Corp Telomerase revers transkriptase transskriptionelle regulatoriske sekvenser
CN1195056C (zh) * 2001-07-12 2005-03-30 钱其军 一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法
EP1420803A1 (de) 2001-08-08 2004-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Verfahren zur verstärkung der expression aus einem zellspezifischen promotor

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