KR100389526B1 - 재조합아데노바이러스벡터및사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 단백질 IX DNA의 부분적 또는 전체적 결실을 특징으로 하며 외래 단백질 또는 그의 기능성 단편 또는 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 형질전환된 숙주 세포 및 재조합 단백질 생산 방법 및 유전자 요법도 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 p53, Rb, 또는 미토신과 같이 세포 주기 조절에, 또는 조건 자살 유전자 티미딘 키나아제 (효과를 나타내기 위해서는 티미딘 키나아제 대사물질과 함께 사용되어야 함)와 같이 세포 사멸 유도에 효과적인 단백질의 발현을 위한 외래 유전자를 함유할 수 있다.

Description

재조합 아데노바이러스 벡터 및 사용 방법

발명의 배경

본 출원은 1993년 10월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 제08/142,669호의 일부 계속 출원인 1994년 5월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제08/233,777호의 일부 계속 출원이며, 상기 출원들은 본원에 참고로 도입된다.

본 명세서에서, 각종 출판물이 괄호로 표시한 인용에 의해, 그리고 특허 청구의 범위 전의 서지 사항 설명란에서 언급된다. 이들 출판물의 개시 내용은 본 발명이 관련되는 선행기술의 상태를 보다 완전히 설명하기 위해서 본 명세서에 참고로 도입한 것이다.

유전자 요법에 유용한 재조합 아데노바이러스의 제조에는 이들 재조합 바이러스에서 결실된 바이러스 E1 영역의 유전자 산물을 트랜스로(in trans) 공급할 수 있는 세포주의 사용이 요구된다. 현재 입수할 수 있는 유일한 유용 세포주는 문헌[Graham 등, 1977]에 최초로 기재된 293 세포주이다. 293 세포는 아데노바이러스 타입 5 게놈의 좌측 약 12% (4.3 kb)를 함유한다 [Aiello (1979); 및 Spector (1983)].

근래 유전자 요법에 적용하기 위해 시험되는 아데노바이러스 벡터는 대개 바이러스 게놈의 5' 말단에서 약 400 bp인 지점으로부터 5' 말단에서 약 3.3 kb인 지점에까지 이르는 Ad2 또는 Ad5 DNA를 결실시켜 총.2.9 kb의 E1이 결실되어 있다.그러므로, 재조합 바이러스의 DNA 서열과 세포주 내의 Ad5 DNA 사이에는 약 1 kb의 제한된 상동성 영역이 존재한다. 이 상동성은 바이러스와 세포내 아데노바이러스 서열 사이의 잠재적인 재조합 가능 영역을 규정한다. 이러한 재조합의 결과 293 세포로부터 유래한 Ad5 E1 영역을 보유한 표현형상 야생형인 바이러스가 생성된다. 이 재조합 사건으로 인해 재조합 바이러스 제제 중에서 야생형 아데노바이러스가 빈번히 검출되는 것이라 추정되며, 이 사건이 Ad2계 재조합 바이러스인 Ad2/CFTR-1의 야생형 오염의 원인임이 직접 증명되었다 (Rich 등, (1993)).

벡터가 C군 아데노바이러스 (타입 1, 2, 5, 6) 중 어느 하나에 기초한 것이라면, 타입 C 아데노바이러스 아군 내의 고도의 서열 상동성으로 인해 이러한 재조합이 일어나기 쉽다.

재조합 아데노바이러스를 소규모로 생산하는 경우에는, 오염된 것으로 확인된 바이러스 제제를 폐기하는 스크리닝법으로 오염원인 야생형 바이러스를 처리할 수 있다. 유전자 요법에 대한 예상 수요를 충족시키기 위해 바이러스 생산 규모가 커짐에 따라, 오염되지 않은 재조합 제제 제공의 어려움 뿐 아니라 임의의 단일 제품(lot)이 야생형 바이러스로 오염될 가능성 또한 증가한다.

올해에 진단되는 새로운 암 환자는 백만명을 넘을 것이며, 암 관련 사망자의 수는 그 절반 정도일 것이다 (American Cancer Society, 1993). p53 돌연변이는 사람의 암에 관련된 가장 보편적인 유전적 변화로서, 사람 암의 50 내지 60%에서 발생한다 (Hollstein 등 (1991); Bartek 등 (1991); Levine (1993)). 예를 들어, p53이 결핍된 종양 치료에 있어서 유전자 요법의 목표는 정상적이고 기능을 갖춘 야생형 p53 유전자를 재활시켜 세포 증식의 제어가 회복되도록 하는 것이다. p53은 세포 주기 진행에 중심적인 역할을 하는 것으로서, 성장을 중지시켜 DNA 손상에 대응한 복구 또는 아팝토시스(apoptosis)가 일어날 수 있도록 한다. 야생형 p53은 최근에 방사선 조사 또는 일부 화학요법제 처치에 의해 유발된 아팝토시스에 필요한 성분인 것으로 확인되었다 (Lowe 등, (1993) A 및 B). 사람의 종양에서 보이는 p53 돌연변이의 높은 발생률을 고려하면, 화학요법 및 방사선 처치에 내성이 되어 버린 종양은 부분적으로는 야생형 p53의 결핍으로 인해 그렇게 된 것일 수 있다. 이러한 종양에 기능성 p53을 재공급한다면, 이들이 방사선 또는 화학요법에 의해 유발된 DNA 손상과 정상적으로 관련되는 아팝토시스에 민감해질 것임은 타당하다.

성공적인 사람 종양 억제 유전자 요법에서 결정적인 사항 중 하나는 암 세포 대부분에 대한 영향력이다. 이러한 목적을 위해, 다양한 종양 모델에서 주로 레트로바이러스 벡터를 사용한 연구가 이루어져 왔다. 예를 들면, 간 악성 종양 치료를 위해 레트로바이러스 벡터를 사용했지만, 생체내 유전자 요법에 요구되는 고도의 유전자 전달을 달성할 수 없었기 때문에 이를 사용한 치료법은 성과가 거의 없었다(Huber, B.E. 등, 1991; Caruso M. 등, 1993).

바이러스 생산의 보다 지속적인 공급원을 찾기 위해, 연구자들은 레트로바이러스 패키징 세포주를 충실성 종양에 직접 주입함으로써 낮은 수준의 유전자 전달과 관련된 문제를 극복하려는 시도를 해왔다 (Caruso, M. 등, 1993; Ezzidine, Z.D. 등, 1991; Culver, K.W. 등, 1992). 그러나, 이들 방법은 번거로우며 환자에서 패키징 세포주에 대한 염증 반응을 유발하기 때문에 사람에게 사용하기에는 만족스럽지 않다. 레트로바이러스 벡터의 또다른 단점은 목적하는 재조합 유전자를 효과적으로 통합하고 발현하는 위해 분열 세포가 요구된다는 점이다 (Huber, B.E. 1991). 필수적인 숙주 유전자 내로의 안정한 통합은 병원성 질환 상태를 발병시키거나 유전시킬 수 있다.

재조합 아데노바이러스는 레트로바이러스 및 기타 유전자 전달 방법에 비해 뚜렷한 장점을 가지고 있다 (Siegfried (1993) 참조). 아데노바이러스는 사람에게서 종양을 유발하는 것으로 밝혀진 바가 전혀 없으며, 생 백신으로서 안전하게 사용되어 왔다 (Straus (1984)). 복제 기능이 결여된 재조합 아데노바이러스는 복제에 필요한 E1 영역을 표적 유전자로 대체함으로써 생산할 수 있다. 아데노바이러스는 정상적인 감염 결과로는 사람의 게놈내로 통합되지 않으며, 그에 따라 레트로바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터의 경우 있을 수 있는 삽입 돌연변이의 위험을 크게 감소시킨다. 또한, 염색체외 DNA는 정상 세포의 계속적인 분열에 따라 점차 소실될 것이므로 이러한 안정적 통합의 결여는 전달된 유전자 효과가 일시적이라는 점에서 또다른 안전상의 특성을 가져온다. 안정적, 고역가의 재조합 아데노바이러스는 레트로바이러스 또는 AAV로는 달성하지 못하는 수준으로 생산될 수 있으므로 다수의 환자를 치료하기에 충분한 양의 물질을 생산할 수 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 광범위한 조직 및 종양 세포 유형으로의 생체내 유전자 전달에 매우 효과적이다. 예를 들면, 아데노바이러스 매개 유전자 전달은 낭포성 섬유증 (Rosenfeld 등, (1992); Rich 등 (1993)) 및 α₁-안티트립신 결핍증 (Lemarchand등, (1992))과 같은 질환에 대한 유전자 요법으로서 강한 잠재성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 양이온성 리포좀/DNA 복합체와 같이 유전자 전달에 대한 다른 대체 방안 역시 현재 연구되고 있으나, 아데노바이러스 매개 유전자 전달만큼 효과적이라고 나타난 것은 아직 없다.

p53 결핍 종양 치료에서와 마찬가지로, 다른 종양에 대한 유전자 요법의 목표는 세포 증식의 제어를 회복시키는 것이다. p53의 경우, 기능성 유전자의 도입으로 세포 주기 제어가 회복되어 치료제에 의해 유발되는 아팝토시스성 세포 사멸이 일어날 수 있다. 이와 유사하게, 유전자 요법을 단독으로, 또는 치료제와 함께 다른 종양 억제 유전자에 동등하게 적용할 수 있어서, 종양 세포의 세포 주기 진행을 제어하고(거나) 세포 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 세포 주기 조절 단백질을 코딩하지 않지만 자살 유전자와 같이 세포 사멸을 직접적으로 유도하는 유전자, 또는 세포에 직접적으로 독성을 갖는 유전자를 유전자 요법 프로토콜에 사용하여 종양 세포의 세포 주기 진행을 직접적으로 막을 수 있다.

세포 주기 진행의 제어를 회복시키는데 어떤 유전자를 사용하는가에 관계없이, 이러한 접근법의 이론 및 실제적인 적용성은 동일하다. 즉, 유전자 전달을 고효율로 달성하여 치료량의 재조합 생성물을 발현시키는 것이다. 따라서, 환자에 대한 위험을 최소한으로 하면서 고효율의 유전자 전달을 가능하게 할 수 있는 벡터로 어떤 것을 사용할 것인가를 선택하는 것은 유전자 요법 치료의 성공 정도에 중요하다.

그러므로, 안전하고 효과적인 유전자 요법 치료를 제공하는 고도의 유전자전달 효율 및 단백질 발현을 가능하게 하는 벡터 및 방법이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 이와 관련한 장점들도 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 아데노바이러스 단백질 IX DNA의 부분적 또는 전체적 결실을 특징으로 하고, 외래 단백질 또는 그의 기능성 단편 또는 그의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 또한, 형질전환된 숙주 세포 및 재조합 단백질의 생산 방법 및 유전자 요법 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

그러므로, 예를 들어 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 p53, Rb 또는 미토신과 같이 세포 주기 조절에 효과적인 단백질, 또는 조건 자살 유전자 티미딘 키나아제(효과를 나타내기 위해서는 티미딘 키나아제 대사물질과 함께 사용해야 함)와 같이 세포 사멸 유도에 효과적인 단백질의 발현을 위한 외래 유전자를 함유할 수 있다.

제1도는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 나타낸다. 이 구조물은 제1도에 나타낸 바와 같이 조립되었다. 그 결과 생성된 바이러스에는 아데노바이러스 서열에서 뉴클레오티드 356 내지 4020에 이르는 5' 결실이 있으며, 단백질 IX 코딩 서열 전체뿐 아니라 E1a 및 E1b 유전자가 제거되었고, E1b와 pIX 유전자에 의해 공유되는 폴리아데닐화 부위는 임의의 목적 유전자 전사 종료에 사용되도록 무손상으로 남겨 두었다.

제2도는 p110^RB의 아미노산 서열을 나타낸다.

제3도는 망막아종 종양 억제 단백질을 코딩하는 DNA의 서열을 나타낸다.

제4도는 본 발명의 범위 내에 있는 재조합 p53/아데노바이러스 구조물의 개략도이다. p53 재조합체는 Ad5를 기초로 하며, 뉴클레오티드 360 내지 3325의 E1 영역을 Ad 2 3부분 리더 cDNA가 딸린 Ad 2 MLP (A/M/53) 또는 사람 CMV(A/C/53) 프로모터에 의해 구동되는 1.4 kb의 전장 p53 cDNA로 대체한 것이다. 대조구 바이러스 A/M은 A/M/53 바이러스와 동일한 Ad 5 결실을 함유하지만 1.4 kb p53 cDNA 삽입체는 없는 것이다. 나머지 E1b 서열 (705 뉴클레오티드)을 결실시켜 단백질 IX가 결실된 구조물 A/M/N/53 및 A/C/N/53을 만들었다. 이들 구조물은 또한 아데노바이러스 타입 5 영역 E3 내에 1.9 kb의 XbaI 결실을 포함한다.

제5A도 및 제5B도는 A/M/53 및 A/C/53으로 감염시킨 종양 세포에서의 p53 단백질 발현을 나타낸다. 제5A도의 실험에서, 정제된 A/M/53 또는 A/C/53 바이러스를 사용하여 Saos-2 (골육종) 세포를 지시된 감염 다중도 (MOI)로 감염시키고 24시간 후에 수거하였다. p53 항체 pAb 1801을 사용하여 총 단백질 농도가 동일하도록 로딩(loading)한 시료의 면역블롯을 염색하였다. 돌연변이 p53 단백질을 과잉발현하는 SW480 세포 추출물을 동일한 단백질 농도로 사용하여 p53 크기 마커로 이용하였다. A/C/53 아래의 "0"은 미처리된 Soas-2 용해물을 함유하는 의사(mock) 감염 시료를 나타낸다. 제5B도의 실험에서, A/M/53 또는 A/C/53 바이러스를 사용하여 Hep 3B (간세포 암종) 세포를 표시된 MOI로 감염시키고 제5A도에서와 같이 분석하였다.화살표는 p53 단백질의 위치를 나타낸다.

제6A도 내지 제6C도는 p53 의존성 Saos-2 형태 변화를 보여준다. 아전면생장 (1 x 10⁵세포/10 cm 플레이트)시킨 SaoS-2 세포를 감염시키지 않거나 (A), 대조구 A/M 바이러스 (B) 또는 A/C/53 바이러스 (C)를 사용하여 MOI = 50으로 감염시켰다. 감염시킨지 72 시간 후에 세포의 사진을 찍었다.

제7도는 사람 종양 세포주에서 A/M/N/53 및 A/C/N/53에 의한 p53 의존성 DNA 합성 억제를 나타낸다. 대조구 아데노바이러스 A/M/ (-x-x-), 또는 p53 발현 A/M/N/53 (-△-△-), 또는 A/C/N/53 (-o-o-) 바이러스를 사용하여 9 종의 상이한 종양 세포주를 표시된 바와 같이 MOI를 증가시키면서 감염시켰다. 종양 종류 및 p53 상태를 각 세포주에 대해 기록하였다 (wt = 야생형, null = 단백질 발현 없음, mut = 돌연변이 단백질 발현). 하기의 실험 II에 기재한 바와 같이, 감염시킨지 72 시간 후에 DNA 합성량을 측정하였다. 결과는 각 투입량마다 3회씩의 측정값으로부터 얻은 것 (평균±표준편차)이며, 매질 대조구의 % 대 MOI로 나타내었다. * H69 세포는 A/M 및 A/M/N/53 바이러스만을 사용하여 시험했다.

제8도는 누드 마우스에서 p53 감염된 Saos-2 세포의 종양형성성을 나타낸다. 대조구 A/M 바이러스 또는 p53 재조합 A/M/N53을 사용하여 Saos-2 세포를 MOI = 30으로 감염시켰다. 처리된 세포를 누드 마우스의 옆구리에 피하주사하고, 8 주 동안 매주 2회씩 종양 치수를 측정하였다 (실험 II에 기재된 바와 같음). 이 결과를 대조구 A/M (-x-x-) 및 A/M/N53 (-△-△-) 처리 세포 모두에 대해 종양 크기 대 종양세포 이식 후의 일(日)수로 그래프화하였다. 오차 막대는 각 시점에서 동물 4 마리로 구성된 각 군에 대한 평균 종양 크기 ± SEM을 나타낸다.

제9도는 수립된 종양에서 rAd/p53 RNA의 발현을 나타낸다. H69 (SCLC) 세포를 누드 마우스에 피하주사하고 종양의 크기가 약 25-50 mm³에 이를 때까지 32일 동안 종양이 진전되게 하였다. 마우스를 무작위화하고 대조구 A/C/β-gal 또는 A/C/53 바이러스를 2 x 10⁹pfu로 종양주위에 주사하였다. 주사한지 2일 및 7일 후에 종양을 절제하고, 각 종양 시료로부터 폴리A RNA를 수득하였다. 동일한 RNA 농도 및 재조합 P53 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. PCR 증폭은 Omnigen 열순환기 (Hybaid사)에서 94℃ 1 분, 55℃ 1.5 분, 72℃ 2분으로 30 사이클 및 10 분 동안 72℃에서의 최종 연장 기간으로 행하였다. 사용된 PCR 프라이머는 5' 3부분 리더 cDNA(5'-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3') 및 3' p53 프라이머(5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3')였다. 1, 2, 4 및 5 레인은 표시된 바와 같이 2일 또는 7일 후에 절제한 p53 처리된 시료이다. 3 및 6 레인은 β-gal 처리된 종양에서 얻은 것이다. 7, 8 및 9 레인은 각각 동등한 로딩량을 확인하기 위해 액틴 프라이머로 증폭시킨 4, 5 및 6 레인의 반복물이다. 10 레인은 3부분/p53 함유 플라스미드를 사용한 양성 대조구이다.

제10A도 및 제10B도는 A/M/N/53을 사용했을 때의 생체내 종양 억제 및 증가된 생존 시간을 보여준다. H69 (SCLC) 종양 세포를 누드 마우스에 피하주사하고 2 주동안 진전되게 하였다. 완충액 단독 (---), 대조구 A/M 아데노바이러스(-x-x-),또는 A/M/N53 (-△-△-), 두 가지 바이러스 모두 (2 x 10⁹pfu/주사) 중 하나를 매주 2 회씩 총 8 회 종양주위에 주사하였다. 종양 치수를 주 당 2회씩 측정하고, 종양 크기를 실험 II에 기재된 바와 같이 평가하였다. A) 종양 크기를 각 바이러스에 대해 H69 세포를 접종한 후의 시간 (일(日)수)의 함수로 그래프화했다. 오차 막대는 동물 5 마리로 구성된 각 군에 대해 평균 종양 크기±SEM을 나타낸다. 화살표는 바이러스가 주사된 날을 표시한다. B) 마우스의 생존을 모니터링하고 완충액 단독 (----), 대조군 A/M (… … …) 또는 A/M/N/53 ( -- ) 바이러스 처리된 H69 세포를 접종한 후의 시간 대 각 군 당 생존 마우스의 비율을 그래프화 했다.

제11A도 내지 제11C도는 재조합 플라스미드 구조물의 맵을 나타낸다. 하기에 기술한 바와 같이 플라스미드를 제작했다. 구조물에서 진한 선은 목적 유전자를 나타내며, 진한 문자는 화살표로 표시되는 다음 단계의 플라스미드를 형성하기 위해 함께 연결시키는 단편을 생성하는 데 사용된 제한효소 부위를 나타낸다. 제11A도에서, pMLBKTK (ATCC 수탁번호 39369)의 HSV-TK 유전자를 클로닝 벡터의 폴리링커 내로 서브클로닝하고, 이어서 pACN 벡터 내로 클로닝하기 위한, 원하는 말단을 가진 TK 유전자를 단리하여 플라스미드 pACNTK를 제작했다. pACN 벡터는 생체내 재조합이 발생하여 재조합 아데노바이러스를 형성하는데 필요한 아데노바이러스 서열을 함유한다 (제12도 참조). 제11B도에서, 플라스미드 pAANTK의 제작 방법은 α-태아단백질 인핸서 (AFP-E) 및 프로모터 (AFP-P) 영역을 코딩하는 PCR 증폭된 단편으로 시작해서 이를 수 단계에 걸쳐 서브클로닝하여, 최종 플라스미드에서는 재조합 아데노바이러스를 형성하기 위한 생체내 재조합 발생에 필요한 아데노바이러스 타입 2 서열이 딸린 HSV-TK 유전자의 상류에 AFP 인핸서 및 프로모터가 있게 하는 것으로 나타나 있다. 제11C도에서, 플라스미드 pAANCAT의 제작 방법은 시판되는 플라스미드로부터 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 단리하는 것으로 시작해서 이를 pAAN 플라스미드 내로 서브클로닝하고(상기 참조), AFP 인핸서/프로모터가 아데노바이러스 서열 배경 중에서 CAT 유전자의 전사를 지시하는 최종 플라스미드 pAANCAT를 생성시키는 것으로 나타나 있다.

제12도는 재조합 아데노바이러스 ACNTK, AANTK 및 AANCAT의 개략적 맵이다. 제11도에 기재된 플라스미드로부터 재조합 아데노바이러스를 제작하기 위해, 플라스미드 pACNTK, pAANTK 또는 pAANCAT 중 어느 하나의 4 중량부(20 μg)를 EcoRI으로 선형화하고 ClaI으로 소화시킬, E3 영역 결실을 함유한 재조합 아데노바이러스 (rACβ-gal) (Wills 등, 1994)의 대형 단편 1 중량부 (5 μg)와 동시에 형질감염시켰다. 그 결과 얻어진 바이러스에서, Ad 5 뉴클레오티드 360-4021은 표시된 바와 같이 HSV-1 TK 또는 CAT 유전자의 발현을 구동하는 CMV 프로모터와 3부분 리더 cDNA (TPL) 또는 α-태아단백질 인핸서와 프로모터 (AFP)로 대체되어 있다. 그 결과 얻어진 재조합 아데노바이러스는 각각 ACNTK, AANTK 및 AANCAT로 표시된다.

제13도는 재조합 아데노바이러스 벡터에서 CAT 발현의 프로모터 특이성을 나타낸다. 재조합 아데노바이러스 AANCAT를 사용하여 표시된 세포주의 2 x 10⁶개를 표시된 바와 같이 MOI = 30 또는 100으로 감염시키거나, 감염시키기 않은 채(UN)로두었다. Hep G2 및 Hep 3B 세포는 α-태아단백질을 발현한 데 반해 다른 세포주들은 발현하지 않았다. 3일 후에, 세포를 수거하여, 총단백질 농도가 동일하도록 추출물 양을 조정한 다음, 하기 방법 부분에 기재된 바와 같이 CAT 활성을 측정하였다. 동등한 수의 미감염 세포를 CAT 활성 백그라운드에 대한 개별 대조구로 하고,¹⁴C 표지된 클로람페니콜 (¹⁴C 단독) 및 CAT 활성을 발휘하는 안정한 세포주 (B21)로부터 얻은 추출물을 각각 음성 및 양성 대조구로 사용하였다. 아세틸 CoA의 전환율을 나타내었는데, 이것은 CAT 발현이 α-태아단백질을 발현하는 세포에 국한되었음을 입증한다.

제14도는 간세포 암종 세포주에 대한 TK/GCV 처치의 효과 및 프로모터 특이성의 영향을 보여준다. ACNTK (-△-), AANTK (-▲-), 또는 대조군 ACN (-□-) 바이러스를 사용하여 Hep-G2 (AFP 양성) 및 HLF (AFP 음성) 세포주를 밤새 감염 다중도 30으로 감염시킨 다음, 간시클로비르를 표시된 농도로 1회 투여하여 처치하였다. 세포에³H-티미딘을 가하여 세포 증식을 평가하고, 18시간이 지난 후 수거했다. 세포내 핵산으로의³H-티미딘 도입을 감염 72 시간 후에 측정하고 (Top Count, Packard사), 미처리 대조구에 대한 백분율 (평균 ± 표준편차)로 나타내었다. 그 결과는 CMV 구동 구조물의 경우 비선택적 투여량 의존 증식 억제를 보여주며, AFP 구동 TK는 Hep-G2를 선택적으로 억제하였다.

제15도는 HCC에서 ACNTK + 간시클로비르의 세포독성을 보여준다. ACNTK (-▲-) 또는 대조구 바이러스 ACN (-□-)을 사용하여 HLF 세포를 MOI 30으로 감염시키고, 표시된 용량의 간시클로비르로 처치하였다. 간시클로비르 처치 72 시간 후에, 세포 상층액 중으로 방출된 락테이트 디히드로게나아제 (LDH)의 양을 비색법으로 측정하고 두 바이러스 처리 군에 대해 간시클로비르 농도 대비 그래프로 나타내었다 (평균 ± SEM).

제16A도 및 제16B도는 누드 마우스에서 수립된 간세포 암종 (HCC) 종양에 대한 ACNTK + 간시클로비르의 효과를 나타낸다. 1 ×10⁷개의 Hep 3B 세포를 누드 마우스 암컷의 옆구리에 피하주사하고 27일 동안 증식하게 하였다. 그 후, 마우스에 ACNTK (-▲-) 또는 대조군 바이러스 ACN (-□-) (100 μl 부피에 1 x 10⁹iu)를 종양내 및 종양주위에 격일제로 총 3회 주사하였다 (화살표로 표시). 간시클로비르 (100 mg/kg, 복막내) 주사는 최초 바이러스 투여 24 시간 후에 시작하여 총 10일 동안 계속하였다. 제6A도에서는, 각 바이러스에 대해 감염 후의 일수에 대한 종양 크기를 그래프화했다. 제6B도에서는, 각 바이러스 처리된 동물군의 체중을 감염 후의 일수에 대해 평균 ± SEM으로 그래프화했다.

야생형 아데노바이러스에 의한 오염의 빈도를 감소시키기 위해서는 바이러스나 세포주를 개량하여 재조합의 확률이 감소되도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, C 군 바이러스에 대한 상동성이 낮은 군에서 선택된 아데노바이러스를 사용하여 293 세포 내의 Ad5 서열과 재조합되는 성향이 거의 없는 재조합 바이러스를 제작할 수도 있을 것이다. 그러나, 이와 다른, 바이러스와 세포내 서열 사이의 재조합을 감소시키는 더 쉬운 수단은 재조합 바이러스 내의 결실의 크기를 더 크게 하여 이 유전자와 293 세포 내 Ad5 유전자 사이의 공유 서열의 범위를 감소시키는 것이다.

아데노바이러스 게놈의 5' 말단으로부터 3.5 kb를 지나서 계속되는 결실은 아데노바이러스 단백질 IX에 대한 유전자에 영향을 미치며 아데노바이러스 벡터에서 바람직하지 않은 것으로 여겨져 왔다 (하기 참조).

아데노바이러스의 단백질 IX 유전자는 바이러스 캡시드의 대부분을 구성하는 9개 헥손군을 안정화시키는 외측 아데노바이러스 캡시드의 작은 성분을 코딩한다 (Stewart (1993)). 아데노바이러스 결실 돌연변이체의 초기 연구에서, 단백질 IX의 부재가 야생형 바이러스에서 관찰되는 것보다 더 큰 열불안정성과 관련이 있지만, 단백질 IX는 아데노바이러스의 비필수 성분인 것으로 여겨졌다. (Colby & shenk (1981)). 보다 최근에 단백질 IX가 전장 바이러스 DNA를 캡시드 내로 패키징하는데 필수적이며, 단백질 IX가 없으면 야생형보다 1 kb 이상 작은 게놈만이 재조합 바이러스로서 증식될 수 있다는 것이 발견되었다 (Ghosh-Choudhury 등, (1987)). 이러한 패키징 제한이 주어지므로, 단백질 IX 결실은 고의적으로 아데노바이러스 벡터 설계에서 고려되지 않았다.

본 명세서에서는 본 발명에 포함되는 기본적인 기술을 수행하기 위한 정의, 방법 및 수단을 담고 있는 분자생물학의 기본 교재가 언급된다. 예를 들면, Sambrook 등 (1989) 및 이 책에 있는 각종 참고문헌을 참조한다. 이러한 참고문헌 및 인용된 출판물들은 본 발명의 내용에 참고로 명백히 도입된다.

당업계에 공지되어 온 바와는 반대로, 본 발명은 유전자 요법과 같은 진단 및 치료 용도에 사용하는 바이러스 제제가 야생형 아데노바이러스로 오염될 위험을 감소시키는 수단으로 단백질 IX 유전자의 결실을 함유한 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것을 청구한다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합체"란 용어는 유전자 조작의 결과로 형성된 자손을 뜻한다. 이러한 결실은 통상적인 E1 결실(보다 작고, 덜 바람직한 pIX 유전자의 일부분 결실이 가능하며 본 발명의 범위에 포함됨)된 바이러스에 존재하면서 293 세포 내에 통합된 Ad5 서열과 재조합될 수 있는 DNA 서열 중 500 내지 700 염기쌍을 추가로 제거할 수 있다. 임의의 C 군 바이러스, 혈청형 1, 2, 5 및 6 를 기초로 한 재조합 아데노바이러스가 본 발명에 포함된다. 또한, 아데노바이러스 타입 2 주요 후기 프로모터로부터 사람 p53 cDNA를 발현하는 하이브리드 Ad2/Ad5계 재조합 바이러스도 본 발명의 범위 내에 있다. 이 구조물을 제1도에 나타낸 바와 같이 조립하였다. 그 결과 생성된 바이러스에는 아데노바이러스 서열에서 뉴클레오티드 약 357 내지 4020에 이르는 5' 결실이 있으며, 단백질 IX 코딩 서열 전체뿐 아니라 E1a 및 E1b 유전자가 제거되었고, E1b와 단백질 IX 유전자에 의해 공유되는 폴리아데닐화 부위는 임의의 목적 유전자 전사 종료에 사용되도록 무손상으로 남겨두었다. 별도의 실시태양을 제4도에 나타내었다. 별법으로 이웃한 단백질 IVa2 유전자에 영향을 미치지 않으면서 30 내지 40 염기쌍을 추가로 결실시킬 수 있지만, 이러한 결실이 외래 폴리아데닐화 시그날을 제공하여 재조합 바이러스에 삽입된 유전자의 전사를 종결시킨다. 이러한 결실을 이용하여 제작된 초기 바이러스는 293 세포에서 야생형 바이러스로 오염되었다는 증거 없이 용이하게 증식하며, 결실 부위에 삽입된 전사 유니트로부터 건전한 p53 발현을 지시한다.

상기한 단백질 IX 결실을 함유한 재조합 바이러스의 삽입 용량은 대략 2.6 kb 이다. 이것은 p53 cDNA를 비롯한 많은 유전자에 충분한 크기이다. 삽입 용량은 아데노바이러스 백본(backbone)에 초기 영역 3 또는 4 내의 결실과 같은 다른 결실을 도입함으로써 증가시킬 수 있다 (Graham & Prevec (1991) 참조). 예를 들어, 초기 영역 3 내의 비필수적 서열 중 1.9 kb의 결실을 함유한 아데노바이러스 백본을 사용할 수 있다. 이러한 추가 결실이 있는 경우 벡터의 삽입 용량은 대략 4.5 kb로 증가되어 망막아종 종양 억제 유전자의 cDNA를 비롯한 많은 보다 큰 cDNA에 충분한 크기가 된다.

본 발명은 아데노바이러스 단백질 IX DNA의 부분적 또는 전체적 결실을 특징으로 하고, 외래 단백질 또는 그의 기능성 단편 또는 그의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 진단 및 치료용 폴리펩티드 및 단백질의 안전한 재조합체 생산에 유용하며, 보다 중요하게는 유전자 요법에서 유전자의 도입에 유용하다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 p53, Rb 또는 미토신과 같이 세포 주기 조절에 효과적인 단백질, 또는 조건 자살 유전자 티미딘 키나아제 (효과를 나타내기 위해서는 티미딘 키나아제 대사물과 함께 사용해야 함)와 같이 세포 사멸 유도에 유효한 단백질의 발현을 위한 외래 유전자를 함유할 수 있다. 본 발명의 벡터에는 임의의 발현 카세트를 사용할 수 있다. "발현 카세트"란, CMV 프로모터 인핸서 등과 같은 전사 프로모터/인핸서, 외래 유전자 및 하기에 규정된 일부 실시태양에서는 폴리아데닐화 시그날을 가진 DNA 분자를 뜻한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외래 유전자"란, 야생형 아데노바이러스에서 발견되는 대응 DNA 분자와 일치하는 방향 및 위치로 존재하지 않는 DNA 분자를 뜻하는 것이다. 외래 유전자는 4.5 kb 이하의 DNA 분자이다. "발현 벡터"란, 적절한 숙주 세포에서 증식할 때 삽입된 DNA 서열이 발현되도록 하는, 즉 DNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드가 숙주의 시스템에 의해 합성되게 하는 벡터를 뜻한다. 재조합 아데노바이러스 발현 벡터는 생물학적으로 활성인 단백질 IX 또는 그의 단편이 생산되지 않는다면 아데노바이러스 단백질 IX를 코딩하는 유전자의 일부를 함유할 수 있다. 이 벡터의 예는 제1도 또는 제4도의 제한효소 맵을 갖는 발현 백터이다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터에는 유도가능한 프로모터 또한 사용할 수 있다. 이들 프로모터는 부가적인 분자의 존재시에만 전사를 개시시킬 것이다. 유도가능한 프로모터의 예에는 β-인터페론 유전자, 히이트 쇼크 유전자, 메탈로티오닌 유전자로부터 얻을 수 있는 프로모터, 또는 스테로이드 호르몬 반응성 유전자로부터 얻을 수 있는 프로모터 등이 있다. 조직 특이성 발현은 유전자 발현 분야에 잘 특징화되어 있으며 상기와 같은 조직 특이성이고 유도가능한 프로모터는 당업계에 매우 잘 알려져 있다. 상기 유전자들은 외래 유전자가 표적 세포에 도입된 후 그 유전자의 발현을 조절 하는 데 사용된다.

또한, 본 발명의 한 실시태양에서는 상기한 바와 같이, 5' 바이러스 말단에서 3500 bp인 지점으로부터 약 4000 bp인 지점에까지 이르는 단백질 IX 유전자 서열의 덜 광범위한 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 별도의 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스 발현 벡터는 아데노바이러스 초기 영역 3 및(또는) 4 내의 비필수 DNA 서열 및(또는) 아데노바이러스 E1a 및 E1b로 지칭되는 DNA 서열이 추가로 결실될 수 있다. 이 실시태양에서, 외래 유전자는 크기가 4.5 kb 이하인 DNA 분자이다.

또다른 실시태양에서는 E1a 및 E1b에 대해 3' 쪽에 위치한 40 개 이하의 뉴클레오티드 결실, 및 pIX 결실, 및 외래 유전자에 호응하는 위치로 재조합 벡터 내로 삽입되어 이 외래 유전자의 발현을 조절하는, 폴리아데닐화 시그날을 코딩하는 외래 DNA 분자를 함유할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 재조합 아데노바이러스 발현 벡터는 야생형 군 아데노바이러스, 혈청형 1, 2, 5 또는 6으로부터 유도될 수 있다.

한 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스 발현 벡터는 기능성 종양 억제 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 외래 유전자를 함유할 수 있다. 본 본원에 사용된 바와 같이 용어 "기능성"이 종양 억제 유전자와 관련된 경우, 이는 세포가 종양 세포의 행태를 보이는 것을 효과적으로 억제하는 종양 억제 단백질을 코딩하는 종양 억제 유전자를 말한다. 기능성 유전자에는 예를 들면, 정상 유전자의 야생형 및 효과적인 종양 억제 단백질을 코딩하는 능력을 보유한 정상 유전자의 변형물 및 조건 자살 단백질 또는 독소와 같은 기타 항종양 유전자가 포함될 수 있다.

이와 유사하게, 본원에 사용된 바와 같이 "비기능성"이란 "불활성화"와 동의어이다. 비기능성 또는 결핍 유전자는 예를 들면 점 돌연변이, 결실, 메틸화 및 당업계에 공지된 다른 경우를 비롯한 다양한 사건에 의해 유발될 수 있다,

본원에 사용된 바와 같이, 한 유전자의 "활성 단편"에는 종양 억제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 능력을 보유하는 유전자의 보다 작은 부분이 포함된다. 하기에서 보다 상세히 설명되는 p56^RB는 기능성 종양 억제 유전자의 활성 단편의 한 예일 뿐이다. 변형되지 않은 유전자의 기능적 활성이 유지되는 한, 부가, 결실 또는 치환과 같은 종양 억제 유전자의 변형 또한 활성 단편의 의미 내에 있는 것으로 간주된다.

종양 억제 유전자의 다른 한 예는 망막아종 (RB)이다. 완전한 RB cDNA 뉴클레오티드 서열 및 생성되는 RB 단백질 (p110^RB로 표시)의 추정 아미노산 서열은 문헌[Lee 등 (1987)] 및 제3도에 나타나 있다. 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 분자 또는 제3도에 나타낸 DNA 서열을 갖는 DNA 분자 역시 망막아종 종양 억제 단백질의 발현에 유용하다. p110^RB의 말단 절단형인 p56^RB또한 유용하다. p56^RB의 서열에 대해서는 문헌[Huang 등 (1991)]을 참조한다. 그 밖의 종양 억제 유전자를 본 발명의 벡터에 사용할 수 있다. 여기에는 p16 단백질 (Kamb 등 (1994)), p21 단백질, 윌름(Wilm)씨 종양 WT1 단백질, 미토신, h-NUC, 또는 결장암 DCC 단백질 등이 있으나 이는 오직 예일 뿐이다. 미토신은 1993년 10월 22일자로 출원된 X. Zhu 및 W-H Lee의 미국 출원 제08/141,239호 및 1994년 10월 24일자로 출원된 동일 발명자에 의한 후속적인 일부 계속 출원인 대리인 관리번호 P-CJ 1191에 기재되어 있으며, 상기 두 가지 문헌 모두가 본원에 참고로 도입된다. 마찬가지로 h-NUC는본 명세서에서 참고로 도입한 1993년 12월 20일자 W-H Lee 및 P-L Chen의 미국 출원 제08/170,586호에 기재되어 있다.

당업자에게 공지된 바와 같이, 용어 "단백질"이란, 펩티드 결합에 의해 특정한 서열로 연결된 아미노산의 선형 중합체를 뜻한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"이란, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 아미노산의 D 또는 L 입체 이성질체 형태를 말한다. 또한, 본 발명의 범위에는 동등한 단백질 또는 동등한 펩티드, 예를 들면 정제된 야생형 종양 억제 단백질의 생물학적 활성을 갖는 것들이 포함된다. "동등한 단백질" 및 "동등한 폴리펩티드"란, 자연 발생 단백질 또는 폴리펩티드의 선형 서열에서 벗어났으나 그의 생물학적 활성을 변화시키지 않는 아미노산 치환체를 함유하는 것을 말한다. 이들 동등물들은 1개 이상의 아미노산을 관련된 아미노산, 예를 들면 비슷하게 전하를 띤 아미노산으로 대체함으로써, 또는 측쇄 또는 관능기의 치환 또는 변형에 의해 천연 서열과 다를 수 있다.

또한, 기능성 종양 억제 단백질의 정의에는 그의 존재가 숙주 세포의 종양형성성, 악성 또는 과다증식성 표현형을 감소시키는 임의의 단백질도 포함된다. 이러한 정의에 포함되는 종양 억제 단백질의 예로는 p110^RB, p56^RB, 미토신, h-NUC 및 p53 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. "종양형성성"은 종양을 형성하는 능력을 갖거나 종양 형성을 야기할 수 있는 능력을 뜻하려는 것이며 종양적 성장과 동의어이다. "악성"은 전이되고 숙주 생물의 생명을 위태롭게 하는 능력을 갖는 종양 세포를 설명하는 것이다. "과다증식성 표현형"은 그 세포 유형의 정상적인 성장한계를 넘는 속도로 성장하고 분열하는 세포를 설명하는 것이다. 또한 "종양적(neoplastic)"은 내인성 기능성 종양 억제 단백질이 결여된 세포 또는 세포가 기능성 종양 억제 단백질을 코딩하는 내인성 핵산을 발현시킬 수 없음을 포함하는 것이다.

본 발명의 벡터의 한 예는 p53 단백질을 코딩하는 외래 유전자 또는 그의 활성 단편을 함유하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터이며, 이는 본 발명에 의해 제공된다. p53 유전자의 코딩 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

표 1

본 명세서에서 설명된 임의의 발현 벡터는 진단 또는 치료용 조성물로서 유용하다. 이들 벡터는 유전자 요법에 유용할 다수의 종양 억제 유전자 스크리닝에사용될 수 있다. 예를 들면, 종양성인 것으로 의심되는 세포 시료를 대상 또는 포유동물에게서 수거할 수 있다. 그 다음, 이 세포를 몇몇 기능성 종양 억제 유전자 중 하나를 코딩하는 외래 유전자를 삽입시킨 본 발명의 재조합 벡터 유효량과 적절한 조건 하에서 접촉시킨다. 이 유전자의 도입이 악성 표현형을 반전시킬 것인지 여부는 연질 아가(agar)에서의 콜로니 형성 또는 누드 마우스에서의 종양 형성에 의해 측정할 수 있다. 악성 표현형이 반전되면, 그 외래 유전자는 그 대상 또는 포유동물에 대한 성공적인 유전자 요법에 대한 긍정적인 후보인 것으로 결정된다. 제약상 사용될 때에는 이들을 1 종 이상의 제약상 허용가능한 담체와 결합시킬 수 있다. 제약상 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 생리적 완충 염수와 같은 수용액 또는 글리콜, 글리세롤, 식물성 오일 (예, 올리브유) 또는 주사가능한 유기 에스테르와 같은 기타 용매 또는 비히클 등이 있다. 제약상 허용가능한 담체를 이용하여 상기 조성물을 세포에 시험관내 투여하거나, 대상에게 생체내 투여할 수 있다.

제약상 허용가능한 담체는 예를 들면 조성물을 안정화시키거나 약제의 흡수를 증가 또는 감소시키는 작용을 하는 생리적으로 허용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리적으로 허용가능한 화합물의 예로는 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이팅제, 저분자량 단백질 또는 기타 안정화제 또는 부형제 등이 있다. 기타 생리적으로 허용가능한 화합물에는 습윤제, 유화제, 분산제 또는 특히 미생물의 생장 또는 작용 방지에 유용한 방부제 등이 있다. 각종 방부제가 공지되어 있으며, 이의 예로는 페놀 및 아스코르브산 등이 있다. 당업자는 생리적으로 허용가능한 화합물 등의 제약상 허용가능한 담체의 선택이 폴리펩티드의 투여 경로 및 특정 폴리펩티드의 구체적인 물리화학적 특성 등에 따라 달라짐을 알 것이다. 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴과 같은 생리적으로 허용가능한 화합물은 대상에 투여된 제약 조성물의 흡수 속도를 지연시키는 지연제로서 특히 유용하다. 담체, 안정화제 또는 보조제의 더 많은 예는 본원에 참고로 도입된 문헌[Martin, Remington's Pharm. Sci., 15판 (Mack Publ. Co., Easton) 1975]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 필요하다면 상기 제약 조성물을 리포좀, 미소구 또는 기타 중합체 매트리스 내에 도입시킬 수 있다 (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida, (1984), 상기 문헌은 본원에 참고로 도입됨). 예를 들어, 인지질 또는 다른 지질로 구성된 리포좀은 비교적 제조 및 투여가 간단하며, 무독성이고, 생리적으로 허용가능하고 대사가능한 담체이다.

본원에 사용된 바와 같이 "제약 조성물"은 1 종 이상의 상기 제약상 허용가능한 담체와 배합한, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 말한다. 이러한 조성물은 치료용 또는 예방용으로 투여할 수 있다. 이들은 유효량을 사용하여 숙주 세포와 생체내, 생체외, 또는 시험관내로 접촉시킬 수 있다. 숙주 세포와 접촉시키는 시험관내 및 생체외 수단은 하기에 설명하였다. 생체내로 실시하는 경우, 본 발명의 벡터를 함유하는 제약의 투여 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 경구, 종양내, 정맥내, 근육내 또는 복막내 투여 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로 행할 수 있으며, 다른 치료 조성물의 경우와 마찬가지로 대상 및 치료되는 상태에 따라 달라질 것이다 (Landmann 등 (1992); Aulitzky 등 (1991); Lantz 등 (1990); Supersaxo 등 (1988); Demetri 등 (1989); 및 LeMaistre 등 (1991)).

또한, 본 발명은 상기한 재조합 아데노바이러스 발현 벡터가 삽입된, 동물 세포 또는 포유동물 세포 등 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 제공한다. 적절한 원핵 세포에는 대장균 세포와 같은 세균 세포 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포를 레트로바이러스 벡터로 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 (Sambrook 등 (1989) 참조), 형질감염법, 전기천공법 및 미세주입법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 동물은 포유동물과 동의적으로 사용되는 것이며 소, 돼지, 고양이, 원숭이, 개, 말, 쥐과, 래트 또는 사람 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 숙주 세포에는 골육종, 난소암종, 유방암종, 흑색종, 간암종, 폐암, 뇌암, 결장직장암, 조혈세포, 전립선암, 경부암종, 망막아종, 식도암종, 방광암, 신경아종, 또는 신장암과 같은 종양성 또는 종양 세포 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, E1a및 E1b 또는 E1a, E1b 및 pIX를 발현할 수 있는 임의의 진핵 세포주는 본 발명의 벡터에 대한 적절한 숙주이다. 한 실시태양에서, 적절한 진핵 숙주세포는 미합중국 20852 메릴랜드주 로크빌 12301 파크론 드라이브 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 구입할 수 있는 293 세포주이다.

본 명세서에서 설명한 임의의 형질전환된 숙주 세포는 진단 또는 치료용 조성물로서 유용하다. 제약상 사용될 때, 이들은 각종 제약상 허용가능한 담체와 배합할 수 있다. 적절한 제약상 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 상기한 것들이다. 이러한 조성물은 하기에 더 상세히 설명한 바와 같이 유효량을 치료용 또는 예방용으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 숙주 세포의 형질전환 방법을 제공한다. 이 방법은 숙주 세포, 즉 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 본 명세서에 설명된 임의의 발현 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 방법으로 형질전환된 숙주 세포 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 접촉은 당업계에 공지된 방법 (Sambrook 등 (1989))을 사용하고 유효량의 발현 벡터를 사용하여 시험관내, 생체내, 또는 생체외로 시행할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주 세포를 삽입된 외래 유전자의 전사 및 번역에 유리한 적합한 조건 하에서 성장시킴으로써 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다. 포유동물, 효모, 곤충 또는 세균 세포와 같은 각종 숙주 세포에서의 재조합 발현 방법은 상기 Sambrook 등의 문헌에 기재된 것을 비롯하여 당업계에 널리 공지되어 있다. 이어서, 항-단백질 항체를 사용한 정제법 또는 컬럼 정제법과 같은 통상적인 방법으로, 번역된 외래 유전자를 단리할 수 있다. 단리된 단백질 또는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 정제 또는 단리란 자연 또는 숙주 세포 환경에서 통상 그 단백질 또는 폴리펩티드와 결합되어 있는 천연 단백질 또는 핵산을 실질적으로 제거하는 것을 뜻한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터 또는 형질전환된 숙주 세포가 삽입된, 사람 이외의 동물을 제공한다. 이러한 "트랜스제닉(transgenic)" 동물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 미국 특허 제5,175,384호에 기재된 방법에 의해서, 또는 문헌[Culver 등 (1991)]에 기재된 바와 같은 통상적인 생체외 요법 기술에 의해 만들어진다.

하기에 상세히 설명한 바와 같이, 상기한 종양 억제 야생형 p53을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 임상적 표적을 포함하여 광범위한 사람 종양 세포 유형에서 DNA 합성을 효과적으로 억제하고 성장을 억제할 수 있다. 또한, 재조합 아데노바이러스는 p53과 같은 종양 억제 유전자를 종양 내로의 직접 주사 또는 암세포의 사전 생체외 처치에 의존하지 않고도 생체내 수립된 종양에서 발현할 수 있다. 발현된 p53은 기능성이며, 생체내의 종양 성장을 효과적으로 억제하고, 사람 폐암의 누드 마우스 모델에서 생존 시간을 현저히 증가시킨다.

그러므로, 본 발명의 벡터는 유전자 요법에 특히 적합하다. 따라서, 이들 벡터를 활용한 유전자 요법의 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 벡터를 정제한 다음 유효량을 대상에게 생체내 또는 생체외로 투여한다. 유전자 요법의 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Larrick, J.W. & Burck, K.L. (1991); Kreigler, M. 1990)]을 참조한다. "대상"은 임의의 동물, 포유동물, 래트, 쥐과, 소, 돼지, 말, 개, 고양이 또는 사람 환자를 뜻한다. 외래 유전자가 종양 억제 유전자 또는 기타 항종양 단백질을 코딩하는 경우, 이 벡터는 대상의 과다증식성 세포의 치료 또는 감소, 대상에서의 종양 증식 억제, 또는 특정 관련 병상의 개선에 유용하다. 병적 과다증식성 세포는 다음 질환 상태의 특징이다: 갑상선 비후증-그라브(Grave)씨병, 건선, 양성 전립선 비대증, 유방암, 육종 및 기타 종양물(neoplasma)을 비롯한 리-프라우메니(Li-Fraumeni) 증후군, 방광암, 결장암, 폐암, 각종 백혈병 및 림프종. 비(非)병적 과다증식성 세포의 예는 수유기 진행 중의 유선 상피세포 및 상처 복구와 관련된 세포 등에서 찾아볼 수 있다. 병적 과다증식성 세포는 접촉 억제의 소실 및 세포의 표면 특성의 변화 및 나아가 세포간 신호전달의 장애를 암시하는 선택적인 부착능력의 감소를 특징적으로 보인다. 이러한 변화에는 분열하려는 자극 및 단백질분해 효소 분비능력이 포함된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터(오토로거스(autologous) 말초 혈액 또는 골수로부터 유도됨)를 사용하여 세포 제제 내로 야생형 종양 억제 유전자를 도입시켜 골수 재구성시 조혈 전구체를 오염시키는 병적인 포유동물 과다증식성 세포의 적절한 표본을 제거하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "적절한 표본"은 환자로부터 얻은 이종 세포 제제, 예를 들면 표현형으로 볼 때 정상인 세포와 병적인 세포 모두를 함유하는 혼합 세포 집단으로 정의된다. "투여"에는 세포 또는 대상에 정맥내로, 종양 내로의 직접 주사에 의해, 종양내 주사에 의해, 복막내 투여에 의해, 폐로의 에어로졸 투여 또는 국소적으로 행해지는 것이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 투여는 상기한 제약상 허용가능한 담체와 배합할 수 있다.

용어 "감소된 종양형성성"이란, 보다 덜 종양형성적이거나 비종양형성적인 세포로 전환된 종양 세포를 뜻하려는 것이다. 종양형성성이 감소된 세포는 생체내에서 종양을 전혀 형성하지 않거나, 또는 생체내 종양 성장이 나타나기까지 수주에서 수개월에 이르는 연장된 지연시간을 갖고(거나) 종양의 3차원적인 크기가 완전히 불활성화되거나 비기능성인 종양 억제 유전자를 가진 종양에 비해 느리게 증가한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"이란 세포 증식을 제어하는 데 긍정적인 결과를 달성하는 벡터 또는 항암 단백질의 양을 뜻하려는 것이다. 예를 들면, 1회의 투여량에는 약 10⁸내지 약 10¹³개의 감염성 세포가 함유될 수 있다. 전형적인 치료 과정은 5일의 기간에 걸쳐 1일 1회의 상기와 같은 투여를 행하는 것이다. 유효량은 치료되는 질병 또는 상태, 환자 및 그의 상태, 및 당업자에게 공지된 기타 요인에 의해 달라질 것이다. 유효량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

적절한 조건 하에서, 그 병상을 개선시킬 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 외래 유전자를 함유한 상기 벡터 유효량을 대상에게 투여함으로써 대상의 과다증식성 세포 또는 유전적 결함을 특징으로 하는 병상을 개선시키는 방법 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전적 결함"이란, 겸상 적혈구 빈혈 또는 테이삭스(Tay-Sachs)병과 같이 유전 요인에 기인하는 임의의 질병 또는 비정상적 상태를 뜻한다.

또한, 본 발명은 종양 억제 유전자 이외의 항암 유전자를 함유하는 아데노바이러스 발현 벡터 유효량을 종양 덩어리 내로 도입시킴으로써 대상 내의 종양 세포의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 항암 유전자는 예를 들면 티미딘 키나아제 (TK)를 코딩할 수 있다. 그 다음, 대상에 항암 유전자의 존재시 세포에 독성을 보이는 유효량의 치료제를 투여한다. 티미딘 키나아제라는 구체적인 경우, 치료제는 간시클로비르 (GCV), 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오시드 (araM), 또는 이들의 기능성 동등물과 같은 티미딘 키나아제 대사물질이다. 숙주 세포에 독성을 갖기 위해서는 티미딘 키나아제 유전자와 티미딘 키나아제 대사물질 모두 동시에 사용되어야 한다. 그러나, GCV는 그 존재시 인산화되고 DNA 합성의 강력한 억제제가 되는 반면 araM은 세포독성 동화물질인 araATP로 전환된다. 다른 항암 유전자도 마찬가지로 대응하는 치료제와 함께 사용되어 종양 세포의 증식을 감소시킬 수 있다. 이러한 다른 유전자 및 치료제 배합은 당업자에게 공지되어 있다. 또하나의 예는 시토신 디아미나아제라는 효소를 발현하는 본 발명의 벡터가 될 수 있다. 이러한 벡터는 5-플루오로우라실 (Austin & Huber, 1993)이라는 약물 투여 또는 6-메틸-퓨린-2'-데옥시리보뉴클레오시드와 조합된 최근에 알려진 대장균 Deo △ 유전자(Sorscher 등 1994)와 병행하여 사용될 것이다.

앞서 설명한 종양 억제 유전자의 사용시에서와 마찬가지로, 단독 또는 적절한 치료제와 배합한 다른 항암 유전자의 사용은 종양 및 악성 종양의 제어되지 않는 세포 성장 또는 증식 특성에 대한 치료법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 환자의 제어되지 않은 세포 성장을 정지시킴으로써 환자에게 존재하는 질병 또는 악액질의 증상을 완화시키는 치료법을 제공한다. 이러한 치료의 효과에는 환자의 생존 시간 연장, 종양 부피 또는 중량의 감소, 종양 세포의 아팝토시스 또는 순환 종양 세포수 감소 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 치료법의 유익한 효과를 정량하는 수단은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명은 아데노바이러스 단백질 IX DNA의 부분적 또는 총체적 결실을 특징으로 하고, 자살 유전자 또는 그의 기능성 동등물인 외래 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. 상기한 항암 유전자 TK는 그것이 발현될 경우 유전자 산물이 세포에 치명적이거나 치명적이 되도록 할 수 있기 때문에 자살 유전자의 한 예가 된다. TK의 경우, 치명성은 GCV의 존재시에 유도된다. TK 유전자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터 유도된다. 대장균 HB101 중의 플라스미드 pMLBKTK (ATCC 수탁번호39369로부터)는 본 발명에 사용하기 위한 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV-1) 티미딘 키나아제 (TK) 유전자의 한 공급원이다. 그러나, 다수의 다른 공급원도 존재한다.

TK 유전자는 아데노바이러스 발현 벡터를 적절한 제약상 허용가능한 담체와 배합함으로써 종양 덩어리 내로 도입시킬 수 있다. 도입은 예를 들면 종양 덩어리내로의 재조합 아데노바이러스의 직접적 주사에 의해 이루어질 수 있다. 간세포 암종 (HCC)과 같은 특정한 암의 경우, 대부분의 HCC는 간동맥을 순환의 원천으로 하기 때문에 전달을 위해 간동맥 내로의 직접 주사를 사용할 수 있다. 종양의 증식을 제어하기 위해, 환자에게 간시클로비르와 같은 TK 대사물질을 처치함으로써 세포 사멸을 유발시켜 종양 부피를 감소시킨다. TK 대사물질은 예를 들어 종양 내로의 국소 접종에 의해서, 또는 HCC라는 특정한 경우에는 간동맥으로의 주사에 의해 전신적으로 투여될 수 있다. TK 대사물질은 1일 1회 이상 투여되는 것이 바람직하지만 필요에 따라 증감할 수 있다. TK 대사물질은 TK 함유 벡터 투여와 동시에, 또는 그에 이어서 투여할 수 있다. 당업자는 치료상 유효한 투여량 및 기간을 알거나 결정할 수 있다.

종양 억제 유전자의 종양 특이성 전달 방법은 동물 내의 표적 조직을 유효량의 본 발명의 재조합 아데노바이러스 발현 벡터와 접촉시킴으로써 수행된다. 유전자는 기능성 종양 억제 유전자 또는 자살 유전자와 같이 항암제를 코딩하는 것으로 한다. "접촉"은 종양내 주사와 같은, 벡터의 효과적인 이전을 위한 임의의 전달 방법을 포함하기로 한다.

또한, 본 발명은 또한 질병 치료 또는 치료법을 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실험 I

본 실시예의 출발 물질로 플라스미드 pAd/MLP/53/E1b-를 사용하였다. 이 플라스미드는 pBR322 유도체인 pML2 (염기쌍 1140에서 2490까지가 제거된 pBR322)에 기초한 것으로, 염기쌍 357에서 3327까지가 제거된 염기쌍 1에서 염기쌍 5788에 이르는 아데노바이러스 타입 5 서열을 함유한다. Ad5 357/3327 결실 부위에는 아데노바이러스 타입 2 주 후기 프로모터, 아데노바이러스 타입 2 3부분 리더 cDNA 및 사람 p53 cDNA로 이루어진 전사 단위가 삽입되어 있다. 이 플라스미드는 Ad5 E1a 및 E1b 유전자가 제거되었으나 Ad5 단백질 IX 유전자를 함유한 전형적인 E1 대체 벡터이다 (아데노바이러스 벡터의 자세한 사항은 Graham & Prevec (1992) 참조). Ad2 DNA는 Gibco BRL로부터 구입하였다. 제한 효소 및 T4 DNA 리가아제는 New England Biolabs에서 구입하였다. 대장균 DH5α감응 세포는 Gebco BRL로부터 구입하였으며, 293 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수하였다. Prep-A-Gene DNA 정제용 수지는 BioRad에서 구입하였다. LB 브로스 성장 배지는 Difco에서 구입하였다. Qiagen DNA 정제 컬럼은 Qiagen, Inc.에서 구입하였다. Ad5 dl327은 뉴욕 대학의 R.J. Schneider로부터 입수하였다. MBS DNA 형질감염 키트는 Stratagene으로부터 구입하였다.

1 μg pAd/MLP/p53/E1b를 제한 효소 Ecl 136II 및 NgoMI 각 20 유닛으로 제조사의 권고에 따라 소화시켰다. 제조사의 권고에 따라, 5 μg Ad2 DNA를 제한 효소 DraI 및 NgoMI으로 소화시켰다. 제한 효소 소화물을 0.8 % 아가로오스 겔의 개별 레인에 로딩하고 100 볼트에서 2 시간 동안 전기영동시켰다. 제조사의 권고에 따라, Prep-A-Gene DNA 추출 수지를 사용하여 Pad/MLP/p53/E1b- 시료 중의 4268 bp 제한 단편 및 Ad2 시료 중의 6437 bp 단편을 겔에서 단리하였다. 제조사의 권고에 따라, 이들 제한 단편을 혼합하고 16℃, 총 50 μl 부피 중에서 16 시간 동안 T4 DNA 리가아제로 처리하였다. 라이게이션 반응물 중 5 μl를 사용하여, 제조사의 방법에 따라 암피실린 내성 대장균 DH5α세포를 형질전환시켰다. 이 과정을 통해 얻어진 6 개의 세균 콜로니를 사용하여 LB 성장 배지 각 2 ml 배양액을 접종시키고 37℃에서 진탕하면서 밤새 배양하였다. 표준 방법(Sambrook 등 (1989))을 사용하여, 각 세균 배양물로부터 DNA를 수득하였다 각 단리물로부터 얻어진 플라스미드DNA의 1/4를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 20 유닛으로 소화시켜 3627, 3167, 2466 및 1445 bp의 XhoI 제한 단편을 함유하는 올바른 재조합체를 스크리닝하였다. 6 개의 스크리닝 단리물 중 5 개가 올바른 플라스미드를 함유하였다. 다음으로, 대량의 플라스미드 DNA를 단리하기 위해 이들 중 하나를 사용하여 LB 배지 1 리터에 접종하였다. 철야 인큐베이션 시킨 다음, 제조사의 권고에 따라 Qiagen DNA 정제 컬럼을 사용하여 이 1 리터 배양물로부터 플라스미드 DNA를 단리하였다. 이렇게 하여 얻어진 플라스미드를 Pad/MLP/p53/PIX-로 지칭하였다. 이 플라스미드 표본은 1993년 10월 22일자로 미합중국 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 이 기탁은 특허 절차를 위한 국제 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에서 행한 것이다. 이 기탁물은 ATCC 수탁번호 75576을 부여받았다.

재조합 아데노바이러스를 제작하기 위해, Pad/MLP/p53/PIX- 10 μg을 제한 효소 EcoRI 40 유닛으로 처리하여 플라스미드를 선형화시켰다. 아데노바이러스 타입 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982))를 제한 엔도뉴클레아제 ClaI으로 소화시키고 큰쪽 단편 (약 33 kb)을 수크로오스 구배 원심분리로 정제하였다. EcoRI 처리된 Pad/MLP/p53/E1b- 10 μg과 ClaI 처리된 Ad5 dl327 2.5 μg을 혼합하고 MBS 포유 동물 형질감염 키트를 제조사의 권고에 따라 사용하여 대략 10⁶개의 293 세포를 형질감염시키는 데 사용하였다. 형질감염 후 8일째에 293 세포를 신선한 배지 중으로 1 대 3으로 나누어 넣었으며 2일 후에는 이 아데노바이러스 유도 세포병리학적 효과가 형질감염된 세포에서 명백해졌다. 형질감염 13일 후에 감염된 세포로부터 표준 방법을 사용하여 DNA를 수득하고 (Graham & Prevec (1991)), 제한 엔도뉴클레아제 XhoI을 사용한 제한 소화로 분석하였다. 바이러스에 의해 지시된 p53 발현은 Saos-2 골육종 세포를 바이러스 용해물로 감염시킨 후 1801로 지칭되는 항p53 모노클로날 항체로 면역블롯팅하여 확인하였다.

실험 II

재료 및 방법

세포주

10% 규정 보충된 소혈청을 함유한 DME 배지 (Hyclone) 중에 유지되는 사람 태아 신장 세포주 293 (ATCC CRL 1573)에서 재조합 아데노바이러스를 성장 증식시켰다. Saos-2 세포는 15% 소태아 혈청을 보충한 카인(Kaign) 배지 중에 유지하였다. HeLa 및 Hep 3B 세포는 10% 소태아 혈청을 보충한 DME 배지 중에 유지하였다. 다른 세포주는 모두 10% 소태아 혈청을 보충한 카인 배지 중에서 성장시켰다. Saos-2 세포는 Eric Stanbridge 박사가 제공한 것이다. 다른 세포주는 모두 ATCC에서 입수한 것이다.

재조합 아데노바이러스의 제작

Ad5/p53 바이러스를 제작하기 위해, p53에 대한 전장 cDNA를 함유하는 1.4 kb HindIII-SmaI 단편 (표 1)을 pGEM1-p53-B-T (Wen Hwa Lee 박사가 제공한 것임)로부터 단리하고 표준 클로닝 절차를 사용하여 (Sambrook 등 (1989)) 발현 벡터 pSP72 (Promega)의 다중 클로닝 부위 내에 삽입하였다. XhoI-BglII를 사용한 소화및 겔 전기영동 후에 벡터로부터 p53 삽입체를 회수하였다. 다음으로, p53 코딩 서열을 Ad5 5' 도립 말단 반복부 및 바이러스 패키징 신호 및 Ad2 주 후기 프로모터 (MLP) 또는 사람 사이토메갈로바이러스 가장 초기(immediate early) 유전자 프로모터 (CMV)의 상류에 있는 E1a 인핸서에 이어서 PML2 백그라운드 중에 3부분 리더 cDNA 및 Ad5 서열 3325-5525 bp를 함유하는 pNL3C 또는 pNL3CMV 아데노바이러스 유전자 전달 벡터 (Robert Schneider 박사가 제공함) 내에 삽입하였다. 상기 새로운 구조물은 Ad5의 E1 영역 (360-3325 bp)을 3부분 리더 cDNA로 이어지는 Ad2 MLP (A/M/53) 또는 사람 CMV 프로모터 (A/C/53)에 의해 구동되는 p53으로 대체한 것이다 (제4도 참조). p53 삽입체는 남아있는 하류의 E1b 폴리아데닐화 부위를 사용한다. Ad 5 서열 중 추가적인 705 뉴클레오티드 결실을 가져 단백질 IX (PIX) 코딩 영역이 제거된 또다른 MLP 및 CMV 구동 p53 재조합체(A/M/N/53, A/C/N/53)를 생성시켰다. 대조구로, p53 삽입체가 없는 모플라스미드 PNL3C로부터 재조합 아데노바이러스를 생성시켰다 (A/M). 제2의 대조구는 CMV 프로모터의 제어 하에 있는 베타-갈락토시다아제 유전자를 코딩하는 재조합 아데노바이러스로 구성되었다 (A/C/β-gal). 이들 플라스미드를 NruI 또는 EcoRI으로 선형화시키고 ClaI으로 소화시킨 Ad5 dl309 또는 dl327 돌연변이체의 대형 단편과 Ca/PO₄형질감염 키트 (Stratagene)를 사용하여 동시에 형질감염시켰다 (Jones & Shenk (1979)). 바이러스 플라크를 단리하고 제한 효소 소화 분석, 및 하류 p53 cDNA 서열을 사용하여 3부분 리더 cDNA 서열에 대한 재조합체 특이적 프라이머를 사용한 PCR 두 가지에 의해 재조합체를 확인하였다. 재조합 바이러스를 연속 희석에 의해 추가로 정제하고, 바이러스 입자를 표준 방법 (Graham & van der Erb (1973); Graham & Prevec (1991))에 의해 정제 및 역가측정하였다.

p53 단백질 검출

Saos-2 또는 Hep 3B 세포 (5 x 10⁵)를 바이러스/세포 플라크 형성 유닛(pfu)의 감염 다중도 (MOI)를 증가시키면서 24 시간 동안 표시된 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. 그 다음, 세포를 PBS로 1회 세척하고 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NaCl, 0.1% NP40, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 10 μg/ml 아프로티닌, 10 μg/ml 류펩틴, 및 1 mM PMSF) 중에서 수거하였다. 세포내 단백질 (약 30 μg)을 10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스에 옮겼다. 막을 α-p53 항체 PAb 1801 (Novocastro)과 인큐베이션시킨 다음, 호스라디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제와 접합시킨 양의 항-마우스 IgG와 인큐베이션시켰다. p53 단백질을 코닥 XAR-5 필름 상에의 화학발광법 (ECL 키트, Amersham)으로 가시화시켰다.

DNA 합성 속도의 측정

세포 (5 x 10³/웰)를 96웰 타이터 플레이트 (Costar)에 플레이팅하고 밤새 부착시켰다 (37℃, 7% CO₂). 그 다음, 세포를 표시된 바와 같이 MOI가 0.3 내지 100인 정제된 재조합 바이러스 입자로 24 시간 동안 감염시켰다. 감염 24 시간 후 배지를 교환하고 총 72 시간 동안 배양을 계속하였다.³H-티미딘 (Amersham, 1 μCi/웰)을 수거 18 시간 전에 가하였다. 유리 섬유 필터 상에 세포를 수거하고 흡수된 방사능의 수준을 베타 신틸레이션 계수기에서 측정하였다.³H-티미딘 흡수량을 배지 대조구에 대한 평균 % (± 표준편차)로 표시하고 MOI에 대비하여 그래프로 나타내었다.

누드 마우스에서의 종양형성성

T225 플라스크에 플레이팅한 약 2.4 x 10⁸Saos-2 세포를 A/M/N/53 또는 A/M 정제 바이러스를 MOI 3 또는 30으로 함유한 현탁 완충액 (PBS 중 1% 수크로오스)으로 처리하였다. 철야 감염에 이어서 세포를 BALB/c 무흉선 누드 마우스(1군 당 4 마리)의 좌측 및 우측 옆구리에 피하로 주사하였다. 한 쪽 옆구리에는 A/M/N/53 처리된 세포를 주사하고, 반대쪽 옆구리에는 대조구 A/M 처리된 세포를 주사하여 각 마우스가 자신의 대조구 역할을 하도록 하였다. 양옆구리에 완충액 처리된 세포를 투여한 동물을 추가 대조구로 활용하였다. 그 다음, 종양의 치수 (길이, 폭 및 높이) 및 체중을 8 주일의 기간에 걸쳐 매주 2회씩 측정하였다. 각 동물에 대해 종양 부피는 측정된 종양 치수의 평균의 1/2과 같은 반경을 같은 구상 형태로 가정하고 추정하였다.

종양내 RNA 분석

BALB/c 무흉선 누드 마우스 (생후 약 5주)에 1 x 10⁷H69 소형세포 폐암종(SCLC) 세포를 우측 옆구리로 피하주사하였다. 종양은 약 25 내지 50 mm³이될 때까지 32일 동안 진전되게 하였다. 마우스에 A/C/53 또는 A/C/β-gal 재조합 아데노바이러스 (2 x 10⁹pfu)를 종양 덩어리 아래의 피하 공간 내로 종양주위 주사하였다. 아데노바이러스 처리 2일 및 7일 후에 동물로부터 종양을 절제하고 PBS로 헹구었다. 종양 시료를 균질화시키고, TriReagent 키트 (Molecular Research Center, Inc.)를 사용하여 전체 RNA를 단리하였다. PolyATract mRNA 단리 시스템(Promega)을 사용하여 폴리A RNA를 단리하고, 약 10 ng의 시료를 p53 mRNA 발현의 RT-PCR 측정에 사용하였다 (Wang 등 (1989)). 프라이머는 아데노바이러스 3부분 리더 cDNA와 하류의 p53 cDNA 사이의 서열을 증폭하도록 설계하여 확실히 내인성 p53이 아닌 재조합 p53만을 증폭시켰다.

누드 마우스에서 수립 종양의 p53 유전자 요법

200 μl 부피 중의 약 1 x 10⁷H69 (SCLC) 종양 세포를 BALB/c 무흉선 누드 마우스 암컷에 피하주사하였다. 종양이 2 주일 동안 진전되도록 한 후 동물을 종양 크기에 따라 무작위화시켰다 (N = 5/군). A/M/N/53 또는 대조구 A/M 아데노바이러스 (2 x 10⁹pfu/주사) 또는 완충액(PBS 중 1% 수크로오스)만을 종양주위 주사로 주 당 2회, 전체 8 회 투여/군으로 투여하였다. 종양 치수 및 체중을 7주일 동안 주 당 2회 측정하고, 종양 부피를 상기한 바와 같이 추정하였다. 그 후, 동물들을 감시하면서 마우스 생존에 대한 처치의 영향을 관찰하였다.

결과

재조합 p53 아데노바이러스의 제작

아데노바이러스 타입 5의 E1a 및 E1b 영역의 일부를 Ad2 MLP (A/M/53) 또는 CMV (A/C/53) 프로모터의 제어 하에 있는 p53 cDNA로 대체함으로써 p53 아데노바이러스를 제작하였다 (제4도에 요약함). 이러한 E1 치환은 재조합 아데노바이러스가 복제하는 능력을 심각하게 훼손시켜 Ad5 E1 유전자 산물을 트랜스로 공급하는, 이들의 293 세포로의 전파를 제한하였다 (Graham 등 (1977)). 제한 효소 소화 및 PCR 분석 두 가지에 의해 p53 재조합체를 확인한 후 재조합 아데노바이러스 중 하나 (A/M/53)로부터 전체 p53 cDNA 서열을 결정하여 돌연변이가 없는 것을 확인하였다. 그 다음에는 p53 재조합체의 정제된 제제를 사용하여 HeLa 세포를 감염시켜 표현형상 야생형인 아데노바이러스의 존재를 분석하였다. E1 결실된 아데노바이러스의 복제를 허용하지 않는 HeLa 세포를 재조합 아데노바이러스 1 - 4 x 10⁹감염 유닛으로 감염시키고, 3 주일 동안 배양하면서 세포병리학적 효과(CPE)를 관찰하였다. 이 분석법을 사용했을 때 재조합 아데노바이러스 복제 또는 야생형의 오염은 검출되지 않았으며,이는 대략 10⁹중 1의 감도인 야생형 아데노바이러스로 감염시킨 대조구 세포에서 관찰되는 CPE에 의해 용이하게 알 수 있었다.

재조합 아데노바이러스로부터의 p53 단백질 발현

p53 재조합 아데노바이러스가 p53 단백질을 발현하는지를 결정하기 위해, 내인성 p53 단백질을 발현하지 않는 종양 세포주를 감염시켰다. 사람 종양 세포주 Saos-2 (골육종) 및 Hep 3B (간세포 암종)를 p53 재조합 아데노바이러스 A/M/53 또는 A/C/53을 MOI 0.1 내지 200 pfu/세포로 24 시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포로부터 얻어진 세포용해물의 웨스턴 분석 결과 두 가지 세포 유형 모두에서 투입량 의존적 p53 단백질 발현이 나타났다 (제5도). 두 가지 세포주 모두 A/M/53보다는 A/C/53으로 감염시켰을 때 p53 단백질을 더 높은 수준으로 발현하였다 (제3도). 비감염 세포에서는 p53 단백질이 전혀 검출되지 않았다. 내인성 야생형 p53의 수준은 정상적으로는 매우 낮으며, 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해서는 거의 검출할 수 없다 (Bartek 등 (1991)). 그러나, 야생형 p53 단백질 수준은 A/M/53 또는 A/C/53을 낮은 MOI로 감염시킨 후에는 쉽게 검출가능하며 (제5도), 낮은 투여량의 p53 재조합 아데노바이러스로도 잠재적으로 효과있는 수준의 p53을 생산할 수 있다는 것을 암시한다.

p53 의존적 형태 변화

p53-음성 골육종 세포주 Saos-2에 야생형 p53를 재도입시키면 통상은 방추형인 이들 세포가 특징적인 확장 및 편평화를 보인다 (Chen 등, (1990)). 아전면생장 상태의 Saos-2 세포 (1 x 10⁵세포/10 cm 플레이트)에 A/C/53 또는 대조구 A/M 바이러스를 MOI 50으로 감염시키고 미감염된 대조구 플레이트가 전면생장 상태가 될 때까지 37℃에서 74 시간 동안 배양하였다. 이 시점에서, 예상되는 형태적 변화는 A/C/53 처리된 플레이트 (제6도, 패널 C)에서는 명백하였으나 미감염 (제6도, 패널 A) 또는 대조구 바이러스로 감염시킨 플레이트 (제6도, 패널 B)에서는 그렇지 않았다. 처음에 보다 낮은 밀도로 접종한 대조구 플레이트가 A/C/53 처리된 플레이트의 경우에 근접하게 전면생장된 72 시간 후에도 정상적인 형태를 유지하였으므로 이효과는 세포 밀도의 함수는 아니었다. 이전의 결과는 Saos-2 세포에서 MOI가 50일 때 고도의 p53 단백질 발현을 보여주었으며 (제5A도), 이러한 결과는 이들 재조합 아데노바이러스에 의해 발현된 p53 단백질이 생물학적으로 활성이라는 증거를 제공해주었다.

세포내 DNA 합성의 p53 억제

p53 재조합 아데노바이러스의 활성을 더 시험하기 위해, 사람 종양 세포의 증식을 억제하는 능력을³H-티미딘 흡수로 측정하여 검사하였다. 내인성 야생형 p53을 발현하지 않는 세포 내로 야생형 p53을 도입하면 세포가 G₁/S 전이기에서 정지되어 표지된 티미딘을 새로이 합성되는 DNA 내로 흡수하는 것을 억제하게 되는 것이 밝혀진 바 있다 (Baker 등 (1990); Mercer 등 (1990); Diller 등 (1990)). 각종 p53 결여 종양 세포주에 A/M/N/53, A/C/N/53 또는 비p53 발현 대조구 재조합 아데노바이러스 (A/M)를 감염시켰다. A/M/N/53 및 A/C/N/53 재조합체 모두에 의한 강력한 투여량 의존적 DNA 합성 억제가 시험된 9 종의 상이한 종양 세포주 가운데 7 종에서 관찰되었다 (제7도). 이들 두 가지 구조물은 이들 사람 종양 세포가 돌연변이 p53을 발현하든 p53 단백질을 발현하지 못하든 관계없이 이들 세포에서 DNA 합성을 억제할 수 있었다. 이 검사에서는 또한, A/C/N/53 구조물이 A/M/N/53보다 일관되게 강력하다는 것이 드러났다. Saos-2 (골육종) 및 MDA-MB468 (유방암) 세포에서, A/C/N/53 구조물을 10 정도로 낮은 MOI로 사용했을 때, DNA 합성이 거의 100% 억제되었다. 대조구 아데노바이러스에 의한 억제율이 겨우 10 내지 30%인 투여량에서도p53 재조합 아데노바이러스 중 어느 하나를 사용한 경우에는 DNA 합성이 50 내지 100% 감소하는 것이 관찰되었다. 이와는 대조적으로, Hep G2 세포 (내인성 야생형 p53을 발현하는 간암종, Bressac 등 (1990)) 또는 K562 (p53 null) 백혈병 세포주에서는 상기 구조물 중 어느 것에서도 대조구 바이러스에 비하여 현저한 p53 특이적 효과가 관찰되지 않았다.

누드 마우스에서의 종양형성성

p53 재조합 아데노바이러스에 대한 보다 엄격한 기능 시험에서, 종양 세포를 생체외 감염시킨 다음 이들 세포를 누드 마우스 내로 주사하여 재조합체가 생체내에서 종양 성장을 억제하는 능력을 조사하였다. A/M/N/53 또는 대조구 A/M 바이러스를 MOI 3 또는 30으로 감염시킨 Saos-2 세포를 누드 마우스의 반대편 옆구리내로 주사하였다. 그 다음, 8주간에 걸쳐 매주 2회씩 종양 크기를 측정하였다. MOI가 30일 때, 모든 동물의 p53 처리된 옆구리에서 종양 성장이 전혀 관찰되지 않은 반면, 대조구로 처리된 종양은 계속 성장하였다 (제8도). 대조구 바이러스 처리된 종양의 점진적인 확장은 완충액 처리된 대조 동물에서 관찰되는 것과 비슷하였다. MOI가 3일 때, 4 마리의 p53 처리된 마우스 중 2 마리에서 종양이 약 6 주를 지나면서 약간의 성장을 보이기는 하였으나 대조구 아데노바이러스와 p53 재조합체 사이에 종양 성장에 명확한 차이가 있었다. 따라서, A/M/N/53 재조합 아데노바이러스는 생체내 환경에서 p53 특이적인 종양 억제를 매개할 수 있다.

Ad/p53의 생체내 발현

암세포의 생체외 처치 및 후속적인 동물 내로의 주사가 종양 억제에 대한 중요한 시험법을 제공하기는 하지만, 보다 임상적으로 타당한 실험은 주사된 p53 재조합 아데노바이러스가 생체내에서 수립 종양을 감염시키고 p53을 발현할 수 있는가를 결정하는 것이다. 이 문제를 밝히기 위해, H69 (SCLC, p53^null) 세포를 누드 마우스에 피하로 주사하고, 32일 동안 종양이 진전되도록 하였다. 그 다음, A/C/53 또는 A/C/β-gal 아데노바이러스 2 x 10⁹pfu를 종양을 둘러싼 종양주위 공간 내로 1회 주사하였다. 다음으로 아데노바이러스 주사 후 제2일 또는 제7일에 종양을 절제하고, 각 종양으로부터 폴리A RNA를 단리하였다. 그 다음, 재조합 p53 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR을 통해 p53 처리된 종양에서 p53 mRNA를 검출하였다(제9도, 1, 2, 4, 5 레인). β-gal 처리된 동물에서 절제한 종양에서는 p53 시그날이 명백하지 않았다 (제9도, 3 및 6 레인). 액틴 프라이머를 사용한 증폭을 RT-PCR 반응에 대한 대조구로 활용하였으며 (제9도, 7 내지 9 레인), 재조합 p53 서열을 함유하는 플라스미드를 재조합 p53 특이적 밴드에 대한 양성 대조구로 사용하였다 (제9도, 10 레인). 이 실험은 p53 재조합 아데노바이러스가 종양주위 공간으로의 1회의 주사 후에 수립 종양 내에서 p53 mRNA의 발현을 특이적으로 지시할 수 있다는 것을 보여준다. 또한, p53 재조합 아데노바이러스를 사용한 감염에 이은 1 주일 이상 동안 생체내 바이러스가 보존됨을 보여준다.

생체내 효능

수립 종양의 유전자 요법의 타당성을 밝히기 위해, 종양 보유 누드 마우스 모델을 사용하였다. H69 세포를 마우스의 우측 옆구리의 피하 공간으로 주사하고,2주일 동안 종양이 자라게 두었다. 그 다음, 마우스에 완충액 또는 재조합 바이러스를 총 8회에 걸쳐 매주 2 회씩 종양주위 주사로 투여하였다. 완충액 또는 대조구 A/M 바이러스로 처리된 마우스에서는 종양이 처리 기간 내내 급속히 성장한 반면 A/M/N/53 바이러스로 처리한 종양은 성장 속도가 현격히 감소했다 (제10A도). 주사를 중지한 후, 대조 처리된 종양은 계속하여 커진 반면 p53 처리된 종양은 외인성 p53의 추가 공급 없이도 1 주일 이상 동안 거의 또는 전혀 자라지 않았다 (제10A도). 완충액만으로 처리된 대조 동물은 바이러스 처리한 어느 군에 비해서도 더욱 빠른 종양 성장을 보였으나, 처리 기간 중 3가지 군 사이에 체중에 있어서 심각한 차이는 보이지 않았다. 일부 동물의 종양 궤양화로 인해 42일 이후에는 종양 크기 측정의 타당성이 제한되었다. 그러나, 생존 시간을 측정하기 위한 계속적인 동물 관찰 결과는 p53 처리된 동물의 생존 이점을 보여주었다 (제10B도). 대조구 아데노바이러스 처리된 최후의 동물이 제83일에 죽은 반면, 완충액만을 처리된 대조 동물은 제56일까지는 모두 죽었다. 이와 대조적으로, A/M/N/53으로 처리된 5 마리의 동물 모두는 계속 생존하였다 (세포 투입 후 제130일) (제10B도). 종합적으로, 이 데이타는 수립된 p53 결핍성 종양이 있는 동물의 종양 성장 및 생존 시간 모두에 대한 p53 특이적인 효과를 확인해준다.

p53을 발현하는 아데노바이러스 벡터

투여량 의존적 방식으로 고도의 야생형 p53 단백질을 발현할 수 있는 재조합 사람 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 각 벡터는 바이러스 복제를 결핍시키는 E1a 및 E1b 영역의 결실을 함유하였다 (Challberg & Kelly (1979); Horowitz,(1991)). 또한 중요한 것은 이들 결실에는 E1b 19 및 55 kd 단백질을 코딩하는 서열이 포함된다는 것이다. 19 kd 단백질은 아팝토시스를 억제하는 데 관련된 것으로 보고되어 있으며 (White 등 (1992); Rao 등 (1992)), 55 kd 단백질은 야생형 p53 단백질에 결합할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (Sarnow 등 (1982); Heuvel 등 (1990)). 이들 아데노바이러스 서열을 제거함으로써 p53에 대한 직접 결합 또는 p53 매개 아팝토시스의 잠재적인 억제를 통한 p53 기능의 잠재적인 억제제가 제거되었다. 단백질 IX 코딩 서열 모두를 포함하여 남아있는 3' E1b 서열도 제거한 또 다른 구조물도 만들었다. 이렇게 하면 아데노바이러스의 패키징 크기 수용력이 야생형 바이러스보다 약 3 kb 모자라게 감소하는 것으로 보고된 바 있으나(Ghosh-Choudhury 등 (1987)), 이들 구조물에서는 E3 영역 역시 제거하여 A/M/N/53 및 A/C/N/53 구조물이 상기 크기 범위 내에 들어가도록 하였다. pIX 영역을 제거함으로써 293 세포에 함유된 것과 상동성인 아데노바이러스 서열은 300 bp 정도로 감소되어 재조합을 통한 복제능력이 있는 야생형 아데노바이러스의 재생성 기회를 축소시킨다. pIX 코딩 서열이 결여된 구조물은 pIX가 있는 것과 동등한 효능을 가진 것으로 보인다.

시험관내 p53/아데노바이러스 효능

감염된 세포에서 p53 단백질 발현에 대한 강력한 투여량 의존성에 맞추어, 종양 세포 성장의 투여량 의존적, p53 특이적인 억제를 증명하였다. 세포 분열은 억제되었으며, 이것은 야생형 p53 단백질 발현이 결핍된 것으로 알려진 다양한 종양 세포 유형에서 DNA 합성의 억제에 의해 증명되었다. 문헌[Bacchetti & Graham(1993)]에서 비슷한 실험에서 p53 재조합 아데노바이러스에 의한 난소암종 세포주 SKOV-3 내 DNA 합성의 p53 특이적 억제가 보고되었다. 난소암종 외에도, 임상적으로 중요한 사람의 암을 대표하며 돌연변이 p53 단백질을 과잉발현하는 세포주를 포함하는 다른 사람 종양 세포주들 역시 본 발명의 p53 재조합체에 의해 성장 억제될 수 있다는 것이 증명되었다. A/C/N/53 재조합체가 이들 종양 유형에서 DNA 합성을 90 내지 100% 억제하기에 효과적인 MOI에서, 대조구 아데노바이러스 매개 억제는 20% 미만이었다.

문헌[Feinstein 등 (1992)]에서는 백혈병 K562 세포에 있어서 야생형 p53의 재투입이 분화를 유도하고 S+G₂에 비해 G₁기에 있는 세포의 비율을 증가시키는 것으로 보고하였지만, 이 세포주에서 p53 특이적 효과는 전혀 발견되지 않았다. 문헌[Horvath & Weber (1988)]에서 사람의 말초 혈액 림프구가 아데노바이러스 감염에 대해 고도로 비허용성이라고 보고된 바 있다. 별도의 실험에서, 재조합체는 A/C/β-gal 아데노바이러스로 비반응성 K562 세포를 상당히 감염시켰으나, 대조구 Hep G2 세포주 및 강한 p53 효과를 보이는 것들을 포함한 다른 세포주는 용이하게 감염시킬 수 있었다. 따라서, 다른 요인들도 관련되어 있겠지만, 효능의 가변성의 적어도 일부는 감염의 가변성에 기인한 것으로 보인다.

제8도에서 A/M/N/53 바이러스와 관련하여 관찰된 결과는 생체내 환경 중에서 완전한 억제가 가능하다는 것을 증명한다. p53을 보다 낮은 MOI로 처리한 동물 4 마리 가운데 2 마리에서의 종양 성장의 재개는 상기 투여량에서 처음에 p53 재조합체로 감염되지 않은 작은 비율의 세포로부터 초래된 것이기 쉽다. 그러나, 보다 높은 투여량에서 A/N/N/53의 경우에 나타난 완전 억제는 종양 성장이 회복되는 능력은 극복될 수 있다는 것을 보여준다.

p53/아데노바이러스 생체내 효능

본 명세서 및 다른 그룹에 의해 행해진 연구 (Chen 등 (1990); Takahashi 등 (1992))에 의하면 야생형 p53의 발현이 결여된 사람 종양 세포는 생체외에서 p53으로 처리될 수 있으며 처리된 세포를 동물 모델 내로 이전하였을 때 종양 성장이 억제되는 결과가 올 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서는 종양 성장의 억제 및 생존 시간의 증가를 모두 이루어내는 생체내 수립 종양의 종양 억제 유전자 요법의 첫 증거를 제공한다. 본 발명의 시스템에서, 종양 세포로의 전달은 종양 덩어리 내로의 직접 주사에 의존하지 않는다. 이보다는 p53 재조합 아데노바이러스를 종양 주위 공간으로 주사하였으며, p53 mRNA 발현이 종양 내에서 감지되었다. 재조합체에 의해 발현된 p53은 기능성이며 대조구, 비p53 발현 아데노바이러스 처리된 종양의 경우에 비해 종양 성장을 강력히 억제하였다. 그러나, p53 및 대조구 바이러스 처리된 종양군 모두가 완충액 처리된 대조 동물에 비해서는 종양 억제를 보였다. 누드 마우스에서 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론-γ, 인터루킨 (IL)-2, IL-4 또는 IL-7의 국소적 발현이 T세포 독립적인 일시적 종양 억제를 유도하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Hoch 등 (1992)). 단핵 세포를 아데노바이러스 비리온에 노출시키는 것도 IFN-α/β의 약한 유도법이다 (Gooding & Wold (1990)에서 고찰됨). 그러므로, 누드 마우스에서 다소의 종양 억제가 대조구 바이러스의 경우에도 관찰된 것은 놀라운 일이 아니다. 이러한 바이러스 매개 종양 억제는 전술한 생체외 대조 바이러스 처리된 Saos-2 종양 세포에서는 관찰되지 않았다. p53 특이적인 생체내 종양 억제는 제10도에서 동물의 계속적인 관찰에 의해 극적으로 증명되었다. p53 처리된 마우스의 생존 시간은 현저히 증가되어, 5 마리의 동물 중 5 마리가 세포 투입 후 제130일 보다 오래까지 생존한 반면 아데노바이러스 대조구 처리된 동물 5 마리 중 한 마리도 살아남지 않았다. 생존한 동물들에서 종양은 여전히 성장하였으며, 이는 처음에 p53 재조합 아데노바이러스로 감염되지 않는 세포를 반영하는 것일 수 있다. 보다 강력하거나 빈번한 투여 계획이 이 문제를 다룰 수 있을 것이다. 또한, 프로모터 셧오프 (shutoff) (Palmer 등 (1991)) 또는 추가의 돌연변이가 이들 세포에 p53 재조합 아데노바이러스 처리에 대한 내성을 부여했을 수도 있다. 예를 들면, 근래 밝혀진, 야생형 p53에 의해 유도되며 후속적으로 세포 주기가 S기로 진행되는 것을 억제하는 유전자 (El-Deiry 등 (1993); Hunter (1993))인 WAF1 유전자 내의 돌연변이가 p53 내성 종양을 초래했을 수도 있다.

실험 III

이 실시예는 본 명세서에 설명된 유전자 치료법에서 자살 유전자 및 그 유전자의 조직 특이적 발현의 용도를 보이는 것이다. 간세포 암종은 전세계적으로 매년 1,250,000명의 추정 사망자를 내는, 사람에게 영향을 미치는 가장 흔한 사람 악성 종양 중 하나이기 때문에 표적으로 정하였다. 이 암의 발생률은 B형 및 C형 간염 감염 및 아플라톡신에의 노출과 관련되는 동남 아시아와 아프리카에서 매우 높다. 20% 미만의 환자가 절제 대상으로 간주되지만 현재로는 HCC 치료 가능성을 제공하는 유일한 치료법이 수술이다 (Ravoet C. 등 (1993)). 그러나, 간세포 암종 이외의 종양도 본 명세서에서 설명하는 종양 증식 감소 방법에 마찬가지로 적용할 수 있다.

세포주

HLF 세포주를 제외한 모든 세포주는 ATCC에서 입수하였다. ATCC 수탁번호는 괄호 안에 나타내었다. 사람 태아 신장 세포주 293 (CRL 1573)을 사용하여 본 명세서에 기재된 재조합 아데노바이러스를 생성 및 증식시켰다. 세포는 10% 규정된 보충 소혈청을 함유한 DME 배지 (Hyclone) 중에 유지하였다. 간세포 암종 세포주 Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) 및 HLF는 10% 소태아 혈청을 보충한 DME/F12 배지 중에 유지하였으며, 유방암종 세포주 MDA-MB468 (HTB 132) 및 BT-549 (HTB 122)도 마찬가지였다. Chang 간세포 (CCL 12)는 10% 소태아 혈청을 보충한 MEM 배지 중에서 성장시켰다. HLF 세포주는 일본 큐슈 대학교 의학부의 T. Morsaki 박사와 H. Kitsuki 박사가 제공한 것이다.

재조합 바이러스 제작

본 명세서에서 ACNTK 와 AANTK로 지칭되며 단백질 IX 기능이 없는 2 종의 아데노바이러스 발현 벡터 (제11도에 도시함)는 종양 세포 내에서 TK 자살 유전자의 발현을 지시할 수 있다. AANCAT로 지칭하는 제3의 아데노바이러스 발현 벡터를 제작하여 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자 발현을 특정한 세포 유형에 특이적으로 표적화하는 것의 타당성을 더 조사하였다. 이들 아데노바이러스 구조물은 제11도 및 제12도에 나타낸 바와 같이 조립하였으며 종양 억제 유전자의 발현에 대해 앞서 설명한 것들의 유도체이다.

외래 유전자의 발현을 위해, 사람 사이토메갈로바이러스 가장 초기 프로모터/인핸서 (CMV) (Boshart, M. 등 (1985)) 또는 사람 α-태아단백질 (AFP) 인핸서/프로모터 (Watanable, K. 등 (1987); Nakabayashi, H. 등 (1989))를 활용하여 TK 유전자 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자 (CAT)의 전사를 지시하는 발현 카세트를 삽입시켰다. CMV 인핸서 프로모터는 광범위한 세포 유형에서 충실한 유전자 발현을 지시할 수 있는 반면 AFP 인핸서/프로모터 구조물은 HCC 환자 집단의 약 70 내지 80%에서 AFP를 발현하는 간세포 암종 세포 (HCC)에 발현을 제한한다. CMV 프로모터/인핸서를 사용한 구조물에서, 아데노바이러스 타입 2의 3부분 리더 서열 또한 TK 전사물의 번역을 증대시키기 위해 삽입했다 (Berkner, K.L. & Sharp (1985)). E1 결실 외에도, 상기 두 가지 아데노바이러스 벡터 모두는 바이러스 E3 영역 내의 1.9 kb의 DNA를 추가로 제거한 것이다. E3 영역에서 제거된 DNA는 바이러스 전파에 필수적이지 않으며, 그 결실에 따라 동등한 양만큼 (1.9 kb) 외래 DNA에 대한 재조합 바이러스의 삽입 용량이 증가된다 (Graham & Prevec (1991)).

AFP 프로모터/인핸서의 특이성을 증명하기 위해, 마커 유전자인 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT)가 AFP 인핸서/프로모터의 제어하에 있는 AANCAT 바이러스를 제작하였다. ACNTK 바이러스 구조물에서는, Ad2의 3부분 리더 서열이 CMV 프로모터/인핸서와 TK 유전자 사이에 위치한다. 3부분 리더는 연결된 유전자의 번역을 증진시키는 것으로 보고되어 있다. E1 치환에 의해 재조합 바이러스의 복제능력이 손상되어 Ad5 E1 유전자 산물을 트랜스로 공급하는 293 세포로의 전파가 제한된다 (Graham 등 (1977)).

아데노바이러스 벡터 ACNTK: 대장균 HB101 (ATCC 수탁번호 39369로부터 얻음) 내의 플라스미드 pMLBKTK를 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV-1) 티미딘 키나아제 (TK) 유전자의 공급원으로 사용하였다. 제한 효소 BglII 및 Pvu II를 사용하여 소화시킴으로써 이 플라스미드에서 TK를 1.7 kb 유전자 단편으로 절제해내고, 표준 클로닝 기술(Sambrook 등 (1989))을 사용하여 플라스미드 pSP72(Promega)의 호환성 BamHI, EcoRV 제한 효소 부위로 서브클로닝하였다. 이어서, XbaI 및 BglII로 소화시켜 이 벡터로부터 TK 삽입체를 1.7 kb 단편으로 단리하고, XbaI, BamHI으로 소화시킨 플라스미드 pACN (Wills 등 (1994)) 내로 클로닝하였다. pACNTK로 지칭한 이 플라스미드 20 μg을 EcoRI으로 선형화시키고, CaPO₄형질감염 키트 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Stratagene)를 사용하여 ClaI으로 소화시킨 ACBGL (Wills 등 (1994), 상기 문헌) 5 μg과 함께 293 세포에 동시형질감염시켰다. 바이러스 플라크를 단리하고, XhoI 및 BsiWI를 사용한 단리된 DNA의 제한 효소 소화 분석에 의해 ACNTK로 지칭되는 재조합체를 확인하였다. 양성 재조합체를 연속 희석에 의해 추가로 정제하고, 표준 방법으로 확대 및 역가측정을 하였다 (Graham & Prevec, 1991).

아데노바이러스 벡터 AANTK: 말단에 제한효소 부위를 함유하는 프라이머를 사용한 PCR 증폭법으로 사람 게놈 DNA (Clontech)로부터 α-태아단백질프로모터(AFP-P) 및 인핸서 (AFP-E)를 클로닝하였다. 210 bp의 AFP-E를 단리하는 데 사용된 프라이머는 5' 프라이머에는 NheI 제한 효소 부위를, 그리고 3' 프라이머에는 XbaI, XhoI, KpnI 링커를 함유하였다. 5' 프라이머 서열은 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3'였다. 5' 프라이머 서열은 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3'였다. 1763 bp의 AFE 단편을 단리하는 데 사용된 프라이머는 5' 프라이머에는 NotI 제한효소 부위를, 그리고 3' 프라이머에는 XbaI 부위를 함유하였다. 5' 프라이머 서열은 5'-CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3'이었다. 3' 프라이머 서열은 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3' 이었다. PCR 증폭을 위해, DNA를 97℃에서 7분 동안 변성시키고, 이어서 97℃ 1분, 53℃ 1분, 72℃ 2분으로 5 사이클 돌린 다음 최종적으로 72℃에서 10분 동안 연장시켰다. 증폭된 AFE를 NotI 및 XbaI으로 소화시킨 다음, NotI, XhoI, XbaI, HindIII, Kpn I, BamHI, NcoI, Sma I, 및 Bgl II 부위를 함유하는 폴리링커에 의해 분리된 아데노바이러스 타입 5 서열 1-350 및 3330-5790을 함유한 플라스미드 벡터(pA/ITR/B)의 NotI, XbaI 부위에 삽입시켰다. 증폭된 AFP-E를 Nhe I 및 Kpn I으로 소화시키고, Xba I 및 Kpn I으로 소화시켜 둔 상기한 AFP-E 함유 구조물 내로 삽입시켰다. 다음으로 이 새로운 구조물을 Xba I 및 Ngo MI로 추가 소화시켜 아데노바이러스 서열 3330-5780을 제거하고, 이것을 이어서 아데노바이러스 타입 2의 뉴클레오티드 4021-10457을 함유한 플라스미드 pACN의 Xba I, Ngo MI 제한 단편으로 대체시켜 α-태아단백질 인핸서 및 프로모터를 모두 함유한 플라스미드 pAAN을 제작하였다. 이 구조물을 이어서 Eco RI 및 Xba I으로 소화시켜 Ad5 도립 말단 반복부, AFP-E 및 AFP-P를 함유한 2.3 kb 단편을 단리한 다음, 이를 Eco RI 및 Xba I으로 소화시킨 상기한 pACNTK의 8.55 kb 단편과 라이게이션시켜 TK 유전자가 아데노바이러스 배경에서 α-태아단백질 인핸서 및 프로모터에 의해 구동되는 pAANTK를 생성시켰다. 다음으로, Eco RI을 써서 이 플라스미드를 선형화시키고, Cla I으로 소화시킨 상기 ALBGL의 큰 단편과 함께 동시형질감염시키고, AANTK로 지칭되는 재조합체를 상기에서와 같이 단리 및 정제하였다.

아데노바이러스 백터 AANCAT: 클로암페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT) 유전자를 Xba I, Bam HI소화에 의해 pCAT-기본 벡터 (Promega Corporation)로부터 단리하였다. 이 1.64 kb 단편을 Xba I, Bam HI으로 소화시킨 pAAN (상기하였음) 내로 라이게이션시켜 pAANCAT를 생성시켰다. 다음으로 Eco RI을 써서 이 플라스미드를 선형화시키고 Cla I으로 소화시킨 γA/C/β-gal의 큰 단편과 동시형질 감염시켜 AANCAT를 생성시켰다.

리포터 유전자 발현: β-갈락토시다아제 발현

24웰 조직 배양 플레이트 (Costar)에 세포를 1 x 10⁵세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 부착되도록 하였다 (37℃, 5% CO₂). 감염 다중도 (MOI) 30으로 ACBGL를 철야 감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 3.7% 포름알데히드; PBS로 고정시키고 1 mg/ml의 Xgal 시약 (USB)으로 염색하였다. 각 MOI에서 양성으로 염색된 세포의 백분율을 추정함으로써 데이타를 평가하였다 (+, ++, +++). [+ = 1-33%, ++ = 33-67%, +++ = > 67%]

리포터 유전자 발현: CAT 발현

10 cm 플레이트 3벌에 2 x 10⁶세포 (Hep G2, Hep 3B, HLF, Chang, 및 MDA-MB468)를 접종하고 철야 인큐베이션하였다 (37℃, 7% CO₂). 다음으로 각 플레이트에 MOI가 30 또는 100으로 AANCAT를 감염시키거나 미감염시키고, 3일 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포를 트립신처리하고, PBS로 세척한 다음 100 μl의 0.25M Tris (pH 7.8)에 재현탁시켰다. 시료를 3회 동결-해동시키고, 상층액을 새 튜브로 옮기고 60℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 시료를 4℃에서 5분 동안 회전시키고, 브래드포드법을 사용하여 (Bio-Rad 단백질 분석 키트) 상층액에서 단백질 농도를 조사하였다. 0.25 M Tris, 25 μl의 4 mM 아세틸 CoA, 1 μl의¹⁴C-클로람페니콜을 사용하여 동등한 단백질 농도로 최종 부피가 75 μl가 되도록 시료를 조정하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 각 시료에 에틸 아세테이트 500 μl를 가하고, 보텍싱(vortexing) 혼합시킨 다음 실온에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 위쪽 상을 새 튜브로 옮기고 진공 하에서 원심분리하여 에틸 아세테이트를 증발시켰다. 반응 생성물을 에틸 아세테이트 25 μl 중에 재용해시키고, 박층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트에 점적하고, 이 플레이트를 미리 평형화시킨 TLC 챔버 (95% 클로로포름, 5% 메탄올)에 넣었다. 그 다음, 용매가 플레이트의 맨 위까지 이동하도록 한 후, 플레이트를 건조시키고 X선 필름에 노출시켰다.

세포 증식: ³ H-티미딘 도입

96웰 마이크로타이터 플레이트 (Costar)에 세포를 5 x 10³세포/웰로 플레이팅하고, 철야 인큐베이션하였다 (37℃, 7% CO₂). DMEM; 15% FBS; 1% 글루타민 중에 연속 희석시킨 ACN, ACNTK 또는 AATK 바이러스를 사용하여 감염 다중도 30으로 하룻밤 동안 세포를 형질감염시킨 후 세포에 간시클로비르 (Cytovene)를 0.001 내지 100 mM 사이의 로그 간격으로 3회 투여하였다. 수거 12 내지 18 시간 전, 각 웰에 1 μCi³H-티미딘 (Amersham)을 가하였다. 감염 72 시간 후 세포를 유리 섬유 필터 상으로 수거하고 액체 신틸레이션 (TopCount, Packard)을 사용하여 도입된³H-티미딘을 계수하였다. 결과는 미처리된 대조구 증식의 %로 플룻하고 배지 대조구에 대해 50% 증식 감소를 나타내기 위한 유효 투여량 (ED₅₀±표준편차)으로서 표로 제시하였다. ED₅₀치는 투여량 반응 데이타에 이론적 방정식을 맞춰 추정하였다.

세포독성: LDH 방출

세포 (HLF, 사람 HCC)를 플레이팅하고, ACN 또는 ACNTK로 감염시킨 다음 증식 분석법에서 설명한 바와 같이 간시클로비르로 처리하였다. 간시클로비르 투여 72 시간 후, 세포를 회전시키고, 상층액을 수거하였다. 락테이트 디히드로게나아제의 농도를 비색법으로 측정하였다 (Promega, Cytotox 96^TM). 평균 (± 표준편차) LDH 방출량을 MOI에 대비하여 그래프로 나타내었다.

생체내 요법

사람 간세포 암종 세포 (Hep 3B)를 10 마리의 무흉선 nu/nu 마우스 암컷 (Simonsen Laboratories, 미국 캘리포니아주 길로이 소재)에 피하로 주사하였다. 각 동물은 좌측 옆구리에 1 x 10⁷정도의 세포를 투여받았다. 종양이 27일 동안 자라도록 한 후 마우스를 종양 크기에 따라 무작위화시켰다. 격일제로 총 3회 ACNTK 또는 대조구 바이러스 ACN (100 μl 중 1 x 10⁹iu)을 종양내 및 종양 주위 주사하여 마우스를 처리하였다. 아데노바이러스 최초 투여 24 시간 후에 시작하여 마우스에 간시클로비르 (Cytovene 100 mg/kg)를 총 10일 동안 매일 복막내 투여하였다. 매주 2회 마우스의 종양 크기 및 체중을 검사하였다. 종양에 대한 측정은 버어니어 캘리퍼스를 사용하여 3차원적으로 이루어졌으며, 평균 종양 치수의 1/2를 r로 한 식 4/3πr³을 사용하여 부피를 계산하였다.

결과

재조합 아데노바이러스를 사용하여 3종의 HCC 세포주 (HLF, Hep 3B 및 Hep G2)를 감염시켰다. 1종의 사람 간 세포주 (Chang) 및 2종의 유방암 세포주 (MDAMB468 및 BT549)를 대조구로 사용하였다. AFP 프로모터/인핸서의 특이성을 증명하기 위해 바이러스 AANCAT를 제작하였다. 이 바이러스를 사용하여 HCC 종양 마커 α-태아단백질 (AFP)을 발현하거나 (Hep 3B, Hep G2), 또는 발현하지 않는 (HLF, Chang, MDAMB468) 세포를 감염시켰다. 제13도에 나타난 바와 같이, AANCAT는 AFP를 발현할 수 있는 HCC 세포에서만 CAT 마커 유전자의 발현을 지시한다 (제13도).

간세포 암종 (HCC) 치료에 대한 ACNTK와 AANTK의 효능을³H-티미딘 도입 시험을 사용하여 분석하여 세포 증식에 대한 HSV-TK 발현과 간시클로비르 처리 조합의 효과를 측정하였다. 세포주를 ACNTK 또는 AANTK 중 하나 (Wills 등 (1994), 상기 문헌), 또는 HSV-TK의 발현을 지시하지 않는 대조구 바이러스 ACN로 감염시킨 다음, 간시클로비르를 점증하는 농도로 처리하였다. 이 처리의 효과는 점증하는 간시클로비르 농도의 함수로 분석하였으며, 도입된³H-티미딘을 50% 억제하는 데 요구되는 간시클로비르의 농도(ED₅₀)를 계측하였다. 또한, 각 세포주의 아데노바이러스 매개 유전자 전달 및 발현의 상대적인 척도는 마커 유전자인 베타갈락토시다아제의 발현을 지시하는 대조구 바이러스를 사용하여 결정하였다. 제14도 및 하기 표 1에 나타낸 데이타는 ACNTK 바이러스/간시클로비르 병행 처리가 조사된 모든 세포주에서 간시클로비르를 병행한 대조구 아데노바이러스 ACN에 비해 세포 증식을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 이와 대조적으로, AANTK 바이러스 벡터는 α-태아단백질을 발현하는 것으로 밝혀진 HCC 세포주에서만 유효하였다. 또한, AANTK/GCV 조합은 세포를 고밀도로 플레이팅하였을 때 더욱 효과적이었다.

표 1

Hep 3B 종양을 보유한 누드 마우스 (N = 5/군)에 동등한 투여량의 ACNTK 또는 ACN 대조구를 종양내 및 종양 주위로 투여하였다. 재조합 아데노바이러스의 첫번째 투여 24 시간 후에, 모든 마우스에서 간시클로비르 매일 처리를 개시하였다. 각 동물에서 종양 치수를 캘리퍼스를 통해 매주 2회 측정하고, 평균 종양 크기를 제16도에 그래프로 나타내었다. 제58일에 평균 종양 크기는 ACNTK 처리된 동물에서 더 작았으나, 그 차이가 통계적 유의치에는 이르지 못하였다 (p 〈 0.09, 단축 (unpaired) t-테스트). 이들 데이타는 생체내 종양 성장에 대한 ACNTK의 특이적 효과를 뒷받침해준다. 각 군들 사이에 평균 체중의 유의한 차이는 감지되지 않았다.

본 발명을 상기 실시태양과 관련하여 설명하였으나, 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고도 다양한 변형을 가할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 이하의 특허 청구 범위에 의해서만 한정된다.

Claims (21)

1. 단백질 IX DNA가 부분적 또는 전체적으로 결실되어 있고, 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 단백질 IX 유전자 서열의 결실이 5' 바이러스 말단에서 약 3500 bp인 지점으로부터 5' 바이러스 말단에서 약 4000 bp인 지점에까지 이르는 것인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 아데노바이러스 초기 영역 3 및(또는) 초기 영역 4 중의 비필수적 DNA 서열이 추가로 결실되어 있는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
4. 제2항에 있어서, 아데노바이러스 E1a 및 E1b로 지칭되는 DNA 서열이 추가로 결실되어 있는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
5. 제2항에 있어서, 초기 영역 3 및(또는) 4 및 아데노바이러스 E1a 및 E1b로 지칭되는 DNA 서열이 추가로 결실되어 있는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 단백질 IX 결실 및 E1a 및 E1b에 대해 3'쪽에 위치한 40개 이하의 뉴클레오티드 결실, 및 폴리아데닐화 시그날을 코딩하는 외래DNA 분자를 추가로 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 혈청형 1, 2, 5 또는 6 중에서 선택된 C 군 아데노바이러스인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
8. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 2.6 kb 이하의 DNA 분자인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
9. 제6항에 있어서, 상기 유전자가 4.5 kb 이하의 DNA 분자인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
10. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 외래 기능성 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
11. 제10항에 있어서, 상기 유전자가 외래 기능성 종양 억제 단백질 또는 그의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
12. 제1항에 있어서, 상기 유전자가 자살 단백질 또는 그의 기능성 동등물을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스 발현 벡터.
13. 단백질 IX DNA가 부분적 또는 전체적으로 결실되어 있고, 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 조성물.
14. 단백질 IX DNA가 부분적 또는 전체적으로 결실되어 있고, 외래 기능성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터 및 1 종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료를 위한 제약 조성물.
15. 제14항에 있어서, 유전자에 의해 코딩되는 외래 기능성 단백질이 종양 억제 단백질이고, 암이 내인성 야생형 종양 억제 단백질의 결여에 관련된 것인 제약 조성물.
16. 제15항에 있어서, 종양이 비소형 세포 폐암, 소형 세포 폐암, 간암종, 흑색종, 망막아종, 유방 종양, 결장직장 암종, 백혈병, 임파종, 뇌 종양, 경부 암종, 육종, 전립선 종양, 방광 종양, 망상내피 조직의 종양, 윌름(Wilm)씨 종양, 성상신경교종, 신경교아세포종, 신경아세포종, 난소암종, 골육종, 및 신장암인 제약 조성물.
17. 단백질 IX DNA가 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있고, 자살 단백질 또는 그의 기능성 동등물을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터 및 1 종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 동물의 종양 증식을 억제하기 위한 제약 조성물.
18. 단백질 IX DNA가 부분적 또는 전체적으로 결실되어 있고, 자살 단백질 또는 그의 기능성 동등물을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터, 유효량의 티미딘 키나아제 대사물질 또는 그의 기능성 동등물, 및 1 종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 대상에서 종양 세포의 증식을 감소시키기 위한 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, 티미딘 키나아제 대사물질이 간시클로비르 또는 6-메톡시퓨린아라비노뉴클레오시드 또는 그의 기능성 동등물인 제약 조성물.
20. 제18항에 있어서, 종양 세포가 간세포 암종인 제약 조성물.
21. 단백질 IX DNA가 부분적 또는 전체적으로 결실되어 있고, 자살 단백질 또는 그의 기능성 동등물을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터 성분, 티미딘 키나아제 대사물질 또는 그의 기능성 동등물 성분, 제약 담체 성분 및 이들 키트 성분을 사용하여 간세포 암종을 치료하기 위한 지시사항을 포함하는, 종양 세포 증식을 감소시키기 위한 키트.