DE69731611T2

DE69731611T2 - Eine Zusammensetzung enthaltend eine Detergenz und einen ein Tumorsuppressorgen kodierenden, adenoviralen Vektor

Info

Publication number: DE69731611T2
Application number: DE69731611T
Authority: DE
Inventors: Heidrun Engler; G. Bernard HUYGHE; C. Daniel MANEVAL; Paul Shabram
Original assignee: Canji Inc
Current assignee: Canji Inc
Priority date: 1996-01-08
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2017-01-08
Also published as: US20030211598A1; US6312681B1; ES2233995T3; US5789244A; CA2242542C; EP0873141A1; CA2242542A1; AU1530097A; US20110104118A1; DE69731611D1; US6165779A; ATE282434T1; US20090048148A1; WO1997025072A1; AU732439B2; EP0873141B1; EP0873141A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung von Krebs mittels Gentherapie, wobei ein therapeutisches Gen, wie z. B. ein Tumorsuppressorgen verwendet wird, das über ein Genfreisetzungssystem wie z. B. ein aus einem rekombinanten viralen Vektor bestehendes Freisetzungssystem, freigesetzt wird, und in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärktendes Agenz enthält. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Freisetzung eines Tumorsuppressorgens (z. B. p53 oder Retinoblastom (RB)) in karzinöse Epithelgewebe und Organe, wie z. B. die Blase, wobei ein rekombinantes Adenovirus-Vektor-Freisetzungssystem verwendet wird, das in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärktendes Agenz enthält.
Blasenkrebs stellt eine wichtige Krankheits- und Todesursache dar. In Bezug auf Krankheiten, die mit Krebs in Zusammenhang stehen, rangiert Blasenkrebs bei Männern an zehnter und bei Frauen an zwölfter Stelle (Cancer Facts and Figures, Amer. Can. Soc. 5: 11, (1995)). Therapien, die für die Behandlung von Blasenkrebs anwendbar sind, umfassen adjuvante Chemotherapie oder Immunotherapie, transurethrale Resektion von erkranktem oberflächlichem Gewebe, vollständige Cystektomie oder Radiotherapie, die häufig mit einer systemischen Chemotherapie kombiniert wird. Trotz dieser therapeutischen Möglichkeiten hat sich die allgemeine Überlebensrate nicht spürbar verbessert (ebenda). Daher müssen neue therapeutische Wege für die Behandlung von Blasenkrebs entwickelt werden.
Gentherapie-Strategien wurden als alternativer therapeutischer Ansatz entwickelt (siehe z. B. Brewster et al. Eur Urol 25: 177–182 (1994); Takahashi et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 5257–5261 (1991); Rosenberg, SA, J. Clin Oncol. 10: 180–199 (1992)).
Spezielle Ansätze, die auf Gentransfer-Methoden basieren, wurden entwickelt, um Neoplasmen zu behandeln. Es wurden Methoden für die Korrektur spezifischer Defekte in bestimmten Genloci, die die Ursache für neoplastische Transformationen und Progressionen sind, entwickelt (Spandidos et al., Anticancer Res. 10: 1543–1554 (1990); Banerjee et al. Cancer Res. 52: 6297–6304 (1992)). Die Überexpression dominanter Onkogene kann mit Methoden behandelt werden, die das transformierende Gen oder Genprodukt inhibieren. Der Verlust einer Tumorsuppressorgen-Funktion kann mit Methoden behandelt werden, mittels derer die Wildtyp-Tumorsuppressorgen-Funktion wiederhergestellt wird (Goodrich et al., Cancer Res. 52: 1968–1973 (1992)). Neben diesen Verfahren, die eine Kompensation von Mutationen zum Ziel haben, wurden auch genetische Techniken entwickelt, um Tumorzellen spezifisch und selektiv abzutöten. Diese Ansätze einer molekularen Chemotherapie beruhen auf der spezifischen Expression von Toxingenen in neoplastischen Zellen (Abe et al., Proc Soc Exp Biol Med. 203: 354–359 (1993)). Schließlich wurden Gentransfer-Verfahren verwendet, um eine Antitumor-Immunisierung zu erreichen. Diese Verfahren der genetischen Immunopotenzierung verwenden Methoden der genetischen Immunoregulation, um die Immunerkennung von Tumoren zu verstärken. Es wurde also eine Vielzahl von speziellen Ansätzen entwickelt, um eine Gentherapie gegen Krebs zustande zu bringen.
Im Fall von Blasenkrebs wurde in Tumorsuppressorgenen wie p53 und RB eine hohe Mutationshäufigkeit beobachtet (Fujimoto et al. Cancer Res. 521393–1398 (1992); Cairns et al. Oncogene 6: 2305–2309 (1991)). Bei solchen genetischen Defekten von Tumorsuppressorgenen kann durch Austausch gegen das korrespondierende Wildtyp-Tumorsuppressorgen die Reversion des neoplastischen Phänotyps hervorgerufen werden (Spandidos, Id.; Banerjee, Id.).
In vitro-Untersuchungen mit Zelllinien aus humanem Blasengewebe haben nach Infektion mit einem rekombinanten Adenovirus eine wirksame Transgen-Expression gezeigt (Bass et al. Cancer Gene Therapy 2: 2: 97–104 (1995)). In vivo-Experimente haben auch eine Adenovirus-Transgen-Expression in der Harn-Blase von Nagetieren nach intravesikulärer Verabreichung gezeigt (ebenda; Morris et al., J. Urology. 152: 506–50 (1994)). In vitro-Experimente mit Wildtyp-Adenovirus zeigten, dass die Anheftung und Aufnahme des Virus nicht durch Benzylalkohol beeinflusst wird, sie zeigten aber ein verstärktes Unmcoating des Virions (Blixt et al. Arch. Virol. 129: 265–277 (1993)). In vivo-Behandlungen mit Agenzien (z. B. Aceton, DMSO, Protaminsulfat) können die schützende "Mucin"-Schicht, die das Blasenepithel vor Bakterien, Viren und anderen Krankheitserregern schützt, aufbrechen (Monson et al. J. Urol. 145: 842–845 (1992); Parsons et al. J. Urol. 143: 139–142 (1990)). Keines der bis heute ausprobierten Verfahren erreichte eine verstärkte Freisetzung eines therapeutischen Tumorsuppressorgens in der Blase zu Behandlung von Blasenkrebs. Um eine Gentherapie für die Behandlung von Blasenkrebs zu ermöglichen, müssen Gentherapie-Methoden entwickelt werden, die eine direkte, optimale in vivo-Freisetzung des Tumorsuppressorgens im Blasenepithel ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung ist auf diese und andere Ziele gerichtet.
In den Artikeln "Recombinant adenovirus-mediated gene transfer to genitourinary epithelium in vitro and in vivo" von Bass et al. (1995), "Expression of the retinoblastoma gene product in bladder carcinoma cells associates with a low frequency of tumor formation" von Goodrich (1992), und "The Retinoblastom Gene Functions as a Growth and Tumor Suppressor in Human Bladder Carcinoma Cells" von Takahashi et al. (1991) wird die Behandlung von Blasenkrebs mittels Gentransfer diskutiert.
In dem Artikel von Wills et al. mit dem Namen "Development and characterization of recombinant adenoviruses encoding human p53 for gene therapy of cancer" wird die Verwendung von Adenoviren als Vektor für Gene diskutiert. Der Artikel "Adenovirus-mediated p53 gene transfer inhibits growth of human tumor cells expressing mutant p53 protein" von Harris et al. offenbart ebenfalls adenovirale Vektoren.
Zusätzlich zu den oben aufgeführten technischen Artikeln offenbart eine Reihe von relevanten Patentdokumenten Hintergrundinformationen für die vorliegende Erfindung.
In der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/10265 werden verschiedene Beispiele der Freisetzung von therapeutischen Zusammensetzungen diskutiert. In einem anderen internationalen Patent Nr. WO 97/11682 wird die Verwendung von Emulsionen mit biologisch aktiven Substanzen, wie z. B. DNA, für die Freisetzung solcher Substanzen in Zellen diskutiert. Das weitere Patent Nr. WO 93/00052 diskutiert ebenfalls Methoden zur Freisetzung von Genen in Zellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einen Puffer formuliert ist, der ein Detergenz umfasst, zur Herstellung eines medizinischen Medikaments, um das Tumorsuppressorgen einem Gewebe, das eine epitheliale Membran aufweist, zu verabreichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einen Puffer formuliert ist, der ein Detergenz umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einen Puffer formuliert ist, der ein Detergenz umfasst, zur Herstellung eines medizinischen Medikaments zur Verabreichung bei der Behandlung von Blasenkrebs.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus, die etwa 10⁹–10¹¹ PN/ml rekombinanten Adenovirus, etwa 2–20 mM Big CHAP oder etwa 0,1–1,0 mM TRITON^®X-100-Detergenz, phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), etwa 2–3% Sucrose (w/v) und etwa 1–3 mM MgCl₂, etwa pH 6,4–8,4 umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt den Einfluss der Rezeptur auf den durch einen Adenovirus vermittelten Gentransfer und die Expression im Blasenepithel der Ratte nach intravesikulärer Verabreichung dar.
2 stellt die Adenovirus-Transgen-Expression in Blasenepithel-Zellen nach intravesikulärer Verabreichung dar.
3 stellt die Dosis-abhängige Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase der Ratte nach intravesikulärer Verabreichung dar.
4 stellt eine reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion(RT-PCR)-Analyse der rekombinanten Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase der Maus nach intravesikulärer Verabreichung dar.
5 stellt einen Zeitverlauf der rekombinanten Adenovirus-Transgen-Expression in Blasen-, Nieren- und Lebergewebe nach intravesikulärer Verabreichung des Virus dar.
6 stellt die rekombinante adenovirale transgene DNA in Blasen- und Nieren-Homogenat nach intravesikulärer Verabreichung dar.
7 stellt die Verbesserung des Gentransfers in Blasenepithel bei Verwendung einer Big CHAP-Rezeptur (N,N-bis-(3-D-Glukonamidopropyl)-Cholamid (CALBIOCHEM^® Biochemicals) dar.
8 stellt die Verbesserung des Gentransfers in Blasenepithel bei Verwendung verschiedener Konzentrationen des rekombinanten Adenovirus in einer 7 mM Big CHAP-Rezeptur dar.
9 stellt die Verbesserung der rekombinanten Adenovirus-Transgen-Expression in Blasengewebe durch Verwendung von Ethanol (ETOH) oder einer Big CHAP-Rezeptur dar.
10 stellt den Gentransfer auf Tumoren bei Verwendung einer 4 mM Big CHAP-Rezeptur dar.
11 stellt den Transgen-Transfer in Blasenepithel eines Schweins dar.
12 stellt die Expression von p53 in Tumorgewebe dar.
13 stellt den Gentransfer in die Schleimhaut eines Ratten-Ileums dar.
Genauere Beschreibung der Erfindung
Der hier benutzte Begriff "Genfreisetzungssystem" bezieht sich auf jedes Mittel zur Freisetzung eines therapeutischen Gens in einem bestimmten Epithel-Gewebe oder Organ, einschließlich beispielsweise rekombinanter Vektoren und Nicht-Vektor-Systeme. Beispiele für Nicht-Vektor-Systeme schließen jeden Lipid-basierten Komplex, Lipid-verkapselte DNA oder kationische Lipid-DNA-Komplexe ein, sind aber nicht darauf limitiert. Beispiele für rekombinante virale Vektoren schließen Herpesvirus, Retrovirus, Grippevirus, Adenovirus und adenoassoziierten Virus ein, sind aber nicht darauf limitiert.
"Rekombinant" bezieht sich auf Nukleinsäuren und Proteine, die durch diese codiert werden, wobei die Nukleinsäuren mit Methoden der rekombinanten DNA-Technologie (auch als Gentechnik bezeichnet) konstruiert worden sind. Ein bevorzugter rekombinanter viraler Vektor ist das adenovirale Vektorfreisetzungssystem, das eine Deletion auf dem Protein IX-Gen aufweist (siehe internationale Patentanmeldung WO 95/11984). Das rekombinante Vektorfreisetzungssystem, das ein therapeutisches Gen wie z. B. ein Tumorsuppressorgen aufweist, ist in einem Puffer formuliert, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält.
Ein "die Freisetzung verstärkendes Agenz" bezieht sich auf jedes Agenz, das die Freisetzung eines therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, in einem karzinösen Gewebe oder Organ verstärkt. Diese verstärkte Freisetzung kann durch verschiedene Mechanismen erreicht werden. Ein solcher Mechanismus kann das Aufbrechen der schützenden Glykosaminoglykan-Schicht auf der Epithel-Oberfläche der Blase einschließen. Beispiele für solche die Freisetzung verstärkenden Agenzien sind Detergenzien, Alkohol, Glykole, Tenside, Gallensalze, Heparin-Antagonisten, Cyclooxygenase-Inhibitoren, hypertonische Salzlösungen und Azetate. Alkohole schließen z. B. die aliphatischen Alkohole wie Ethanol, N-Propanol, Isopropanol, Butylalkohol und Acetylalcohol ein. Glykole schließen Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und andere niedermolekulare Glykole wie Glycerol und Thioglycerol ein.
Azetate wie Essigsäure, Gluconolazetat, und Natriumazetate sind weitere Beispiele für Agenzien, die die Freisetzung verstärken. Hypertonische Salzlösungen wie 1 M NaCl sind weitere Beispiele für Agenzien, die die Freisetzung verstärken. Beispiele für Tenside sind Natrium Dodecyl-Sulfat (SDS) und Lysolecithin, Polysorbat 80, Nonylphenoxypolyoxyethylen, Lysophosphatidylcholin, Polyethylenglykol 400, Polysorbat 80, Polyoxyethylenether, Polyglykolether-Tenside und DMSO. Gallensalze wie Taurocholat, Natrium-Tauro-Deoxycholat, Deoxycholat, Chenodesoxycholate, Glykocholinsäure, Glykochenodeoxycholinsäure und andere Adstringentien wie Silbernitrat können verwendet werden. Heparin-Antagonisten wie quaternäre Amine, wie z. B. Protaminsulfat können auch verwendet werden. Cyclooxygenase-Inhibitoren wie z. B. Natrimsalicylat, Salicylsäure, und nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel (NSAIDS) wie Indomethacin, Naproxen oder Diclofenac können verwendet werden.
Detergenzien schließen anionische, kationische zwitterionische und nichtionische Detergenzien ein. Beispielhafte Detergenzien schließen Taurocholat, Deoxycholat, Taurocholat, Tauro-Deoxycholat, Cetylpyridum, Benzalkoniumchlorid, ZWITTERGENT^®3-14-Detergenz, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propaneulfonat-Hydrate, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, TRITON^®-X-100 Detergenz, C12E8, Octyl-β-D-Glucopyranosid, PLURONIC^®-F68-Detergenz, TWEEN^® 20 Detergenz, und TWEEN^® 80 Detergenz (CALBIOCHEM^® Biochemicals) ein.
In einer Ausgestaltung ist das die Freisetzung verstärkende Agenz in dem Puffer enthalten, in dem das rekombinante adenovirale Vektorfreisetzungssystem formuliert ist. Das die Freisetzung verstärkende Agenz kann vor dem rekombinanten Virus verabreicht werden oder gleichzeitig mit dem Virus. In einigen Ausgestaltungen wird das die Freisetzung verstärkende Agenz mit dem Virus verabreicht, indem eine Virus-Präparation mit einer Agenz-Zusammensetzung, die die Freisetzung verstärkt, kurz vor Verabreichung an den Patienten gemischt wird. In anderen Ausgestaltungen werden das die Freisetzung verstärkende Agenz und das Virus dem Pfleger in einem gemeinsamen Gefäß für die Verabreichung geliefert.
Im Falle einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthaltenes Tumorsuppressorgen aufweist, das in einen Puffer formuliert ist, der außerdem ein Agenz umfasst, das die Freisetzung verstärkt, kann die pharmazeutische Zusammensetzung über einen Zeitraum im Bereich von ungefähr 5 Minuten bis 3 Stunden verabreicht werden, bevorzugt ungefähr 10 Minuten bis 120 Minuten, und besonders bevorzugt ungefähr 15 Minuten bis 90 Minuten. In einer anderen Ausgestaltung kann das die Freisetzung verstärkende Agenz vor Verabreichung des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystems, das das Tumorsuppressorgen enthält, verabreicht werden.
Die vorgezogene Verabreichung des die Freisetzung verstärkenden Agenz kann im Bereich von ungefähr 30 Sekunden bis 1 Stunde, bevorzugt ungefähr 1 Minute bis 10 Minuten, und besonders bevorzugt ungefähr 1 Minute bis 5 Minuten vor der Verabreichung des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystems, das das Tumorsuppressorgen enthält, geschehen.
Die Konzentration des die Freisetzung verstärkenden Agenz wird von einer Reihe von Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen, wie z. B. dem jeweils spezifisch verwendeten, die Freisetzung verstärkenden Agenz, dem Puffer, dem pH, dem Zielgewebe oder -Organ, und der Art der Verabreichung. Die Konzentration des die Freisetzung verstärkenden Agenz wird sich im Bereich von 1% bis 50% (v/v), bevorzugt 10% bis 40% (v/v), und besonders bevorzugt 15% bis 30% (v/v) bewegen. Bevorzugt wird die Konzentration des Detergents in der finalen Rezeptur, die den Patienten verabreicht wird, ungefähr das 0,5–2-fache der kritischen Mizellbildungskonzentration (CMC) betragen. Eine bevorzugte Konzentration von Big CHAP beträgt ungefähr 2–20 mM, besonders bevorzugt ungefähr 3,5–7 mM.
Der Puffer, der das die Freisetzung verstärkende Agenz enthält, kann jeder pharmazeutische Puffer sein, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, oder Natriumsphosphat/Natriumsulfat, Tris-Puffer, Glycinpuffer, steriles Wasser und andere Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. jene, die durch von Good et al. (1966) in Biochemistry 5: 467 beschrieben worden sind. Der pH des Puffers in der pharmazeutischen Zusammensetzung, die das in dem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthaltene Tumorsuppressorgen aufweist, kann im Bereich zwischen 6,4–8,4 liegen, bevorzugt 7–7,5, und besonders bevorzugt 7,2–7,4.
Eine bevorzugte Rezeptur für die Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus enthält etwa 10⁹–10¹¹ PN/ml Virus, etwa 2–20 mM Big CHAP oder etwa 0,1–1,0 mM TRITON^®X-100-Detergenz in phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), sowie etwa 2–3% Sucrose (w/v) und etwa 1–3 mM MgCl₂, bei einem pH von etwa 6,4–8,4.
Der Begriff "verstärkend" beschreibt die erhöhte Freisetzung des therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, in das karzinöse Gewebe oder Organ. Die erhöhte Freisetzung eines therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, kann mit verschiedenen Mitteln gemessen werden, z. B. in dem die Expression des Tumorsuppressorgens im Vergleich zu Expressionslevels gemessen wird, die sich einstellen, wenn das Tumorsuppressorgen in einem adenoviralen Vektorfreisetzungssystem mit einem Puffer, der kein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält, freigesetzt wird.
Beispiele für therapeutische Gene sind Tumorsuppressorgene und das Suizidgen Thymidinkinase. Beispiele für Tumorsuppressorgene schließen p53, das Retinoblastom-Gen, entweder in voller Länge (p110^RB) oder als Fragmente, wie z. B. p94^RB or p56^RB), und p16 ein, sind aber nicht darauf limitiert. Andere therapeutische Gene schließen CFTR, für Cytokine codierende Gene (wie die Interferone α, β, γ, δ und die Interleukine IL-4, IL-10 und IL-2) GM-CSF und alle anderen Gene ein, die für Proteine kodieren, die ein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von nicht karzinösen Erkrankungen der Blase aufweisen, wie z. B. Cystitis. In einigen Ausgestaltungen der Erfindung codiert das therapeutische Gen für Antisense-RNA.
In einigen Ausgestaltungen enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame Menge eines therapeutischen Gen, wie z. B. eines Tumorsuppressorgen, in einem rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem, in einem Puffer, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält. Der hier benutzte Begriff "therapeutisch wirksam" bezieht sich auf die Vermeidung, Verminderung oder Heilung von Symptomen, die mit einem Krankheitsstatus einhergehen.
Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung werden therapeutisch wirksame Mengen der pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem therapeutischen Gen, wie z. B. p53 oder dem Retinoblastom-Tumorsuppressorgen, in einem rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem, das in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält, verabreicht. Therapeutisch wirksame Mengen des Retinoblastom-Tumorsuppressorgens in dem rekombinanten viralen Vektorfreisetzungssystem, das in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält, liegen im Bereich von ungefähr 1 × 10⁸ Partikel/ml bis 1 × 10¹² Partikel/ml, typischerweise ungefähr 1 × 10⁸ Partikel/ml bis 5 × 10¹¹ Partikel/ml, besonders typisch 1 × 10⁹ Partikel/ml bis 1 × 10¹¹ Partikel/ml (PN/ml).
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können außerdem einen Stabilisator, Verstärker oder andere pharmazeutisch akzeptable Carrier oder Träger enthalten. Ein pharmazeutisch akzeptabler Carrier kann einen physiologisch akzeptablen Bestandteil enthalten der z. B. wirkt, indem er das rekombinante virale Vektorfreisetzungssystem, das das Tumorsuppressorgen enthält, stabilisiert.
Ein physiologisch akzeptabler Bestandteil kann z. B. Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Sucrose oder Dextrane, Antioxidantien, wie z. B. Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, niederkulare Proteine oder andere Stabilisatoren oder Arzneistoffträger umfassen. Andere physiologisch akzeptable Bestandteile umfassen Feuchthaltemittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Konservierungsstoffe, die besonders nützlich für die Verhinderung von Wachstum oder Aktivität von Mikroorganismen sind. Es sind verschiedene Konservierungsstoffe wohlbekannt, einschließlich z. B. Phenol und Ascorbinsäure. Ein Fachmann weiß, dass die Auswahl eines pharmazeutisch akzeptablen Carriers vom Weg der Verabreichung und den besonderen physio-chemischen Eigenschaften des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem und dem jeweiligen darin enthaltenen Tumorsuppressorgen abhängig ist. Beispiele für Carrier, Stabilisatoren oder Hilfsstoffe finden sich in Martin, Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton, Pa. 1975), dessen Offenbarungsgehalt durch die Bezugnahme in diese Schrift aufgenommen wird.
Das rekombinante virale Vektorfreisetzungssystem, das ein therapeutisches Gen enthält und in einem Puffer formuliert ist, der ein die Freisetzung verstärkendes Agenz enthält, kann in jedem karzinösen Gewebe oder Organ freigesetzt werden, in em jede Freisetzungsmethode, die dem normal ausgebildeten Fachmann bekannt ist, verwendet wird, beispielsweise intratumorale oder intravesikuläre Verabreichung. Karzinöse Gewebe und Organe umfassen jedes Gewebe oder Organ, das eine Epithel-Membran aufweist, wie z. B. den Gastrointestinaltrakt, die Blase, die Atemwege und die Lunge. Beispiele umfassen Karzinome der Blase und der oberen Atemwege, der Vulva, des Gebärmutterhalses, der Vagina oder der Bronchien; lokale metastatische Tumoren des Bauchfells, bronchio-alveolare Karzinome, pleurale metastatische Tumore, Karzinome des Mundes und der Mandeln, Karzinome des Nasopharynx, der Nase, des Kehlkopfs, der Speiseröhren, des Magens, des Dickdarms und des Rektums, der Gallenblase, oder der Haut, oder Melanome, sind aber nicht hierauf begrenzt.
Das erfindungsgemäße die Freisetzung verstärkende Agenz kann auch verwendet werden, um andere pharmazeutische Agenzien, wie z. B. Proteine, Nukleinsäuren, Antisense-RNA, kleine Moleküle, etc. für die Verabreichung an jedes Gewebe oder Organ mit einer Epithel-Membranen zu formulieren.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber den Schutzbereich nicht einschränken.
Experimentelle Beispiele
Beispiel 1
Ethanol verbessert den Gentransfer in der Blase
Anfängliche Experimente haben gezeigt, dass verschiedene Faktoren einschließlich der Viruskonzentration, der Zeit der Verabreichung, und dem Volumen der Dosierung den Gentransfer in das Blasenepithel nach intravesikulärer Verabreichung an Ratten beeinflussen können. Da durch intravesikuläre Verabreichung verschiedener Lösungsmittel eine erhöhte Eindringtiefe von Farbstoffen erreicht werden kann, wurde auch eine Veränderung der Adenovirus-Rezeptur als alternative Strategie zur Erhöhung der Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase untersucht (Monson et al. Urology 145: 842–845 (1991)). Die ersten Experimente richteten sich auf die Verwendung von Ethanol zur Erhöhung der Adenovirus-Transgen-Expression in der Blase.
Neun weibliche Buffalo-Ratten (Harlan Sprague Dawley) wurden mit Isofluran anästhesiert und erhielten eine intravesikuläre Verabreichung eines menschlichen rekombinanten Adenovirus, der für das lacZ-Gen (rAd-βgal) codiert. Der menschliche rekombinante Adenovirus, der für das lacZ-Gen (rAd-βgal) codiert, wird in Wills et al. Human Gene Therapy 5: 1079–1088 (1994) beschrieben. Vor der Verabreichung wurden die Blasen mit PBS gespült und entleert. rAd-βgal wurde dann verdünnt, um eine finale Konzentration von 1.7 × 10¹¹ PN/ml in 1) VPBS (2% (w/v) Sucrose und 2 mM MgCl₂ in PBS), 2) 30% (v/v) Ethanol, oder 3) 50% (v/v) DMSO, zu erreichen, und wurde in einem Volumen von 250 μl verabreicht (N = 3 Tiere/Gruppe). Die verabreichte Zusammensetzung verblieb für 45 Minuten in der Blase. Die Blase wurde dann mit PBS gespült, und die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden die Ratten getötet, die Blasen wurden entnommen, fixiert und die ganzen Organe wurden mit einer X-Gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid)-Lösung gefärbt, um den Reportergen-Transfer auszuwerten. X-Gal-gefärbte Gewebe wurden dann in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Die Hydrolyse von X-Gal durch β-Galactosidase führt zu einer blauen Farbe, die auf dem oberflächlichen luminalen Blasenepithel auftritt.
In den Blasen aller Tiere, die mit rAd-βgal behandelt wurden, wurde im Anschluss an die Freisetzung durch den adenoviralen Vektor eine Transgen-Expression beobachtet, nicht jedoch in den unbehandelten Kontrolltieren. Die Transgen-Expression war ähnlich zu bereits veröffentlichten Ergebnissen, für die die PBS/Sucrose-Rezeptur verwendet wurde (Bass et al. Cancer Gene Therapy 2: 2: 97–104 (1995)). In scharfen Gegensatz dazu war die β-Galaktosidase-Expression in der luminalen Epithel-Oberfläche bei Tieren, die rAd-βgal verdünnt in 30% Ethano erhalten hatten, wesentlich verstärkt (1). Die in 1 beschriebenen Blasen-Proben wurden eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Die histologische Auswertung des Blasengewebes zeigte eine erhöhte β-Galaktosidase-Expression des geschnittenen Blasenepithels, wenn der Adenovirus-Rezeptur Ethanol beigefügt war (2). Die Wechselwirkung von Ethanol mit der schützenden Glykosaminoglykan-Schicht (GAG) auf der Epithel-Oberfläche stellt einen Mechanismus für den beobachteten Anstieg der Transgen-Expression dar. Das Aufbrechen dieser Schicht kann die Wechselwirkung zwischen Virus und Zelle auf der Oberfläche erleichtern und möglicherweise das Eindringen in die Submucosa verstärken.
Beispiel 2
Dosis-abhängige Transgen-Expression in der Blase der Ratte
In einem anderen Experiment wurden 18 weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit Isofluran anästhesiert und erhielten einen intravesikulären Bolus (0.5 ml) rAd-βgal in Konzentrationen von 2 × 10⁷, 2 × 10⁸, 2 × 10⁹, 2 × 10¹⁰, und 2 × 10¹¹ PN/ml in einer 22.5%igen (v/v) Ethanol-Rezeptur. Nach einer 45-minütigen Inkubation wurden die Blasen mit PBS gespült, und die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. Zwei Tage später wurden die Ratten getötet, die Blasen wurden entnommen, fixiert und die ganzen Organe wurden mit X-Gal-Lösung gefärbt, um die Adenovirus-Transgen-Expression auszuwerten. Die β-Galaktosidase-Expression im luminalen Blasenepithel korrelierte mit der Konzentration des verabreichten rekombinanten Adenovirus (3). Zwischen den Tieren, die 2 × 10¹⁰ oder und 2 × 10¹¹ PN/ml erhielten, wurden keine wesentlichen Unterschiede beobachtet, was für eine Sättigung der Transgen-Expression in diesem Modell spricht. Die Analyse des entnommenen Flüssigkeitsvolumens nach der Verabreichung zeigte bei diesen hohen Dosen lediglich eine geringe Reduktion des infektiösen Titers der verabreichten Substanz. Die Expression der β-Galaktosidase nahm bei geringeren Konzentrationen ab. Bei Tieren mit einer Dosierung von 1 × 10⁷ PN/ml und bei einem unbehandelten Kontrolltier wurde kein Hinweis auf eine β-Galaktosidase-Aktivität gefunden.
Beispiel 3
ACNRB Gentransfer in die Blase der Maus
Um die Expression des RB-Transgens spezifisch auszuwerten, wurde eine Pilot-Studie mit einem RT-PCR-Assay durchgeführt. Der rekombinante Adenovirus, der in dieser Studie verwendet wurde, basierte auf dem menschlichen Serotyp 5-Adenovirus, aus dem die frühe virale Region 1, die für E1a, E1b und pIX-Proteine codiert, entfernt worden war. Dieser Adenovirus ist beschränkt auf die Fortpflanzung in 293 Zellen, die die Ad5 E1-Genprodukte, die für die Replikation erforderlich sind, produzieren. Transfer-Plasmide, die entweder für vollständiges oder trunkiertes RB kodieren, wurden aus pACN (Wills et al. Cancer Gene Therapy 2: 191–197 (1995)) erzeugt und wurden einer nach dem anderen verwendet, um die rekombinanten Adenoviren zu konstruieren. Dazu wurde entweder eine vollständige RB-cDNA (1–928 Aminosäuren), die als ein 2,8 kB Xba1-BamH1-Fragment aus dem Plasmid pETRbc (Huang et al. Nature 350: 160–162 (1991)) subkloniert wurde, oder ein trunkiertes Fragment (Aminosäuren 381–928), das als ein 1,7 kB Xba1-BamH1-cDNA-Fragment subkloniert wurde, stromabwärts des CMV-Promotor/Emhancer und der dreiteiligen Ad2-leader-cDNA des Plasmids pACN angeordnet. Diese Plasmide wurden anschließend mit EcoR1 linearisiert und entweder mit dem isolierten, durch Cla1 verdauten großen Fragment aus H5ilE4 (Hemstrom et al. J Virol. 62: 3258–3264 (1988)) cotransfiziert (CaPO4, Stratagene), um Ad-RB56 (ACN 56) mit einer partiellen E4-Deletion zu erhalten, oder mit dem großen Fragment aus einem Hybrid-Virus aus d1327 (Ginsberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3823–3827 (1980)) und H5ilE4, um Ad-Rb110 (ACNRB) zu erhalten, der Deletionen sowohl in der E3- als auch in der E4-Region des Vektors enthält.
Acht weibliche ICR-Mäuse (Charles River Laboratories) wurden mit Avertin anästhesiert, und jede erhielt eine intravesikuläre Verabreichung (80 μl) ACNRB. ACNRB (4 × 10¹¹ PN/ml) wurde verdünnt und in einer PBS-Lösung oder einer 30%igen (v/v) Ethanollösung formuliert. Nachdem der Virus für 45 min in der Blase war, konnten sich die Tiere entleeren und erholen. Die Mäuse wurden 2 beziehungsweise 14 Tage nach ACNRB-Verabreichung getötet, und die Blasen, Lebern und Nieren jedes Tieres wurden entnommen, homogenisiert und für die Analyse verarbeitet (N = 2 Tiere/Gruppe). Die Transgen-Expression wurde mit einem für ACNRB spezifischen Primer mittels RT-PCR bestimmt. Genauer gesagt wurden Primer hergestellt, um ACNRB zu identifizieren und die Region zwischen dem 3'-Ende der CMV-Sequenz und dem 5'-Ende der RB-Sequenz zu amplifizieren. Nach der Amplifikation (30 Zyklen) wurden die RT-PCR-Produkte auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel, das mit Etidiumbromid gefärbt wurde, getrennt und fotografiert. Eine erhöhte ACNRB-Expression wurde nach Behandlung mit ACNRB in 30%igem (w/v) Ethanol beobachtet, im Vergleich zu einer sehr geringen Expression nach Behandlung mit ACNRB in VPBS. Die Positivkontrollen für den Assay umfassten Proben aus ACNRB-infizierten menschlichen 5637 Blasenkrebs-Zellen (KONTROLLE). RNA-Proben aus Blasen von ACNRB-infizierten Tieren, die mit Primern amplifiziert wurden, die spezifisch für beta-Aktin sind, lieferten eine interne Kontrolle für die Qualität der RNA. Unbehandelte Proben und Blasenproben ohne die Reverse Transkriptase (RT) lieferten Kontrollen für kontaminierende DNA. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden ACNRB-Expressionraten in den Blasenhomogenaten von Tieren, die ACNRB in 30%igem Ethanol erhalten hatten, festgestellt (4). In nicht-Blasengewebe oder in Proben, die 14 Tage nach der Verabreichung entnommen worden waren, wurde kein Hinweis auf Expression festgestellt.
Beispiel 4
Kinetik der Biodistribution und ACNRB-Expression nach intravesikulärer Verabreichung an Mäuse
Um den Zeitverlauf der Expression nach intravesikulärer Verabreichung zu untersuchen, wurden 40 weibliche Mäuse (Charles River Laboratories) mit Avertin anästhesiert und erhielten einen intravesikulären Bolus (0.80 μl) ACNRB (4 × 10¹⁰ PN/ml in 22%igem (v/v) Ethanol). Die verabreichte Zusammensetzung verblieb für 45 Minuten in der Blase, und die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. Die Mäuse wurden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, und 14 Tage nach der Verabreichung für die Analyse getötet (N = 4/Zeitraum). Blasen, Lebern und Nieren wurden entnommen und in flüssigen Stickstoff für die anschließende Analyse schockgefroren. Für die Detektion der ACNRB-Expression wurden Gewebeproben homogenisiert und die Gesamt-RNA mit TRI-Reagent^® extrahiert. Ein Aliquot der Gesamt-RNA wurde in einem RT-PCR-Assay mit für ACNRB spezifischen Primern amplifiziert, um die Transgen-Expression von der endogenen Expression zu unterscheiden. Für die Detektion der ACNRB-DNA wurde ein DNA-Extraktionskit (Stratagene) für Gewebehomogenate verwendet. Die PCR wurde mit den für ACNRB spezifischen Primern durchgeführt, wie es oben für die RT-PCR-Analyse beschrieben ist.
Eine transgene ACNRB-Expression in den Blasenhomogenaten nur in solchen Proben entdeckt, die an den Tagen 1–6 entnommen worden waren, wobei die Expression relativ zum endogenen p53 mit der Zeit abnahm (5, obere Abbildung). In Proben, die 7 und 14 Tage nach der Verabreichung entnommen worden waren, wurde keine Expression entdeckt. Interessanterweise wurde eine geringe ACNRB-Expression in den Nieren der Tage 1, 2 und 3 entdeckt, allerdings wurde in der Leber keine Expression beobachtet (5, untere Abbildungen).
ACNRB-DNA wurde in Blasengewebe aller Tiere, die ACNRB erhielten, entdeckt, einschließlich derer, die 14 Tage nach Verabreichung entnommen worden waren (6, linke Abbildung). Auch in den Nierenhomogenaten wurde DNA gefunden, was die in diesem Gewebe entdeckte ACNRB-Expression bestätigt (6, rechte Abbildung). In Leberproben, die während der Studie entnommen worden waren, wurde kein Hinweis auf ACNRB-DNA gefunden (Daten nicht gezeigt). Proben aus einem unbehandelten Tier (U) und gereinigte ACNRB-DNA (PC) dienten als Negativ- bzw. 25 Positivkontrollen.
Da die systemische Verabreichung von rekombinanten Adenoviren hauptsächlich in einer Transgen-Expression in der Leber resultiert (Li et al. Human Gene Therapy 4: 403–409 (1993)), spricht die Abwesenheit von ACNRB-DNA und Expression in Leberproben (5 und 6) für eine zu vernachlässigende systemische Einwirkung von ACNRB nach intravesikulärer Verabreichung. Ein Rückfluss durch die Harnleiter kann zur Detektion von ACNRB in der Niere beigetragen haben.
Die oben gezeigten Daten zeigen eine Transgen-Expression in der Blase von Nagetieren nach intravesikulärer Verabreichung von ACNRB. Diese Untersuchungen zeigen weiterhin, dass der Adenovirus-vermittelte Gentransfer in das Blasenepithel durch die Anwesenheit eines die Freisetzung verstärkenden Agenz, wie z. B. Ethanol, in der Rezeptur verstärkt werden kann. Ein Mechanismus für den erhöhten Gentransfer kann das Aufbrechen der schützenden Glykosaminoglykan-Schicht auf der Epithel-Oberfläche der Blase sein. Eine einzige inravesikuläre Verabreichung von ACNRB in einer 20–30%igen (v/v) Ethanol-Rezeptur führt zu einer Transgen-Expression in der Blase, die für ungefähr eine Woche andauert. Ein Rückfluss durch die Harnleiter ist eine mögliche Erklärung für die zeitweilige Expression von ACNRB in der Niere. Das Fehlen der ACNRB-Expression und ACNRB-DNA in der Leber spricht für eine begrenzte systemische Einwirkung von ACNRB nach intravesikulärer Verabreichung.
Beispiel 5
Verwendung von Detergenz-Rezepturen
Um Nebenwirkungen zu minimieren, ohne Verluste bei der Wirksamkeit des Gentransfers hinzunehmen, wurden andere Hilfsstoffe getestet. Es ist bekannt, dass Detergenzien mit Zellmembranen interagieren und große Löcher ausbilden, ohne die Zellen weiter zu beschädigen. Die Wirksamkeit von rekombinanten Adenoviren, die in weniger toxischen Detergenzien formuliert waren, wurde in Gentransfer-Modellen an der Ratte und Maus untersucht.
Um die Wirksamkeit des Gentransfers in das Blasenepithel auszuwerten, wurde rAd-βgal in verschiedene Detergenzien bei deren kritischer Mizellbildungskonzentration formuliert. Weibliche Ratten (ungefähr 200 g b/w, Harlan Sprague Dawley) wurden mit Isofluran anästhesiert und erhielten eine intravesikuläre Verabreichung rAd-βgal (1 × 10¹¹ PN/ml) in verschiedenen Detergenz-Rezepturen (siehe Tabelle 1). Vor der Verabreichung wurden die Blasen mit PBS gespült und entleert. rAd-βgal wurde dann in einem Volumen von 0.5 ml verabreicht. Die verabreichte Lösung blieb 45 Minuten in der Blase. Die Blasen wurden dann mit PBS gespült, und die Tiere konnten sich von der Behandlung erholen. 48 h später wurden die Ratten getötet, die Blasen entnommen und in Formalin fixiert. Nach der Fixierung wurden die Blasen durch einen Längsschnitt geöffnet, so dass das Urothel dem Farbstoff (X-Gal) ausgesetzt wurde, der in eine blaue Farbe umgewandelt wird, wenn eine Expression des Reportergens (β-Galaktosidase) vorliegt. Die luminale Epithel-Oberfläche der gesamten Blase wurde fotografiert, und die blaue Färbung ausgewertet: + (minimale Färbung), ++ (mäßige Färbung); +++ (intensive Färbung, die die gesamte Epithel-Oberfläche der Blase bedeckt). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Einige der anionischen Detergenzien (Taurodeoxycholat), zwitterionischen Detergenzien (CHAPS, ZWITTERGENT^® und nichtionischen Detergenzien (Big CHAP, TRITON^®-X-100) verstärkten den Gentransfer wesentlich. Kationische Detergenzien und einige der nichtionischen Detergenzien (PLURONIC^®-F68, TWEEN^® 20) hatten keine vergleichbaren Effekte. Im allgemeinen gingen Verbesserungen des Gentransfers mit Cystitis einher. Zwitterionische Detergenzien erleichterten die Bildung von Blasensteinen.
Mögliche Erscheinungsformen der Cystitis, die bei Verwendung von Ethanol beobachtet wurden, wurden bei Mäusen mit einer 7 mM Big CHAP (2 × CMC) oder 0,05 mM TRITON^®-X-100-Detergenz-Rezeptur (CMC) untersucht. Rezepturen wurden intraversikuär mit einem Volumen von 80 μl verabreicht, und die Tiere wurden 7 Tage lang beobachtet. Nach der Tötung wurden die Blasen in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin für die pathologische Auswertung gefärbt. Bei Mäusen, die mit Big CHAP behandelt worden waren, wurde nur eine schwache Makrophagen-Infiltration in das Blasengewebe beobachtet. TRITON^®-X-100 verursachte eine deutlichere Makrophagen-Infiltration (schwach bis mittel). In scharfem Kontrast dazu wurde bei Mäusen, die mit 22%igem Ethanol behandelt wurden, eine deutliche Cystitis festgestellt.
Beispiel 6
Gentransfer von ACNRB
Zusätzlich zu den Experimenten mit dem Reportergen wurde eine andere Versuchsreihe durchgeführt, um den Gentransfer von ACNRB spezifisch auszuwerten. Weibliche ICR-Mäuse wurden mit Avertin anästhesiert, und jede Maus erhielt eine intravesikuläre Verabreichung (80 μl) ACNRB. ACNRB (4 × 10¹⁰ PN/ml) war in VPBS, 22%iger (v/v) Ethanollösung oder 3 mM Big CHAP formuliert. Nachdem der Virus für 45 min in der Blase war, konnten sich die Tiere erholen. Die Mäuse wurden 48 h nach ACNRB-Verabreichung getötet, und die Blasen wurden in flüssigen Stickstoff schockgefroren.
Die Transgen-Expression wurde mittels RT-PCR bestimmt. Die Gewebe wurden in RNAse-freiem Wasser gespült, homogenisiert, in Tri-Reagenz (Molecular Research Center) verdaut und die gesamte zelluläre RNA extrahiert. ACNRB wurde mit einem 5'-Primer, der in der CMV-Region des ACNRB-Vektors beheimatet war, sondiert, und ein 3'-Primer saß am 5'-Ende des Rb-Genoms. Die RT-PCR wurde im Perkin Elmer 9600 GeneAmp PCR System durchgeführt. Die Zyklus-Bedingungen waren 10 min bei 65°C, 8 min bei 50°C und 5 min bei 95°C. 32 PCR-Zyklen wurden durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 30 s bei 94°C, 30 s bei 58°C und 30 s bei 72°C bestand. Der 32igste Zyklus beinhaltete einen 10-minütigen Elongationsschritt bei 72°C, um eine vollständige Verlängerung unvollständiger DNA-Fragmente zu garantieren. ACNRB-RNA-Banden wurden mit Etidiumbromid gefärbt. Die Ergebnisse, nämlich eine verstärkte Expression bei Verwendung einer Ethanol- oder Big CHAP-Rezeptur, sind in 9 gezeigt.
Beispiel 7
Big CHAP verbessert die Transgen-Expression bei minimaler Cystitis
Da Big CHAP die Transgen-Expression bei minimaler Cystitis verbessert, wurde diese Rezeptur für weitere Untersuchungen ausgewählt, einschließlich Konzentration- und Dosis-Abhängigkeit in Studien, die ähnlich den oben beschriebenen waren. Anästhesierten weiblichen Ratten wurde rAd-βgal (1 × 10¹¹ PN/ml) über einen intravesikulären Katheter in die Blase verabreicht. rAd-βgal war in verschiedenen Konzentrationen von Big CHAP formuliert. Ein Volumen von 0.5 ml wurde injiziert und Verblieb für 45 Minuten in der Blase. Die Tiere wurden 48 h später getötet, die Blasen in 4% Formalin/Glutaraldehyd fixiert, durch einen Längsschnitt geöffnet und die β-Galaktosidase-Enzymaktivität mit X-Gal-Substrat gemessen. Die Intensität der Blaufärbung korreliert mit der β-Gal-Transgen-Expression. Die Abbildung zeigt die Epithel-Oberfläche X-Gal-gefärbter Blasen. Die Ergebnisse weisen auf einen konzentrations-abhängigen Anstieg des Gentransfers in das Epithel hin. Die 3.5–7 mM-Konzentration des Big CHAP verbesserte den Gentransfer wesentlich. Die Rezeptur alleine (7, untere Abbildung) löste keine Blaufärbung des X-Gal-Substrats aus. Eine höhere Konzentration (17,5 mM) erhöhte den Gentransfer oder die Expression nicht erkennbar, löste jedoch in einigen der getesteten Tiere Cystitis aus.
Die Wirkungen höherer Konzentrationen des rekombinanten Adenovirus wurden ebenfalls getestet. Anästhesierten weiblichen Ratten wurden unterschiedliche Konzentrationen an Big CHAP formuliertem rAd-βgal über einen intravesikulären Katheter in die Blase verabreicht. Die Tiere wurden 48 h später getötet, die Blasen in 4% Formalin/Glutaraldehyd fixiert, durch einen Längsschnitt geöffnet und mit X-Gal gefärbt. 8 zeigt einen konzentrationsabhängigen Anstieg des Gentransfers in das Epithel. Eine Konzentration von 1,3 × 10¹¹ PN/ml induzierte einen maximalen Gentransfer. Eine höhere Konzentration (6,5 × 10¹¹ PN/ml) erhöhte die Blaufärbung nicht erkennbar. Bei geringeren Konzentrationen an rAd-βgal, 1,3 × 10¹⁰ PN/ml, oder 1,3 × 10⁹ PN/ml, nahm die Transgen-Expression dosisabhängig ab. Beim Vergleich zwischen 3,5 und 7 mM-Rezepturen war die β-Galaktosidase-Expression ähnlich, obwohl die verstärkte Wirkung bei Tieren, die mit der 7 mM Big CHAP-Rezeptur behandelt worden waren, stärker reproduzierbar erschien.
Beispiel 8
Transgen-Expression in Tumoren mit einer Big CHAP-Rezeptur
Da sich die ursprünglichen Untersuchungen auf Tiere mit intakten Blasenepithel konzentriert hatten, wurde der durch den Adenovirus vermittelte Gentransfer in einem Tiermodell, bestehend aus einem transitionalen Zellkarzinom, ebenfalls untersucht. In männlichen Fisher-Ratten wurden Tumoren durch sechsmonatige Hinzufügung von 0,05% BBN zum Trinkwasser induziert. rAd-βgal (1 × 10¹¹ PN/ml), das in 4 mM Big CHAP oder VPBS formuliert war, wurde für 45 min durch direkte Injektion in die Blase verabreicht. Die β-Gal-Expression wurde 48 h nach der Behandlung untersucht. Im Einklang mit früheren Experimenten, bei denen tumorfreie Tiere verwendet wurden, war der Gentransfer ins Tumorgewebe bei der Big CHAP-Rezeptur im Vergleich zu der VPBS-Rezeptur verbessert (10).
Der Gentransfer des rAD, das das p53-Gen trug (rAD-p53) (Wills et al. Human Gene Therapy 5: 1079–1088 (1994)), wurde ebenfalls in diesem Tiermodell für Blasenkrebs untersucht. In weiblichen Fisher-Ratten wurden Blasentumoren durch dreimonatige Hinzufügung von 0,05% BBN (N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl)-Nitrosamin) zum Trinkwasser induziert. rAD-p53 (1 × 10¹¹ PN/ml) war in 7 mM Big CHAP formuliert. Unter Isofluran-Anästhesie wurde für die Verabreichung ein Katheter (24 G) in die Blase geschoben. rAD-p53 wurde der Blase für 45 min verabreicht. Die Tiere konnten sich dann von der Anästhesie erholen. 24 h später wurden die Tiere getötet, und die Blase in Formalin fixiert. Nach Einbettung in Paraffin und schneiden wurde die p53-Expression mittels Immunohiostochemie mit dem p53ES-Kit (Oncogene) und AEC (AEC-Kit, Vector Labs) als Substrat untersucht. Die Gewebe wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. 12 zeigt die p53-Genexpression im Oberflächenbereich des proliferierenden Epithels (linke Abbildung) und die Kernfärbung für die p53-Expression bei stärkerer Vergrößerung (rechte Abbildung). In unbehandelten Tieren wurde keine Färbung im Tumorgewebe beobachtet.
Beispiel 9
Big CHAP verbessert die Transgen-Expression in Schweine-Urothel
Um Volumina zu simulieren, die für klinische Untersuchungen erwartet werden, wurde die 7 mM Big CHAP-Rezeptur in Zusammenarbeit mit der SPRI Drug Safety and Metabolism Group an einem chronisch katheterisierten adulten Schweinemodell getestet. rAd-βgal (1 × 10¹¹ PN/ml) wurde in VPBS oder 7 mM Big CHAP formuliert. Ein Volumen von 50 ml wurde über den Katheter in die Blasen der bei Bewusstsein befindlichen Tiere injiziert. Die verabreichte Substanz verblieb dort für 2 h. Die Tiere wurden 48 h später getötet, und eine mittige Sektion der Blase wurde entnommen und für die β-Galaktosidase-Expression gefärbt. Im Vergleich zu dem mit VPBS-behandelten Schwein wurde bei dem mit 7 mM Big CHAP behandelten Schwein eine Zunahme der Intensität der Genexpression beobachtet (11). Die histologische Untersuchung zeigte eine Transduktion mehrerer Epithelschichten bei Verwendung von Big CHAP (linke Abbildung), aber nur eine oberflächliche Transduktion bei Verwendung des VPBS-Puffers (rechte Abbildung).
Beispiel 10
Gentransfer in Darmepithel bei Ratten
Eine leichte Modifikation des Verfahrens von Sandberg et al. (Human Gene Therapy 5: 1161–1168 (1994)) wurde verwendet, um Abschnitte aus dem Ratten-Ileum für die Transfer-Studien vorzubereiten. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit Isofluran anästhesiert. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und ein rostral vom Peyerschen Plaque gelegenes Ileum-Segment wurde isoliert. Das Segment (ungefähr 3 cm) wurde sorgfältig von Speiseresten gereinigt, und beide Seiten wurden mit atraumatischen Gefäßklemmen verschlossen. 0,5 ml rAd-βgal (1 × 10¹¹ PN/ml) wurden mit einer 24 G-Nadel direkt in das Segment injiziert und wurden dort für 45 min inkubiert. rAd-βgal war in 10 mM Taurodeoxycholat (in steril filtriertem, destilliertem Wasser) (Testgruppe 1) oder VPBS (Testgruppe 2) formuliert. Eine dritte Testgruppe umfasste Tiere, die mit 10 mM Taurodeoxycholat behandelt worden waren. Anschließend wurden die Klemmen entfernt und eine lockere Seidennaht wurde zur Wiedererkennung bei der späteren Autopsie an beiden Enden befestigt.
Der Bauchhöhlenschnitt wurde geschlossen und die Tiere konnten sich in ihrem Käfigen erholen. 48 h später wurden die Tiere getötet. Das infizierte Segment und ein Kontrollsegment wurden entnommen und für die X-Gal-Färbung des gesamten Organs fixiert.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Das Ausmaß der X-Gal-Blaufärbung zeigte das Vorhandensein der Transgen-Expression in den Ileum-Abschnitten. Für die Detergenz-Rezeptur war ein verstärkter Gentransfer erkennbar (mittlere Abbildung).
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in den Offenbarungsgehalt dieser Schrift aufgenommen, so als ob für jede einzelne Publikationen oder Patentanmeldung angegeben wäre, dass sie durch die Bezugnahme aufgenommen wurde.

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einem Puffer formuliert ist, der ein Detergens umfasst, zur Herstellung eines medizinischen Medikaments, um das Tumorsuppressorgen einem Gewebe, das eine epitheliale Membran aufweist zu verabreichen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Detergens Big CHAP ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Detergens TRITON^® X-100 ist.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Tumorsuppressorgen p53 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Tumorsuppressorgen ein Retinoblastoma-Gen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Detergens etwa das 0,5 bis 2fache der kritischen Micellisierungskonzentration beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einem Puffer formuliert ist, der ein Detergens umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Tumorsuppressorgen p53 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Tumorsuppressorgen ein Retinoblastoma-Gen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei das Detergens Big CHAP ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei das Detergens TRITON^® X-100 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Konzentration des Detergens die etwa 0,5 bis 2fache kritische Micellisierungskonzentration beträgt.
Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Adenovirus, wobei die Zusammensetzung etwa 10⁹–10¹¹ PN/ml rekombinanten Adenovirus, etwa 2–10 mM Big CHAP oder etwa 0,1–1,0 mM Octylphenoxypolyethoxyethanol, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH etwa 6,4–8,4), etwa 2–3% Sucrose (Gewicht/Volumen) und etwa 1–3 mM MgCl₂ umfasst.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Tumorsuppressorgens, das in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, das in einem Puffer formuliert ist, der ein Detergens umfasst, zur Herstellung eines medizinischen Medikaments zur Verabreichung bei der Behandlung von Blasenkrebs.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Tumorsuppressorgen p53 ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Tumorsuppressorgen ein Retinoblastoma-Tumorsuppressorgen ist.
Verwendung nach Anspruch 14, 15 oder 16, wobei das Detergens Big CHAP ist.
Verwendung nach Anspruch 14, 15 oder 16, wobei das Detergens TRITON^® X-100 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Verabreichung mittels intravesikaler Verabreichung erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei die therapeutisch wirksame Menge eines Tumorsuppressorgens, die in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, im Bereich von etwa von 1 × 10⁸ Teilchen/ml bis 5 × 10¹¹ Teilchen/ml des rekombinanten Adenovirus liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die therapeutisch wirksame Menge eines Tumorsuppressorgens, die in einem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem enthalten ist, im Bereich von etwa von 1 × 10⁹ Teilchen/ml bis 1 × 10¹¹ Teilchen/ml eines rekombinanten Adenovirus liegt.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Retionblastoma-Tumorsuppressorgen RB-Protein in ganzer Länge kodiert.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Retinoblastoma-Tumorsuppressorgen p56^RB kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei das Detergens vor Verabreichung des rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystems, das das Tumorsuppressorgen umfasst, verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei das Detergens mit dem rekombinanten adenoviralen Vektorfreisetzungssystem, das das Tumorsuppressorgen umfasst, verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 25, wobei die Konzentration des Detergens das 0,5 bis 2fache der kritischen Micellisierungskonzentration beträgt.
Pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus, die etwa 10⁹–10¹¹ PN/ml rekombinanten Adenovirus, etwa 2–10 mM Big CHAP oder etwa 0,1 bis 1,0 mM TRITON^® X-100 Detergens, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), etwa 2–3% Sucrose (Gewicht/Volumen) und etwa 1–3 mM MgCl₂, etwa pH 6,4–8,4, umfasst.