JPH10503361A

JPH10503361A - 組換えｐ５３アデノウイルス方法と組成物

Info

Publication number: JPH10503361A
Application number: JP7513310A
Authority: JP
Inventors: ツァン，ウェイ‐ウェイ; ロス，ジャック・エイ
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 1998-03-31
Also published as: CZ122596A3; RU2222600C2; NO961696D0; EP0725791A1; CA2174556C; ATE525387T1; US20030012770A1; EP0725791B1; WO1995012660A2; CN1079833C; PL314311A1; HU9601084D0; US6905873B1; CN1136826A; CA2174556A1; KR20050052517A; KR100812631B1; US6830749B2; UA73265C2; AU698437B2

Abstract

(57)【要約】リポソームを介する同時トランスフェクション、及び、トランスフェクションされた細胞中で細胞変性効果（ＣＰＥ）を直接観察することにより、組換えアデノウイルスを製造する簡単で効率的な方法を開示した。さらにまた、新規のｐ５３アデノウイルス構成物についての組成物及び方法、ならびに変異ｐ５３を持つ細胞と動物がｐ５３の機能と腫瘍抑制力を回復する方法も開示した。

Description

【発明の詳細な説明】組換えｐ５３アデノウイルス方法と組成物発明の背景１．発明の分野本発明は一般には、組換え技術の分野に関する。本発明の一部の態様においては、組換えアデノウイルスを産生させる簡単で能率的な方法に関する。他の態様においては、異常なｐ５３を持つ細胞が正常なｐ５３機能と増殖の抑制力を回復する方法を含む、ｐ５３アデノウイルス構成物（construct）に関する新規な組成物と方法に関する。２．関連技術の説明放射線療法、外科手術、及び化学療法を始めとする現在の癌治療方法では、効果に限度があることが知られている。アメリカ合衆国では、肺癌のみをとってみても死亡数は年間１４０，０００人以上に達している。最近の年齢別統計では、肺癌の死亡率は、女性の乳癌死亡率を超えている。禁煙運動が行われるようになって喫煙の慣習は減ってきたが、肺癌死亡率は高いまま２１世紀を迎えることになろう。肺癌の新しい治療方法の合理的な開発は、肺癌の分子レベルの生物学の理解しだいである。現在の確立された理論では、各種癌の病因の少なくとも一部は、遺伝子に異常が生じて一以上の遺伝子が過剰発現するか、あるいは、異常又は変異遺伝子が発現することにあるとされている。例えば、多くの症例においてガン遺伝子が発現したことが原因となって癌が発病したことが知られている。「ガン遺伝子」とは、遺伝的に変質した遺伝子で、発現産物が突然変異しているために正常細胞の機能や制御を何らかの理由で破壊するのである（Spandidos et al.，1989）。今日まで研究されたほとんどのガン遺伝子は、正常細胞遺伝子のコード領域、つまり、「原ガン遺伝子」が、突然変異、それも多くは点突然変異をおこすことによって、「活性化され」、発現したタンパク質産物のアミノ酸を置換することがわかっている。この変質した発現産物は、新生物形成過程に参加する異常な生物機能を示すようになる（Travali et al.，1990）。このような基礎となる突然変異は、化学的突然変異形成や電離放射線など各種手段により発生する。現在では、ｒａｓ，ｍｙｃ，ｎｅｕ，ｒａｆ，ｅｒｂ，ｓｒｃ，ｆｏｓ，ｊｕｎやａｂｌを始めとして、多くのガン遺伝子やガン遺伝子群が同定されて、遺伝子によって差はあるものの、特徴付けもなされている（Travali et al.，1990; Bishop， 1987）。正常細胞が増殖している間は、増殖を促進する原ガン遺伝子と、増殖を制御するガン抑制遺伝子とが均衡を保っていると考えられている。いくつかの要因により、これら二つの力の均衡が崩れ、新生物形成状態になる。この要因の一つが、ガン抑制遺伝子の突然変異である（Weinberg，1991）。重要なガン抑制遺伝子は、細胞タンパク質をコードしている遺伝子であるｐ５３である。ｐ５３は細胞の増殖を制御していてる５３ｋＤの核リンタンパク質である。ｐ５３遺伝子が突然変異していて、さらに、この遺伝子が存在している染色体１７ｐから対立遺伝子が排除されていることが、ヒトの悪性腫瘍で最も頻繁に見いだされる変化である。ｐ５３タンパク質は進化を通して保存度が高く、ほとんどの正常組織で発現されている。野生型ｐ５３は、細胞周期の制御（Mercer ，1992）、転写の調節（Fields et al.，1990，and Miez et al.，1992）、ＤＮＡの複製（Wilcock and Lane，1991，and Bargonetti et al.，1991）、及びアポトーシスの誘発（Yonish-Rouach et al.，1991，and Shaw et al.，1992）に関与していることが立証されている。各種の突然変異ｐ５３対立遺伝子は、１個の塩基が置換されただけで、全く異なる成長調節特性をもつタンパク質が合成されるようになって、最後には悪性腫瘍をもたらすことが知られている（Hollstein et al.，1991）。事実、ｐ５３遺伝子は、ごく普通に見られるヒトの癌で、突然変異している頻度が最も高い遺伝子であって（Hollstein et al.，1991; Weinberg，1991）、特に喫煙に起因する癌に関与することが認められている（Hollstein et al.，1991; Zakut-Houri et al.，1985）。乳癌中のｐ５３の過剰発現も報告されている（Casey et al.，19 91）。癌の遺伝子療法で最も挑戦的な態様の一つは、ｐ５３のようなガン抑制遺伝子を利用することである。野生型ｐ５３をある種の乳癌細胞や肺癌細胞にトランスフェクションすると、これらの細胞系が増殖を抑制する制御能力を回復することが報告されている（Casey et al.，1991; Takahasi et al.，1992）。ＤＮＡのトランスフェクションは、患者の細胞内にＤＮＡを導入する実行可能な手段ではない。しかしながら、これらの実験結果は、ｐ５３遺伝子の改良デリバリー手段さえ開発されれば、ｐ５３遺伝子が突然変異している癌細胞に野生型ｐ５３を供給して、効果的な治療方法とすることができることを示している。遺伝子による腫瘍抑制療法に適用しようとして、遺伝子デリバリーシステムが研究開発されている。実際の生細胞を感染させる、つまり、ウイルスが自らの遺伝材料を伝達する過程の効率が良いので、ウイルス系遺伝子伝達媒体が特に興味深い。これまでにこの分野で、例えば、各種の遺伝子をデリバリーするように操作したレトロウイルスベクターの産生に、ある程度の進歩が見られた。しかしながら、遺伝子療法としてレトロウイルスベクターを使用するには、レトロウイルスは標的細胞にレトロウイルス受容体が存在しないと感染することができない点、濃縮及び精製が難しい点、複製している細胞にしか効率的に組み込むことができない点などの重大な欠陥がある。アデノウイルスベクターシステムは、ある種の遺伝子伝達プロトコルに使用することを目的として最近提案されたものであるが、現在の組換えアデノウイルス製造方法にいくつかの問題がある。現在の製法は、発現ベクターとアデノウイルスプラスミドとをリン酸カルシウムを介して宿主細胞にトランスフェクションした後、このトランスフェクションした細胞をプラーク解析する。この種のトランスフェクション工程と解析方法は、非能率的であり、しかも、低濃度のウイルスしか増殖できないという典型的な結果となる。したがって、増殖に対する抑制力を回復する手段として、ｐ５３などのガン抑制遺伝子を細胞に導入する新しい方法を開発することが、明かに必要である。また、組換えアデノウイルスの製造方法としては、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション工程と、アガロースで表面処理してプラーク解析する試験方法を用いない方法が有利である。発明の要旨本発明は上記その他の問題を解決するためになされたもので、ｐ５３アデノウイルスなどの組換えアデノウイルスの能率的な製造方法、及び、異常ｐ５３を持つ細胞がｐ５３の機能を回復できる効果的な手段を提供する。さらに、癌細胞のような異常なｐ５３機能を持つ細胞中で野生型ｐ５３の発現を促進する組成物を使用する方法に用いる組換えアデノウイルスベクターとビリオンを開示する。さらにまた、リポソームを仲介としてＤＮＡをトランスフェクションした後、細胞変性効果（cytopathic effect）（ＣＰＥ）を観察し、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析を行って、組換えアデノウイルスを増殖する簡単なプロトコルも開示する。また、組換えアデノウイルスを産生増殖するこの新規方法を用いて、上記以外の遺伝子をビリオンゲノムに取り込むことも考えられる。これらの遺伝子としては、網膜芽腫（ｒｂ）遺伝子などのガン抑制遺伝子、抗ｃ−ｍｙｃや抗ｋ−ｒａｓなどのアンチセンスガン遺伝子、及び癌遺伝子療法に用いる増殖制御関連遺伝子などを挙げることができる。本発明者らは、本発明によって転移性増殖の制御に著しい効果を挙げることができることを立証した。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３組換えアデノウイルスが、形質転換した細胞の成長速度を顕著に低減できることが証明されている。このウイルスは、また、ウイルスに感染したＨ３５８細胞の腫瘍形成を抑制した。さらに、同所性肺癌も、先ず、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管支内に接種した後、Ａｄ５ＣＭＶ− ｐ５３組換えアデノウイルスを気管支内滴注を行うことにより増殖を防止することができた。このように腫瘍形成が抑制されたことは、高濃度のｐ５３タンパク質が一時的に発現しただけでも、殺腫瘍効果を誘発するに充分であることが示唆されている。特異的な一実施態様において、本発明は突然変異又は異常ｐ５３遺伝子を持つと推定される標的細胞など、悪性腫瘍細胞タイプを含む標的細胞中に野生型ｐ５３遺伝子を組み入れるベクター構成物に関する。これらの態様では、ｐ５３遺伝子がプロモーターによって制御されている遺伝子発現単位又は転写単位を調製し、この単位を組換えアデノウイルス内のアデノウイルスベクターに組み入れる。いくつかの理由からこの発明は全体として、驚異的に有利な発明である。第一の理由は、ｐ５３ウイルスは毒性があるため、アデノウイルスをつくる際に用いられるような、パッケージング細胞中に産生させることはできないと従来から考えられてきた点にある。第二の理由は、アデノウイルスのＥ１ＢはＰ５３と結合するため、ｐ５３の機能に干渉する点にある。第三に、一旦ｐ５３を産生すると、ｐ５３アデノウイルスは各種癌細胞の成長抑制に予期せざるほど効果的であることが見いだされている点にある。最後に、コントロールウイルスでは抑制されず、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を用いる治療を通じて肺癌細胞の腫瘍形成が抑制されるが、この新規なｐ５３タンパク質デリバリー方法とその製剤は驚くべき治療効果があることを示している点にある。したがって本発明は、ｐ５３などのガン抑制遺伝子、アンチセンスガン遺伝子、その他の関連遺伝子をアデノウイルスに担持させてヒトの癌治療に使用する、アデノウイルスベクター構成物に関する。これは、一実施態様においては、組換えアデノウイルスビリオン又は粒子は、野生型ｐ５３をコードする発現領域を含む組換え挿入断片を含むベクター及びその製剤処方が組み入れられていて、ベクターがヒトの転移細胞中でｐ５３を発現することができるものとなっている。ベクターのｐ５３発現領域は、ゲノム配列を含んでもよいが、ｐ５３のｃＤＮＡ配列の方が当業者からの入手が容易であり、操作も簡単であるので、ｐ５３のｃＤＮＡ配列を用いて簡単化することを考慮している。ベクターの組換え挿入断片は、一般に、ＳＶ４０又はプロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナルなどのプロモーター領域及びポリアデニル化シグナルを含む。好ましい実施態様においては、ＣＭＶプロモーター、ウイルスＬＴＲ、ＲＳＶ又はＳＶ４０プロモーターなどの強力な構成的プロモーター、あるいは伸長因子 −１やアクチンプロモーターなどのような、哺乳動物の細胞において高濃度で発現する遺伝子と結合しているプロモーターに、ｐ５３発現領域を制御させることを考慮している。現在のところ、最も好ましいプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターである。本発明では、ｐ５３のコード配列をＥ１Ｂを欠いているウイルスゲノムに挿入あるいは添加することにより、ｐ５３遺伝子又はｃＤＮＡを組換えアデノウイルスに導入する。しかしながら、好ましいアデノウイルスは、アデノウイルスベクター構成物から複製及び／又はパッケージングに必須なウイルス遺伝子を欠失させておき、その位置にｐ５３発現領域を導入することができる、増殖欠損性ウイルス（replication defective viruses）である。Ｅ１Ｂの他にも、複製に必須の遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ，Ｅ２やＥ４）や、非必須の遺伝子（例えば、Ｅ３）を欠失させておいて、ｐ５３で置換してもよい。図１のゲノム構成で例示しているように、アデノウイルスベクターからＥ１ＡとＥ１Ｂを欠失させておいて、その位置にｐ５３発現領域を導入しているベクターとビリオンが特に好ましい。増殖欠損性アデノウイルスを製造する技術は当業者によく知られていて、Ghos h-Choudhury and Grahama(1987)、McGrory et al.，(1988)、及びGluzmann et a l.,（1982）に例示されている。これらの文献各々は、引用することにより本発明の一部とする。各種細胞系に既に複製欠失があるとしても、欠失を相補できさえすれば、これらの細胞系を用いて組換えアデノウイルスを増殖できることもよく知られている。好ましい細胞系はヒト２９３細胞系であるが、複製を許容できる、即ち、好ましい場合Ｅ１ＡとＥ１Ｂを発現できる他の細胞系も使用することができる。さらに、細胞をプラスチック皿や懸濁培地で増殖して、ウイルス株を得ることができる。本発明は、Ｅ１を欠いているウイルスとＥ１を発現する細胞の組合せだけに限らない。本発明では、ｐ５３ベクターがＥ１Ｂを持たない限り、上記以外でもお互いに相補しているウイルスと宿主細胞との組合せを実際に使用することができる。機能的なＥ２を欠いているウイルスとＥ２を発現する細胞との組合せでもよいし、機能的なＥ４を欠いているウイルスとＥ４を発現する細胞との組合せなどでもよい。例えばＥ３のような複製に必須ではない遺伝子が欠失し、これが置換されている場合、この欠失を宿主細胞が特異的に相補する必要はない。アデノウイルスのベクターやビリオンの固有の性質は、Ｅ１Ｂを持っていてはいけないという条件以外、本発明の実施に重要であるとは考えられていない。アデノウイルスは、これまでに異なる４２の血清型とサブグループＡ〜Ｆが知られているが、このうち、どのアデノウイルスでもよい。本発明の方法に使用する増殖欠損性アデノウイルスベクターの出発原料としては、サブグループＣのタイプ５アデノウイルスが好ましい。タイプ５のアデノウイルスは、大量の生化学及び遺伝学情報が蓄積されていて、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構成物に使用されてきたヒトアデノウイルスだからである。上記に関連する態様において、本発明は、新規なｐ５３ＤＮＡセグメント、又は発現ベクター、及び本発明により製造するアデノウイルスｐ５３ベクターを取り入れる組換え宿主細胞に関する。本発明のＤＮＡセグメントは、一般に、転写の５’−３’方向に、サイトメガロウイルスＩＥプロモーター、野生型ヒトｐ５３の構造遺伝子、及びＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含有している。組換えアデノウイルスを含有する宿主細胞は、一般に、真核細胞及び２９３細胞などの哺乳類細胞である。あるいは本発明のアデノウイルスに感染しているｐ５３遺伝子欠失細胞でもよい。他の実施態様において、本発明は、野生型ｐ５３をコードする組換えアデノウイルスを含み、薬理的に許容できる溶液又は緩衝液に分散させた製薬組成物に関する。好ましい薬理的に許容できる溶液としては、リン酸塩、乳酸塩、トリスなどで緩衝した中性塩類溶液が挙げられる。言うまでもなく、アデノウイルスは精製して、妨害する欠陥アデノウイルス粒子や、内毒素その他のパイロジェンなどの好ましからざる汚染物を実質的に皆無とし、ベクター構成物を服用する動物や患者に副作用が起きないようにすることが望ましい。ベクター精製の好ましい手段としては、塩化セシウム密度勾配遠心法などの浮遊密度勾配法の使用が挙げられる。さらに他の実施態様において、本発明は、野生型ｐ５３欠損細胞にｐ５３機能を与える方法、あるいはこの細胞が野生型ｐ５３タンパク質の機能を回復する方法に関する。これを達成する手段として、ｐ５３突然変異を持つ細胞を、野生型ｐ５３がこの細胞内で発現するのに充分な有効量の組換えアデノウイルスに接触させる。これは、例えば癌細胞などの、欠陥ｐ５３を含む細胞を持つ動物又はヒト患者に、生理的有効量のアデノウイルス含有製薬組成物を投与することにより達成することができる。したがって、本発明の範囲には、乳癌や肺癌などのヒト悪性腫瘍を有効に治療する方法も含まれるものとする。さらに他の実施態様において、本発明はｐ５３発現アデノウイルスを用いて、悪性増殖、さらには転移性増殖をも防止することに関する。一実施態様においては、ｐ５３遺伝子が突然変異している細胞の制御できない増殖を抑制するために、組換えｐ５３を発現しているアデノウイルスが使われる。より好ましい実施態様においては、このｐ５３を発現しているアデノウイルスによって、Ｈ３５８細胞の腫瘍形成と増殖を抑制するが、ｐ５３機能の存在を示すことができる他の細胞を使用してもよい。さらに他の実施態様においては、ｐ５３を発現しているウイルスを気管支内に滴注することにより、同所性肺腫瘍の増殖を防止する。これについては、ヌードマウスにＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスを用いる実験を行って、好成績をおさめた。Ｈ３５８細胞は通常では顕著な腫瘍塊をつくる細胞であるが、Ａｄ５ＣＭＶ −ｐ５３ウイルスを感染させることにより腫瘍形成を抑制することができた。さらに、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管内に接種した後、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスを気管内に滴注することにより、同所性肺癌の増殖を防止して、肺癌細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３のin vitroでの効果を確認した。肺癌細胞の腫瘍形成がコントロールウイルスのＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ではなく、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３による治療によって抑制されたことは、ｐ５３タンパク質が治療効果を持っていることを示している。当業者は他のウイルスデリバリー方法も本発明の範囲に含まれていることを理解している。本発明の実施態様のある一面は、正常な細胞機能の回復や、癌の治療を目的とするｐ５３構成物の使用を例示する。反面、組換えアデノウイルスによって標的細胞内、あるいは宿主細胞内で高濃度のガン抑制タンパク質を発現するために、本発明を一般的に適用することを提案する。例えば、癌治療薬様相の一環として、発明者により考案されたｐ５３の置換に加え、特に例をあげると、網膜芽腫遺伝子（ｒｂ）、アンチセンスガン遺伝子（ｃ−ｍｙｃやｃ−ｒａｓ）、その他関連遺伝子を導入してヒト癌の療法とすることが考えられている。本発明で用いるアデノウイルスベクターは複製欠損性であるので、ガン細胞などのような、最終的に感染しなければならない細胞中で複製することができないことを指摘しなければならない。したがって、治療を開始した時のように、患者の治療を継続する必要があると判断される場合には、一定期間後、例えば６ケ月後あるいは一年後ウイルスを再導入する必要が出でくる可能性がある。本発明のアデノウイルスベクターは、遺伝子療法とは直接関係がない実施態様においても有用性がある。このような、これまでと述べてきたところとは異なる用法としては、各種ｐ５３遺伝子のin vitro解析や突然変異誘発研究、さらに例えば抗体産生や他の態様で用いるタンパク質の組換え生産が挙げられる。新しく見いだされるｐ５３の分子活性に関するすべての実施態様を含むヒトの治療とは関係がない実施態様においても同じことが言える。即ち、細胞へｐ５３をデリバリーするのに、他の関連ウイルスを使用することである。これにはヘルペス属ウイルス、例えば単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が好適である。これまで述べてきたところとは異なる一実施態様において、本発明は非能率的なリン酸カルシウムによるトランスフェクションと単調なプラーク検定法によらないで、あらゆる種類の組換えアデノウイルスを簡単に生産する製法に関する。本発明の組換えアデノウイルス製法は、一般的にリポソームを介したトランスフェクションによりアデノウイルスプラスミトと発現ベクターを好適な宿主細胞に導入し、その後、相同組換えとウイルス産生が行われていることを示す細胞変性効果（ＣＰＥ）が培養した宿主細胞中に存在するかどうかを解析する。第一工程のトランスフェクションの効率が上がれば、第二工程のＣＰＥが有利となる。リポソームを介したトランスフェクションに使用する好ましい組成物は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジデオイロキシ［dideoyloxy］）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート）で、これは市販で入手可能である。ＣＰＥは直接観察が可能な現象で、位相差顕微鏡で評価することができる。ＣＰＥは、初めに溶菌感染した細胞が収縮し、最後には溶菌プラークが形成されるアデノウイルスの細菌毒性の形態的特徴を示したものである。この方法固有の利点としては、インキュベートを開始して１０日〜１４日後に、ウイルスの増殖が容易に測定できることである。これは、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションと、その後のプラーク検定との組合せでは、少なくとも１４日、普通は最低２１日、時として数週間経たないと結果を評価できないのと比較すると著しい改善である。ある実施態様では、Ｅ１が欠けているプラスミドと２９３細胞の組合せで例示されているように、本発明の方法を、複製欠損性アデノウイルスプラスミドとこの欠陥を相補する宿主細胞の組合せに使用している。機能的Ｅ１ＡとＥ１Ｂが欠けているアデノウイルスプラスミドに、ｐ５３発現領域を組み込んで、本発明の実用実施例として使用することができるが、この同じ方法によってどのような発現領域でも組換えアデノウイルスに取り入れることもできる。正確な方法の実施態様は所望によって異なるが、ある場合では最小必須培地を使用することが好ましい。これらの新しい方法をＰＣＲ解析と併用して、正しく組換えられたウイルスが存在しているか、否かを確認することできる。ＰＣＲは当業者に公知であって、アメリカ合衆国特許第4,683,195号に開示されている。この特許は引用することにより本発明の一部とする。ＰＣＲを本発明と併用する場合、細菌変性効果を示す細胞の上澄み液からＤＮＡを採取し、１組は発現ベクターに特異性を持ち、他の１組はアデノウイルスゲノムに特異性を持つ２組のプライマーを用いてＰＣＲによりこのＤＮＡを解析する。ベクター、又は挿入断片に特異性を有するＤＮＡは、例えばｐ５３ＤＮＡの発現によってｍＲＮＡやタンパク質の産生を示すように、最終的に発現させたいポリペプチド又はＲＮＡをコードするＤＮＡの一部をなす遺伝子セグメントであると定義することができる。また、アデノウイルスゲノムに特異性を有するＤＮＡは、増殖がモニターされている段階の間に発現されるどの部分のゲノムでもよい。図面の簡単な説明次に掲げる図面は本明細書を構成する一部であって、本発明の特定の実施態様をさらによく説明するために掲載したものである。以下に開示する特定の実施態様の詳細な説明と、これら図面のうち一以上を併せて参照すれば、本発明をよく理解することができる。図１は、組換えｐ５３アデノウイルスの産生のための図である。ｐ５３発現カセットをｐＸＣＪＬ．１のＸｂａＩ部位とＣｌａＩ部位の間に挿入した。ｐ５３発現ベクター（ｐＥＣ５３）と組換えプラスミドｐＪＭ１７を、２９３細胞中に同時トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、細胞変性効果が開始されるまで培地に維持された。新しく産生されたｐ５３組換えアデノウイルス（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３）は、ＣＰＥ上澄み液をプロテイナーゼＫで処理し、フェノールで抽出して作成したＤＮＡテンプレートを用い、ＤＮＡをＰＣＲで解析することにより同定した。図２Ａは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡの構造解析に使用した地図を示している。これは、ｐ５３発現カセットの位置、ＰＣＲプライマー及び制限部位を示す、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ゲノムＤＮＡの地図である。ゲノムの大きさは約３５．４ｋｂで、１００図単位（maps unit）（１ｍ.ｕ.＝０．３５ｋｂ）に目盛りを付けることができる。ｐ５３発現カセットは、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ.）を置換した。プライマー１は、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモーターの第一イントロンの下流に位置している。プライマー２は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル中に位置している。両プライマーとも両端は、ｐ３５ｃＤＮＡ挿入断片から１５〜２０ｂｐ離れて、１．４０ｋｂのＰＣＲ産物の周囲を定めている。プライマー３と４とは、Ａｄ５ゲノムから各々１１ｍ.ｕと１３．４ｍ.ｕ.に位置し、０．８６ｋｂのウイルスゲノム特異的ＰＣＲ産物の周囲を定めている。図２Ｂは、ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示している。各々の反応では、１．４ｋｂ（ｐ５３）と０．８６ｋｂの（Ａｄ５）ＤＮＡフラグメントを定めている２組のプライマーを使用した。各々の反応に使用したＤＮＡテンプレートは、ｐＥＣ５３プラスミド（レーン１）、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ＤＮＡ（レーン２）、ＤＮＡなし（レーン３）及びＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡ（レーン４）であった。レーン（Ｍ）は分子量マーカーに対応している。図２ＣはＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡの制限地図を示している。ＣｓＣｌ勾配で精製したＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ＤＮＡのサンプルを、各々、酵素なし（Ｕ）、Ｈｉｎｄ III（Ｈ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、及びＣｌａＩで消化して、１％アガロースゲルで解析した。レーン（Ｍ）は分子量マーカーである。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、２９３における組換えアデノウイルスによる細胞変性効果の観察結果を示している。また、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、２９３細胞の一連の位相差画像（×４００）である。さらに、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、一頁の画像を４パネルに分けたものである。図３Ａはトランスフェクション前、図３Ｂはトランスフェクション後１２日のネガティブコントロール、図３Ｃはトランスフェクション後１２日のＣＰＥを開始したもの、図３Ｄはトランスフェクション後１４日のＣＰＥを完了したものである。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄは、組換えアデノウイルスに感染した細胞の免疫組織化学像を示している。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄは、Ｈ３５８細胞の一連の免疫組織画像である。また、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄは、一頁の画像を４パネルに分けて、Ｈ３５８細胞に対するＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の感染力を示したものである。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２をＨ３５８細胞に、５０ＰＦＵ／細胞で２４時間感染させた。また、培地のみを使用したものを偽感染（mock infection）として使用した。感染させた細胞は、免疫染色により解析した。図４Ａは、偽感染を抗ｐ５３抗体でプローブした結果を示している。図４Ｂは、細胞をＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２コントロールに感染させて、抗ｐ５３抗体でプローブした結果を示している。図４Ｃは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させた細胞を、無関係の抗体（ＭＯＰＣ−２１）でプローブした結果を示している。図４Ｄは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させた細胞を、抗ｐ５３抗体でプローブした結果を示している。使用した抗ｐ５３抗体は、Ｐａｂ１８０１であり、染色にはアビジン−ビオチン法を用いた。図５Ａでは、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｈ３５８細胞中で発現した外因性ｐ５３の相対濃度を比較したものである。Ｈ３５８細胞のサンプルは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に３０ＰＦＵ／細胞で感染させて、感染２４時間後及び７２時間後でサンプルとして調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のクーマシーブルー染色によると、ロードされたタンパク質サンプルの相対量を示すことができる。レーン１と４は、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた細胞のサンプルである。レーン２と３は、異なる２つのＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３株それぞれに感染させた細胞から、感染２４時間後採取したサンプルである。レーン５と６は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させた細胞から、感染７２時間後採取したサンプルである。レーン７は、感染７２時間後で採取した偽感染Ｈ３５８のサンプルである。レーンＭは、予め染色したｋＤａ単位の分子量マーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）である。図５Ｂは、レーン配置を図５ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合と同様にして、ウェスタンブロット法で解析した結果を示している。抗ｐ５３抗体を用いてウェスタンブロット法でｐ５３発現の相対濃度を解析した。使用した一次抗体は、ｐ５３タンパク質（PAb 1801，Oncogene Science Inc.）とβアクチン（Amersham，Inc .）に対するモノクローナル抗体であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した２次抗体とＥＣＬ発色剤は、ウェスタンブロット法でウイルス感染させたＨ３５８細胞をAmersham Inc．から入手した。５Ｂのウェスタンブロット法の構成と規模は５Ａと同一である。図６は、ウェスタンブロット法で測定したｐ５３発現の時間経過を示している。Ｈ３５８細胞を多数の皿に入れ、ＩＯＰＦＵ/細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させた。感染後の指定時点で細胞ライセートを調製した。ウェスタンブロットを抗ｐ５３抗体と抗アクチン抗体とで同時にプローブした。レーン“Ｃ”はネガティブコントロールを示している。棒グラフはデンシトメーターで測定したｐ５３の相対量を示している。図７Ａは、細胞系Ｈ３５８のウイルス感染ヒト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６０ｍｍ）あたり細胞数１０⁵個、１細胞系あたり６皿の割合で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（multiplicity of infection、多重感染度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた。感染後６日間、毎日細胞数を数えた。これらの成長曲線は、実験を４回繰り返して得たデータから作成した。図７Ｂは細胞系Ｈ３２２由来の、ウイルス感染ヒト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６０ｍｍ）あたり細胞数１０⁵個、１細胞系あたり６皿の割合で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（多重感染度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた。感染後６日間、毎日細胞数を数えた。これらの成長曲線は、実験を４回繰り返して得たデータから作成した。図７Ｃは細胞系Ｈ４６０由来の、ウイルス感染ヒト肺癌細胞の成長曲線である。細胞は、皿一枚（６０ｍｍ）あたり細胞数１０⁵個、一細胞系あたり６皿の割合で接種した。２４時間後、１０ＭＯＩ（多重感染度、即ちＰＦＵ／細胞）のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた。感染後６日間、毎日細胞数を数えた。これらの成長曲線は、実験を４回繰り返して得たデータから作成した。図８は同所性肺癌モデルによるＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３実験のフローチャートを示している。これはＨ２２６Ｂｒ細胞とウイルスを接種したヌードマウスを治療する実験で、投与量と治療計画の概略をフローチャートとして示したものである。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、治療マウスとコントロールマウス各々から切除した、肺と中隔膜のサンプルである。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、一頁の画像を４パネルに分けたものである。治療後６週間が経過した最終日において、マウスを殺した。肺と中隔膜の組織を切除して、腫瘍形成を評価した。図９Ａは、正常ヌードマウスの中隔膜ブロックのサンプルである。図９Ｂは、ビヒクル（ＰＢＳ）で治療したマウスの中隔膜ブロックのサンプルである。図９Ｃは、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で治療したマウスの中隔膜ブロックのサンプルである。図９Ｄは、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２で治療したマウスの中隔膜ブロックのサンプルである。矢印は腫瘍塊を示している。最良の実施態様の詳細な説明Ａ．肺癌発生の分子事象本発明者らは実験を行い、癌が発生及び進行する重要な分子事象を同定した。この結果、本発明者らは、in vivoで特定の正常なタンパク質機能を回復することにより、悪性表現型を抑制する新しい方法を開発することができた。最も発生頻度が高い肺癌組織（８０％）を、非小細胞肺癌（non-small-celllu ng cancer）（ＮＳＣＬＣ）の名称で分類し、これに鱗状癌（squqmous）、腺癌（adenocarcinoma）、及び大細胞未分化癌（large-cell undifferentiated）を含めた。現在のところ、肺癌の分子生物学のデータの多くは、発生頻度が低い小細胞肺癌（small-cell lung cancer）（ＳＣＬＣ）の研究から得られたものである。ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣとは、細胞の神経分泌の特徴によって区別することができる。ＳＣＬＣは化学療法によく反応するが、治療後速やかに再発する。ＮＳＣＬＣは、上記以外の発癌物質が誘発する上皮癌のモデルとしても用いることができる。この実験で開発されたアプローチや観察は、この他のタイプの上皮癌にも適用することもできる。悪性形質転換の過程には、遺伝的パラダイムが介在していることを示す数多くの証拠が集められている。癌細胞で検出される主な障害は、優性ガン遺伝子や、優性ガン抑制遺伝子に存在している。優性ガン遺伝子は、原ガン遺伝子と呼ぶクラスの遺伝子が変化したもので、シグナルトランスダクションや転写を含む重要な正常細胞機能に関与している。形質転換を起こす能力を与える優性ガン遺伝子の一次的修飾は、点突然変異、転座、転位、及び増幅を含む。ガン抑制遺伝子では、突然変異や欠失あるいはこれらの併合にによって、機能をホモ接合で喪失すると、形質転換が起こると思われる。ガン抑制遺伝子の一部は転写の調整によって、増殖を制御する役割を果たしているように思われる。優性ガン遺伝子やガン抑制遺伝子の発現が変化すると、細胞の一部の特性に影響が出てきて、悪性表現型の誘因となる可能性もある。これまで、ガン遺伝子が仲介する形質転換のメカニズムがより良く知られるようになって来ているにも拘らず、ガン遺伝子とその産物を特異的に標的とする療法の開発はほとんど進歩しなかった。当初、この分野の研究では、先ず優性ガン遺伝子の特徴付けがなされたこともあって、焦点がこの優性ガン遺伝子に充てられていた。ＤＮＡを介する遺伝子の伝達が研究されるようになって、先ずヒト悪性腫瘍からＤＮＡが転移し、その後で正常細胞が悪性表現型を獲得することが立証された。Ｂｐ５３と、癌におけるｐ５３の突然変異現在、ｐ５３はガン抑制遺伝子であると認識されている（Montenarch，1992）。化学物質による発癌、紫外線照射、及びＳＶ４０を含むいくつかのウイルスにより形質転換した多くの細胞に、高濃度のｐ５３が見いだされている。ｐ５３遺伝子は、広範囲に亘る各種ヒト腫瘍において、突然変異によって失活している場合が多く、発生頻度が高いヒトの癌で突然変異することが最も多い遺伝子であると既に報告されている（Mercer，1992）。ｐ５３遺伝子はヒトＮＳＣＬＣの５０％以上（Hollestein et al.，1991）、及びこれ以外の広範囲の腫瘍において突然変異している。ｐ５３遺伝子は、ラージＴ抗原やＥ１Ｂなどの宿主タンパク質と複合物を形成することができる３７５個のアミノ酸からなるリンタンパク質をコードしている。このタンパク質は正常組織や正常細胞で見いだされるが、形質転換した細胞や、腫瘍組織と比較すると僅かな濃度でしかない。興味深いことに、野生型ｐ５３は細胞の成長や細胞分裂を調整する上で重要であると思われることである。ある症例では、野生型ｐ５３の過剰発現に、ヒト腫瘍細胞系において抗増殖効果があったことが示されている。したがって、ｐ５３は細胞の増殖に対してネガティブレギュレーターとして作用することができるし（Weinberg，1991）、制御できない細胞の増殖を直接的に抑制したり、あるいは制御できない増殖を抑制できる遺伝子を間接的に活性化することもできる。したがって、野生型ｐ５３が存在していなかったり不活性化していると、形質転換を起こす一因となる可能性もある。しかしながら、ある研究では、突然変異ｐ５３遺伝子の形質転換する潜在性能が完全に発現するためには、突然変異ｐ５３が存在することが必要であると報告している。野生型ｐ５３が多くの細胞系において中枢的に重要な増殖調整遺伝子であると認識されているが、この遺伝子の遺伝的特性や、生化学的特性にも役割があるように思われる。ミスセンス突然変異は、ｐ５３遺伝子によく起こるが、ガン遺伝子の形質転換能にとっても必須な突然変異である。点突然変異に誘発された単独の遺伝的変化は、ｐ５３ガン遺伝子を生じうる。しかしながら、他のガン遺伝子とは異なり、ｐ５３の点突然変異は少なくとも３０個のそれぞれ異なるコドンで存在することで知られている。これらの点突然変異は、ホモ接合を減らすことなく、細胞の表現型を転換させる優性対立遺伝子を作り出すことが多い。さらに、これらドミナントネガティブな対立遺伝子の多くは生物中では寛容され、生殖細胞系中に受け継がれる。各種対立遺伝子は、最小限の機能不全をもつ負の対立遺伝子から、強い浸透度のドミナントネガティブな遺伝子まで、広い範囲に亘っている（Weinberg，1991）。 Caseyらは、野生型ｐ５３をコードしているＤＮＡを、二つのヒト乳癌細胞系にトランスフェクションすると、これらの細胞が増殖を抑制する制御を回復すると報告している（Casey et al.，1991）。また、突然変異ｐ５３ではなく、野生型ｐ５３をヒト肺癌細胞系にトランスフェクションしても同様な効果が得られたことが報告されている（Takahasi et al.，1992）。ｐ５３は、変異遺伝子よりも優性で、変異遺伝子と細胞中に同時トランスフェクションすると、増殖に拮抗する選択がなされる。トランスフェクションされたｐ５３が正常に発現しても、内因性ｐ５３を持つ細胞の増殖には影響しない。したがって、正常細胞が上記のような構成物を取り込んでも、副作用はない。したがって、ｐ５３に起因する癌を野生型ｐ５３で治療して、悪性腫瘍細胞数を減らすことは可能である。しかしながら、ＤＮＡトランスフェクションによって患者の体内の癌細胞にＤＮＡを導入することは不可能であるので、上記の研究がその目的を達成するまでには、まだまだ長い距離を行かなくてはならない。Ｃ．遺伝子療法の技術遺伝子療法について今日までいくつかのの実験アプローチが提案されているが、それぞれ特有の欠点がある（Mulligan，1993）。上記したようにトランスフェクション法は、ＤＮＡに実験対象の遺伝子を含有させて、生物的にではなく、例えば物理的又は化学的に細胞膜を浸透することにより細胞内に導入することが基本となっている。このことからこのアプローチは、一時的に体外に取り出すことができ、治療由来の細胞毒性を寛容できる細胞、すなわちリンパ球に限られてしまう。また、ある脂質や両親媒性ペプチドからリポソーム又はタンパク質結合体をつくって、トランスフェクションに使うことはできるが、遺伝子組込みの効率が低く、細胞１,０００〜１００,０００個当り組込み成功例１件程度でしかない。そればかりでなく、トランスフェクションされた遺伝子の発現持続時間は、増殖性細胞で数日間、非増殖性細胞で数週間に過ぎないことが多い。したがって、ＤＮＡトランスフェクションは明かに癌治療方法として適当ではない。第二のアプローチは、それぞれのウイルスが独自の遺伝子材料を持参して、細胞に入って行くことができるウイルスの天然の性能を利用する方法である。独自の遺伝子を宿主ゲノムに取り込ませ、多量の外来遺伝材料を伝達し、広範囲の種と細胞型に感染でき、その上特別の細胞系でパッケージングされることができる性能を持つレトロウイルスは、遺伝子デリバリーベクターとして有望ではある。しかしながら、三つの重要な問題があって、レトロウイルスベクターの実用を阻んでいる。第一に、レトロウイルスの感染力は、標的表面のレトロウイルス受容体の存在量しだいであるということである。第二に、レトロウイルスが効率的に取り込まれるのは、複製している細胞だけである。最後は、レトロウイルスは濃縮及び精製が難しいことである。Ｄ．遺伝子療法に用いるアデノウイルス構成物ヒトアデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスで、ゲノムの大きさは約３６ｋｂである（Tooza，1981）。アデノウイルスはこれまでに、真核細胞遺伝子発現のモデルシステムとして広く研究され、特徴もよく調べられて、遺伝子伝達システムとして開発するのに魅力的な系である。この群のウイルスは、in vitro 、in vivoともに、増殖と操作が容易で、宿主域が広い。溶菌感染細胞では、アデノウイルスは宿主のタンパク質合成を停止し、宿主のメカニズムに多量のウイルスタンパク質を合成させて、おびただしいウイルスを産生する。ゲノムのＥ１領域にはＥ１ＡとＥ１Ｂがあって、ウイルスのゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写調節を行うタンパク質をコードしている。Ｅ２発現遺伝子にはＥ２ＡよＥ２Ｂとがあって、ウイルスの複製機能、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、及び複製の準備をする末端タンパク質の合成を可能にしている。Ｅ３遺伝子産物は、細胞障害性Ｔ細胞や腫瘍壊死因子による細胞分解を防止するので、ウイルスの増殖に重要であると考えられる。Ｅ４タンパク質に関連する機能には、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、及び、宿主細胞の閉止（ host cell shutoff）がある。後期遺伝子産物にはビリオンキャプシドタンパク質のほんどんとが含まれていて、主要後期プロモーターからつくられる１個の一次転写産物のプロセッシングの大部分が起こった後に初めて、これらの後期遺伝子産物が発現する。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、感染後期の段階で高い効率を発揮する（Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a）。ウイルスのゲノムは、in cisでは少量しか必要とされないので（Tooza，1981 ）、アデノウイルス由来のベクターと２９３細胞などの細胞系とを同時使用すると、このベクターが大きなＤＮＡフラグメントを置換する優れた性能が生まれる。また、Ａｄ５で形質転換したヒト胚腎臓細胞系（Graham，et al.，1977）は、in trans に必須のウイルスタンパク質を供給するように開発されてきた。したがって、本発明者らは、このような特性からin vivoで癌細胞を標的とするには、アデノウイルスを使うのがよいと判断した（Grunhaus & Horwitz，1992）。細胞に外来タンパク質をデリバリーするアデノウイルスシステムの特筆すべき利点としては、（ｉ）外来ＤＮＡによって比較的大きなウイルスＤＮＡを置換することができる、（ii）組換えアデノウイルスの構造が安定している、（iii）ヒトにアデノウイルスを投与しても安全である、及び（iv）アデノウイルスによる感染と癌又は悪性腫瘍との間で、知られている関連性がない、（ｖ）高力価の組換えウイルスを得ることができる、（vi）アデノウイルスの感染度が高いことが挙げられる。この他、レトロウイルスに勝るアデノウイルスベクターの利点として、高濃度の遺伝子発現を挙げることができる。さらに、アデノウイルスの複製は、レトロウイルスの配列とは異なり、宿主の遺伝子複製に依存しない。Ｅ１領域におけるアデノウイルスの形質転換遺伝子は、容易に欠失でき、効率的な発現ベクターとなるので、アデノウイルスベクターに起因するガン遺伝子の危険は無視できる程小さいと考えられる（Grunhaus & Horwitz，1992）。一般に、アデノウイルス遺伝子伝達システムは、Ｅ１などゲノムの一部を欠失させて複製欠損性（replication-incompetent）とするが、感染適格性は保持するように操作した、組換えアデノウイルスを基本としている。アデノウイルスゲノムから別の部分をさらに欠失させると、相対的に大きな外来タンパク質を発現することができる。例えば、Ｅ１とＥ３両方の領域を欠失しているアデノウイルスは、１０ｋｂまでの外来ＤＮＡを担持して、２９３細胞内で高力価になることができる（Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a）。驚くべきことに、アデノウイルスによる感染後、導入した遺伝子（トランスジーン）が発現を続けていたことが報告されている。最近では、真核細胞や動物全体に遺伝子を伝達する仲介手段として、アデノウイルスを介する遺伝子の伝達が研究されるようになった。例えば、まれな劣性遺伝疾患であるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏症を罹患しているマウスの治療において、アデノウイルス構成物を用いて正常なＯＴＣ酵素を供給できることが見いだされた。残念ながら、１７症例のうち正常濃度のＯＴＣを発現できるまで回復したものは４例に過ぎなかった（Stratford-Perricaudet et al.，1991b）。したがって、この実験のマウスの大部分は、欠陥が部分的に矯正されただけで、生理的にも、表現型でも変わるところはなかった。このような結果では、癌療法にアデノウイルスベクターの使用が促進される筈がない。コットンラットの嚢胞性線維症の膜内外伝導調整遺伝子（cystic fibrosis tr ansmembrane conductanve regulator、ＣＦＴＲ）の遺伝子を、アデノウイルスによって肺上皮に伝達する実験が行われた。この実験は部分的には成功したが、実験動物の上皮に伝達された遺伝子の生物活性を評価することはできなかった（ Rosenfeld et al.，1992）。この実験でも、遺伝子が伝達されたこと、肺気道細胞でＣＦＴＲタンパク質が発現したことは証明されたが、生理的効果は証明されなかった。１９９１年のScience 誌の論文において、Rosenfeldらは、α１−抗トリプシンタンパク質を肺で発現させることに成功したが、生理的効果を証明することができなかったことを報告している。事実、彼らは観察された発現の濃度は、ヒトの肺の保護に必要な濃度の約２％、つまり、生理的効果に必要な濃度を大幅に下回ると見積ったのであった。正常ラットの肝臓にヒトα₁−抗トリプシン遺伝子を肝門内注射により導入する実験が行われた。その結果、遺伝子は肝臓で発現し、導入されたヒトタンパク質がラットの血漿に分泌された（Jaffe et al.，1992）。しかし、残念ながら、得られた濃度は治療価値に達する程高くはなかった。これらの実験結果では、アデノウイルスが組換え細胞中で充分なタンパク質を発現させて、生理的に妥当な効果を挙げることを証明できなかったし、また、アデノウイルスシステムが癌療法に使用できる有用性を持つことも証明できなかった。さらにまた、本発明以前では、ｐ５３には毒性があるので、アデノウイルスを製造する場合に用いられるような、パッケージング細胞にｐ５３を取り入れることはできないと思われていた。また、アデノウイルスのＥ１Ｂは、ｐ５３と結合するので、この点からもアデノウイルスの技術と、ｐ５３の技術とを結び付けることはできないと考えられていたのである。Ｅ．ｐ５３−アデノウイルス構成物と腫瘍の抑制本発明は、癌の遺伝子療法に、新しく効果的なガン抑制ベクターを提供するものである。この組換えウイルスは、高力価である、標的範囲が広い、効率的に形質導入ができる、標的細胞に組み込まれることがないなどの、アデノウイルスベクターとしての長所を活用しようとするものである。本発明の一実施態様においては、増殖欠損性であり、ヘルパーに依存性がない、アデノウイルスをつくり、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下で野生型ｐ５３（Ａｄ５ＣＭＶ −ｐ５３）を発現している。発現ベクターの制御機能は、補乳動物の細胞中で発現しようとする場合には、ウイルスから与えられることが多い。例えば、広く使用されているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）から派生されるものである。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルスの複製開始点を含有するフラグメントとして容易にウイルスから得ることができて、特に有用である。ＳＶ４０のフラグメントは、ウイルス複製開始点に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇ１Ｉ部位の方向に伸びている約２５０ｂｐの配列を含んでいさえすれば、小さくとも、大きくとも、どちらでも使用するのに差し支えはない。さらに、プロモーター配列や制御配列は、制御配列が宿主細胞のシステムと適合すれば、通常は、含まれている遺伝子配列と結合したままで使用することができるし、また、その方が望ましい。複製開始点は、ＳＶ４０あるいは他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から派生されるような外因性の開始点を含むベクターを構成して得ることができるし、また宿主細胞の染色体複製メカニズムから得ることもできる。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれている場合には、それで充分である場合が多い。好ましいｐ５３アデノウイルスの増殖デザインは図１の図表にしてある。これについて、組換えアデノウイルスの増殖及び同定の改良プロトコルが開発されている（以下で説明する）。同定後、図２に示すようなＰＣＲ解析によりｐ５３組換えアデノウイルスの構造を確認した。この構造を単離して確認した後、このｐ５３アデノウイルスを使って、ホモ接合ｐ５３遺伝子を欠失させたヒト肺癌細胞系Ｈ３５８に感染させた。ウェスタンブロット法により、この外因性ｐ５３タンパク質が高濃度で発現し（図４及び図５）、感染３日後でピークに達したこと（図６）が認められた。さらにまた、ｐ５３が点突然変異している細胞系Ｈ３２２において、変異しているｐ５３が外因性ｐ５３の発現によって負の調節を受けていることが示された。実験コントロールとしては、構造がＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３と似ているビリオン（Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２）を使用した。このビリオンは、ラウス肉腫ＬＴＲプロモーターによって制御されたルシフェラーゼｃＤＮＡをビリオンの発現カセット中で含有していた。ビリオンＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染させた細胞中では、ｐ５３が発現したことも検出されなかったし、アクチンの発現が変化したことも検出されなかった。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させたＨ３５８細胞の増殖は、非感染細胞又はコントロールビリオンに感染させた細胞とは対照的に、大幅に阻害された（図７Ａ）。ｐ５３ビリオンにより、Ｈ３２２細胞の増殖もまた大幅に阻害されたが（図７Ｂ）、野生型ｐ５３を含有するヒト肺癌Ｈ４６０細胞では影響が少なかった（図７Ｃ）。 in vitroにおいて、肺癌細胞の増殖に対して、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の仲介による強力な抑制効果が認められた。ＭＯＩが１ＰＦＵ／細胞以下のＡｄ５ＣＭＶ −ｐ５３で細胞を感染させた場合、増殖抑制はそれほど明らがではなかった。ところが、ＭＯＩが１００ＰＦＵ／細胞以上であると、コントロールウイルスであるＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２おいてさえ細胞毒性が認められた。本発明者らの研究において、成長速度実験で用いた至適用量は、１０〜５０ＰＦＵ／細胞であった。この用量範囲ならば、細胞増殖の抑制はｐ５３タンパク質の発現によるものであるとすることができた。ヌードマウスを用いる実験において、Ｈ３５８細胞をＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で処理することによって、腫瘍形成を大幅に抑制したことが認められた。ヒトの同所性肺癌のマウスモデルにおいて、ウイルス処理の３日前に、ｐ５３が点突然変異している腫瘍形成性Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管支内に接種した。このモデルシステムにＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を気管支内滴注することにより腫瘍形成を防止した。このことから、修飾されたアデノウイルスは、ヒトの癌細胞内でガン抑制遺伝子の伝達及び発現を仲介する効率的なベクターであり、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスは、今後さらに癌遺伝子療法で使用する治療剤に開発できることが示唆されている。ヒト肺癌細胞内でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の仲介により、高濃度のｐ５３遺伝子が発現したことがウェスタンブロット法解析で証明されている。外因性ｐ５３タンパク質の検出量は、Ｈ４６０細胞の場合では内因性野生型ｐ５３の約１４倍、Ｈ３５８細胞の場合ではインターナルコントロールであるβアクチンの約２〜４倍であった。高濃度で発現された理由は、（１）遺伝子の伝達が非常に効率的であった、（２）強力なＣＭＶプロモーターがｐ５３ｃのＤＮＡを発現させた（３）アデノウイルスＥ１エンハンサーがｐ５３のｃＤＮＡの転写を増強したことが挙げられる。感染後のｐ５３発現の持続時間は、Ｈ３５８細胞の場合１５日以上であった。しかしながら、感染５日後以降では発現が急速に減衰した。感染Ｈ３５８細胞からＤＮＡサンプルを採取してＰＣＲ解析を行ったところ、タンパク質濃度が低下するにつれて、ウイルスＤＮＡの濃度も低下することが認められ、in v itro では癌細胞が増殖を続けている間中、ウイルスのＤＮＡが失われていくことを示していた。従前から宿主細胞が仲介してＣＭＶプロモーターが閉止する（CMV promoter s hutoff）現象が報告されていたことから、ｐ５３の発現を制御しているＣＭＶプロモーターが細胞内で減衰するのでｐ５３の発現も低下して行くとも考えられる（Dai et al.，1992）。アデノウイルスベクターは、宿主遺伝子に組み込まれない遺伝子伝達ベクターである。したがって、遺伝子発現の持続時間は、宿主細胞、伝達される遺伝子、及び関連するプロモーターを始めとする多数の要因に依存している。Crystalらは感染６週間後においてすら、コットンラットの上皮細胞における嚢胞性腺維症の膜内外伝導調整遺伝子が低濃度の発現をしているのを証明した（Rosenfeld et al.，1992）。また、Perricaudetの研究所では、ｍｄｘマウスの筋肉のミニジストロフィンが感染後３ケ月以上も最低限度の発現を続けていたことを証明した。本実験で観察されたように、野生型ｐ５３タンパク質が高濃度で短時間発現することにより、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３によってin vivo処理した後では、副作用が少ないという利益効果が生まれる。本明細書で開示した実験では、ｐ５３組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞がｐ５３タンパク質の機能を回復するためと考えられる腫瘍抑制特性を持つことを示している。これらの実験結果は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ビリオンを癌治療の治療剤として使用することを支持している。Ｆ．組換えアデノウイルス増殖同定の改良プロトコル新しい遺伝子伝達システムとしての組換えアデノウイルスには、遺伝子療法やワクチンの開発の多くの面で適用される可能性がある。このような分子生物学の分野では、組換えアデノウイルスの増殖が重要な用具である。組換えアデノウイルスの現在の増殖方法は、リン酸カルシウム沈澱を仲介として２９３細胞内にトランスフェクションした後、トランスフェクションした細胞をプラーク検定することからなる。この方法のトランスフェクションの効率には改良する余地があり、また、操作手続きもより簡単化する必要がある。本発明以前では、組換えアデノウイルスの増殖は、常套的にリン酸カルシウムを介してトランスフェクションを行うことにより実施されてきた。この方法は細胞を、リン酸カルシウム中でベクター又はプラスミドＤＮＡに数時間さらした後、例えば、１５％グリセロールに１分間つけるなど、短時間のショック処理を行うことからなる。この方法は細胞に取り入れられるＤＮＡの濃度が低い、つまり極めて効率の悪いトランスフェクション手段であるという著しい欠点がある。ウイルスが増殖したことは、ウイルスの増殖に起因する細胞溶解を示す、溶解した細胞の周囲に、清澄な丸い区域となっているプラークが見えることで判断することができる。本発明者らは、トランスフェクション効率を著しく向上し、選択も簡単化にできる新規なアデノウイルス製造方法を開発した。本発明者らは、ＤＯＴＡＰを介するトランスフェクションなどの、リポソームを介するトランスフェクションと、細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察とを組み合わせると、効率は向上し、検出も迅速で簡単化できることを見いだした。新方法では、リポソームＤＯＴＡＰを介して遺伝子を伝達して、発現ベクターと組換えプラスミドを２９３細胞中に形質導入する。このようにしてトランスフェクションされた細胞は、０．５％アガロースで表面処理してプラーク検定するのではなく、そのまま最小必須培地に維持しておいて細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察する。新方法を用いて、２４ウェルプレートのうちウェル２個、及び６０ｍｍ皿５枚のうち３枚に、同時トランスフェクションして、それぞれ第１０日目と第１２日目にＣＰＥを発生させる二つの実験を行った。対照として、リン酸カルシウム沈澱法を用いて、１回当り６０ｍｍ皿２０枚に同時トランスフェクションさせて、これを３回繰り返したが組換えウイルスを得ることはできなかった。ＨｅｐＧ２細胞系とＨｅＬａ細胞系にＤＯＴＡＰが仲介するトランスフェクションを行い、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）解析を実施したところ、ＣＡＴ活性はリン酸カルシウムトランスフェクションの場合の５倍以上高かった。同時トランスフェクション後、アガロースによる表面処理をしないことで操作手続きが簡単になった。インキュベート１０〜１４日後では、普通は濁って測定が難しくなるプラークを同定するのではなく、直接ＣＰＥを観察するだでけであるので、この実験の終了点、つまりウイルスの増殖は、培養後１０〜１４日後に判断が不明瞭で困難であるプラークを確認するかわりに、ＣＰＥを直接観察することによってより簡単になった。図３はＣＰＥによる細胞培養と、ＣＰＥによらない細胞培養を比較したものである。本発明者らはさらに、ＰＣＲを用いてアデノウイルスの力価を迅速に測定する技術を開発した。この方法はＣＰＥを示す細胞培養物の上澄み液からＤＮＡサンプルを採取して、直接ＰＣＲ解析を行うものである。この方法では、便宜上、挿入断片に特異性を持つ配列を増幅するプライマーと、ウイルスゲノムに特異性を持つ配列を増幅するプライマーの２組のプライマーを使用する。本発明者らは、アデノウイルスを細胞培地中に放出しても、僅か約５０μｌの上澄み液でＤＮＡテンプレートを作って、ＰＣＲにより検出できることを証明した。ＰＣＲ増幅を行った挿入断片に特異性を持つ配列と、ウイルスゲノムに特異性と持つ配列は、例えば、アガロースゲル上でＰＣＲ増幅産物を解析することにより同定する。挿入断片に特異性を持つＤＮＡに対応するバンド、ウイルスゲノムに特異性と持つＤＮＡに対応するバンド、及びプライマーに対応するバンドを適当な標準マーカーと比較して同定する。ＰＣＲにより、挿入断片に特異性を持つ遺伝子産物と、ウイルスゲノムに特異性を持つ遺伝子産物を増幅する場合には、増幅すべき配列に特異的なプライマーを作成する。挿入断片に特異的な産物の定まった部分を増幅するプライマーと、ウイルスゲノムに特異的な産物のセグメントを定めるプライマーの２組のプライマーを用いれば効果的かつ選択的に増幅を達成することができる。例として、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから、ｐ５３発現カセットを構成した。１組のプライマーは、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモーターの第一イントロンの下流に位置し、もう１組のプライマーは、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに位置している。理想的には、これらのプライマーは両方とも、ｃＤＮＡ挿入断片、つまりこの実施例ではｐ５３から１５〜２０ｂｐ離れていることが望ましい。定められたＰＣＲ産物、例えば１．４０ｋｂのｐ５３ｃＤＮＡを選択する。また、例えば、第２組のプライマーはＡｄ５ゲノムから１１Ｍ.Ｕ.及び１３．４Ｍ .Ｕ.に位置して、０．８６ｋｂのウイルスゲノムに特異的なＰＣＲ産物を定めている。プライマーの選択は当業者にとり周知である。塩基対配列が分かっているＤＮＡ配列の部分を選択して、これを増幅するためのプライマーを構成してもよい。プライマーは、ＤＮＡとハイブリッドを形成して、遺伝子の一部分の合成開始部位となる。ヌクレオチドプライマーは、対合する二本鎖のそれぞれの部位と結合するように設計され、その間に入る配列を増幅すべき部分として定めるようにしてもよい。プライマーとして用いるヌクレオチド分子は、一般に増幅することを所望するＤＮＡセグメントと相補的な、少なくとも１０ｂｐの配列を含んでいる。１０ｂｐの大きさは、一般的な最低限度で、大きさが１０ｂｐより小さいと、ハイブリッド形成が効果的に行えなくなり、安定性に問題が生じる。好ましくは、１５〜２０ｂｐの大きさを使用する。本発明の最良の実施態様では、図１に示すプライマーセットを使用しているが、これは１９ｂｐ又は２０ｂｐの大きさである。Ｇ．患者と治療プロトコル切除不能な閉塞性気管支内癌などのｐ５３に起因する肺癌患者の細胞に、アデノウイルス−ｐ５３遺伝子構成物を局所的にデリバリーすることにより、治療有効遺伝子をデリバリーして臨床疾患を和らげる極めて効果的な方法となる。このアプローチは、最後の癌細胞まで殺すか、除くことを意図している現在の癌療法の顕著な改善である。腫瘍細胞が休眠する現象は立証されており、この減少のために、効果的な殺細胞などあり得るはずがない。ＮＳＣＬＣ細胞がアデノウイルス構成物を取り込むと、この細胞の増殖率が低下する。こうなると患部の肺が広がったまま（expanded）になっている時間が長くなり、気管支内の腫瘍の再増殖を防止することができ、患者が長く生存できるようになる。切除不能の、気管支内腫瘍が再発し、気道の一部又は全部を閉塞している患者で、体外からの放射線治療に効果がなかったか、放射線治療を受けられない場合には、このプロトコルを考慮する。現在の治療法では、このような病状に対しては一時的な抑えができるだけである。ほとんどの患者では、体外から放射線治療を受けていても、癌は再発する。近接照射カテーテル（brachytherapy catheter ）を挿入して、照射療法を追加することもできる。しかしながら、この療法の受診患者の平均寿命は、６ケ月である。近接照射療法で効果がなかった患者は、遺伝子療法に適格である。この場合、先ずレーザー鉗子又は生検鉗子で気道から腫瘍を取り除く。これをアデノウイルス構成物の注射と併用すると、注射量を減量することができる。ウイルス構成物の投与をしている場合でも、進行性腫瘍の場合は、他の緩和療法を平行実施してもよい。次の各種実施例は本発明の最良の実施態様を説明するために記載したものである。当業者は、これらの実施例で開示する技術は、本発明者らが本発明の実施によく機能する技術として発明したもので、したがって、最良の実施態様を構成するものと考えられていることを理解しなくてはならない。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、本明細書で開示された特定の実施態様を数多く変更して、同様の結果を得たとしても、これらの変更は本発明の精神及び範囲内であることを理解しなければならない。例１ｐ５３発現ベクターの構成本実施例ではｐ５３発現ベクターの構成を説明する。このベクターは次の通りに構成して、アデノウイルス株Ａｄ５ゲノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ. ）を置換するのに用い、さらにまた例２で説明するアデノウイルスビリオンの構成にも使用する。図１に示す、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Boshart et al.，1985）、ｐ５３ｃＤＮＡ、及び、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含有するｐ５３発現カセットを、ｐｘＣＪＬ１（Dr．Frank L．Graham，McMaste r University，Canadaから恵贈）のＸｂａＩ部位とＣｌａＩ部位との間に挿入した。ゲノムの大きさは、約３５．４ｋｂで、これは図単位に換算すると、１００ｍｕ.（１ｍ.ｕ.＝０．３５ｋｂ）となる。ｐ５３発現体カセットはＡｄ５ゲノムのＥ１領域（１．３〜９．２ｍ.ｕ.）を置換した。プライマー１の配列は、５’−ＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣ−３ ’（配列番号１）であって、ヒトＣＭＶ主要ＩＥ遺伝子プロモーター（Boshart ，et al.，1985）の第１イントロンの下流に位置している。プライマー２の配列は、５’−ＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）であって、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに位置している。これらのプライマーはいずれも、その両端がｐ５３ｃＤＮＡ挿入断片から１５〜２０ｂｐだけ離れていて、１．４０ｋｂのＰＣＲ産物を定めている。プライマー３の配列は、５’− ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号３）、プライマー４の配列は、５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号４）であって、Ａｄ５ゲノムの各々１１ｍ.ｕ.及び１３．４ｍ.ｕ.に位置し、０．８６ｋｂのウイルスゲノムに特異的なＰＣＲ産物を定めている。例２組換えｐ５３アデノウイルスの産生及び増殖本実施例では、ｐ５３を発現する、ヘルパー依存性がない組換えアデノウイルスを産生する好適な方法を説明する。この方法は、アデノウイルスのパッケージングには限りがあるため、ｐＪＭ１７は、自らウイルスを形成できない事実を基本にして、組換えアデノウイルス産生の分子戦略を組み立てている。したがって、トランスフェクションされた細胞内でｐ５３発現ベクタープラスミドと、ｐＪＭ１７とを相同組換えして、必要なアデノウイルスタンパク質を発現する細胞だけに、パッケージングされることができる生ウイルスをつくることができる。本実施例の方法は、宿主細胞として２９３細胞を使って、異種ＤＮＡ発現カセットがＥ１領域又はＥ３領域を置換しているウイルスを増殖するものである。この工程では、ＤＮＡを２９３細胞内に同時トランスフェクションする必要がある。ウイルス増殖の効率は、主としてこのトランスフェクションで決められる。本発明以前では、ＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションする方法は、通常、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈澱法であった（Graham and van der Eb，1973）。しかしながら、この方法とプラーク検定法を併用することは比較的に難しいし、また、ウイルス増殖の効率が低いのが通例である。本実施例で説明するように、リポソームを介したトランスフェククションを行い、トランスフェクションされた細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）で同定することにより、トランスフェクションとその後のトランスフェクションされた細胞の同定を著しく改良させることができる。２９３細胞系は、加熱により失活させたウマ血清１０％を加えたダルベッコ改良最小必須培地中に維持された。相同組換えするｐ５３発現ベクターと、プラスミドｐＪＭ１７（Mcgrory，et al.，1988）とは、メーカーのプロトコル（Boehr inger Mannheim Biochemicals，1992）に従って、ＤＯＴＡＰを介したトランスフェクションににより、２９３細胞中に同時トランスフェクションした。この概略図を図１に示す。２９３細胞（継代３５、６０％集密的）は、トランスフェクションの２４時間前に６０ｍｍ皿か、２４ウェルプレートのいずれかに接種した。ウェル各々の細胞は、ＤＯＴＡＰを３０μｌ、ｐ５３発現ベクターを２μｇ、及びプラスミドｐＪＭ１７を３μｇをそれぞれ添加して、トランスフェクションした。トランスフェクション後からＣＰＥの開始まで、２〜３日毎に最小必須培地を細胞に供給した。例３組換えアデノウイルスの同定本実施例では、適当な細胞系で同時トランスフェクションを実施した後、組換えビリオンを同定を確認する新しいポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検定を説明する。実験プレートから細胞培養物の上澄み液のアリコート（５０〜３７０μｌ）を採取し、プロテイナーゼＫ（０．５％のＳＤＳと２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０μｇ／ｍｌ）により５６℃で１時間処理して、フェノール−クロロホルムで抽出し、核酸をエタノール沈澱させた。ＤＮＡペレットは２０μｌのｄＨ₂Ｏ中に再懸濁して、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。各種ＰＣＲプライマーの相対的位置とその配列を図１に掲げる。これらの配列はそれぞれ、配列番号１、２、３及び４である。ｃＤＮＡ挿入断片に特異的なプライマーは、１．４ｋｂのＰＣＲ産物を定め、ウイルスゲノムに特異的なプライマーは、０．８６ｋｂのＰＣＲ産物を定めている。ＰＣＲ反応は、ＭｇＣｌ₂を４ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、トリトンＸ−１００を０．１％、ｄＮＴＰｓそれぞれ２００μＭづつ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を１０ｍＭ、プライマーそれぞれ２μＭづつ、及びＴａｑポリメラーゼ（Promega）を１．０単位含有する５０μｌ容量内で実施した。反応は、９４℃で０．５分、５６℃で０．５分、及び７２℃で１分、３０サイクル行った。新しく増殖した組換えウイルスの同定方法を簡単化するため、細胞培養物の上澄み液から採取したＤＮＡサンプルを直接ＰＣＲ検定する検定法を開発した。ＣＰＥを起こしている細胞の培地から上澄み液のアリコート（５０又は３７０μｌ）を取り、プロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出した。エタノール沈澱の後、２組のプライマーを使ってＰＣＲ解析を行い、挿入断片に特異的な配列と、ウイルスゲノムに特異的な配列を増幅した。ＰＣＲプライマーの標的とその配列を図１に示す。プライマー１、２、３、及び、４は、それぞれ配列番号１、２、３、及び、４で表される。その結果、１．４ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片と０．８６ｋｂのウイルスゲノムフラグメントは、発現ベクター（ポジティブコントロール）と陽性の細胞培養物のＤＮＡサンプルから増幅された（図２ＢＮそれぞれレーン１及び４）。０．８６ｋｂのフラグメントだけが、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２ウイルス（ネガティブコントロール、レーン２）のＤＮＡサンプルから増幅した。未処理の陽性の細胞培地の上澄み液を取って、ＰＣＲ反応を行ったが、いずれの場合も増幅されたバンドは現れなかった（レーン３）。これらの実験結果は、細胞培地の上澄み液を僅か５０μｌ使ってＤＮＡテンプレートをつくることにより、細胞培地に放出されたアデノウイルスが検出可能であることを示している。また、これらの実験結果から、アデノウイルスの力価を、これまで行われてきたプラーク検定にかわり、この技術によって測定する定量法を開発することができることがわかる。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ勾配法により精製して、ジデオキシＤＮＡ配列決定法により、これが野生型配列のｐ５３ｃＤＮＡであることを確認した。同様にして、コントロールウイルスであるＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２を産生したが、発現カセット中でラウス肉腫ウイルスプロモーターとルシフェラーゼｃＤＮＡが使われている以外は、構造がＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に類似している。大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を担持する組換えアデノウイルスであるＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺも、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に類似する構造である。このＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺは、Dr．Frank L．Grahamから恵贈された。ウイルス株、力価及び感染。Graham and Prevecの方法（1991）によりプラーク精製をおこなって、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３、Ａｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２、及び、Ａｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺそれぞれのクローンをつくった。１個のウイルスクローンを２９３細胞で増殖させた。完全な細胞変性効果を示している２９３細胞の培地を集めて、１０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。上澄み液をプールして、等分し、ウイルス株として−２０℃で保存した。ウイルスの力価はプラーク測定法（Graham and Prevec，1991）により測定した。単層に蒔いた細胞にウイルス溶液（６０ｍｍ皿毎に０．５ｍｌ）を添加して、５分毎に短時間攪伴しながら室温で３０分間インキュベートして細胞系を感染させた。その後、培地を添加して、感染細胞を３７℃のインキュベーター中に入れた。Ｈ２２６Ｂｒ、Ｈ３２２、Ｈ４６０、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、ＬＭ２や、Ｖｅｒｏなどの各種細胞系にＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺを用いて、組換えアデノウイルスによる遺伝子伝達の効率を評価した。ＭＯＩが３０ＰＦＵ／細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺに細胞系を感染した後、Ｘ−ｇａｌで染色したところ、すべての細胞系の９７〜１００％がブルーに染まっていたのが認められた。例４ヒト肺癌細胞においてＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３が誘導するｐ５３遺伝子の発現本実施例では、ホモ接合でｐ５３遺伝子が欠失しているヒト肺癌細胞に、組換えｐ５３アデノウイルスを感染させることを説明する。この実験結果では、これら細胞の増殖と変異株ｐ５３の発現が抑制され、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ビリオンが転移細胞の制御に有用な薬剤であることを示していた。単層にした感染細胞を３．８％ホルマリンで固定し、３％Ｈ₂Ｏ₂を含むメタノールで５分間処理したものについて、免疫組織化学解析を行った。この免疫組織化学解析は、Vectastain Elite kit（Vector，Burlingame，CA）を用いて実施した。この解析に用いた一次抗体は、抗ｐ５３抗体ＰＡｂ１８０１（Oncogene S cience，Manhasset，NY）であった。また、ネガティブコントロールとしてＭＯＰＣ−２１（Organonn Teknika Corp.，West Chester，PA）を使用した。二次抗体はアビジンで標識した抗マウスＩｇＧ（Vector）であった。また、ビオチン化したホースラディッシュペルオキシダーゼＡＢＣ複合試薬を用いて、抗原抗体複合物を検出した。最後に、細胞をHarrisヘマトキシリン（Sigma）で対比染色して、Cytoseal 60（Stephens Scientific，Riverdale，NJ）でマウントした。感染細胞系の免疫組織化学解析を行うことにより、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスのＣＭＶプロモーターに制御されるｐ５３発現のin situにおける発現を検討した。ホモ接合でｐ５３が欠失しているＨ３５８細胞系では、３０〜５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞の多重感染度で、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染させたとき、免疫組織化学解析で検出したように、ｐ５３遺伝子が効率９７〜１００％で伝達されているのが認められた（図４）。ヒトＣＭＶＩＥプロモーターによって転写されたＬａｃＺ遺伝子を担持しているウイルスであるＡｄ５ＣＭＶ−ＬａｃＺで確認した時にも、組換えアデノウイルスによる高い伝達効率が認められた。３０〜５０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでは、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、ＬＭ２、及び、ヒトＮＳＣＬＣ癌細胞系を含む、試験されたすべての細胞系の９７〜１００％において、Ｘ−ｇａｌ染色法によるβ− ガラクトシダーゼ活性が陽性であった。アデノウイルスベクターは、遺伝子をヒト癌細胞に伝達する効率的な伝達媒体であることを、これらの実験結果は示している。単層にした細胞をリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）で洗った後、この細胞を皿にに入れて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（６０ｍｍ皿１枚当り０．５ｍｌ）で細胞を分解して、全細胞溶解液をつくり、この全細胞溶解液でウェスタンブロット法解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、レーンに細胞５×１０⁴個に等しい細胞溶解液（１０〜１５ｍｌ）をロードした。ゲル中のタンパク質はＨｙｂｏｎｄ^TM−ＥＣＬ膜に移動させた。これらの膜は、０．５％のドライミルクを含むＰＢＳでブロッキングして、一次抗体として、マウスの抗ヒトｐ５３モノクローナル抗体Ｐ１８０１、マウスの抗ヒトβアクチンモノクローナル抗体（Amersh am）でプローブし、洗った後、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したウサギの抗マウスＩｇＧ（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL ）でプローブした。これらの膜は、Amershamの増強化学ルミネセンスプロトコルにしたがって発色させた。発現した外因性ｐ５３の相対量はデンシトメーター（ Molecular Dynamics Inc，Sunnyvale，CA）により測定した。ウェスタンブロット法では、外因性ｐ５３タンパク質が高濃度で発現したことを示していた（図５Ａレーン２、３及び５、６）。タンパク質は感染３日後でピークに達した（図６、挿入断片、０．５日〜３日）。コントロールとして、例１の組換えＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３と似た構造を持つビリオンを構成した。このビリオンの発現カセットには、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターにより制御されるルシフェラーゼｃＤＮＡを含有させた。ビリオンＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に感染した細胞では、ｐ５３の発現も検出されなかったし、アクチンの発現の変化も検出されなかった。組換えｐ５３アデノウイルスを、次の３つのヒト肺癌ＮＳＣＬＣ細胞系に感染させた。ホモ接合でｐ５３遺伝子が欠失しているＨ３５８細胞系、コドン２４８でｐ５３遺伝子が点突然変異（ＧからＴ）しているＨ３２２細胞系、及び野生型ｐ５３遺伝子を持っているＨ４６０細胞系である。ウイルス感染２４時間前、６０ｍｍ培養皿にＨ３２２及びＨ４６０（１×１０⁵）又はＨ３５８（２×１０⁵）を接種した後、これらのヒトＮＳＣＬＣ細胞の成長速度を測定した。細胞は、１０ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。さらに、培地を用いて偽感染コントロール（mock infection control）をつくった。このように、異なった処理条件をおこなった３組の各細胞系を培養して、感染後１〜６日間細胞数を毎日計数した。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３に感染したＨ３５８は、非感染細胞やコントロールビリオン感染細胞とは対照的に、増殖が大幅に抑制された（図７Ａ）。Ｈ３２２細胞の増殖もｐ５３ビリオンによって大幅に抑制されたが（図７Ｂ）、野生型ｐ５３を含有するヒト肺癌Ｈ４６０細胞に対する影響は小さかった（図７Ｃ）。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ウイルスに感染したＨ３５８細胞の７９％は、増殖が抑制されたが、非感染細胞とコントロールウイルス感染細胞の増殖は、抑制されなかった。ｐ５３が点突然変異をしているＨ３２２細胞系の７２％は、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３によって増殖が抑制されたが、このウイルスの野生型ｐ５３を含有するＨ４６０細胞系の増殖に対する影響は小さかった（２８％が抑制された）。これらの結果は、ｐ５３組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞にｐ５３タンパク質の機能を回復させることにより、腫瘍を抑制できることを示している。実施例５ｐ５３欠損細胞のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３による治療本実施例では、組換えｐ５３アデノウイルスによりin vivoで腫瘍細胞に増殖抑制力を回復させて、細胞の悪性増殖又は転移増殖を治療することに関する。本発明の目的であるアデノウイルスを介する遺伝子療法によって、癌を治療する方法を説明する。１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３及びＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２にＨ３５８細胞を感染させた。偽感染（mock infection）として、等量の細胞を培地で処理した。感染２４時間後、処理した細胞を採取して、ＰＢＳで２回洗った。このように処理した細胞は、それぞれ、１匹当り０．１ｍｌ容量に細胞３百万（３×１０⁶）個加えたものをヌードマウス（Harlan Co.，Houston，TX）に皮下注射した。ウイルスは、それぞれを、マウス５匹づつに投与した。マウスには、注射前に照射（３００ｃＧｙ、⁶⁰Ｃｏ）を行い、注射後は毎週検査を行った。腫瘍形成の評価は、６週間の末日に行った。腫瘍の体積は、断面の直径の積の平方根を求め、この平方根を平均直径とする球体を腫瘍の体積と想定して計算した。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を介した、腫瘍形成に対する抑制効果を測定するため、ヌードマウスにＨ３５８細胞（ヒトＮＳＣＬＣ型細胞）を皮下注射して、新生物形成増殖を誘発した。１０ＰＦＵ／細胞でＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２に２４時間感染させた細胞を、マウスそれぞれに１回注射した。培地のみで処理したＨ３５８細胞は、偽感染コントロールとして使用した。偽感染細胞、及びコントトールウイルス感染細胞の場合には、表１に示すように感染１４日後で、腫瘍が触知できるようになった。表１に示す通り、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で処理した細胞を投与されたマウスには、腫瘍は形成されなかった。６週間の末日において、腫瘍は直径４〜１０ｍｍであった。この実験は１群マウス５匹で開始したが、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３群、及びＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２群の各々１匹のマウスは、恐らく院内感染のため実験終了前に死亡した。例６肺癌治療とＡｄ５ＣＭＶ−Ｐ５３本実施例では、組換えｐ５３アデノウイルスを用いてin vivoで腫瘍細胞に増殖抑制力を回復させて、動物の癌を治療することに関する。本発明の目的であるアデノウイルスを介した遺伝子療法によって、癌を治療する方法を説明する。同所性ヒト肺癌のマウスモデルにより、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３の腫瘍形成を抑制する効能をさらに評価した。Ｈ３５９細胞とＨ３２２細胞はこのモデルで腫瘍を形成しなかったので、Ｈ２２６Ｂｒ細胞系を使用した。この細胞系の由来は肺鱗状癌（squamous lung cancer）で、肺から脳へ転移したものである。また、このＨ２２６Ｂｒは、ｐ５３遺伝子のエクソン７、コドン２５４で点突然変異（ＡＴＣからＧＴＣ）していて、マウスにおいて腫瘍形成性である。同所性ヒト肺癌のマウスモデルの試験方法は、前報により報告されていた（Ge orges，et al.，1993）。簡単に言うと、ヌードマウスを放射線処理（３００ｃＧｙ、⁶⁰Ｃｏ）して、Ｈ２２６Ｂｒ細胞を気管支内滴注により接種した。滴注量はマウス１匹当り、０．１ｍｌ容量のＰＢＳに細胞２×１０⁶個を添加したものを投与した。接種３日後、１群当り１０匹のマウスにウイルス又はビヒクル（ＰＢＳ）０．１ｍｌを１日１回、２日間気管支内滴注した。この時のウイルス投与量は、マウス１匹当り５×１０⁷個のＡｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２であった。マウスは６週間の末日に殺した。肺組織及び中隔膜組織を切除して、腫瘍の大きさを測定することにより腫瘍形成を評価した。腫瘍塊の切片を組織学的に解析して、腫瘍であることを確認した。ヌードマウスを照射した後、Ｈ２２６Ｂｒ細胞をマウス１匹当り２×１０⁶個、気管支内滴注により接種した。接種３日後、マウスそれぞれに（１群当り８〜１０匹）Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれか０．１ｍｌを１日１回、２日間気管支内滴注した。ウイルス投与量は、マウス１匹当り５×１０⁷ＰＦＵであった。６週間の末日に、肺組織と中隔膜組織を切除して、腫瘍の大きさを測定することにより、腫瘍形成を評価した。この試験方法のフローチャートを図８に示し、切除した代表的なサンプルを図９に掲げる。検出した腫瘍は、組織学的な解析により確認した。腫瘍の寸法データを表２に示す。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３で治療したマウスのうち、腫瘍を形成したものは２５％に過ぎなかったが、ビヒクルコントロール又はＡｄ５／ＲＳＶ／ＧＬ２コントロールで治療したマウスのうち、７０〜８０％が腫瘍を形成した。Ａｄ５ＣＭＶ− ｐ５３群の腫瘍の大きさは、コントロール群より著しく小さかった。これらの結果は、同所性ヒト肺癌のマウスモデルにおいて、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３がＨ２２６Ｂｒによる腫瘍形成を防止できることを示している。例７Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３と臨床治療言うまでもなく、例５及び例６で説明したような動物モデルは、前臨床実験の一部として実施されるものである。臨床段階に入ると、患者毎にアデノウイルスを介した遺伝子伝達療法の適用を決定し、体内にアデノウイルスに特異的な抗体が存在するか、否かの試験を行う。抗体が存在しているか、あるいは過去に薬剤又は天然物質に対するアレルギーの病歴がある場合には、綿密な臨床観察下で１０³〜１０⁶程度の投与量で組換えアデノウイルスの試験的投与を行うのがよい。Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３による癌治療では、ＣＭＶプロモーターなどの好適なプロモーター／エンハンサー要素の制御により、組換えアデノウイルスがｐ５３を発現する。したがって、ＦＤＡ（Food and Drug Administration）が人体への投与を許容する方法により、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３を製造し、精製しなければならない。このような方法としては、先ず、塩化セシウム密度勾配遠心法を行い、これに続いて効果及び純度試験を行うことを含むが、これのみに限らない。ｐ５３アデノウイルス治療方法には、直接投与又は局所投与と、より全身型の投与との、二つの好適な基本的方法がある。これらの方法によって、ｐ５３の変異に起因することで知られている各種の異なる癌を好適に治療することができる。全身投与としては、アデノウイルスを簡単に静脈内注射して、注射部位から遠い組織部位をウイルスに感染させることができ（Stratford-Perricaudet et al. ，1991）、したがって、ｐ５３に起因するすべての悪性腫瘍の治療に好適である。ウイルスの静脈内注射用剤形としては、薬理的に許容できる溶液でもよいし、また、時間をかけて投与する注入剤でもよい。一般的に言って、機能を持つウイルス粒子を投与する場合、効果がある粒子数は１×１０¹⁰〜５×１０¹²であると信じられている。特に、肺癌の場合、もし所望なら、組換えアデノウイルスを物理的に直接に標的とすることができるが、このような場合、嚢胞性線維症の膜内外伝導調整遺伝子の気管支内投与と同様にして目的を達することができる（Rosenfeld et al.， 1992）。この場合、組換えｐ５３アデノウイルスは標的細胞の部位近くにデリバリーされる。より詳しく言えば、次の方針にしたがって好ましい治療プロトコルを作成する。患者は先ず、気管支鏡検査を受けて、狭窄の程度を見積る。内視鏡的に腫瘍を可能な限り大きく切除する。気管支鏡検査法受診の際は、局所又は全身麻酔を施術することが望ましい。Stifcor^TMトランス気管支鏡吸引針（Stifcor^TMtransbronc hial aspiration needle）（２１ｇ）を気管支鏡の生検チャンネルに通すことができる。こうした後、約１０ｍｌ以下程度の少量のｐ５３アデノウイルスを残存腫瘍部位に注射する。使用するアデノウイルスは、複製を行うことができないので、ウイルスそのものが患者の健康に有害な影響を与えることはない。しかしながら、患者は治療中少なくとも４８時間は入院して、急性副作用や、遅延性副作用をモニターする。過去において増殖欠損性アデノウイルスをヒトの遺伝子伝達媒体として使用する安全性について、懸念が表明されたこともあったが（Rosenfeld et al.，1992）、アデノウイルスの投与量を適当にモニターして、好ましからざる副作用の機会をさらに減ずる。反応の必要性が存在しているか、否か、あるいは、毒性が存在しているか、否かを判断する規準にはいろいろとある。毒性の存在の判断規準の一助として、治療開始前に、腫瘍床（tumor bed）の写真をとっておき、長径と垂線を測っておく。大きさは直径の積として記録する。腫瘍が再び成長を始めたら、これらのデータから再生速度を計算することができる。疾患が進行性に転ずる時期も、最初の観察値から腫瘍の体積の減少値を引く計算を繰り返して、進行性疾患の徴候を得ることによって判定する。進行性疾患とは、病巣を測定して、直径の積の値が≧２５％増加していることを言う。進行性疾患であると判定する前に、患者に少なくとも２コースの治療を実施する。患者の生存日数はプロトコル開始の日から計算する。追跡検査には、癌治療で日常的に行われている検査をすべて含める。これには、例えば臨床徴候のモニター、及び、各種ｐ５３遺伝子の発現パターンを検討する標準解析、分子生物解析のための政権材料の採取を含む。これらの解析では、さらに、伝達された遺伝子を取り込んだ細胞数、in vivoにおけるプロモーターの相対強度などについての情報を提供できるようにしてもよい。このようにして得たデータに基づいて、治療方法の調整を行うことが望ましい。治療方法の調整は、異なるプロモーターをもつアデノウイルス構成物、感染したほとんど腫瘍細胞、又はすべての腫瘍細胞が組換え遺伝子の非生理的な過剰発現を起こさないように、注射するＰＦＵを変えることなどを含む。 in vivoにおいて、アデノウイルスが伝達した外因性遺伝子の発現は、長期間持続することができると考えられる。ウイルスが伝達した外因性遺伝子の発現が長期間持続し、しかも、治療上の有効性を維持するためには、場合に応じて管理しなくてはならない。遺伝障害の改良に要求される発現レベルは、他の疾患を完治するのに要求されるレベルとかなり異なるために、マーカー遺伝子は、遺伝子の発現の治療持続性を見積もるのには、有効性において限りがある。最良の実施態様に関連して、本発明の組成物と方法を説明したが、説明した組成物、方法、及び方法からなる工程又は一連の工程を変更することはできるが、これらの変更も本発明の概念、精神及び範囲内であることは、当業者にとって明白である。より詳しく言えば、本発明で説明した薬剤を、化学的及び生理的関連がある特定の薬剤で置換して、同一又は類似の結果を得ることができることは明白である。当業者にとって明白である、このような類似する置換及び変更は、以下に述べる請求の範囲で定義されている本発明の精神、範囲及び概念内であるものと見なす。請求されている事項及び方法は、過度の実験を行うことなく、製造及び実施することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換えアデノウイルスにおいて、ｐ５３をコードする発現領域を含むベクター構成物を担持するウイルスであって、ベクターは、ヒト悪性細胞中でｐ５３を発現することができるウイルス。２．請求項１に記載の組換えアデノウイルスにおいて、ベクター構成物は、サイトメガロウイルスＩＥプロモーターの制御下に置かれているｐ５３発現領域を含むウイルス。３．請求項２に記載の組換えアデノウイルスにおいて、ベクター構成物は、ｐ５３発現領域と、サイトメガロウイルスＩＥプロモーターと、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルとを含むウイルス。４．請求項１に記載の組換えアデノウイルスにおいて、アデノウイルス複製に必須の遺伝子がベクター構成物から欠失していて、その位置にｐ５３発現領域が導入されているウイルス。５．請求項１に記載の組換えアデノウイルスにおいて、アデノウイルスベクターのＥ１Ａ領域及びＥ１Ｂ領域が欠失していて、その位置にｐ５３発現領域が導入されているウイルス。６．請求項１に記載の組換えアデノウイルスにおいて、図１のゲノム構成を持つウイルス。７．請求項１に記載の組換えアデノウイルスにおいて、薬理的に許容し得る処方中に分散しているウイルス。８．請求項１に記載の組換えアデノウイルスに感染している組換え宿主細胞。９．野生型ｐ５３を欠失している細胞に野生型ｐ５３タンパク質の機能を回復させる方法において、細胞中で野生型ｐ５３を発現するための有効量の請求項１に記載の組換えアデノウイルスを、細胞に接触させることを含む方法。１０．請求項９に記載の方法において、細胞がｐ５３遺伝子に突然変異をもつ癌細胞である方法。１１．請求項１０に記載の方法において、細胞がヒト肺癌細胞である方法。１２．請求項１０に記載の方法において、細胞がヒト乳癌細胞である方法。１３．請求項９に記載の方法において、細胞が哺乳動物の体内に位置し、アデノウイルスが薬理学的に許容できる剤形で哺乳動物に投与される方法。１４．組換えアデノウイルスを産生する方法において、アデノウイルスプラスミド及び発現ベクターを、リポソームを介するトランスフェクションにより好適な宿主細胞に導入すること、及び、相同組換えとウイルスの産生が行われたことを示す細胞変性効果があるかどうか培養した宿主細胞を解析することを含む方法。１５．請求項１４に記載の方法において、リポソームを介するトランスフェクション工程がＤＯＴＡＰを介するトランスフェクションである方法。１６．請求項１４に記載の方法において、アデノウイルスプラスミドは、複製欠損性アデノウイルスプラスミドであって、宿主細胞がこの欠損を相補する方法。１７．請求項１６に記載の方法において、アデノウイルスプラスミドは機能的なＥ１Ａ及びＥ１Ｂを欠失していて、宿主細胞がＥ１を発現している細胞である方法。１８．請求項１７記載の方法において、宿主細胞が２９３細胞である方法。１９．請求項１４記載の方法において、宿主細胞が最小必須培地で培養されている方法。２０．請求項１４記載の方法において、細胞変異効果を示す細胞の上澄み液からＤＮＡを採取すること、及び、発現ベクターに特異的なＤＮＡプライマーとアデノウイルスゲノムに特異的なＤＮＡプライマーを用いて、組換えアデノウイルスが存在していることを確認するために、ＰＣＲによってＤＮＡを解析することをさらに含む方法。２１．請求項１４記載の方法において、ヒト転移細胞中でｐ５３を発現させることができるプロモーターの制御下に置かれているｐ５３をコードしているＤＮＡセグメントを発現ベクターが含む方法。