CN1136826A - 重组p53腺病毒方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了利用脂质体介导的共转染及直接观察被转染细胞中的细胞病变效应(CPE)以制备重组腺病毒的简化而有效的方法。还公开了涉及新的p53腺病毒构建体的组合物及制备方法，包括恢复有异常p53之细胞和动物体内的p53功能及肿瘤抑制作用的方法。

Description

重组p53腺病毒方法和组合物
                    发明的背景
本发明总地涉及重组技术领域。在某些方面，涉及简化而有效的产生重组腺病毒的方法。在其他方面，提供包括p53腺病毒构建体的新组合物及其制备方法，包括恢复p53功能及抑制有异常p53之细胞生长的方法。
                     相关技术的描述
目前治疗肿瘤的方法，包括放射治疗、外科治疗和化学药物治疗均只有有限的效果。在美国每年仅死于肺癌的就有14万人以上。近年，按年令组调查的妇女肺癌死亡率己超过了乳腺癌死亡率。虽然实施戒烟计划后已减少了吸烟的风行，但预计进入21世纪肺癌死亡率仍将居高不下。合理的开发肺癌的新疗法探取决于在分子水平上对肺癌生物学的了解。
现已证实，各种不同的肿瘤至少部分是由于导致一种或多种基因的过表达、或异常或突变基因表达的遗传异常引起的。例如，在许多情况下，已知“癌基因”的表达将导致肿瘤发生。“癌基因”是从遗传上改变了的基因，其突变的表达产物以某种方式破坏正常细胞的功能或调控(Spandidos et al.，1989)。
已发现迄今研究的大多数癌基因都是突变而成为被“活化的”，所说的突变常常是发生在正常细胞基因即“原癌基因”之编码区中的点突变，从而导致被表达之蛋白质产物中的氨基酸取代。这种改变了的表达产物表现有参于恶性生长过强的异常生物学功能(Travali et al.，1990)。可用各种手段，例如化学诱变或电离幅射引起根本性突变。现已鉴定了包括ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、iun和abl在内的许多癌基因和癌基因家族，并在不同程度上确定了它们的性质(Travali et al.，1990；Bishop，1987)。
在正常细胞生长期间，认为生长促进性原癌基因受到生长约束性肿瘤抑制基因的抗衡。有几种因素可使这两种力量失衡，导致肿瘤生成状态。其中一种因素是肿瘤抑制基因的突变(Weinbery，1991)。
一种重要的肿瘤抑制基因是编码细胞蛋白质p53的基因，所说的p53是分子量53KD的控制细胞增殖的核内磷蛋白。引起定位于染色体17p上应该基因及某位基因丢失的突变是在人类恶性肿瘤中鉴定的最常见的改变。p53蛋白质在进化过程中是高度保守的，并且可在大多数正常组织中表达。已证明野生型53参于控制细胞周期(Mercer，1992)。转录调节(Fields et al.，1990，和Mietz et al.，1992)、DNA复制(Wilcoch and Lane，1991和Bargonetti et al.，1991)及诱导编程性细胞死亡(Yonish-Rouach et al.，1991和Shaw et al.，1992)。
各种突变p53等位基因是已知的，其中单个碱基取代导致具有相当不同之生长调节性质的蛋白质的合成，最终导致肿瘤发生(Hollstein et al.，1991)。事实上，已发现p53基因是常见的人肿瘤中最常发生突变的基因(Hollstein et al.，1991；Weinberg，1991)，并且与那些同吸烟有关的肿瘤有着特殊的联系(Hollstein et al.，1991；Zalcut-Houri et al.，1985)。也已报导p53在乳腺癌中的过表达(Casey et al.，1991)。
对肿瘤进行基因治疗的一个最具挑战性的方面涉及利用肿瘤抑制基因，如p53。已报导了将野生型p53转染到某些类型的乳腺和肺肿瘤细胞中可恢复细胞系中的生长抑制性控制(Casey etal.，1991；Takahasi et al.，1992)。虽然DNA转染并不是将DNA导入病人细胞中的可行手段，但这些结果可以证明，如果能建立一种输送p53基因的改良方法，则向带有突变之p53基因的肿瘤细胞提供野生型p53可能是一种有效的治疗方法。
近年已研究并开发了可应用于肿瘤抑制之基因治疗的基因释放系统。鉴于病毒在感染真实活细胞(即一种病毒遗传材料本身被转移的过程)中的效力，所以对基于病毒的基因转移载体特别感兴趣。在这方面，例如在产生用于输送各种基因的工程化逆转录病毒载体中已取得了某些进展。然而，与使用逆转录病毒载体进行基因治疗相联系的主要问题是因为它们的感染性要取决于靶细胞上逆转录病基受体的可利用性、它们难于浓缩和纯化、以及它们只能有效地整合到复制细胞中。
最近已提出将腺病毒载体系统用于某些基因转移方法，但目前用于制备重组腺病毒的方法却有几方面的缺陷。这些方法依赖于磷酸钙介导的向宿主细胞内转染表达载体和腺病毒质粒，以及其后对被转染的细胞进行噬斑检测。这些类型的转染步骤和检测法效率低，而且一般只造成低水平的病毒增殖。
因此，仍需要开发将肿瘤抑制基因如p53导入作为恢复生长抑制之工具的细胞内的新方法。不必进行磷酸钙介导的转染及琼脂糖铺板以检测噬斑的生产重组腺病毒的方法也将是有利的。
                   发明的概要
本发明通过提供生产重组腺病毒如p53腺病毒的有效方法，以及恢复p53对带有异常p53之细胞的功能的有效手段来解决前述的和其他一些问题。公开了含重组腺病毒载体和病毒颗粒的组合物，以及使用这样的组合物促成有异常p53功能之细胞如肿瘤细胞中野生型p53表达的方法。还公开了使用脂质体介导的DNA转染然后观察细胞病变效应(CPE)及转好进行聚合酶链反应(PCR)分析以增殖重组腺病毒的简化方法。
此外，利用该新的产生并增殖重组腺病毒的方法，预计也可将其他基因掺入列病毒颗粒基因组中。这些基因可包括肿瘤抑制基因如成视网膜细胞瘤(rb)基因、反义癌基因即抗C-myc和抗K-ras，以及用于肿瘤基因治疗的其他生长控制相关基因。
本发明人已证明了本发明方法在控制转移瘤生长中的显著作用。已显示Ad5CMV-p53重组腺病毒可显著地降低被转化细胞的生长速率。该病毒抑制了病毒感染之H358细胞的致瘤性。当在气管内接种H226Br细胞后病毒在气管内侵染时，其可阻止同位肺癌生长。抑制致癌性还提示，即使暂时表达高水平p53蛋白质，也可足以诱导杀肿瘤效应。
在一个特定实施方案中，本发明涉及将野生型p53基因导入靶细胞(例如包括恶性细胞类型在内的推测有突变或异常p53基因的靶细胞)内的载体构建体。这些实施方案包括制备其中p53基因被置于否动子控制下的基因表达或转录单元，且所说的单元被插入重组腺病毒内的腺病毒载体中。基于下述几个理由，本发明作为一个整体是令人惊奇并有其优点的。首先，以前认为由于p53病毒是有毒性的，所以不能进入包装细胞例如用于制备腺病毒的细胞内增殖；第二，腺病毒的E1B与p53结合并因此而干扰其功能；第三，一旦增殖后即发现p53腺病毒可在抑制各种肿瘤细胞生长中发挥意想不到的效果；最后，肺癌细胞的致癌性是通过用Ad5CMV-p53处理而不是通过控制病毒而受到抑制的，表明新的p53蛋白质输送和制备具有意想不到的治疗效力。
因此本发明涉及腺病毒载体构建体，其包括使用腺病毒来携带肿瘤抑制基因如p53、反义致癌基因和其他用于人类肿瘤治疗的相关基因。在一个实施方案中，包括了重组腺病毒病毒颗粒或掺入这种载体的颗粒，及其药学配制品，所说的载体包含其中有编码野生型p53之表达区的重组插入段，借助该表达区载体能够在人转移瘤细胞中表达p53。载体中的p53表达区可包括基因组序列，但为了简便起见，一般较好利用p53 cDNA序列，因为这些序列容易获得并且更易于操作。载体的重组插入序列一般还包括启动子区和聚腺苷酸化信号如SV40或鱼精蛋白基因聚腺苷酸化信号。
在优选实施方案中，悬欲使p53表达区处于强结构启动子如CMV启动子、病毒LTR、RSV或SV40启动子、或与以高水平在哺乳动物细胞中表达之基因相关联的启动子如延伸因子-1或肌动蛋白启动子的控制之下。目前，最优选的启动子是巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
可以按照本发明的简化方法，将p53编码序列插入缺乏E1B的病毒基因组中，从而将p53基因或cDNA导入重组腺病毒。但优选的腺病毒是复制缺陷病毒，其中复制和/或包装所必需的病毒基因已从腺病毒载体构建体中被删除，从而得以在其位置上导入p53表达区域。除E1B外的任何基因，不管其为复制所必要(如E1A，E2和E4)或不必要的(如E3)均可被删除并用p53取代之。
特别优选的是如图1的基因组结构举例显示的，其中腺病毒的F1A和E1B区域已被删除并在它们的位置中导入了p53表达区的载体和病毒颗粒。
制备复制缺陷型腺病毒的技术是本领域已知的，例如包括Ghosh-Choudhury和Graham(1987)、McGrory等人(1988)、及Ghezman等人(1982)所描述的方法(这些文献均掺入本文作为参考文献)。各种已知的细胞系只要它们补偿任何可能存在的复制缺陷，均可用于制备重组腺病毒。优选的细胞系是人293细胞系，但也可以使用容许复制，即在优选情况下可表达E1A和E1B的任何其他细胞系。此外，为了得到病毒原种贮存液，也可以在塑料平皿上或悬浮液培养物中增殖细胞。
本发明不只限于缺少E1的病毒和单单表达E1的细胞。实际上，只要p53载体没有E1B，本发明可以利用其他病毒和宿主细胞的互补组合。可以使用缺少功能性E2的病毒和表达E2的细胞，也可以使用缺少功能性E4和表达E4的细胞等。如果删除并取代不是复制所必需的基因，例如，E3基因，则不必由宿主细胞特异性地补偿这一缺陷。
除了要求腺病毒载体和病毒颗粒没有E1B外，根据它们的性质对于成功地实践本发明并不是关键的。腺病毒可以是42个不同的已知血清型或亚类A-F中的任何一个。为了得到用于本发明方法的条件复制缺陷型腺病毒载体，优选亚类C的5型腺病毒作为起始材料。这是因为5型腺病毒是人类腺病毒，关于该病毒亚型的许多生物化学和遗传学信息都是已知的，并且历史上在利用腺病毒作载体的大多数构建工作都是使用该亚型。
本发明的进一步相关方面涉及新的p53 DNA片段、或表达载体，以及掺入了按照本发明制备的腺病毒p53载体的重组宿主细胞。本发明的DNA片段在转录的5’-3’方向上一般包括巨细胞病毒IE启动子、野生型人p53的结构基因、及SV40早期聚腺苷酸化信号。含有重组腺病毒的宿主细胞一般是真核或哺乳动物宿主细胞，如293细胞，或者可以是已用本发明的腺病毒感染的p53基因有缺陷的细胞。
其他实施方案涉及含有分散于药学下可接受的溶液或缓冲液中的，编码野生型p53之重组腺病毒的药物组合物。优选的药学上可接受的溶液包括用磷酸盐、乳酸盐。Tris等缓冲的中性盐溶液。当然，可以纯化腺病毒以使之基本上没有不需要的污染物，如缺损干扰腺病毒颗粒或内毒素及其他热原，以使之不在接受该载体构建体的动物的或病人体内引起任何不适宜的反应。纯化载体的优选手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化铯梯度离心法。
在其他实施方案中，本发明涉及为野生型p53有缺陷的细胞提供p53功能，或恢复野生型p53蛋白质功能的方法。为此目的，可使携带p53突变的细胞与一定量的可在细胞内有效地表达野生型p53的本发明的重组腺病毒接触。可通过给体内隐藏有p53缺陷性细胞例如肿瘤细胞的动物或人投用生理上有效量的含腺病毒的药物组合物来达到这一目的。因此，本发明还包括治疗人肿瘤如乳腺和肺癌的有效方法。
在本发明的另一实施方案中，使用表达p53的腺病毒预防肿瘤和转移瘤生长。在一个实施方案中使用表达p53的重组腺病毒抑制具有p53基因突变之细胞的不受控制的生长。在一更优选的实施方案中，表达p53的腺病毒抑制H358细胞的致瘤性和生长，但可使用作为p53功能之指示物的其他细胞。
在另一实施方案中，使用气管内滴入的表达p53的病毒抑制同位肺肿瘤生长。Ad5CMV-p53病毒在裸鼠试验中产生了令人鼓舞的结果。病毒抑制了病毒感染之H358细胞-正常产生明显肿瘤团块之细胞的致瘤性。当在气管内接种H226Br细胞证实Ad5CMV-p53对肺癌细胞的体外作用后，气管内滴入病毒时，病毒也抑制同位肺癌细胞生长。通过用Ad5 CMV-p53而不是对照病毒Ad5/RSV/GL2处理抑制肺癌细胞的致癌性，表明p53蛋白质具有治疗效力。本领域技术人员将会理解到，输送病毒的其他方法也包括在本发明范围内。
虽然通过使用p53构建体恢复正常细胞功能和用于肿瘤治疗举例说明了本发明的各个方面，但认为本发明一般可适用于期望通过使用重组腺病毒实现在靶或宿主细胞中高水平表达肿瘤抑制蛋白质的任何情况。例如，在肿瘤治疗程式方面，除了p53取代外本发明人意欲涉及的特定例子是导入成视网膜细胞瘤基因(rb)、反义癌基因(C-myc或C-ras)、及其他用于人肿瘤治疗的相关基因。
应指出的是，因为所利用的腺病毒载体是复制有缺陷的，所以不能在最终被感染的细胞如肿瘤细胞中复制。因此，在某些病人需要连续治疗的情况下，如在治疗开始时，可能有必要在一定时间如6个月或一年后再次导入病毒。
本发明的腺病毒载体还具有除与基因治疗直接相关联的实施方案以外的其他实用性。例如其他应用可包括对各种p53基因进行体外分析和诱变研究，以及重组生产用于例如制备抗体及其他实施方案的蛋白案质。在与人基因治疗相关的，包括所有涉及进一步限定p53之分子活性相关的实施方案以外的实施方案中，也可以利用其他相关病毒向细胞输送p53。那些属于疱疹病毒家族的病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、E-β病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)将是适用的。
本发明的一个不同的方面涉及生产任何一种类的重组腺病毒的简化方法，该方法没有使用效率差的磷酸钙转染法和繁索噬斑检测法。为了按照本发明的方法生产重组腺病毒，一般可用脂质体介导的转染法将腺病毒质粒和表达载体导入适当的宿主细胞中，然后分析培养的宿主细胞，了解其是否存在借以指示同源重组和病毒产生的细胞病变效应(CPE)。正是由于第一步骤转染效率的提高才使相继的和有利的CPE步骤成为可能。
用于脂质体介导之转染的优选组分是可从市场上购得的DOTAP(N-〔2，3-二癸氧基〕-丙基)-N，N，N-三甲基-硫酸二甲铵)。CPE是一种可以使用相差显微镜直接观察的现象。CPE描述腺病毒细胞毒性的形态学特征，其开始是减少溶胞感染的细胞，最后是形成溶胞噬斑。这种方法的一个独特优点是在保温10至14天后很容易检测到病毒增殖。这是对至少需要14天，通常长达21天，甚至经常长达几周才能得出结果的磷酸铝介导的转染法和继后之噬斑检测法的一个明显改进。
在某些实施方案中，可使用本发明的方法，并联合使用有复制缺陷的腺病毒质粒连同补偿这种缺陷的宿主细胞，例如合用缺少E1的质粒和293细胞。在本发明的工作实施例中使用了缺少功能性E1A和E1B并掺入p53表达区域的腺病毒质粒，但任何表达区域均可以这种方式掺入重组腺病毒中。可以根据需要改变实际使用方法学；但其包括在某些情况下优选使用MEM培养基。
这些新方法可以与PCR分析合用以进一步证实正确重组之病毒的存在。PCR是本领域已知的技术，例如参见美国专利No.4,683,195(该文献列入本文作为参照)。为了与本发明结合使用PCR，可从表现有细胞病变效应的细胞上清中得到DNA，并使用两对引物-一对表达载体特异性DNA引物和一对腺病毒基因组特异性DNA引物，以PCR方法分析DNA。按照定义，载体或插入序列特异性DNA是这样的基因片段，它是编码多肽或最终预期将被表达的RNA之DNA的一部分，如用作为mRNA的p53DNA表达和蛋白质产生所说明的。腺病毒基因组特异性DNA可以是在被监测的增殖阶段被表达之基因组的一部分。
                     附图的简要描述
下述附图构成本说明书的一部分并用于进一步证明本发明的某些方面。参考一个或多个附图并结合对本文所给出的特定实施方案的详细描述将会更好地理解本发明。
图1显示得到重组p53腺病毒的流程。将p53表达盒插入pXCJL。1品xbaI和ClaI位点之间。将p53表达载体(pEC53)和重组质粒pJM1F共转染到293细胞中。将被转染的细胞维持于培养基中直到发生细胞病变效应。使用经蛋白酶K处理和苯酚提取CPE上清液而从中制得的DNA模板，对DNA进行PCR分析以鉴定新产生的p53重组腺病毒(Ad5CMV-p53)。
图2A显示用于对Ad5CMV-p53基因组DNA进行结构分析的酶切图。Ad5CMV-p53基因组DNA的酶切图给出p53表达盒、PCR行物和限制性位点的定位。基因组大小约为35.4kb，被分成100个酶切图单元(1m.u.＝0.35kb)。p53表达盒置换Ad5基因组的E1区(1.3-9.2m.u.)。引物1位于人CMV大IE基因启动子的第一内含子下游。引物2位于SV40早期聚腺苷酸化信号中。而引物在离开p53 cDNA插入段而末端的15-20的处，用于限定1.40kb PCR产物。引物3和4分别定位于Ad5基因组的1/m.u.和13.4m.u.处，其限定0.86kb病毒基因组特异性PCR产物。
图2B显示PCR产物的琼脂糖凝胶分析结果。每个反应中使用限定1.4kb(p53)和0.86kb(Ad5)DNA片段的两对引物。用于各反应的DNA模板是pEC53质粒(泳道1)、Ad5/RSV/GL2DNA(泳道2)、无DNA(泳道3)，和Ad5CMV-p53 DNA(泳道4)。标记(M)的泳道相当于分子量标志。
图2C显示Ad5CMV-p53 DNA的限制性酶切图。分别不用酶消化(U)和用限制性酶Hind IV(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)及ClaI(C)消化CsCl梯度纯化的Ad5-CMV-p53 DNA样品，并在1％琼脂糖凝胶上分析。标记(M)的泳道是分子量标志。
图3A、3B、3C和3D显示重组腺病素对293细胞之细胞病变效应的观察。图3A、3B、3C和3D显示293细胞的一系列相差显微镜影象(X400)。图3A为转染前的镜检观察；图3B为转染后第12天的阴性对照；图3C显示转染后第12天发生CFE；图3D显示转染后14天时完成CPE。
图4A、4B、4C和4D显示用重组腺病毒感染之细胞的免疫组织学特征。图4A、4B、4C和4D显示H358细胞的一系列免疫组织学影象。观察Ad5CMV-p53在H358细胞中的感染性。用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以50pFU/细胞的剂量感染H358细胞24小时。用单独的培养基作为模拟感染。用免疫染色法分析被感染的细胞。图4A显示用抗p53抗体探查的模拟感染。图4B显示用Ad5/RSV/GL2对照病毒感染的并用抗p53抗体探查的细胞。图4C显示用无关抗体(MOPC-21)探查的Ad5CMV-p53感染的细胞。图4D显示用抗p53抗体探查的Ad5 CMV-p53感染的细胞。使用的抗p53抗体是Pab 1801，并使用抗生物素蛋白-生物素方法进行染色。
图5A显示用于比较H358细胞中外源p53相对表达水平的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。感染后24和72小时制备以30PFU/细胞的剂量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染的H358细胞样品。对SDS-PAGE分析进行考马斯蓝染色，以显示所负载的蛋白质样品的相对量。泳道1和4含有Ad5/RSV/GL2感染的细胞样品。泳道2和3含有感染后24小时收集的用两份个别Ad5 CMV-p53储备物感染的细胞样品。泳道5和6是感染后72小时收集的Ad5 CMV-p53感染的细胞样品。泳道7是感染后72小时的模拟感染的H358样品。泳道M显示以KDa表示的预染色的分子量标志物(GIBCO-BRL)。
图5B显示对如图5A所示SDS-PAGE分析的同一泳道固化凝胶的Western印迹分析结果。使用抗p53抗体以Western印迹法分析p53的相对表达水平。使用的第一抗体是抗p53蛋白质(Pab 1801，Oncogene Seience Inc.)和β-肌动蛋白(AmershamInc.)的单克隆抗体。MRP结合的第二抗体和ECL显影剂购自Amershem Inc.。用Western印迹法检查病毒感染的H358细胞。图5B的Western印迹与图5A显示者有相等的布局和次序。
图6是用Western印迹法检测的p53表达的时间过程。以10PFU/细胞的浓度用Ad5 CMV-p53感染多个平皿的H358细胞。感染后在所指出的时间点制备细胞溶胞产物。同时用抗p53和抗肌动蛋白抗体进行Western印迹探查。标记“C”的泳道代表阴性对照。直方图代表用光密度计测得的p53的相对密度。
图7A显示病毒感染的细胞系H358的人肺癌细胞的生长曲线。以每平皿(60mm)105个细胞，每个细胞系6平皿接种细胞。24小时后，以10m.o.i(感染复数，即PFU/细胞)的病毒剂量用Ad5在CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后每天计数细胞共计数6天。生长曲线代表得自4次独立实验研究的数据。
图7B显示病毒感染的细胞系H322之人肺癌细胞的生长曲线。以每平皿(60mm)105个细胞和每个细胞系6平皿接种细胞。24小时后，以10m.o.j(感染复数，即PFU/细胞)用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后计数细胞6天。生长曲线代表得自4次独立实验研究的数据。
图7C显示病毒感染的细胞系H460的人肺癌细胞的生长曲线。以每平皿(60mm)105个细胞和每个细胞系6平皿接种细胞。24小时后，以10m.o.i(感染复数，即PFU/细胞数)的病毒剂量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后计数细胞6天。生长曲线代表是自4次独立实验研究的数据。
图8显示在同位肿瘤模型中试验Ad5 CMV-p53的流程。流程中总结了处理接种H226 Br细胞和病毒之裸鼠的剂量和程序。
图9A、9B、9C和9D显示得自经处理的小鼠和对照小鼠的肺和横隔片段的样品。图9A、9B、9C和9D是同一个图的4个部分。6周预处理结束时杀死小鼠。切除肺和横膈组织用于估计肿瘤生成情况。图9A是正常裸鼠横隔块的样品；图9B是载体(PB5)处理之小鼠的横隔块样品；图9C是Ad5 CMV-p53处理之小鼠的横隔块样品；图9D是Ad5/RSV/GL2处理之小鼠的横隔块样品。箭以指示肿瘤块。
                优选实施方案的详细描述
A.肺癌发展的分子行为
本发明人所进行的研究已鉴定了导致肿瘤发生和进展的标准分子行为。这样使得发明人能够建立恢复某些正常蛋白质功能从而得以在体内抑制恶变表型的新方法。
最常见的肺癌组织学改变(80％)分为非小细胞肺癌(NSCLC)这一类，并包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌。目前关于肺癌分子生物学的资料来自对不太常见的小细胞肺癌(SCLC)的研究。可以根据细胞的神经内分泌特征区分SCLC和NSCLC；SCLC对化学治疗及应性很好；但治疗后会很快复发。NSSLC也可作为致癌因子诱导的上皮癌的模型。本研究中建立的研究方法和手段也可应用于其他类型的上皮癌。
已积累的大量证据表明恶性转变过程是由遗传范式介导的。在肿瘤细胞中检测到的主要损伤发生在显性癌基因和肿瘤抑制基因中。显性癌基因在一类参予临界正常细胞功能(包括信号转导和转录)的称为原癌基因的基因中有所改变。赋予转变能力的显性癌基因中的基本修饰包括点突变、转位、重排和扩增。肿瘤抑制基因似乎通过突变、缺失或其联合作用而发生功能的纯合丢失，以发生转变。某些肿瘤抑制基因可能通过调节转录而在控制增殖中发挥作用。修饰显性癌基因和肿瘤抑制基因的表达很可能影响那些体现恶性表型之细胞的某些特征。
尽管对参于癌基因介导之转变的机制不断有新的了解，但在发展针对特异性靶癌基因和其产物的治疗方案方面却进展不大。在这个领域中的研究工作最初是集中在显性癌基因上，因为这些癌基因是要首先定性的。DNA介导的基因转移研究表明在从恶性人肿瘤转移DNA后正常细胞才获得恶性表型。B.p53和肿瘤中的p53突变
目前p53被认定为肿瘤抑制基因(Montenarh，1992)。已发现在许多用化学致癌、紫外照射，以及包括SV40在内的几种病毒转化的细胞中有高水平的p53。在许多种人肿瘤中p53基因是突变尖活的常见的靶，并且有报导认为其为常见人肿瘤中最常见的突变基因(Mercer，1992)。该基因在50％以上的人NSCLC(Hollestein et al.，1991)和许多其他肿瘤中发生了突变。
p53基因编码可以与宿主蛋白质如大丁抗原及E1B形成复合物的375氨基酸磷蛋白。该蛋白质可见于正常组织和细胞中，但其浓度比在被转化细胞或肿瘤组织中小得多。令人感兴趣的是，野生型p53在调节细胞生长和分裂中似乎是很重要的。已显示在某些情况下在人肿瘤细胞系中过表达野生型p53是抗增殖的。因此p53可作为细胞生长的负调节剂(Weinberg，1991)并可直接抑制不受控制的细胞生长或间接激活抑制这种生长的基因。因此没有或失活野生型p53可造成转化。但有些研究工作表明突变体p53的存在对于充分表达有转化可能的基因是不可缺少的。
虽然野生型p53被认定为许多细胞类型中的起关键作用的重要生长调节因子，但其遗传学和生物化学特征似乎也有着一定作用。错义突变是p53基因中常见的并且对于癌基因的转化能力是必不可少的。由点突变促成的单一基因改变可产生致癌p53。但与其他癌基因不同，已知p53点突变发生于至少30个不同的密码子处，然而常常产述一些细胞表型中移动而又没有降低杂合性的显性等位基因。另外，其中许多显性失活等位基因似乎是生物体中容许的并可在种系中传递下去。各种突变等位基因似乎是从极小机能障碍到强烈外显的，显性失活等位基因排布的(Weinberg，1991)。
Casey和其同事已报导将编码野生型p53的DNA转染到两个人乳腺癌细胞系中可恢复这类细胞中的生长抑制控制(Casey，etal.，1991)。将野生型而不是突变的p53转染到人肺癌细胞系中也已证明了相似的作用(Takahasi et al.，1992)。P53相对于突变基因似乎是显性的并且将用突变基因针对将其转染到细胞中时的增殖进行选择。正常表达转染的p53并不影响含内源p53之细胞的生长。因此，可由正常细胞容纳这样的构建体而没有不良作用。
因此用野生型p53处理p53相关肿瘤可能减少恶性细胞的数目。然而，因为不能利用DNA转染方法将DNA导入病人体内的肿瘤细胞中，所以上述这些研究还没有达到这一目的。
C.基因治疗技术
迄今已提出了几种基因治疗的实验方法，但每种方法都有其特定的缺点(Mulligan，1993)。如上文所述，已有几种基本转染方法，其中例如通过物理或化学方法加大细胞膜通透性以将含有感兴趣基因的DNA非生物学地导入细胞中。当然，这种方法只限于能暂时从体内除去的并能耐受这种处理的细胞毒性的细胞，即淋巴细胞。可以使用与某些脂质和两亲性肽形成的脂质体或蛋白质结合物进行转染，但基因整合的效率仍很低，一般每1,000到100,000个细胞才有一个发生整合，并且已转染基因的表达常常限于几天(增殖细胞)或几周(非增殖细胞)。因此DNA转染显然不是一种肿瘤治疗的适宜方法。
第二种方法是利用病毒携带其自身的遗传材料连同它们一起进入细胞的天然能力。因为逆转录病毒能够标其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传材料、感染广谱品系和细胞类型并可被包装到特定细胞系内，所以其有希望作为基因运输载体。但也有三方面的主要问题妨碍在实际中使用逆转录病毒载体。第一，逆转录病毒的感染性取决于靶细胞表面上病毒受体的可利用性。第二，逆转录病毒只有效地整合到复制中的细胞内。最后，逆转录病毒难于浓缩和纯化。
D.用于基因治疗的腺病毒构建体
人腺病毒是其基因组大小约36kb的双股DNA肿瘤病毒(Tooza，1981)。作为真核基因表达的模型系统，已对腺病毒进行了广泛的研究并充分鉴定了其性质，使之成为开发腺病毒作为基因转移系统的有吸引力的系统。该组病毒很容易生长和操作，并且在体外和体内表现有很宽的宿主范围。在溶胞感染的细胞中，腺病毒能够切断宿主蛋白质合成途径，引导细胞机构合成大量的病毒蛋白质，并产生大量病毒。
基因组的E1区域包括E1A和E1B及少数细胞基因，其中E1A和E1B编码负责病毒基因组转录调节的蛋白质。包括E2A和E2B在内的E2的表达得以合成病毒复制功能蛋白质，如DNA结合蛋白、DNA聚合酶及引发复制的末端蛋白质。E3基因产物防止由细胞毒性T细胞和肿瘤坏死因子引起的细胞溶解作用并且似乎对病毒增殖有着重要作用。与E4蛋白质相关的功能包括DNA复制、晚期基因表达及宿主细胞关闭。晚期基因产物包括大部分病毒颗粒衣壳蛋白质，并且这些蛋白质只在从主要晚期启动子开始的单一初级转录本发生大部分加工后被表达。在感染的晚期，主要晚期启动子(MLP)表现出高的效率(Stratford-Perricaudet andPerricaudet，1991a)。
由于只有一小部分病毒基因组似乎需要为顺式(Tooza，1981)，腺病毒衍生的载体当与细胞系如293细胞联用时对于大DNA片段的取代具有极大的潜力。为了提供反式的病毒必需蛋白质已建立了Ad-5转化的人胚胎肾细胞系(Graham，et al.，1977)。因此本发明者推论腺病毒的特点使之成为用于导向体内癌细胞的良好候选者。
使用腺病毒系统向细胞递送外来蛋白质的特殊优点包括(i)能够由外来DNA取代相对大的病毒DNA片段；(ii)重组腺病毒的结构稳定性；(iii)给人投用腺病毒的安全性；(iv)腺病毒感染与肿瘤或癌没有任何已知的联系；(v)能够得到高滴度重组病毒；以及(vi)腺病毒有高感染力。
腺病毒载体不同于逆转录病毒的其他优点包括较高的基因表达水平。另外，与逆转录序列不同，腺病毒复制不依赖于宿主基因复制。因为E1区中的腺病毒转化基因可以很容易地被删除并且仍提供有效的表达载体，所以一般认为由腺病毒载体造成的致癌危险是可以忽略的(Grunhaus & Horwitz，1992)。
一般说来，腺病毒基因转移系统是基于重组的工程化腺病毒，通过删除其基因组的一部分如E1而使其成为复制非感受的，并且仍保留其对感染的感受性。当对腺病毒基因组进行附加删除时，可以表达相对大的外来蛋白质。例如，E1和E3区缺失的腺病毒能够携带长达10kb的外来DNA并可在293细胞中生长至高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaccelet，1991a)。已有人报导在腺病毒感染后可令人惊奇地持续表达转移基因。
作为介导基因向真核细胞内或整个动物体内转移的手段，近年已广泛研究了腺病毒介导的基因转移。例如，在治疗患有罕见的隐性遗传疾病鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺陷症的小鼠中，发现可利用腺病毒构建体提供正常OTC酶。但不幸的是，在17例中只有4例达到OTC的正常表达水平(Stratford-Perricaudetet al.，1991b)。因此，大多数小鼠的缺陷只得到部分纠正，并且没有导致生理或表型改变。因此这些结果对于在肿瘤治疗中使用腺病毒载体没有多少促进。
使用腺病毒将囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的基因转移到cotton大鼠肺上皮细胞中的尝试也获得了部分成功，但尚没有可能估计被转移的基因在动物上皮细胞中的生物学活性(Rosenfeld et al.，1992)。另外，这些研究证明了CFTR蛋白质在肺导气管细胞中的基因转移和表达，但没有显示出生理学效应。在1991年的Science中，Rosenfeld等人发表了关于α1抗胰蛋白酶蛋白质的肺表达但仍未显示有生理学效应的文章。事实上，他们估计其所观察到的表达水平只是为在人肺中产生保护作用所需水平的约2％，即远低于发挥生理学效应所必需的水平。
已通过门脉内注射将人α1抗胰蛋白酶的基因导入正常大鼠的肝内，在其中表达并导致被导入之人蛋白质向这些大鼠血浆中的分泌(Jaffe et al.，1992)。但令人失望的是，所获得的表达水平不足以发挥治疗价值。
这些结果未证明腺病毒能够指导在重组细胞中表达足够的蛋白质以达到生理学相关效应，因此没有提示可将腺病毒系统用于与肿瘤治疗相关的方面。再者，在本发明之前，一般认为p53是有毒性的，所以不能被掺入到包装细胞如那些用于制备腺病毒的细胞中。因为腺瘤毒的E1B结合p53，所以认为这是不能联合使用腺病毒和p53的另一个原因。
E.p53-腺病毒构建体和肿瘤抑制
本发明提供了用新的和更有效的肿瘤抑制载体进行肿瘤基因台疗的方法。该重组病毒利用了腺病毒载体的优点，例如高滴度、宽靶宿主范围、有效的转导及不在靶细胞中整合等。在本发明的一个实施方案中，制得在人巨细胞病毒启动子控制下表达野生型p53(A5CMV-p53)的复制缺陷性的、不依赖辅助病毒的腺病毒。
当要求在哺乳动物细胞中表达时，常常提供来自病毒的对表达载体的控制功能。例如，常用的启动子是衍生于多瘤病毒、腺病毒2和猴病毒40(SV40)的启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子是特别适用的，因为而药均可作为也含有SV40病毒复制原点的片段很容易地从该病毒中得到。也可以使用较小或较大的SV40片段，所提供的片段中包括了从HindIII位点向前延伸到位于病毒复制原点中之Bg1I位点的约250bp序列。另外，还有可能并常常期望利用正常情况下与所包括的基因序列联系的启动子或控制序列，所提供的这些控制序列是与宿主细胞系统相匹配的。
可以构建载体使之包括外源的，例如得有SV40或其他病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)来源的复制原点，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供复制原点。如果载体被整合到宿主细胞染色体中，则后者常常是足够的。
图1中图解显示了优选的p53腺病毒的设计和增殖。与此相联系的，已建立了增殖和鉴定重组腺病毒的改良方法(详见下文)。鉴定后，如图2中所示，用PCR分析方法从结构上证实p53重组腺病毒。分离并证实其结构后，用p53腺病毒感染具有纯合p53基因缺失的人肺癌细胞系H358。Western印迹显示以高水平表达了外源p53蛋白质(图4和图5)并在感染后3天达到峰值水平(图6)。
还显示在p53点突变细胞系H322中因外源p53的表达而使突变p53受到下调。使用具有与Ad5 CMV-p53相似结构的病毒颗粒(Ad5/RSV/GL2)作为实验对照。该病毒颗粒含有由存在于病毒颗粒之表达盆中的Rous肉瘤病毒LTR启动子驱动的荧光素酶cDNA。在用病毒颗粒Ad5/RSV/GL2感染的细胞中既没检测到p53表达也没检测到肌动蛋白表达的改变。与未被感染或被对照病毒颗粒感染的细胞相反，被Ad5 CMV-p53感染的H358细胞的生长受到很大抑制(图7A)。H322细胞的生长也受到p53病毒颗粒的很大抑制(图7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460细胞的生长则只受到较小的影响(图7C)。
Ad5 SMV-p53介导对肺癌细胞体外生长的强抑制作用。当以低于1PFU/细胞的MOI用Ad5 CMV-p53感染细胞时生长抑制作用并不十分明显，而以高于100PFU/细胞的MOI感染时，即使用对照病毒Ad5/RSV/GL2感染也可观察到细胞毒性。在我们的研究中，用于生长速率研究的最适剂量为10-50PFU/细胞。在此剂量范围内，细胞生长抑制作用归因于被表达的p53蛋白质。
在裸鼠中进行的试验证明Ad5 CMV-p53处理之H358细胞的致癌性受到很大程度的抑制。在正向人肺癌小鼠模型中，在病毒处理前3天气管内接种有p53点突变的致瘤性H226Br细胞。气管内滴入Ad5 CMV-p53可防止该模型系统中的肿瘤形成，提示经修饰的腺病毒是介导人肿瘤细胞中肿瘤抑制基因转移和表达的有效载体，并且Ad5 CMV-p53病毒可进一步开发成用于肿瘤基因治疗的治疗剂。
如经Western印迹分析证明的，Ad5 CMV-p53介导了p53基因在人肺癌细胞中的高水平表达。在H460细胞中外源p53蛋白质比内源野生型p53丰富约14倍，在H358细胞中则比β-肌动蛋白内部对照丰富2至4倍。高水平表达可解是由于(1)高效率基因转移，(2)强CMV启动子驱动p53 cDNA表达，和(3)腺病毒E1增强子增强p53 cDNA转录。在H358细胞中p53表达期间长达感染后的15天以上。但在感染后5天表达迅速降低。对得自被感染H358细胞之DNA样品的PCR分析显示病毒DNA水平随蛋白质水平降低而降低，表明在肿瘤细胞体外连续生长期间有病毒DNA的丢失。
p53表达降低也可能是由于控制p53表达之CMV启动子的细胞衰减所致，因为以前曾报导了宿主细胞介导的CMV启动子切断现象(Dai et al.，1992)。腺病毒载体是非整合性基因转移载体并因此基因表达时间长短取决于包括宿主细胞、被转移的基因及相关启动子等多种因素。Crystal及其同事的研究显示，感染后6周可在Cotton大鼠上皮细胞中检测到囊性纤维化跨膜传导调节蛋白基因的低水平表达(Rosenfeld et al.，1992)。Perricaudet的实验室证明，在mdx小鼠肌肉中小肌营养不良蛋白基因的小量表达持续到感染后的3个月以上。本研究中观察到的短期高水平表达野生型p53蛋白质可能有益于降低在体内用Ad5 CMV-p53处理后对正常细胞产生的可能的负作用。
本文公开的研究工作表明p53重组腺病毒具有肿瘤抑制性质，所说的抑制作用似乎是通过恢复肿瘤细胞中的p53蛋白质功能而产生的。这些结果支持使用Ad5 CMV-p53病毒颗粒作为肿瘤治疗的治疗剂。
F.增殖和鉴定重组腺病毒的改良方法
重组腺病毒作为新的基因输送系统，在基因治疗和疫苗开发中可能具有许多潜在应用价值。因此重组腺病毒的增殖是重要的分子生物学工具。增殖重组腺病毒的已有方法是使用磷酸钙沉淀法介导病毒转染293细胞，然后对被转染的细胞进行噬斑检测。需要改善与该方法相关的转染效率，并且可进一步简化操作步骤。
在本发明之前，增殖重组腺病毒的常规方法是利用磷酸钙介导的转染。这种方法包括使细胞在磷酸钙中与载体或质粒DNA接触几小时，然后在15％甘油中进行短时(如1分钟)震盛处理。这种方法的明显缺点在于只导致低水平的DNA掺入细胞中，即其为一种效率很低的转染手段。也可以根据噬斑的出现正常指示病毒增殖，所说的噬斑看起来为环绕着被溶解细胞的表明由病毒增殖引起之细胞溶解的清晰的圆形区域。
本发明人已建立了一种显著地改善了转化效率并且简化了选择程序的新的腺病毒生产方法。发明人发现，将脂质体介导的转染例如DOTAP介导的转染与观察细胞病变效应(CPE)结合，将导致转染效率的改善和检测手段的快速和简化。在该新的方法中，利用脂质体DOTAP介导的基因转移方法将表达载体和重组质粒转导到293细胞中。然后不是用0.5％琼脂糖覆盖被转染的细胞进行噬斑检测，而是将被转染的细胞持续维持在MEM培养基中以观察细胞病变效应(CPE)。
在使用该新的方法进行的两项研究中，24孔平板的2个孔和5个60mm平皿中的3个平皿分别于共转染后的10和12天产生了CPE。相反，使用磷酸钙沉淀法，在每次实验中均没有从一式三份的20个60mm平皿的共转染中得到重组病毒。在Hep G2和HeLa细胞系中使用CAT检测，发现DOTAP介导的转染产生比磷酸钙转染法高5倍的CAT活性。
共转染后除掉琼脂糖覆盖层也简化了这一方法。在研究的终点，通过直接观察CPE而不是鉴定噬斑从而使方法更加简便和清楚，其中所说的签定噬斑方法通常很不清楚而且难于在保温10-14天后确定噬斑。图3显示有CPE之细胞培养物与没有CPE之细胞培养物的比较结果。
本发明人还发展了使用PCR确定腺病毒滴度的快速方法。对得自有CPE之细胞培养物上清液的DNA样品进行直接PCR分析的使用两对引物，一对扩增插入段特异性序列，另一对扩增病毒基因组特异性序列。发明人证明可用PCR技术检测释放到细胞培养基中的腺病毒，从而允许使用少至50μL的上清液制备DNA模板。
例如可在琼脂糖凝胶上分析PCR扩增的产物来确定经PCR扩增而鉴定的插入段特异性和病毒基因组特异性DNA序列。可与适当的分子量标准品标滤物进行比较，以鉴定相当于插入段特异性DNA和病毒基因组特异性DNA及行物的带。
当利用PCR扩增插入段特异性和病毒基因组特异性基因产物时，可首先制备对将被扩增的序列特异的引物。使用而对引物实现有效的选择性扩增：一对扩增插入段特异性产物的限定部分，另一对限定病毒基因组特异性产物的小片段。只作为实例，已构建了含有人巨细胞病毒(CMV)启动子和SV40早期聚腺苷酸化信号的D53的表达盒。第一引物组将包括位于人CMV主要1E基因启动子之第一内含子下游的引物，第一引物组的其他行物则将位于SV40早期聚腺苷酸化信号中。实际上，这两对引物均离开cDNA插入段，即作为举例说明的p53约15至20个碱基对。
应选择一限定的PCR产物，例如1.40kb p53DNA。例如第二组行物可位于Ad5基因组的11M.U T 13.4M.U.处，以限定0.86kb病毒基因组特异性PCR产物。
引物选择是本领域技术人员已知的。可以构建用于扩增有已知碱基对序列之DNA序列的已选择部分的引物。引物与DNA杂交并作为合成基因之一部分的起始位点。设计在反向双链上不同位点结合的核苷酸引物，从而限定作为将被扩增之部分的介入序列。被利用作为引物的核酸分子一般将包括与预期扩增之DNA片段互补的至少10个碱基对的序列。选择10碱基对作为通常的引物大小下限，如小于10碱基对可能不产生有效的杂交并可能存在稳定化问题。较好使用15-20碱基对的引物，本发明的优选方案中所利用的如图1所示的引物对大小为19或20个碱基对。
G.患者和治疗程序
发明人提议向患有p53相关联肿瘤，如不可切除之阻塞性支气管内肿瘤的患者的肺肿瘤细胞内区域性输送腺病毒-p53基因构建体将是一种输送治疗上有效的基因以对抗临床疾病的很有效的方法。该方法是对目前使用的肿瘤治疗法的重大改进方法，其依赖于试图杀死或消除最后的肿瘤细胞。因为肿瘤细胞休眠是一种已证实的现象，所以这就使得有效杀伤几乎成为不可能。
预计NSCLC细胞摄入腺病毒构建体将减低这些细胞的增殖速率。这就增加了受影响之肺仍继续扩展的时间，防止支气管内肿瘤再生长并延长患者的存活期。
对于那些患有不可切除之复发性支气管内肿瘤并部分或完全阻塞了通气道，没有或不能接受外部光束放射治疗的患者，可考虑使用这种方法。对于这种状态患者，已有疗法常常只是起短期缓解作用。即使进行外部光束放射治疗，大多数患者也都有复发。有可能插入短距离放射治疗插管并给予额外的放射治疗。接受这种治疗的患者平均存活期为6个月。没有进行短距离放射治疗的病人也应符合进行基因治疗条件。可以用激光或活体解剖钳从通气道中除去肿瘤。这可以与注射腺病毒构建体结合进行，以便减少必须注射之病毒的量。如果肿瘤恶化，则不解给接受其他缓解治疗的患者使用病毒构建体。
下列实施例用于证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解到，实施例中公开的技术代表了本发明人在实践本发明过程中发现的改进技术，因此可看作是实践本发明的优选方式。但从本公开的观点看，本领域技术人员应理解到，可以在不背离本发明的精神和范围前提下，对所公开的特定实施方案进行许多改变而仍可获得相同或相似的结果。
                     实施例1
                p53表达载体的构建
本实施例描述p53表达载体的构建。按所指出的方法构建该载体并用于取代腺病毒株Ad5基因组的E1区域(1.3-9.2m.u.)，以构建实施例2中所述的腺病毒病毒颗粒。
将如图1中所示的，含有人巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart，et al.，1985)、p53 cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信号的p53表达盒插入pXCJL1(由Frank L. Graham博士(McMaster University，Canada)提供)的XbaI和ClaI位点之间。
该基因组大小约35.4kb，被分成100个酶切图单位(1m.u.＝0.35kb)。用p53表达盒取代Ad5基因组的E1区(1.3-9.2m.u.)。
引物1具有序列5’-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3’(SEQ ID NO：1)并定位于人CMV主要IE基因启动子(Boshart，et al.，1985)的第一内含子下游。引物2具有序列5’-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3’(SEQ ID NO：2)并定位于SV40早期聚腺苷酸化信号中。两引物均在两末端离开p53cDNA插入段15-20bp，以限定1.40kb PCR产物。引物3具有序列5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3’(SEQ ID NO：3)，引物4具有序列5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’(SEQ ID NO：4)，且两引物分别定位于Ad5基因组的11m.u.和13.4m.u.处，借以限定0.86kb病毒基因组特异性PCR产物。
                      实施例2
              重组p53腺病毒的产生和增殖
本实施例描述一种适于产生表达p53的p53的辅助病毒作依赖性重组腺病毒的方法。用于产生重组腺病毒的分子策略是基于这样的事实，即由于腺病毒的包装限制，所以pJM1F不能以具本身形成病毒。因此，p53表达载体质粒和被转化细胞内pJM1F之间的同源重组产生只能够包装在表达必要腺病毒蛋白质之细胞中的活病毒。
本实施例的方法利用293细胞作为宿主细胞，以增殖在E1或E3区域包含异源DNA表达盒之取代的病毒。该方法需要将NDA共转染到293细胞中。转染效率在很大程度上决定病毒增殖的效率。在本发明之前，用于将DNA转染到293细胞中的方法通常是磷酸钙/DNA共沉淀法(Graham and van der Eb，1973)。但这种方法及噬斑检测法相对比较难以完成并且一般所达到的病毒增殖效率较低。本实施例作为举例说明，当根据细胞病变效应(CPE)鉴定被转染的细胞时，表明使用脂质体介导的转导方法显著改善了被感染细胞的转染效果和继后的鉴定效率。
将293细胞系维持在添加10％热灭活马血清的Dulbecco氏改进的极限基本培养基中。按照制造商推荐的程序(BoehringerMannheim Biochem：calc，1992)，以DOTAP介导的转导法将用于同源重组的p53表达载体和质粒pJM1F(McGrory，et al.，1988)共转染到293细胞中。图1中图解显示了这一方法。
转染前24小时将293细胞(35代，60％汇合)接种在60mm平皿或24孔平板上。用30μl DOTAP、2μg p53表达载体、和3μg质粒pJM1F转染各小孔中的细胞。转染后每2-3天给细胞提供MEM培养基直到发生CPE。
                       实施例3
            进一步证实重组腺病毒的同一性
本实施例举例说明用新的聚合酶链反应(PCR)法进一步证实共转染适当细胞系后所得重组腺病毒的同一性。
从试验平板中收集细胞培养物上清液的等分样品(50至370μl)，于56℃用蛋白酶K(50μg/ml，含0.5％SOS和20mMEDTA)处理/小时，用苯-酚氯仿提取，并用乙琼沉淀核酸。将DNA沉淀物重新悬浮在20μldM2O中并用作PCR扩增的模板。图1和SEQ ID NOS：1、2、3和4分别图示了PCR行物及其序列的相对位置。cDNA插入段特异性引物限定1.4kb PCR产物，病毒基因组特异性引物限定0.86kb PCR产物。在含有4mMMgCl2、50mM KCl、0.1％Triton X-100、200μM各种dNTP、10mM Tris-HCl(pH9.0)、2μM各种引物和1.0单位Taq聚合酶(Promega)的50μl总反应混合物中进行PCR反应。反应以94℃，0.5分钟、56℃，0.5分钟、和72℃、1分钟进行30次循环。
为了简化鉴定新增殖之重组病毒的方法，建立了对得自细胞培养物上清的DNA样品的直接PCR检测法。用蛋白酶K处理有CPE之细胞培养基上清的等分样品(50或370μl)并用苯酚/氯仿提取。乙醇沉淀后，使用两对扩增插入段特异性和病毒基因组特性序列的引物以PCR技术分析DNA样品。图1中显示了PCR引物靶及其序列。引物1、2、3和4分别由SEQ ID NOs：1、2、3和4表示。
结果可见，从表达载体(阳性对照)和阳性细胞培养物的DNA样品(分别是图2B所示的泳道1和4)扩增了1.4kb插入段和0.86kb病毒基因组片段。只从Ad5/RSV/GL2病毒的DNA样品(阴性对照，泳道2)扩增了0.86kb片段。使用未经处理的阳性细胞培养基上清(泳道3)进行的PCR反应中未出现扩增的带。
这些结果表明，使用少至50μL的细胞培养基上清制备DNA模板，以PCR方法可以检测出释放到细胞培养基中的腺病毒。这些结果将得以发展使用这一技术确定腺病毒滴度的定量检测方法，而传统上这一检测是以噬斑检测法完成的。
对CsCl梯度纯化的病毒DNA进行双脱氧DNA测序分析，以进一步证实Ad5 CMV-p53病毒中p53 cDNA野生型序列的存在。以相似方法产生的对照病毒Ad5/RSV/GL2具有与Ad5 CMV-p53相似的结构，但在其表达盒中使用了Rous肉瘤病毒启动子和荧光素酶cDNA。携带E.col；β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的重组腺病毒(Ad5 CMV-Lac Z)也具有与Ad5 CMV-p53相似的结构，并由Dr.Frank L. Graham提供。
病毒种子培养物、滴度和感染。按照Graham和Prevec(1991)的方法，以噬斑纯化法得到Ad5 CMV-p53、Ad5/RSV/GL2和Ad5 CMV-Lac Z病毒的个别克隆。在293细胞中增殖单一病毒克隆。收集显示有完全细胞病毒效应之293细胞的培养基并以1000×g离心10分钟。等分全并的上清并于-20℃储存用作病毒种子储备物。以噬斑检测法确定病毒滴度(Graham and Prevec，1991)。向细胞单层上加入病毒溶液(每个60mm平皿0.5ml)并在室温下保温30分钟(每隔5分钟简单搅动一次)的感染细胞系。然后加入培养基并将被感染的细胞放回37℃保温箱。
还在H226Br、H322、H460、HeLa、HepG2、LM2、和Vero等多种细胞系中使用Ad5 CMV-LacZ估计重组腺病毒的基因转移效率。使用X-gal染色，在用Ad5 CMV-LacZ以30PFU/细胞的MOI感染后，所有细胞系均着染97-100％蓝色。
                    实施例4
在人肺癌细胞中Ad5 CMV-p53指导的p53基因表达
本实施例描述使用重组p53腺病毒感染有纯合p53基因缺失的人肺肿瘤细胞。结果显示这些细胞的生长和突变p53的表达均受到抑制，表明Ad5 CMV-p53病毒颗粒可以用作控制转移细胞的有用治疗剂。
对用3.8％福尔马林固定并用3％H2O2(在甲醇中)处理5分钟的被感染之细胞单层进行免疫组织化学研究。使用Vectastain刚ite试剂盒(Vector，Burlingame，CA)完成免疫组织化学分析。使用的第一抗体是抗p53抗体PAb 1801(Oncogene Science，Manhasset，NY)，并使用MOPC-21(Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)作为阴性对照。第二抗体是抗生物素蛋白标记的抗小鼠IgG(Vector)。使用生物素化的辣根过氧化物酶ABC复合试剂检测抗原-抗体复合物。最后用Harris苏木精(Sigma)复染并用Cytoseal 60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)固定细胞。
对被感染的细胞系进行免疫组织化学分析，以检验由Ad5CMV-p53病毒的CMV启动子驱动之p53表达的原位表达。如经免疫组织化学分析所测得的，当30-50噬斑形成单位(PEU)/细胞的感染复数用Ad5 CMV-p53感染具有p53之纯合缺失的H358细胞系时，该细胞系中p53基因转移效率为97-100％(图4)。
使用携带由人CMV IE启动子转录的LacZ基因的病毒Ad5CMV-LacZ进一步证实重组腺病毒的高转移效率。以30-50PFU/细胞的MOI感染细胞，经X-gal染色显示包括HeLa、HepG2、LM2和人NSCLC肿瘤细胞系在内的所有被检细胞均有97-100％呈现β-半乳糖苷酶活性的阳性反应。这些结果表明腺病毒载体是向人肿瘤细胞内转移基因的有效载体。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗细胞后，在含SDS-PAGE样品缓冲液的平皿(每个60mm平皿0.5ml)中溶解单层细胞并对制得的细胞溶解物进行Western印迹分析。为进行SDS-PAGE分析，泳道内所加细胞溶解物相当于5×104个细胞(10-15ml)。将凝胶中的蛋白质转移到HybondTM-ECL膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上。用加于PBS中的0.5％乳粉封闭膜并用第一抗体：小鼠抗人p53单克隆抗体pAb 1801和小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体(Amersham)探查，洗涤并用第二抗体：辣根过氧化物酶结合的免抗小鼠IgG(PierceChemical Co.，Rockford，IL)探查。按照Amersham的增强化学荧光法使膜显色。用光密度计(Molecular Dynamic Inc.，Sunnyvale，CA)检测所表达的外源p53的相对量。
Western印迹显示以高水平表达了外源p53蛋白质(图5A，泳道2、3和5、6)。感染后第3天蛋白质量达到峰值(图6，插入片段，0.5天至3天)。作为对照，构建与实施例1的重组Ad5 CMV-p53有核似结构的病毒颗粒。该病毒颗粒含有由病毒颗粒的表达盒中的Rous肉瘤病毒LTR启动子驱动的虫荧光素酶cDNA。在用病毒颗粒Ad5/RSV/GL2感染的细胞中没有检测到p53表达，也没有检测到肌动蛋白表达的改变。
使用重组p53腺病毒感染三个人肺NSCLC细胞系：具有p53基因纯合缺失的细胞系H358、在密码子248(G至T)处有p53基因之点突变的细胞系H322，和具有野生型p53基因的细胞系H460。在60mm培养皿中接种H322和H460(1×105)或H358(2×105)后检测人NSCLC细胞的生长速率，并于接种后24小时感染病毒。以10PFU/细胞的感染复数(MOI)用病毒感染细胞。使用培养基进行模拟感染作为对照。感染后第1-6天每天计数作不同处理的各细胞系的一式三份培养物。
与未经感染的细胞或用对照病毒颗粒感染的细胞相反，用Ad5 CMV-p53感染的H358细胞的生长受到明显抑制(图7A)。H322细胞的生长也受到p53病毒颗粒的很大抑制(图7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460细胞的生长则只受到较小程度的影响(图7C)。Ad5 CMV-P53病毒感染的H358细胞的生长受到79％的抑制，而未经感染或用对照病毒感染的细胞则没有受到抑制。具有p53点突变的细胞系H322的生长受到Ad5 CMV-p53的抑制达72％，而含有野生型p53的细胞系H460的生长则只受到较小影响(28％抑制率)。
结果表明p53重组腺病毒具有肿瘤抑制性质，其通过恢复肿瘤细胞中的p53蛋白质功能发挥作用。
                      实施例5
          Ad5 CMV-p53用于处理p53缺陷细胞
本实施例涉及使用重组p53腺病毒恢复对肿瘤细胞的体外生长抑制，从而用于抑制细胞的恶性或转移生长。其描述本发明通过腺病毒介导的基因疗法以预期某些方式用于肿瘤治疗。
以10PFU/细胞的MOI用Ad5 CMV-p53和Ad5/RSV/GL2感染H358细胞。用培养基处理等量的细胞以作为模拟感染。感染后24小时，收获经过处理的细胞并用PBS洗两次。对于每种处理，均以0.1ml体积给每只裸鼠(Harlan Co.，Houston，TX)皮下注射3×106个细胞。每种处理使用5只小鼠。注射前照射(300cGy，60Co)小鼠，并在注射后每周检查一次。6周结束时估计肿瘤形成情况并计算肿瘤体积，其中俘定肿瘤有平均直径的球形，求其模断面直径之乘积平方根算出肿瘤体积。
为了确定Ad5 CMV-p53介导的对致癌性的抑制效果，给裸鼠皮下注射H358细胞(人NSCLC型细胞)以诱发肿瘤生长。每只小鼠接受一次已以10PFU/细胞的剂量用Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染24小时的细胞注射。以单独用培养基处理的H358细胞作为模拟感染对照。如从表I中看出的，在注射后14天只经模拟感染或对照病毒感染的细胞诱发了第一个可触及的肿瘤。
      表I  在裸鼠体内Ad5 CMV-p53对H358
               之致瘤性的影响a
    处  理     肿瘤数/小鼠数(％)     平均体积(mm3±SD)
    培养基     4/5  (80)     37±12
  Ad5/RSV/GL2     3/4  (75)     30±14
  Ad5 CMV-p53     0/4  (0)       -
a每只小鼠皮下注射2×106个经处理的H358细胞。
6周期间结束时测肿瘤大小。
如表I中所示，接受Ad5 CMV-p53处理之细胞的小鼠并没有显现肿瘤。6周结束时肿瘤直径为4-10mm。该项研究以每组5只小鼠开始；在Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2组中有一只小鼠没有完成研究。较早死亡可能是由于实验环境感染所致。
                       实施例6
                 Ad5 CMV-p53用于治疗肺癌
本实施例涉及使用重组p53腺病毒恢复对肿瘤细胞的体内生长抑制作用，并因而用于治疗动物肿瘤。描述本发明通过腺病毒介导的基因疗法预期以某些方式用于治疗肿瘤。
进一步使用同位人肺癌小鼠模型来估计Ad5 CMV-p53在抑制致癌性中的效率。因为H358和H322细胞在该模型中不产生肿瘤，所以使用H266Br细胞系。该细胞系在小鼠体内增殖成鳞状上皮细胞肺癌并从肺转移到脑。H266Br在p53基因的外显子F，密码子254处有点突变(ATC变成GTC)并且在小鼠体内是致癌性的。
以前曾描述过在同位人肺癌小鼠模型中的试验方法(Georges，et al.，1993)。简单地说，通过支气管内滴注给经过照射(300 cGY，60Co)的裸鼠接种H226Br。每只小鼠接受体积为0.1ml(在PBS中)的2×106个细胞。接种后3天，每天一次经支气管内滴注用0.1ml病毒或载体(PBS)处理每组10只小鼠，其处理2天。所用的病毒剂量为每只小鼠5×107Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2。6周时间结束时杀死小鼠。切除肺和横膈组织估计肿瘤形成情况并测量肿瘤大小。对肿瘤块的切片进行组织学分析以进一步证实肿瘤。
经支气管内滴注给经过照射的裸鼠接种2×106个H226Br细胞/小鼠。接种后3天，经支气管内滴注用0.1ml Ad5/RSV/GL2或载体(PBS)处理每只小鼠(每组8-10只)，每天一次共两天。所使用的病毒剂量为5×107PFU/小鼠。6周结束时切除动物肺和横膈组织以估计肿瘤生成情况并测量肿瘤大小。图7中显示方法的流程，图8中则证明有代表性的切除样品。经组织学分析进一步证实所检测的肿瘤。表II中总结了肿瘤检测的数据：
             表II.  在同位人肺癌小鼠模型中
          Ad5 CMV-p53对H226Br之致瘤性的影响a
    处  理     有肿瘤的小鼠数/总小鼠数(％)     平均体积(mm3±SD)
     载体     7/10  (70)     30±8.4
  Ad5/RSV/GL2     8/10  (80)     25±6.9
  Ad5 CMV-p53     2/8   (25)     8±3.3b
a用2×106个H226Br细胞/小鼠经气管内滴注接种小鼠，接种后第3天，连续两天每天给小鼠支气管内滴注载体或病毒(5×107/小鼠，0.1ml体积)。6周时间结束时估计小鼠体内肿瘤生成情况。
b经双向方差分析与接受载体(PBS)或对照病毒组的动物相比p＜0.05。
只有25％经Ad5 CMV-p53处理的小鼠生成肿瘤，而载体或Ad5/RSV/GL2对照组则有70-80％的被处理小鼠生成肿瘤。Ad5 CMV-p53组的平均肿瘤大小明显小于对照组。这些结果表明Ad5 CMV-p53可以阻止H226Br在同位人肺癌小鼠模型中形成肿瘤。
                     实施例7
              Ad5 CMV-p53用于治疗程式
当然，如本文实施例5和6中所述，动物模型中的应用可作为临床前试验的一部分。因此，可以试验已确定有进行腺病毒介导基因转移治疗临床指征的病人体内是否存在抗腺病毒抗体。如果存在抗体并且病人有对药理学或天然物质发生过敏反应的历史，将指示可以在密切临床观察下给予应用103至106试验剂量的重组腺病毒。
为了使用Ad5 CMV-p53治疗肿瘤，应制备在适当启动子/增强子元件如CMV启动子控制下表达p53的重组腺病毒，并按照符合药物与食品管理局(FDA)规定的生产人用药品的方法纯化之。这些方法包括但不只限于氯化铯密度梯度离心，然后测试效率和纯度。
认为有两种基本方法是适于p53腺病毒治疗的方法，一是直接或局部给药和一种是全身性给药。本方法适于治疗各种已知与p53突变相关的不同的肿瘤。就全身给药来说，已显示简单地静脉内注射腺病毒足可导致远离注射部位之组织的病毒感染(Stratford-Perricaudet et al.，199b)，并因此而适于治疗所有p53相关肿瘤。可以将病毒加在药理学上可接受的溶液中通过静脉内途径，或经长时间输送投用于病人。一般说来，所投用的有效数量的功能性病毒颗粒将在1×1010至5×1012范围内。
另外，具体就肺癌来说，必要时可以更直接地物理注入重组腺病毒，以相似方式经支气管内投用囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(Rosenfeld et al.，1992)。这样可以将重组p53腺病毒输送到更接近靶细胞的部位。
更详细地说，可以沿着下列路线发展优选的治疗方法。首对病人进行气管镜检查以了解阻塞程度。应通过气管镜尽可能多地切除大体肿瘤。最好在局部或全身麻醉下对病人进行气管镜检查。将一个StifcorTM跨气管抽吸针(21g)通过气管镜的活检通道。然后以小体积如大约10ml或更小些的体积在残留肿瘤部位注射p53腺病毒。
因为所利用的腺病毒在任何情况下都是复制况无能的，所以病毒本身对治疗对象的健康没有不良影响。但治疗期间病人至少应在医院里留院观察48小时以监视其总性和迟发性不良反应。过去已注意到使用重组缺陷腺病毒作为基因转移载体的安全问题(Rosenfeld et al.，1992；faffe et al.，1992)，但应适当地监测腺病毒的使用剂量以进一步尽可能地减少不期望的副作用。
当提出存在反应不足或存在毒性时，应该考虑多个不同的标准。为了帮助确定毒性的存在，在疗程开始前应摄影测量肿瘤的大小。将测量最长直径和其垂直径长度。以直径的乘积记录肿瘤大小。可根据这些数据计算出肿瘤再生长的速率。
测定从第一次观察有肿瘤块退化到出现进行性病变为止的时间进程。进行性疾病定义为所测得之损伤的直径乘积的总和增加≥25％。在确定进行性病变之前病人必须已接受了至少两个疗程的治疗。从进入程序开始测病人的存活期。
追踪检查应包括所有用于肿瘤治疗的常规检查，包括监测临床指征和进行用于常规和分子生物学分析的活体组织检查，在分子生物学分析中估测各种p53基因表达的特征。如此也将提供已摄入了被转移之基因的细胞的数目及启动子及体内相对强度的信息。基于获得的资料，可对治疗方案进行调整。这些调整可包括使用不同启动子的腺病毒构建体或所注射之pfu数目的改变以确保在没有非生理性过表达重组基因的情况下感染更多的或所有的肿瘤细胞。
应考虑到在体内由腺病毒转移之外源基因的表达可持续一个长的时期。治疗上有效地长期表达由病毒转移的外源基因必须基于每个具体病例来考虑和处理。标志基因在其应用中只限于估计基因表达的治疗上相关的持续时间，因为为了缓解任何已知遗传疾病所需的表达水平可能与为了完全治疗其他疾病所需的水平有很大的差异。
虽然已借助优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员显然可以在不背离本发明的概念、精神和范围的前提下对本文所述的组合物、方法及方法中的各步骤或各步骤的次序作出改动。及具体地说，显然可以用某种化学和生理学上相关的制剂取代本文描述的制剂并获得相同或相似的结果。所有这些相似的取代或修饰对本领域技术人员来说都是显而易见的，并视为属于本发明待批权利要求所限定的本发明范围和概念之内。所有权利要求的材料和方法均可重现并不必进行过多的重复性实验。
                        参考文献
下列参考文献的内容提供对本文所述内容的补充，并列入本文作为参考。
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                        序列表
(1)一般信息：(i)申请人：
(A)名称：BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OF
         TEXAS SYSTEM
(B)街道：201 West 7th Street
(C)城市：Austin
(D)州：Texas
(E)国家：美国
(F)邮政编码：78701
(G)电话号码：(512)499-4462
(H)传真：(512)499-4523(ii)发明人：ZHANG，Wei-Wei
          ROTH，Jack A.(iii)发明名称：重组p53腺病毒方法和组合物  (iv)序列数：4(v)通讯地址：
(A)收信人：Arnold，White & Durkee
(B)街道：P.O.Box 4433
(C)城市：Houston
(D)州：Texas
(E)国家：USA
(F)邮编：77210(vi)计算机可读的形式：
(A)介质类型：Floopy软盘
(B)计算机：IBM PC相容性
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS，ASCII
(D)软件：PATENTIN RELEASE#1.0，VERSION#1.25(vii)本申请资料：
(A)申请号：未知
(B)申请日：与本文一致
(C)分类：未知  (viii)在先申请资料：
(A)申请号：USSN 08/145,826
(B)申请日：1993年10月29日
(C)分类：未知(ix)律师/代理人信息：
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(A)电话：(512)418-3000
(B)传真：(512)474-7577
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Claims (21)

1.携带腺病毒载体构建体的重组腺病毒，所说的载体包含编码p53的表达区，其能移在人恶性细胞中表达p53。
2.权利要求1的重组腺病毒，其中载体构建体包含位于巨细胞病毒IE启动子控制下的p53表达区。
3.权利要求2的重组腺病毒，其中载体构建体包含p53表达区、巨细胞病毒IE启动子及SV40早期聚腺苷酸化信号。
4.权利要求1的重组腺病毒，其中从载体构建体中删除了腺病毒复制所必需的基因并在其位置上导入了p53表达区。
5.权利要求1的重组腺病毒，其中腺病毒载体的E1A和E1B区被删除并在其位置上导入了p53表达区。
6.权利要求1的重组腺病毒，其具有图1所示的基因组结构。
7.权利要求1的重组腺病毒，其分散于药理学上可接受的配方中。
8.用依据权利要求1的重组腺病毒感染的重组宿主细胞。
9.恢复有野生型p53缺陷之细胞的野生型p53蛋白质功能的方法，其包括使细胞与一定量可在细胞中有效表达野生型p53的权利要求1的重组腺病毒接触。
10.权利要求9的方法，其中细胞是有p53基因突变的肿瘤细胞。
11.权利要求10的方法，其中细胞是人肺癌细胞。
12.权利要求10的方法，其中细胞是人乳腺癌细胞。
13.权利要求9的方法，其中细胞位于哺乳动物体内，并且腺病毒是以药理学上可接受的形式给哺乳动物投用的。
14.产生重组腺病毒的方法，该方法包括：
通过脂质体介导的转染将腺病毒质粒和表达载体导入适当的宿主细胞中；并
分析培养的宿主细胞是否有作为同源重组和病毒产生之指征的细胞病变效应。
15.权利要求14的方法，其中脂质体介导的转染步骤是DOTAP介导的转染。
16.权利要求14的方法，其中腺病毒质粒是有复制缺陷的腺病毒质粒并且宿主细胞弥补这一缺陷。
17.权利要求16的方法，其中腺病毒质粒缺少功能性E1A和E1B，并且宿主细胞是表达E1的细胞。
18.权利要求17的方法，其中宿主细胞是293细胞。
19.权利要求14的方法，其中宿主细胞是在MEM培养基中培养的。
20.权利要求14的方法，进一步包括从表现有细胞病变效应之细胞上清中得到DNA并使用表达载体特异性和腺病毒基因组特异性DNA探针经PCR分析DNA，以证实重组腺病毒的存在。
21.权利要求14的方法，其中表达载体包含p53编码DNA片段，该片段处于能够指导人转移性细胞中p53表达的启动子控制之下。
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