HU222981B1 - Rekombináns p53-adenovírusok, eljárások előállításukra, és a vírusokat tartalmazó készítmények - Google Patents

Rekombináns p53-adenovírusok, eljárások előállításukra, és a vírusokat tartalmazó készítmények Download PDF

Info

Publication number
HU222981B1
HU222981B1 HU9601084A HU9601084A HU222981B1 HU 222981 B1 HU222981 B1 HU 222981B1 HU 9601084 A HU9601084 A HU 9601084A HU 9601084 A HU9601084 A HU 9601084A HU 222981 B1 HU222981 B1 HU 222981B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
use according
adenovirus
cell
gene
Prior art date
Application number
HU9601084A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601084D0 (en
HUT76527A (en
Inventor
Jack Roth
Wei-Wei Zhang
Original Assignee
Board Of Regents The University Of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Board Of Regents The University Of Texas System filed Critical Board Of Regents The University Of Texas System
Publication of HU9601084D0 publication Critical patent/HU9601084D0/hu
Publication of HUT76527A publication Critical patent/HUT76527A/hu
Publication of HU222981B1 publication Critical patent/HU222981B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát p53-proteint expresszáló rekombináns adenovírusok,a rekombináns vírusokkal fertőzött gazdasejtek, a vírusokat tartalmazókészítmények, valamint a rekombináns adenovírusok előállításáraszolgáló eljárások képezik. A találmány tárgyát képezi továbbá egyeljárás az abnormális p53-proteint tartalmazó sejtek normális p53-protein-funkciójának visszaállítására. A találmány szerinti megoldásalkalmas a p53-gén tumorsejtekbe történő bevitelére és a p53-mutációkkal összefüggő rákos betegségek (mint például az emberitüdőrák és emlőrák) kezelésére. ŕ

Description

A találmány szerinti megoldás a rekombináns technológia tárgykörébe tartozik. A találmány tárgyát közelebbről p5 3-proteint expresszáló rekombináns adenovírusok, a rekombináns vírusokkal fertőzött gazdasejtek, a vírusokat tartalmazó készítmények, valamint a rekombináns vírusok előállítására szolgáló eljárások képezik. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás az abnormális p53-proteint tartalmazó sejtek normális p53protein-funkciójának visszaállítására.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható a p53-gén tumorsejtekbe történő bevitelére, a p53-mutációkkal összefüggő rákos betegségek (mint például az emberi tüdőrák és emlőrák) kezelésére, ezen belül a rosszindulatú vagy metasztázisos növekedés gátlására, és az eltávolított tumorok kiújulásának megakadályozására.
A rák jelenlegi kezelési eljárásairól (beleértve a sugárkezelést, sebészeti beavatkozást és a kemoterápiát) ismert, hogy hatékonyságuk korlátozott. Az Egyesült Államokban egyedül tüdőrákban évente több mint 140 000 ember hal meg. Napjainkban az életkorhoz arányosított, tüdőrákból eredő elhalálozások száma nőknél felülmúlja az emlőrák okozta elhalálozások számát. Bár a dohányzás mérséklésére irányuló programok bevezetése csökkentette a dohányzás gyakoriságát, a tüdőrákból eredő elhalálozási gyakoriság a XXI. században is igen magas szinten marad. A tüdőrák esetében alkalmazható új terápiák kifejlesztésének sikere a tüdőrák molekuláris szintű biológiájának megértésén múlik.
Jól ismert, hogy számos különböző rákot - legalábbis részben - genetikai rendellenességek okoznak, melyek egy vagy több gén túlexpresszálását, illetve abnormális vagy mutáns gén (vagy gének) expresszióját eredményezik. Sok esetben például az onkogének expressziója okozza a rák kifejlődését. Az „onkogének” olyan - genetikailag módosított - gének, amelyek mutáns expressziós termékei valamilyen módon károsítják a normális celluláris működéseket, illetve a celluláris szabályozást [Spandidos és munkatársai (1989)].
Az eddig tanulmányozott legtöbb onkogénről megállapították, hogy egy normális celluláris gén (azaz egy „protoonkogén”) kódolórégiójában lévő mutáció - gyakran pontmutáció - eredményeként kerül „aktivált” állapotba. Az ilyen mutáció az expresszált proteintermékben aminosavszubsztitúciókat eredményez. A módosított expressziós termék abnormális biológiai működést fejt ki, amely részt vesz a daganatos folyamatban [Travali és munkatársai (1990)]. Az alapvető mutációk különböző módon, például kémiai mutagenezissel vagy ionizáló sugárzás eredményeként jönnek létre. A közelmúltban számos onkogént és onkogéncsaládot (mint például ras, myc, neu, raf, erb, src, fins, jun és abl) azonosítottak és karakterizáltak [Travali és munkatársai (1990); Bishop (1987)].
Úgy gondoljuk, hogy a normális sejtnövekedés során a növekedést elősegítő protoonkogéneket ellensúlyozzák a növekedést gátló tumorszuppresszorgének. E két erő egyensúlyát több faktor befolyásolhatja, ami daganatos állapotot eredményezhet. Az egyik ilyen tényezőt a tumorszuppresszorgének mutációi képezik [Weinberg (1991)].
Az egyik lényeges tumorszuppresszorgén a p53 celluláris proteint (amely sejtproliferációt szabályozó, 53 kDos sejtmagi foszfoprotein) kódoló gén. A p53-gén mutációi és a 17p-kromoszómakaron (amelyen a p53-gén található) lévő allélvesztés az emberi malignus betegségek esetében azonosított leggyakoribb változások. A p53-protein az evolúció során nagymértékben konzerválódott, s a legtöbb normális szövetben expresszálódik. A vad típusú p53-proteinről kimutatták, hogy szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában [Mercer (1992)], a transzkripciós szabályozásban [Fields és munkatársai (1990); és Mietz és munkatársai (1992)], a DNS-replikációban [Wilcock és Lane (1991); Bargonetti és munkatársai (1991)], valamint az apoptózis indukciójában [Yonis-Rouach és munkatársai (1991)].
Ismeretesek különböző p53-allélok, amelyekben egyetlen bázis szubsztitúciója olyan proteinek expresszióját eredményezi, amelyek a p53-proteintől teljesen eltérő növekedésszabályozó tulajdonságokat mutatnak, ami végül is malignus betegségekhez vezet [Hollstein és munkatársai (1991)]. A gyakori emberi rákbetegségek esetében a leggyakrabban mutáción átesett génként a p53-gént azonosították [Hollstein és munkatársai (1991); Weinberg (1991)], és azt találták, hogy nagymértékben összefügg a cigarettafüsttel kapcsolatos rákokkal [Hollstein és munkatársai (1991); Zakut-Houri és munkatársai (1985)]. A p53 túlexpresszálását emlőtumorokban szintén leírták [Casey és munkatársai (1991)].
A rákos betegségek génterápiájának egyik leginkább érdeklődésre számot tartó módja a tumorszuppresszorgének (mint például a p53) alkalmazását foglalja magában. Beszámoltak arról, hogy a vad típusú p53-gén bizonyos típusú emlőrák- vagy tüdőráksejtekbe történő transzfektálása helyreállíthatja a növekedésgátló kontrollt [Casey és munkatársai (1991); Takahashi és munkatársai (1992)]. Bár a DNS-transzfekció a páciensek sejtjeibe történő DNS-bevitel céljára nem alkalmazható, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vad típusú p53-gén - mutáción átesett p53-gént tartalmazó - ráksejtekbe történő bevitele a rák hatásos kezelési eljárása lehet, ha sikerül kifejleszteni a p53-gén bevitelének javított eljárását.
A tumorszuppresszió céljára alkalmas génterápiában alkalmazható génbeviteli rendszerek vizsgálata és kifejlesztése jelenleg is tart. A víruson alapuló génbeviteli hordozók különösen jelentősek, mivel a vírusok hatékonyan képesek megfertőzni az élő sejteket, mely folyamat során maga a virális genetikai anyag kerül be a sejtekbe. Ezen a területen tapasztalható némi fejlődés; például, különböző gének bevitele céljából - génsebészeti eljárásokkal - retrovírusvektorokat alakítottak ki. A retrovírusvektorok génterápiában történő alkalmazásával kapcsolatban jelentős problémák merülnek fel, mivel fertőzőképességük a célsejtekben a retrovírusreceptorok hozzáférhetőségétől függ; koncentrálásuk és tisztításuk bonyolult; és csak a replikációt mutató sejtekbe épülnek be hatékonyan.
Az utóbbi időben javasolták az adenovírusvektorrendszerek bizonyos génbeviteli eljárásokban történő alkalmazását, azonban a rekombináns adenovírus előállí2
HU 222 981 Bl tásának jelenlegi eljárásainak több hátránya is van. Ezek az eljárások az expressziós vektorok és adenovírusplazmidok gazdasejtekbe történő (kalcium-foszfát közvetítésével végzett) transzfekcióján és a transzfektált sejtek plakkanalízisén alapulnak. Az ilyen típusú transzfekciós és vizsgálati lépések nem hatékonyak, és rendszerint alacsony szintű vírusszaporulatot eredményeznek.
A fentiek következtében, egyértelműen szükség van olyan új eljárások kifejlesztésére, amelyek - a növekedésgátlás helyreállításának eszközeként - a tumorszuppresszorgének (mint például a p53) sejtekbe történő bevitelére alkalmazhatók. Szintén előnyösek lennének a rekombináns adenovírus kifejlesztésének olyan eljárásai, amelyekkel elkerülhető a kalcium-foszfát közvetítésével történő transzfekció és - a plakkanalízishez szükséges - agarózos lefedés.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során a fenti és egyéb problémák megoldása érdekében - rekombináns adenovírus (például p53-adenovírus) hatékony előállítási eljárásainak, valamint a rendellenes működésű p53-proteint tartalmazó sejtekben a p53-fimkció helyreállítására alkalmas eljárások kifejlesztését tűztük ki célul. A találmány leírásában rekombináns adenovírusvektorokat és virionokat, valamint - a rendellenes működésű p53-proteint tartalmazó sejtekben, például ráksejtekben a vad típusú p53 expresszióját elősegítő készítmények alkalmazási eljárásait táljuk fel. Feltárunk továbbá egy egyszerűsített eljárást rekombináns adenovírus szaporítására, melynek során liposzóma közvetítette DNS-transzfekciót végzünk, majd megfigyeljük a citopátiás hatást (CPE; „cytopathic effect”), és - előnyösen - polimeráz-láncreakciós (PCR) analízist végzünk.
Ezenkívül, a rekombináns adenovírusok előállításának és szaporításának új eljárásának alkalmazásakor számolunk azzal, hogy a viriongenomba más gének is foglalhatók. Az ilyen gének közé tartoznak a retinoblastomagén (rb-gén), az antiszensz onkogének (azaz anti-cmyc és anti-k-ras), illetve más, a rákterápiában alkalmazható, növekedésszabályozással kapcsolatos gének
A találmány szerinti megoldás alkalmazásával bebizonyítottuk, hogy jelentős hatás érhető el a metasztázisos növekedés szabályozásában. Az Ad5CMV-p53 rekombináns adenovírusról kimutattuk, hogy jelentős mértékben csökkenti a transzformált sejtek növekedési sebességét. A vírus gátolta a vírussal fertőzött H358sejtek tumorképzését, sőt - ha a H226Br-sejtek légcsővön keresztül történő becseppentését követően a vírust szintén légcsövön keresztül adtuk be -, megakadályozta a tüdőrák ortotopiás növekedését. A tumorképző sajátság gátlása felveti annak lehetőségét is, hogy a p53protein magas szintű, átmeneti expressziója is elégséges lehet a tumorképződést gátló hatás indukciójához.
A találmány egyik speciális megvalósítási módját olyan vektorkonstrukciók képezik, amelyek vad típusú p53-gének célsejtekbe (például olyan sejtekbe, amelyekről feltételezzük, hogy mutáns vagy rendellenes p53-gént tartalmaznak; ilyenek például a malignus sejttípusok) történő beadására alkalmasak. Az ilyen megvalósítási módokban génexpressziós vagy transzkripciós egységet állítunk elő, amelyben a p53-gént egy promoter szabályozása alá helyezzük, és az egységet egy rekombináns adenovíruson belül egy adenovírusvektorba helyezzük. A találmány szerinti megoldás több okból is meglepő módon előnyös. Először: korábban azt gondolták, hogy a p53vírus csomagolósejtben („packaging cell”) (például adenovírus előállításához alkalmazott sejtben) nem állítható elő, mivel toxikus lehet; másodszor: az adenovírus E1Bje megköti a p53-at, így gátolja annak működését; harmadszor: a p53-adenovírus nem várt módon hatásosnak bizonyult a különböző ráksejtek növekedésének gátlásában; és végül: az Ad5CMV-p53-adenovirussal végzett kezelés gátolta a tüdőráksejtek tumorképző sajátságát, a kontrollvírussal végzett kezelés azonban nem, ami azt jelzi, hogy az új proteinbeviteli eljárás és készítmény kiemelkedő terápiás hatékonyságú.
A fentiek értelmében, a találmány tárgyát adenovírusvektor-konstrukciók képezik, amelyek a tumorszuppresszorgének (mint például a p53-gén), antiszensz onkogének és más, génterápiában alkalmazható rokon gének hordozójaként adenovírust tartalmaznak. A találmány egyik megvalósítási módját adenovírusvirionok vagy ilyen vektorokat magukban foglaló vírusrészecskék, valamint ezek gyógyászati készítményei képezik, amelyek olyan rekombináns inszertet tartalmaznak (beleértve a vad típusú p53-at kódoló expressziós régiót), amelyek révén a vektorok képesek a p53-at a humán metasztázisos sejtekben expresszálni. A vektorban lévő p53 expressziós régió tartalmazhat genomiális szekvenciát, de az egyszerűség kedvéért, előnyösen p53-cDNSszekvencia alkalmazható, mivel az ilyen szekvenciák könnyen hozzáférhetők, és könnyebben manipulálhatók. A vektor rekombináns inszertje általában promoterrégiót és poliadenilációs szignált (például SV40 vagy protamingén poliadenilációs szignált) is tartalmaz.
A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében kívánatos lehet a p53 expressziós régiót egy erős, konstitutív promoter (például CMV-promoter, virális LTR- vagy SV40-promoter) vagy olyan génekkel kapcsolatos promoter szabályozása alá helyezni, amelyek emlőssejtekben magas szinten expresszálódnak (mint például az elongációs faktor-1 vagy az aktinpromoterek). Jelenleg a legelőnyösebb promoter a citomegalovírus (CMV) IE-promotere.
A p53-gént vagy -cDNS a találmány szerinti megoldás értelmében úgy vihető be a rekombináns adenovírusba, hogy a p53-kódolószekvenciát olyan vírusgenomba inszertáljuk, amelyből hiányzik az E1B. Az előnyös adenovírusok hibás replikációjú vírusok, amelyekben a replikációhoz és/vagy a csomagoláshoz („packaging”) nélkülözhetetlen vírusgént delécióval eltávolítottuk az adenovírusvektor-konstrukcióból, miáltal a p53 expressziós régiót bevihettük a helyére. Az E1B mellett bármely gén - függetlenül attól, hogy a replikáció tekintetében esszenciális-e (például E1A, E2 és E4) vagy sem (például E3) - deletálható és p53-génnel helyettesíthető.
Különösen előnyösek azok a vektorok és virionok, amelyekben az adenovírusvektor E1A- és ElB-régiói
HU 222 981 Bl deletáltak, és helyükön p53 expressziós régió található (ezek példájaként ld. az 1. ábrán bemutatott genomszerkezetet).
A hibás replikációjú adenovírusok előállítási eljárásai a szakirodalomból ismertek [Ghosh-Choudhury és Graham (1987); McGrory és munkatársai (1988); Gluzman és munkatársai (1982) (mely forrásokat teljes teqedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni)]. Szintén jól ismert, hogy a rekombináns adenovírusok szaporítására különböző sejtvonalak alkalmazhatók, melyekkel szemben az a követelmény, hogy kiegészítsék a replikációs hiányosságokat. Ilyen célra előnyös sejtvonal a humán 293-sejtvonal, de bármilyen más, a replikációt elősegítő (azaz, előnyös esetben, ElA-t és ElB-t expresszáló) sejtvonal is alkalmazható. A sejtek - a bennük lévő vírusállomány kinyerése érdekében - műanyag tálcán vagy szuszpenziós tenyészetben szaporíthatok.
A találmány szerinti megoldás nem korlátozódik kizárólag az El-hiányos vírus és az El-expresszáló sejtek alkalmazására. A találmány szerinti megoldás értelmében a vírusok és gazdasejtek egyéb kiegészítő kombinációi is alkalmazhatók, feltéve, hogy a p53-vektor nem tartalmaz ElB-t. Alkalmazható például a funkcionális E2-t nem tartalmazó vírus és az E2-expresszáló sejtek kombinációja, vagy a funkcionális E4-et nem tartalmazó vírus és az E4-expresszáló sejtek kombinációja stb. Amennyiben olyan gént deletálunk és helyettesítünk, amely nem esszenciális a replikáció szempontjából (például az E3-gén), nem szükséges, hogy a gazdasejt kompenzálja az ilyen gén hiányát.
Úgy tartjuk, hogy a találmány szerinti megoldás sikeres megvalósításához az adenovírusvektorokkal és virionokkal szemben támasztott azon feltételen kívül, hogy ne tartalmazzanak ElB-gént, természetük nem döntő jelentőségű. Az alkalmazott adenovírus a 42 különböző, ismert szerotípus, illetve az A-F alcsoportok bármelyikébe tartozhat. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, feltételesen hibás replikációjú adenovírusvektor előállítása céljára a C alcsoport 5. típusába tartozó adenovírus az előnyös kiindulási anyag. Ennek oka, hogy az 5. típusba tartozó adenovírus humán adenovírus, amelyről jelentős mennyiségű biokémiai és genetikai ismeret áll rendelkezésre, és ezt a vírust alkalmazták a legtöbb - vektorként adenovírus alkalmazásával készült - konstrukció előállításához.
A találmány tárgyát képezik továbbá az új p53DNS-szegmensek vagy expressziós vektorok, valamint a rekombináns gazdasejtek, amelyek a találmány szerinti módon előállított p53-adenovírusvektort tartalmaznak. A találmány szerinti DNS-szegmensek általában - a transzkripció 5’-3’ irányának megfelelően citomegalovírus-IE-promotert, vad típusú humán p53-at kódoló strukturális gént és SV40 korai poliadenilációs szignált tartalmaznak. Az adenovírust tartalmazó rekombináns gazdasejtként általában eukarióta- vagy emlős gazdasejtet alkalmazunk, például 293-sejtet, de alkalmazhatunk olyan sejtet is, amely a p53-gént illetően rendellenességet mutat, s amelyet a találmány szerinti adenovírussal fertőztünk.
A találmány más megvalósítási módjait gyógyászati készítmények képezik, amelyek - gyógyászati szempontból elfogadható oldatban vagy pufferben diszpergált - rekombináns adenovírust tartalmaznak (mely vírus vad típusú p53-at kódol). A gyógyászati szempontból elfogadható, előnyös oldatok közé tartoznak a foszfát-, laktát-, Tris- és egyéb pufferekkel puffereit semleges sóoldatok. Természetesen szükség lehet az adenovírus megfelelő mértékű tisztítására, hogy lényegében mentessé tegyük a nemkívánatos szennyezésektől, például a hibás, zavaró hatású adenovírusrészecskéktől, endotoxinoktól vagy más pirogénektől, aminek az a célja, hogy ezek a vektorkonstrukcióval kezelt állatban vagy emberben ne okozzanak kellemetlen reakciókat. A vektor tisztításának egyik előnyös eljárása a sűrűséggradiens-centrifugálás, például a cézium-klorid-gradienscentrifugálás.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint egy - vad típusú p53-protein tekintetében hiányos - sejtben biztosítjuk a p53-fúnkciókat, vagy helyreállítjuk a vad típusú p53-protein-funkciókat. Ennek megvalósítása érdekében a p53-mutációt hordozó sejtet a találmány szerinti rekombináns adenovírus - a sejtben a vad típusú p53-protein expresszálásához - hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe. Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy az adenovírust tartalmazó gyógyászati készítmény fiziológiailag hatásos mennyiségét - hibás p53-gént tartalmazó sejteket, például ráksejteket hordozó - állatnak vagy embernek adjuk be. Ilyenformán, a találmány tárgyát képezik a humán malignus betegségek (például emlő- vagy tüdőrák) kezelésének hatásos eljárásai is.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a p53-expresszáló adenovírust malignus, sőt, metasztázisos növekedés megakadályozására alkalmazzuk. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a p53-génben mutációkat hordozó sejtek kontrollálatlan növekedésének gátlására rekombináns p53-at expresszáló adenovírust alkalmazunk. A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint a p53-at expresszáló adenovírussal H358-sejtek tumorképzését és növekedését gátoljuk, de alkalmazhatunk bármilyen más - a p53-fúnkció indikátoraként működő - sejtet is.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a p53-at expresszáló vírust - légcsövön keresztül beadva - ortotopiás tüdőtumor-növekedés megakadályozására alkalmazzuk. Az Ad5CMV-p53-vírus csupasz („nude”) egérrel végzett tesztekben biztató eredményeket adott. A vírus gátolta a vírussal fertőzött H358-sejtek (melyek egyébként jelentős nagyságú tumort képeznek) tumorképzését. Amikor az Ad5CMVp53-vírust - a H226Br-sejtek légcsövön keresztül történő (intratracheális) bejuttatása után - légcsövön keresztül adtuk be, megakadályozta az ortotopiás tüdőráknövekedést, ami e vírus tüdőráksejtekre gyakorolt in vitro hatását bizonyítja. A tüdőráksejtek tumorképzését az Ad5CMV-p53-vírussal végzett kezelés gátolta, a kontroll Ad5/RSV/GL2 vírussal végzett kezelés azonban nem, ami azt jelzi, hogy ap53-protein terápiás hatékonyságú. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a
HU 222 981 Bl vírusbevitel egyéb eljárásai szintén a találmány tárgyát képezik.
Bár a találmány szerinti megoldás különböző megvalósítási módjainak példáit a p53-konstrukciók alkalmazásán keresztül, a normális sejtfunkció helyreállításával és a rákterápiában való alkalmazhatósággal kapcsolatban mutatjuk be, a találmány szerinti megoldás általánosan alkalmazható bármely olyan helyzetben, ahol egy célsejtben vagy gazdasejtben - rekombináns adenovírus alkalmazásával - egy tumorszuppresszor-protein magas szintű expressziójának megvalósítása kívánatos. Például, a rákterápia összefüggésében, az általunk kidolgozott p53-helyettesítésen kívül jellemző példa a retinoblastomagén (rb), az antiszensz onkogének (c-myc vagy c-ras) és más, rokon gének rákterápiában történő alkalmazása.
Rá kell mutatnunk arra, hogy az alkalmazott adenovírusvektor - mivel replikációja hibás - nem lesz képes a megfertőzött sejtekben (például ráksejtekben) replikálódni. Ennek megfelelően, olyan esetekben, amikor bizonyos páciensek esetében folytonos kezelésre van szükség, például a terápia kezdetén, szükség lehet arra, hogy a vírust bizonyos idő (például hat hónap vagy egy év) elteltével ismételten bejuttassuk a sejtekbe.
A találmány szerinti adenovírusvektorok a génterápiával közvetlenül kapcsolódó megvalósítási módokban is felhasználhatók. Az alternatív alkalmazások közé tartoznak például a különböző p53-gének in vitro analízisei és mutagenezisvizsgálatai, valamint a - például antitestek előállításához vagy más megvalósítási módokban alkalmazható - proteinek rekombináns eljárásokkal történő előállítása. Az embergyógyászattal kapcsolatos megvalósítási módoktól eltérő megvalósítási módokban - beleértve a p53 molekuláris aktivitásának további meghatározását célzókat - a p53-sejtbe történő beviteléhez más rokon vírusok is alkalmazhatók. Ilyen célokra a herpescsaládba tartozó vírusok - például a herpes simplex vírus (HSV), Epstein-Barr-vírus (EBV), citomegalovírus (CMV) és pseudorabiesvírus (PRV) - alkalmazhatók előnyösen.
A találmány egy másik megvalósítási módját bármilyen típusú rekombináns adenovírus egyszerűsített előállítási eljárása képezi, melynek során kiküszöböljük a nem kellő hatékonyságú kalcium-foszfátos transzfekció és az unalmas plakkanalízis alkalmazását. A találmány szerinti megoldás értelmében a rekombináns adenovírus előállítása érdekében általában egy megfelelő gazdasejtbe - liposzóma közvetítette transzfekcióval adenovírusplazmidot és egy expressziós vektort viszünk be, majd a tenyésztett gazdasejteket citopátiás hatás (CPE) jelenlétére vizsgáljuk, ami homológ rekombinációra és vírustermelődésre utal. Az eljárás első lépésében a transzfekciós hatékonyság növelése teszi lehetővé a második - és előnyös - CPE-lépés megvalósíthatóságát.
A liposzóma közvetítette transzfekció céljára előnyösen alkalmazható készítmény a DOTAP (N-[l-(2,3dideoil-oxi)-propil]-N,N,N-trimetil-ammónium-metilszulfát), amely kereskedelmi forgalomban beszerezhető. A CPE egy közvetlenül megfigyelhető jelenség, amely fáziskontraszt-mikroszkóppal vizsgálható. A CPE az adenovírus citotoxicitásának morfológiai sajátosságait írja le, ami a lírikusán fertőzött sejtek összezsugorodásával kezdődik, és lírikus plakk kialakulásával végződik. Ezen eljárás jelentős előnye, hogy a vírusok szaporodása 10-14 napos inkubálást követően könnyen meghatározható, ami a kalcium-foszfátos transzfekcióhoz, és az azt követő plakkanalízishez képest lényeges javulást jelent, mivel ezek legalább 14 napot, általában minimum 21 napot, és gyakran több hetet vesznek igénybe, mielőtt sor kerülhetne az eredmények értékelésére.
Bizonyos megvalósítási módokban a találmány szerinti eljárást hibás replikációjú adenovírusplazmidokkal és a hibás replikációt kiegészítő gazdasejttel kapcsolatban alkalmazzuk, melynek példájaként az El-hiányos plazmidok és a 293-sejtek kombinációját említjük. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításának példáiban a funkcionális E1A- és ElB-gént nem tartalmazó adenovírusplazmidokat (amelyek tartalmazzák a p53 expressziós régiót) alkalmazzuk, de a rekombináns adenovírusba hasonló módon bármilyen expressziós régió beépíthető. Az eljárás pontos módszertana kívánság szerint változtatható, azonban - bizonyos esetekben — előnyös a MEM-tápközeg alkalmazása.
A találmány szerinti új eljárásokat - a pontosan rekombinálódott vírus jelenlétének igazolása érdekében - PCR-analízissel kombinálhatjuk. A polimerázláncreakció a szakemberek számára jól ismert, s leírása megtalálható a 4,683,195 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni). A PCR találmány szerinti eljárással történő kombinálása során a citopátiás hatást mutató sejtek felülúszójából DNS-t nyerünk ki, és a kinyert DNS-t polimeráz-láncreakcióval - két láncindító pár (egy expressziós vektorra specifikus és egy másik, adenovírusgenomra specifikus láncindító-DNSpár) alkalmazásával - analizáljuk. A vektor- vagy inszertspecifikus DNS - definíció szerint - olyan génszegmens, amely az expresszálni kívánt polipeptidet vagy RNS-t kódoló DNS részét képezi (például a p53DNS expressziója mRNS- vagy proteintermelődés formájában). Az adenovírusgenomra specifikus DNS a genom bármely olyan része lehet, amely az ellenőrzött szaporítási stádium során expresszálódik.
A leíráshoz csatolt ábrák szintén a leírás részét képezik, s a találmány bizonyos megvalósítási módjainak részletesebb szemléltetését teszik lehetővé. Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetését újuk le.
Az 1. ábrán a rekombináns p53-adenovírus előállításának vázlatát mutatjuk be. A p53 expressziós kazettát a pXCJL.l-vektor Xbal- és Clal-helyei közé inzertáltuk. A p53 expressziós vektort (pEC53) és a rekombináns pJM17-plazmidot együttesen 293-sejtekbe transzfektáltuk. A transzfektált sejteket a citopátiás hatás megjelenéséig a tápközegben tartottuk. Az újonnan képződött, rekombináns p53-adenovírusok (Ad5CMV-p53) azonosítását a DNS PCR-analízisével végeztük, amihez a proteináz-K-val kezelt és fenollal extra5
HU 222 981 Bl hált CPE-felülúszókból kivont DNStemplátokat alkalmaztuk.
A 2A. ábrán az Ad5CMV-p53-DNS strukturális analíziséhez alkalmazott térképet mutatjuk be, amelyen feltüntettük a p53 expressziós kazetta, a PCR-láncindítók és a restrikciós helyek elhelyezkedését. A genom mérete körülbelül 35,4 kb, melyet 100 térképegységre osztottunk (egy térképegység=O,35 kb). Az Ad5-genom El-régióját (1,3-9,2 térképegység) a p53 expressziós kazetta helyettesíti. Az 1. láncindító a humán CMV fő IE-génjének promoterétől 3’-irányban lévő első intronban helyezkedik el, míg a 2. láncindító az SV40 korai poliadenilációs szignálban található. Mindkét láncindító - a p53-cDNS mindkét végétől 15-20 bp távolságban 1,40 bp-os PCR-terméket határoz meg. A 3. és 4. láncindító az Ad5-genom 11-es, illetve 13,4-es térképegységénél helyezkedik el, s egy 0,86 kb-os vírusgenom-specifikus PCR-terméket határoznak meg.
A 2B. ábrán a PCR-termékek agarózgél-analízisének eredményeit mutatjuk be. Valamennyi reakcióban az 1,4 kb-os (p53), illetve 0,86 kb-os (Ad5) DNS-fragmenst meghatározó két láncindító párt alkalmaztuk. Az egyes reakciókban templát-DNS-ként pEC53-plazmidot (1. oszlop), Ad5/RSV/GL2 DNS-t (2. oszlop) és Ad5CMV-p53-DNS-t (4. oszlop) alkalmaztunk. Az „M” jelű oszlop a molekulatömeg-markereket tartalmazza.
A 2C. ábrán az AdCMV-p53-DNS restrikciós térképezésének eredményét mutatjuk be. A CsClgradiens alkalmazásával tisztított Ad5CMVp53-DNS-mintákat enzim nélkül (U), HindlII-mal (H), BamHI-gyel (B), EcoRIgyel (E) és Clal-gyel (C) emésztettük, és az emésztett mintákat 1%-os agarózgélen analizáltuk. Az M jelű oszlopok a molekulatömeg-markereket tartalmazzák.
A 3A., 3B., 3C. és 3D. ábrákon a 293-sejteken megfigyelt, rekombináns adenovírus okozta, citopátiás hatásokat (CPE) mutatjuk be (400-szoros nagyítású fáziskontraszt-mikroszkópos képek). A 3A. ábrán a transzfekció előtti állapot; a 3B. ábrán a negatív kontroll (a transzfekció utáni 12. napon); a 3C. ábrán a CPE megjelenése (a transzfekció utáni 12. napon); a 3D. ábrán pedig a CPE kiteljesedése (a transzfekció utáni 14. napon) látható.
A 4A., 4B., 4C. és 4D. ábrán rekombináns adenovírussal fertőzött H358-sejtek immunhisztológiai képeit mutatjuk be (az Ad5CMVp53-vírus H358-sejtekben mutatott fertőzőképessége). A H358-sejteket 24 óra hosszat, 50 PFU/sejt (PFU: plakk-képző egység) mennyiségben Ad5CMV-p53vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztük. Az álfertőzéshez csak tápközeget alkalmaztunk, A fertőzött sejteket immunfestéssel vizsgáltuk. A 4A. ábrán az álfertőzéssel kapott eredmény látható, amihez próbaként anti-p53-antitestet alkalmaztunk. A 4B. ábrán a kontroll Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőzött sejtek immunhisztológiai képe látható (próbaként anti-p53-antitestet alkalmaztunk). A 4C. ábrán Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött sejtek képe látható, melyekhez próbaként MOPC-21-antitestet alkalmaztunk. A 4D. ábrán az Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött, anti-p53-antitesttel tesztelt sejteket mutatjuk be. Az anti-p53-antitest a Pab-1801antitest volt; a festéshez az avidin-biotineljárást alkalmaztuk.
Az 5A. ábrán „Coomassie-blue”-val festett SDSPAGE-gélt mutatunk be, amelyen - H358sejtekben - az exogén p53 expressziójának relatív szintjét hasonlítjuk össze. Az Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal 30 PFU/sejt mennyiségben fertőzött H358sejtmintákat a fertőzés után 24 és 72 órával készítettük. Az SDS-poliakrilamidgél „Coomassie-blue”-festése megmutatja a felvitt proteinminták relatív mennyiségét. Az 1. és 4. oszlop az Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőzött sejtek mintáit, a 2. és 3. oszlop a két különböző Ad5CMV-p53-állománnyal fertőzött sejtek (fertőzés után 24 órával készített) mintáit, az 5. és 6. oszlop pedig az AdCMVp53-vírussal fertőzött sejtek (fertőzés után 72 órával készített) mintáit tartalmazza. A 7. oszlop az álfertőzött H358-sejtek (fertőzés után 72 órával készített) mintáját tartalmazza. Az M oszlop az előre megfestett (kD-ban megadott) molekulatömeg-markereket (GIBCO-BRL) tartalmazza.
Az 5B. ábrán az 5A. ábrán bemutatott SDS-PAGEgél oszlopbeosztásával megegyező gél „Western-blot”-analízisét mutatjuk be. A p53-expresszió relatív szintjét anti-p53antitest alkalmazásával végzett „Westemblot”-analízissel vizsgáltuk. Primer antitestekként a p53-protein elleni monoklonális antitesteket (Pab-1801; Oncogene Science Inc.), illetve β-aktin elleni monoklonális antitesteket (Amersham Inc.) alkalmaztunk. A torma-peroxidázzal konjugált második antitestet és az ECL-előhívót az Amersham Inc.-től szereztük be.
A 6. ábrán a p53-expresszió - „Westem-blot”-analízissel meghatározott - időbeli lefutását mutatjuk be. Több csészében H358-sejteket Ad5CMV-p53-vírussal fertőztünk (10 PFU/sejt mennyiségben). A sejtlizátumokat a fertőzés után a megjelölt időpontokban állítottuk elő. A „Westem-blot”-okat egyidejűleg anti-p53- és anti-aktin-antitesttel teszteltük. A 6B. ábrán látható „C” jelzé6
HU 222 981 ΒΙ sű oszlopok a negatív kontrollokat reprezentálják. A 6A. ábrán látható hisztogram a p53 (denzitométer alkalmazásával meghatározott) relatív mennyiségét mutatja.
A 7A. ábrán vírussal fertőzött, H358-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (m. o. i.; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 7B. ábrán a H322-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (MOI; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 7C. ábrán a H460-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (MOI; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 8. ábrán az Ad5CMV-p53 vírus ortotopiás tüdőrákmodellben végzett tesztelésének folyamatábráját mutatjuk be. A H226Br-sejtekkel és vírusokkal beoltott egerek adagolási és a kezelés rendjét a folyamatábrán foglaltuk össze.
A 9A., 9B., 9C. és 9D. ábrákon a kezelt és kontroliegerekből kimetszett tüdő- és mediastinummintákat mutatjuk be. Az egereket a kezelés után hat héttel öltük le. A tüdő- és mediastinumszöveteket a tumorképződés értékelése érdekében metszettük ki. A 9A. ábrán normális csupasz egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9B. ábrán hordozóval (PBS) kezelt egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9C. ábrán AD5CMV-p53-vírussal fertőzött egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9D. ábrán pedig Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőzött egerek mediasztinális blokkjának mintája látható. A nyilak a tumortömegeket mutatják.
A) A tüdőrák kifejlődésének molekuláris szintű eseményei
Vizsgálataink során olyan kulcsfontosságú molekuláris eseményeket azonosítottunk, amelyek a rák kifejlődéséhez és előrehaladásához vezetnek. Ezek azonosítása lehetővé tette, hogy új eljárásokat fejlesszünk ki bizonyos normális proteinfunkciók helyreállítására, miáltal a malignus fenotípus in vivő gátolható.
A leggyakoribb előfordulású tüdőrák (az esetek 80%-a) szövettanilag a nem kis sejtes tüdőrák („nonsmall-cell lung cancer”; NSCLC) kategóriába sorolható, s idetartozik a pikkelyes, az adenokarcinómás és a nagy sejtes, differenciálatlan tüdőrák. A tüdőrák molekuláris biológiájáról jelenleg rendelkezésre álló adatok közül sok a ritkább kis sejtes tüdőrák („small-cell lung cancer”; SCLC) tanulmányozásából származik. Az SCLC a sejtek neuroendokrinsajátságai alapján különböztethető meg az NSCLC-től; az SCLC nagyon érzékeny a kemoterápiára, de a kezelés után gyorsan kiújul. Az NSCLC más, karcinogén indukálta epiteliális rákok modelljeként is szolgál. A vizsgálatunk során kapott eredmények más típusú epiteliális rákok esetében is felhasználhatók.
Sok bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy a malignus átalakulást (transzformációt) genetikai paradigma közvetíti. A ráksejtekben kimutatott fő károsodások a domináns onkogénekben és tumorszuppresszorgénekben fordulnak elő. A domináns onkogének a protoonkogéneknek nevezett gének csoportjában (melyek a kulcsfontosságú, normális sejtfunkciókban, például a szignáltranszdukcióban és transzkripcióban vesznek részt) módosításokat mutatnak. A domináns onkogének - transzformációs képességet biztosító - elsődleges módosításai közé tartoznak a pontmutációk, transzlokációk, átrendeződések és az amplifikáció. A transzformáció bekövetkezéséhez a tumorszuppresszorgének (mutáció, deléció vagy ezek kombinációjának eredményeként bekövetkező) homozigóta funkcióvesztésére van szükség. Úgy tűnik, néhány tumorszuppresszorgén - a transzkripció szabályozása révén - szerepet játszik a proliferáció irányításában. A domináns és tumorszuppresszor-onkogének expressziójának módosítása valószínűleg befolyásolja a sejtek bizonyos jellemzőit, ami hozzájárul a malignáns fenotípus kialakulásához.
Annak ellenére, hogy az onkogén közvetítette transzformációról egyre több ismeretanyag áll rendelkezésre, az onkogéneket és termékeiket specifikusan megcélzó terápiás stratégiák kifejlesztése terén kevés előrehaladás tapasztalható. Kezdetben ezen a területen a kutatás a domináns onkogénekre koncentrálódott, mivel ezeket sikerült elsőként karakterizálni. A DNS közvetítette génátvitel vizsgálatai kimutatták, hogy a rosszindulatú emberi daganatokból származó DNS bevitelét követően a normális sejtek malignáns fenotípusúak lesznek.
B) A p53-gén és a p53-mutációk jelentősége a rákban
A p53 jelenleg tumorszuppresszorgénként ismeretes [Montenarh (1992)]. Sok - kémiai karcinogenezis7
HU 222 981 Bl sel, ultraibolya sugárzással és különböző vírusokkal, például SV40-nel - transzformált sejtben nagy mennyiségű p53-gént találtak. A p53-gén a különböző emberi tumorok mutációs inaktiválásának gyakori célpontja, s beszámoltak arról, hogy ez a gén az általános emberi rákok esetében a leggyakrabban mutált gén [Mercer (1992)]. Ez a gén a humán nem kis sejtes tüdőrák (NSCLC) eseteinek több mint felében [Hollestein és munkatársai (1991)], valamint számos más tumorban mutált.
A p53-gén egy 375 aminosavas foszfoproteint kódol, amely komplexet képezhet a gazdaproteinekkel (mint például a nagy T-antigénnel és az ElB-vel). A p53-protein megtalálható a normális szövetekben és sejtekben, de olyan koncentrációban, amely a transzformáit sejtekben vagy a tumorszövetben megfigyelhetőhöz képest elhanyagolható.
Érdekes módon, a vad típusú p53 lényeges szerepet tölt be a sejtnövekedés és -osztódás szabályozásában. A vad típusú p53 túlexpresszálásáról kimutatták, hogy emberi tumorsejtvonalakban néhány esetben antiproliferációs hatású. Ilyenformán, a p53 a sejtnövekedés negatív regulátoraként funkcionálhat [Weinberg (1991)], és közvetlenül gátolhatja a kontrollálatlan sejtnövekedést vagy közvetett módon, aktiválhatja az ilyen sejtnövekedést gátló géneket. Következésképpen, a vad típusú p53 hiánya vagy inaktiválása elősegítheti a transzformációt. Néhány vizsgálat eredményei azonban azt mutatják, hogy a gén transzformáló potenciáljának teljes kifejeződéséhez szükség lehet a mutáns p53 jelenlétére.
Bár a vad típusú p53 - az elfogadott álláspont szerint - sok sejttípusban központi jelentőségű növekedésregulátor, úgy tűnik, genetikai és biokémiai jellemzői szintén betöltenek valamilyen szerepet. A p53-gén esetében a „missense” mutációk gyakoriak, és az onkogén transzformációs képessége szempontjából kulcsfontosságúak. Egyetlen - pontmutációk okozta - genetikai változás karcinogén p53-gént eredményezhet. Más onkogénektől eltérően, a p53 pontmutációiról ismert, hogy legalább 30 különböző kodonban fordulnak elő, gyakran domináns allétokat létrehozva, melyek a sejt fenotípusában eltolódásokat okoznak, a homozigótaság felé mutató redukció nélkül. Az organizmusok sok ilyen domináns alléllal szemben toleránsak, s ezek az allétok a csíravonalban továbbadódnak. A különböző mutáns allétok természete a minimális hibás működéstől az erősen penetráns, domináns negatív allétokig teljed [Weinberg (1991)].
Casey és munkatársai beszámoltak arról, hogy a vad típusú p53-at kódoló DNS emberi emlőráksejtvonalba történő transzfektálása helyreállítja a sejtekben a növekedés gátlási kontrollját [Casey és munkatársai (1991)]. A vad típusú, de nem mutáns p53-gén emberi tüdőráksejtvonalakba történő transzfekciójával kapcsolatban hasonló hatást mutattak ki [Takahashi és munkatársai (1992)]. Úgy tűnik, a p53-gén domináns a mutáns génnel szemben, és a mutáns gént tartalmazó sejtekbe transzfektálva gátolja a proliferációt. A transzfektált p53-gén normális expressziója nem befolyásolja az endogén p53-at tartalmazó sejtek növekedését, így az ilyen konstrukciókat a normális sejtek zavaró hatások fellépése nélkül vehetik fel.
A fentiek alapján lehetséges, hogy a p53-génnel kapcsolatos rákok vad típusú p53-génnel történő kezelése csökkenti a malignus sejtek számát. A fentebb említett és más, hasonló vizsgálatok azonban e cél megvalósításától távol állnak, mivel a DNS-transzfekció nem alkalmazható a DNS - beteg testében lévő ráksejtekbe történő - bejuttatására.
C) Génterápiás eljárások
Napjainkig a génterápia számos kísérleti megközelítését ajánlották, de mindegyiknek megvan a maga hátránya [Mulligan (1993)]. Amint azt korábban említettük, léteznek alapvető transzfekciós eljárások, melyek során a kérdéses gént tartalmazó DNS-t nem biológiai módszerrel (például a sejtmembrán átjárhatóságának fizikai vagy kémiai módszerekkel történő biztosításával) juttatjuk be a sejtbe. Ez az eljárás természetesen csak olyan sejtek esetében alkalmazható, amelyek ideiglenesen eltávolíthatók a testből, s képesek tolerálni a kezelés citotoxicitását (ilyenek például a limfociták). A transzfekcióhoz alkalmazhatók liposzómák vagy bizonyos lipidekből és amfofil peptidekből kialakított proteinkonjugátumok, de ilyen esetekben a gén beépülésének (integrálódásának) hatékonysága még mindig nagyon alacsony (1000-100 000 sejtre egy integrációs esemény nagyságrend), és a transzfektált gének expressziója a proliferálódó sejtekben csupán napokra, a nem proliferálódó sejtekben pedig hetekre korlátozódik. Ennek megfelelően, a rákterápiában a DNS-transzfekció egyértelműen alkalmatlan eljárás.
Egy másik eljárás a vírusok sejtekbe jutásának természetes képességét használja ki, melynek során a vírusok saját genetikai anyagukat magukkal viszik a sejtbe. A retrovírusok génbevivő vektorokként történő alkalmazása ígéretes, mivel képesek génjeik gazdasejtgenomba történő integrálására, nagy mennyiségű idegen genetikai anyag bevitelére, igen különböző fajok és sejttípusok megfertőzésére, továbbá speciális sejtvonalakban történő „csomagolódásra” („packaging”). Mindezek ellenére, a retrovírusvektorok gyakorlati alkalmazását három fő probléma akadályozza. Először; a retrovírus fertőzőképessége a célsejt felületén a vírusreceptorok hozzáférhetőségétől függ. Másodszor; a retrovírusok csak replikációt mutató sejtekbe integrálódnak hatásosan. Végül, a retrovírusok koncentrálása és tisztítása bonyolult.
D) Génterápiában alkalmazható adenovíruskonstrukciók
A humán adenovírusok kétszálú DNS-tumorvírusok, genomjuk mérete hozzávetőleg 36 kb [Tooza (1981)]. Az adenovírusokat - az eukarióta génexpresszió modelljeként - széleskörűen tanulmányozták és részletesen karakterizálták, ami az adenovírusokat vonzóvá teszi a génbeviteli rendszerként történő kifejlesztés céljára. Az adenovírusok növesztése és manipulálása egyszerű, és in vitro, illetve in vivő egyaránt széles gazdaspektrumot mutatnak. A lírikus mértékben fertőzött sejtekben az adenovírusok képesek a gazda proteinszintézisét kikapcsolni, és a celluláris gépezetet úgy irányítani, hogy nagy mennyiségű vírusprotein, illetve a vírus bőséges mennyisége termelődjön.
HU 222 981 Bl
A genom El-régiója E1A- és ElB-gént tartalmaz, melyek a vírusgenom - és néhány celluláris gén transzkripciós szabályozásáért felelős proteineket kódolják. Az E2A- és E2B-gént tartalmazó E2-régió expressziója a virális replikációs funkciók (például DNSkötő protein, DNS-polimeráz, valamint a replikációt beindító terminális protein) szintézisét teszi lehetővé. Az E3-géntermékek megakadályozzák a citotoxikus Tsejtek és a tumomekrózis-faktor által kiváltott citolízist, s ezáltal a vírus szaporodása szempontjából lényegesek. Az E4-proteinekkel kapcsolatos funkciók közé tartozik a DNS-replikáció, a kései génexpresszió és a gazdasejt kikapcsolása. A kései géntermékek közé tartozik a legtöbb virion-kapszidprotein, és ezek csak akkor expresszálódnak, ha a fő kései promoterből származó primer transzkriptum érési folyamatának („processing”) nagyobb része már lezajlott. A fő kései promoter („major laté promoter”; MLP) a fertőzés kései stádiumában nagy hatékonyságot mutat [Stratford-Perricaudet és Perricaudet (1991/a)].
Mivel úgy tűnik, hogy a vírusgenomnak csak kis részére van szükség in cis [Tooza (1981)], az adenovíruseredetű vektorok - ha olyan sejtvonalakkal összefüggésben alkalmazzuk őket, mint a 293-sejtek - kiváló lehetőséget nyújtanak a nagy DNS-ffagmensek szubsztitúciójára. Az Ad5-tel transzformált humán embrionális vesesejtvonalat [Graham és munkatársai (1977)] azért fejlesztették ki, hogy az esszenciális vírusproteineket in trans biztosítsa. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az adenovirusok - tulajdonságaiknak köszönhetően - a ráksejtek in vivő megcélzásában történő alkalmazás tekintetében előnyös eszközként szolgálhatnak [Grunhaus és Horwitz (1992)].
Az idegen proteinek sejtbe történő bevitele szempontjából az adenovírusrendszer előnyei a következők: (1) képesek arra, hogy viszonylag nagy vírus-DNSdarabokat idegen DNS-sel helyettesítsenek; (2) a rekombináns adenovirusok szerkezetileg stabilak; (3) az adenovirusok biztonságosan adhatók be az embereknek; (4) jelenlegi ismereteink szerint az adenovírusfertőzés rákkal vagy malignus betegséggel nem áll összefüggésben; (5) a rekombináns vírus nagy titerjei érhetők el; és (6) az adenovírus nagyon fertőzőképes.
A retrovírusokkal szemben az adenovirusok további előnyei közé tartozik a magas szintű génexpresszió. Ezenkívül, a retrovírusokkal ellentétben, az adenovírusreplikáció független a gazda génreplikációjától. Mivel az adenovírus El-régiójában elhelyezkedő transzformáló gének könnyen deletálhatók, és még így is hatásos expressziós vektorokat biztosítanak, az adenovírusvektorok onkogén kockázata elhanyagolható [Grunhaus és Horwitz (1992)].
Az adenovírust alkalmazó génbeviteli rendszerek általában rekombináns, genetikailag manipulált adenovíruson alapulnak, amelyet - genomjának egy részének (például El-régiójának) deléciójával - replikációra alkalmatlanná tesznek, miközben fertőzőképessége megmarad. Az adenovírus genomjának további deléciói révén viszonylag nagy mennyiségű idegen protein expresszálható. Például, az El- és E3-régióban deletált adenovírusok 10 kb hosszúságú idegen DNS-t is képesek hordozni, és 293-sejtekben nagy mennyiségben szaporíthatok [Stratford-Perricaudet és Perricaudet (1991/a)]. Leírták azt is, hogy az adenovírusfertőzés után, meglepő módon, a transzgének tartós expressziója figyelhető meg.
Az adenovírus közvetítette génbevitelt az utóbbi időben a gének eukariótasejtekbe és élő állatokba történő bevitelének eszközeként tanulmányozták. A ritka recesszív genetikai rendellenességben, az omitin-transzkarbamiláz (OTC)-hiányban szenvedő egerek kezelésekor azt találták, hogy az adenovíruskonstrukciók felhasználhatók a normális OTC-enzim biztosítására. Az OTC normális szintű expresszióját sajnos 17 eset közül csak négyben sikerült elérni [Stratford-Perricaudet és Perricaudet (1991/b)]. Következésképpen, a defektust a legtöbb egérben csak részlegesen sikerült kijavítani, ami nem vezetett fiziológiai vagy fenotípusos változáshoz. Az ilyen eredmények kevés ösztönzést nyújtanak az adenovírusvektorok rákterápiában történő alkalmazásához.
Azok a kísérletek, melyek során a húgyhólyagfibrózis transzmembránkonduktancia-regulátorát (CFTR) kódoló gén patkány tüdőhámjába történő bevitelére adenovírust alkalmaztak, csak részben voltak sikeresek, bár az állatok hámjában nem volt lehetőség a bevitt gén biológiai aktivitásának értékelésére [Rosenfeld és munkatársai (1992)]. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy tüdő légúti sejtjeiben a génbevitel és a CFTR-protein expressziója sikeres volt, de fiziológiai hatást nem sikerült kimutatni. Rosenfeld és munkatársai [Science (1991)] leírták, hogy az αΐ-antitripszinprotein expresszióját kimutatták a tüdőben, de nekik sem sikerült fiziológiai hatást megfigyelniük. Az expresszió szintjét az emberi tüdő védelméhez szükséges szint kb. 2%-ának becsülték, ami messze a fiziológiai hatás kifejtéséhez szükséges szint alatt marad.
A humán cq-antitripszin génjét intraportális injekcióval normális patkányok májába vitték be. A májban a gén expresszálódott, és a patkányokban a bevitt humán protein vérplazmába történő szekrécióját eredményezte [Jaffe és munkatársai (1992)], azonban a kapott proteinszint nem volt elég a terápiás hatás kifejtéséhez.
Ezek az eredmények nem bizonyítják azt, hogy a rekombináns sejtekben az adenovírus képes lenne a megfelelő protein - fiziológiailag releváns hatást biztosító - expresszióját irányítani, következésképpen arra sem utalnak, hogy az adenovírusrendszer hasznos lenne a rákterápiában. A találmány szerinti megoldás kidolgozása előtt úgy gondoltuk, hogy a p53 nem foglalható - például az adenovírus előállításához alkalmazott - „csomagolósejtbe” („packaging cell”), mivel toxikus hatású lehet. Mivel az adenovírus ElB-proteinje kötődik a p53-hoz, úgy véltük, hogy ez további okát képezi annak, hogy az adenovírus nem kombinálható a p53-technológiával.
E) p53-adenovíruskonstrukciók és a tumorszuppresszió
A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk egy rákgénterápiás eljárást, melyet egy új és az eddigieknél hatásosabb tumorszuppresszor-vektor alkalma9
HU 222 981 Bl zásával végzünk. Ezzel a rekombináns vírussal kihasználhatók az adenovírusvektorok előnyei, úgymint a nagy titer, a széles célsejtspektrum, a hatékony transzdukció és a célsejtek genomjába való beépülés hiánya. A találmány egyik megvalósítási módja szerint egy hibás replikációjú, „helper’-fuggetlen adenovírust állítunk elő, amely humán citomegalovírus-promoter szabályozása alatt vad típusú p53-at (Ad5CMV-p53) expresszál.
Ha az expressziót emlőssejtekben kívánjuk végrehajtani, az expressziós vektorok szabályozóelemeiként gyakran vírusokból származó elemeket alkalmazunk. Például, az általánosan alkalmazott promoterek poliomavírusból, adenovírus-2-ből és SV40-ből származnak. Az SV40-vírus korai és kései promoterei különösen előnyösek, mivel mindkettő olyan fiagmensként nyerhető ki a vírusból, amely SV40 replikációs kezdőhelyet is tartalmaz. Kisebb vagy nagyobb SV40-fragmensek szintén alkalmazhatók, feltéve, hogy tartalmazzák a HindlIIhelytől a - virális replikációs kezdőhelynél lévő - BglIhelyig terjedő, hozzávetőleg 250 bp-os szekvenciát. Olyan promoterek és szabályozószekvenciák alkalmazása is lehetséges - és gyakran kívánatos -, amelyek normális esetben kapcsolatban állnak a vektorba foglalt génszekvenciával, feltéve, hogy az ilyen szabályozószekvenciák kompatibilisek a gazdasejttel.
A replikációs kezdőhely biztosítható oly módon, hogy a vektorba exogén kezdőhelyet, például SV40-ből vagy más vírusból (poliomavírusból, adenovírusból, VSV-ből, BPV-ből) származó kezdőhelyet foglalunk, illetve biztosítható a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa révén is. Amennyiben a vektor integrálódik a gazdasejt kromoszómájába, az utóbbi lehetőség gyakran megfelelő.
Az előnyös p53-adenovírus kialakításának és szaporításának menetét az 1. ábrán mutatjuk be. A rekombináns adenovírus szaporításához és azonosításához javított eljárást fejlesztettünk ki (ld. később). Azonosítás után a rekombináns p53-adenovírus szerkezetét PCRanalízissel igazoltuk (ld. 2. ábra). A p53-adenovírust izolálása és szerkezetének igazolása után - a (p53-gén homozigóta delécióját hordozó) H358 humán tüdőráksejtvonal fertőzésére alkalmaztuk. „Westem-blot”-analízissel kimutattuk, hogy az exogén p53-protein magas szinten expesszálódott (4. és 5. ábra), és expressziója a fertőzés utáni 3. napon érte el csúcsát (6. ábra).
Egy p53-pontmutációt hordozó H322-sejtvonalban kimutattuk azt is, hogy a mutáns p53-at az exogén p53 expressziója leszabályozta. A kísérlethez kontrollként az Ad5/RSV/GL2 viriont alkalmaztuk, amely szerkezetileg hasonló az Ad5CMV-p53-vírushoz. Ez a virion - expressziós kazettájában - a Rous-szarkómavírus LTR-promotere által irányított luciferáz-cDNS-t tartalmazott. Az Ad5/RSV/GL2 virionnal fertőzött sejtekben sem p53-expressziót, sem az aktinexpresszió változását nem tapasztaltuk. Az Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött H358-sejtek növekedése nagymértékben gátolt volt, szemben a nem fertőzött, illetve a kontrollvirionnal fertőzött sejtek növekedésével (7A. ábra). A H322-sejtek növekedését a p53-virion szintén nagymértékben gátolta (7B. ábra), míg a vad típusú p53-at tartalmazó humán H460-tüdőráksejtek növekedése kevésbé volt gátolt (7C. ábra).
Az Ad5CMV-p53-vírus a tüdőráksejtek növekedésére in vitro erős gátló hatást gyakorolt. A növekedés gátlása nem volt egyértelmű abban az esetben, ha a sejteket 1 PFU/sejtnél kisebb fertőzési multiplicitással fertőztük az Ad5CMV-p53-vírussal, míg a 100 PFU/sejtnél nagyobb fertőzési multiplicitásnál még a kontroll Ad5/RSV/GL2 vírus esetében is citotoxicitás figyelhető meg. Kísérleteink során a növekedési sebesség vizsgálatához optimális dózis 10-50 PFU/sejt volt. E dózistartományon belül a sejtnövekedés gátlása az expresszált p53-protein hatásának tudható be.
A csupasz egerekkel végzett tesztek bizonyították, hogy az Ad5CMV-p53-vírussal kezelt H358-sejtek tumorképző hajlama nagymértékben gátolt volt. Az ortotopiás tüdőrák egérmodelljében a tumorképző sajátságú H226Br-sejteket (melyek a p53-génben pontmutációt tartalmaznak) a vírussal végzett kezelés előtt három nappal, légcsövön keresztül adtuk be az egereknek. Az Ad5CMV-p53-vírus légcsövön keresztül történő (intratracheális) becseppentése e modellben megakadályozta a tumorképződést, ami arra utal, hogy a módosított adenovírus hatásos vektor a tumorszuppresszorgének humán ráksejtekbe történő beviteléhez és expresszálásához, és az Ad5CMV-p53-vírusból rák elleni génterápiában alkalmazható terápiás szer fejleszthető ki.
Amint a „Westem-blot”-analízissel kimutattuk, az Ad5CMV-p53-vírus a humán tüdőráksejtekben a p53gén magas szintű expresszióját biztosította. Az exogén p53-protein H460-sejtekben az endogén, vad típusú p53protein mennyiségéhez viszonyítva hozzávetőleg 14szeres, H358-sejtekben a β-aktin belső kontrollmennyiségéhez viszonyítva pedig kb. 2-4-szeres mennyiségben volt jelen. A magas szintű expresszió (1) a rendkívül hatékony génbevitelnek; (2) a p53-cDNS-t irányító erős CMV-promotemek; és (3) a p53-cDNS transzkripcióját fokozó adenovirális El-erősítőszekvenciának („enhancer”) tudható be. H358-sejtekben a p53-expresszió a fertőzés után több mint 15 napig folytatódott, azonban a fertőzés utáni 5. napon az expresszió gyors csökkenése volt megfigyelhető. A fertőzött H358-sejtekből származó DNS-minták PCR-analízise azt mutatta, hogy a vírusDNS szintje a csökkenő proteinszintnek megfelelően csökkent, ami azt jelzi, hogy a vírus-DNS a ráksejtek folyamatos in vitro növekedése alatt elvész.
A p53-expresszió csökkenését a - p53-expressziót irányító - CMV-promoter celluláris csillapítása is eredményezheti, hiszen a CMV-promoter gazdasejt közvetítette kikapcsolását korábban leírták [Dai és munkatársai (1992)]. Az adenovírusvektorok nem integrálódó génbevivő vektorok, így a génexpresszió időtartama számos tényezőtől - köztük a gazdasejtektől, a bevitt génektől és a releváns promotertől - függ. Crystal és munkatársai kimutatták, hogy patkányhámsejtekben a húgyhólyagfibrózis transzmembránkonduktancia-regulátor gén alacsony szintű expressziója a fertőzést követően hat héttel volt detektálható [Rosenfeld és munkatársai (1992)]. Perricaudet laboratóriumában kimutat10
HU 222 981 Bl ták, hogy mdx-egér izmában a minidystrophingén minimális szintű expressziója a fertőzés után három hónapig tartott. Az általunk végzett vizsgálatban a vad típusú p53-protein rövid ideig tartó, magas szintű expressziójának az lehet az előnyös hatása, hogy az Ad5CMV-p53-vírussal végzett in vivő kezelést követően csökkenti a normális sejteket károsító esetleges mellékhatásokat.
Az itt leírt vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy a rekombináns p53-adenovírus tumorszuppresszív tulajdonságokat hordoz, ami valószínűleg a tumorsejtekben a p53-protein működésének helyreállításával fejti ki hatását.
F) Javított eljárás a rekombináns adenovírus szaporítására és azonosítására
A rekombináns adenovírusnak - mint új génbeviteli rendszernek - a génterápia és a vakcinák kifejlesztése terén számos lehetséges alkalmazása létezik. Ennek megfelelően, a rekombináns adenovírus szaporítása jelentős molekuláris biológiai eszköz. A rekombináns adenovírus szaporításának létező eljárásai során a 293sejtek kalcium-foszfátos kicsapással végzett transzfekcióját és a transzfektált sejtek plakkanalízisét alkalmazzák. Ezen eljárás transzfekciós hatékonysága javításra szorul, míg maga az eljárás egyszerűsíthető.
A találmány szerinti megoldás megszületése előtt a rekombináns adenovírus szaporítása hagyományosan a kalcium-foszfát közvetítette transzfekcióval történt. Ezen eljárás során a sejteket - kalcium-foszfát-oldatban, több órán át - érintkezésbe hozzák a vektorvagy plazmid-DNS-sel, majd rövid ideig, például egy percig, 15%-os glicerinnel kezelik. Az ilyen eljárások jelentős hátránya, hogy a sejtbe csak nagyon kevés DNS épül be, vagyis a transzfekció nagyon alacsony szintű. A vírus szaporodását rendszerint a plakkok megjelenése jelzi, amelyek a lizált sejtek körül megjelenő kerek, világos foltként figyelhetők meg, s amelyek azt mutatják, hogy a sejt lízise a vírus szaporodása következtében bekövetkezett.
Az adenovírus szaporítására kifejlesztettünk egy új eljárást, amely jelentős mértékben fokozza a transzfekciós hatékonyságot, továbbá egyszerűsíti a szelekciót. Felismertük, hogy a liposzóma közvetítette transzfekció (például a DOTAP közvetítette transzfekció) és a citopátiás hatás (CPE) megfigyelésének kombinálása fokozott transzfekciós hatékonyságot, valamint gyors és egyszerű detektálást eredményez. A találmány szerinti új eljárásban egy expressziós vektor és egy rekombinációs plazmid 293-sejtekbe történő transzdukciójára DOTAP-liposzóma közvetítette génbevitelt alkalmazunk. A transzfektált sejteket - ahelyett, hogy a plakkanalízishez 0,5%-os agarózzal lefednénk - a citopátiás hatás (CPE) megfigyelése céljából folyamatosan MEM-tápközegben tartjuk.
Az új eljárás alkalmazásával végzett két kísérletben egy 24 üregű tálca két üregében, öt 60 mm-es csésze közül pedig háromban figyeltünk meg - az együttes transzfekció utáni 10., illetve 12. napon - citopátiás hatást. Ezzel szemben, a kalcium-foszfátos kicsapási eljárás alkalmazásával három (egyenként húsz 60 mm-es csésze alkalmazásával végzett) kísérlet egyikében sem kaptunk rekombináns vírusokat. Hep-G2- és HeLa-sejtekben CAT-vizsgálatot alkalmazva a DOTAP közvetítette transzfekció ötször nagyobb CAT-aktivitást eredményezett, mint a kalcium-foszfátos transzfekció.
Az együttes transzfekció utáni agarózos lefedés elhagyása tovább egyszerűsítette az eljárást. A vírus szaporodásának értékelése sokkal egyszerűbbé és egyértelműbbé válik, mivel a rendszerint nem egyértelmű - és 10-14 napos inkubálás után nehezen meghatározható - plakkok azonosítása helyett közvetlenül a citopátiás hatásokat vizsgáljuk. A 3. ábrán citopátiás hatást mutató sejttenyészetet citopátiás hatást nem mutató sejttenyészettel hasonlítunk össze.
Kifejlesztettünk továbbá egy gyors eljárást az adenovírustiterek - polimeráz-láncreakcióval történő meghatározására. A citopátiás hatást mutató sejttenyészetek felülúszójából származó DNS-minták közvetlen PCR-analízise során két láncindító párt alkalmazunk; az egyiket az inszertspecifikus, a másikat a vírusgenom-specifikus szekvenciák amplifikálásához. Kimutattuk, hogy a sejttenyésztő tápközegbe kibocsátott adenovírusok polimeráz-láncreakcióval kimutathatók, ami a DNS-templátok előállításához mindössze 50 μί felülúszó alkalmazását teszi lehetővé.
A PCR-amplifikációból származó, inszertspecifikus és vírusgenom-specifikus DNS-szekvenciák például az amplifikált termékek agarózgélen végzett analízisével azonosíthatók. Az inszertspecifikus DNS-nek és a vírusgenom-specifikus DNS-nek (valamint a láncindítóknak) megfelelő sávok alkalmas standard molekulatömeg-markerekkel történő összehasonlítás alapján azonosíthatók.
Ha az inszertspecifikus és vírusgenom-specifikus géntermékek amplifikálására polimeráz-láncreakciót alkalmazunk, elsőként az amplifikálni kívánt szekvenciákra specifikus láncindítót kell készítem. A hatékony és szelektív amplifikáció két láncindító pár alkalmazásával valósítható meg: az egyik párt az inszertspecifikus termék meghatározott szakaszának amplifikálására, a másik párt a vírusgenom-specifikus termék egy bizonyos szakaszának amplifikálására alkalmazzuk. Kizárólag példaként említjük, hogy a p53 expressziós kazettát humán citomegalovírus (CMV)-promoter és SV40 korai poliadenilációs jel alkalmazásával állítottuk elő. Az első láncindító pár a humán CMV fő IE-génjének promoterétől 3’-irányban elhelyezkedő első intronban található láncindítóból és az SV40 korai poliadenilációs szignálban elhelyezkedő másik láncindítóból áll. Ideális esetben mindkét láncindító a cDNS-inszerttől - amely példánkban a p53 - 15-20 bázispár távolságra helyezkedik el.
Ki kell választani egy meghatározott PCR-terméket, például egy 1,40 kb-os p53-cDNS-t. A második láncindító pár például az Ad5-genom 11-es és 13,4-es térképegységénél helyezkedhet el, miáltal egy 0,86 kbos, vírusgenom-specifikus PCR-terméket határoz meg.
A láncindítók szelekciója a szakemberek számára jól ismert. Ismert nukleotidszekvenciájú DNS-szekvenciák kiválasztott szakaszainak amplifikálásához megfelelő
HU 222 981 Bl láncindítókat alakíthatunk ki. A láncindítók a DNS-hez hibridizálódnak, és a gén egy szakasza szintézisének kezdőhelyeként szolgálnak. A láncindító oligonukleotidokat úgy alakítjuk ki, hogy az egymással szemben álló duplex szálak különböző helyeihez kötődjenek, s a közbeeső szekvenciát az amplifikálni kívánt szakaszként határozzák meg. A láncindítóként alkalmazni kívánt nukleinsavmolekulák szekvenciája általában legalább 10 bázispár hosszúságú, és komplementernek kell lennie az amplifikálni kívánt DNS-szegmenshez. A 10 bázispáros méretet általános alsó határként tekintjük, mert előfordulhat, hogy a 10 bázisnál rövidebb oligonukleotidok nem hibridizálódnak hatásosan, és a stabilizáció problémát jelenthet. Előnyösen 15-20 bp méretű láncindítókat alkalmazunk, míg a találmány egy előnyös megvalósítási módjában az 1. ábrán látható láncindító párt használjuk, amelynek mérete 19 vagy 20 bp.
G) Páciensek és kezelési eljárások
Úgy tartjuk, hogy a p53-mal kapcsolatos rákos betegségben (például műtéti úton el nem távolítható, a légutakat eltömítő endobronchiális rákban) szenvedő betegek esetében az adenovirális p53-génkonstrukciók tüdőráksejtekbe történő helyi bevitele nagyon hatásos eljárása a terápiás szempontból hatásos gén - betegséget leküzdő célú - bevitelének. E megoldást jelentős fejlesztésnek tartjuk azokhoz a jelenlegi rákterápiákhoz képest, amelyek a rákos sejtek legutolsó darabig történő elpusztításán vagy eltávolításán alapulnak. Mivel a tumorsejtek nyugalmi állapota ismert jelenség, ez nagyon valószínűtlenné teszi hatékony elpusztításukat.
Arra számítunk, hogy az adenovíruskonstrukciók nem kis sejtes tüdőráksejtek (NSCLC) által történő felvétele csökkenti az ilyen sejtek proliferációjának sebességét. Ez megnövelheti azt az időtartamot, amíg az érintett tüdő feszes marad, megakadályozhatja az endobronchiális (hörgőn belüli) tumor újbóli növekedését, és meghosszabbíthatja a beteg életben maradását.
A fenti eljárást azon betegek számára tartjuk előnyösnek, akikben a műtéti úton el nem távolítható (a légutakat részlegesen vagy teljesen elzáró) endobronchiális tumor kiújult, és akik nem kaphatnak külső sugárkezelést. Az ilyen betegség jelenlegi terápiái csak rövid idejű, átmeneti javulást eredményeznek; a legtöbb betegben a külső sugárkezelés ellenére is kiújul a rák. Behelyezhetünk brachyterápiás katétert is, és további sugárkezelést adhatunk. Az ilyen kezelésen átesett betegek átlagos túlélési ideje hat hónap. A sikertelen brachyterápián átesett betegek szintén alkalmasak lehetnek a génterápiára. A légutakból a tumor lézerrel vagy biopsziacsipesszel távolítható el. Ez az adenovíruskonstrukciók injektálásával együtt végezhető, ami csökkenti az injektáláshoz szükséges térfogatot. A víruskonstrukciók beadása nem zárja ki annak lehetőségét, hogy - a tumor előrehaladása esetén - a beteg tüneti kezelést is kapjon.
Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módjait kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a példákban leírt eljárások, melyek az általunk kidolgozott eljárásokat reprezentálják, a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során jól működnek, s ilyenformán a találmány előnyös megvalósítási módjainak tekinthetők. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől, és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
1. példa p53 expressziós vektor előállítása
Ebben a példában egy p53 expressziós vektor előállítási eljárását ítjuk le. Ezt a vektort a megadott módon állítjuk elő, és az Ad5-adenovírustörzs genomja El-régiójának (1,3-9,2 térképegység) helyettesítésére, valamint a 2. példában leírt adenovírusvirion előállítására alkalmazzuk.
Az 1. ábrán bemutatott p53 expressziós kazettát amely humán citomegalovírus-promotert [Boshart és munkatársai (1985)], p53-cDNS-t és SV40 korai poliadenilációs szignált tartalmaz - a pXCJLl-vektor [melyet Dr. Frank L. Grahamtől („McMaster University”, Kanada) kaptunk] Xbal- és Clal-helyei közé inszertáltuk.
A genom mérete körülbelül 35,4 kb, melyet 100 térképegységre osztottunk (1 térképegység=0,35 kb). A p53 expressziós kazetta az Ad5-genom El-régióját (1,3-9,2 térképegység) helyettesítette.
Az 1. láncindító (5’-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3’; 1. azonosító számú szekvencia) a humán CMV fő IE-génjének promoterétől [Boshart és munkatársai (1985)] 3’-irányban helyezkedik el. A 2. láncindító (5’-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3’; 2. azonosító számú szekvencia) az SV40 korai poliadenilációs szignálban helyezkedik el. A két láncindító a p53cDNS mindkét végétől 15-20 bp távolságban 1,40 kbos PCR-terméket határoz meg. A 3. láncindító (5’TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3; 3. azonosító számú szekvencia) és a 4. láncindító (5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’; 4. azonosító számú szekvencia) az Ad5-genom 11-es, illetve 13,4-es térképegységénél helyezkedik el, és egy 0,86 kb-os, vírusgenomspecifikus PCR-terméket határoznak meg.
2. példa
A rekombináns p53-adenovírus előállítása és szaporítása
Ebben a példában a p53-at expresszáló, „helper”független rekombináns adenovírusok előállítási eljárását ítjuk le. A rekombináns adenovírus előállításához alkalmazott molekuláris stratégia azon a tényen alapul, hogy a pJM17-plazmid - az adenovírus csomagolási („packaging”) korlátja miatt - önmaga nem képes vírust képezni. A transzfektált sejten belül a p53 expressziós plazmidvektor és a pJM17-plazmid közötti homológ rekombináció életképes vírust eredményez, amely csak olyan sejtekben csomagolható, amelyek expresszálják a szükséges adenovírusproteineket.
Az eljárás során - az El- vagy E3-régiókban a heterológ DNS-expressziós kazetták szubsztitúcióit tartalmazó - vírusok szaporításához gazdasejtként 293-sejte12
HU 222 981 Bl két alkalmazunk. Az eljáráshoz a DNS 293-sejtekbe történő együttes transzfekciójára van szükség. A transzfekció nagymértékben meghatározza a vírusszaporítás hatékonyságát. A találmány szerinti megoldás megszületése előtt a DNS 293-sejtekbe történő transzfektálásához rendszerint a kalcium-foszfát/DNS együttes kicsapási eljárást [Graham és van dér Eb (1973)] alkalmazták, azonban ez az eljárás - a plakkanalízissel együtt - viszonylag bonyolult, és jellemzően alacsony hatékonyságú vírusszaporítást eredményez. Ahogy azt ebben a példában is leítjuk, a transzfekció és a fertőzött sejtek későbbi azonosításának hatékonyságát - liposzóma közvetítette transzfekcióval és a transzfektált sejtek citopátiás hatás (CPE) alapján történő azonosításával - jelentős mértékben javítottuk.
A 293-as sejtvonalat - 10% hővel inaktivált lószérummal kiegészített - Dulbecco-féle módosított minimális esszenciális tápközegben tartottuk. A homológ rekombináció érdekében a p53 expressziós vektort és a pJM17plazmidot [McGrory és munkatársai (1988)] DOTAP közvetítette transzfekcióval - melyet a gyártó (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992) útmutatásai szerint végeztünk - együttesen 293-sejtekbe transzfektáltuk. Ennek menetét vázlatosan az 1. ábrán mutatjuk be.
A 293-sejteket (35 passzálás, 60%-os konfluens állapot) a transzfektálás előtt 24 órával, 60 mm-es csészékbe vagy 24 üregű tálcákra helyeztük. Az egyes üregekben lévő sejteket 30 pl DOTAP, 2 pg p53 expressziós vektor és 3 pg pJM17-plazmid elegyével transzfektáltuk. A transzfektálás után a sejteken - a citopátiás hatás megjelenéséig - két-három naponként kicseréltük a MEM-tápközeget.
3. példa
A rekombináns adenovírusok azonosságának igazolása
Ebben a példában a megfelelő sejtvonal transzfektálását követően a rekombináns virionok azonosságának új, polimeráz-láncreakciós (PCR) vizsgálatát mutatjuk be.
A sejttenyészeti felülúszók aliquotjait (50-370 pl) összegyűjtöttük a tesztelőtálcákról, 56 °C-on egy óra hosszat (0,5% SDS-t és 20 mM EDTA-t tartalmazó) 50 pg/ml koncentrációjú proteináz-K-val kezeltük, fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd a nukleinsavakat etanollal kicsaptuk. A DNS-üledéket 20 pl desztillált vízben újraszuszpendáltuk, s az így kapott szuszpenziót a PCR-amplifikációhoz templátként alkalmaztuk. A PCR-láncindítók egymáshoz viszonyított elhelyezkedését, illetve szekvenciáikat az 1. ábrán, illetve a szekvencialista 1., 2., 3. és 4. azonosító számú szekvenciájában mutatjuk be. A cDNS-inszertspecifikus láncindítók 1,4 kb-os PCR-terméket, a vírusgenomspecifikus láncindítók pedig 0,86 kb-os PCR-terméket határoznak meg. A polimeráz-láncreakciókat 4 mM MgCl2-ot, 50 mM KCl-ot, 0,1% „Triton-X-100”-at, mindegyik dNTP-ből 200 pM-t, 10 mM Tris-Cl-puffert (pH=9,0), mindegyik láncindítóból 2 pM-t és 1,0 egység Taq-polimerázt (Promega) tartalmazó, 50 pl térfogatú reakcióelegyben végeztük. A reakciókat 30 ciklussal (94 °C-on 0,5 percig, 56 °C-on 0,5 percig és 72 °Con 1 percig) végeztük.
Az újonnan szaporított vírusok azonosítási eljárásának egyszerűsítése érdekében sejttenyészeti felülúszóból származó DNS-mintákon végzett közvetlen PCR-analízist fejlesztettünk ki. A citopátiás hatást mutató sejtek tápközege felülúszójának aliquotjait (50 pl vagy 370 pl) proteináz-K-val kezeltük, majd fenol/kloroform eleggyel extraháltuk. Etanolos kicsapást követően a DNS-mintákat - inszertspecifikus és vírusgenom-specifikus szekvenciák amplifikálása céljából két láncindító pár alkalmazásával - polimeráz-láncreakcióval analizáltuk. A PCRláncindító szekvenciákat és fogadó- („target”) szekvenciáikat az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1.,2., 3. és 4. láncindítót a szekvencialista 1., 2., 3., illetve 4. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be.
A polimeráz-láncreakció eredményeként az expressziós vektorból (pozitív kontroll) és a pozitív sejttenyészetből származó DNS-mintákból egy 1,4 kb-os cDNS-inszertet és egy 0,86 kb-os vírusgenomfragmenst amplifikáltunk (2B. ábra, 1., illetve 4. oszlop). Az Ad5/RSV/GL2 vírusból származó DNS-mintából (negatív kontroll) csak a 0,86 kb-os fragmenst sikerült amplifikálni (2B. ábra, 2. oszlop). A kezeletlen pozitív sejtek tenyésztő tápközegének felülúszójának polimeráz-láncreakciójával amplifikált sávokat nem kaptunk (2B. ábra, 3. oszlop).
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a sejttenyésztő tápközegbe felszabadult adenovírusok - a DNS-templátok előállításához mindössze 50 pl tápközeg-felülúszó alkalmazásával végzett - polimeráz-láncreakcióval kimutathatók. Ezek az eredmények lehetővé teszik egy kvantitatív eljárás kifejlesztését, amellyel e technika felhasználható az adenovírustiterek - hagyományosan plakkanalízissel végzett - meghatározásához.
Az Ad5CMV-p53-vírus p53-cDNS-ének vad típusú szekvenciáját a CsCl-gradiens alkalmazásával tisztított vírus-DNS szekvenálásával ellenőriztük. A hasonló módon előállított, kontroll Ad5/RTSV/GL2 vírus szerkezete hasonlít az Ad5CMV-p53-vírus szerkezetéhez, azzal a különbséggel, hogy expressziós kazettájában Rousszarkóma-vírus-promotert és luciferáz-cDNS-t alkalmaztunk. Az E. coli β-galaktozidáz-gént (LacZ) hordozó rekombináns Ad5CMV-LacZ-adenovírus (melyet Dr. Frank L. Grahamtől kaptunk) szerkezete szintén hasonló az Ad5CMV-p53-víruséhoz.
Az Ad5CMV-p53-, Ad5/RSV/GL2 és Ad5CMVLacZ-vírusok egyedi kiónjait Graham és Prevec (1991) eljárása szerint végzett plakktisztítással kaptuk. Az egyes vírusklónokat 293-sejtekben szaporítottuk. A kiteljesedett citopátiás hatást mutató 293-sejtek tenyésztő tápközegét összegyűjtöttük, és 1000 χ g-vel 10 percig centrifugáltuk. Az összeöntött felülúszókat aliquotokra osztottuk, és -20 °C-on vírusállományokként tároltuk. A vírustitereket plakkanalízissel határoztuk meg [Graham és Prevec (1991)]. A sejtvonalak fertőzése érdekében a 60 mm-es csészékben egy rétegben elhelyezett sejtekhez szobahőmérsékleten, 30 percre - csészénként 0,5 ml - vírusoldatot adtunk, és ötpercenként rövid keverést végeztünk. A sejtekhez ezután hozzáadtuk a tenyésztő tápközeget, és a fertőzött sejteket 37 °C-os inkubátorba helyeztük.
HU 222 981 Bl
A rekombináns adenovírusok génbeviteli hatékonyságát különböző sejtvonalakban (például H226Br, H332, H460, HeLa, Hep-G2, LM2 és Verő) Ad5CMV-LacZvírus alkalmazásával is értékeltük. E vírus 30 PFU/sejt dózisával végzett fertőzés után a sejtvonalak - X-galfestéssel - 97-100%-os kék festődést mutattak.
4. példa
Ad5CMV-p53 irányította p53-gén-expresszió emberi tüdőráksejtekben
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus homozigóta p53-deléciót hordozó - emberi tüdőráksejtek fertőzésére történő alkalmazását írjuk le. Az eredmények azt mutatják, hogy az ilyen sejtek növekedése és a mutáns p53 expressziója gátlás alá került, ami arra utal, hogy az Ad5CMV-p53-virion a metasztázisos sejtek kontrollálásának hatásos eszköze lehet.
A 3,8%-os formáimnál fixált és metanolban 3%-os hidrogén-peroxiddal 5 percig kezelt egyrétegű, fertőzött sejtekkel immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, amihez „Vectastatin Elité” reagenskészletet (Vector, Burlingame, CA) alkalmaztunk. Primer antitestként a Pab-1801 anti-p53-antitestet (Oncogene Science, Manhasset, NY) alkalmaztuk. Negatív kontrollként MOPC-21-antitestet (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) használtunk. Második antitestként avidinnal jelölt antiegér-IgG-t (Vector) alkalmaztunk. Az antigénantitest komplex kimutatásához biotinilált torma-peroxidáz-ABC-komplex reagenst alkalmaztunk. A sejteket végül „Harris hematoxilin”-nal (Sigma) utánfestettük, és „Cytoseal 60”-nal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) tárgylemezre rögzítettük.
A fertőzött sejtek immunhisztokémiai vizsgálatát a p53 - Ad5CMV-p53-vírus CMV-promotere által irányított - in situ expressziójának vizsgálata érdekében végeztük. A H358-sejtvonalban - amely homozigóta p53-deléciót hordoz - a p53-gén bevitele 97-100%-os hatékonyságú volt, ha a sejteket 30-50 plakk-képző egység/sejt (PFU/sejt) fertőzési multiplicitással fertőztük (4. ábra).
A rekombináns adenovírus nagy génbeviteli hatékonyságát Ad5CMV-LacZ-vírussal is igazoltuk. Ez a vírus a LacZ-gént hordozza, melynek transzkripcióját a humán CMV-IE-promoter irányítja. 30-50 PFU/sejt fertőzési multiplicitásnál valamennyi vizsgált sejtvonal (HeLa-, Hep-G2-, LM2- és a humán NSCLC-sejtvonal) - X-galfestéssel vizsgálva - 97-100%-ban pozitív volt a galaktozidázaktivitásra. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az adenovírusvektorok hatásos hordozókként alkalmazhatók a gének emberi ráksejtekbe történő bevitelében.
A csészékben lévő egyrétegű sejttenyészet foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) végzett mosását követően a sejtek SDS-PAGE-pufFerrel (0,5 ml/60 mm-es csésze) történő lízisével készített teljes sejtlizátumokkal „Westem-blot”-analízist végeztünk. Az SDS-poliakrilamidgélekre 5xl04 sejtnek megfelelő mennyiségű (10-15 ml) sejtlizátumot vittünk fel. A gélen lévő proteineket Hybond™-ECL-membránra (Amersham, Arlington Heights, IL) másoltuk. A membránokat PBS-ben 0,5% tejporral blokkoltuk, és próbaként a primer antitestekkel [Pab-1801 monoklonális antihumán-p53-antitest és monoklonális egér antihumán-p-aktin-antitest (Amersham)] teszteltük, mostuk, majd a torma-peroxidázzal konjugált nyúl antiegér-IgG másodlagos antitesttel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) teszteltük. A membránokat az Amersham-féle erősített kemilumineszcenciaeljárással hívtuk elő. Az expresszált exogén p53 relatív mennyiségét denzitométerrel (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) határoztuk meg.
A „Westem-blot”-analízis eredménye azt mutatta, hogy az exogén p53-protein magas szinten expresszálódott (5A. ábra; 2., 3., 5. és 6. oszlop). Az expresszált protein mennyisége a 3. napon érte el maximumát (6. ábra, 0,5-3. napig). Kontrollként az 1. példában leírt rekombináns Ad5CMV-p53-víruséhoz hasonló szerkezetű viriont állítottunk elő, amely expressziós kazettájában Rous-szarkóma-vírus-LTR-promoter szabályozása alatt álló luciferáz-cDNS-t tartalmaz. Az Ad5/RSV/GL2 virionnal fertőzött sejtekben sem a p53-expressziót, sem az aktinexpresszió változását nem tapasztaltuk.
A rekombináns p53-adenovírust három emberi NSCLC-sejtvonal - H358 (amely a p53-gén homozigóta delécióját hordozza), H322 (amely a 248. kodonnál a p53-gén pontmutációját [G-»T] hordozza) és H460 (amely vad típusú p53-gént tartalmaz) - fertőzésére alkalmaztuk. Az emberi NSCLC-sejtek növekedési sebességének meghatározásához a H322- és H460-sejteket lxlO5 mennyiségben, a H358-sejteket pedig 2xl05 mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük (a vírusfertőzés előtt 24 órával). A sejteket 10 PFU/sejt fertőzési multiplicitással fertőztük meg. Az álfertőzött kontroll esetében tenyésztő tápközeget alkalmaztunk. Mindegyik sejtvonal esetében három tenyészetet készítettünk, melyeket a két vírussal, illetve tápközeggel kezeltünk, és a sejteket a fertőzést követő első hat napon naponta számoltuk.
Az Ad5CMV-p53-viriormal fertőzött H358-sejtek növekedése - az álfertőzött sejtekéhez és a kontrollvirionnal fertőzött sejtekéhez képest - nagymértékben gátolt volt (7A. ábra). A H322-sejtek növekedését a p53virion szintén nagymértékben gátolta (7B. ábra), míg a vad típusú p53-gént tartalmazó H460-sejtek növekedését csak kisebb mértékben (7C. ábra). Az Ad5CMVp53-vírussal fertőzött H358-sejtek növekedésének gátlása 79%-os volt, míg a nem fertőzött, illetve a kontrolivírussal fertőzött sejtek növekedése nem volt gátolt. Az Ad5CMV-p53-vírus a - p53-pontmutációt hordozó H322-sejtek növekedését 72%-os arányban, míg a vad típusú p53-at hordozó - H460-sejtek növekedését csak 28%-os arányban gátolta.
Az eredmények azt jelzik, hogy a rekombináns p53adenovírus tumorszuppresszív tulajdonságot mutat, mely hatást a tumorsejtekben a p53-protein funkciójának helyreállításával fejt ki.
5. példa
Az Ad5CMV-p53-vírus alkalmazása p53-hiányos sejtek kezelésére
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus tumorsejtek növekedésgátlásának in vitro helyreállítására, és ezáltal a sejtek rosszindulatú vagy metasztázisos
HU 222 981 Bl növekedésének kezelésére történő alkalmazását mutatjuk be. Néhány olyan megvalósítási módot írunk le, amelyek felhasználhatók a rák adenovírus közvetítette génterápiás kezelésében.
H358-sejteket 10 PFU/sejt fertőzési multiplicitással Ad5CMV-p53- és Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztünk. Azonos mennyiségű sejtet csak tápközeggel kezeltünk (álfertőzött kontroll). A fertőzés után 24 órával a kezelt sejteket betakarítottuk, és PBS-sel kétszer öblítettük. Mindegyik kezeléshez 0,1 ml térfogatban 3χ 106 sejtet szubkután csupasz egerekbe (Harlan Co., Houston, TX) injektáltunk (kezelésenként öt egeret alkalmaztunk). Az egereket az injektálás előtt besugároztuk (300 cGy, δθϋο), és az injektálás után hetente vizsgáltuk. A tumorképződést a hathetes periódus végén értékeltük, és a tumortérfogatot - gömbszerű alakot feltételezve, az átlagos tumorátmérőt a keresztmetszeti átmérők szorzatának négyzetgyökének tekintve - számítottuk.
Az Ad5CMV-p53-vírus által közvetített, tumorképző sajátosságot gátló hatás meghatározása érdekében a csupasz egereket - daganatos növekedés indukálása céljából - szubkután H358-sejtekkel (humán NSCLC-sejttípus) oltottuk be. Mindegyik egérbe olyan sejteket injektáltunk, amelyeket előzetesen 24 óra hosszat 10 PFU/sejt dózisban Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2 vírussal fertőztünk. A csak tápközeggel kezelt H358-sejteket álfertőzött kontrollként alkalmaztuk. Az - először a 14. napon kitapintható - tumorokat csak az álfertőzött, illetve a kontrolivírussal fertőzött sejtek indukálták (ld. 1. táblázat).
1. táblázat
Az Ad5CMV-p53-vírus hatása a H358-sejtek tumorképzésére csupasz egerekben»
Kezelés Tumorok száma/egerek száma (%) Átlagos térfogat (mm3±SD)
Tápközeg 4/5 (80) 37±12
Ad5/RSV/GL2 3/4 (75) 30±14
AdCMV-p53 0/4 (0) -
a A kezelt H358-sejteket szubkután, egerenként 2 x1ο6 dózisban adtuk be. A tumorméretet a 6. hét végén határoztuk meg.
Amint az 1. táblázatban látható, az Ad5CMV-p53vírussal kezelt sejtek nem képeztek tumorokat. A 6. hét végén a tumorok átmérője 4-10 mm volt. Ezt a kísérletet csoportonként öt egérrel kezdtük; az Ad5CMV-p53és az Ad5/RSV/GL2 csoportban egy-egy egér a kísérlet befejezése előtt elpusztult, amit feltehetően keresztfertőzés okozott.
6. példa
Az AdCMV-p53 alkalmazása tüdőrák kezelésében
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus tumorsejtek növekedésgátlásának in vivő helyreállítására, s ezáltal állatokban rákok kezelésére történő alkalmazását mutatjuk be. Néhány olyan megvalósítási módot írunk le, amelyek felhasználhatók a rák adenovírus közvetítette génterápiás kezelésében.
Az Ad5CMV-p53-vírus tumorképzést gátló hatékonyságát az ortotopiás emberi tüdőrák egérmodelljében teszteltük. Mivel ebben a modellben a H358- és H322sejtek nem képeznek tumorokat, a H226Br-sejtvonalat alkalmaztuk. Ez a sejtvonal a pikkelyes (squamosus) tüdőrákból származik, és a tüdőből az agyba tevődik át. A H226Br-sejtek a p53-gén 7. exonjában, a 254. kodonnál pontmutációt hordoznak (ATC-+GTC), s egerekben tumorképző sajátságúak.
Az ortotopiás humán tüdőrák egérmodellben történő tesztelésének eljárását korábban leírták [Georges és munkatársai (1993)]. Röviden; sugárkezelt (300 cGy, δθϋο) csupasz egereknek - légcsövön keresztül történő (intratracheális) becseppentéssel - H226Br-sejteket adtunk be. Minden egyes egérnek 0,1 ml PBS-ben 2χ 106 sejtet adtunk be. Három nappal a beadás után, csoportonként tíz egeret - két napig naponta egyszer, intratracheális becseppentéssel - 0,1 ml vírusoldattal vagy hordozóval (PBS) kezeltünk. Egerenként 5xl07 Ad5CMV-p53vagy Ad5/RSV/GL2 vírust adtunk be. Az egereket a hathetes periódus végén leöltük. A tumorképződés értékeléséhez az egerek tüdejét és mediastinumát kivágtuk, és megmértük a tumor méretét. A tumorokat a tumortömeg metszeteinek szövettani vizsgálatával ellenőriztük.
A sugárkezelt csupasz egereknek intratracheális becseppentéssel 2 χ 106 H226Br-sejtet adtunk be. Három nappal később valamennyi egérnek (csoportonként 8-10-nek) - két napig naponta egyszer - intratracheális becseppentéssel 0,1 ml Ad5CMV-p53-vírusoldatot, Ad5/RSV/GL2 vírusoldatot, illetve hordozót (PBS-t) adtunk be. Egerenként 5 χ 107 vírust adtunk be. Az egereket a hathetes periódus végén leöltük. A tumorképződés értékeléséhez az egerek tüdejét és mediastinumát kivágtuk, és megmértük a tumor méretét. Az eljárás folyamatábráját a 8. ábrán, a kimetszett szervek jellemző példáit pedig a 9. ábrán mutatjuk be. A detektált tumorokat szövettani vizsgálattal ellenőriztük. A tumorok mérésének eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. táblázat
Az Ad5CMV-p53-vírus hatása a H226Br-sejtek tumorképzésére az ortotopiás humán tüdőrák egérmodelljében»
Kezelés Tumort hordozó egerek száma/összes egér (%) Átlagos térfogat (mm3±SD)
Hordozó 7/10 (70) 30±8,4
Ad5/RSV/GL2 8/10 (80) 25±6,9
[ AdCMV-p53 2/8 (25) 8±3,3b
a Az egereknek intratracheálisan 2x 106 H226Br-sejtet adtunk be.
A beadás után három nappal az egereknek - szintén intratracheálisan - két napig naponta hordozót vagy vírusokat (0,1 ml térfogatban 5 χ 107 vírust) adtunk be. A tumorképződést a hathetes időszak végén értékeltük.
b Az Ad5CMV-p53-vírussal kezelt csoportot a hordozóval (PBS), illetve a kontrolivírussal kezelt csoporttal összehasonlítva p<0,05 (kéttényezős szórásnégyzet-elemzéssel).
HU 222 981 Bl
Az Ad5CMV-p53-vírussal kezelt egerek csupán 25%-ában, míg a hordozóval vagy az Ad5/RSV/GL2 vírussal kezelt egerek 70-80%-ában képződtek tumorok. Az Ad5CMV-p53 csoportban az átlagos tumorméret lényegesen kisebb volt, mint a kontrollcsoportokban. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az Ad5CMV-p53 az ortotopiás humán tüdőrák egérmodelljében képes megakadályozni a H226Br-sejtek tumorképzését.
7. példa
Az Ad5CMV-p53-vírus alkalmazása kezelési eljárásokban
Az 5. és 6. példában az állatmodelleket természetesen a preklinikai vizsgálatok részeként alkalmazzuk. Ezek után azokat a betegeket, akik számára orvosilag javallott az adenovírus közvetítette génbeviteli kezelés, adenovírus elleni antitestek jelenlétére vizsgáljuk. Amennyiben ilyen antitestek jelen vannak, és a beteg allergiás a gyógyszerészeti vagy a természetben előforduló anyagokra, fokozott klinikai megfigyelés mellett 103-106 rekombináns adenovírus nagyságrendű tesztelő dózis beadását javasolhatjuk.
A rák Ad5CMV-p53 alkalmazásával végzett kezelése érdekében, a „Food and Drug Administration” (FDA) által elfogadható eljárás szerint - megfelelő promoter- és erősítő („enhancer”)-elemek (például CMV-promoter) szabályozása alatt - p53-at expresszáló rekombináns adenovírust állíthatunk elő és tisztíthatunk. Az ilyen eljárások közé tartozik - nem kizárólagosan - a cézium-klorid-sűrűséggradiens-centrifúgálás, amely után a rekombináns vírust hatékonyságra és tisztaságra teszteljük.
A p53-adenovírus alkalmazásával végzett kezelésre két alapvető eljárást tartunk alkalmasnak; egy közvetlen vagy helyi beadást, illetve egy általánosabb beadást. Az ilyen eljárások bármilyen - p53-mutációkkal kapcsolatos - rák kezelésére alkalmasak. Az általános beadást illetően kimutatták, hogy az adenovírus egyszerű intravénás injektálása elégséges az injektálás helyétől távoli szövetek virális fertőzéséhez [Stratford-Perricaudet és munkatársai (1991/b)], s ezáltal alkalmas valamennyi - p53mal kapcsolatos - malignus betegség kezelésére. A vírust bármilyen - gyógyászati szempontból elfogadható - oldatban, intravénás injektálással vagy megfelelő ideig adagolt infúzióval adhatjuk be a betegnek. Általánosan, úgy tartjuk, hogy a funkcionális vírusrészecskék beadandó, hatásos mennyisége 1 χ 1 Olo-től 5 χ 1012-ig terjed.
Kívánt esetben, különösen tüdőrák esetén - a húgyhólyagfibrózis transzmembránkonduktancia-regulátorának intratracheális beadásához [Rosenfeld és munkatársai (1992)] hasonló módon - a rekombináns adenovírus közvetlenebb fizikai célba juttatása alkalmazható, melynek eredményeként a rekombináns p53-adenovírus a célsejtekhez közelebb vihető be.
A következőkben az előnyös kezelési eljárásokat írjuk le részletesebben. A betegeket először - a légutak elzáródásának értékelése céljából - bronchoszkóppal vizsgáljuk. Az endoszkópiás vizsgálat segítségével a lehető legtöbb nagy tumort ki kell vágni. A betegek bronchoszkópiás vizsgálatát előnyösen helyi vagy általános érzéstelenítés mellett kell végezni. A bronchoszkóp biopsziavezetékébe egy transzbronchiális Stifcor™ aspirációs tűt (2lg) vezetünk be. A kivágott tumor helyére - kis, például 10 ml-es térfogatban - injektáljuk a p53-adenovírust.
A vírus által kiváltott, a beteg egészségére káros hatások semmilyen körülmények között nem várhatók, mivel az alkalmazott adenovírus replikációra képtelen. Ennek ellenére, a betegeket - az akut és késői zavaró reakciók ellenőrzése érdekében - legalább 48 órára kórházban kell tartani. A replikációra képtelen adenovírus génbeviteli hordozóként történő alkalmazásának biztonsági vonatkozásait korábban már leírták [Rosenfeld és munkatársai (1982); Jaffe és munkatársai (1992)], az adenovírus beadandó dózisát azonban úgy kell megválasztani, hogy a nem kívánt mellékhatások kialakulásának esélye minimális legyen.
A reakció szükségessége létezésének vagy a toxicitás létezésének bemutatásaként különböző kritériumokat kell figyelembe venni. A toxicitás létezése meghatározásának elősegítése érdekében a tumorágyat a terápia megkezdése előtt le kell fényképezni, és meg kell mérni legnagyobb átmérőjét és annak merőlegesét. A tumor méretét az átmérők szorzataként kell megadni. Ezen adatok alapján, ezekből a számokból kiszámíthatjuk a tumor kiújulásának mértékét.
A betegség előrehaladásának idejét a tumortömeg csökkenésének első megfigyelésétől az előrehaladó betegség bizonyítékának megjelenéséig mérhetjük. Az előrehaladó (súlyosbodó) betegség definíció a mért lézió átmérőinek szorzatai összegének 25%-os vagy nagyobb növekedése. Mielőtt a betegség előrehaladását minősítenénk, a betegeknek legalább két kezelésen kell átesniük. A páciensek életben maradását az eljárás kezdetétől kell mérni.
A későbbi vizsgálatok közé a rákterápiában általánosan alkalmazott vizsgálatok tartoznak, beleértve a klinikai tünetek megfigyelését és a standard és molekuláris biológiai analízisek (melyekkel meghatározható a különböző p53-gének expressziós mintázata) céljából történő biopsziákat. Az ilyen vizsgálatok információt nyújthatnak a bevitt gént felvevő sejtek számáról és a relatív in vivő promoterhatékonyságról. A kapott adatok alapján kívánatos lehet a kezelés finomítása. Az ilyen finomítások közé tartozhat az eltérő promotereket tartalmazó adenovíruskonstrukciók alkalmazása vagy - több vagy valamennyi tumorsejt megfertőzésének (a rekombináns gének fiziológiástól eltérő túlexpresszálása nélküli) biztosítása érdekében - a vírus injektált PFUdózisának megváltoztatása.
Az adenovírus alkalmazásával in vivő bevitt exogén gének expressziója hosszabb ideig folytonos lehet. A vírus közvetítésével bevitt exogén gének terápiás szempontból hatásos, hosszú időtartamú expresszióját minden egyes esetre külön kell meghatározni. A markergének haszna a génexpresszió terápiás szempontból megfelelő szintjének megállapítására korlátozódik, mivel egy adott, bármilyen genetikai rendellenesség javításához szükséges expressziós szint jelentős mértékben különbözhet egy másik betegség gyógyításához szükséges szinttől.
HU 222 981 Bl
Bár a találmány szerinti készítményeket és eljárásokat a találmány előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti készítmények, eljárások és azok lépéseinek gyakorlati megvalósításában, valamint azok sorrend- 5 jében különböző változtatások hajthatók végre anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak. Közelebbről, kézenfekvő, hogy az itt leírt anyagok helyett alkalmazhatók bizonyos olyan anyagok, amelyek kémiai 10 vagy fiziológiai szempontból hasonlóak az általunk alkalmazottakhoz, és azonos vagy hasonló eredmények elérését teszik lehetővé. Valamennyi ilyen - szakember számára nyilvánvaló - helyettesítést a találmány tárgyához tartozónak tekintünk. Az igénypontokban említett vala- 15 mennyi anyag és eljárás elvárható mennyiségű kísérleti munkával előállítható, illetve megvalósítható.
Hivatkozások jegyzéke
Az alábbi hivatkozásokat - amennyiben azok a találmány leírását a példákban ismertetett módszerek 20 vagy más részletek tekintetében kiegészítik - teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.
Bargonetti, eí al. (1991) Cell 65:1083-1091.
Boehringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP fór high efficiency transfections, BMBiochemica 9 25 (1):17.
Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of humán cytomegalovirus. Cell, 41:521-530.
Bishop (1987) Science 235:305-311. 30
Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, Μ. E., Vogelstein, B., and Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression of humán breast cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene. Oncogene 6:1791-1797.
Dai, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 35
89:10 892-10 895.
Fields etal. (1990) Science 249:1046-1049.
Georges et al. (1993) Cancer Rés 53:1743-1746. Ghosh-Choudhury and Graham (1982) Biochem. Biophys. Rés. Comm. 147:964-973. 40
Gluzman et al., (1982) in Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y., Ed.) pp. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
Graham, F. L. and A. J. van dér Eb. (1973). A new technique fór the assay of infectivity of humán ade- 45 novirus 5 DNA. Virology 52:456-467.
Graham, F. L., J. Smiley, W. C. Russell and R. Naim (1977). Characteristics of a humán cell line transformed by DNA írom humán adenovirus type 5. J. Gén Virol. 36:59-72.
Grunhaus, A. and Horwitx, M. S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Sémin. Virology 3:237-2542. Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and
Harris, C. (1991). p53 mutations in humán cancers. Science 253:49-53.
Jaffe et al., (1992) Natúré Genetics 1:372-378.
Le Gál et al., (1993) Science 259:988-990.
McGrory, W. J. et al. (1988). A simple technique fór the rescue of early region 1 mutations intő infectious humán adenovirus type 5. Virology 163:614-617.
Mercer, W. E. (1992). Cell cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rév. Eukar. Gene Express. 2:251-263.
Mietz, et al. (1992) EMBO 11:5013-5020.
Montenarh, M. (1992). Biochemical, immunological, and functional aspects of the growth suppressor/oncoproteinp53. Critic. Rév. Onco. 3:233-256.
Mulligan, (1993), Science 260:926.
Ragot etal., (1993) Natúré, 361:647-650.
Rosenfeld et al., (1991) Science, 232:431-434. Rosenfeld eí al., (1992) Cell 68:143-155.
Shaw, etal., (1992) 89:4495-4499.
Spandidos, et al. (1989), J. Pathol., 157:1-10. Stratford-Perricaudet, L. and M. Perricaudet. (1991a).
Gene transfer intő animals: the promise of adenovirus. p. 51-61, In O. Cohen-Haguenauer and M. Boiron (Eds.), Humán Gene Transfer, Editions John Libbey Eurotext, Francé.
Stratford-Perricaudet etal., (1991b) Hűm. Gene. Ther. 1:241-256.
Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M. M., Hida, T., Linnoila, I., Ueda, R., and Minna, J. D. (1992). Wild-type bút nőt mutant p53 suppresses the growth of humán lung cancer cells beating multiple genetic lesions. 1992. Cancer Rés. 52:2340-2342.
Tooza, J. (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Travali, et al. (1990), FASEB, 4:3209-3214.
Yonish, etal. (1991),Natúré 352:345-347.
Weinberg, R. A. (1991). Tumor suppressor gene.
Science 254:1138-1145.
Wilcock, eí al. (1991) Natúré 349:429-431. Zakut-Houri et al. (1985), EMBOJ., 4:1251-1255. Zhang, eí al. (1993) BioTechniques in press.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ : egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS:
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCCCACCC CCTTGGCTTC 20
I
HU 222 981 Bl
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS:
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TTGTAACCAT TATAAGCTGC
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS:
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS:
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CATCTGAACT CAAAGCGTGG

Claims (28)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A p53-proteint kódoló expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírus alkalmazása rákos elvál- 35 tozás kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, lokálisan, előnyösen a tumorba történő direkt injektálással vagy intratracheálisan, előnyösen légcsőbe porlasztva bead- 40 ható gyógyászati készítmény előállítására.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, szisztémásán, előnyösen intravénás injektálással vagy intravénás infúzióban beadható gyógyászati készítmény előállítására.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkal- 45 mazás, amely szerint heterológ promoter, előnyösen erős konstitutív promoter, még előnyösebben a citomegalovírus-IE-promoter, az RSV-promoter, az EFl-promoter, az aktin promoter vagy a polioma- vagy SV40vírusból származó promoter, még előnyösebben pedig 50 a citomegalovírus-IE-promoter vagy a korai vagy késői SV40-promoter vezérlése alá helyezett p53-kódoló expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint citomegalovírus-IE-promoter vezérlése alá helyezett p5 3-kódoló expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint poliadenilációs szignált, előnyö20 sen SV40-vírusból vagy egy protamingénből származó poliadenilációs szignált is tartalmazó rekombináns adenovírust, még előnyösebben a p53-kódoló expressziós régiót követően poliadenilációs szignált is tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  7. 7. Az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint replikációs origót, előnyösen virális replikációs origót, még előnyösebben SV40-, poliomavírus-, adenovírus-, VSV- vagy BPV-eredetű replikációs origót is tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint enhanszert, előnyösen az El-enhanszert is tartalmazó, még előnyösebben az El-enhanszer vezérlése alá helyezett p53-kódoló expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint 5. típusú adenovírusszekvenciákat is tartalmazó rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint az adenovírus 1,3-9,2 térképegységei közötti részletet nélkülöző rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint egy replikádéhoz nélkülözhetetlen génben deléciót szenvedett és a deléció helyén a p53-kódoló expressziós régiót tartalmazó, előnyösen az E1A- és ElB-régióban deléciót szenvedett és a deléció helyén a p53-kódoló expressziós régiót tartalmazó,
    HU 222 981 Bl még előnyösebben az 1. ábrán bemutatott genomszerkezetű rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  12. 12. Az 1 -11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint az ElB-régiót nélkülöző rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint gyógyászatilag elfogadható készítményben, előnyösen a tumorba infúzióval beadható vagy hosszú időn keresztül infúzióval adagolható diszpergált rekombináns adenovírust alkalmazunk.
  14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, metasztázisos növekedés gátlására, humán malignancia gátlására vagy tumorigenitás gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, epiteliális rák, előnyösen tüdőrák, még előnyösebben ortotóp tüdőrák vagy endobronchiális tumor, még előnyösebben nem kis sejtes tüdőrák vagy mellrák vagy nem reszektálható tumorok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, hosszabb időszakon keresztül adagolandó gyógyászati készítmény előállítására.
  17. 17. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, legalább kétszer beadandó, előnyösen másodszor eltérő fertőzőképességű rekombináns adenovírus bejuttatását eredményező gyógyászati készítmény előállítására.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, másodszor mintegy fél és egy év közötti időszak elteltével beadandó gyógyászati készítmény előállítására.
  19. 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, tumorreszekció, előnyösen bronchoszkópia után beadandó gyógyászati készítmény előállítására.
  20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, tumorreszekció után a maradék tumorba injektálandó gyógyászati készítmény előállítására.
  21. 21. Az 1 -20. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, a beadást követően adenovírussal reaktív antitest jelenlétére vagy vektoralapú toxicitásra tesztelendő páciensnek beadandó gyógyászati készítmény előállítására.
  22. 22. Az 1 -21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, 1010 és 5 χ 1012 közötti számú rekombináns adenovírusrészecskét tartalmazó dózisban beadandó gyógyászati készítmény előállítására.
  23. 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, 10 ml vagy annál kisebb térfogatban beadandó gyógyászati készítmény előállítására.
  24. 24. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, a rekombináns adenovírust El-expresszáló sejtvonal, előnyösen a 293 jelű sejtvonal alkalmazásával csomagolva tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.
  25. 25. In vitro eljárás vad típusú p53-protein tekintetében hiányos sejt vad típusú p53-protein-fúnkciójának helyreállítására, azzal jellemezve, hogy a sejtet az 1. igénypontban megadott rekombináns adenovírusnak a sejtben vad típusú p53-proteint expresszáltatni képes mennyiségével érintkeztetjük.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy p53-génben mutációt hordozó ráksejtet érintkeztetünk a rekombináns adenovírussal.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emberi epiteliális sejtet, előnyösen emlőráksejtet vagy mellráksejtet érintkeztetünk a rekombináns adenovírussal.
  28. 28. In vitro eljárás rekombináns adenovírus előállítására, azzal jellemezve, hogy alkalmas gazdasejtbe adenovírusplazmidot és expressziós vektort juttatunk liposzómamediált transzfekció útján, és a tenyésztett gazdasejteket olyan citopátiás hatás jelenlétére vizsgáljuk, amely homológ rekombinációt és vírustermelődést jelez;
    ahol az expressziós vektor tartalmaz egy p53-at kódoló expressziós régiót.
HU9601084A 1993-10-29 1994-10-28 Rekombináns p53-adenovírusok, eljárások előállításukra, és a vírusokat tartalmazó készítmények HU222981B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/145,826 US6410010B1 (en) 1992-10-13 1993-10-29 Recombinant P53 adenovirus compositions
PCT/US1994/012401 WO1995012660A2 (en) 1993-10-29 1994-10-28 Recombinant p53 adenovirus methods and compositions

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9601084D0 HU9601084D0 (en) 1996-06-28
HUT76527A HUT76527A (en) 1997-09-29
HU222981B1 true HU222981B1 (hu) 2004-01-28

Family

ID=22514730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601084A HU222981B1 (hu) 1993-10-29 1994-10-28 Rekombináns p53-adenovírusok, eljárások előállításukra, és a vírusokat tartalmazó készítmények

Country Status (18)

Country Link
US (9) US6410010B1 (hu)
EP (1) EP0725791B1 (hu)
JP (2) JPH10503361A (hu)
KR (2) KR100812631B1 (hu)
CN (1) CN1079833C (hu)
AT (1) ATE525387T1 (hu)
AU (1) AU698437B2 (hu)
BR (1) BR9408179A (hu)
CA (1) CA2174556C (hu)
CZ (1) CZ288790B6 (hu)
HU (1) HU222981B1 (hu)
NO (1) NO961696L (hu)
NZ (1) NZ275356A (hu)
PL (1) PL186151B1 (hu)
RU (1) RU2222600C2 (hu)
SK (1) SK50996A3 (hu)
UA (1) UA73265C2 (hu)
WO (1) WO1995012660A2 (hu)

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605712B1 (en) * 1990-12-20 2003-08-12 Arch Development Corporation Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions
EP0575518A1 (en) * 1991-03-06 1993-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6210939B1 (en) * 1993-10-25 2001-04-03 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
PT797676E (pt) * 1993-10-25 2006-05-31 Canji Inc Vector adenoviral recombinante e metodos de utilizacao
US20060275261A1 (en) * 1993-10-25 2006-12-07 Canji, Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20070259429A9 (en) * 1993-10-25 2007-11-08 Canji,Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20010006629A1 (en) * 1993-10-25 2001-07-05 Richard J. Gregory Recombinant adenoviral vector and methods of use
US20020010144A1 (en) * 1994-04-29 2002-01-24 Robert Sobol Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US7592317B1 (en) * 1994-08-11 2009-09-22 The University Of Chicago Constitutive gene expression in conjuction with ionizing radiation
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
CA2206205A1 (en) * 1994-11-28 1996-06-06 Genetic Therapy, Inc. Tissue-specific treatment, diagnostic methods, and compositions using replication-deficient vectors
US5998205A (en) * 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
FR2729295A1 (fr) * 1995-01-17 1996-07-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Traitement therapeutique combine des pathologies hyperproliferatives
AU5297496A (en) * 1995-02-17 1996-09-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods of preparation and use of recombinant adenoviral vectors
AU722042B2 (en) * 1995-11-30 2000-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
EP1724350A1 (en) * 1995-11-30 2006-11-22 The Board Of Regents, The University Of Texas System Method and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
US6133243A (en) * 1996-02-22 2000-10-17 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Liposomal-viral DNA complexes for treating disease
US5958892A (en) * 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
AU4328897A (en) * 1996-08-23 1998-03-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-proliferative factor from transfected cells
JP2001505766A (ja) * 1996-11-18 2001-05-08 マクギル ユニバーシティー アポトーシスと生長を調節するアデノウイルスベクターを有する、有糸分裂後のニューロン
ATE550429T1 (de) * 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
US7732129B1 (en) * 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
BR9808697A (pt) * 1997-04-28 2000-07-11 Rhone Poulenc Rorer Sa Processo para inibir o crescimento de um tumor, vetor de adenovìrus defeituoso, vetor de vìrus, uso do mesmo, e, composição farmacêutica
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
US20020086840A1 (en) * 2000-01-26 2002-07-04 Zarling David A. Use of Rad51 inhibitors for p53 gene therapy
ES2380007T3 (es) * 2001-04-06 2012-05-07 The University Of Chicago Inducción por agentes quimioterapéuticos de la actividad del promotor Egr-1 en la terapia génica
US8034791B2 (en) 2001-04-06 2011-10-11 The University Of Chicago Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics
US20040242523A1 (en) * 2003-03-06 2004-12-02 Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago Chemo-inducible cancer gene therapy
KR100432953B1 (ko) * 2001-09-01 2004-05-28 김주항 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스
EP1327688A1 (en) * 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses with enhanced lytic potency
US7078037B2 (en) * 2002-04-19 2006-07-18 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Peptides and DNA encoding the peptides useful for immunizations against Coccidioides spp. infections
CA2511625A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 City Of Hope Modified vaccinia ankara expressing p53 in cancer immunotherapy
CA2518169C (en) * 2003-03-06 2012-01-24 Zhaohui Peng A recombinant constructed by a virus vector and a human tumor suppressor gene and its use
US7262027B2 (en) * 2003-03-14 2007-08-28 Medical College Of Ohio Polypeptide and DNA immunization against Coccidioides spp. infections
US20080039409A1 (en) * 2003-12-24 2008-02-14 Locomogene, Inc. Method of Suppressing Cancer
JPWO2005061007A1 (ja) * 2003-12-24 2007-07-12 学校法人 聖マリアンナ医科大学 癌の抑制方法
WO2005082422A1 (en) * 2004-02-24 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Combination of ad-p53 and chemotherapy for the treatment of tumours
US20070212298A1 (en) * 2004-08-25 2007-09-13 Prefix Suffix Use of the combination comprising temozolomide and tnf-alpha for treating glioblastoma
US8926987B2 (en) 2004-11-18 2015-01-06 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Replication-competent adenoviral vectors
CA2595874A1 (en) * 2005-01-26 2006-08-03 Zhaohui Peng The new use of recombinant adenovirus-p53 agent in treatment of tumor patients
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
US20070231304A1 (en) * 2006-01-30 2007-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy
TW200808739A (en) 2006-04-06 2008-02-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolines for PDK1 inhibition
US20080027016A1 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 Nicholas Anthony Laszlo Cancer treatment application of genomic replacement therapy
PA8809001A1 (es) 2007-12-20 2009-07-23 Novartis Ag Compuestos organicos
JP5674476B2 (ja) 2008-01-25 2015-02-25 ピー５３ インコーポレイテッド Ｐ５３バイオマーカー
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
BR112012019635A2 (pt) 2010-02-22 2016-05-03 Hoffmann La Roche compostos inibidores de pirido[3,2-d] pirimidina pi3k delta e métodos de uso
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
BR112013009196A2 (pt) 2010-10-15 2020-08-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York usos de polipeptídeo para redução da aquisição de ácido graxo e da ingestão de alimento, bem como para promoção de saciedade relacionados à obesidade
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
KR101928116B1 (ko) 2011-01-31 2018-12-11 노파르티스 아게 신규 헤테로시클릭 유도체
BR112013020875A2 (pt) 2011-02-15 2019-09-24 Immune Design Corp método para indução de uma resposta imune específica para um imunógeno em um indivíduo.
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
CA2853256C (en) 2011-10-28 2019-05-14 Novartis Ag Novel purine derivatives and their use in the treatment of disease
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
PL2830662T3 (pl) 2012-03-29 2019-02-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Sposoby leczenia zaburzeń utraty włosów
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
WO2013152230A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Smooth muscle specific inhibition for anti-restenotic therapy
RS57420B1 (sr) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp Vakcine za hsv-2
SG11201406550QA (en) 2012-05-16 2014-11-27 Novartis Ag Dosage regimen for a pi-3 kinase inhibitor
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
AU2014236947A1 (en) 2013-03-15 2015-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
KR20160095035A (ko) 2013-12-06 2016-08-10 노파르티스 아게 알파-이소형 선택성 포스파티딜이노시톨 3-키나제 억제제를 위한 투여 요법
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
EP3104878B1 (en) 2014-02-14 2019-05-22 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
WO2016011083A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
WO2016105517A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
CA2997947A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
LT3370733T (lt) 2015-11-02 2021-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 aktyvinimo ir imuninės kontrolės taškų blokados būdai
CA3002954A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Novartis Ag Dosage regimen for a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
US20190038713A1 (en) 2015-11-07 2019-02-07 Multivir Inc. Compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
NZ746934A (en) 2016-04-15 2023-11-24 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP7099967B2 (ja) 2016-07-01 2022-07-12 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 幹細胞由来移植片からの増殖性細胞の排除
WO2018022946A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
US11154591B2 (en) 2016-10-14 2021-10-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
AU2017375958A1 (en) 2016-12-12 2019-07-04 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
RS64870B1 (sr) 2017-03-16 2023-12-29 Alpine Immune Sciences Inc Imunomodulatorni proteini varijante pd-l1 i njihove upotrebe
SG11201907769XA (en) 2017-03-16 2019-09-27 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11201908280SA (en) 2017-03-30 2019-10-30 Univ Queensland "chimeric molecules and uses thereof"
WO2019040994A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 The Australian National University IMMUNOREGULATOR MOLECULES AND USES THEREOF
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
WO2019136179A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
AU2019322487B2 (en) 2018-03-19 2024-04-18 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and CD122/CD132 agonists for the treatment of cancer
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2019345151A1 (en) 2018-09-19 2021-04-29 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant CD80 fusion proteins and related constructs
WO2020113141A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110055227A (zh) * 2019-03-13 2019-07-26 中国人民解放军第四军医大学 用于增生性瘢痕治疗的野生型p53腺病毒及纯化的制备方法
CN114302736A (zh) 2019-04-17 2022-04-08 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体(icosl)融合蛋白的方法和用途
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
MX2022013998A (es) 2020-05-08 2023-02-16 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras inhibidoras de april y baff con y sin una proteina inhibidora de celulas t y metodos de uso de las mismas.
US20240279310A1 (en) 2021-05-07 2024-08-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3950082A (en) * 1973-01-10 1976-04-13 David Volk Ophthalmic lens for presbyopia and aphakia
US4002439A (en) * 1973-01-10 1977-01-11 David Volk Method of forming an ophthalmic lens for presbyopia and aphakia
US4050192A (en) * 1974-12-23 1977-09-27 David Volk Apparatus for farming ophthalmic lens for presbyopia and aphakia
US4149801A (en) * 1977-02-17 1979-04-17 David Volk Method and apparatus for measuring aspheric contact lens surfaces
US4740463A (en) 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
US4640595A (en) * 1984-05-02 1987-02-03 David Volk Aspheric contact lens
EP0174608A1 (en) 1984-09-13 1986-03-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Beta-actin gene and regulatory elements, preparation and use
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4710193A (en) * 1986-08-18 1987-12-01 David Volk Accommodating intraocular lens and lens series and method of lens selection
US5055400A (en) 1986-11-26 1991-10-08 University Of Guelph Leukotoxin gene of pasteurella haemolytica
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5532220A (en) 1987-08-31 1996-07-02 The Regents Of The University Of California Genetic mechanisms of tumor suppression
US5763209A (en) * 1988-09-26 1998-06-09 Arch Development Corporation Methods and materials relating to the functional domains of DNA binding proteins
AU629554B2 (en) 1988-06-24 1992-10-08 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Exogenous gene expression vector containing chick beta-actin gene promoter
AU638954B2 (en) 1988-10-31 1993-07-15 Regents Of The University Of California, The Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype
WO1990010448A2 (en) 1989-03-07 1990-09-20 Genentech, Inc. Covalent conjugates of lipid and oligonucleotide
US6677312B1 (en) 1989-03-29 2004-01-13 The Johns Hopkins University Methods for restoring wild-type p53 gene function
DE69032864T3 (de) 1989-03-29 2013-01-31 The Johns Hopkins University Nachweis des Ausfalls des Wildtyps des p53-Gens
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
US6800617B1 (en) 1989-03-29 2004-10-05 The Johns Hopkins University Methods for restoring wild-type p53 gene function
US5527676A (en) 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
SE464777B (sv) 1989-10-03 1991-06-10 Be Ge Ind Ab Progressiv luftfjaeder
US5200773A (en) * 1989-10-27 1993-04-06 Volk Donald A Diagnostic indirect ophthalmoscopy contact lens system
US5046836A (en) * 1989-10-27 1991-09-10 Volk Donald A Diagnostic indirect ophthmalmoscopy contact lens system
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
IE911115A1 (en) 1990-04-10 1991-10-23 Canji Inc Gene therapy for cell proliferative diseases
NO312681B1 (no) 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5255025A (en) * 1991-10-15 1993-10-19 Volk Donald A Measurement apparatus for indirect ophthalmoscopy
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
US6348352B1 (en) 1992-09-18 2002-02-19 Canji, Inc. Methods for selectively transducing pathologic mammalian cells using a tumor suppressor gene
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
US5347326A (en) * 1992-10-05 1994-09-13 Volk Donald A Diagnostic or therapeutic contact lens
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
US5430506A (en) * 1992-11-06 1995-07-04 Volk; Donald A. Indirect ophthalmoscopy lens for use with slit lamp biomicroscope
DK0931830T3 (da) 1993-02-16 2001-06-11 Onyx Pharma Inc Cytopatiske vira til terapi og profylakse af neoplasi
US5496731A (en) 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
FR2704234B1 (fr) * 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
RU2219241C2 (ru) * 1993-07-13 2003-12-20 Рон-Пуленк Роре С.А. Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты)
WO1995011301A1 (en) 1993-10-19 1995-04-27 The Regents Of The University Of Michigan P53-mediated apoptosis
PT797676E (pt) 1993-10-25 2006-05-31 Canji Inc Vector adenoviral recombinante e metodos de utilizacao
US6210939B1 (en) * 1993-10-25 2001-04-03 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
US5440458A (en) * 1993-11-02 1995-08-08 Volk; Donald A. Illuminated lens case
US5479222A (en) * 1993-11-15 1995-12-26 Volk; Donald A. Indirect ophthalmoscopy lens system and adapter lenses
FR2712602B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2716893B1 (fr) 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
US5436680A (en) * 1994-04-20 1995-07-25 Volk; Donald A. Indirect ophthalmoscopy lens providing apparent image curvature
EP0758382A1 (en) 1994-04-29 1997-02-19 Sidney Kimmel Cancer Center Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US5526074A (en) * 1994-10-31 1996-06-11 Volk; Donald A. Full field reinverting indirect contact ophthalmoscope
US5523810C1 (en) * 1995-06-05 2001-04-17 Volk Optical Inc Indirect ophthalmoscopy contact lens device with compound contact lens element
EP0761613B1 (en) * 1995-09-07 2001-10-24 Ford Motor Company Method for heating and forming a glass sheet
US5805269A (en) * 1996-08-27 1998-09-08 Volk Optical, Inc. High magnification indirect ophthalmoscopy lens device
US5757464A (en) * 1996-08-29 1998-05-26 Volk Optical, Inc. Indirect ophthalmoscopy contact lens device with compound contact lens element
EP1017308B1 (en) * 1996-10-24 2003-06-04 Volk Optical, Inc. Ophthalmoscopic viewing system
US5986801A (en) * 1996-11-08 1999-11-16 Volk; Donald A. Image reinverter for stereo microscope
US5857475A (en) * 1997-03-03 1999-01-12 Volk Optical, Inc. Optical component cleaning apparatus
US5963301A (en) * 1997-10-22 1999-10-05 Volk Optical, Inc. Lense arrangement for vitreoretinal surgery

Also Published As

Publication number Publication date
AU8094994A (en) 1995-05-23
CA2174556A1 (en) 1995-05-11
US6511847B1 (en) 2003-01-28
KR20050052517A (ko) 2005-06-02
US20030021767A1 (en) 2003-01-30
WO1995012660A2 (en) 1995-05-11
KR960705930A (ko) 1996-11-08
SK50996A3 (en) 1996-10-02
US6143290A (en) 2000-11-07
US20070190040A1 (en) 2007-08-16
US20030012770A1 (en) 2003-01-16
HU9601084D0 (en) 1996-06-28
NO961696D0 (no) 1996-04-26
CN1079833C (zh) 2002-02-27
US7033750B2 (en) 2006-04-25
PL314311A1 (en) 1996-09-02
KR100812631B1 (ko) 2008-03-13
NO961696L (no) 1996-06-26
CA2174556C (en) 2009-02-24
UA73265C2 (en) 2005-07-15
AU698437B2 (en) 1998-10-29
CZ122596A3 (en) 1996-08-14
US6805858B1 (en) 2004-10-19
RU2222600C2 (ru) 2004-01-27
WO1995012660A3 (en) 1995-08-03
HUT76527A (en) 1997-09-29
CN1136826A (zh) 1996-11-27
EP0725791A1 (en) 1996-08-14
BR9408179A (pt) 1997-05-27
CZ288790B6 (cs) 2001-09-12
US6905873B1 (en) 2005-06-14
NZ275356A (en) 1997-12-19
JP2003265193A (ja) 2003-09-24
US6410010B1 (en) 2002-06-25
ATE525387T1 (de) 2011-10-15
EP0725791B1 (en) 2011-09-21
PL186151B1 (pl) 2003-11-28
US6830749B2 (en) 2004-12-14
US6740320B1 (en) 2004-05-25
JPH10503361A (ja) 1998-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6511847B1 (en) Recombinant p53 adenovirus methods and compositions
JP3847334B2 (ja) ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20031201

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees