UA73265C2 - Adenovirus-recombinant carrying the structure of adenovirus vector, a method for the restoration of protein p53 function in tumor cell with deficit of natural p53, a method for the preparation of adenovirus-recombinant - Google Patents

Description

Опис винаходу 1. ОБЛАСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 2 Настоящее изобретение относится, в основном, к области технологий получения рекомбинантов. В частности, оно касается вопроса упрощения и повьішения зффективности способов получения рекомбинантньх аденовирусов. Кроме того, предложень! новье составь! и способь! использования структур аденовируса РБЗ, включая способь! восстановления нормальньх функций Р5З и подавления роста клеток с отклоненньіми от нормь! РБЗ. 2. ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Современнье методьї лечения рака, включающие радиационную терапию, хирургию и химическую терапию, характеризуются ограниченной зффективностью. Только рак легких убивает в Соединенньх Штатах более 140000 человек ежегодно. Недавно для установленной возрастной группьї смертность от рака легких превьсила смертность от рака груди у женщин. Хотя введение в жизнь программь! борьбь! с курением снизило темпь! 72 распространения курения, уровень смертности от рака легких останется вьісоким даже в 21-м веке. Развитиє новьїх терапевтических методов лечения рака легких будет зависеть от проникновения в механизм биологий рака легких на молекулярном уровне.

В настоящее время установлено, что разновидности рака вьізьшваются, по крайней мере, частично, генетическими отклонениями, которье проявляются или в повьішенной зкспрессии одного или более генов, или в зкспрессии отклоненного от нормь! или мутантного гена или генов.

Например, во многих случаях, как известно, зкспрессия онкогенов вьізьівает развитие рака. "Онкогень!" - зто генетически измененнье геньї, чей мутированньй продукт зкспрессии каким-то образом нарушает нормальное функционирование клетки или управление зтим процессом. (Зрапаїдоз еї а/ї., 1989).

Большинство из изученньїх на настоящий момент онкогенов получили определение "активированньх" в с 22 результате мутации, часто точечной мутации, в кодирующей области нормального клеточного гена, то есть Го) "протоонкогена", результатом чего является замещение аминокислоть! в протеиновом продукте, зкспрессия которого претерпела изменение. Зтот продукт с видоизмененной зкспрессией проявляет отклоненнье от нормь! биологические функции, которніе оказьвают влияние на протекание процесса образования опухолей (Тгамаїї еї аІ,, 1990). Не проявляющие себя мутации могут развиваться при различньїх обстоятельствах, например в о 30 результате химического мутагенеза или ионизирующей радиации Цельй ряд онкогенов или онкогенньїх Ге) семейств, включая газ, тус, пе, гаї, его. згс, пев, |шп, абі, в настоящее время уже идентифицировань и в различной степени описань! (Тгамаїї еї а!., 1990, Візпор, 1987). сч

Как установлено, при нормальном росте клетки, прото-онкогеньї, стимулирующие рост, сбалансировань «се генами-супрессорами, сдерживающими рост новообразований. Некоторьіе факторь! могут внести дисбаланс во 35 взаймодействиє зтих двух сил, ведущий к состоянию, предполагающему образование опухолей. Одним из таких - факторов является мутация в генах-супрессорах новообразований (У/еіпрего, 1991).

Одним из важньїх генов-супрессоров новообразований является ген, кодирующий клеточньйй протеин, роз, которьій представляет собой ядерньій фосфопротеин Казз (замещенньій в цикле фосфопротеин Казбз), которьй « управляет клеточной пролифератией (процессом разрастания клеток). Мутации, происходящие с геном роз, и З 70 потеря аллельного гена на хромосоме 17р, где зтот ген размещен, представляют собой одни из найболеє с распространенньїх видоизменений, идентифицированньх в злокачественньїх новообразованиях человека. з» Протеин р53З обладает вьісокой степенью сохранности в процессе зволюции и проявляется в наийболее нормальньїх тканях. Бьіло продемонстрировано, как природньій р5З3 должен бьть вовлечен в управление клеточньім циклом (Мегсег, 1992), в процесс транскрипционного регулирования (РіЕта35 еї аї., 1990, апа Міеї» еї 49 а, 1992), в репликацимй ОМА (УМїсосК апа І апе, 1991, апа Вагодопейі еї аіІ., 1991) и в возбуждение апоптоза це. (Хопізп-Коцасні еї аї, 1991, апа, Зпаму еї аї., 1992). со Известньї различнье мутантнье аллельньсе гень! р53, в которьїх единственное базовое замещение ведет к синтезу протеинов, которне имеют совершенно другие характеристики, определяющие закономерности роста, о что, в конечном счете, ведет к злокачественньім новообразованиям (Ноівіеїп еї а!., 1991).Действительно, бьіло

Ге»! 20 установлено, что ген р53 является найболее часто мутированньім геном при раке у человека (Ноїївіеїп еї аї., 1991; МУеіпрего, 1991) и, в частности, ассоциируется с теми разновидностями рака, возникновение которьсх сл связано с сигаретньм дьімом (Ноїівіеїп еї аї., 1991; 7акиш-Ноигі еї аіЇ 1985).Чрезмерная зкспрессия роЗ в опухолях груди также бьіла документально подтверждена (Сазеу еї а|!., 1991).

Одним из аспектов, привлекающих найбольшее внимание генной терапии рака, является использование генов-супрессоров, таких как р53, для лечения опухолей. Бьіло установлено, что трансфекция (заражениє

ГФ) клеток чужеродной нуклейиновой кислотой, например вирусной) природного гена ро3 в определенного типа опухолевьх клетках рака груди и легких может восстановить управление процессом подавления роста в о клеточньїх линиях (Сазеу еї а/!.,1991, Такапазві еї аі., 1992).Хотя трансфекция ОМА не является жизнеспособнь!м средством введения ОМА в клетки пациентов, зти результатьі служат демонстрацией того, что внедрение 60 природного гена р53 в раковьіе клетки, содержащие мутированньій р53, может стать зффективньм методом лечения, если будут разработаньі усовершенствованнье способь! внедрения гена роз.

В настоящее время ведется изучение проблемь! и создаются системь! внедрения гена, которьіе могут бьіть применень! в генной терапии для подавления роста опухоли. Средства на основе вируса для трансфекции гена вьізьшают особьй интерес, благодаря способности вирусов инфицировать действительно живье клетки. 62 Налицо способ, в котором вирусньйй генетический материал перемещаєтся самостоятельно. В зтой связи уже бьли оотмеченьй некоторье успешнье решения, например воспроизведение ретровирусньїх векторов (направленньїх на вирусь!?), разработанньїх для доставки внедряемьїх генов. Однако, существуют серьезнье проблемь), связаннье с использованием ретровирусньїх векторов в генной терапии. Поскольку их Зффективность зависит от о наличия ретровирусньїх рецепторов на клетках-мишенях, их трудно сконцентрировать и обеззаразить, и, кроме того, они могут зффективно внедряться только в размножающиеся клетки (репликационнье клетки).

Недавно бьіли предложеньї аденовируснье векторнье системь! для использования в некоторьїх протоколах перемещения определенньїх генов, однако, современнье методь! приготовления аденовирусов-рекомбинантов 7/0 ймеют недостатки, которне заключаются в следующем: Зти методьй основаньі на трансфекции вирусов зкспрессии и аденовирусньїх плазмидов в клетках-хозяевах и последующей реакции розеткообразования на зараженньїх клетках. При зтом, даннье методьі трансфекции имеют промежуточное звено в виде фосфата кальция.

Такие методьі! осуществления трансфекции незффективньі и их типичньмм результатом является низкий /5 уровень воспроизведения вирусов.

Позтому остаеєтся очевидной необходимость в разработке новьіїх методов внедрения генов-супрессов подавления роста новообразований, таких как ро3, в клетки в качестве средств для восстановления функции подавления роста. Большой интерес вьізьїівают также способь! приготовления вирусов-рекомбинантов, которье исключают грансфекцию с промежуточньм звеном в виде фосфата кальция и присоединение агарозь! для 2о реакции розеткообразования.

Настоящее изобретение относится к изложенньм вьше проблемам создания зффективньїх способов получения аденовирусов-рекомбинантов, таких например, как аденовирус р53, и зффективньїх средств, с помощью которьїх возможно восстановление функции ро3, воздействующих на клетку с видоизмененньм роз.

Полученьі векторьі аденовируса-рекомбинанта и вирионь; предложень способьі использования зтих с об боставов, с целью доставки природной зкспрессии роЗ в клетки с отклоненньми от нормь! функциями роЗ,какими являются раковье клетки. Кроме того, еде одним существенно новьім признаком изобретения і) является упрощенньій протокол воспроизведения аденовируса-рекомбинанта, благодаря использованию трансфекции ОМА с промежуточньм звеном липосомь! с последующим цитопатогенньм зффектом, т.е. патогенньімм воздействием вируса на культуру ткани, и, предпочтительно, исследованиями цепной реакции ю зо полимеризации (РОК).

Более того, использование зтого нового метода образования и / воспроизведения ікс, аденовирусов-рекомбинантов показало, что другие гень! могут бьіть инкорпорированьі в бином вириона. Зти су гень! могут включать геньі-супрессорьї новообразований, например ген ретинобластомь! (гр), невосприйимчивье онкогень, т.е. апіі-с-тус и апіі-К газ, и другие геньї, несущие ответственность за управление процессом роста о з5 при генной терапии рака. ча

Мспользуя настоящее изобретение, изобретатели продемонстрировали замечательньй зффект в управлений ростом метастазь. Бьіло показано, что аденовирус-рекомбинант ДаБСММ-ро5з значительно снижает интенсивность роста измененньїх клеток. Вирус подавлял онкогенность инфицированньїх вирусом клеток Н 358.

Кроме того, он предотвращал рост ортотопического рака легких, когда вирус вводился внутритрахеально, « следуя за внутритрахеальной инокуляцией клеток Н226ВГг. з с Подавление онкогенности также наводит на мьісль о том, что даже временной зкспрессии вьісокого уровня протеина р53 может бьіть достаточно для возбуждения зффекта, уничтожающего опухолевне клетки. ;» В одном из вариантов осуществления данное изобретение касается векторньїх структур для введения природньїх генов роЗ в клетки-мишени, причем существует подозрение, что даннье клетки-мишени содержат Мутированнье или отклоненньсе от нормь! гень! р-53, включающие раковне клеточньсе группь!. -І Зти варианть! изобретения предусматривают приготовление зкспрессии гена или единиць! транскрипции, в которой ген располагается под контролем промотора, а упомянутая единица внедряется в аденовирусньй о вектор вместе с аденовирусом-рекомбинантом. Данное изобретение обладает новизной и оригинальностью

ГІ решения проблемь! по нескольким причинам: Во-первьїх, ранее существовало мнение, что вирус роЗ не может Воспроизводиться в "упаковьівающих" клетках, например таких, которье используются для получения

Ме. аденовирусов, из-за их возможной токсичности; во-вторьїх, Е1В аденовируса оказьівает влияние на р5З и зтим с самьїм отрицательно влияет на его функции; в третьих, получив возможность к воспроизведению, аденовирус ро3 обнаруживает неожиданную способность к зффективному подавлению роста различньїх раковьїх клеток; и наконец, онкогенность клеток рака легких бьіла подавлена, благодаря лечению с помощью Дазхсмум-рзз, но не с помощью контрольного вируса.

Все зти моменть! указьвают на то, что новьій метод доставки протеина р53 и способ его приготовления (Ф, обнаруживают поразительную терапевтическую зффективность. Таким образом, настоящее изобретение ка касается аденовирусньїх векторньїх структур, которне вовлекаются, за счет использования аденовируса, в процесс переноса генов-супрессоров роста новообразований, например ро53, нечувствительньїх онкогенов и бо других генов при терапевтическом лечении рака у человека. В одном из вариантов изобретения показань рекомбинантнье аденовируснье вирионьі или частиць, инкорпорирующие такие векторь, и нлших фармакологические составь, которье содержат рекомбинантную вставку, имеющую область зкспрессии, кодирующую природньій р53, посредством которого векторбьі получают возможность создавать условия для проявления роз (зкспрессии р53) в метастатических клетках человеческого организма. Область зкспрессии роЗ3 65 В векторе может содержать последовательность геномов, но для упрощения можно предположить, что более предпочтительно использование последовательности СОМА р53, так как зто легко доступно для анализа уровня техники в данной области и проще в управлении процессом. Рекомбинантная вставка вектора должна также включать провоцирующую область и сигнал полиаденилации (роїуадепііайоп), например ЗМ40 или сигнал полиаденилации гена протамина.

В предпочтительньїх вариантах изобретения предполагается, что может возникнуть необходимость в созданиий сильного, существенного (структурного) промотора, например промотора цитомегаловируса (СМУ), вирусного ГТК, К5М, промотора 5М40 или промотора, ассоциированного с генами, которне проявляются на вьісоких уровнях в клетках млекопитающихся, например в факторе-1 злонгации или в промоторах актина. В настоящее время найболее предпочтительньім промотором считается промотор ГЕ вируса цитомегалий (СММ). 70 Ген р53 с ОМА может бьіть введен в аденовирус-рекомбинант, в соответствии с настоящим изобретением, простьім включением или добавлением кодирующей последовательности рб53З в вирусньй геном, которьй испьітьівает недостаток в Е1В. Однако, в качестве предпочтительньїх аденовирусов следует рассматривать дефектнье вирусь! репликаций, в которьїх вирусньїй ген, существенньій для репликации и/или "упаковьівания" бьлл удален из аденовирусной векторной структурьі, давая возможность зоне зкспрессии ро3 переместиться на /5 бвое место. Любой ген, в дополнение к Е1В то ли существенньй, например ЕТА, Е2, Е4, то ли несущественньй, например ЕЗ, для репликации, может бьіть удален и замещен роз.

В частности, предпочтительньми являются те векторь! и вирионь, в которьїх области ЕТА и Е1В векторов аденовируса удаленьі, а зона зкспрессии ро53 внедрена на их место; что показано в качестве примера на структуре генома на Фиг.1.

Технологические процессьі! приготовления репликационньїх дефектньїх аденовирусов хорошо известнь! из уровня техники, что подтверждаєтся приведенньіми в данном описаний аналогами Сповз8в-Споцанагу и Стапбат (1987); МсОгогу еї аї., (1988); и СіІй2тап еї аїЇ.,, (1982), перечисленньми в ссьлках на использованную литературу. Кроме того, хорошо известно, что могут бьіть использованьі! различньюе клеточнье линии, с целью воспроизведения аденовирусов-рекомбинантов, при зтом, их воспроизведение может продолжаться до тех пор, с г пока существует возможность дополнения дефекта репликации, если таковой присутствует. Предпочтительной клеточной линией является клеточная линия 293 человека, но существуют также и другие клеточнье линии, і) приемлемье для репликации, например, могут бьіть использованьі! в предпочтительном случае зкспрессии ЕТА и Е18. Причем клетки могут воспроизводиться как на пластмассовьїх чашках, так и в культуре суспензии, чтобь получить запасьї культурь! вирусов. ю зо Изобретение не ограничиваєтся вирусами с недостающим звеном Еї и клетками с зкспрессией Е1.

Действительно, связи с настоящим изобретением, могут бьіть использованьі! другие дополняемьіе комбинации ікс, вирусов и клеток-хозяев, причем зтот процесс дополнения (замещения) будет длиться до тех пор, пока вектор с роЗ не останется без Е1В. Могут бьть использованьі клетки с зкспрессией Е?2 и вирус, теряющий функциональное звено Е2 точно так же, как и клетки с зкспрессией Е4 и вирус, теряющий функциональное звено о з5 Е4 и т.д. В том случає, если несущественньій для репликации ген удаляется или замещается, каковьм, ча например, является ген ЕЗ, такой дефект нет надобности отдельно укомплектовьвать с помощью клетки-хозяина.

Что касается природь! векторов аденовирусов и вирионов, то для успешного их использования в связи с настоящим изобретениегм, решающим фактором является только удовлетворение требований, связанньх с « отсутствием в векторах аденовирусов и вирионах Е1В. Может бьть использован любой аденовирус из 42 нт») с известньїх различньїх серотипов или подгрупп А-РЕ. Аденовирус типа 5 подгруппь! С является предпочтительньім стартовьим материалом для получения цельного репликационно-дефектного вектора аденовируса для ;» использования в методике, предлагагмой настоящим изобретением. Аденовирус типа 5 вьібран потому, что, в связи с зтим аденовирусом человека, накоплен значительньій обьем биохимической и генетической Мнформации, и, кроме того, он традиционно применяется для большинства структур, использующих аденовирус -І в качестве вектора.

Дополнительньіми обьектами настоящего изобретения являются новьіе сегментьі ОМА р5З или векторь о зкспрессии, а также рекомбинантньюе клетки-хозяева, которье инкорпорируют аденовирусньій вектор роз,

ГІ приготовленньй в соответствий с настоящим изобретением. Сегментьі ОМА, в соответствии с настоящим Мзобретением, должньі, в основном, содержать, в направлений 5-3! транскрипции, промотоз цитомегаловируса

Ме, 1Е, структурньій ген для природного человеческого ро5З3 и оранний сигнал полиаденилации 5М40. с Рекомбинантная, содержащая аденовирус клетка-хозяин должна представлять собой звкариотическую клетку -хозяин или клетку млекопитающегося, такую как, например клетка 293, или такой клеткой может бьіть клетка с дефектом в гене ро53, которая бьіила инфицирована аденовирусом, в соответствии с изобретением. 5Б Следующие примерь осуществления изобретения касаются фармацевтических составов, содержащих аденовирус-рекомбинант, которьій кодирует природньй ро5З, рассеянньїх в фармакологически допустимьсх (Ф, растворах или буферньх смесях предпочтительнье, фармакологически допустимье растворьі включают ка нейтральньюе физиологические растворьї, защищеннье фосфатом, лактатом, тризом (Ттгів) и т.п. Безусловно, существует стремление очистить аденовирус до такой степени, чтобьі существенно освободить его от бор нежелательньх загрязнений, таких например, как дефектнье, создающие помехи аденовируснье частиць! или зндотоксинь! и другие пирогень, чтобь! зтот аденовирус, не вьізььвал побочньїх реакций в организме животного или человека, получающего векторную структуру. Предпочтительньми средствами очистки вектора является создание условий для использования градиентов плавучей плотности, например, центрифугирование хлорида цезия в градиенте плотности. 65 Последующие варианть! создания изобретения относятся к способу возбуждения зкспрессии ро3 или восстановления зкспрессии природного протеина ро5З в клетках, испьітьвающих дефицит в природном протеине роЗ3. Для вьіполнения зтой задачи следует обеспечить контакт клетки, несущей мутацию р53 с некоторьм количеством аденовирусов-рекомбинантов, которье, в соответствии с изобретением, способнь! заставить проявиться зкспрессии природного ро5З в клетке. Зто может бьть осуществлено путем введения 0 физиологически зффективного количества фармацевтического состава, содержащего аденовирус, в организм животного или человека, которьій поражен клетками с дефектньїм р53, каковьіми, например, являются раковье клетки. Позтому настоящее изобретение относится также к зффективньм способам лечения раковьх заболеваний человека, а именно рака груди и рака легких.

Еще в одном варианте осуществления изобретения аденовирус роЗ с вьіраженной зкспрессией роз 7/0 используется для предотвращения раковьїх заболеваний и даже для подавления роста метастаз. В одном из вариантов использования изобретения рекомбинантньй аденовирус с проявляющейся зкспрессией роз используется для подавления бесконтрольного роста клеток, которье имеют мутации гена рб53. В предпочтительньїх вариантах аденовирус с проявляющейся зкспрессией ро3 подавляет онкогенность и рост только клеток НЗ58, но никаких других, что может бьіть использовано в качестве индикатора функции роза.

В следующем варианте использования изобретения вирус с вьіраженной зкспрессией р53 используется для предотвращения ортотопического роста опухоли легких при введений вируса внутритрахеальнь!м способом.

Вирус АазСММ показал обнадеживающие результать! в испьітаниях на безволосьїх мьішах. Вирус подавлял онкогенность пораженньхх вирусом клеток НЗ5Б8, клеток которне нормально производят значительнье опухолевье массьі. Введение вируса также предотвращало ортотопический рост опухоли легких при введений го Ввируса внутритрахеальньм способом сопровождающим внутритрахеальную инокуляцию клеток Н226ВГ, подтверждая воздействие дДабвсмММ-ро3З іп мійго на клетки рака легких. Онкогенность клеток рака легких подавлялась только посредством лечения даз5сСммМ-рбо3, но не контрольньм вирусом АабБ/к5м/0512, что указьввает на терапевтическую зффективность протеина р53. Специалистам, компетентньім в данной области знаний, должно бьть очевидно, что, в соответствий с настоящим изобретением, предполагаются и другие с методь доставки вируса.

Поскольку все признаки данного изобретения представленьії использованием структур р5З3, в связи с і) восстановлением нормальной функции клетки и для использования при лечениий рака, существует предположение, что данное изобретение применимо, в основном, для любой ситуации, когда есть намерение достичь вьісокого уровня зкспрессии протеина, подавляющего рост в клетке -мишени или клетке-хозяине путем ю зо Мспользования аденовирусов-рекомбинантов. Например, в контексте моделей для лечения рака, касающихся формьі, но не содержания, изобретением предлагаєется частньій вариант, в дополнение к замещению роз, ікс, которьій представляет собой введение гена (тб) ретинобластомь), (с-тус или с-газ) нечувствительньх с (антисенсорньх) онкогенов и других генов, имеющих отношение к терапийи рака человека.

Следует отметить, что, поскольку используемьй вектор аденовируса является дефектной репликацией, он о з5 Не сможет повториться (размножиться) в таких клетках, которне являются раковьіми и которне обязательно ча инфицируются. Итак, при продолжений лечения определенной группь! пациентов, например пациентов, которье вступили в начальную стадию терапиий рака, для них может потребоваться повторное внедрение вируса после определенного периода времени, например через 6 месяцев или через год.

Векторьї аденовируса по настоящему изобретению находят также применение в вариантах осуществления « Мзобретения, которье непосредственно не связаньй с сгенной терапией Альтернативнье варианть в с использования включают, например, анализь іп мйго и исследования мутагенезиса различньїх генов ро5З и

Й рекомбинантное получение протеинов для использования, например, в воспроизведений антитела или в других а вариантах. В вариантах изобретения, которье не связаньі с терапевтическими способами лечения человека, включая все те, которнше касаются дальнейшего определения активности роЗ на молекулярном уровне, могут бьіть использованьі другие соответствующие вирусьі для переноса р5З в клетку. Вирусьі, относящиеся к -І семейству герпес-вирусов, например, герпес-симплекс - вирус (Н5М), Зпштейн-Барр-вирус (ЕВМ), цитомегаловирус (СММУ), а также вирусьїь инфекционного бульбарного паралича (РЕМ) могут послужить о доказательством данного суждения.

ГІ Отдельньім аспектом настоящего изобретения является упрощение способа получения любого из типов аденовирусов-рекомбинантов, благодаря исключению использования незффективного способа трансфекции с

Ме. применением, в качестве промежуточного звена, фосфата кальция и трудоемкой реакции розеткообразования. с В соответствии с настоящим изобретением, чтобь! получить аденовирус -рекомбинант, следует просто ввести плазмид аденовируса и вектор зкспрессии в подходящую клетку-хозяин путем трансфекции с промежуточньім звеном липосомь, а затем проанализировать культивированную клетку-хозялин на предмет присутствия дв цитопатогенного зффекта (СРЕ), которьїй является показателем существления гомологической рекомбинации и получения вируса. (Ф, Новьїй способ отличается увеличением зффективности трансфекции первого зтапа, которьій способствует ка лучшему протеканию второго, которьій зффективно проявляется на зтапе цитопатогенного зффекта (СРЕ).

Предпочтительньм составом для использования в трансфекции с промежуточньм звеном липосомь! бо является ООТАР (М-І-11-022,3-дидеоилокси)-пропил)-М,М,М-триметил-аммониумметисульфат), которьій доступен для приобретения на коммерческом рьінке. Цитопатогенньій зффект (СРЕ) является признаком, которьй поддаєется непосредственному наблюдению. Он может оцениваться путем использования метода фазово-контрастной микроскопии. Цитопатогенньій зффект (СРЕ) характеризует морфологические признаки цитотоксичности аденовируса, которая начинается со сморщивания инфицированной клетки, за счет 65 лизирующего влияния, и завершается образованием литической бляшки. Отличительной особенностью данного метода является то, что воспроизведение вируса обязательно дает о себе знать после 10-14 дней инкубационного периода. Зто является значительньм преиймуществом по сравнению с трансфекцией, использующей в качестве промежуточного звена фосфат кальция и последующую реакцию розеткообразования, при которой требуется, по крайней мере, 14, а обьічно минимум до 21 дня, хотя зачастую

Зтот срок вьірастает до нескольких недель, прежде чем могут бьіть оценень! результати.

В некоторьїх примерах осуществления способ по изобретению может бьть использован в связи с аденовирусньми плазмидами, которне являются репликационно-дефектньми вместе с клеткой-хозяином, которая дополняет дефект, как показано на примере плазмидов с недостающим Еї и клеток 293.

Аденовируснье плазмидьй с недостающими функциональньми ЕЛЛА и Е1В, и которье инкорпорируют зону 7/0 зкспрессии р53, используются для описания примера осуществления способа по данному изобретению. Однако, любье зонь зкспрессии могут бьть инкорпорированьй в аденовирусе-рекомбинанте подобньм образом.

Отдельнье методологические аспектьі могут, при желаниий, меняться. Однако, предполагаєется, что, в определенньх случаях, должна бьіть предпочтительной среда МЕМ.

Даннье новье методь! могут бьїть скомбинированьі с цепньмми реакциями полимеризации (РСК) для 7/5 подтверждения наличия правильно рекомбинированного вируса.

Цепная реакция полимеризации (РСК) хорошо известна из уровня техники, см. патент США Мо4683195, приведенньй в качестве аналога. Чтобьії получить возможность использования РСК в соответствии с настоящим изобретением, следует получить ОМА из надосадочной жидкости клеток, проявляющих цитопатогеийньій зффект, и подвергнуть анализу ОМА с использованием цепной реакции полимеризации (РСК), в которой участвуют две го парьі первичньїх злементов, один-специфический вектор зкспрессии, другой - аденовирусньй геном - специфическая ОМА.

Вектор или вводимая специфическая ОМА-(по определению) генньіїй сегмент, которьій является частью ОМА, кодирующей полипептид или генньій сегмент КМА, которьій стремится к вніражению своей зкспрессии, как зто проиллюстрировано ЮОМА-зкспрессией р53, тКМА и получением ротеина. Специфическая ОМА генома сч г спеповнруса может являться любой частью генома, проявляющей свою зкспрессию при управлений процессом о воспроизведения.

Частью настоящего описания являются рисунки, которье включень для дополнительного раскрьтия определенньїх аспектов изобретения. Изобретение может бьїть лучше понято при обращении к одному или целому ряду приведенньїх рисунков в сочетаний с подробньім описанием отдельньїх вариантов осуществления ю зо Мзобретения.

Фиг.1. Дана схема образования аденовируса-рекомбинанта р53. Кассета зкспрессии р53 бьіла введена ісе) между Хаа 1-й Сіа 1 участками рХСЛІ.1. Вектор зкспрессии р53 (рЕС5З) и рекомбинантньій плазмид (р.)М17) с бьіли подвергнуть! котрансфекции в клетках 293. Зараженньсе клетки вьідерживались в среде до тех пор, пока не проявлялся цитопатогенньій зффект. Идентификация вновь образованньїх аденовирусов-рекомбинантов роЗ о (дазхсмм-ро53) производилась на пробах цепной реакции полимеризации (РСК) ОМА с использованием матриц ї-

ОМА, приготовленньїх из надосадочной жидкости, обработанной протеиназой К и зкстрактом фенола.

На Фиг.2А показана карта, применяеємая для структурньїх исследований ОМА давБсмм-ро53. Карта ОМА генома ДасСММ-роЗ с местами расположения кассет зкспрессии р53, первичньїх материалов цепной реакции полимеризации (РСК) и ограничивающих участков. Размер генома около 35,4Кр, разделеннье на 100 ячеек « Карть! (1т.и. (ячейка картьІ-0,35КБ). Кассета зкспрессии заняла место зоньі Е1 (1,3-9,2т.и.) генома Ада5. з с Первичньй злемент 1 сосредоточен в первом интроне, расположенном вниз по траектории движения промотора главного гена ТЕ цитомегаловируса (СММ) человека. Первичньій злемент 2 сосредоточен в зоне раннего ;» сигнала полиаденилации 5М40. Оба зти злемента расположеннье в 15-20бр от ввода СОМА роіз на двух концах, определяют продукт 1,40Ко цепной реакции полимеризацин (РСК). Первичньсе злементь З и 4 сосредоточень в ячейке карть! (т.и.) и 13,4 ячейке карть! (т.и.)генома Ад5, соответственно, и определяют специфический -І продукт 0,86КЬ цепной реакции полимеризации (РС11) геномавируса.

На Фиг2В показаньі пробьії геля агарозьь продукта цепной реакциийи полимеризации (РСК). Две парь о первичньїх злементов (параметров), которне определяют фрагментьї ОМА 1,4КЬ (р53) и 0,86КЬ (Аа5), бьіли ко использованьі в каждой реакции. В каждой реакции бьіли использованьї матриць ОМА: плазмид рЕС53З (1-я 5р полоса), ОМА Ааз/ксСмМ/свІ 2 (2-я полоса), никаких ОМА (3-я полоса) и ОМА Дазсму-розз (4-я полоса). Полоса с

Ме. обозначением (М) соответствует генам-маркерам молекулярного веса. сп На Фиг2С показано картирование ограничения ОМА давсмм-р53. Образць ОМА, очищенной от

С8СіІ-градиента АЯАБСММ-роі3, бьіли классифицировань! по признаку отсутствия знзима ()), Ніпа ІП (Н) (задний, задняя нога туши), Ват НІ (В), Есо КІ (Е) и Сіа І (С), соответственно, и проанализировань! на 195 геле агарозь!.

Б Дорожка с обозначением (М) соответствует генам-маркерам молекулярного веса.

Ріа Фиг.зЗА, ЗВ, ЗС и 30 показаньі результатьь наблюдения цитопатогенньїх зффектов на клетках 293,

Ф) полученньїх с помощью аденовируса-рекомбинанта. На Фиг.ЗА , ЗВ, ЗС и ЗО даньї серии фазовьїх контрастньх ка изображений (х400) клеток 293. На Фиг.ЗА, ЗВ, ЗС и 30 дань четьіре фотографии одной фигурьі, показанной на странице. Фигура 2А-перед трансфекцией, фигура ЗВ -отрицательньй контрольньій результат на 12-й день бо после трансфекции, фигура ЗС -появление цитопатогенного зффекта (СРЕ) на 12-й день после трансфекции, фигура ЗО-полное проявление цитопатогенного зффекта (СРЕ) на 14-й день после трансфекции.

На Фиг.4А, 48, 4С и 40 дана иммунология клеток, инфицированньїх аденовирусами-рекомбинантами. На

Фиг.АА, 4В, 4С и 40 показаньії серии иммунологических изображений клеток НЗ58. На Фиг.4А, 4В, АС и 40 дань 4 фотографии фигурьі), представленной на одной странице. Проявление способности к инфицированию в 65 Клетках НЗ58. Клетки НЗ58 бьіли инфицированьї АЯАБСММ-роЗ или Аав/ксСмусІ2 в 50 РЕШ/клетка в течение 24 часов. Питательная среда бьла использована, единственно, в качестве смоделированной инфекции.

Инфицированнье клетки бьіли проанализированьї с помощью иммуноокрашивания. На Фиг.4А представлень результать! испьітаний смоделированной инфекции с помощью антитела апіі-р53. На Фиг.48О8 показань! клетки, инфицированнье контрольньмм Аабв/к5мМ/512 и испьтаннье с помощью антитела апіі-р53. На Фиг.4С дань инфицированнье клетки АЯДБСММ-роіЗ3, испьітаннье с помощью несвязанного антитела (МОРС-21). На Фиг.А40 показана клеточная инфекция АЯа5СМУ, испьтан чая антителом апіі-р53. В качестве антитела апіі-р53 бьіл использован Раб 1801, а для окрашивания применяли авидино-биотиновьй метод.

На Фиг.5А показано сравнение относительного уровня зкспрессии зкзогенного роЗ в клетках НЗ5В с помощью геля 5О5-РАСЕ, окрашенного в голубой цвет (Соотазвзвзіе-біце). Образцьі клеток НЗ58, которне бьіли 7/0 Мнфицированьї АЯ5СМУ-роз3 или Даз/кзм/512 в ЗОРЕО/клетка, препарировались в течение 24 и 72 часов после инфицирования. Испьітьшшвались образцьії пробьі ЗО5Б-РАСЕ, окрашенной в голубой цвет (Соотагвзвіе-ЬКіє), с целью определения относительного содержания протеина. Полосьй 1 и 4 содержат образць! клеток, инфицированньїх ДаОБ/КЗМ/ОІ 2.

Полось 2 и З содержат образць! клеток, имуфицированньїх двумя индивидуальньми группами АаЗСММ-роз /5 Через 24 часа после инфицирования. Полосьр 5 и б-зто образцьї ДазсСмМмМ-роЗ-инфицированной клетки, собраннье через 72 часа после инфицирования. Полоса 7-зто образец Н 358 с моделированньм инфицированием через 72 часа после инфицирования. Полоса М-зто предварительно окрашеннье геньі-маркерьї молекулярного веса в КОСа (СІВСО-ВКІ).

На Фиг.5В дан блотированньій УУезіегп анализ геля, размещенного на полосе, идентичной той, которая 2о принадлежит ЗО5З-РАСЕ на Фиг5А. Относительнье уровни зкспрессии роз бьіли исследованьі УУезіегп блотированием с использованием апіії-р53. Первичнье антитела бьіли моноклональньмми антителами против протеина р5З3 (Раб 1801, Опсодепе Зсіепсе Іпс.) и (-актина (Атегзпат Іпс.) НКР-коньюгированное вторичное антитело и ЕСі-проявитель бьіли полученьї из вирус-инфицированньїх клеток НЗ58, прошедших Уу/евіегп блотирование (Атегепат Іпс.). Отпечаток, полученньй УУевіегп блотированием, на Фиг.5В, имеет сч об Зквивалентную методику восстановления и лечения, что и у тех, которне представлень на Фиг.5А.

На Фиг.б показано время опротекания зкспрессии ро53, определенное УУевзіегп блотированием. і)

Множественнье чашки клеток НЗ58 бьіли инфицированьї АЯБСММ при 1ОРЕШ/клетка. Клеточнье лизать! бьіли приготовленьї в установленнье моменть! времени после инфицирования. У/езіегп блотирование бьло испьітано с помощью антител анти-ро53 и анти-актина одновременно. Полосьї с отметкой "С" представляют отрицательнье ю зо результать!. Гистограмма показьівает относительнье количества р53, определеннье с помощью денситометра.

На Фиг.7А показана кривая роста вирус-инфицированньх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях ікс,

Н 358. Клетки бьіли засеянь! в количестве 10 клеток на чашку (60 мм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек с на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки бьіли инфицированьь АЯ5СММ-роЗ3 или дав/кзмМ/512 при 10т.о.і. (Х«множественность инфицирования, т.е. РЕО/клетка). После инфицирования клетки подсчитьівались ме) з5 ежедневно в течение 6 дней. Кривьіе роста представляют данньє, полученнье при наблюдений четьірех ча отдельньїх исследований.

На Фиг.7В показана кривая роста вирус-инфицированньх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях

Н 322. Клетки бьіли засеяньі в количестве 10 5 клеток на чашку (60 мм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки біли инфицированьї АЯАБСММ-ро5З или Аав/квм/сіІ 2 при «

ЛОт.ої. (множественность инфицирования, т.е. РЕМ/клетка). После инфицирования клетки подсчитьввались з с ежедневно в течение б дней. Криве роста представляют даннье, полученнье при наблюдений четьрех отдельньїх исследований. ;» На Фиг.7С показана кривая роста вирус-инфицированньмх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях

Н 460. Клетки бьіли засеяньі в количестве 10 5 клеток па чашку (бОмм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки бьіли инфицированьї А4ЇБСММ-роЗ или Дав/кзм/сІ2 при -І 10т.о.і. (множественность инфицирования, те. РЕШ/клетка). После инфицирования клетки подсчитьівались ежедневно в течение б дней. Криве роста представляют даннье, полученнье при наблюдений четьрех о отдельньїх исследований. ко На Фиг.8 показана схема последовательности операций при исследований АЯ5СММ-рб5З в ортотопической 5р Модели рака легких. Дозировка и методика лечения безволосьїх мьішей, зараженньїх клетками Н226Вг и

Ме. вирусами, представлень в указанной схеме. сп На Фиг.9А. 98, 9С и 90 показань! образць! средостений, легких мьішей, прошедших лечение, и контрольньх мьішей. Фиг.9А, 98, 9С и 9О-зто фотографии одной фигурь. Особь бьла принесена в жертву в конце б-недельного периода, наступившего после прекращения лечения. Ткани легкого и средостения бьіли иссечень ов для изучения опухолевого формообразования. На Фиг.ЗА показан образец медиастинального блока от нормальной безволосой мьши. На Фиг.9В дан образец медиастинального блока из мьіши, которая бьла

Ф) подвергнута лечению с помощью переносчика фосфатно-солевого буферного раствора (РВ5). На Фиг.9сС ка показан образец медиастинального блока от мьіши, прошедшей курс лечения Ааб5сСмММ-ро3. На Фиг.90 представлен образец медиастинального блока, взятого от мьіши, прошедшей курс лечения Аав/кБм/соі 2. 60 Стрелки указьівают на опухолевне массь.

А. Явления, происходящие на молекулярном уровне при развитии рака легких. Исследования, проведеннье авторами настоящего изобретения, идентифицировали принципиально важнье явления на молекулярном уровне, ведущие к появлению и прогрессированию рака. Зто дало возможность изобретателям разработать новье методьі! восстановления известньїх нормальньх функций протеина до такой степени, когда фенотип, 65 Вьізнівающий раковне новообразования, может бьть подавлен іп мімо.

Найиболее распространеннье гистологий рака легких (8095) обьединеньій под названием "рак легких с вовлечением значительного количества клеток (М5СІ С)" и включают сквамозньй рак, аденокарциному и неидентифицированную форму рака с обширньмм вовлечением пораженньїх клеток. Накоплен большой банк данньїх, касающихся молекулярной биологии рака легких, которйе основаньй на изучениий не так часто встречающейся формь! рака легких с вовлечением небольшого числа клеток (5СІ С). ЗСІ С может бьіть отличен от МЗС С по нейрозндокринньїм признакам клеток. ЗСІ С очень чувствителен к химической терапии, но бьістро возобновляется после прохождения пациентом курса лечения. МЗС! С также может служить моделью для других форм зпителиального рака, вьізванного канцерогенньіми веществами. Научнье достижения, полученнье в результате создания настоящего изобретения, могут бьіть использованьь для лечения других форм 7/0 зпителиального рака.

Накоплен богатьй опьт, подтверждающий тот факт, что процессу злокачественньїх трансформаций предшествует генетическая парадигма. Основнье патологические изменения, происходящие в раковьїх клетках, касаются доминантньїх онкогенов и генов-супрессоров новообразований. Доминантнье онкогеньї имеют альтернативьі в классе генов, названнье прото-онкогенами, которне участвуют в принципиально важньх 7/5 функциях нормальньїх клеток, включая сигнальную трансдукцию и транскрипцию. Первостепенной важности модификации в доминантньїх онкогенах, которье обеспечивают возможность трансформации, включают точечнье мутации, трансформации, реклассификации и амплификации (расширения, усиления).

Геньі-супрессорьї новообразований необходимь! для осуществления гомозигозной утратьі функций за счет мутации и удаления или комбинирования последних, с целью получения трансформаций. Некоторье 2о гтеньі-супрессорьї новообразований предназначеньі для осуществления процессов управления разрастанием клеток путем регулирования трансплантации. Модификация зкспрессиий доминантньїх онкогенов и генов-супрессоров, по всей вероятности, влияет на определеннье характеристики клеток, которье способствуют возникновению злокачественного фенотипа.

Несмотря на увеличение накопленньїх знаний о механизмах, происходящих в процессе трансформаций, с об МспьІтьвающих опосредствованное влияние онкогенов, недостаточное развитие получили терапевтические методьї лечения, действие которьїх должно бьіть направлено специально на онкогень и их продуктьі, служащие і) мишенью для воздействия на них при лечебном процессе. Первоначально исследования в зтой области бьіли сосредоточеньі на доминантньїх онкогенах, поскольку они первьіми требовали описания. Исследования процесса переноса ОМА-промежуточного гена продемонстрировали механизм приобретения злокачественного (у фенотипа нормальньми клетками, в результате переноса ОМА от злокачественньїх опухолей человека.

В. Р-53 и мутанть р-53 в раковьїх новообразованиях. ісе)

Р-53 известен как ген-супрессор опухолевьїх новообразований (Мопіепагй, 1992). Вьісокие уровни его бьіли с обнаружень! во многих клетках, трансформированньїх химическим онкогенезом, ультрафиолетовой радиацией и различньми вирусами, включающими 5М40. Ген р53 представляет собой часто встречающуюся мишень ме) з5 Мутирующей инактивациий в большом разнообразий опухолевьх новообразований человека, и уже к документально подтверждено, что он является найболее часто встречающимся мутированньм геном в традиционньїх раковьіїх новообразованиях (Мегсег, 1992). Он мутируется более чем в 5095 рака легких с довольно обширньм вовлечением клеток (МЗСІ С) (НоїІезієвїп еї аіЇ., 1991) и в большом количестве других новообразований. «

Ген р-53 кодирует фосфопротеийн аминовой кислоть-375, которьій может формировать комплексь сота) с протеинами- хозяевами, например обширньій Т-антиген и Е18. Протеин обнаружен в нормальньх клетках и тканях, но в концентрациях, которье незначительнь, в сравнений с трансформированньми клетками или ;» тканями опухолевьїх новообразований. Интересен тот факт, что природньй р5б3, как бьіло установлено, играет важную роль в процессе регулирования роста клеток и их делении. Чрезмерная зкспрессия природного р53, как

ВвіяснИилось, в некоторьїх случаях подавляет пролифератию в клеточньїх линиях опухолевьїх новообразований -І человека. Так, роЗ может действовать как негативньій регулятор клеточного роста (УУеіпрего, 1991) и может непосредственно подавлять бесконтрольньй рост клеток или вьшолнять зту функцию опосредованно, о активизируя геньї, которне подавляют зтот рост. Отсутствие природного р53 или лишение его активности может

ГІ способствовать возникновению процесса трансформации.

Однако, некоторье исследования указьвают на то, что присутствие мутантного гена р53 может оказаться

Ме. необходимьї!м для полной зкспрессии трансформирующего потенциала гена Хотя признано, что природньй ген с роЗ3 является чрезвьмчайно важньм регулятором роста для многих типов клеток, играют роль также его генетические и биохимические признаки. Миссенс-мутации являются обьічньіми для гена рб53 и существенньіми для трансформирующей способности оонкогена. Единственное генетическое изменение, подсказанное в Тточечньми мутациями, может создать концерогенньй р53. Однако известно, что, в отличие от других онкогенов, точечнье мутации р53 встречаются, по крайней мере, в 30 отдельньїх кодонах, часто создавая доминантнье (Ф, аллельнье геньі, которье способствуют образованию смещений в фенотипе клетки без репозиции до ка гемозиготьі. Кроме того, многие из зтих доминантньїх негативньїх аллельньїх генов иногда переносятся в организме и передаются в линию зарождения инфекции. Различнье мутантнье аллельнье гень! могут бо переходить из минимально дисфункционального состояния в состояние чрезвьмчайно проникающих, доминантньїх негативньїх аллельньх генов (УУеіпрего, 1991)

Сазеу и его коллеги показали, что трансформация ОМА, кодирующая природньій ро53З в двух клеточньх линиях рака груди человека, восстанавливает функцию управления подавлением роста в таких клетках (Сазеу еї аІ., 1991) Подобньій зффект бьіл также продемонстрирован на трансфекции природного, но не мутантного, 65 роз в клеточньїх линиях рака легких человека (ТакКапйазві еї аіІ., 1992). Р5З проявляет доминантнье признаки по сравнению с мутантньм геном и может произвести отбор против пролифератии после трансфекции в клетке с мутантньмми генами. Нормальная зкспрессия подверженного трансфекции гена р53 не воздействует на рост клеток с зндогенньім р53. Таким образом, такие структурь! могут восприниматься нормальньми клетками без побочньїх зффектов.

Исходя из изложенного, можно заключить о возникновениий возможности лечения рака, имеющего отношение к ро3, природньмм роЗ путем уменьшения количества раковьїх клеток. Однако, исследования, приведеннье вьіше, далеки от практического применения, хотя бьі потому, что трансфекция ОМА не может бьіть использована для внедрения ОМА в раковье клетки в организме больного.

С. МЕТОДЬЇ ГЕННОЙ ТЕРАПИЙ 70 Разработано несколько зкспериментальньхх методов применения генной терапии, но они все имеют значительнье недостатки. (Миїйїдап, 1993). Как указьівалось вьіше, существует цельій ряд основньїх методов трансфекции, в которьїх ОМА, содержащая интересующий нас ген, вводится в клетки не биологическим путем, а, например, путем физического или химического проникновения через клеточную оболочку. Естественно, такие методьї ограничень!ї клетками, которье могут бьіть временно извлеченьї из организма и в состоянии перенести 7/5 Читотоксичность лечения, т.е. лимфоцить. Липосомь, или протейновье коньюгать, образованнье определенньми липидами, амфофильньми ептидами, могут бьть использованьь для трансфекции, но зффективность интегрирования гена остается все еще низкой, порядка одного случая интеграции на 1000-1000000 клеток, а зкспрессия зараженного гена часто ограничиваєется днями в разрастающихся клетках и неделями в неразрастающихся клетках. Позтому совершенно очевидно, что метод трансфекции не может бчитаться подходящим для лечения рака.

Второй метод основьівается на естественной способности вирусов проникать в клетки, внедряя в них свой собственньій генетический материал. Ретровирусьь имеют прейимущество в качестве векторов для переноса генов, благодаря своей способности внедрять свои геньії в геном-хозяин, перенося большое количество чужеродного генетического материала, инфицируя широкий спектр специфических групп клеток, которье с ов Вьістраиваются в специфические клеточнье линии. Однако, существуют три основнье проблемні, препятствующие практическому использованию ретровирусньїх векторов. Первое - ретровирусное і) инфицирование зависит от доступности рируеньїх рецепторов на поверхности мишени. Второе - ретровирусь зффективно интегрируют только в репликационнье клетки. Наконец, последнее -ретровирусь! трудно сконцентрировать и обеззаразить. ю зо р. АДЕНОВИРУСНЬЕ СТРУКТУРЬІЇ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЬЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ГЕННОЙ ТЕРАПИЙ

Аденовирусь! человека-зто опухолевье вирусьі двунитевой ОМА с размерами генома около ЗбКЬ (ТОО2А, ісе) 1981). Аденовирусь! бьіли широко изученьі и описаньі в качестве модельной системь! для зквариотической с генной зкспрессии, что заставляет воспринимать их как привлекательную систему для использования аденовирусов в качестве системь! для переноса генов. Такую группу вирусов легко вьіращивать и использовать, о зв при зтом они проявляют широкий круг хозяев іп мйго и іп мімо. В литически инфицированньїх клетках ї- аденовирусь! способнь! отсечь синтез протеина-хозяина, направляя клеточнье механизмь! на синтез большого количества вирусньїх протеинов и получение обильного количества вирусов.

Зона Еї7 генома включает ЕТА и Е1В, которье кодируют протеиньі, ответственнье за регулирование транскрипции вирусного генома и некоторьх клеточньїх генов. Зкспрессия Е2, включающая Е2А и Е2В, « обеспечивает синтез вирусньїх пликационньїх функций, например ОМА-связанного протеина, ОМА -полимеразь пт») с к окончательного протеина, что создает почву для репликации. Продуктьі гена ЕЗ предупреждают цитолиз,

Й вьізьиваемь!й цитотоксичньїми Т-клетками, и фактор некроза опухоли и играют важную роль для вирусного а воспроизведения.

Функции, ассоциированнье с протеинами Е4, включают репликацию ЮМА, зкспрессию последнего гена и отсечение клетки-хозяина. Продукть! последнего гена включают большинство протеинов капсида вириона, при -І зтом они проявляются только после того, как большая часть производства единственного главного транскрипта из основного последнего промотора будет вьіполнена. Последний основной промотор (МІ Р) проявляет вьісокую о зффективность в процессе последней фазьї инициирования (Зігацйога-Регтісацаеї апа Регїтісацаеї, 19914). ко Поскольку только небольшая часть вирусного генома требуется іп еїв (Тоола. 1981), аденовирус-производньсе векторь! предлагают отличньійй потенциал для замещения обширньїх фрагментов ОМА

Ме, при использованиий связи с такими клеточньми линиями, как для клеток 293. Ад5-трансформированная сп клеточная линия мезонефроса (первичной почки) (Сгапат, еї аї., 1977) била создана для обеспечения основньх вирусньїх протейнов іп (гапз. Изобретатели, таким образом, показали, что даннье характеристики адено-вирусов продемонстрировали хорошие предпосьілки для их использования, с целью прицельного попадания в раковье дв Клетки іп міго (Сгиппациз 8 Нопмі(г, 1992).

Особьне преимущества аденовирусной системь! для переноса инородньїх протеинов в клетку включают:

Ф) (1) способность к замещению относительно больших фрагментов вирусной ОМА с помощью чужеродной ка ОМА; (2) структурную стабильность аденовирусов-рекомбинантов; 60 (3) безопасность аденовирусного назначения для человека; (4) отсутствие каких бь-то ни бьло известньх ассоциаций аденовирусной инфекции с раком или злокачественньіми образованиями; (5) способность к получению вьісоких титров при использовании вируса рекомбинанта при лечении. (6) внісокую зффективность аденовируса. 65 Еще одним прейимуществом аденовирусньїх векторов, по сравнению с ретро-вирусамм, являются вьісокие уровни зкспрессии гена. Кроме того, репликация аденовируса не зависит от репликации гена-хозяина, что вьгодно отличает его применение от применения ретровируса. Поскольку аденовируснье трансформирующие геньі в зоне Е1 могут бьіть свободно удаленьї и при зтом обеспечивать существование векторов зффективной зкспрессии, существует мнение, что онкогенньій риск от аденовирусньїх векторов сводится к минимуму и не принимаєется в расчет (ОСтиппацзв 85 Ногміїг, 1992).

В основном, аденовируснье системь! переноса генов основьіваются на рекомбинантном сконструированном аденовирусе, которьій представляет собой репликацию, не укомплектованную за счет отсутствия части ее генома, например ЕТ1, по при зтом сохраняющую еще способность к инфицированию. Относительно большое количество чужеродньх протейнов может бьть проявлено, если в аденовирусном геноме осуществить 7/0 Ддополнительнье удаления. Например, аденовирусьі, неукомплектованнье в обеих зонах ЕЇ1 и ЕЗ, способнь переносить до ЛОКр чужеродной ОМА и могут бьть вьращень до вьісоких титров в клетках 293 (.Зігабога-Регтісацдеї 4 Регтісацаеї, 1991а). Кроме того, біла отмечена также удивительно продолжительная зкспрессия трансгенов, сопровождающая аденовирусное инфицирование.

Способ переноса гена с помощью аденовируса недавно бьіл изучен в качестве средства переноса гена 7/5 посредника в звкариотические клетки живьх организмов. Например, при лечений мьшей с редким рецессивньіїм генетическим расстройством-орнитозньім транскабамилаза-дефицитом (Огпіїпіпе ігапзсаграту!азе (ОТС)-бнло обнаружено, что аденовируснье структурь! могут бьіть использованьї для снабжения нормальньми" (ОТО) знзимами. К сожалению, зкспрессия нормальньїх уровней (ОТС) бьіла достигнута только в 4-х из 17-и примерах (Зіганога-Регтісацадегеї еї а)|., 19915). Позтому дефект бьіл только частично исправлен у большинства Мвішей, ч го не привело ни к физиологическим, ни к фенотипическим изменениям, а значит, такие результать оставляют мало надеждь! на возможность использования аденовирусньїх векторов в терапии рака.

Попьїтки использовать аденовирус при переносе гена для регулятора трансмембранной проводимости при фиброзно-кистозной дегенерации (СЕТК) в легочньій зпителий хлопковьїх крьіс также имели только частичньй успех без возможности получения биологической активности перенесенньїх генов в зпителиий животньх с об (КозептЕта еї аї., 1992). М опять -таки зти исследования продемонстрировали перенос гена и зкспрессию протеина СЕТК в клетках легочньїх дьхательньх путей (воздуховодов), но не подтвердили никакого і) физиологического зффекта В 1991г научная статья авторов КозепіЕта еї а! показала легочную зкспрессию -1-антитрипсин-протеина, которая опять-таки не дала физиологического зффекта. Авторь! зтой статьи пришли к вьіводу, что уровни зкспрессии, которую они наблюдали, составляют всего 2 процента от того уровня, которьй ю зо требуется для защитьй легкого человека, т.е. зти уровни намного ниже тех, которье способнь! дать физиологический зффект. ісе)

Ген для человеческого о).-антитрипсина бьіл введен в печень нормальньх крьіс путем иитрапсрталоной су иньекции, где наблюдалась его зкспрессия, результатом чего бьло обнаружение секреции веденного человеческого протеина в плазме зтих крьіс (Чаїе еї а!., 1992). Однако полученнье уровни не бьіли достаточно і.

ВьІсОКИ, Чтобь оказать какое-либо терапевтическое воздействиеє. че

Итак, даннье результать! не подтверждают того, что аденовирус в достаточной степени способен направить зкспрессию достаточного протеина в рекомбинантньїх клетках на получение релевантного физиологического зффекта, и позтому они не вьісказьвают предположения об использованиий потенциальньїх возможностей аденовирусной системьї для лечения рака. Кроме того, в существовавшем до настоящего времени уровне « техники бьітовало мнение, что роЗ не может бьіть инкорпорирован в упакованную клетку, такую, которую они Пд) с использовали для получения аденовируса, так как она могла бьіть токсичной. То, что Е1В аденовируса й присоединяется к р5З3, бьіло воспринято как еще оду причину того, что технология аденовируса и р5З3 не могут "» сочетаться.

Е. СТРУКТУРЬЇ АДЕНОВИРУСА Р5З И ПОДАВЛЕНИЕ ОПУХОЛЕВЬЇХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Настоящее изобретение предлагаеєт генную терапию рака с новьім и более зффективньм вектором -І подавления оопухолевьх новообразований. Данньій рекомбинантньій вирус использует преимущества аденовирусньїх векторов, такие как вьісокие титрьї, широкий диапазон поражения, зффективная трансдукция и о неспособность интегрировать в клетки-мишени. В одном из примеров осуществления изобретения получают ко репликационно-дефектньій, не требующий помощника независимьй аденовирус, которьй способствует проявлению зкспрессии природного роЗ3 (АазСММ-ро3) под управлением человеческого цитомегаловирусного б промотора. сл Контрольнье функции на векторах зкспрессии часто обеспечиваются вирусами, когда хотят достичь депрессии в клетках млекопитающих. Например, обьічно используемье промоторьї являются производньіми от полиомьі, аденовируса 2 и вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (5М40). Ранние и поздние промоторь! вируса ЗМ40 являются особенно часто применяемьми, так как они оба легко получаются из вируса в виде фрагмента, которьій содержит ЗМ40-вирусньій источник репликацимй Меньшие или большие 5М40 - фрагменть іФ) могут бьть также использован при условии, что включено приблизительно 250Бр последовательности, ко простирающейся от участка Ніпа Ії по направлению к участку Ва ІІ, сосредоточенному, в вирусном источнике репликации. Кроме того, возникает также возможность, и часто желаемая, использования промотора или бо Контрольньїх последовательностей, нормально ассоциированньїх с включенной генной последовательностью, при условий, что такие контрольнье последовательности совместимь! с системами клетки-хозяйна.

Источник репликации может бьть обеспечен структурой вектора, чтобь! включить зкзогенньій Источник, такой, например, которьій может бьіть производньім от ЗМ40 или других (например, полиомьї, адено, УМ, ВРМ) вирусньїх источников, или может бьть снабжен механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина. Гели б5 Вектор интегрируется в хромосому клетки-хозяина, зтого бьіваєт достаточно.

Структура и воспроизведение предпочтительного аденовируса р53 представлень! в виде графической схемь!

на Фиг.1. В связи с зтим бьіл разработан улучшенньій протокол для воспроизведения и идентификации аденовируса-рекомбинанта (будет описано ниже). После идентификации аденовирус-рекомбинант ро53 бьл структурно подтвержден анализами цепной реакции полимеризации (РСК), как показано на Фиг.2. После

Мзоляции и подтверждения структурь! аденовирус р5З бьіл использован для инфицирования клеточной линий

НЗ5В рака легких человека, которая имела гомозигозное удаление гена р53. Отпечатки (реплики) У/евіегп показали, что зкзогенньій протеин р53 проявил зкспрессию на вьісоком уровне (Фиг.4 и Фиг.5), а пик его зкспрессии пришелся на 3-й день после инфицирования (Фиг.б).

Бьіло также показано в клеточной линии НЗ22 точечной мутации роі3, что мутант р53 бьіл отрегулирован с 7/0 понижением уровней зкспрессией зкзогенного р53. В качестве зкспериментального контрольного злемента бьл использован вирион дав/кем/с12, которьій имел структуру, похожую на структуру АЯ5СММ-р53. Зтот вирус содержал СОМА-люциферазу произведенную І ТК-промотором вируса Коиз -саркомь! в кассете зкспрессий вириона. Ни зкспрессии р53, ни изменения в зкспрессии актина не бьіло обнаружено в клетках, инфицированньх даБ/кЗмМ/12 вириона. Рост клеток НЗ58, инфицированньїх АЯЗБСМУМ-р5і3, бьіл в большей степени подавлен, по /5 сравнению с неинфицированньми клетками, или клетками, ни скицированньми контрольньіїм вирионом (Фиг.7А).

Рост клеток НЗ22 бьіл также в большой степени подавлен вирионом роз (Фиг.7В), в то время как рост клеток

Н4б0 раковьїх опухолей человека, содержащих природньй роз, испьітьївал меньшее влияние (Фиг.7С) дафсммМ-ро53 оказал сильное подавляющее воздействиеє на рост клетки рака легких: іп міго. Подавление роста не бьіло столь очевидно, когда клетки бьіли инфицированьі Ааб5сСіміМ-р53 при МОЇ (множественности инфицирования) ниже, чем ТРЕО/клетка, а при МОЇ вьіше, чем Т100РРШ/клетка цитотоксичность наблюдалась даже у контрольного вируса дав/к8мМ/512. В наших исследованиях оптимальной дозой для изучения возрастного состава популяции бьіло значение 10-БОРЕШ/клетка. В диапазоне зтой дозьі подавление роста клетки бьіло показательно для протеина рб53 с проявленной зкспрессией роз.

Испьітания, проведеннье на безволосьх мьшах, продемонстрировали, что способность к образованию с опухолей в клетках НЗ58, пролеченньїх ДАБСММ-роіз, бьіла значительно снижена. В зкспериментальной модели с мьішами ортотопического рака легких человека онкогеннье клетки Н226Вг с точечной мутацией бьіли введень! і) внутритрахеально за три дня до начала лечения вирусом. Внутритрахеальная инсталляция ДазсСмМм-роз предупреждала формирование опухолей в данньїх модельньх системах, предполагающих, что модифицированньїй аденовирус является зффективнь!м вектором для промежуточного переноса и зкспрессия ю зо Генов-супрессоров опухоли на уровне раковьїх клеток человека и что вирус ЛазСММ-роЗ впоследствиий может бьіть усовершенствован до получения терапевтического средства, с целью использования его в генной терапии ікс, рака. с дафсмм-р53 является посредником при получениий вьісокого уровня зкспрессии гена роЗ в клетках рака легких человека, что продемонстрировано У/езіегп-блотированньми анализами. Зкзогенньій протеин ро5З3 бьл о

Зв почти В 14 раз обильнее, чем зндогенньій природньій р5З в клетках Н4іб60, и почти в два-четьіре раза обильнее, ї- чем Др-активньій внутренний контроль в клетках Н-358. Вьісокий уровень зкспрессии может бьть обьяснен присутствием вьісокозффективного переносчика гена, сильного промотора цитомегаловируса (СМУ), приводящего в движение р5о5З3-СОМА. л адено-вгрусного Е1-усилителя, активизирующего транскрипцию

СОМА-р53. Продолжительность зкспрессии ро53 после инфицирования составила более 15 дней в клетках НЗ58. «

Однако, наблюдалось бьістрое затухание зкспрессии по истечений 5 дней после инфицирования. Анализь 8 с цепной реакции полимеризации на образцах ОМА на инфицированньїхх клетках НЗ58 показали снижение уровня й вирусной ОМА с уменьшенньм уровнем протеина, указьівающим на потерю вирусной ОМА. в процессе «» непрерьівного роста раковьїх клеток іп міїго.

Понижение зкспрессии рб53З, также может явиться результатом клеточной аттенуации промотора цитомегаловируса, которьій контролируеєт степень зкспрессии р5З, поскольку явление отсечения промотора -і цитомегаловируса-промежуточной клетки-хозяина уже известно (Баї, ек аїЇ.,, 1992). Аденовируснье векторь представляют собой; неинтегрированнье векторьі-переносчики генов и позтому длительность зкспрессии гена о зависит от целого ряда факторов, включающих клетки-хозяева, перенесеннье геньї и соответствующие ко промоторь. Кристалл и соисполнители показьвали низкий уровень зкспрессии гена-регулятора 5р траксмембраннон проводимости в фиброзно-кистозньїх дегенерациях в клетках зпителия хлопковой крьсь, что

Фо обнаруживало себя через б недель после инфицирования (КозепеЕла еї аї!., 1992). Лаборатория Регїтісацаеї сл продемонстрировала минимальную зкспрессию гена-минидистрофина в тах мьшце мьіши, которая длилась более трех месяцев после инфицирования. Скоротечнье зкспрессий вьісокого уровня природного протеина роз, наблюдавшиеся в настоящем исследований, могу г иметь обнадеживающие результать, вьізьиівающие снижение 5в ВОоЗзМОоЖжнНьЬх побочньх влияний на нормальнье клетки, сопровождающие іп хмімо лечение с помощью дазсмм-рБ53. іФ) Раскрьїтье в данном описаний результатьі указьвают на то, что аденовирус-рекомбинант р53 обладает ко свойствами подавления опухолей, при зтом он осуществляет зти действия за счет восстановления функции протеина ро5З в раковьх клетках. Зти результатьь дают возможность заявить об использований вириона во лазсму-ро5З3 в качестве терапевтического средства для лечения рака.

Е. УЛУЧШЕННЬЙ ПРОТОКОЛ ДЛЯ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ИЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ АДЕНОВИРУСА

РЕКОМБИНАНТА

Аденовирус-рексмбинант как новая система переноса гена имеет много сфер потенциального применения в генной терапии и для создания вакцин. Воспроизведение вируса-рекомбинанта является позтому важньм б5 биологическим инструментом на молекулярном уровне. Существующие способьі воспроизведения аденовирусов-рекомбинантов используют преципитацию фосфата кальция в качестве промежуточного звена при трансфекции клетки 293 с последующими реакциями розеткообразования на зараженньїх клетках.

Зффективность трансфекции, связанная с зтим методом, требует улучшения, а сама процедура должна бьть упрощена.

В техническом уровне до создания изобретения воспроизведение аденовируса-рекомбинанта обьічно проводилось за счет трансфекции с промежуточньм звеном фосфата кальция. Зтот процесс вовлекает проявляющие зкспрессию клетки в векторную или плазмидную ОМА в фосфате кальция в течение нескольких часов перед бьістрой шоковой терапией, например, в течение одной минуть в 15-процентном глицероле.

Даннье методьі! страдают значительньм недостатком, которьій заключаєется в том, что только низкие уровни 7/0 ОМА инкорпорируются в клетке, т. е. зти методьї являются малозффективньм средством трансфекции. На вирусное воспроизведение бьіло также указано появлением бляшек, которье, в поле зрения, вьіглядели светльми кругльми зонами вокруг лизированньїх клеток, что обнаруживаєт клеточньій лизис, вьізванньй воспроизведением вируса.

Настоящим изобретение предложен новьій способ получения аденовируса, которьій значительно повьішает 7/5 Ззффективность трансфекции, а также упрощаєт селекцию. В соответствии с изобретением установлено, что соединение трансфекции с промежуточньм звеном липосомьі), например, трансфекции с промежуточньм звеном ООТАР, с наблюдением цитопатогенного зффекта (СРЕ) ведет как к повьнішению зффективности, таки к бьістрому и упрощенному процессу определения обьекта. В предложенном способе перенос гена с помощью промежуточного звена -ПОТАР-липосомь- используется для переноса вектора зкспрессии и плазмида 2о рекомбинации в клетки 293. Зараженньєе клетки, вместо присоединения к 0,5-процентной агарозе для получения реакции розеткообразования, длительное время вьідерживаются в питательной среде для получения цитопатогенного зффекта (СРЕ).

В двух исследованиях, использующих новьій метод, 2 лунки из 24 лунок чашки Петри и З чашки из пяти бОо-миллиметровьхх чашек обнаружили цитопатогенньй зффект на 10-й и 12-й день после трансфекции, сч ов боответственно. Напротив, при использований метода преципитации фосфата кальция, ни один вирус-рекомбинант не бьл получен в трех пробах при участии в котрансфекции двадцати бОо-миллиметровьх і) чашек на каждьій зксперимент. Использование проб САТ в клеточньїх линиях Нерб2 5 Неї а трансфекция с промежуточньм звеном ЮОТАР показало в пяти складках повьішеннуюїо активность САТ, по сравнению с трансфекцией с промежуточньім звеном фосфата кальция. ю зо МИсключение формирования накладки агарозьь после котрансфекции также упрощало процесс. Конечная цель исследования, воспроизведение вируса, становится более понятной и легче достижимой, благодаря ікс, возможности непосредственного наблюдения за цитопатогенньм зффектом (СРЕ), вместо идентификации с розеток, что обьічно бьло лишено наглядности и трудно осуществимо после 10-14 дней инкубационного периода. Фиг.З показьівает культуру клетки с цитспатогенньм зффектом, в сравнений с клеточной культурой, у о которой отсутствует цитопатогенньій зффект (СРЕ). ї-

Изобретатели также разработали способ бьстрого определения титров аденовируса с использованием цепной реакции полимеризации (РСК). Непосредственная проба РСК на образцах ОМА из надосадочной жидкости клеточной культурьі с цитопатогенньімм зффектом (СРЕ) обьічно использует две парьі первичньйх злементов: одну, предназначенную для усиления специфического включения, другую - для усиления вирусньйх « геном - специфических последовательностей. Изобретатели показали, что аденовирусьі, вьіделеннье в среде 7) с клеточной культурь), способньї определяться в процессе цепной реакции полимеризации, таким образом позволяя приготовить матриць ОМА, использовав питтожно малое количество, около 50 ці, надосадочной ;» Жидкости.

Идентификация специфических включений и вирусньїх геном-специфических последовательностей ОМА,

ВБтекающих из усиления цепной реакции полимеризации, мелеет бьіть определена, например, с помощью -і пробьї, полученной из РСК-усиленного продукта на гелях агарозьі. Пучки волокон (полось! хромосом), соответствующие специфическим включениям ОМА и вирусньм геном-специфическим ОМА. Кроме того, о исходнье злементь! могут бьіть идентифицированьі, благодаря сравнению с соответствующими стандартньми ко маркерами.

Там, где цепная реакция полимеризации используется для усиления специфических включений и вирусньїх б геном-специфических генньїх продуктов, может бьіть впервье получена возможность приготовить исходное сл средство для получения последовательности, которая должна бьіть усилена. Зффективное и избирательное усиление достигается путем использования двух пар первичньїх злементов: одна-для усиления определенного участка специфического продукта включения, другая-для определения сегмента вирусного 5в Ггеном-специфического продукта. Только для примера, кассета для зкспрессии р5З бьіла сконструирована с человеческим цитомегаловирусньм (СММУ) промотором и ранним сигналом полиаденилации 5М40. Первая іФ) группа исходньїх злементов должна включать исходньій злемент, сконцентрированньй в первом интроне, ко расположенном вниз по ходу перемещения гфомотора главного гена ІЮ(Е цитомегаловируса (СМУ) человека, тогда как другой первичньій злемент первой группь! исходньїх злементов должен бьіть сосредоточен в раннем бо сигнале полиаденилации ЗМ40. При идеальньїх условиях, оба зтих первичньїх злемента располагаются на расстояний 15-20 базовьїх пар от включения СОМА. которьім в иллюстративном примере является роб.

Должен бьїть установлен определенньїй продукт цепной реакции полимеризации (РСК), например СОМА роз 1,4ОКБ. В качестве примера, вторая группа исходньїх злементов может бьіть сконцентрирована в районе 11М.). (ячейка карть!) 13,4М.О. (ячейка карть)) генома АЯ5 для того, чтобьії определить 0,86Ккр-вирусного геном - б5 специфического продукта цепной реакции полимеризации.

Селекция исходною злемента хорошо известна тем, кто следит за уровнем техники в данной области

Существует возможность конструирования первичньїх злементов для усиления отобранньіїх участков до последовательностей ОМА, чья последовательность базовой парь )известна. Первичнье злементь гибридизируются до ЮМА и вьіступают в роли начальньхх участков для синтеза участков гена. Исходнье Ззлементь пуклеотидов предназначень! для связьівания на отдельньїх участках на противоположньх дуплексньх штаммах, таким образом определяя вводимую последовательность в качестве участка, которьій должен бьть усилен. Молекульі нуклеиновой кислотьі, которье являются первичньми злементами, должнь!, в основном, включать, по меньшей мере, последовательность 10-базовой парьії, которая должна соответствовать сегменту

ОМА, предназначенному для вьіполнения усилительной функции. Размер 10-базовойпарь! вьібираєтся в /о качестве главного нижнего предела, для указанньх размеров, менеє чем 10 баз не могут активно гибридизироваться, а наступление стабилизации может стать проблемой. Лучшими вариантами могут считаться размерь! 15-20, которне используются в предпочтительньїх вариантах. В варианте доказанном на Фиг.1, используются размерь 19 и 20 базовьїх пар. б. ПАЦИЕНТЬ!Ї И ПРОТОКОЛЬІ! ЛЕЧЕНИЯ

Изобретатели предполагают, что региональная доставка аденовирусньїх р5З генньїх структур в клетки рака легких больньїх формой рака, имеющей отношение к рб53, например неоперабельной, закупоривающей зндобронхиальной формой рака, окажется зффективньм способом доставки терапевтически зффективного гена, способного противостоять клинике заболевания. Имеется предположение, что такой подход к решению проблемь! является значительньм усовершенствованием в развитие терапевтических способов лечения 2о раковьх заболеваний, которне основань! на попьітках убить или удалить последнюю раковую клетку. Поскольку скрьїтая потенция раковой клетки является установленньм фактором, зффективное ее уничтожение всегда составляло проблему.

Существует мнение, что поглощение аденовирусньїх структур клетками М5СІЇ должно снизить степень разрастания зтих клеток. Зто должюно продлить промежуток времени, когда больное легкое может оставаться в с ов расширенном состоянии, предотвратить возобновление роста зндобронхиальной опухоли и продлить жизнь больного. і)

Больнье с рецидивом неоперабельной зндобронхиальной опухоли, которая частично или полностью закрьівает дьїхательнье пути и которая безуспешно подверглась или не может бьїть подвергнута наружной радиотерапии, бьли вьбрань для протокола лечения предлагаемьм способом. Существующие ю зо Терапевтические способьі лечения в таких условиях предлагают только кратковременное облегчение.

Большинство пациентов получили рецидивьі, несмотря на лучевую радиотерапию. Существует возможность ікс, введения брахитерапевтического катетера и назначения дополнительной адиотерапии. Больнье, получившие с такое лечение, могли прожить, в среднем, б месяцев. Больнье, для которьїх брахитерапезтическое лечение оказалось незффективньм, также бьіли отобраньії для получения генной терапии. Опухоль может бьіть удалена о з5 из дьїхательньхх проходов с помощью лазера или биопсийньїх щипцов. Зто может бьіть вьіполнено в сочетания сир вводом аденовирусньїх структур, уменьшая таким образом обьем, которьій должен бьіть введен. Назначение вирусньїх структур не должно препятствовать назначению пациентам других паллиативньїх средств, если опухоль прогрессирует.

Включеньї следующие примерь, демонстрирующие предпочтительнье вариантьї осуществления « Мзобретения. Специалистьі в данной области должнь! принять к сведению, что технологические приемьі, в с показань! в примерах, которье соответствуют способам, раскрьітьім изобретением, чтобь! дать представление об их осуществлений в соответствий с изобретением и, таким образом, показать осуществимость изобретения в ;» его предпочтительньїх вариантах. Однако, исходя из принципов раскрьїтия данного изобретения, специалисть должнь отдавать себе отчет в том, что па практике способьі по данному изобретению могут бьіть осуществлень б использованием зквивалентной замень некоторьїх признаков с достижением аналогичного результата, -І оставаясь при зтом в рамках сущности изобретения, вьіраженной в изложений его формули.

ПРИМЕР 1 о Структура вектора зкспрессии роб.

ГІ Настоящий пример описьшвает структуру вектора зкспрессии р53З Данньій вектор сконструировал и 5р Мспользуется для замещения зонь ЕТ (1,3-9,2т.и.) генома Ад5 аденовирусного штамма и получения структурь

Ме. аденовирусного вириона, описанного в примере 2. сп Кассета зкспрессии р53, показанная на Фиг.1, содержащая промотор питомегаловируса (СМУ) человека (Возпагі, еї аІ.,1985), роЗ СОМА и ранний сигнал полиаденилации 5М40, бьіла установлена между участками Хра

І « Сіаї рхХСЛІ (описано: Ог.Ргапк І .гапагтиМс Мавіег Опімегайу, Сападіа).

Размер генома составляет около 35,4КЬ, разделеннье на 100 карточньїх ячеек (1т.иу. (карточная ячейка)-0,35КЬ.).Кассета зкспрессии р53 заместила зону Е1 (1,3-9,2т.и.) генома Авд5.

Ф) Первичньій злемент 1 имеет последовательность 5-СССССАСССССТТООСТТОо-3 (5ЕБЕО ІЮО МО: 1) и ка сосредоточен в первом интроне вниз по движению промотора гллиного гена ЛЕ цитомегаловируса человека (Возпагі еї аІ., 1985).Первичньїй злемент 2 имеет последовательность 5-ТТІЗТААССАТТАТААДОСтТОС-3 (5ЕО ІЮ бо МО: 2) и сосредоточен в раннем сигнале полиаденилации ЗМ40.

Оба первичньїх злемента.15-20бр от включения СОМА р53З на обоих концах определяют продукт цепной реакции пролимеризации 1,4ОкКБ. Первичньй злемент 5 имеет последовательность 5-ТІССТТТСТСАССАССТОТТО-3 (5БО 10 МО: 3) и первичньйй злемент 4 имеет последовательность 5-АТОТОААСТСАААОСОІвО-3 (ЗЕО ІЮ МО: 4) и расположень в 11т.и и 13,4т.и. генома дах соответственно, 65 Которне пределяют продукт 0.86кб-вирусно-геном-специфической цепной реакции полимеризации.

ПРИМЕР 2

Образование и воспроизведение аденовируса-рекомбинанта р53. Данньй пример описьівает способ, применяемьй для образования помощник - независимого рекомбинантного аденовируса, проявляющего зкспрессию рб53. Молекулярньїй алгоритм, примененньій для получения аденовируса-рекомбинанта осноззи на долом факте, что, благодаря лимиту упаковки (дозировки) деновируса, р/М17 не может формировать вирус самостоятельно. Позтому гомологические рекомбинации между векторньім плазмидом зкспрессии р53 и рОМ17 в инфицированной клетке позволил получить результат в виде жизнеспособного вируса, которьій может бьть упакован только в клетках, в которьїх созданьі условия для зкспрессии протеинов. В данном примере клетки 293 используются в качестве клеток-хозяев для воспроизведения вирусов, которне содержат замещения кассет 7/0 Ззкспрессий гетерологнческой ОМА в зонах Е1 и ЕЗ.

Зтот процесс требует котрансфекции ОМА в клетках 293. Трансфекция широко определяем зффективность вирусного воспроизведения. Способ, использованньй для трансфекции ОМА в клетках 293 до создания настоящего изобретения, обьічно включал использование фосфата кальция/ копреципитации ОМА (Сіайат «5 мап дег ЕБ, 1973).Однако зтот способ совместно с розеткообразованием относительно трудноосуществим и 7/5 Ообьічно заканчиваєтся малой зффективностью воспроизведения вирусов. Как показано на зтом примере, трансфекция и последующая идентификация инфицированньїх клеток бьіли значительно усовершенствовань, благодаря использованию способа трансфекции с промежуточньм перемещающим звеном липосомь, при идентификации з груженньїх клеток с помощью цитопагогенного зффекта (СРЕ).

Клеточнье линии 293 вьідерживались в несколько измененной питательной среде ЮОЮцШрессо с 1095 инактивчрованной с помощью нагревания лошадиной сьівороткой. Вектор зкспрессии р53 и плазмид рОМ17 (Ме

Сгогу еї аі., 1988) для гемологической рекомбинации бьіли подвергнуть! котрансфекции в клетках 293 с помощью метода трансфекции с промежуточньм звеном ЮСОТАР, согласно протоколу исполнения (Воепгіпдег Мапппеїт

Віоспетіса!в, 1992).Схематически зто изображено па Фиг.1.

Клетки 293 (проход 30. б090-пересечение) бьли заражень за 24 часа до трансфекции пли в сч об 80-миллиметровьх чашках, или в 24-луночньїх чашках Петри. Клетки в каждой лунке бьіли подвержень! трансфекции с помощью 30 СОТ АР. 2 вектора зкспрессии ро5З и З плазмида р.)М17. После трансфекции клетки і) получали питание и виде средь! МЕМ каждьсе 2-3 дня до тех пор, пока не появлялся цитопатогенньій зффект.

ПРИМЕР З

Подтверждение идентичности аденовируса-рекомбинанта. ю зо Данньій пример иллюстрирует новьій способ исследования цепной реакциийи полимеризации (РСК) для подтверждения идентичности рекомбинантньїх о вирионов, сопровождающих процесс котрансфекции ікс, соответствующей клеточной линии. с

Слои надосадочной жидкости клеточной культурьі (от 50 до 37Омл) бьіли собраньі из участвовавших в исследованиях чашек Петри, обработань! протеиназой К (50/с 0,596 505 и 20тМ ЕОТА) при 562С в течение 1 о з5 часа с помощью фенолхлороформа, а нуклейновьіе кислоть! бьілИ вьіведень! в осадок с помощью зтанола. р

Осадок ОМА бьл повторно суспендирован в 204Н о и использован в качестве матриць! для усиления цепной реакции полимеризации (РСК). Относительнье локализаций первичньїх злементов цепной реакции полимеризации (РСК) и их последовательности показань на Фиг.1 и обозначень: ЗЕО ІО МО5:1,2,З3и 4 соответственно. Первичнье злементьі специфических включений ОМА определяют продукт 1.4К5 цепной « реакции полимеризации (РСК), а вируснье геном-специфические первичнье злементь! определяют продукт 8 с 0,86КЬ цепной ргагдціни полимертации (РСК). Цепнье реакции полимеризации проводились в обьеме 50, й содержащем 4тМ Масі2, 50тМ КСІ, 1,195 тритона Х-100, 200 каждой из аМТР, 10тМ Ттів-СІ (рНое.0), 2 каждого «» первичного злемента и 1,0 единица Тад-полимеразьі! (Ргогпеда) Реакции проводились при 949С в течение

О,5мин., 562С в течение 0,5мин., 722С в течение мин. на протяжений 30 циклов.

Чтобьї упростить процесс идентификации вновь воспроизведенного рекомбинантного вируса, бьл -і разработан способ осуществления непосредственно цепной реакции полимеризации (РСК) на образцах ОМА, о взятьїх из надосадочной жидкости клеточной культурьі Слойи (50 или 370) надосадочной жидкости клеточной средьі с цитопатогенньмм зффектом бьіли обработаньії протеиназой К и фенол/хлроформ/зкстрактом. После ко зтанолового осаждения ообразцьь ОМА бьли проанализированьй с использованием цепной реакции б» 50 полимеризации (РСК), в которой принимали участие две парьі первичньїх злементов, с целью усиления специфических последовательностей включений и вирусногеном-спедифических последовательностей. сл Мишени первичньїх злементов цепной реакциий полимеризации и их последовательности показань! на Фиг.1.

Первичньсе злементьї 1, 2, З, и 4 представленьі с помощью ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, З, 4 соответственно.

В результате, включение СОМА 1,4КБ и фрагмент вирусного генома 0,86КЬ бьіли усиленьі из вектора Ззкспрессии (положительньй результат) и образцов ОМА положительной клеточной культурь (Фиг.28В, полоса 71 и 4 соответственно). Только фрагмент 0.86КЬ бьіл усилен из образца ОМА вируса Аабв/к5м/сіІ 2 (отрицательньй о результат, полоса 2). Никаких усиленньїх полос, пучков волокон не бьіло обнаружено при цепньїх реакциях іме) полимеризации (РСК), которне использовали необработанньй положительньій надосадочньій слой клеточной культурь (3-я полоса). бо Зти результать! указьівают на то, что деновирусьі, секретированнье в клеточной культурной среде, могут бьіть определеньії цепной реакцией полимеризации (РСК), используя всего лишь 50 надосадочной жидкости средьі клеточной культурьі для приготовления матриц ОМА. Полученнье результатьї должнь! позволить разработать количественньій метод при использований данного способа, с целью определения аденовирусньх тигров, что обьічно получают с помощью метода розеток. 65 Природная последовательность СОМА роз в вирусе ДАЇБСММ-роЗ бьіла подтверждена посредством дидеокси рщмМмА-последовательности на СзСі-дгадіепі - очищеной вирусной ОМА. Контрольньій вирус Аав/кБм/оІ2,

полученньй подобньм способом, имеет структуру, подобную дабБсСмММ-р53, за исключением вирусного промотора Копв-саркомь! и СОМА люциферазь, которье бьіли использовань в его кассете зкспрессии.

Аденовирус-рекомбинант, которьій несет ген Е.соїї р-галактозидазь (І ас7), АахСМУ-і ае7, имеет структуру, подобную ДЯБСММ-роіз и бьіл получен на оснований исследований Ог. Егапк І. (зганат.

Вирусная биомасса, тигр и инфицированиєе. Индивидуальнье клоньі Ааб5сСММ-р53, АОБ/КЗМ/Б12 и

АаЙ5сСМУ-Ї ас2-вирусов бьіли полученьі путем обеззараживания бляшек (розеток) по методу Сгайат 4 Ргемес (1991). Одиночнье вируснье клоньі бьіли воспроизведеньі в клетках 293. Культурная среда клеток 293, обнаруживающая законченньй цитопатогенньй зффект, бьіла собрана и центрифугирована при 1000хд в /о0 течение 1бмин. Собранньсе над осадочнье массь бьіли расслоень! и размещень! для хранения при температуре -202С в качестве штамма (биомассь). Вируснье титрьі бьли определеньй в результате реакции розеткообразования (Стапбат апа Ргемес, 1991). МИнфицирование клеточньїх линий бьіло произведено путем добавления вирусньїх растворов (О,5мл на бОо-миллиметровую чашку) к клеточньім монослоям и создания условий инкубационного периода при комнатной температуре в течение 30 минут с кратковременньіми 7/5 Встряхиваниями через каждье 5 минут. Зтот процесс сопровождался добавлением культурной средь и возвращением инфицированньїх клеток в и инкубатор при 3720.

Зффективность передачи гена аденовируса-рекомбинанта также бьла исследована на примере использования АЯ5СМУ-І ас в целом ряде клеточньїх линий, например Н226Вг, НЗ22, Н460, НЕГа, Нер 02,1. М2 и Мего. С помощью окраски Х-геля все клеточнье линии бьіли окрашень!: 97-10095 - в голубой цвет - после инфицирования ДазСММУ-їі ас при МОЇ ЗОРЕРМШ/клетка.

ПРИМЕР 4

Зкспрессия гена р53, направляемая ДазСМУ, в клетках рака легкого человека.

Зтот пример раскрьівает способ использования аденовируса-рекомбинанта р53, с целью инфицирования клеток рака легких человека с помощью гомозигозного удаления гена р53. Результать! показьівают, что рост Га гр; Ззтих клеток и зкспрессия мутанта рб53 бьли подавлень), обнаруживая потенциал вириона Ааз5смм-рзз, проявляющего признаки агента, способного контролировать состояние метастатических клеток. о

Монослоий инфицированной оклетки бьли подвергнуть иммуногистохимической обработке которая заключалась в том, что зти слой бьли зафиксировань! 3,8-процентньм о формалином и обработань

З-процентньм НьОо в метаноле в течение 5 минут. Иммуногистохимичесхие анализь! бьіли осуществлень с использованием набора Месіавіаіп ЕїШе (Меоіог, Випіпдате, СА). В качестве первичного антитела использовали анттиело РАБ і 801 апіі-р5оЗ3 (Опсодепе Зсіепсе, Маппаззеї, МУ); МОРС-21 (Огдапоп ТекКпіса Согр., М/еві Спезіег, іш

РА) использовался в качестве отрицательной контрольной группьі. В качестве второго антитела использовали с амідіп-Іабеіед апіїтоизе Ід (авидин-меченьійй антимьішиньій иммуноглобулин 5) (вектор) Віоїіпуїагейд Цогзегадізй регохідазе АВС сотріех геадепі (комплексньй АВС реактив блотированной периксидазь хрена) бьіл о

Зз5 Мспользован в качестве определителя антиген-антитело-комплекса. Наконец, клетки после обесцвечивани; рч- препарата бьіли докрашень Наїгтіз-гематоксилином (Зідта) и установленьі с помощью уплотняющего материала - Цитосила-60 (З(ерпепз Зсіепійіс, Кімегааіе, МУ).

Иммуногистохимические анализьь инфицированньїх клеточньїх линий бьли произведеньії с целью « исследования зкспрессии іп зйш-зкспрессии рб53, возбужденной промотором цитомегаловмруса (СМУ) вируса да5смМмМ-р53. В клеточной линии НЗ5Н, которая имела гомозигозное удаление р53, ген р53З бьіл перенесен со Ш-д с зффективностью 97-10095, как показали иммуногистохимические анализьі, когда клетки біли инфицировань ц дафсмум-р53 при множественности инфицирования -30-50 розетки - формирующих единиц (РЕШ/клетка) (Фиг.4). "» Вьісокая зффективность переноса аденовируса-рекомбинанта бьіла подтверждена АабзсСММУ-і ас7. вирусом, которьій несет ген Іас/, трансформированньій промотором ТЕ СММ (цитомегаловируса) человека. При множественности инфицирования человека 30-БОРЕШ/клетка все клетки подвергались исследованию включая -І НЕГа, Нер 52, ІМ2, и клеточнье линии рака М5СІ С человека показали 97-10095 позитивньій результат для р-галактозидаза-активности с помощью Х-гелевого окрашивания. Зти результатьій указьвают на то, что о аденовируснье векторьї представляют собой зффективное средство для доставки гена в раковье клетки ко человека.

ММезвіега-блотирующие анализь! бьіли осуществленьй на всех клеточньїх изатах, приготовленньіїх путем б растворения клеток монослоев в чашках, с помощью буферного образца 5О5-РАСЕ (0,5бмл на сл бОо-миллиметровую чашку) после промьівания клеток фосфатно-солевьм буферньмм раствором (РВ5). Для анализов 5О5-РАСЕ линии бьли загруженьї лизатами зквивалентно 5х107 клеткам (10-15мл). Протейнь бьли перенесеньі к Нуропатм-ЕСІ -мембране (Атегепат, Агіпдіоп Неїзпїв8. і І). Мембрань! бьіли заблокировань 0,595 сухим молоком в фосфатно-солевом буферном растворе и проведень! исследования с помощью первичньх о антител: мьішиного античеловеческого роз моноклонального антитела РАБ 1801 и мьішиного античеловеческого р-активного моноклонального антитела (Атегейпйат), промьть и иследованьь с помощью вторичного о антитела, а именно, кроличьего антимьшиного гаммаглобулина б, связанного пероксидазой хрена (Ппогзегадівп ррегохідазе - сопіодайїей гарбрії апіітоцзе ідо) (Ріегсе Спетіса! Со., КосКоога, І). Мембрань! бьіли разработань 60 в соответствии с усиленньм хемилюминесцентньм протоколам. Относительнье количества зкзогенного рбоЗ3 с вніраженной зкспрессией бьіли определеньї денсиномером (Моіесцаг бупатісз Іпс., Зиппумаїе, СА).

УУезіега-блоть! показали что зкзогенньій протеин р-53 проявил свою зкспрессию на вьісоких уровнях (Фиг.5А, полось 2, З и 5, 6). Пик протеина наблюдался на 3-й день после инфицирования (Фиг.б6, внедрения от 0,5 дня до 3-х дней). В качестве контрольного злемента бьл разработан вирион, структура которого напоминает бо рекомбинант АДазсСмММ-ро53 по примеру 1. Вирион содержит СсОМА-люциферазу, приведенною в активное состояние промотором ТК вируса Коивз-саркомь! в кассете зкспрессии вириона. Ни зкспрессии ро5З3, ни изменения в зкспрессии актина не бьіло обнаружено в клетках, инифицированньїх вирионом Дазв/кам/сі 2,

Аденовирус-рекомбинант бьіл использован для инфицирования трех линий рака легких МЗСІ С: - клеточкой линии НЗ58, которая имеет гомозигозное удаление гена роз, - клеточной линии НЗ22, которая имеет точечную мутацию гена роЗ в кодоне 248 (от з до Т), и - клеточной линии Н460, которая имеет природньй ген ро.

Степень роста клеток М5ЗСІ С человека бьіла определена, исходя из инокуляции НЗ22 и Н4б0О (1х10 5). или

НЗ5Б8 (2х105) в 60-миллиметровьїх чашках за 24 часа до вирусного инфицирования. Клетки бьіли инфицировань вирусом при множественности инфицирования 1О0РЕШ//клетка. Культурная среда бьіла использована дня 70 контроля смоделированной инфекции. Матричнье культурьі каждой клеточной линии с различньми видами обработки подсчитьівались ежедневно с 1-го по 6-й день после инфицирования.

Рост клеток НЗ58. инфицированньх Ааб5хсСмММ-ро53, бьл значительно подавлен, по сравнению с неинфицированньїми клетками или с клетками, инфицированньіми контрольньїм вирионом (Фиг.7А). Рост клеток

НЗ22 бьл также в большой степени подавлен вирионом роЗ (Фиг.7В), тогда как клетки НібО рака легких 75 человека, содержа дне природньій рб53, бьіли подвергнутьі воздействию в меньшей степени (Фиг.7С). Рост клеток НЗ58, инфицированньїх вирусом АЯБ5СММ-рБ5З, бьіл подавлен на 7995, в то время как неинфицированнье клетки или клетки, инфицированнье контрольньім вирусом, подавленьі не бьіли. Рост клеточной линии НЗ22, которая имела точечную мутацию, бьіл подавлен на 7295 посредством ДазСмМУМ-р53, тогда как рост клеточной линии Н4іб60, содержащей природньй роб, бьіл подавлен меньше (подавление роста составило 2896).

Результатьі указьвают на то, что аденовирус-рекомбинант обладаеєт свойствами подавления роста злокачественньіїх новообразований, благодаря восстановлению функций протеина р53 й клетках опухолевьх новообразований.

ПРИМЕР 5 использование ДАБСММ-рБ5З при лечений клеток с роЗз-дефицитом. с

Настоящий пример касается использования аденовируса-рекомбинанта р53 при восстановлениий функции о подавления роста опухолевьїх клеток іп мйго и осуществления таким образом лечения заболеваний, связанньмх со злокачественньмм иль метастатическим ростом клеток. Он описьівает некоторье из способов по данному изобретению, которье предполагается использовать при лечениий рака с помощью аденовирусной генной терапии. ІС о)

Клетки НЗ5УК бьіли инфицированьї ДА4ЇБСММ-роЗ и Аазук5мМизІ2 при множественности инфицирования (МОЇ) 1О0РЕШ/клетка. Одинаковое количество клеток бьіло обработано средой, смоделированной в качестве инфекции. ї-о

Через 24 часа после инфицирования обработаннье клетки бьли собраньь и дваждь: промьть с фосфатно-солевьм буферньїм раствором (РВ5). Для каждого из видов обработки три миллиона (3х109У) клеток со в обьеме 0,1мл бьіли подкожно введень! каждой из безволосьїх мьішей (Нагіап Со., Ноизіоп, ТХ). Для каждого из видов обработки бьіло использовано по 5 особей. Мьіши бьли облученьі (ЗО0ссСу, б0Со) перед иньекцией и ї- обследовались еженедельно после иньекции. Опухолевье новообразования бьли обнаружень б конце шестинедельного периода, а обьем опухоли бьл определен на основе использования модели сферь! со средним диаметром опухоли, полученньмм в виде корня квадратного из величинь! произведения диаметров « поперечного сечения.

Чтобьї определить зффект подавления онкогенности с помощью дабБсСмМмМ-ро53, безволосье мьіши бьли З с инфицированьї подкожно клетками НЗ58 (клетка рака типа МЗСІ С человека), чтобь! вьізвать злокачественнье "» новообразования. Каждая мьішь получила одну иньекцию клеток, которье бьіли инфицированьї ДАБСММ-роз " или дав/к5мМ/512 при 10РЕМО/клетка в течение 24 часов. Клетки НЗ58, обработаннье только средой, бьіли использованьій в качестве контрольньїх с ложньм инфицированием. Опухоли, которье первоначально прощупьшались, на 314-й день после иньекции Бьли индуцированьь только смоделированньми или - контрольньмми вирусинфицированньїми клетками, как показано в табл.1. (95) дк

Фо сп давсмут 111омюЇ111111111111 «дтп а Обработаннье клетки НЗ58 бьіли введень! внутримьішечно в 2х105 клетки/одна особь. Размерь! опухоли бьіли определеньї в конце

ГФ) б-недельного периода. ю Как показано и таблице 1, у мьішей, которне получили клетки, обработаннье ДазсСмМмМ-р5З3, опухолевье новообразования не развивались. Опухоли в конце б-недельного периода имели 4-1ї0мм в диаметре. Зто 60 исследование начиналось с 5-ю особями на группу. Одна мьішь в каждой из групп исследований с ДА5СММ-роз или дав/кзМ/512 не участвовала и не смогла завершить цикл исследований. Ранние смерти наступили, предположительно, от нозокомиальной инфекции.

ПРИМЕР 6 дафсСмуУ-р53 в лечении рака легких. 65 Настоящий пример касается использования аденовируса рекомбинанта р53 для восстановления функции подавления роста клеток новообразований іп мімо и лечения таким образом злокачественньїх опухолей у животньїх. На данном примере наблюдаются несколько путей осуществления изобретения, с целью его использования для лечения рака методом генной терапии, использующей аденовирус в качестве промежуточного звена-посредника.

Зффективность АЗДБСММ-роЗ для подавления онкогенности бьіла повторно доказана на мьішиной модели ортотопического рака легких человека. Поскольку клетки НЗ58 и НЗ22 в данной модели не вьізьівают опухолевьїх новообразований, в исследований использовалась клеточная линия Н226Вг. Зта клеточная линия имела происхождения от сквамозного рака легких и метастазировала от легкого до мозга Н226бВг имеет точечную мутацию (от АТС до СТО) в зкзоне 7, кодона 254, гена ро5З3 и является онкогенной в организме мьіши. 70 Процедура тестирования в мьішиной модели ортотопического рака легких человека рапсе уже бьіла описана (Сеогдев, еї а!., 1993). В двух словах, безволосьіе мьіши били предварительно облучень (ЗО0ссу, бОСо), после зтого привить! внутритрахеальной инсталляцией клеток Н226Вг. Каждая мьішь получила 2х1059 клеток в обьеме

О.Лмл РВ5 (фосфатно-солевого буферного раствора). Через три дня после прививки 10 мьішей на группу обрабатьівались 0О,1мл вируса или средь-носители (РВ5) путем внутритрахеальной инстилляции 1 раз в день в 75 течение двух дней. Йспользовались дозировка вируса АДБСМУ-рб5З или дабБ/в5М/012 - 5Х10" на одну у особь.

Мьіши бьіли умерщвленьй в конце б-недельного периода. Опухолевье новообразования бьли изучень следующим образом. Ткани легкого и средостения бьли иссеченьь и определень! размерь опухоли.

Новообразования бьіли подтвержден гистологическими анализами иссечения опухолевой массь.

Облученнье безволосье мьіши бьіли привитьі клетками Н226Вг - 2х106 на одну особь путем внутритрахеальной инстилляции. Через три дня после прививки каждая из мьшей (8-10 мьшей на группу) прививались 0,їмл или Аа5СММ-р5З3, или АабБ/к5мМ/12, или носителем (РВ5) (фосфатно-солевьм буферньм раствором) путем внутритрахеальной инстилляции один раз в день в течение двух дней. Дозировка вируса составляла 5х10 " (РЕШуна мьішь. Опухолевье новообразования бьіли исследовань в конце б-недельного периода путем иссечения тканей легкого и средостения и определеньі! размерь! опухолей. Схема процедурь с 29 исследования показана на Фиг.7 с представлением образцов иссечения на Фиг.8. Обнаруженнье опухоли біли (У подтвержденьї гистологическими анализами. Даннье измерений опухолей представлень в таблице 2. ю з Ф с о і - а Мьіши бьіли привить 2х106 Н2г26Вг клетками/мьшь внутритрахеально. На 3-й день после прививки мьшам внутритрахеально вводили или среду-носитель, или вирусь! (БлОЇ каждого состава в 0О,1мл) один раз в день в течение двух дней. Анализ опухолевого новообразования бьл проведен в конце б-недельного периода. « типами анализов бьіло установлено несоответствие равное р«О0,05. - с Только 25965 мьішей обработанньїх ДАЇБСММ-р53, получили сформировавшиеся опухоли, тогда как в группе ц мьшей, обработанньх о носителем или АдавБ/кемМ/312 (контрольная группа) опухоли получили 70-8090 "» инфицированньїх мьішей. Средний размер опухоли для группьї АЗД5СММ-робЗ бьіл значительно меньше, чем для контрольньїх групп. Зти результатьіь указьвают на то, что дазсммМ-ро3 может предохранить Н226Вг от формирования опухолевьїх новообразований в мьішиной модели ортотопического рака легких человека. - ПРИМЕР 7 аБсму-р5б3 в лечебньх схемах.

Мамі Естественно, что модели лечения, разработаннье для животньїх, должнь применяться как часть км исследований, предшествующих клиническим назначениям, как показано на примерах 5 и 6. Позтому больньєе, Которьім бьіло установлено показание на лечение с помощью переноса гена посредством аденовируса, могут б бьїть исследованьі на присутствие антител, действие которьіх направлено против аденовируса. При наличий с антител и при установившейся аллергической реакции больного на какие-либо фармакологические или естественнье средства, может бьіть назначено применение опьітньїх доз порядка от 103 до 105 аденовируса рекомбинанта под пристальньмм клиническим наблюдением.

Для назначения человеку при лечении рака с использованием АазхсСмММ-ро3З аденовирус-рекомбинант, проявляющий зкспрессию р5З под контролем соответствующих промоторов/усиливающих злементов, например о промотора СММ (цитомегаловируса), должен бьіть приготовлен и обеззаражен, в соответствии с методикой, іме) одобренной организацией по надзору за продуктами питания и лекарственньми средствами (БА). Такая методика включает, но не ограничиваеєтся, центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия с 60 последующими испьітаниями на зффективность и чистоту.

Сложилось мнение, что существует два способа лечения с помощью аденовируса ро53, непосредственное или локальное назначение или более общее лечение. Даннье методь дают тезультать! только при лечений многообразия злокачественньїх опухалей, которье известньі, как имеющие отношение к р5З-мутациям. Что касается общего лечения, то, как бьіло доказано на опьітах, достаточно обьікновенной внутривенной иньекции, 65 чтобьї инфицировать введенньім вирусом ткани, расположеннье на расстоянии от места введения лекарства (Зігабога-Регтісацаеї еї а!., 19916). Таким образом, вирусное инфицирование с помощью внутривенной иньекции можно рассматривать, как способ, удобньіїй для лечения всех злокачественньїх опухолей, имеющих отношение к ро3. Вирус может бьть назначен больньмм как внутривенно в виде любого фармакологически допустимого раствора так и в виде инфузий в течение какого--о промежутка времени. Откровенно говоря, существует глубокое убеждение в том, что для получения ожидаємого зффекта, количество назначенньїх действующих вирусньїхх частиц должно бьгть порядка от 1х1079 до 5х10727,

Кроме того, там где речь идет о раке легких, при желаниий может бьіть использован метод более прямого физического воздействия аденовируса-рекомбинанта на клетки-мишени, аналогичньій внутритрахеальному назначению регулятора трансмембранной проводимости при фиброзно-кистозной дегенерации (Козепіеїа еї аї., 70 1992). Результатом такого метода может бьіть доставка аденовируса-рекомбинанта р5З поближе к тому месту, где концентрируются клетки-мишени.

Более подробно предпочтительнье протокольй лечения могут бьть разработань! в соответствии со следующие алгоритмом. Вначале больной может бьть подвергнут бронхоскопии для вьіяснения степени поражения. Методом зндоскопии должна бьіть извлечена как можно большая часть опухоли. Предварительная 75 бронхоскопия должна проводиться под местньім или общим наркозом. Трансбронхиальная аспирационная игла (219) Зійсогтм (с жестким сердечником 7?) должна бьть проведена в биопсийньй канал бронхоскопа. К сохранившимся участкам опухоли может бьіть подведен мальй обьем аденовируса р53 в количестве 10мл или меньше.

В любом случає, если даже примененного аденовируса окажется недостаточно для возникновения репликационного зффекта, сам по себе вирус на организм человека никакого пагубного воздействия не окажет.

Тем не менее, больньіе во время лечения должньі! находиться в стационаре, по меньшей мере, в течение 48 часов для наблюдения за возможньм возникновением острой или отдаленной во времени подобной реакции.

Хотя вопросу зффективного и безопасного применения аденовируса с дефицитом репликации в качестве носителя при переносе гена в человеческом организме бьіло уделено внимание в прошлом (Козепіевї|а еї аї., Ге 1992; даМе еї аіІ., 1992), дозировка аденовируса, назначаемая для ввода в организм должна серьезно о исследоваться, с целью дальнейшего уменьшения возможностей возникновения побочньїх зффектов.

Существуют различнье критерии, которье следует принимать во внимание при оценках существования необходимости в ответной реакции и существования токсичности Для решения вопроса определения токсичности, прежде чем приступить к курсу терапевтического лечения, следует сфотографировать ложе юю опухоли, измерить ее найбольший диаметр и перпендикуляр. Размер опухоли определяеться как произведение диаметров. Имея зти даннье можно рассчитать степень рецидива опухоли. ї-о

Время до прогрессирования в развитии болезни может бьть также измерено, начиная от первого с обследования с обнаружением уменьшения опухолевой массьй до появления очевидньїх признаков прогрессирования. Прогрессирование в развитий болезни определяется как увеличение на 52595 суммь о произведений диаметров измеренньїх новообразований. Больной должен пройти, по крайней мере, два курса їх терапевтического лечения, прежде чем появятся показания на прогрессирование болезни. Наблюдение над больньїми должнь! оцениваться с момента занесения в протокол (историю болезни).

Последующие исследования должнь! включать все действия (назначения) терапевтического лечения рака, « включая определение клинических анализов и взятие биопсий для стандартньїх и молекулярньїх биологических анализов, в которьїх может бьіть исследована структура зкспрессии различньїх генов рб53. Зти анализь! могут - с также представить даннье о количестве клеток, которье восприняли перенесенньій ген, а также об а относительной зффективности просмотра іп мімо. Основьіваясь на полученньїх данньїх, могут бьіть внесень! є» нужнье корректировки в ход лечения. Зти корректировки могут включать структурьі аденовируса, которье используют различнье промоторьі или изменения в количестве РЕ множественности инфицирования), введенньїх с целью обеспечения уверенности в том, что инфицированьі все или большинство клеток опухолей -і без нефизиологической чрезмерной зкспрессии рекомбинантньх генов. с Установлено, что зкспрессия зкзогенньїх генов, перенесенньх іп мімо аденовирусами, может существовать в течение продолжительного времени. Терапевтически зффективная, продолжительная во времени зкспрессия іме) зкзогенньїх генов, переносимьїх вирусами, должна бьіть направлена на больного организмом (природой) самого бу 50 больного. Гень-маркерь ограниченьь в своем влиянии определением терапевтически релевантной продолжительности зкспрессии гена, так уровни зкспрессии, необходимье для исправления любого данного сл генетического нарушения, значительно отличаются от уровня, требуемого для основательного лечения другой болезни.

Хотя составь и способь! но данному изобретению бьіли описаньі, ссьілаясь на предпочтительнье примерь! осуществления, специалистам, имеющим опьїт в данной области знаний, совершенно очевидно, что возможнь! о варианть! в составах, способах и в приемах или в последовательности приемов способов, описанньх вьіше, без отступления от сущности, изложенной в формуле изобретения. Более конкретно, из данного описания їмо) изобретения вьітекает, что определеннье посредники-носители, которне могут иметь как химическую, так и физиологическую природу, заменяются посредниками, описанньмми в данном изобретений и проявляющими бо идентичньй или похожий зффект. Все подобнье замещения должнь! бьть в рамках признаков формуль! изобретения. Все защищеннье формулой изобретения продуктьі и способь! могут бьіть осуществленьі без дополнительньїх зкспериментальньїх исследований.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЬ

Представленньй перечень ссьілок охватьвает технический уровень, использованньій изобретателями яри 65 созданиий изобретения. Информация, представленная в перечне, приведена в качестве аргументации при обоснованиях существенности признаков изобретения.

Вагдопецчії, еї аї. (1991) СеїЇ 65:1083-1091.

Воепегіпдег Маппйеїп Віоспетісаіз (1992). Использованиег ООТАР для осуществления вьісокозффективньх трансфекций. ВМВіоспетіса 9(1):17.

Возпагї, М.еї аІ(1985) Очень зффективньйй усилитель располагается вверх по ходу перемещения самого раннего гена цитомегаловируса человека.

Сеїї 41:521-530.

Вівпор (1987) Зсіепсе 235:305-311.

Савзеу. о І о-Нией, М. І оре, М.Е., Модеї!вівїп. В, єбапьгіаде, Е.. (1991). 70 Подавление роста клеток раку груди путем внедрения природного гена ро53.

Опсодепе 6:1791-1797. ба). еї аї. (1992) Ргос. Май.Асад. 5сі. 89:10892-10895.

Рієвїдз еї аї. (1990) Зсіепсе 249:1046-1049.

Сеогдез еї аї. (1993) Сапсег Кез 53:1743-1746.

Спозп-Споцапигу апа Сгапат (1982) Віоспет. Віорпуз. Кевз. Согат. 147:964-973.

Сіи2гтап и другие (1982) в разработке звкариотических вирусньїх векторов (Сій2тап, У., Ед.) рр. 187-192,

Сей 5ргіпд Нагброг Ргезв, Соїд 5ргіпд Нагрог, Мем/-Жогк.

Сгапат, Р.Ї. й А.). мап дег ЕВ. (1973) Новая технология проведения исследований способности к инфицированию ДНК-5 аденовируса человека. Мігоіоду 52:456-467. Сгапат, РБ.Ї., 9У.5тіПеу, МУ.С.Кивве! 5 К.Маїт (1977). Характеристики клеточньх линий человека, грансформировайньх ДНК из человеческого аденовируса типа 5. Сеп Мігої. 36:59-72.

Сгоппайв, А. Кф Ногпміїх, М.5.(1992) Аденовирусь,используемье в качестве клональньїх векторов. Зетіп.

Мігоїосду 3:237-2542.

Ноївівеїп, М., бЗіагапеКу, О.,Модеівіет, В., 45 Наїтіз,С (1991). Мутации р5З3З в человеческих раковьх сч новообразованиях. Зсіепсе 253:49-53.

Уатїе еї аї., (1992) Нашге Сепейез 1:372-378. і)

Ї е Заї еї аї., (1993) Зсіепсе 259:988-990.

Меогогу, МУ у. еї а. (1988) Простой способ исправления ранних мутаций зоньї икфекционньїх человеческих аденовирусов типа 5. Мігоїоду 163:614-617. ю зо Мегзег, МУ.Е (1992) Регулирование клеточного цикла и протеин ро5З-супрессор роста злокачественного нозообразозания. Стійс. Кем. Еисаг. Сепе Ехргезв. 2:251-263. ісе)

Міеї2, еї аі. (1992) ЕМВО 11:5013-5020. с

Мопіепаг, М. (1992). Биохимические, иммунологические и функциональнье аспектьі супрессорой роста/онкопротеийнов р5З3. Стікіс. гем. Опсо. 3:233-256. ме)

Миїйїдап (1993), Зсіепсе 260-926. ї-

Касої еї а!., (1993) Майте, 361:647-650

Козептеїйа еї аї., (1991) Зсіепсе, 232:431-434.

Козепгеїйа еї аї., (1992) Сеї! 68:143-155.

Зпам, еї а), 89:4495-4499, «

Зрапаїдов, еї аї!., (1989), 9У.Раїйої., 157:1-10. з с зЗіганога-Регтісацдеї, Ї. 5 Регїтісацаеї (1991а) Перенос гена в организме животньїх: надежньі, связаннье с . использованием аденовирусов.р.51-61.і1п О.Сопеп-Надцепацег 5 Воігоп (Едв»). Перенос человеческого гена, и? Едікіопе допп Гіррбеу Епигоїехі, Егапсе. зЗігенога-Регтісацаєеї! еї аї., (19915) Нит. Сепе. ТНег. 1:241-256

Такапахкі, Т., Сагропе, О., ТаКапазгзкі., Мам, М.М., Ніаа., І Іппоїйа, І., Оеда, К., 5 Міппа, 9.0. (1992) Природньй -І роЗ, но не мутант р53, подавляет рост клеток рака легких, характеризующиеся множественньіми генетическими дефектами. 1992. Сапсег Кев. 52:2340-2342. о Теега, 9. (1981). Молекулярная биология вирусов ДНК новообразований, 2-е дог.Соїй Зргіпда Нагрог ко І арогагоїу, Соїд Зргіпд Нагрог, Мем Могк.

Тгамаїї.еї аІ. (1990). ЕАЗЕВ, 4:3209-3214. ме) Хопіви, еї аї. (1991), Маїшге 352:345-347. сп МУеїіпрего, К.А (1991). Ген-сунрессор новообразований. Зсіепсе 254:1138-1145.

УМІсоск еї аї. (1991). Майшге: 349:429-431. 7аіці-Ноигі еї аі. (1985), ЕМВО .)., 4:1251-1255. 7папо, еї а!ї., (1993). Віо Тесппідцез іп ргезв.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Ф) 1. Общая информация: ка (Ї) Заявитель:

А. Имя: "БО ОВ РИДЖЕНТ, ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОВ ТЕКЗАС СИСТЕМ" во В Стрит (Адрес): 201 Вест Севенс(7-я) Стрит

С. Сити (Город) Остин

О. Стейт (Штат) Техас

Е Кантри (Страна) США

Е. Почтовьй индекс. (ЗИП) 78701 65 о Телефон: (512) 499-4462

Н. ТЕЛЕФАКС: (512) 499-1523

(ії) Изобретатели Занг, Вей-Бей

Рот, Джек А. (ії) Название изобретения:

АДЕНОВИРУС-РЕКОМБИНАНТ роз

СПОСОБЬЇ И СОСТАВЬ

(м) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (у) Соответствующий адрес: (А) Адресат: Арнольд, Вайт 45. Деки 70 (В) Адрес: А/Я 4433 (С) Город: Хьюстон (0) Штат: Техас (Е) Страна: США (Р) Почтовьй индекс: 77210 (мі) Форма, читаемая на компьютере:

А Тип носителя: Дискета

В Компьютер: ІВМ.РО-совместимьй

С Операционная система: РО-0О5/М5-005, АЗСІЇ

О Программное обеспечение: РАТЕМТІМ КЕГЕАЗЕ 5 1.0, МЕКБІОМ 81.25 (мії) Данньве о заявке, находящейся на рассмотрении:

А Номер заявка: неизвестен

В Дата подачи: в соответствий с витекающими обстоятельствами

С Классификация: неизвестна (мії) Ранее поданная заявка: сч

А Номер заявки: ОЗБЕМ 09/145,826

В. Дата подачи: 29 октября 1993г (8)

С Классификация. Неизвестна (їх) Информация о патентном поверенном/агенте

А Имя: Барбари С. Китчел ю зо В Регистрационньй номер: 33,928

С Ссьілка на документ об уплате пошлинь ?: ШТЕСЗ5ОР-- ісе) (СО Информация о каналах связи: с

А Телефон: (512)418-3000

В ТЕЛЕФАКС: (512)474-7577 о

С Телекс: 79-0924 ї- 2. МІНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ:

ЗБОЮ МО: 1 і. Характеристики последовательности:

А. Длина: 20 «

В. Тип: Нуклеиновая кислота з с С. Цепь ДНК: Одиночная

О. Топология: Линейная ;» ії. Молекулярньй тип: ії. Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО: 1: вОСсСсСАССС ССТТОоОСстТТо -І ЗБОЮ МО: 2: і Характеристики последовательности: і А. Длина: 20 ко В. Тип: Нуклеиновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная

Ме. О. Топология: Линейная сп ії. Молекулярньй тип: ії. Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО: 2:

ТТТОТААССАТ ТАТААОСТОС

5Б ЗБОЮ МО: 3: і. Характеристики последовательности:

Ф) А. Длина: 20 ка В. Тип: Нуклеиновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная во О. Топология: Линейная ії. Молекулярньй тип: ії. Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО: 3:

ТСОСТТСТСА ССАОСТОТТО

ЗБОЮ МО. 4: 65 і Характеристики последовательности:

А. Длина: 20

В Тип: Нуклеиновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная

Ор. Топология: Линейная ії. Молекулярньй тип: ії. Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО: 4:

САТСТОААСТ САААДОСОоТОоО

АДЕНОВИРУС-РЕКОМБИНАНТ роз

СПОСОБЬІ И СОСТАВЬ

О ти Цитомегаловирує Ранний сигнал сої Сеязующев звено ДНК - ріпротенна! полиаденилацин у лиш полилинкер. рСМУ су40 РА

Ж Рекомбикантньй ---ШИШИУНУ-- У 5 ол,

ВАЗ? я рХСм. 1 Левьй конеч генома АД Кассета зкспрессий ропо В (70 КВ) АЕ1 (1.3-9.2 ту) пяа хх оо 16 ти

Ячейхи картьї 37 ти 000 ти 0 ти рРВАХ

ОДЯ ро 3.7 ти Шо

ДЯ во Рекомбинантньй плазмид, ду Вектор х до зкопрессни роЗ ) і РЕС5З | рУМ17 Ї

Мо (9255) (40.3 Кб) /

У сч

У, . ра

Зло Я о 16 ту («онтрансфекция в клетках 293) гомологическая рекомбинация ) ю

Аденовирусь-рекомбинантві (се) ) Обеззараживаниє бияшек (наспоениє) с

Запасні аденовирпуса-пехомбинанта

АЯБСМУ-рЗ

Фиг. 1 Ше

Ватні! Ватні Ватні -

НН я4кь -| Ковєкь-

Ї дян р у дян Ячейки карти о, 10.20.30 40 50 60 70 80 90 100ту «

ІТА Бинт и ітв

ЕсоВ! Сіа! Ватні Есові шщ (1.25) (9.2) (59.5) (76.0) с Фиг 2А . "» (ші мі 2 3 8 12.0: "о

Ше 20- Й (95) Щі ке 1.6: Тоді - С - включенле ро)

ФО 50 КЕ. фрагмент лоб 0.5 - Ще сл о «би в іме) бо б5 мМ и НОВ ЕЕ С М (ко ра ей шо-- СИ що -6

І

- - я -т -20 ще 10 . т С

Ши, Ж

Ме ни ОО

ЕК УК л.с Н озВ ще вхо 5. др ТМ КМ хе --5 с янв їжу ер шу ню, ик ох мекв ще ЯКЕ еВ

М У у АРИК в ВЕ вись М

Я у ипеуте ек УК Вт а кв Я

СЮ ЗУ т В ке сч оди ут

Не Кк ера повінню. ней

Фаесг. ЗА поруку ин р т, и во олив о шо Ах зо пи не жи ю

Зрита ех сек.

ЕІ о т

Кк

ЕС в т ж У с

Ве доню»

Я Крус лов ав

В пеки ню с

Нед мери

Зо нов ун с. пов я я де ех А їх с дих пн

Ки: оо: вух ге а сс іао и у

Кн « рн ся с Фиг, ЗВ -о пт в ;» Ес Би " ву свя поет пед товт ее и Му слон Ден -і т ЕК Кт ТО

Пл пік вико

Си кА ее ах омани нн ол ву о іа си ВІ ДО Й ис г ве

Ге) ща КА Зрех є о за х он МЕ - Фени чі 7. МИЛА ЕВ

Фиг 3С 60 б5

БВ нн рен

Пе я мк пуп и тод я м і Не і НН тю Ме КВ АШИЕ ам, ПИЛУ. п й и .

Ко п, КИ КОН ОИИ М

Фиг 30 75 ЩА вс ей ФМ ке їж ою; Я сх. З а «щ: пе М бр Я Р б: з м, сь жд чо и КМ "УМ ях ки ній дова 3 жа р «т, 7; и г о ові: айс У ; пе Я Її 720 Ті ат шо ОО ит, . мук а у ій ій 7 ку р сх з Я асю: Злувси а ау чик й рве ВД,

Меси кві вне ! во АНА. Кая, сч

ШК у вв Я А МН:

Фиг. 4А о нн а в вся ул, Мих ХА є ше пут дя г А хх оо ну х ДОН: ю з у оо « М г почне ви 25 ВА і со й У 3 й сей ї ее рок рег й них тк : Ше М сч

ПО кри. й ., пав З са з Ліст МИ под тя т А. щі

Й мо, ль - ,/ - ма у кі я.

ИН Ку

Фиг. 48 « ша п -» рт й а дво - ін у у ат о 7 ль зак ут хг. п Що Я ек т ши ал ; де щі ва " ка? ч зах їн "7. . «А,

Р - ч- а ет с іч зе а й оз 6 Кф ї за. Ки - | 2-8 - т » " | « х », «а й що (9) ж лав і Ки Фі.

Є «г лі» о ' шою. о у М Ко а Е а- - й ду Ат ст МА

Фиг. 4С сл С ожеа з й

Ф "ки » "а вай Ци кі су, че. ва - я

КЗ ж тетед я рої ши жі чу - -. чу да М К "а В (Ф) св. ЧЕ 7 «. є, ". сь ой й ) , ек ко тя ка но й ОЗ - Й оф й: щі М т. лев,

І вч ОК ря нах з а? є ть д

Коста сс а Му й

БЕ т ль 65 Фиг. 40

2 340.56 Д 7 М (краї поро и ОО: я

М в ШК о ей ек НЯ ее - 200 щ ше Ме ЗАЙ 525 Ше ї і. й о -97 ка ар нин ШО і і -43 5 70 Ст нь чи ях і Ї г ІВ ЩО -

Фиг. 5А 1234567

Щ се шини: зад мо фе -рБ3 ! ! -ДАсіїп

Фиг. 58 103 85 7 с й о щи 0 8 п й й

ОЙ й

ИЙ й ю зо й й й 29 що о : Я ї 23 1

С т сч

І Дни после инфицировання Гео)

Фиг А де 5СМУ-роЗ - ст--Н-НШ2ШН2ИИ5353233006 за ї -рбБ3 й на -Асіїп « буов и 359 5 5 З с Дни после инфицирования :з» Фиг. 68 тя в -І 4.0 ОО Среда-носитель о Ф дОБ/ВБМ/СІ 2. Контрольньй вирус ке т Ай5СМУ-рбБЗ - дденовирус- - 30 рекомбинант в

Ф : сл Е 8 20 1.01- ф га

Ф) ра д--й 3-й 0123456 60 Дни после инфицировакия

Фиг. 7А б5

Клегочная линия нзг2 40 ОО Среда-носитель

Фе АОБ/КОМ/ОІ 2 контрольний вирус

У давсму-рб53 Аденовирус- рекомбичант - 30 о

Е ' 2 я х 70 5 20

Клетки (миллисн) 1.0 0123456

Дни после инфицирования

Фиг. 7В

Й ф

Клеточная линия набо 4.0 ОО Среда-носитель Ху е АОБ/НБМ/СГ2 копефьння с

У АЙ5СМУ-Р53 аденфо о рекомб т 3.0 о

Е г

Е у

Е

5 ро. 2.0 т ІС о) й і (Се) т; 1.01- 5, Га я о 01234565

Дни после инфицирования

Фиг. 7С «

Щі Льсье мьшши (облученнье 300 сбу, 60 Со) о, с 1-й день |!

Введен пентран для анестезий ч

І» 2 Х 106 Н2268Вг сеї (0.1 ос моіїште)

Внутритрахеальная инстилляция с использованиєм трахвотома

І

-І "т (пентран)

ОО 4-й день Внутритраувальняя инетилляция (0.1 сс / мьшь) 5-й нь (4 У де з т

ХО РЕ Множественность Контрольньй ко мнфицирования рекомбиначтом -аденовирусом носитель в) / У, доа5сМУу-реЗ дабБ/нЗМІ2 мьши/клетка мьши/клетка мьши/клетка сл ---62- 251 - 5

Агония 6-я неделя 29 Звтаназия (ингалляция СО»!

Аутопсия (вскрьтие и иссечение средостения)

Измеренне размера опухоли Їде иеспедования бо Фиг. 8 бо ї ч 25 ах а у. , У чи

ЕН Код

Фиг ЗА г й й

Фиг 98 щи і с

Фиг 90 щі 6) ; Й. що . -зЩ й , х " її 3 хх ю ж «й (Се) с

ПИТНІ се рин ЦИ) со 1 2 З

Фиг 30 ч-

Claims (50)

Формула винаходу «

1. Аденовирус-рекомбинант, несущий структуру аденовирусного вектора, способного обеспечить зкспрессию о, с гена р53З в злокачественньїх клетках человека, содержащего зону зкспрессии, при зтом зона зкспрессии "» находится под управлением конститутивного промотора, способного направлять зкспрессию гена р5З в " злокачественнье клетки человека и содержащего сигнал полиаденилации.

2. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто промотор ІЕ цитомегаловируса.

З. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто вирусньй І ТК.

- 4. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто промотор КБУ.

с 5. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто промотор фактора-1 злонгации.

6. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто 5М40. іме)

7. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто актин. б 50

8. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто промотор полиома.

9. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что промотор - зто аденовирусньїй промотор. сл

10. Аденовирус-рекомбинант по п. 9, отличающийся тем, что сигнал полиаденилации - зто сигнал полиаденилации 5М40.

11. Аденовирус-рекомбинант по п. 9, отличающийся тем, что сигнал полиаденилации - зто сигнал 2о полиаденилации протамина. о

12. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что зона, кодирующая ро53, замещает зонь,, кодирующие ЕЇпА и ЕЇІВ. о

13. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что структура вектора содержит зону зкспрессий ро3, промотор ІЕ цитомегаловируса и ранний сигнал полиаденилации 5М40. 60

14. Аденовирус-рекомбинант по п. 2, отличающийся тем, что он имеет дефицит репликации.

15. Аденовирус-рекомбинант по п. 71, отличающийся тем, что ген, ответственньй за репликацию аденовируса, удален из структурь! вектора, а зона зкспрессии р5З3 внедрена на его место.

16. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что зоньі ЕІА и ЕІВ вектора аденовируса удалень, а зона зкспрессии р53 внедрена на их место. б5

17. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что он достигает уровня белка ро53З в клетке-хозяине примерно в 14 раз больше, чем уровень зндогенного р53 в инфицированньйх клетках Н4іб0.

18. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что он достигает уровня белка ро53З в клетке-хозяине примерно в 2-4 раза больше, чем уровень бета-актина в инфицированньх клетках НЗ5Б8.

19. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что он имеет структуру генома, показанную на фиг.1.

20. Аденовирус-рекомбинант по п. 1, отличающийся тем, что он рассеян в фармакологически допустимом составе.

21. Аденовирус-рекомбинант по п. 17, отличающийся тем, что аденовирус зкспрессирует уровень р5БЗ, достаточньій для уничтожения злокачественньїхх раковьїх клеток человека. 70

22. Аденовирус-рекомбинант по п. 17, отличающийся тем, что аденовирус зкспрессирует уровень р5БЗ, достаточньїй для введения апоптоза в злокачественнье раковне клетки человека.

23. Аденовирус-рекомбинант по п.17, используемьій для трансфекции линии зукариотических клеток млекопитающих, животньх и человека.

24. Способ восстановления функции протеина ро53 в опухолевой клетке с дефицитом природного роз, /5 Включающий создание условий контакта клетки с аденовирусом-рекомбинантом по одному из пп. 1-19, содержащим вектор с зоной зкспрессии, кодирующей роб.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что используют опухолевую клетку с мутацией в гене р53.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что опухолевая клетка представляет собой клетку рака легких человека.

27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что опухолевая клетка представляет собой клетку рака груди человека.

28. Способ по п. 24, отличающийся тем, что создают условия для контакта путем расположения клетки в организме млекопитающего, а аденовирус вводят млекопитающему в фармакологически допустимом виде.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что аденовирус вводят непосредственно в раковую клетку. сч

30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что аденовирус вводят внутривенно в организм млекопитающего.

31. Способ по п.28, отличающийся тем, что аденовирус вводят внутритрахеально в организм і) млекопитающего.

32. Способ по п. 28, отличающийся тем, что аденовирусь! в количестве 107-102 вводят в организм млекопитающего. ю

33. Способ по п. 28, отличающийся тем, что раковая клетка представляет собой опухолевую клетку.

34. Способ производства аденовируса-рекомбинанта по одному из пп. 1-19, заключающийся в том, что о вводят плазмиду аденовируса р).М17 и вектор зкспрессии роЗ в клетку-хозянина путем трансфекции с Ге промежуточньм перемещающимся звеном липосомь! и проводят анализ культивированной клетки-хозяина на наличие цитопатогенного зффекта, являющегося показателем рекомбинации и получения вируса-рекомбината. о

35. Способ по п. 34, огличающийся тем, что промежуточньм перемещающимся звеном липосомь!ї является - ІМ-(1--2,3-дидеоилокси)-пропил|-М,М,М-триметил-аммониум метилсульфат).

36. Способ по п. 34, отличающийся тем, что в качестве плазмидьй аденовируса используют репликационно-дефектную плазмиду аденовируса, а клетка-хозяин дополняет дефект. «

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что плазмида аденовируса испьітьївает дефицит в функциональньх 70 ЕїА и ЕЇІВ, а в качестве клетки-хозяина используют клетку с зкспрессией ЕЇ. - с

38. Способ по п. 34, отличающийся тем, что в качестве клетки-хозяина используют клетку 293. ц

39. Способ по п. 34, отличающийся тем, что культивирование клетки-хозяина проводят в среде МЕМ. "»

40. Способ по п. 34, отличающийся тем, что дополнительно к определению цитопатогенного зффекта получают ОМА из надосадочного слоя клеток, проявляющих цитопатогенньій зффект, и проводят анализ ОМА с помощью цепной реакции полимеризации (РСК), при зтом используют в зкспрессии вектор-специфическую ОМА -І и аденовирусную геномспецифическую ОМА для подтверждения получения аденовируса-рекомбинанта.

41. Способ по п. 34, отличающийся тем, что используют вектор зкспрессий, включающий сегмент о роЗ-кодирующей ОМА, находящийся под управлением промотора, способного направлять зкспрессию роЗ в ко метастатические клетки человека.

42. Аденовирус-рекомбинат по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что используется для производства б препарата, тормозящего рост клетки злокачественного новообразования. с

43. Аденовирус-рекомбинат по п. 42, отличающийся тем, что указанньй препарат используют для введения пациенту в течение периода времени, необходимого для торможения роста клетки злокачественного новообразования,

44. Аденовирус-рекомбинат по п. 42 или п. 43, отличающийся тем, что указанньій препарат используют для введения пациенту, по меньшей мере, дваждь. о

45. Аденовирус-рекомбинат по п. 42, отличающийся тем, что указанньй препарат используют для введения ко пациенту впрьіскиванием в область местонахождения опухоли после ее иссечения.

46. Аденовирус-рекомбинат по п. 42, отличающийся тем, что указанньй препарат используют для введения бо пациенту локально или регионально прямьм впрьскиванием в область местонахождения опухоли путем внутритрахеального введения, введения с помощью системь), методом внутривенного впрьіскивания или методом внутривенного вливания.

47. Аденовирус-рекомбинат по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что используется для производства препарата, обеспечивающего контроль роста метастаз, подавление злокачественного развития заболевания 65 Мімли подавлениє онкогенности.

48. Аденовирус-рекомбинат по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что используется для производства препарата для лечения зпителиального рака, в частности, рака легких и/или зндобронхиальньїх опухолей, особенно, рака легких, характеризующегося наличием крупньїх клеток; или неоперабельньїх опухолей.

49. Аденовирус-рекомбинат по любому из пп. 42, 47-48, отличающийся тем, что указанньй препарат используют для введения пациенту в дозировке от 1079 до 5х1072,

50. Аденовирус-рекомбинат по любому из пп. 42, 47-48, отличающийся тем, что указанньій препарат используют для введения пациенту в обьеме 10 миллилитров или менее. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних 70 мікросхем", 2005, М 7, 15.07.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) ІФ) (Се) с (зе) і - -

с . и? -І (95) іме) (о) сл іме) 60 б5