ES2694681T3 - Métodos para tratar trastornos de pérdida capilar - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de Jak3 seleccionado entre el grupo que consiste en: decernotinib; tofacitinib; inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923); NSC114792; PF-956980; un ARN no codificante o ADN no codificante que es específico para un ácido nucleico que codifica un polipéptido de JAK3; y un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3 para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida capilar seleccionado entre el grupo que consiste en alopecia areata y alopecia androgénica.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Métodos para tratar trastornos de pérdida capilar Antecedentes de la invención

La Alopecia Areata (AA) es una de las enfermedades autoinmunes más altamente prevalente es que afectan a aproximadamente 5 millones de individuos en Estados Unidos, y a tantos como 140 millones en todo el mundo. La AA conduce a la pérdida del cabello debido al colapso del privilegio inmune del folículo piloso y la posterior destrucción autoinmune. La AA es una enfermedad cutánea que conduce a la pérdida del cabello en el cuero cabelludo y en cualquier parte. En algunos casos graves, puede evolucionar a la pérdida completa del pelo de la cabeza o del cuerpo. Aunque se cree que la Alopecia Areata está causada por la inmunidad, todavía no se ha desarrollado el diagnóstico del nivel genético y agentes terapéuticos dirigidos de forma racional. La base genética de la AA es muy desconocida. Su impacto psicológico en los pacientes afectados es devastador, en particular en los niños.

B.Y. Chang et al., (2009) J. Immunol. 183 (3): 2183-92 desvela el tratamiento de ratones que tienen enfermedad cutánea psoriasiforme usando R348, un inhibidor de JAK3.

Sumario de la invención

Un aspecto de la invención incluye un inhibidor de Jak3 seleccionado entre el grupo que consiste en decernotinib, tofacitinib, inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923); NSC114792; PF-956980; un ARN no codificante o ADN no codificante que es específico para un ácido nucleico que codifica un polipéptido de JAK3; y un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3 para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida capilar seleccionado entre el grupo que consiste en alopecia areata y alopecia androgénica. En algunas realizaciones, el ARNsi dirigido a un gen de Jak3 es uno cualquiera de las secuencias que se indican en la Tabla 1. En una realización más, se pretende la administración del inhibidor de Jak3 por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, mediante inyección intravenosa; mediante una infusión; por vía parenteral, por vía transdérmica, por vía transmucosal, por vía rectal, por vía oral, por vía nasal, o mediante administración tópica; o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak3 diariamente, semanalmente, dos veces a la semana, mensualmente, dos veces al mes, o anualmente. En algunas realizaciones, el inhibidor de Jak3 se administra 1 vez a la semana, 2 veces a la semana, 3 veces a la semana, 4 veces a la semana, 5 veces a la semana, 6 veces a la semana, 7 veces a la semana, 8 veces a la semana, 9 veces a la semana, 10 veces a la semana, 11 veces a la semana, 12 veces a la semana, 13 veces a la semana, o 14 veces a la semana. En otras realizaciones, al sujeto se le administra el inhibidor de Jak3 durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, o al menos 16 semanas. En algunas realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak3 con un inhibidor de Jak1/2 al sujeto. En otras realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak1/2 de forma simultánea con el inhibidor de Jak3. Además, en otras realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak1/2 en cualquier orden con el inhibidor de Jak3. En algunas realizaciones, el inhibidor de Jak1/2 es ruxolitinib, figlotinib, AG490, momelotinib, pacritinib, baricitinib, fedratinib, BMS-911543, o lestaurtinib.

La solicitud también desvela un método para inducir el recinto capilar en un sujeto en la que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una proteína tirosina quinasa (PTK) implicada en la señalización de citoquinas. El inhibidor puede ser un inhibidor de Jak3. El inhibidor puede ser tofacitinib (CP690550). El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, efluvio telogénica, alopecia areata, tiña de la cabeza, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal. El método puede comprender adicionalmente determinar si el inhibido administrador indujo el crecimiento capilar en el sujeto afectado con un trastorno de pérdida capilar en comparación con el crecimiento capilar del sujeto antes del tratamiento con el individuo. El inhibidor puede ser un anticuerpo que se une de forma específica a una proteína Jak3 o un fragmento de la misma; un ARN no codificante o ADN no codificante que disminuye la expresión del gen que codifica la proteína Jak3; un ARN no codificante o ADN no codificante que disminuye la expresión de la proteína Jak3; un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3; una molécula pequeña; o una combinación de los mismos. La molécula pequeña puede ser Janex 1 (WHI-P131), PF-956980, WHI-P154, tofacitinib (CP690550), VX-509, inhibidor IV de JAK3, NSC114792, o R348. El anticuerpo se puede unir de forma específica a una proteína que comprende la SEQ ID NO: 1. El ARNsi se puede dirigir a una secuencia humana de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO: 2. El ARNsi se puede dirigir a un gen de Jak3 es uno cualquiera de las secuencias que se indican en la Tabla 1. La administración puede comprender una inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, o intravenosa; una infusión; administración oral, nasal, o tópica; o una combinación de las mismas. Se puede pretender que la administración del inhibidor de Jak3 se produzca diariamente, semanalmente, dos veces a la semana, mensualmente, dos veces al mes, o anualmente. Se puede pretender que el inhibidor de Jak3 se administre 1 vez a la semana, 2 veces a la semana, 3 veces a la semana, 4 veces a la semana, 5 veces a la semana, 6 veces a la semana, 7 veces a la semana, 8 veces a la semana, 9 veces a la semana, 10 veces a la semana, 11 veces a la semana, 12 veces a la semana, 13 veces a la semana, o 14 veces a la semana. Al sujeto se le administra el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

inhibidor de Jak3 durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, o al menos 16 semanas. El método puede comprender adicionalmente la administración de un inhibidor de Jak1/2 al sujeto. Se puede pretender que el inhibidor de Jak1/2 se administre de forma simultánea con la administración del inhibidor de Jak3. Además, en otras realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak1/2 secuencialmente en cualquier orden con el inhibidor de Jak3. En algunas realizaciones, el inhibidor de Jak1/2 es INCB 018424, GLPG0634, aG490, CYT387, SB1518, LY3009104 (Baricitinib; INCB28050), TG101348, BMS-911543, o CEP-701.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra que el tratamiento de ratones con el inhibidor de Jak3 (tofacitinib; CP-69055) evita la alopecia areata (AA).

La FIG. 2 muestra la eliminación relacionada con el tratamiento de infiltrados de linfocitos T dérmicos y biomarcadores inflamatorios mediante inmunotinción (FIG. 2A) y mediante citometría de flujo (FIG. 2B). Los linfocitos T CD8+ NKG2D+, que representan hasta un 25 % de células dérmicas en piel con AA, se eliminan completamente con el tratamiento. La citometría de flujo es de suspensiones de células individuales de la piel. Las células en el cuadrante superior derecho no se observan en ratones sanos normales y son linfocitos T efectores CD8+NKG2D+. Los linfocitos T efectores CD8+NKG2D+ se encuentran en ratones alopécicos después de injerto de piel. Los ratones tratados con el inhibidor de Jak3 no desarrollan alopecia y su piel está desprovista de estas células.

La FIG. 3 son gráficos que muestran la eliminación con el tratamiento de linfocitos T CD8 T de “tipo NK” que producen IFN-y en LN cutáneo, y pérdida de quimioquinas inducibles por IFN circulantes. Los gráficos de barras en el panel de la parte izquierda muestran citometría de flujo intracelular de células de LN estimuladas con PMA/Iono de ratones tratados individualmente y sin tratar teñidas con CD8.NKG2A/C/D/E.IFNy. Se muestran dos ratones por grupo.

La FIG. 4 es un diagrama de cinta que muestra que los receptores de injerto de C3H/HeJ se trataron con un inhibidor de JAK3 (panel derecho), o PBS. El ARN se extrajo de piel recogida las semanas 6 (w6) y 13 (w13) después del tratamiento y también de ratones que se habían sometido a cirugía simulada y que posiblemente se interrogaron con análisis de micromatriz.

La FIG. 5 muestra fotografías de ratones antes (panel superior) y después de tratamiento tópico (9 días (panel en la parte media) y 30 días (panel en la parte inferior)) solo con crema.

La FIG. 6 muestra fotografías de ratones antes (panel superior) y después de tratamiento tópico (9 días (panel en la parte media) y 30 días (panel en la parte inferior)) con el inhibidor de Jak3, tofacitinib.

La FIG. 7 muestra fotografías de ratones antes (panel superior) y después de la infusión de control (5 semanas (panel en la parte media) y 10 semanas (panel en la parte inferior)) sin el inhibidor de Jak3, tofacitinib.

La FIG. 8 muestra fotografías de ratones antes (panel superior) y después de la infusión con bomba (5 semanas (panel en la parte media) y 10 semanas (panel en la parte inferior)) con el inhibidor de Jak3, tofacitinib.

La FIG. 9 muestra la eliminación relacionada con el tratamiento de infiltrados de linfocitos T dérmicos y biomarcadores inflamatorios mediante citometría de flujo. La citometría de flujo es de células de ganglios linfáticos. Las células en el cuadrante superior derecho no se observan en ratones sanos normales y representan linfocitos T efectores CD8+NKG2D+. Los linfocitos T efectores CD8+NKG2D+ se encuentran en ratones alopécicos después de injerto de piel. Los ratones alopécicos tratados con el inhibidor de Jak3 presentan recrecimiento capilar y sus ganglios linfáticos están desprovistos de estas células.

La FIG. 10 muestra que los "ligandos de estrés" de NKG2D están regulados de forma positiva en el folículo piloso, y demuestra la patogénesis compartida en ser humano y ratón.

La FIG. 11 es una microfotografía de una inmunotinción que muestra que los linfocitos T CD8+ NKG2D+ infiltran en el folículo piloso, y demuestra la patogénesis compartida en ser humano y ratón.

La FIG. 12 nuestro análisis de citometría de flujo que muestra que los linfocitos T NKG2D+ CD8+ son las células infiltrantes dominantes, y demuestra la patogénesis compartida en ser humano y ratón. (por ejemplo, véase Clark, et al., (2006) J Invest Dermatol. 126 (5): 1059-70, que se refiere a un método para aislar restos arrastrados de linfocitos T de la piel).

La FIG. 13 muestra que la transcriptómica comparativa desvela una firma de respuesta a IFN compartida, y demuestra patogénesis compartida en ser humano de ratón.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La FIG. 14 muestra representaciones que representan que los Linfocitos T Citotóxicos CD8+NKG2D+ son células productoras de IFN-gamma que portan receptores de tipo NK.

La FIG. 15 muestra que los linfocitos T CD8 de Tipo NK son necesarios para transferencia de Linfocitos T de Alopecia Areata.

La FIG. 16 muestra estudios preclínicos usando inhibidores de JAK sistémicos en el modelo de ratón C3H-HeJ de alopecia areata (por ejemplo, véase O'Shea, Immunity. 20 de abril de 2012; 36 (4): 542-50).

La FIG. 17 muestra los resultados de estudios preclínicos con administración sistémica de inhibidor JAK3 (tofacitinib), y el tratamiento con tofacitinib previene la Alopecia Areata.

La FIG. 18 es un diagrama que representa diferentes ejemplos de terapias dirigidas hacia la alopecia areata. Estas terapias tópicas se pueden usar para revertir la enfermedad establecida.

La FIG. 19 muestra estudios preclínicos con administración tópica de inhibidor de JAK3 (tofacitinib). El tratamiento tópico usando inhibidor de JAK3 da como resultado la inversión de la AA de larga duración (2-3 meses de duración). Antes del tratamiento, todos los ratones presentaban una pérdida de pelo durante 2-3 meses. A los ratones de control se les aplicó una crema diariamente. Los ratones tratados con el inhibidor de Jak3, Tofacitnib, se trataron diariamente con una crema tópica que contenía Tofacitnib al 0,5 %.

La FIG. 20 muestra un resumen de estudios preclínicos en ratones C3H/HeJ con alopecia.

La FIG. 21 muestra la prevención de AA con tratamiento sistémico con un inhibidor de JAK3 administrado en el momento del injerto de piel. Todos los reactivos comienzan en el momento del injerto (prevención). El inhibidor de JAK3 (CP690550) se administró usando mini-bombas osmóticas Alzet (bombas de 28 días, Modelo 2004) implantadas por vía subcutánea, 10 mg/kg/día o vehículo (PEG300).

La FIG. 22 muestra microfotografías que representan que el tratamiento con inhibidor de Jak3, tofacitinib, normaliza el infiltrado inflamatorio.

La FIG. 23A muestra la regulación positiva de NKG2DL en el folículo piloso de ratones C3H/HeJ alopécicos. Tinción con inmunofluorescencia de ligandos de NKG2D (H60) en la vaina de la raíz interna del folículo piloso (marcado con K71).

La FIG. 23B muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. Tinción con inmunofluorescencia de células CD8+NKG2D+ en folículos pilosos de ratones C57BL/6, C3H/HeJ sanos y C3H/HeJ AA.

La FIG. 23C muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. Linfoadenopatía y celularidad cutáneas sorprendentes en ratones C3H/HeJ que desarrollaron AA.

La FIG. 23D muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. Las representaciones muestran la frecuencia de los linfocitos T CD8+NKG2D+ de piel y ganglios linfáticos de drenaje de piel en ratones alopécicos con respecto a ratones sin injertar.

La FIG. 23E muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. Las representaciones muestran el inmunógeno tipo de los linfocitos T CD8+NKG2D+ en ganglios linfáticos cutáneos en ratones C3H/HeJ alopécicos.

La FIG. 23F muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. Los gráficos demuestran que los linfocitos T CD8+NKG2D+ aislados de LN cutáneos de ratones AA eliminan las células de vaina térmica que expresan Rae-1 cultivadas a partir de folículos pilosos de C3H/HeJ de una manera dependiente de NKG2D.

La FIG. 23G muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. La sec del ARN se realizó en clasificación de linfocitos T CD8+NKG2D+ y CD8+NKG2D' purificados a partir de ganglios linfáticos cutáneos de AA. Las transcripciones reguladas de forma positiva en linfocitos T CD8+NKG2D+ se compararon con la expresión genética de CTL y la expresión genética de células NK en la bibliografía-, 9, y el solapamiento de las firmas genéticas se presenta en este Diagrama de Venn.

La FIG. 23H muestra el fenotipo celular y la función de los linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ en ratones con AA. A los ratones C3H/HeJ se les inyectaron, por vía subcutánea, 2*10® de células de cuatro poblaciones diferentes. La pérdida de pelo desarrollada en receptores después de inyección de células LN totales o linfocitos T CD8+NKG2D+ solos (5 de 5 ratones por grupo), entras que los ratones que recibían linfocitos T CD8+NKG2D' o células LN cells con agotamiento de células NKG2D+ no desarrollaron alopecia (0 de 5 ratones por grupo). *** valor de p =< 0,001.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La FIG. 24A muestra a la formación de perfiles de transcripción de piel con AA de ser humano y ratón que desvela evidencias de IFNy, linfocitos T citotóxicos y la ruta de IL15 como fundamental para la patogénesis de la enfermedad, invitando a direccionamiento terapéutico usando inhibidores de Jak. La FIG. 24A es un diagrama de Venn que muestra el solapamiento del listado de genes de piel de ratón C3H/HeJ alopécico completo (en comparación con piel de C3H/HeJ sin afectar) con expresión genética a inducida por IFNy —y firmas de genes de células CD8 y NK de publicaciones del consorcio de ImmGen 8 9 (panel de la parte superior). El listado representativo de genes expresados de forma diferencial entre AA humana y AA de C3H/HeJ desvela rutas inflamatorias compartidas, en particular genes de la ruta de IFNy, genes representativos de efectores de CD8, y una firma de la ruta de IL-15 sorprendente (panel de la parte inicial).

Las FIGS. 24B-D muestran el efecto del tratamiento con un inhibidor de Jak3 (JAK3i). En la FIG. 24B, JAK3i (tofacitinib) inhibe la activación de Stat3 inducida por IL-15 en linfocitos T. En la FIG. 24C, JAK3i inhibe la función citotóxica de las células LAK inducida por IL-15. En la FIG. 24D, JAK3i inhibe la expresión de la Granzima B de células LAK inducida por IL-15 y la producción IFNy.

La FIG. 25A muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3i previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. Los ratones C3H/HeJ injertados se trataron de forma sistémica desde el momento del injerto. El inicio de la alopecia se inhibe con JAK3i, tratamiento con tofacitinib. La durabilidad de la prevención de la enfermedad se demostró mediante retirada del tratamiento durante un periodo adicional de 12 semanas después de la retirada del tratamiento.

La FIG. 25B muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3i previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. Los ratones C3H/HeJ injertados se trataron de forma sistémica desde el momento del injerto. El inicio de la alopecia se inhibe con JAK3i, tratamiento con tofacitinib.

La FIG. 25C muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3 previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. La frecuencia de los linfocitos T CD8+NKG2D+ en la piel y en los ganglios linfáticos cutáneos de ratones tratados con JAK3i disminuyó de forma significativa en comparación con los ratones de control. *** valor de p =< 0,001.

La FIG. 25D muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3i previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. La tinción inmunohistoquímica de biopsias de piel mostró que la expresión de CD4, CD8, MHC clase I y II en la piel disminuía de forma significativa en ratones tratados con JAK3i en comparación con los ratones de control.

La FIG. 25E muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3i previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. La puntuación de ALADIN (un resumen estadístico de la expresión de genes de la firma de IFN y de la firma de CTL) de ratones tratados con JAK3i mostró normalización. Para estudios de expresión genética, los ratones injertados con piel sana autóloga se incluyeron como controles operados de forma simulada.

La FIG. 25F muestra que el direccionamiento de linfocitos T citotóxicos CD8+NKG2D+ con JAK3i previene el inicio de la alopecia en ratones C3H/HeJ injertados. Los resultados de GEDI de ratones tratados con JAK3i mostraron reducción de las firmas de CTL e IFN.

La FIG. 26A muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la quinasa efectora cadena abajo JAK3. De tres a cinco ratones por grupo con AA de larga duración (al menos 12 semanas después del injerto) se trataron por vía tópica en el lomo dorsal con JAK3i al 0,5 %, tofacitinib o (paneles superiores) vehículo solo (Aquaphor) mediante aplicación diaria durante 12 semanas. Un manto completo de pelo apareció en los ratones tratados con JAK3i a las 7 semanas de tratamiento y se desarrolló adicionalmente a las 12 semanas. La durabilidad del recrecimiento capilar se midió durante un periodo adicional de 8 semanas después de la retirada del tratamiento sin evidencias de recurrencia de la enfermedad.

La FIG. 26B muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la quinasa efectora cadena abajo JAK3. El gráfico representa el transcurso del tiempo del índice de crecimiento capilar que se muestra como semanas después del tratamiento.

La FIG. 26C muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la quinasa efectora cadena abajo, JAK3. Las representaciones representan que la frecuencia de los linfocitos T CD8+NKG2D+ en la piel de ratones tratados con JAK3i disminuyó de forma significativa en comparación con los ratones de corto. * valor de p =< 0,05, ** valor de p =<0,01, n.s. = no significativo.

La FIG. 26D muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la quinasa efectora cadena abajo, JAK3. La tinción inmunohistoquímica de las biopsias de piel muestra pérdida de expresión de marcadores de la clase I y II de CD4, CD8, MHC relacionada con el tratamiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La FIG. 26E muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la

quinasa efectora cadena abajo, JAK3. La puntuación de ALADIN muestra pérdida de firmas de CTL e IFN

relacionada con el tratamiento.

La FIG. 26F muestra la inversión de la AA establecida con inhibidor de molécula pequeña por vía tópica de la

quinasa efectora cadena abajo, JAK3. El análisis de GEDI posee territorios de expresión genética con inversión de

firmas patógenas y las relacionada con el tratamiento.

La FIG. 27A muestra que Rae-1 está regulado de forma positiva en HF de AA. Inmunotinción de la lesión usando un anticuerpo pan-Rae-1 en ratones alopécicos C3H/HeJ, ratones C3H/HeJ sin afectar y ratones C57B1.6.

La FIG. 27B muestra que H60 y Rae-1 están sobre expresados en AA. Expresión de NKG2DL RNA en piel Con lesión alopécica de ratones C3H/HeJ en comparación con piel sin lesiones de ratones C3H/HeJ sin afectar. Los datos de RT-PCR de ADNc de 3 ratones se muestran y se representan como índice de inducción relativo.

La FIG. 27C muestra que los linfocitos T CD4 no son frecuentes en piel con lesiones de AA: evaluación mediante citometría de flujo de piel alopécica con lesión. Cuantificación de linfocitos T CD4 y CD8 como un porcentaje de células CD3+ o CD45+ seleccionadas totales.

La FIG. 27D muestra que los linfocitos T CD8+NKG2D+ con inmunofenotipo de memoria efectores son similares en la piel con lesiones y en los ganglios linfáticos de drenaje cutáneo. Los linfocitos T CD8alfa+NKG2D+ seleccionados se presentan para expresión de CD8beta, NKG2D, NKg2a/C/E, CD44, CD103 y CD62L.

La FIG. 28 es un mapa de redes de genes regulados de forma positiva expresados diferencialmente en células LN CD3+ CD8+NKG2D+ con respecto a células CD8+NKG2D-. Para crear una matriz de puntuación de interacción biológica con los genes expresados diferencialmente se usó String.db. El mapa de redes se creó usando cytoscape; solo se usaron interacciones biológicas > 0,75. Los nodos representan genes, y las crestas representan interacciones biológicas tal como se obtienen a partir de string.db. El tamaño del nodo es proporcional al factor de cambio, y la anchura de la cresta es proporcional a la interacción biológica.

La FIG. 29 muestra validación de estudios de expresión de ARN de ratón. Para determinar la firma de expresión de piel de ratón C3H/HeJ afectada con alopecia areata, la piel con lesión se aisló de tres ratones hembra afectados y tres controles emparejados por edades sin afectar. Los ARN total y pequeño se aislaron de piel completa y el ARNc etiquetado con biotina se generó a través de transcripción in vitro, seguido de hibridación al Genechip 430 2.0 de Ratón de Affymetrix. El análisis de datos se realizó como se destaca en los Métodos. La FIG. 29A es un mapa de calor que representa los genes expresados de forma significativa y diferencial entre piel afectada y sin afectar de C3H/HeJ. La FIG. 29B muestra la validación mediante qRT-PCR of de varios genes relacionados con el sistema inmunológico seleccionados a partir de este listado cuyos niveles de expresión están regulados significativamente de forma positiva en piel con lesión de AA en comparación con piel sin afectar, en la que cada barra representa el promedio del factor de cambio de tres experimentos independientes. UA = sin afectar; Aa = afectado.

La FIG. 30A muestra el tratamiento sistemático de ratones AA con un inhibidor de JAK3. Los ratones C3H/HeJ con alopecia areata de larga duración se trataron con tofacitinib con mini-bombas osmóticas Alzet (bombas, modelo 2004, Durect Corporation) implantadas por vía subcutánea en el lomo de cada ratón para administrar vehículo (poli(etilenglicol) (PEG)300) o vehículo que contenía tofacitinib de JAK3i (Abmol) a 15 mg/kg/día durante 12 semanas. La inversión de la alopecia areata fue completa tanto en el lomo como en el abdomen.

La FIG. 30B muestra claramente sistémico de ratones con AA con inhibidor de JAK3. El análisis de citometría de flujo de poblaciones de piel y de ganglios linfáticos cutáneos muestran la eliminación de la población de linfocitos T cD8+NKG2D+ en ratones tratados (n = 3 por grupo).

La FIG. 30C muestra el tratamiento sistémico de ratones con AA con inhibidor de JAK3. La inmunotinción de piel de ratones tratados con tofactinib o placebo demuestra la eliminación de infiltración de CD8 y regulación positiva de MHC I y II en ratones tratados con tofacitinib.

La FIG. 31 representa la señalización de JAK-STAT en el desarrollo del folículo piloso normal. Para analizar el estado de la ruta de señalización de e JAK-STAT durante el ciclo capilar normal, el ARNm se recogió de piel de tres ratones en los días 17, 23, 29, 33 después del nacimiento. Las muestras representan la transición de fase telogénica a anagénica tal como es evidente en las micro fotografías de tinciones de H&E a partir de estos momentos. Día 17 = fase telegénica temprana; día 23 = fase telogénica tardía; día 29 = fase anagénica temprana; día 33 = fase anagénica completa. El ADNc Se preparó y se sondeó en matrices de qPCR de JAK-STAT. La señalización de JAK- STAT es hacia arriba en la fase telogénica y hacia abajo en la fase anagénica (véase la FIG. 32).

La FIG. 32 es un mapa de calor que muestra un análisis de agrupamiento jerárquico. El ARNm aislado de piel de ratón en cada momento (D17, 23, 29, 33) se sondeó en matriz de qPCR de JAK-STAT. Color Rojo = inducido, Color Verde = reprimido. Se muestran todos los genes de la matriz. Es evidente que varios grupos de genes están

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

regulados de forma positiva en ambos momentos de la fase telogénica (d17 y d23), o regulados de forma positiva en ambos momentos de la fase anagénica (d29 y d33).

La FIG. 33A es un mapa de calor que muestra un análisis de agolpamiento jerárquico. La figura muestra los promedios de 3 replicados biológicos / punto temporal. El grupo de Control: D17 (Telógeno); Grupo 1: D23 (telógeno); Grupo 2: D29 (anágeno); y Grupo 3: D33 (anágeno). JAK1 y 3 están reguladas de forma positiva en el grupo telogénico (rojo en el grupo de control y en el Grupo 1). La expresión de los componentes de la ruta de señalización de JAK-STAT está en la parte superior en la fase telogénica y en la parte inferior en la fase anagénica.

La FIG. 33B es un mapa de calor que muestra un análisis de agrupamiento jerárquico. La figura muestra los promedios de 3 replicados biológicos / punto temporal. El grupo de Control: D17 (Telógeno); Grupo 1: D23 (telógeno); Grupo 2: D29 (anágeno); y Grupo 3: D33 (anágeno). Stat 1/2/3/5 están reguladas de forma positiva en la fase telogénica (rojo en el grupo de control y en el grupo 1). La expresión de los componentes de la ruta de señalización de JAK-STAT está en la parte superior en la fase telogénica y en la parte inferior en la fase anagénica.

La FIG. 34 es un mapa de calor (parte superior) que muestra un análisis de grupos. El grupo de Control: D17 (Telógeno); Group 1: D23 (telógeno); Grupo 2: D29 (anágeno); y Grupo 3: D33 (anágeno). Ligandos potenciales para JAK StAT o dianas para JAK3i: OSM, IL6st (GP130), IL-4, IL-2Rg, CSF1R, y otros regulados de forma positiva en muestras de telógeno.

La FIG. 35 muestra resúmenes de genes regulados de forma positiva en fase telogénica, así como regulados de forma negativa en fase telogénica. El grupo de Control: D17 (Telógeno); Grupo 1: D23 (telógeno); Grupo 2: D29 (anágeno); y Grupo 3: D33 (anágeno). CRP, un gen bien definido regulado de forma positiva por la señalización de JAK/STAT, aumenta de forma sorprendente en la fase telogénica.

La FIG. 36 son microfotografías que muestran JAK-STAT en el desarrollo del folículo piloso: Desarrollo embrionario. Se identificó que Stat 3 y Stat 5 se expresaban de forma diferencial entre fase telogénica y anagénica. Para examinar el patrón de expresión en el desarrollo embrionario, las formas activadas (fosforiladas) de estas proteínas se tiñeron. Como se muestra, P-Stat 3 se expresa en capas epiteliales durante las primeras etapas del desarrollo y a continuación se pueden observar débilmente en la papila dérmica. La expresión de P-Stat5 aparece más tarde, en E16.5, en células dérmicas dispersas y se hace más pronunciada en el condensado dérmico por E18.5.

La FIG. 37 son microfotografías que muestran JAK-STAT en el desarrollo del folículo piloso: desarrollo postnatal. P- Stat3 se expresa en las capas basales de la epidermis y en las capas epiteliales superiores del folículo durante el desarrollo neonatal de la piel. La expresión también se puede detectar en la papila dérmica, lo más evidente durante la fase telogénica (D17). P-Stat5 se expresa altamente en la papila dérmica en todas las etapas del ciclo capilar. En la fase telogénica, la expresión de P-Stat5 se puede limitar a un subconjunto de células DP, el más cercano a la protuberancia de K15+ (D17, parte inferior).

La FIG. 38 son microfotografías que muestran el efecto de un inhibidor de JAK-STAT en el ciclo capilar de ratones normales: Inducción de fase anagénica. La inhibición de la ruta de JAK-STAT durante la fase telogénica (mediante aplicación de un inhibidor de JAK) da como resultado un inicio temprano de la fase anagénica. Los animales de 7-8 semanas de edad en fase telogénica se trataron con controles o con inhibidores de JAK STAT. Los controles negativos (solo vehículo; Panel de la parte Izquierda) y positivo (SAG = agonista de hedgehog sónico; panel de la parte Media) muestran que el tratamiento con DMSO solo no induce la fase anagénica, mientras que el tratamiento con agonista de hedgehog sónico da como resultado una inducción temprana (4-7 días después del tratamiento) de la fase anagénica, tal como se esperaba. Parte Derecha: el tratamiento con el inhibidor de Jak 3, Tofacitinib (10 mg/ml) da como resultado una inducción notable de la fase anagénica después de 2 semanas o 3 semanas de tratamiento en comparación con ratones tratados con vehículo que permanecen en la fase telogénica.

La FIG. 39 son microfotografías que muestran efectos del tratamiento farmacológico en proliferación de queratinocitos in vivo. No parece que el de tofacitinib cause hiperproliferación de la epidermis. Parte superior: Krt6, un marcador de proliferación de queratinocitos expresado generalmente en la vaina de la raíz interna del folículo. Parte inferior: los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación del folículo. En piel tratada con tofacitinib, la proliferación en la parte germinal secundaria se produce más tarde, lo que indica que Tofacitinib puede inducir la fase anagénica.

La FIG. 40 son representaciones que muestran JAK-STAT en el ciclo capilar: un tratamiento farmacológico en ratones. Cuantificación del número y grosor de los folículos pilosos en piel tratada con el inhibidor de Jak3, Tofacitinib, y un inhibidor de Jak1/2 Ruxolitinib, en comparación con piel depilada y tratada con vehículo (DMSO). Tanto los números de folículos como el grosor de los folículos es mayor en la piel tratada con fármacos que en ratones tratados con vehículo.

La FIG. 41 son microfotografías que muestran el efecto de inhibidores de Jak en la morfogénesis del folículo piloso humano: tratamientos farmacológicos de cuero cabelludo fetal humano. Se obtuvo cuero cabelludo embrionario humano a las 20 semanas y se trató in vitro con 30 mg/ml del inhibidor de Jak3, Tofacitinib, o vehículo solo. La piel

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se recogió y se seccionó y se evaluó a la morfología del folículo piloso. Los pelos en la piel tratada parecen más avanzados en la primera fase anagénica de la morfogénesis en comparación con el cuero cabelludo tratado con DMSO.

La FIG. 42 muestra el tratamiento tópico con un inhibidor de JAK. Los ratones C57BL/6 normales de siete semanas de edad se rasuraron en la fase telogénica y se trataron con inhibidor de Jak3 al 1 % (Tofacitinib; panel de la parte Derecha), 1,5 mg/ml de Isopropil unoprostona (Latisse; panel de la parte Derecha Media), SAG 100 uM (agonista de shh; panel de la parte Izquierda Media), o DMSO como vehículo (Panel de la parte Izquierda) mediante aplicación diaria durante 3 semanas. El efecto dura hasta poco más de 1 mes en el momento en el que se tomó la imagen. El fármaco tópico se administró en la mitad derecha de cada ratón, y la parte izquierda de cada ratón se trató con DMSO solo.

La FIG. 43 son microfotografías de tinción de Ki67 (color verde) que muestran una proliferación notable en la fase telogénica del folículo piloso en piel tratada con Tofacitinib y SAG, en comparación con el vehículo, lo que indica el comienzo de la fase anagénica.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un inhibidor de Jak3 para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida capilar (por ejemplo, Alopecia Areata (AA), una forma autoinmune común de pérdida capilar). La investigación clínica en AA ha disminuido más allá que sus enfermedades autoinmunes "hermanas" investigadas en mayor medida en las que este gen se ha visto implicado (por ejemplo, artritis reumatoide (RA), diabetes mellitus de tipo 1 (T1D), esclerosis múltiple (MS)). La invención proporciona agentes terapéuticos que anteriormente no se han sometido a ensayo en AA, que pueden dar información clínica sobre la relevancia clínica aproximada de las rutas relacionadas con Jak3 en aA y enfermedades relacionadas.

Abreviaturas y Definiciones

Las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indiqué claramente de otro modo.

Como se usa en el presente documento el término "aproximadamente" se usa en el presente documento para hacer referencia a aproximadamente, prácticamente, alrededor de, o en la región de. Cuando el término "aproximadamente" se usa en conjunto con un intervalo numérico, éste modifica a ese intervalo ampliando los límites Superior e inferior de los valores numéricos que se presentan. En general, el término "aproximadamente" se usa en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado con una varianza de un 20 por ciento hacia arriba o hacia abajo (superior o inferior).

Visión general del Integumento y Células Capilares

El integumento (o piel) es el órgano más grande del cuerpo y es un órgano altamente complejo que cubre la superficie externa del cuerpo. Se fusiona, en diversas aberturas del cuerpo, con las membranas mucosas de los canales alimentarios y otros canales. El integumento realiza una serie de funciones esenciales tales como mantener un ambiente interno constante a través de la regulación de la temperatura corporal y la pérdida de agua; excreción por las glándulas sudoríparas; pero actúa predominantemente como barrera protectora contra la acción de agentes físicos, químicos y biológicos en tejidos más profundos. La piel es elástica y, excepto en algunas áreas, como las plantas de los pies, las palmas y las orejas, está unida al tejido subyacente. También varía en grosor desde 0,5 mm (0,02 pulgadas) en los párpados ("piel delgada") hasta 4 mm (0,17 pulgadas) o más en las palmas y plantas ("piel gruesa") (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt HG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

La piel está formada por dos capas: a) la epidermis y b) la dermis. La epidermis es la capa externa, que es comparativamente delgada (0,1 mm). Tiene varias células de espesor y está formada por 5 capas: el estrato germinativo, el estrato espinoso, el estrato granuloso, el estrato lucídico (que se limita a la piel gruesa) y el estrato córneo. La capa epidérmica más externa (el estrato córneo) consiste en células muertas que se desprenden constantemente de la superficie y se reemplazan desde abajo por una sola capa basal de células, llamada estrato germinativo. La epidermis está formada principalmente de queratinocitos, que constituyen más de un 95 % de la población celular. Los queratinocitos de la capa basal (estrato germinativo) se dividen constantemente, y las células hijas posteriormente se mueven hacia arriba y hacia afuera, donde experimentan un periodo de diferenciación, y por último se desprenden de la superficie. La población celular restante de la epidermis incluye células dendríticas tales como células de Langerhans y melanocitos. La epidermis es esencialmente celular y no vascular, y contiene poca matriz extracelular, excepto la capa de colágeno y otras proteínas debajo de la capa basal de queratinocitos (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt hG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La dermis es la capa interna de la piel y está formada por una red de material extracelular colágeno, vasos sanguíneos, nervios y fibras elásticas. Dentro de la dermis se encuentran los folículos pilosos con sus glándulas sebáceas asociadas (conocidas de forma colectiva como la unidad pilosebácea) y las glándulas sudoríparas. La superficie de contacto entre la epidermis y la dermis es extremadamente irregular y desigual, excepto en la piel delgada. Por debajo de las células epidérmicas basales a lo largo de la superficie de contacto epidérmico-dérmica, la matriz extracelular especializada se organiza en una estructura distinta llamada membrana basal (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt HG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

La fibra capilar de los mamíferos está formada por células queratinizadas y se desarrolla a partir del folículo piloso. El folículo piloso es un trozo de tejido obtenido a partir de un recrecimiento de la epidermis, que se encuentra inmediatamente debajo de la superficie de la piel. La parte distal del folículo piloso es una continuación directa de la epidermis externa, cutánea. Aunque es una estructura pequeña, el folículo piloso comprende un sistema altamente organizado de capas reconocibles diferentes dispuestas en series concéntricas. Los folículos pilosos activos se extienden hacia abajo a través de la dermis, la hipodermis (que es una capa suelta de tejido conectivo) y en la capa grasa o adiposa (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt HG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

En la base de un folículo piloso activo se encuentra el bulbo capilar. El bulbo consiste en un cuerpo de células dérmicas, conocido como la papila dérmica, contenido en una taza invertida de células epidérmicas conocida como la matriz epidérmica. Independientemente del tipo de folículo, las células epidérmicas germinativas en la base misma de esta matriz epidérmica producen la fibra capilar, junto con varias capas epidérmicas de soporte. La vaina dérmica más baja es contigua con el tallo basal de la papila, desde donde la vaina se curva externamente alrededor de todas las capas epidérmicas de la matriz del cabello como una cubierta delgada de tejido. La porción más baja de la vaina dérmica continúa luego como una manga o tubo para la longitud del folículo (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt HG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

El desarrollo de los apéndices de la piel, tales como folículos del pelo y las plumas, se basa en la interacción entre la epidermis y la dermis, las dos capas de la piel. En el desarrollo embrionario, un intercambio secuencial de información entre estas dos capas apoya una serie compleja de procesos morfogenéticos, que se traduce en la formación de estructuras de folículos adultos. Sin embargo, a diferencia de las células cutáneas y epidérmicas generales de la piel, ciertas poblaciones de células del folículo piloso, después de la madurez, conservan sus comportamientos interactivos, inductivos y biosintéticos de tipo embrionario. Estas propiedades pueden derivarse de la naturaleza muy dinámica del folículo productivo cíclico, en el que la remodelación tisular repetida requiere un alto nivel de comunicación interactiva dérmica-epidérmica, que es vital para el desarrollo embrionario y podría ser deseable en otras formas de reconstrucción tisular.

La fibra capilar se produce en la base de un folículo activo a una velocidad muy rápida. Por ejemplo, los folículos producen fibras capilares a una tasa de 0,4 mm al día en el cuero cabelludo humano y hasta 1,5 mm al día en las vibrisas o bigotes de la rata, lo que significa que la proliferación celular en la epidermis del folículo se encuentra entre los más rápidos tejidos adultos (Malkinson FD y JT Kearn, Int J Dermatol 1978, 17: 536-551). El pelo crece en ciclos. La fase anagénica es la fase de crecimiento, en la que se dice que hasta un 90 % de los folículos pilosos están en fase anagénica; la fase de catagénica es la fase de involución o regresión que representa aproximadamente un 1-2 % de los folículos pilosos; y la fase telogénica es la fase de reposo o inactividad del ciclo, que representa aproximadamente un 10-14 % de los folículos pilosos. La longitud del ciclo varía en diferentes partes del cuerpo.

La formación de folículos pilosos y los ciclos se controlan mediante un equilibrio de señales inhibitorias y estimulatorias. Las pistas de señalización están potenciadas por factores de crecimiento que son miembros de la familia de TGFp-BMP. Un antagonista importante de los miembros de la familia de TGFp-BMP es la folistatina. La folistatina es una proteína secretada que inhibe la acción de diversas BMP (tales como BMP-2, -4, -7 y -11) y activinas al unirse a dichas proteínas, y supuestamente desempeña un papel en el desarrollo del folículo piloso (Nakamura M, et al., FASEB J, 2003, 17 (3): 497-9; Patel K Intl J Biochem Cell Bio, 1998, 30: 1087-93; Ueno N, et al., PNAS, 1987, 84: 8282-86; Nakamura T, et al., Nature, 1990, 247: 836-8; lemura S, et al., PNAS, 1998, 77: 64952; Fainsod A, et al., Mech Dev, 1997, 63: 39-50; Gamer LW, et al., Dev Biol, 1999, 208: 222-32).

El bulbo terminal profundamente integrado, en el que las interacciones dérmico-epidérmicas locales impulsan el crecimiento activo de la fibra, es el centro de señalización del folículo piloso que comprende un grupo de células mesenquimales, llamado papila dérmica (DP). Esta misma región también es fundamental para la remodelación del tejido y los cambios de desarrollo implicados en las fases de crecimiento y regresión de la fibra capilar o del apéndice. La DP, un actor clave en estas actividades, parece orquestar el complejo programa de diferenciación que caracteriza la formación de fibra capilar de la fuente de células epidérmicas germinativas primitivas (Oliver RF, J Soc Cosmet Chem, 1971, 22: 741-755; Oliver RF y CA Jahoda, Biology of Wool and Hair (eds Roger et al.), 1971, Cambridge University Press: 51-67; Reynolds AJ y CA Jahoda, Development, 1992, 115: 587-593; Reynolds AJ, et al., J Invest Dermatol, 1993, 101: 634-38).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La vaina dérmica más baja (DS) se encuentra debajo del tallo basal de la papila, desde donde se curva hacia afuera y hacia arriba. Esta vaina dérmica a continuación recubre externamente las capas de la matriz del cabello epidérmico como una capa delgada de tejido y continúa hacia arriba a lo largo del folículo. La vaina radicular externa derivada de la epidermis (SRO) también continúa por la longitud del folículo, que se encuentra inmediatamente en el interior de la vaina dérmica entre las dos capas, y forma una membrana basal especializada denominada membrana vítrea. La vaina de la raíz externa constituye poco más que una monocapa epidérmica en el folículo inferior, pero se vuelve cada vez más gruesa cuando se acerca a la superficie. La vaina interna de la raíz (IRS) forma un molde para el desarrollo del cabello. Comprende tres partes: la capa de Henley, la capa de Huxley y la cutícula, siendo la cutícula la parte más interna que toca el tallo del cabello. La capa de la cutícula del IRS tiene un grosor de una sola célula y se encuentra adyacente a la fibra capilar. Se une estrechamente con la capa de cutícula de fibra capilar. La capa Huxley puede comprender hasta cuatro capas celulares. La capa Henley del IRS es la capa de una sola célula que corre adyacente a la capa ORS (Ross MH, Histology: A text and atlas. 3a edición, Williams y Wilkins, 1995: Capítulo 14; Burkitt HG, et al., Wheater's Functional Histology. 3a Edición, Churchill Livingstone, 1996: Capítulo 9).

Alopecia areata

La Alopecia areata (AA) es una de las enfermedades autoinmunes más prevalentes, que afecta a aproximadamente 4,6 millones de personas solo en Estados Unidos, incluyendo hombres y mujeres de todos los grupos étnicos, con un riesgo de por vida de un 1,7 % (1). En la AA, la autoinmunidad se desarrolla contra el folículo piloso, dando como resultado una pérdida de cabello sin cicatrices que puede comenzar como parches, que se pueden unir y progresar para cubrir todo el cuero cabelludo (alopecia total, AT) o en ocasiones en todo el cuerpo (alopecia universal, AU). Cornelius Celsus describió por primera vez la AA en 30 A.D., usando el término "ofiasis", que significa "serpiente", debido al sinuoso camino de la caída del cabello a medida que se extiende lentamente por el cuero cabelludo. Hipócrates usó por primera vez la palabra griega 'alopekia' (sarna del zorro), el término moderno "alopecia areata" fue usado por primera vez por Sauvages en su Nosologica Medica, publicado en 1760 en Lyons, Francia.

Curiosamente, la AA afecta preferentemente a los folículos pilosos pigmentados en la fase anágena (crecimiento) del ciclo del cabello, y cuando el cabello vuelve a crecer en parches de AA, con frecuencia vuelve a ser blanco o incoloro. El fenómeno del blanqueamiento repentino del cabello'se atribuye, por lo tanto, a AA con un inicio agudo, y se ha documentado a lo largo de la historia que ha afectado a varios individuos relevantes en momentos de profunda pena, estrés o miedo (2). Los ejemplos incluyen a Shahjahan, quien tras la muerte de su esposa en 1631 experimentó un agudo blanqueamiento de su cabello, y en su pena construyó el Taj Mahal en su honor. Sir Thomas More, autor de Utopia, quien en vísperas de su ejecución en 1535 se dice que se convirtió en 'blanco en barba y cabello'. Se cree que el repentino blanqueamiento del cabello es el resultado de un ataque agudo en los folículos pilosos pigmentados, dejando ilesos los cabellos blancos.

Varios aspectos clínicos de AA siguen sin explicación, pero pueden contener pistas importantes para comprender la patogénesis. La AA ataca los pelos solo alrededor de la base de los folículos pilosos, que están rodeados por densos grupos de linfocitos, lo que da como resultado la patognomónica apariencia de 'enjambre de abejas' en histología. Basándose en estas observaciones, se postula que se emite una señal o señales en el folículo piloso anágeno pigmentado e invoca una respuesta inmune aguda o crónica contra el extremo inferior del folículo piloso, lo que lleva a la perturbación del ciclo del cabello, caída aguda del cabello, anomalías del tallo capilar y rotura capilar. A pesar de estas perturbaciones radicales en el folículo piloso, no existe una destrucción permanente de órganos y la posibilidad de que el cabello vuelva a crecer permanece si se restablece el privilegio inmunológico.

A lo largo de la historia, en ocasiones se ha considerado que la AA era una enfermedad neurológica provocada por el estrés o la ansiedad, o como un resultado de un agente infeccioso, o incluso por una disfunción hormonal. El concepto de un mecanismo autoinmune determinado genéticamente como la base de AA surgió durante el siglo XX a partir de múltiples líneas de evidencia. Los folículos pilosos de AA presentan un infiltrado inmune con células Th, Tc y NK activadas (3, 4) y hay un cambio de una respuesta de citoquinas supresoras (Th2) a autoinmune (Th1). El modelo humanizado de Aa, que implica la transferencia del cuero cabelludo del paciente con AA a ratones SCID inmunodeficientes, ilustra la naturaleza autoinmune de la enfermedad, ya que la transferencia de linfocitos T de donante provoca la pérdida de cabello solo cuando se cocultiva con folículo piloso u homogenado de melanoma humano (5, 6). Los linfocitos T reguladores que sirven para mantener la tolerancia inmune se observan en números más bajos en el tejido con AA (7), y la transferencia de estas células a ratones C3H/HeJ conduce a resistencia a AA (8). Aunque la AA se ha considerado durante mucho tiempo exclusivamente como una enfermedad mediada por linfocitos T, en los últimos años se ha postulado un mecanismo adicional de la enfermedad. El folículo piloso se define como uno de los pocos sitios privilegiados inmunes en el cuerpo, caracterizado por la presencia de barreras de matriz extracelular para impedir el tráfico de células inmunitarias, falta de células presentadoras de antígenos, e inhibición de la actividad de las células NK a través de la producción local de factores inmunosupresores y niveles reducidos de expresión de clase I de MHC (9). Por lo tanto, la noción de un 'colapso de privilegios inmunitarios' también se ha invocado como parte del mecanismo por el que puede surgir la AA. El apoyo para una base genética para AA proviene de múltiples líneas de evidencia, incluida la heredabilidad observada en parientes de primer grado (10, 11), estudios de gemelos (12) y, más recientemente, de los resultados de los estudios de los inventores con respecto a vínculos familiares (13).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tratamiento de Trastornos de Pérdida Capilar

La presente solicitud desvela el descubrimiento de que un agente terapéutico conocido, por ejemplo, un inhibidor de una proteína tirosina quinasa (PTK) implicada en la señalización de citoquinas, tal como Jak 3, se puede usar para el tratamiento de trastornos de pérdida capilar. Los ejemplos no limitantes de trastornos de pérdida capilar incluyen: alopecia androgénica, Alopecia areata, efluvio telógeno, alopecia areata, alopecia total, y alopecia universal. Por ejemplo, la alopecia androgénica (también denominada alopecia anrogenética en mujeres) es una forma común de pérdida capilar tanto en hombres como en mujeres que da como resultado la pérdida del pelo y la caída del cuero cabelludo. Por ejemplo, la alopecia areata (AA), generalmente comienza con parches de pérdida capilar del cuello cabelludo u otras partes del organismo. Si la AA no se trata o no responde a los tratamientos, entonces puede aparecer la pérdida de cabello en la zona afectada (por ejemplo, alopecia total). La alopecia total (AT) así como la alopecia universal (AU) son formas graves de alopecia areata (AA). La AU es la forma más grave de alopecia areata. Véase, por ejemplo, Cho et al., (2012) J Korean Med Sci, 27: 799-802.

La solicitud desvela un método para tratar un trastorno de pérdida capilar en un sujeto mamífero con necesidad del mismo, comprendiendo el método la administración al sujeto un inhibidor de una proteína tirosina quinasa (PTK) implicada en la señalización de citoquinas. El inhibidor de Jak3 puede ser un anticuerpo que se une de forma específica a una proteína Jak3 o un fragmento de la misma; un ARN no codificante o ADN no codificante que

disminuye la expresión del gen que codifica la proteína Jak3; un ARN no codificante o ADN no codificante que

disminuye la expresión de la proteína Jak3; un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3; una molécula pequeña; o una combinación de los mismos. El inhibidor puede ser un inhibidor de Jak3. El inhibidor puede ser tofacitinib (CP690550). La molécula pequeña puede ser Janex 1 (WHI-P131), PF-956980, WHI-P154, VX-509, inhibidor IV de JAK3, NSC114792, o R348. El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, efluvio telógeno, alopecia areata, tiña de la cabeza, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal.

La solicitud desvela un método para inducir el recinto capilar en un sujeto en la que el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una proteína tirosina quinasa (PTK) implicada en la señalización de citoquinas. El inhibidor de Jak3 puede ser un anticuerpo que se une de forma específica a una proteína Jak3 o un fragmento de la misma; un ARN no codificante o ADN no codificante que disminuye la expresión del gen que codifica la proteína Jak3; un ARN no codificante o ADN no codificante que disminuye la expresión de la proteína Jak3; un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3; una molécula pequeña; o una combinación

de los mismos. El inhibidor puede ser un inhibidor de Jak3. El inhibidor puede ser tofacitinib (CP690550). La

molécula pequeña puede ser Janex 1 (WHI-P131), PF-956980, WHI-P154, VX-509, inhibidor IV de JAK3, NSC114792, o R348. El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, efluvio telógeno, alopecia areata, tiña de la cabeza, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal.

La solicitud también desvela un método para tratar un trastorno de pérdida capilar en un sujeto mamífero con necesidad del mismo, comprendiendo el método la administración al sujeto un inhibidor de Jak3. El inhibidor puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se refiere a la SEQ ID NO: 1. El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, efluvio telógeno, alopecia areata, tiña de la cabeza, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal

La solicitud también desvela un método para inducir el recinto capilar en un sujeto en la que el método comprende la administración al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de Jak3, controlando de ese modo el crecimiento capilar en el sujeto. El inhibidor puede comprender un anticuerpo que se une de forma específica a una proteína que comprende la SEQ ID NO: 1. El sujeto puede estar afectado con un trastorno de pérdida capilar. El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, efluvio telógeno, alopecia areata, tiña de la cabeza, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal.

La presente solicitud desvela el descubrimiento de que un número de genes humanos se han identificado como una población base de genes implicados en la transición de fase telogénica a fase anagénica del ciclo capilar (por ejemplo, gen del Ciclo Capilar de Fase telogénica a fase anagénica (TAHC)). Se identificó que estos genes estaban regulados de forma positiva en la fase telogénica del ciclo capilar, y se pueden correlacionar con la presencia de aun trastorno de pérdida capilar en un sujeto. Estos genes, ahora que se han identificado, se pueden usar para una diversidad de métodos útiles; por ejemplo, se pueden usar para determinar si un sujeto tiene susceptibilidad hacia un trastorno de pérdida capilar, tal como Alopecia Areata (AA). Los genes identificados como parte de esta población base o grupo de título capilar de transición de fase telogénica a fase anagénica (es decir, "genes de TAHC") incluyen CSF1R (ID del Gen con N.° de Registro 1436), FCER2 (ID del Gen con N.° de Registro 2208), IFNGR1 (ID del Gen con N.° de Registro 3459), IL20 (ID del Gen con N.° de Registro 50604), OAS1 (ID del Gen con N.° de Registro 4938), PTPRC (ID del Gen con N.° de Registro 5788), CEBPD (ID del Gen con N.° de Registro 1052), CRP (ID del Gen con N.° de Registro 1401), IL2RA (ID del Gen con N.° de Registro 3559), IL4 (ID del Gen con N.° de Registro 3565), IL6ST (ID del Gen con N.° de Registro 3572), INSR (ID del Gen con N.° de Registro 3643), JAK3 (ID del Gen con N.° de Registro 3718), NR3C1 (ID del Gen con N.° de Registro 2908), OSM (ID del Gen con N.° de Registro 5008), PTPN11 (ID del Gen con N.° de Registro 5781), SOCS3 (ID del Gen con N.° de Registro 9021), STAT5A (ID del Gen con N.° de Registro 6776), STAT5B (ID del Gen con N.° de Registro 6777), CCND1 (ID del Gen con N.° de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Registro 595), F2 (ID del Gen con N.° de Registro 2147), LRG1 (ID del Gen con N.° de Registro 116844), PRLR (ID del Gen con N.° de Registro 5618), MPL (ID del Gen con N.° de Registro 4352), y JUNB (ID del Gen con N.° de Registro 3726).

La solicitud desvela un método para detectar la presencia de o una predisposición a un trastorno de pérdida capilar en un sujeto humano en la que el método comprende obtener una muestra biológica de un sujeto humano; y detectar si existe una alteración en el nivel de expresión de un ARNm o una proteína codificada por un gen de TAHC en el sujeto en comparación con el nivel de expresión en un sujeto no afectado con un trastorno de pérdida capilar La detección puede comprender la determinación de si la expresión del ARNm o expresión de proteínas del gen de TAHC aumenta o disminuye en comparación con la expresión en una muestra normal. La detección puede comprender la determinación en la muestra de si la expresión de al menos 2 proteínas de TAHC, al menos 3 proteínas de TAHC, al menos 4 proteínas de TAHC, al menos 5 proteínas de TAHC, al menos 6 proteínas de TAHC, al menos 6 proteínas de TAHC, al menos 7 proteínas de TAHC, o al menos 8 proteínas de TAHC aumenta o disminuye en comparación con la expresión en una muestra normal. La detección puede comprender la determinación en la muestra de si la expresión de al menos 2 ARNm de TAHC, al menos 3 ARNm de TAHC, al menos 4 ARNm de TAHC, al menos 5 ARNm de TAHC, al menos 6 ARNm de TAHC, al menos 6 ARNm de TAHC, al menos 7 ARNm de TAHC, o al menos 8 ARNm de TAHC aumenta o disminuye en comparación con la expresión en una muestra normal. En una realización, un aumento en la expresión de al menos 2 genes de TAHC, al menos 3 genes de TAHC, al menos 4 genes de TAHC, al menos 5 genes de TAHC, al menos 6 genes de TAHC, al menos 7 genes de TAHC, o al menos 8 genes de TAHC indica una predisposición a o la presencia de un trastorno de pérdida capilar en el sujeto. En otra realización, una disminución en la expresión de al menos 2 genes de TAHC, al menos 3 genes de TAHC, al menos 4 genes de TAHC, al menos 5 genes de TAHC, al menos 6 genes de TAHC, al menos 7 genes de TAHC, o al menos 8 genes de TAHC indica una predisposición a o la presencia de un trastorno de pérdida capilar en el sujeto. En una realización, la expresión del ARNm o nivel de expresión de proteína en el sujeto aumenta aproximadamente 5 veces, aumenta aproximadamente 10 veces, aumenta aproximadamente 15 veces, aumenta aproximadamente 20 veces, aumenta aproximadamente 25 veces, aumenta aproximadamente 30 veces,

aumenta aproximadamente 35 veces, aumenta aproximadamente 40 veces, aumenta aproximadamente 45 veces,

aumenta aproximadamente 50 veces, aumenta aproximadamente 55 veces, aumenta aproximadamente 60 veces,

aumenta aproximadamente 65 veces, aumenta aproximadamente 70 veces, aumenta aproximadamente 75 veces,

aumenta aproximadamente 80 veces, aumenta aproximadamente 85 veces, aumenta aproximadamente 90 veces,

aumenta aproximadamente 95 veces, o aumenta 100 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En algunas realizaciones, la expresión del ARNm o nivel de expresión de proteína en el sujeto aumenta al menos aproximadamente 100 veces, aumenta al menos aproximadamente 200 veces, aumenta al menos aproximadamente 300 veces, aumenta al menos aproximadamente 400 veces, o aumenta al menos aproximadamente 500 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En otras realizaciones, la expresión del ARNm o nivel de expresión de proteína del gen de TAHC en el sujeto aumenta de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 70 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En otras realizaciones, el nivel de expresión de ARNm o proteína en el gen de TAHC en el sujeto aumenta de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 90 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En una realización, la expresión del ARNm o nivel de expresión de proteína en el sujeto disminuye aproximadamente 5 veces, disminuye aproximadamente 10 veces, disminuye aproximadamente 15 veces, disminuye aproximadamente 20 veces, disminuye aproximadamente 25 veces, disminuye aproximadamente 30 veces, disminuye aproximadamente 35 veces, disminuye aproximadamente 40 veces, disminuye aproximadamente 45 veces, disminuye aproximadamente 50 veces, disminuye aproximadamente 55 veces, disminuye aproximadamente 60 veces, disminuye aproximadamente 65 veces, disminuye aproximadamente 70 veces, disminuye aproximadamente 75 veces, disminuye aproximadamente 80 veces, disminuye aproximadamente 85 veces, disminuye aproximadamente 90 veces, disminuye aproximadamente 95 veces, o disminuye 100 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En algunas realizaciones, la expresión del ARNm o nivel de expresión de proteína en el sujeto disminuye al menos aproximadamente 100 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de ARNm o proteína en el gen de TAHC en el sujeto disminuye de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 70 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. Además, en otras realizaciones, el nivel de expresión de ARNm o proteína en el gen de TAHC en el sujeto disminuye de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 90 veces, en comparación con lo que sucede en la muestra normal. En otras realizaciones, la detección comprende secuenciación genética, hibridación selectiva, amplificación selectiva, análisis de expresión genética, o una combinación de los mismos. En otra realización, el trastorno de pérdida capilar comprende alopecia androgénica, alopecia areata, efluvio telógeno, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal. En una realización, el gen de TAHC es CSF1R, FCER2, IFNGR1, IL20, OAS1, PTPRC, CEBPD, CRP, IL2RA, IL4, IL6ST, INSR, JAK3, NR3C1, OSM, PTPN11, SOCS3, STAT5A, STAT5B, CCND1, F2, LRG1, PRLR, MPL, o JUNB. En otra realización, el gen de TAHC es CRP.

Diagnóstico

La solicitud desvela métodos para diagnosticar si el sujeto es susceptible o no o tiene un trastorno de pérdida capilar. Los métodos de diagnóstico se pueden basar en la monitorización de la expresión de genes de TAHC, tales como CSF1R, FCER2, IFNGR1, IL20, OAS1, PTPRC, CEBPD, CRP, IL2RA, IL4, IL6ST, INSR, JAK3, NR3C1, OSM,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

PTPN11, SOCS3, STAT5A, STAT5B, CCND1, F2, LRG1, PRLR, MPL, o JUNB, en un sujeto, por ejemplo, se aumentan o disminuyen en comparación con una muestra normal. Como se usa en el presente documento, el término "diagnóstico" incluye la detección, formación de tipos, monitorización, dosificación, comparación, en diversos estadios, incluyendo estadios iniciales, pre-sintomático, y estadios terminales, en adultos y niños. El diagnóstico puede incluir la evaluación de una predisposición o riesgo de desarrollo, el pronóstico, o la caracterización de un sujeto para definir el tratamiento más apropiado (farmacogenética).

La solicitud desvela métodos de diagnóstico para determinar si un individuo presenta riesgo de desarrollar un trastorno de pérdida capilar, o padece un trastorno de pérdida capilar, en la que la enfermedad resultado de una alteración en la expresión de genes de TAHC. Se desvela un método para detectar la presencia de o una predisposición a un trastorno de pérdida capilar en un sujeto. El sujeto puede ser un ser humano o un niño del mismo. El método puede comprender la detección, en una muestra del sujeto, de si existe o no alteración en el nivel de expresión de una proteína codificada por un gen de TAHC en el sujeto en comparación con el nivel de expresión en un sujeto no afectado con un trastorno de pérdida capilar. En una realización, la detección puede comprender la determinación de si la expresión del ARNm del TAHC aumenta o disminuye. Por ejemplo, en un ensayo de micromatriz, se puede buscar la expresión diferencial de un gen de TAHC. Cualquier expresión de un gen de TAHC que es 2X más elevada o 2X más baja que la expresión de TAHC observada para un sujeto no afectado con un trastorno de pérdida capilar (como se indica mediante una lectura de fluorescencia) no se considera normal, y que merece una investigación adicional. La detección de miembro de comprender la determinación, en la muestra, de si la expresión de al menos 2 proteínas de TAHC, al menos 3 proteínas de TAHC, al menos 4 proteínas de TAHC, al menos 5 proteínas de TAHC, al menos 6 proteínas de TAHC, al menos 6 proteínas de TAHC, al menos 7 proteínas de TAHC, o al menos 8 proteínas de TAHC aumenta o disminuye. La presencia de una alteración de ese tipo es indicativa de la presencia o predisposición a un trastorno de pérdida capilar.

La presencia de una alteración en un gen de TAHC en la muestra se detecta a través de la formación de genotipos de una muestra, por ejemplo, mediante secuenciación genética, hibridación selectiva, amplificación, análisis de expresión genética, o una combinación de los mismos. En una realización, la muestra puede comprender sangre, suero, esputo, secreciones lacrimales, semen, secreciones vaginales, tejido fetal, tejido cutáneo, tejido epitelial, tejido muscular, liquido amniótico, o una combinación de los mismos.

La solicitud desvela un kit de diagnóstico usado para determinar si una muestra de un sujeto presenta un aumento de la expresión de al menos 2 o más genes de TAHC. El kit puede comprender un cebador de ácido nucleico que se hibridar de forma específica uno o más genes de TAHC. La solicitud también desvela un kit de diagnóstico usado para determinar si una muestra de un sujeto presenta una predisposición a un trastorno de pérdida capilar en un sujeto humano. El gen de TAHC puede ser CSF1R, FCER2, IFNGR1, IL20, OAS1, PTPRC, CEBPD, CRP, IL2RA, IL4, IL6ST, INSR, JAK3, NR3C1, OSM, PTPN11, SOCS3, STAT5A, STAT5B, CCND1, F2, LRG1, PRLR, MPL, o JUNB. El trastorno de pérdida capilar puede comprender alopecia androgénica, alopecia areata, efluvio telógeno, alopecia total, hipotricosis, hipotricosis simple hereditaria, o alopecia universal.

Métodos de Manipulación de ADN y Aminoácidos y Purificación de los Mismos

La práctica de aspectos de la presente invención puede usar, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia en la materia. En la bibliografía se explican totalmente técnicas de ese tipo. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a Ed., ed. de Sambrook (2001), Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning. Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., documento de Patente de Estados Unidos N.°: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.), de forma específica, Methods In Enzvmology. Vols. 154 y 155 (Wu et al., eds.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Caner y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology. Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Alguien con experiencia en la materia puede obtener una proteína en la técnica de varias maneras, que incluyen el aislamiento de la proteína mediante medios bioquímicos o expresión de una secuencia de nucleótidos que codifican la proteína de interés mediante métodos de ingeniería genética.

Una proteína está codificada por un ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, ADN genómico, ADN complementario (ADNc), ADN sintético, así como cualquier forma de ARN correspondiente). Por ejemplo, se puede codificar con un ácido nucleico recombinante de un gen. Las proteínas de la invención se pueden obtener a partir de diversas fuentes y se pueden producir de acuerdo con diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína se puede obtener mediante identificación sistemática de bibliotecas de ADN, o mediante

amplificación a partir de una fuente natural. Una proteína puede ser un fragmento o porción de la misma. Los ácidos nucleicos de codificar una proteína se pueden producir mediante tecnología de AdN recombinante y los ácidos nucleicos recombinantes de ese tipo se pueden preparar mediante técnicas convencionales, que incluyen síntesis química, ingeniería genética, técnicas enzimáticas, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, una proteína Jak 5 3 es el polipéptido codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ

ID NO: 2. Un ejemplo de un polipéptido de Jak 3 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1.

La secuencia de polipéptidos de Jak 3 humana se representa en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos de 10 Jak 3 humana se muestra en la SEQ ID NO: 2. La información de la secuencia relacionada con Jak 3 es accesible en bases de datos públicas con los números de Registro en GenBank NP_000206 (para proteína) y NM 000215 (para ácido nucleico). JAK3 es un asociado de señalización cadena debajo de la cadena gamma común del receptor IL-2, que está compartida con los receptores IL-2, -4, -7, -9, -15, y - 21.

15 La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre humana que corresponde a Jak3 (restos 1 - 1124):

1 MAPPSEETPL IPQRSCSLLS TEAGALHVLL PARGPGPPQR LSFSFGDHLA EDLCVQAAKA

61 SGILPVYHSL FALATEDLSC WFPPSHIFSV EDASTQVLLY RIRFYFPNWF GLEKCHRFGL

121 RKDLASAILD LPVLEHLFAQ HRSDLVSGRL PVGLSLKEQG ECLSLAVLDL ARMAREQAQR

181 PGELLKTVSY KACLPPSLRD LIQGLSFVTR RRIRRTVRRA LRRVAACQAD RHSLMAKYIM

241 DLERLDPAGA AETFHVGLPG ALGGHDGLGL LRVAGDGGIA WTQGEQEVLQ PFCDFPEIVD

301 ISIKQAPRVG PAGEHRLVTV TRTDNQILEA EFPGLPEALS FVALVDGYFR LTTDSQHFFC

361 KEVAPPRLLE EVAEQCHGPI TLDFAINKLK TGGSRPGSYV LRRSPQDFDS FLLTVCVQNP

421 LGPDYKGCLI RRSPTGTFLL VGLSRPHSSL RELLATCWDG GLHVDGVAVT LTSCCIPRPK

481 EKSNLIWQR GHSPPTSSLV QPQSQYQLSQ MTFHKIPADS LEWHENLGHG SFTKIYRGCR

541 HEWDGEARK TEVLLKVMDA KHKNCMESFL EAASLMSQVS YRHLVLLHGV CMAGDSTMVQ

601 EFVHLGAIDM YLRKRGHLVP ASWKLQWKQ LAYALNYLED KGLPHGNVSA RKVLLAREGA

661 DGSPPFIKLS DPGVSPAVLS LEMLTDRIPW VAPECLREAQ TLSLEADKWG FGATVWEVFS

721 GVTMPISALD PAKKLQFYED RQQLPAPKWT ELALLIQQCM AYEPVQRPSF RAVIRDLNSL

781 ISSDYELLSD PTPGALAPRD GLWNGAQLYA CQDPTIFEER HLKYISQLGK GNFGSVELCR

841 YDPLGDNTGA LVAVKQLQHS GPDQQRDFQR EIQILKALHS DFIVKYRGVS YGPGRQSLRL

901 VMEYLPSGCL RDFLQRHRAR LDASRLLLYS SQICKGMEYL GSRRCVHRDL AARNILVESE

961 AHVKIADFGL AKLLPLDKDY YWREPGQSP IFWYAPESLS DNIFSRQSDV WSFGWLYEL

1021 FTYCDKSCSP SAEFLRMMGC ERDVPALCRL LELLEEGQRL PAPPACPAEV HELMKLCWAP

1081 SPQDRPSFSA LGPQLDMLWS GSRGCETHAF TAHPEGKHHS LSFS

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre humana que corresponde a Jak3 (nucleótidos 120 5449), en la que la parte "ATG" subrayada y en letra negrita representa el comienzo del marco de lectura abierto:

1 cacacaggaa ggagccgagt gggactttcc tctcgctgcc tcccggctct gcccgccctt

61 cgaaagtcca gggtccctgc ccgctaggca agttgcactc atggcacctc caagtgaaga

121 gacgcccctg atccctcagc gttcatgcag cctcttgtcc acggaggctg gtgccctgca

181 tgtgctgctg cccgctcggg gccccgggcc cccccagcgc ctatctttct cctttgggga

241 ccacttggct gaggacctgt gcgtgcaggc tgccaaggcc agcggcatcc tgcctgtgta

301 ccactccctc tttgctctgg ccacggagga cctgtcctgc tggttccccc cgagccacat

361 cttctccgtg gaggatgcca gcacccaagt cctgctgtac aggattcgct tttacttccc

421 caattggttt gggctggaga agtgccaccg cttcgggcta cgcaaggatt tggccagtgc

481 tatccttgac ctgccagtcc tggagcacct ctttgcccag caccgcagtg acctggtgag

541 tgggcgcctc cccgtgggcc tcagtctcaa ggagcagggt gagtgtctca gcctggccgt

601 gttggacctg gcccggatgg cgcgagagca ggcccagcgg ccgggagagc tgctgaagac

661 tgtcagctac aaggcctgcc tacccccaag cctgcgcgac ctgatccagg gcctgagctt

721 cgtgacgcgg aggcgtattc ggaggacggt gcgcagagcc ctgcgccgcg tggccgcctg

781 ccaggcagac cggcactcgc tcatggccaa gtacatcatg gacctggagc ggctggatcc

841 agccggggcc gccgagacct tccacgtggg cctccctggg gcccttggtg gccacgacgg

901 gctggggctg ctccgcgtgg ctggtgacgg cggcatcgcc tggacccagg gagaacagga

961 ggtcctccag cccttctgcg actttccaga aatcgtagac attagcatca agcaggcccc

1021 gcgcgttggc ccggccggag agcaccgcct ggtcactgtt accaggacag acaaccagat

1081 tttagaggcc gagttcccag ggctgcccga ggctctgtcg ttcgtggcgc tcgtggacgg

1141 ctacttccgg ctgaccacgg actcccagca cttcttctgc aaggaggtgg caccgccgag

1201 gctgctggag gaagtggccg agcagtgcca cggccccatc actctggact ttgccatcaa

1261 caagctcaag actgggggct cacgtcctgg ctcctatgtt ctccgccgca gcccccagga

1321 ctttgacagc ttcctcctca ctgtctgtgt ccagaacccc cttggtcctg attataaggg

1381 ctgcctcatc cggcgcagcc ccacaggaac cttccttctg gttggcctca gccgacccca

1441 cagcagtctt cgagagctcc tggcaacctg ctgggatggg gggctgcacg tagatggggt

1501

1561

1621

1681

1741

1801

1861

1921

1981

2041

2101

2161

2221

2281

2341

2401

2461

2521

2581

2641

2701

2761

2821

2881

2941

3001

3061

3121

3181

3241

3301

3361

3421

3481

3541

3601

3661

3721

3781

3841

3901

3961

4021

4081

4141

4201

4261

4321

4381

4441

4501

4561

4621

4681

4741

4801

4861

4921

4981

5041

5101

5161

5221

5281

5341

5401

ggcagtgacc

ggtccagaga

gctgagtcag

gggccatggg

ggcccgaaag

gtcattcctg

ccacggcgtg

catagacatg

ggtcaaacag

tgtctctgcc

caagctgagt

gatcccctgg

caagtggggc

tgccctggat

caagtggaca

gccctccttc

cctctcagac

gctctatgcc

gctgggcaag

tacaggtgcc

ctttcagcgg

tggtgtcagc

cggctgcttg

tctctattcc

ccgcgacctg

cttcggccta

ccagagcccc

gtcagacgtc

ctgcagcccc

ctgccgcctc

tgctgaggtt

attcagcgcc

tcatgccttc

gcccgcagac

gcccctctct

cattgcattt

aaggttcaag

gcaaggaacc

gtttcctttt

agcctcgctc

tgcttcccag

gtgcaccacc

tggccaggct

tgttggaata

attattttta

acagtgatcc

ttcctgtctt

acggagtctc

gctccgcctc

aggcgcccgc

ttgttagcca

agtgctggga

atctgacttc

ctgtggctgg

ggcaggaaag

ttttcccacc

gacaccaaac

agggaacagc

ggagcctaca

tgggtctcag

aactttctga

ctgcaaagct

ccagctacca

cttccctcca

cctgacctca

atgtttgttg

ctcacttcct

ggtcacagcc

atgacatttc

tccttcacca

acagaggtgc

gaagcagcga

tgcatggctg

tatctgcgaa

ctggcctacg

cggaaggtgc

gaccctgggg

gtggcccccg

ttcggcgcca

cctgctaaga

gagctggccc

cgagccgtca

cccacacctg

tgccaagacc

ggcaactttg

ctggtggccg

gagattcaga

tatggcccgg

cgcgacttcc

tcgcagatct

gccgcccgaa

gctaagctgc

attttctggt

tggagcttcg

tcggccgagt

ttggaactgc

cacgagctca

ctgggccccc

actgctcacc

ctctggatta

gggcctcaga

gggggggctc

acagatgggc

aaatttaaga

ctgtctctct

tgttacccag

gttcaagcga

acacccggct

gatctcgaac

ataggcatga

agagacagga

tcctgcctta

atttccaatg

gctctgtcgc

ctgggttcac

caccacaccc

ggatggtttc

ttacaggcat

tgctccccga

gactctgcct

gctggggtcc

tgtccaatgg

ctggcaggaa

atgccaagcg

gttttgcccc

ttctgtcccc

ctggtgagag

tttctgccac

catccttgca

gccccactct

gggttccttg

actgaataaa

gctgtatccc

cacccacatc

acaagatccc

agatttaccg

tgctgaaggt

gcttgatgag

gagacagcac

aacgtggcca

ccctcaacta

tcctggctcg

tcagccccgc

agtgtctccg

cggtctggga

aactccaatt

tgctgattca

ttcgtgacct

gtgccctggc

ccacgatctt

gcagcgtgga

tgaaacagct

tcctcaaagc

gccgccagag

tgcagcggca

gcaagggcat

acatcctcgt

tgccgcttga

atgcccccga

gggtcgtcct

tcctgcggat

tggaggaggg

tgaagctgtg

agctggacat

cagagggcaa

ggtctctgtt

ggccttatga

ccgtggcctg

atatgtgtca

ctctcgcatc

ctttttattt

ggtggagtgc

ttctcctgcc

aatttttttt

tcctaacctc

gccactgcac

tcttgctacg

tcctcctaaa

gggacattca

ccaggctgga

accattctct

ggctaatttt

catctcctga

gagccactgc

tctctgtttc

tttaggggag

cagtccaccc

gaccctttct

cttttcacgc

tgagaaggct

ttccatgcag

tgcaaaatgg

ggattctcat

ttttgcctcc

gccttccctc

ggccctgggg

ggggctgggc

ggaattcagt

cagacccaaa atccttggtt tgctgacagc gggctgtcgc catggatgcc ccaagtgtcg catggtgcag cctggtgcca tctggaggac ggagggggct tgtgttaagc ggaggcgcag agtgtttagt ttatgaggac acagtgcatg caatagcctc acctcgtgat cgaggagaga gctgtgccgc gcagcacagc actgcacagt cctgcggctg ccgcgcgcgc ggagtacctg ggagagcgag caaagactac atccctctcg gtacgagctc gatgggatgt ccagaggctg ctgggcccct gctgtggagc acaccactcc gactggctgt gggtcctcta tagaatagcc gtggggctct ttcccaaccc tttttatttt agtggtgcga tcagcctccc atttttaata aagtgatcct ccaggctttt ttgcccaggc tagctgggac tgtagctttt gtacagtggc cgcctcagcc ttgtattttt cctcgtgatc gcccggccct tctggaggaa cccgtgtatc taatggtatc gtcctcaccc aatcaaggga cagagtaagg tgtgacagtg tcagagctta gcaggttaag ttggaaaact atataccccc ctggggaagt tgaggcctca ggaaaaaaaa aaaaaaaaa

gaaaagtcca

cagccccaat

ctggagtggc

catgaggtgg

aagcacaaga

taccggcatc

gaatttgtac

gccagctgga

aaaggcctgc

gatgggagcc

ctggagatgc

acacttagct

ggcgtcacca

cggcagcagc

gcctatgagc

atctcttcag

gggctgtgga

cacctcaagt

tatgacccgc

gggccagacc

gatttcattg

gtcatggagt

ctcgatgcca

ggctcccgcc

gcacacgtca

tacgtggtcc

gacaacatct

ttcacctact

gagcgggatg

ccggcgcctc

agcccacagg

ggaagccggg

ctgtcctttt

gtgaccttag

cttcaggaac

tgtggccttt

ctgagtcctg

cttaagccct

tatttttatt

tctcggctca

gagtagctgg

gagatgaggt

cccacctcag

ttttttttaa

tggtcttgaa

tacagcacct

tttttttttt

gcaatctagg

tcccaagtag

agtagagacg

tgcccgtctc

catgtagctt

gccaaggaca

tctttgggat

tgagtgtcct

tacaaggggc

aggaaaggca

aggttaagag

ggcaagttcc

ccccttggct

cttctgctgc

cttatccatc

acctgatcgt

cccaatacca

atgagaacct

tggatgggga

actgcatgga

tcgtgctgct

acctgggggc

agctgcaggt

cccatggcaa

cgcccttcat

tcaccgacag

tggaagctga

tgcccatcag

tgccggcccc

cggtccagag

actatgagct

atggtgccca

acatctcaca

taggcgacaa

agcagaggga

tcaagtatcg

acctgcccag

gccgcctcct

gctgcgtgca

agatcgctga

gcgagccagg

tctctcgcca

gcgacaaaag

tccccgccct

ctgcctgccc

accggccatc

ggtgtgagac

catagctcct

gcccggagct

acccccatga

gcaatttgtt

gcccaaagaa

ggccccctga

tttgagacag

gtgcaacctc

gattacaggt

ttcaccatga

cctcccaaag

atttattatt

ctcctgggct

agttttgagt

tttttttgag

ctcactgcaa

ctgggactac

gggtttcacc

ggcctcccaa

taaatgtatg

agagcagttg

cctgaaaggg

agggcttcag

acaaagggat

ttcctggcag

cccaagtatt

tttccctctc

gtgcagggtc

tcctcctcac

tctcaaaact

actactactg tagccctgtc gtctgtgtcc agctgtctcc gtacagaggg ggctctggaa

Las variantes de proteína pueden incluir modificaciones de secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las 5 modificaciones en la secuencia de aminoácidos entran en una o más de tres clases: variantes de sustitución, inserción o deleción. Las inserciones pueden incluir fusiones amino y/o carboxilo terminales así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácido individuales o múltiples. Habitualmente las inserciones serán inserciones más pequeñas que las de las fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro restos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las deleciones se caracterizan por la retirada de uno o más restos de aminoácido de la secuencia de la proteína. Estas variantes se preparan habitualmente mediante mutagénesis específica del sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo de ese modo ADN que codifica la variante, y a partir de ese momento expresan del ADN en cultivo celular recombinante.

Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden un gen, tal como un gen de Jak3, que codifica un polipéptido se pueden sintetizar, total o parcialmente, usando métodos químicos conocidos en la técnica. Como alternativa, un polipéptido, tal como Jak3, se puede producir usando métodos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida. La síntesis de proteínas se puede realizar usando técnicas manuales o de forma automatizada. La síntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de polipéptidos de Jak3 se pueden sintetizar por separado y se pueden combinar usando métodos químicos para producir una molécula de longitud completa.

Como se usa en el presente documento, una "molécula de Jak3" puede ser un ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta actividad de Jak3, o un polipéptido o peptidomimético que presenta actividad de Jak3. Por ejemplo, una molécula de Jak3 puede incluir la proteína Jak3 humana (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1), o una variante de la misma, tal como un fragmento de la misma, que presenta actividad de Jak3. La actividad de Jak3 puede incluir sucesos de señalización por medio de receptores de citoquina de tipo I (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7, lL-9, IL-15, IL-21) que usan la cadena gamma (yc) normal. Por ejemplo, la actividad de Jak3 puede ser una señal transducida como respuesta a su activación mediante fosforilación de tirosina mediante receptores de interleuquina.

El ácido nucleico puede ser cualquier tipo de ácido nucleico, incluyendo ADN genómico, ADN complementario (ADNc), ADN sintético o semisintético, así como cualquier forma de ARN correspondiente. Por ejemplo, una molécula de Jak3 puede comprender un ácido nucleico recombinante que codifica proteína Jak3 humana. En una realización, una molécula de Jak3 puede comprender un ácido nucleico de origen no natural creado artificialmente (tal como mediante secuencias de ensamblaje, corte, ligamiento o amplificación). Una molécula de Jak3 puede ser bicatenaria. Una molécula de Jak3 puede ser monocatenaria. Las moléculas de Jak3 de la invención se pueden obtener a partir de diversas fuentes y se pueden producir de acuerdo con diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico que es una molécula de Jak3 se puede obtener mediante identificación sistemática de bibliotecas de ADN, o mediante amplificación a partir de una fuente natural. Las moléculas de Jak3 se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante y los ácidos nucleicos recombinantes de ese tipo se pueden preparar mediante técnicas convencionales, incluyendo síntesis química, ingeniería genética, técnicas esquemáticas, o una combinación de las mismas. Los ejemplos no limitantes de una molécula de Jak3 que es un ácido nucleico, es el ácido nucleico que comprende la sEq ID NO: 2. Otro ejemplo de una molécula de Jak3 es un fragmento de un ácido nucleico que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2, en la que el fragmento presenta la actividad de Jak3. Una molécula de Jak3 de la presente invención también incluye variantes de ácido nucleico humano que codifica la proteína Jak3, o variantes de las proteínas Jak3 humanas que presentan la actividad de Jak3. Una molécula de Jak3 también puede incluir un fragmento de la ácido nucleicos de Jak3 humano que codifica un polipéptido que presenta la actividad de Jak3. Una molécula de Jak3 puede incluir un fragmento de la proteína Jak3 que presenta la actividad de Jak3.

Una molécula de Jak3 también puede incluir genes ortólogos de Jak3, que son genes conservados entre diferentes especies biológicas tales como seres humanos, perros, gatos, ratones, y ratas, que codifican proteínas (por ejemplo, homólogos (incluyendo variantes de corte y empalme), mutantes, y derivados) que tienen funciones biológicamente equivalentes como las de la proteína obtenida a partir del ser humano (tal como una proteína Jak3). Los ortólogos de Jak3 incluyen cualquier ortólogos de mamífero de Jak3 incluyendo el ortólogos en seres humanos y otros primates, mamíferos experimentales (tales como ratones, ratas, hámsters y cobayas), mamíferos de significancia comercial (tales como caballos, vacas, camellos, cerdos y ovejas), y también mamíferos de compañía (tales como animales domésticos, por ejemplo, conejos, hurones, perros, y gatos).

Las variantes de Jak 3 pueden comprender, por ejemplo, variantes de origen natural debidas a variaciones alélicas entre individuos (por ejemplo, polimorfismos), aleros mutados relacionados con la alopecia areata, o formas de corte y empalme alternativas. En una realización, una molécula de Jak3 es una variante de ácido nucleico del ácido nucleico que tiene la secuencia que se muestran en la SEQ ID NO: 2, en la que la variante tiene una identidad de

secuencia de nucleótidos con respecto a la SEQ ID NO: 2 de aproximadamente un 65 %, aproximadamente un

75 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un

92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un

96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 % con la SEQ ID NO: 2. En una realización, una molécula de Jak3 incluye cualquier parte de aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el fragmento puede comprender aproximadamente 15 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, o aproximadamente 30 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos incluyen todas las posibles longitudes de nucleótidos entre aproximadamente 8 100 nucleótidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 15 y 100, o entre aproximadamente 20 y 100.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La solicitud desvela adicionalmente ácidos nucleicos que son complementarios con un ácido nucleico que codifica una proteína Jak3. Los ácidos nucleicos complementarios de ese tipo pueden comprender secuencias de ácidos nucleicos, que se hibridan a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína Jak3 en condiciones de hibridación rigurosas. Los ejemplos no limitantes de condiciones de hibridación rigurosas incluyen temperaturas superiores a 30 °C, superiores a 35 °C, en exceso de 42 °C, y/o salinidad inferior a aproximadamente 50o mM, o inferior a 200 mM. El experto en la materia puede ajustar las condiciones de hibridación modificando la temperatura, salinidad y/o la concentración de otros reactivos tales como SDS o SSC.

Una molécula de Jak3 puede comprender una proteína o polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos de Jak3, tal como la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polipéptido se puede modificar, tal como mediante glicosilaciones y/o acetilaciones y/o reacción o acoplamiento químicos, y puede contener uno o varios aminoácidos no naturales o sintéticos. Un ejemplo de una molécula de Jak3 es el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ iD NO: 1. En otra realización, una molécula de Jak3 puede ser un fragmento de una proteína Jak3. Por ejemplo, la molécula de Jak3 puede incluir cualquier parte de aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. El fragmento puede comprender aproximadamente 10 aminoácidos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 60 aminoácidos, o aproximadamente 75 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos incluyen todas las posibles longitudes de aminoácido entre aproximadamente 8 y 100 aproximadamente aminoácidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 10 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 15 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 20 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 35 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 40 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 50 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 70 y 100 aminoácidos, entre aproximadamente 75 y 100 aminoácidos, o entre aproximadamente 80 y 100 aminoácidos.

La molécula de Jak3 puede incluir variantes de la proteína Jak3 humana (que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1). Tales variantes pueden incluir las que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 46 % a aproximadamente un 50 % con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 50,1 % a aproximadamente un 55 % con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 55,1 % a aproximadamente un 60 % con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de aproximadamente un 60,1 % a aproximadamente un 65% con la SEQ ID NO: 1, o que

tienen una identidad de aproximadamente un 65,1 % a aproximadamente un 70% con la SEQ ID NO: 1, o que

tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 70,1 % a aproximadamente un 75% con la SEQ ID

NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 75,1 % a aproximadamente un 80 % con la

SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 80,1 % a aproximadamente un 85 % con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 85,1 % a aproximadamente un 90% con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 90,1 % a aproximadamente un 95 % con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 95,1% a aproximadamente un 97% con la SEQ ID NO: 1, o que tienen una identidad de al menos de aproximadamente un 97,1 % a aproximadamente un 99 % con la SEQ ID NO: 1.

Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida se conocen bien, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser restos individuales, pero se pueden producir en varias ubicaciones diferentes a la vez. En una realización no limitante, las inserciones pueden ser del orden de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 restos de aminoácido, mientras que las deleciones pueden variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 restos. Las deleciones por inserciones se pueden preparar en pares adyacentes (por ejemplo, una deleción de aproximadamente 2 restos o inserción de aproximadamente 2 restos). Sustituciones, deleciones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas se puede combinar para llegar a una construcción final. Las mutaciones no pueden colocar la secuencia fuera del marco de lectura y no deberían crear regiones complementarias que hubieran producir una estructura de ARNm secundaria. Las variantes de sustitución son aquellas en las que al menos se ha eliminado un resto y se ha insertado un resto diferente en su lugar.

Los cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica se realizan seleccionando restos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lamina o conformación helicoidal, (b) carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que pueden producir los mayores cambios en las propiedades de las proteínas serán aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, se sustituye por (o con) un resto hidrófobo, por ejemplo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o con) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o por) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye por (o con) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina, en este caso, (e) aumentando el número de sitios para sulfatación y/o glicosilación.

En las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede haber variaciones menores. Las variaciones en la secuencia de aminoácidos se pueden producir cuando la secuencia mantiene una identidad aproximadamente un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, o aproximadamente un 99 % con respecto a la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, se pueden usar sustituciones de aminoácido conservativas. Las sustituciones conservativas son las que se producen dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales, en los que la capacidad de intercambio de restos tiene cadenas laterales similares.

Los aminoácidos genéticamente codificados generalmente se dividen en familias: (1) aminoácidos ácidos Son aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) aminoácidos polares sin carga son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina, y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático, tales como serina y treonina; (ii) un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida, tales como asparagina y glutamina; (iii) un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; (iv) un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas, tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; y (v) un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre, tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa útiles son: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina.

Por ejemplo, los expertos en la materia conocen la sustitución de un resto de aminoácido con otro que es biológica y/o químicamente similar como una sustitución conservativa. Por ejemplo, una sustitución conservativa podría ser sustituir un resto hidrófobo por otro, o un resto polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. La mutagénesis de sustitución

0 deleción se puede usar para insertar sitios para N-glicosilación (Asn-X-Thr/Ser) u O-glicosilación (Ser o Thr). También pueden ser deseables las deleciones de cisteína u otros restos lábiles. Las deleciones o sustituciones de sitios de proteólisis potential, por ejemplo, Arg, se consigue por ejemplo mediante deleción de uno de los restos básicos o sustituyendo uno por restos de glutaminilo o histidilo.

La molécula de Jak3 puede incluir un peptidomimético que presenta la actividad de Jak3. Un peptidomimético es una cadena similar a la de una proteína pequeña diseñada para imitar un péptido que puede surgir de la modificación de un péptido existente con el fin de proteger esa molécula de la degradación enzimática y aumentar su estabilidad, y/o alterar las propiedades de la molécula (por ejemplo, modificaciones que cambian la estabilidad por la actividad biológica de la molécula). Estas modificaciones implican cambios en el péptido que no se pueden producir de forma natural (tal como cadenas principales alteradas y la incorporación de aminoácidos naturales). A partir de péptidos existentes se pueden desarrollar compuestos similares a fármacos. Un peptidomimético puede ser un péptido, péptido parcial, o molécula no peptídica que imita la estructura de unión terciaria o actividad de un péptido nativo seleccionado o dominio funcional de proteína (por ejemplo, motivo de unión o sitio activo). Estos miméticos peptídicos incluyen péptidos recombinante o químicamente modificados.

Una molécula de Jak3 que comprende la SEQ ID NO: 1, variantes de la misma, o fragmentos de la misma, se puede modificar para producir miméticos peptídico mediante sustitución de una o más cadenas laterales de origen natural de los 20 aminoácidos genéticamente codificados (o D aminoácidos) con otras cadenas laterales. Esto se puede producir, por ejemplo, con grupos tales como alquilo, alquilo inferior, alquilo cíclico de 4-, 5-, 6-, a 7 miembros, amida, alquilo inferior amida, amida di(alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, carboxi y los derivados de éster Inferior de los mismos, y con heterociclos de 4, 5-, 6-, as 7 miembros. Por ejemplo, se pueden preparar análogos de prolina en los que el tamaño del anillo del resto de prolina cambia de 5 miembros a 4, 6, o 7 miembros. Los grupos cíclicos pueden ser saturados o insaturados, y si son insaturados, pueden ser aromáticos o no aromáticos. Los grupos heterocíclicos pueden contener uno o más heteroátomos de nitrógeno, oxígeno, y/o azufre. Los ejemplos de tales grupos incluyen los grupos furazanilo, ifurilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por ejemplo, morfolino), oxazolilo, piperazinil como (por ejemplo, 1 -piperazinilo), piperidilo (por ejemplo,

1 -piperidilo, piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo, 1 -pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por ejemplo, tiomorfolino), y triazolilo. Estos grupos heterocíclicos pueden ser sustituidos o sin sustituir. Cuando un grupo está sustituido con el sustituyente puede ser alquilo, alcoxi, halógeno, oxígeno, o fenilo sustituido o sin sustituir. Los peptidomiméticos también pueden tener restos de aminoácidos que se han modificado químicamente mediante por fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o retirada de otros restos. Por ejemplo, se pueden diseñar peptidomiméticos y se pueden dirigir a secuencias de aminoácidos codificados por una molécula de Jak3 que comprende la SEQ ID NO: 1.

Hay disponibilidad una la diversidad de técnicas para construir miméticos peptídicos con la actividad biológica deseada igual o similar a la del péptido nativo correspondiente, pero con más una actividad más favorable que la del péptido con respecto a solubilidad, estabilidad, y/o susceptibilidad a hidrólisis o proteólisis (véase, por ejemplo, Morgan y Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24, 243-252, 1989). Determinados compuestos peptidomiméticos se basan en la secuencia de aminoácidos de los péptidos de la invención. Los compuestos peptidomiméticos pueden ser

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

compuestos sintéticos que tienen una estructura tridimensional (es decir, un motivo peptídico) basándose en la estructura tridimensional de un péptido seleccionado. El motivo peptídico proporciona al compuesto peptidomimético la actividad biológica deseada, en el que la actividad y unión del compuesto mimético no se reduce esencialmente, y a menudo es la misma que o mayor que la actividad del péptido nativo en el que se modela el mimético. Los compuestos peptidomiméticos pueden tener características adicionales que potencian su aplicación terapéutica, tal como un aumento de la permeabilidad celular, mayor afinidad y/o avidez y semivida biológica prolongada. En la técnica hay una rápida disponibilidad de estrategias de diseño de peptidomiméticos (véase, por ejemplo, Ripka y Rich (1998) Curr. Op. Chem. Biol. 2: 441-452; Hruby et al., (1997) Curr. Op. Chem. Biol. 1: 114-119; Hruby y Balse, (2000) Curr. Med. Chem. 9: 945-970).

Transfección Celular

Un vector de expresión eucariota se puede usar para transfectar células con el fin de producir proteínas codificadas por secuencias de nucleótidos del vector. Las células de mamífero (tales como células aisladas a partir del bulbo capilar; por ejemplo células de la vaina dérmica y células de la papila dérmica) pueden contener un vector de expresión (por ejemplo, uno que contienen un gen que codifica una proteína o polipéptido de Jak3) mediante la introducción del vector de expresión en una célula hospedadora apropiada mediante métodos conocidos en la técnica.

Una cepa de célula hospedadora se puede elegir por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido expresado codificado por un gen, tal como un gen de Jak3, de la manera deseada. Las modificaciones del polipéptido de ese tipo incluyen acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma "prepro" del polipéptido también se puede usar para facilitar la inserción, plegamiento y/o unción correcta. En la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209) están disponibles diferentes células hospedadoras que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades posteriores a la traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), y se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña.

Un ácido nucleico exógeno se puede introducir en una célula mediante una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, tales como lipofección, microinyección, precipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediará con DEAE-dextrano, o electroporación. La electroporación se realiza a un voltaje y capacitan hacia aproximados para dar como resultado la entrada de la construcción o construcciones de ADN en células de interés (Tales como células del bulbo terminal de un folículo piloso, por ejemplo, células de la papila dérmica o células de la vaina dérmica). Otros métodos de transfección también incluyen precipitación con fosfato cálcico modificada, precipitación con polibreno, fusión de liposoma, y administración genética mediada por receptor.

Las células que se modificarán mediante ingeniería genética pueden ser células primarias secundarias obtenidas a partir de diversos tejidos, e incluyen tipos de células que se pueden mantener y propagar en cultivo. Los ejemplos no limitantes de células primarias y secundarias incluyen células epiteliales (por ejemplo, células de la papila dérmica, células del folículo piloso, células de la vaina de la raíz interna, células de la vaina de la raíz externa, células de glándulas sebáceas, células de la matriz epidérmica), células neuronales, células endoteliales, células gliales, fibroblastos, células musculares (tales como mioblastos) queeratinocitos, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, células de la médula ósea), y precursores de estos tipos de células somáticas.

El tejido de vertebrados se puede obtener mediante métodos conocidos por un experto en la materia, tales como una biopsia por punción u otros métodos quirúrgicos para obtener una fuente de tejido del tipo de célula primaria de interés. Una biopsia o extracción por punción se puede usar para obtener una fuente de queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, o células mesenquimales (por ejemplo, células del folículo piloso o células de la papila dérmica). La retirada de un folículo piloso se puede usar para obtener una fuente de fibroblastos, queratinocitos, células endoteliales, o células mesenquimales (por ejemplo, células del folículo piloso o células de la papila dérmica). Una mezcla de células primarias se puede obtener a partir del tejido, usando métodos fácilmente puestos en práctica en la técnica, tales como formación de desplantes o digestión enzimática (por ejemplos usando enzimas tales como pronasa, tripsina, colagenasa, elastasa dispasa, y quimotripsina). En el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.419.661 y en la publicación de solicitud de PCT Wo/2001/032840 también se han descrito métodos de biopsia. Las células primarias se pueden adquirir a partir del individuo al que se le administran las células primarias o secundarias modificadas por ingeniería genética. Sin embargo, las células primarias también se pueden obtener a partir de un donante, que no sea el receptor, de la misma especie. Las células también se pueden obtener a partir de otra especie (por ejemplo, conejo, gato, ratón, ratón, oveja, cabra, perro, caballo, vaca, pájaro, o cerdo). Las células primarias también pueden incluir células de una fuente de tejido de vertebrado aislado que crece unido a un sustrato de cultivo tisular (por ejemplo, matraz o placa) o que crece en una suspensión; células presentes en un explante obtenidas a partir de tejido; cualquiera de ambos de los tipos de células que se han mencionado anteriormente sembrados por primera vez; y suspensiones de cultivo celular obtenidas a partir de estas células sembradas. Las células secundarias pueden ser células primarias sembradas que se retiran del sustrato del cultivo y se vuelven a sembrar, o pasar, además de células de los pases posteriores. Las células secundarias se pueden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

pasar una o más veces. Estas células primarias o secundarias pueden contener vectores de expresión que tienen un gen que codifica una proteína de interés (por ejemplo, una proteína o polipéptido de Jak3).

Cultivo Celular

Con respecto a la célula hospedadora que se está cultivando se pueden usar diversos parámetros de cultivo. Las condiciones de cultivo apropiadas para células de mamífero se conocen bien en la técnica (Cleveland WL, et al., J Immunol Methods, 1983, 56 (2): 221-234) o las puede determinar el experto en la materia (véase, por ejemplo, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2a Ed., Rickwood, D. y Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992)). Las condiciones de cultivo celular pueden variar de acuerdo del tipo de célula hospedadora seleccionada. Se puede usar medios disponibles en el mercado. Los ejemplos no limitantes de medio incluyen, por ejemplo, Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEm, Sigma); Medio F10 de Ham (Sigma); medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, Utah); Medio RPMI-1640 (Sigma); y medio químicamente definido (CD) media, que se formulan para diversos tipos celulares, por ejemplo, Medio Cd-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

El medio de cultivo celular se puede suplementar cuando sea necesario con componentes o ingredientes suplementarios, incluyendo componentes opcionales, en concentraciones o cantidades apropiadas, si fuera necesario o si se desea. Las soluciones del medio de cultivo celular proporcionan al menos un componente de una o más de las siguientes categorías: (1) una fuente de energía, normalmente en forma de un carbohidrato tal como glucosa; (2) todos los aminoácidos esenciales, y normalmente el conjunto básico de los veinte aminoácidos más cisteína; (3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones; (4) ácidos grasos libres o lípidos, por ejemplo ácido linoleico; y (5) elementos traza, en el que los elementos traza se definen como compuestos inorgánicos o elementos de origen natural que pueden ser necesarios a concentraciones muy bajas, normalmente en el intervalo micromolar.

El medio también se puede suplementar de forma electiva con uno o más componentes de cualquiera de las siguientes categorías: (1) sales, por ejemplo, magnesio, calcio, y fosfato; (2) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, suero, insulina, transferrina, y factor de crecimiento epidérmico; (3) hidrolizados de proteína y tejido, por ejemplo peptonas o mezclas de peptonas que se pueden obtener a partir de gelatina purificada, material vegetal, o productos secundarios animales; (4) nucleósidos y bases tales como, adenosina, timidina, e hipoxantina; (5) tampones, tales como HEPES; (6) antibióticos, tales como gentamicina o ampicilina; (7) agentes protectores celulares, por ejemplo poliol plurónico; y (8) galactosa. En una realización, al medio de cultivo se le pueden añadir factores solubles.

El cultivo de células de mamífero que se puede usar con la presente invención se prepara en un medio adecuado para el tipo de célula que se va a cultivar. En una realización, el medio de cultivo celular puede ser uno cualquiera de los que se han discutido anteriormente (por ejemplo, MEM) que se suplementa consuelo de una fuente de mamífero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)). En otra realización, el medio puede ser un medio acondicionado para mantener el crecimiento de las células epiteliales o células obtenidas a partir del bulbo capilar de un folículo piloso (tales como células de la papila dérmica o células de la vaina dérmica). Por ejemplo, las células epiteliales se pueden cultivar de acuerdo con Barnes y Mather en Animal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998). En una realización más, las células epiteliales o células del folículo piloso se pueden transferir con vectores de ADN que contienen genes that que codifican un polipéptido o proteína de interés (por ejemplo, una proteína o polipéptido de Jak3). En otras realizaciones de la invención, las células crecen en un cultivo de suspensión (por ejemplo, un cultivo tridimensional tal como un cultivo de gota colgante) en presencia de una cantidad eficaz de enzima, en el que el sustrato enzimático es una molécula de la matriz extracelular en el cultivo en suspensión. Por ejemplo, la enzima puede ser una hialuronidasa. Las células epiteliales o células del folículo piloso se pueden cultivar de acuerdo con métodos que se practican en la técnica, por ejemplo, como los que se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.785.876, o como se describen por Harris en Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Gran Bretaña; 1996; véase el Capítulo 8).

Un cultivo en suspensión es un tipo de cultivo en el que las células, o agregados de células (tales como agregados de células DP), se multiplican cuando se suspenden en un medio líquido. Un cultivo en suspensión que comprende células de mamífero se puede usar para el mantenimiento de tipos celulares que no se adhieren o para permitir que las células manifiesten características celulares específicas que no se observan en la forma adherente. Algunos tipos de cultivos en suspensión pueden incluir cultivos tridimensionales o un cultivo de gota colgante. Un cultivo de gota colgante es un cultivo en el que el material a cultivar se inocula en una gota de fluido unida a una superficie plana (tal como cubre objetos de vidrio, porta objetos de vidrio, placa de Petri, matraz, y similares), y se puede invertir sobre una superficie hueca. Las células en una gota colgante se pueden agregar hacia el centro del colgante de una gota como resultado de la gravedad. Sin embargo, de acuerdo con los métodos de la invención, las células cultivadas en presencia de una proteína que degrada la matriz extracelular (tal como colagenasa, condroitinasa, hialuronidasa, y similares) se harán más compactas y se agregarán dentro del cultivo de gota colgante, para que la degradación del ECM permita que las células se pongan más cerca en las cercanías las unas respecto a las otras ya que estará presente menos ECM. Véase también la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° US 20100303767 A1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las células obtenidas a partir del bulbo capilar de un folículo piloso (tales como células de la papila dérmica o células de la vaina dérmica) se pueden cultivar en una población homogénea, individual (por ejemplo, que comprende células DP) en un cultivo de gota colgante con el fin de generar un agregado de células DP. Las células Tania se pueden cultivar como una población heterogénea (por ejemplo, que comprende células DP y DS) en un cultivo de gota colgante con el fin de generar un agregado quimérico de células DP y DS. Las células epiteliales se pueden cultivar en una monocapa hasta confluencia tal como se practica en la técnica. Los métodos de cultivo de ese tipo se pueden realizar esencialmente de acuerdo con métodos que se describen en el Capítulo 8 del Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Gran Bretaña; 1996); Underhill CB, J Invest Dermatol, 1993, 101 (6): 820-6); en Armstrong y Armstrong, (1990) J Cell Biol 110: 1439-55; o en Animal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998).

Los cultivos tridimensionales se pueden formar a partir de agar (tal como Agar de Gey), hidrogeles (tales como matrigel, agarosa, y similares; Lee et al., (2004) Biomaterials 25: 2461-2466) copolímeros que están reticulados. Estos polímeros pueden comprender polímeros naturales y sus derivados, polímeros sintéticos y sus derivados, o una combinación de los mismos. Los polímeros naturales pueden ser polímeros aniónicos, polímeros catiónicos, polímeros anfipáticos, o polímeros neutros. Los ejemplos no limitantes de polímeros anímicos pueden incluir ácido hialurónico, ácido algínico (alginato), carragenano, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, y pectina. Algunos ejemplos de polímeros catiónicos, incluyen quitosano o polilisina. (Peppas et al., (2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73). Los ejemplos de polímeros anfipáticos pueden incluir colágeno, gelatina, fibrina, y carboximetil quitina. Los ejemplos no limitantes de polímeros neutros pueden incluir dextrano, agarosa, o pululano. (Peppas et al., (2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73).

Las células adecuadas para el cultivo de acuerdo con métodos de la invención can pueden albergar vectores de expresión introducidos, tales como plásmidos. Las construcciones de vector de expresión se pueden introducir a través de transformación, microinyección, transfección, lipofección, electroporación, o infección. Los vectores de expresión pueden contener secuencias codificantes, o porciones de las mismas, que codifican las proteínas para expresión y producción. Los vectores de expresión que contienen secuencias que codifican las proteínas y polipéptidos producidos, así como los elementos de control de la transcripción y la traducción apropiados, se pueden generar usando métodos bien conocidos y puestos en práctica por las personas con experiencia en la materia. Estos métodos incluyen técnicas de síntesis, técnicas de ADN recombinante in vitro, y recombinación genética in vivo que se describen en J. Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y en F. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.

Compuestos Moduladores de Jak3

Como se usa en el presente documento, un "compuesto modulador de Jak3" se refiere a un compuesto que interactúa con un gen de Jak3 o una proteína Jak3 o polipéptido que modula su actividad y/o su expresión. El compuesto puede aumentar la actividad fue expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3. Por el contrario, el compuesto puede disminuir la actividad o la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3. El compuesto puede ser un agonista de Jak3 o un antagonista de Jak3 (por ejemplo, un inhibidor de Jak3). Algunos ejemplos no limitantes de compuestos moduladores de Jak3 incluyen péptidos (tales como fragmentos de péptidos que comprenden un polipéptido codificado por un gen de Jak3, o anticuerpos o fragmentos del mismo), moléculas pequeñas, y ácidos nucleicos (tales como ARNsi o ARN no codificante específico para un ácido nucleico que comprende un gen de Jak3). Los agonistas de una proteína Jak3 pueden ser moléculas que, cuando se unen a una proteína Jak3, aumentan o prolongan la actividad de la proteína Jak3. Los agonistas de Jak3 incluyen proteínas con ácido nucleicos, moléculas pequeñas, o cualquier otra molécula que activa una proteína Jak3. Los antagonistas de una proteína Jak3 pueden ser moléculas que, cuando se unen a una proteína Jak3 disminuyen la cantidad o la duración de la actividad de la proteína Jak3. Los antagonistas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, moléculas pequeñas, o cualquier otra molécula que disminuye la actividad de una proteína Jak3.

El término "modular," tal como aparece en el presente documento, se refiere a un cambio en la actividad fue expresión de un gen o proteína Jak3. Por ejemplo, la modulación puede producir un aumento o una disminución en la actividad de la proteína, características de unión, o cualquier otra propiedad biológica, funcional, o Inmunológica de una proteína Jak3.

Un compuesto modulador de Jak3 puede ser un fragmento peptídico de una proteína Jak3 que se unió a la proteína. Por ejemplo, el polipéptido de Jak3 puede incluir cualquier porción de aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. El fragmento comprender aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 30 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 40 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 50 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 60 aminoácidos consecutivos, o aproximadamente 75 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos incluyen todas las posibles longitudes de aminoácidos entre e incluyendo aproximadamente 8 y aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 35 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 70 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 100 aminoácidos, o entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100 aminoácidos. Estos fragmentos etílicos se pueden no tener en el mercado o se pueden sintetizar a través de métodos de síntesis en fase líquida o en fase sólida (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra). Los fragmentos peptídicos de Jak3 se pueden aislar a partir de una fuente natural, se pueden modificar por ingeniería genética, o se pueden preparar por vía química. Estos métodos se conocen bien en la técnica.

Un compuesto modulador de Jak3 puede ser una proteína, tal como un anticuerpo (monoclonal, policlonal, humanizado, quimérico, o humano completo), o un fragmento de unión de al mismo, dirigido contra un polipéptido codificado por un gen de Jak3. Un fragmento de anticuerpo puede ser una forma de un anticuerpo diferente a la forma de longitud completa e incluye porciones o componentes que existen dentro de anticuerpos de longitud completa, además de fragmentos de anticuerpo que se han modificado por ingeniería. Los fragmentos de anticuerpo pueden incluir Fv de cadena individual (scFv), diacuerpos, Fv, y (Fab')2, triacuerpos, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de las CDR, regiones variables, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, regiones marco conservadas, regiones constantes, y similares (véase, Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2: 339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 395-402). Los anticuerpos se pueden obtener en el mercado, se pueden generar a medida, o se pueden sintetizar contra un antígeno de interés de acuerdo con métodos establecidos en la técnica (véase Roland E. Kontermann y Stefan Dübel (editores), Antibody Engineering. Vol. I y II, (2010) 2a ed., Springer; Antony S. Dimitrov (editor), Therapeutic Anticuerpos: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), (2009), Humana Press; Benny Lo (editor) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), (2004) Humana Press. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos a Jak3 se pueden obtener en el mercado en Abcam, Santa Cruz Biotechnology, Abgent, R&D Systems, Novus Biologicals, etc. Los anticuerpos humanos dirigidos a cualquiera Jak3 (tales como anticuerpos monoclonales, humanizados, o quiméricos) pueden ser agentes terapéuticos de anticuerpo útiles para uso en seres humanos. En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo se dirige contra la SEQ ID NO: 1.

La inhibición del ARN que codifica un polipéptido codificado por un gen de Jak3 puede modular de forma eficaz la expresión de un gen de Jak3 a partir del cual se transcribe el ARN. Los inhibidores se seleccionan entre el grupo que comprende: ARNsi; ARN de interferencia o ARNi; ARNds; los ADN transcritos con ARN Polimerasa III; ribozimas; y ácidos nucleicos no codificante, que pueden ser ARN, ADN, o un ácido nucleico artificial.

Los oligonucleótidos no codificante, incluyendo ADN no codificante, ARN, y moléculas de ADN/ARN, actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante unión a ARNm dirigido y evitando la traducción de la proteína. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligonucleótidos no codificante de aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido codificado por un gen de Jak3, por ejemplo, mediante técnicas de fosfodiéster convencionales (Dallas et al., (2006) Med. Sci. Monit. 12 (4): RA67-74; Kalota et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173: 173-96; Lutzelburger et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173: 243-59). Las secuencias de nucleótidos no codificantes incluyen: morfolinos, 2'-O-metil polinucleótidos, ADN, ARN y similares. En una realización, el oligonucleótido no codificante para Jak3 comprende TGCCATGAGTGCAACTTGCCTAGC (SEQ ID NO: 3).

El ARNsi comprende la estructura bicatenaria que contiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 pares de bases, por ejemplo, de aproximadamente 21 a aproximadamente 25 pares de bases, y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un gen diana expresado o ARN dentro de la célula. El ARNsi comprende una hebra de ARN codificante y una hebra de ARN no codificante hibridada junto con interacciones de formación de pares de bases de Watson-Crick. La hebra codificante comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es esencialmente idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos contenida dentro de la molécula de ARNmi diana. "Esencialmente idéntica" a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se diferencia de la secuencia diana en aproximadamente un 3 % o menos. Las hebras codificante y no codificante del ARNsi pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenario, complementarias, o Puede comprender una molécula individual en la que dos partes complementarias se emparejan por bases y se unen con enlace covalente mediante una zona de "horquilla" monocatenaria. Véase también, McMnaus y Sharp (2002) Nat Rev Genetics, 3: 737-47, y Sen y Blau (2006) FASEB J., 20: 1293-99.

El ARNsi puede ser ARN alterado que se diferencia del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Las alteraciones de ese tipo pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al extremo o extremos del ARNsi o a uno o más nucleótidos internos del ARNsi, o modificaciones que hacen que la ARNsi sea resistente a la digestión con nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNsi con desoxirribonucleótidos. Una o ambas hebras del ARNsi también puede comprender una protuberancia en la posición en el extremo 3'. Como se usa en el presente documento, una protuberancia en el extremo en la posición 3' se refiere a al menos un nucleótido sin emparejar que se extiende desde el extremo en la posición 3'-terminal de una hebra de ARN que forma dúplex. Por ejemplo, el ARNsi puede comprender al menos una protuberancia en el extremo en la posición 3' con una longitud de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos), o con una longitud de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos, o con una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

longitud de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos, o con una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos. Por ejemplo, cada hebra del ARNsi puede comprender protuberancias en el extremo en la posición 3' de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

El ARNsi se puede producir por vía química o por vía biológica, o se puede expresar a partir de un plásmido recombinante o vector viral (por ejemplo, véase el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.294.504 y el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.422.896. Los métodos a modo de ejemplo para producir y someter a ensayo moléculas de ARNds o ARNsi se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2002/0173478 de Gewirtz, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 8.071.559 de Hannon et al., el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.674.895 de Reich et al., y en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.148.342 de Tolentino et al.

En una realización, un ARNsi dirigido a una secuencia de ácidos nucleicos humana que comprende un gen de Jak3 se puede generar contra una cualquiera de las SEQ ID NOS: 2. En otra realización, un ARNsi dirigido a una secuencia de ácidos nucleicos humana que comprende un gen de Jak3 puede comprender una cualquiera de las secuencias que se enumeran en la Tabla 1.

En otra realización, el ARNsi dirigido a Jak3 se enumera en la Tabla 1.

Tabla 1. SECUENCIAS de ARNsi para Jak3

SEQ ID NO:

4

TCAACTATCTGGAGGACAA

5

AGACAGAGGTGCTGCTGAA

6

GGTCCTTCACCAAGATTTA

7

CCTGGATCCTGCTAAGAAA

8

CGATCTTCGAGGAGAGACA

9

GGACAGACAACCAGATTTT

10

GGAAGCTGCAGGTGGTCAA

11

CCCAATACCAGCTGAGTCA

Los ADN transcritos de ARN polimerasa III contienen promotores, tales como el promotor U6. Estos ADN se pueden transcribir para producir los ARN ahorquillados pequeños en la célula que pueden funcionar como ARNsi o los ARN lineales que pueden funcionar como ARN no codificante. El compuesto modulador de Jak3 puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos sintéticos, o cualquier combinación adecuada de modo que se inhibe el ARN y/o gen diana. Además, estas formas de ácido nucleico pueden ser de dos, tres, o cuatro hebras. (Véase por ejemplo Bass (2001) Nature, 411: 428-429; Elbashir et al., (2001) Nature, 411: 494 498; el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.509.154; y las Publicaciones de PCT con N. osWO 00/044895, WO 01/036646, WO 99/032619, WO 00/01846, WO 01/029058, WO 00/44914).

Un compuesto modulador de Jak3 puede ser una molécula pequeña que se une a una proteína Jak3 e interrumpe su función, o por el contrario, aumenta su función. Las moléculas pequeñas son un grupo diverso de sustancias sintéticas y naturales que generalmente tienen pesos moleculares bajos. Se pueden aislar a partir de fuentes naturales (por ejemplo, plantas, hongos, microbios y similares), se obtienen en el mercado y/o están disponibles como bibliotecas o colecciones, o se pueden sintetizar. Las moléculas pequeñas candidatas que modulan una proteína Jak3 se pueden identificar a través de identificación sistemática in silico o identificación sistemática de alto rendimiento (HTP) de bibliotecas combinatorias de acuerdo con métodos establecidos en la técnica (por ejemplo, véase Potyrailo et al., (2011) ACS Comb Sci. 13 (6): 579-633; Mensch et al., (2009) J Pharm Sci. 98 (12): 4429-68; Schnur (2008) Curr Opin Drug Discov Devel. 11 (3): 375-80; y Jhoti (2007) Ernst Schering Found Symp Proc. (3): 169-85. La mayoría de los agentes farmacéuticos convencionales, tales como aspirina, penicilina, y muchos agentes quimioterapéuticos, son moléculas pequeñas, se pueden obtener en el mercado, se pueden sintetizar por vía química, o se pueden obtener a partir de bibliotecas aleatorias o combinatorias como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5 (1): 32-6).

En la actualidad los inhibidores de JAK3 están en ensayos clínicos en seres humanos para el tratamiento del rechazo al transplante de riñón agudo y artritis reumatoide. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de Jak3 incluyen: Janex 1 (WHI-P131) (Changelian et al., (2008) Blood, 111 (4): 2155-7); Uckun et al., (1999) Clin Cancer Res. 5 (10): 2954-62; Uckun et al., (2010) Arzneimittelforschung. 60 (4): 218-25), PF-956980 (Producto N.° PZ0151 de Sigma (St. Louis, MO,
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/pz0151 ?lang=en&region=US)); Changelian et al., (2008) Blood, 111 (4): 2155-7), WHI-P154 (Producto N.° 420104-5MG de Calbiochem (San Diego, CA,
http://www.emdbiosciences.com)); Changelian et al., (2008) Blood, 111 (4): 2155-7), VX-509 (oral de Vertex

5

10

15

20

25

Pharmaceuticals, Cambridge MA; Fleischmann et al., (2011) Arthritis Rheum, 63:LB3; Fleischmann et al., (2012) Curr Opin Rheumatol. Feb 18, PMID: 22357358), inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923) Producto N.° de Calbiochem 420121- 10MG (San Diego, CA,
http://www.emdbiosciences.com, WO1998022103), NSC114792 (Kim et al., (2010) Mol Cáncer. 2010, 9:36), tofacitinib (CP690550) (Changelian et al., (2008) Blood, 111 (4): 2155-7; Vijayakrishnan et al., (2011) Trends Pharmacol Sci. 32 (1): 25-34; Fleischmann et al., (2012) Curr Opin Rheumatol. Feb 18, PMID: 22357358), y R348 (tópico y oral de Rigel Pharmaceuticals, San Francisco CA; Deuse et al., (2008) Transplantation. 85 (6): 885-92; Vijayakrishnan et al., (2011) Trends Pharmacol Sci. 32 (1): 25-34).

Las estructuras de inhibidores de JAK3 útiles para la invención incluyen a) Janex 1, oral y tópico; b) PF-956980, infusión i.v.; c) WHI-P154; d) ZM-39923; e) NSC114792; f) tofacitinib (CP690550), oral.

a)

imagen1

b)

imagen2

imagen3

imagen4

O C [3

d)

I

. HCI

e)

imagen5

f)

Los ejemplos no limitantes de inhibidores de JAK (por ejemplo, Inhibidores de Jak de Tipo I y de Tipo II) se discuten en O'Shea y Plenge (Immunity, 20 de abril de 2012; 36 (4): 542-50) LaFave y Levine (Trends Pharmacol Sci. Nov de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2012; 33 (11): 574-82), Kontzias et al., (Curr Opin Pharmacol. Agosto de 2012; 12 (4): 464-70), Norman (Expert Opin Ther Pat. Oct de 2012; 22 (10): 1233-49), y Wilson (Expert Opin Ther Pat. mayo de 2010; 20 (5): 609-23).

El conocimiento de una secuencia primaria de una molécula de interés, tal como un polipéptido codificado por un gen de Jak3, y la similitud de esa secuencia con proteínas de función conocida, puede proporcionar información con respecto a los inhibidores o antagonistas de la proteína de interés además de agonistas. La identificación y la identificación sistemática de agonistas y antagonistas se facilita adicionalmente mediante la determinación de características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X, difracción por neutrones, espectrometría por resonancia magnética nuclear, y otras técnicas para determinación estructural. Estas técnicas proporcionan el diseño o identificación racional de agonistas y antagonistas.

Los compuestos de ensayo, tales como compuestos moduladores de Jak3, se pueden identificar sistemáticamente a partir de bibliotecas grandes de compuestos sintéticos o naturales (véase Alicea-Velázquez y Boggon (2011) Curr Drug Targets, 12 (4): 546-55; Wang et al., (2007) Curr Med Chem, 14 (2): 133-55; Mannhold (2006) Curr Top Med Chem, 6 (10): 1031-47; y Hensen (2006) Curr Med Chem 13 (4): 361-76). En la actualidad se usan numerosos medios para síntesis aleatoria y dirigida de compuestos a base de sacárido, péptido, y ácido nucleico. Las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles en el mercado en Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), AMRI (Albany, NY), ChemBridge (San Diego, CA), y MicroSource (Gaylordsville, CT). Una biblioteca química rara está disponible en Aldrich (Milwaukee, Wis.). Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en formas de extractos bacterianos, fúngico, vegetales y animales están disponibles por ejemplo en Pan Laboratories (Bothell, Wash.) o MycoSearch (N.C.), o se pueden producir fácilmente. Además, Las bibliotecas y compuestos naturales y producidos por vía sintética se pueden modificar fácilmente a través de Medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales (Blondelle et al., (1996) Tib Tech 14:60).

En la técnica se conocen bien métodos para preparar bibliotecas de moléculas ay en el mercado están disponibles muchas bibliotecas. Las bibliotecas de interés en la invención incluyen bibliotecas de péptidos, bibliotecas de oligonucleótidos aleatorios, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, y similares. Las bibliotecas de péptidos degenerados se pueden preparar fácilmente en solución, en forma inmovilizada como bibliotecas de presentación de péptidos de flagelos bacterianos o como bibliotecas de presentación de fagos. Los ligandos peptídicos se pueden seleccionar a partir de bibliotecas condenatorias de péptidos que contienen al menos un aminoácido. Las bibliotecas se pueden sintetizar a partir de restos sintéticos peptoides y no peptídicos. Las bibliotecas de ese tipo se pueden sintetizar adicionalmente para que contengan restos sintéticos no peptídicos, que Están menos sujetos a la degradación enzimática en comparación con sus homólogos de origen natural. Por ejemplo, las bibliotecas también pueden incluir bibliotecas de péptido sobre plásmido, bibliotecas de molécula pequeña sintética, bibliotecas de aptámero, bibliotecas basadas en traducción in vitro, bibliotecas de polisoma, bibliotecas de péptido sintético, bibliotecas de neurotransmisor, y bibliotecas químicas.

Los ejemplos de bibliotecas sintetizadas por vía química se describen en Fodor et al., (1991) Science 251: 767-773; Houghten et al., (1991) Nature 354: 84-86; Lam et al., (1991) Nature 354: 82-84; Medynski, (1994) BioTechnology 12: 709-710; Gallop et al., (1994) J. Medicinal Chemistry 37 (9): 1233-1251; Ohlmeyer et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-11426; Houghten et al., (1992) Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618; Salmon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712; Publicación de PCT con N.°WO 93/020242, con fecha de 14 de octubre, 1993; y Brenner et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383.

Los ejemplos de bibliotecas de presentación de fago se describen en Scott et al., (1990) Science 249: 386-390; Devlin et al., (1990) Science, 249: 404-406; Christian, et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 711-718; Lenstra, (1992) J. Immunol. Meth. 152: 149-157; Kay et al., (1993) Gene 128: 59-65; y Publicación de PCT con N.°WO 94/018318.

Las bibliotecas basadas en traducción in vitro incluyen las que se describen en la Publicación de PCT con N.°WO 91/005058; y Mattheakis et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-9026.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fuente de ligando" puede ser cualquier biblioteca de compuesto que se describe en el presente documento, o extracto tisular preparado a partir de diversos órganos en un sistema del organismo, que se puede usar para identificar sistemáticamente compuestos que podrían actuar como un agonista o antagonista de una proteína Jak3. La identificación sistemática de bibliotecas de compuesto que se enumeran en el presente documento (véase también el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.884.189), en combinación con estudios en animales in vivo, ensayos funcionales y de señalización que se describen a continuación se pueden usar a identificar compuestos moduladores de Jak3 que regulan el crecimiento capilar o para tratar trastornos de pérdida capilar.

La identificación sistemática de las bibliotecas se puede conseguir mediante cualquier diversidad de métodos comúnmente conocidos. Véanse, por ejemplo, las siguientes referencias, que desvelan la identificación sistemática de bibliotecas de péptidos: Parmley y Smith, (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott y Smith, (1990) Science 249: 386-390; Fowlkes et al., (1992) BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yu et al., (1994) Cell 76: 933-945; Staudt et al., (1988) Science 241: 577-580; Bock et al.,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(1992) Nature 355: 564-566; Tuerk et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992; Ellington et al., (1992) Nature 355: 850-852; documentos de Patente de Estados Unidos N.os 5.096.815, 5.223.409, y 5.198.346, todos de Ladner et al.; Rebar et al., (1993) Science 263: 671-673; y Publicación de PCT con N.°WO 94/018318.

También se pueden generar e identificar sistemáticamente bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas. Una biblioteca combinatoria de compuestos orgánicos pequeños es una colección de análogos estrechamente relacionados que difieren entre sí en uno o más puntos de diversidad y se sintetizan mediante técnicas orgánicas mediante procesos de múltiples etapas. Las bibliotecas combinatorias incluyen un gran número de compuestos orgánicos pequeños. Un tipo de biblioteca combinatoria se prepara por medio de métodos de síntesis en paralelo para producir una matriz de compuesto. Una matriz de compuesto puede ser una colección de compuestos que se pueden identificar por sus direcciones espaciales en coordenadas cartesianas y se organizan de manera que cada compuesto tenga un núcleo molecular común y uno o más elementos de diversidad estructural variable. Los compuestos en dicha matriz de un compuesto se producen en paralelo en recipientes de reacción separados, con cada compuesto identificado y rastreado por su dirección espacial. Los ejemplos de mezclas de síntesis paralelas y métodos de síntesis paralelos se proporcionan en el documento de Estados Unidos con N.° de Ser. 08/177.497, presentado el 5 de enero, 1994 y su Publicación de PCT con N.°WO 95/018972 correspondiente, así como el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.712.171 y su Publicación de PCT con N.°WO 96/022529 correspondiente.

En un ejemplo no limitante, se pueden identifica sistemáticamente bibliotecas no peptídicas, tales como una biblioteca de benzodiazepina (véase, por ejemplo, Bunin et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712). También se pueden usar bibliotecas de peptoides, tales como las que describe Simon et al., (1992) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371. Otro ejemplo de una biblioteca que se puede usar, en la que los grupos funcionales amido en péptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria transformada por vía química, es descrita porOstresh et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11138-42.

Las tecnologías de búsqueda y modelado por ordenador permiten la identificación de compuestos, o la mejora de compuestos ya identificados, que pueden modular la expresión o actividad de una proteína Jak3. Habiendo identificado dicho compuesto o composición, los sitios activos o las regiones de una proteína Jak3 se pueden identificar posteriormente mediante el examen de los sitios a los que se unen los compuestos. Estos sitios pueden ser sitios de unión a ligandos y se pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de péptidos, las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos, o el estudio de complejos del compuesto o composición pertinente con su ligando natural. En este último caso, para encontrar el sitio activo se pueden usar métodos químicos o de cristalografía por rayos X, encontrando en qué parte del factor se encuentra el ligando que formar el complejo.

La estructura geométrica tridimensional de un sitio, por ejemplo, la de un polipéptido codificado por un gen de Jak3, se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X, que puede determinar una estructura molecular completa. La RMN en fase sólida o líquida se puede usar para determinar determinadas distancias intramoleculares. Cualquier otro método experimental de determinación estructural se puede usar para obtener estructuras geométricas parciales o completas. Las estructuras geométricas se pueden medir con un ligando complejo, natural o artificial, que puede aumentar la precisión de la estructura del sitio activo determinada.

En la técnica se conocen otros métodos para preparar o identificar péptidos que se unen a una diana. La impresión molecular, por ejemplo, se puede usar para la construcción de novo de estructuras macromoleculares Tales como péptidos que se unen a una molécula. Véase, por ejemplo, Kenneth J. Shea (1994) Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites, TRIP 2 (5); Mosbach, (1994) Trends in Biochem. Sci., 19 (9); y Wulff, G., en Polymeric Reagents and Catalysts (Ford, W. T., Ed.) ACS Symposium Series No. 308, pp 186-230, American Chemical Society (1986). Un método para preparar miméticos de un compuesto modulador de Jak3 implica las etapas de: (i) polimerización de monómeros funcionales alrededor de un sustrato conocido (el molde) que presenta una actividad deseada; (ii) eliminación de la molécula molde; y a continuación (iii) polimerización de una segunda clase de monómeros en, el vacío dejado por el mol de, para proporcionar una nueva molécula que presenta una o más propiedades deseadas que son similares a las del molde. Además de preparar péptidos de esta manera, también se pueden preparar otras moléculas de unión tales como polisacáridos, nucleósidos, fármacos, nucleoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, glicoproteínas, esteroides, lípidos y otros materiales biológicamente activos. Este método es útil para diseñar una gran diversidad de miméticos biológicos que son más estables que sus homólogos naturales, ya que se preparan mediante la polimerización por radicales libres de monómeros funcionales, dando como resultado un compuesto con una estructura principal no biodegradable. Otros métodos para diseñar moléculas de ese tipo incluyen, por ejemplo, un diseño de fármacos basado en relaciones de actividad estructural, que requieren la síntesis y evaluación de una serie de compuestos y modelos moleculares.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ensayos de Identificación Sistemática

Un compuesto modulador de Jak3 puede ser un compuesto que influyen en la actividad y/o expresión de una proteína Jak3 in vivo y/o in vitro. Los compuestos moduladores son de Jak3 pueden ser agonistas y antagonistas de una proteína Jak3, y pueden ser compuestos que ejercen su efecto en la actividad de una proteína Jak3 a través de expresión, a través de modificaciones posteriores a la traducción, o mediante otros medios.

Los compuestos o agentes de ensayo que se unen a una proteína Jak3, y/o tienen un efecto estimulatorio o inhibitorio en la actividad o la expresión de una proteína Jak3, se pueden identificar mediante dos tipos de ensayos: (a) ensayos basados en células que usan células que expresan una proteína Jak3 o una variante de la misma en la superficie celular; o (b) ensayos sin células, que pueden hacer uso de proteínas Jak3 aisladas. Estos ensayos pueden usar un fragmento biológicamente activo de una proteína Jak3, proteínas de longitud completa, o una proteína de fusión que incluye todo o parte de un polipéptido codificado por un gen de Jak3. Una proteína Jak3 se puede obtener a partir de cualquier especie de mamífero adecuada (por ejemplo, ser humano, rata, pollo, Xenopus, equino, bovino o murino). El ensayo puede ser un ensayo de unión que comprende medición directa o indirecta de la unión de un compuesto de ensayo. El ensayo también puede ser un ensayo de actividad que comprende medición directa o indirecta de la actividad de una proteína Jak3. El ensayo también puede ser un ensayo de expresión que comprende medición directa o indirecta de la expresión de secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 o una proteína codificada por un gen de Jak3. Los diversos ensayos de identificación sistemática se pueden combinar con un ensayo in vivo que comprende la medición del efecto del compuesto de ensayo en los síntomas de un trastorno o enfermedad de pérdida capilar en un sujeto (por ejemplo, alopecia androgénica, alopecia areata, alopecia total, o alopecia universal), o incluso hipotricosis.

Un ensayo in vivo también puede comprender la evaluación del efecto de un compuesto de ensayo en la regulación del crecimiento capilar en modelos de mamífero conocidos que presentan fenotipos de crecimiento capilar defectuosos o anómalos o mamíferos que contienen mutaciones en el marco de lectura abierto (ORF) de secuencias de ácidos nucleicos que comprenden un gen de Jak3 que influye en la regulación del crecimiento capilar o densidad del pelo. El control del crecimiento capilar puede comprender una inducción del crecimiento capilar o densidad en el sujeto. En el presente documento con el efecto del compuesto en la regulación del crecimiento capilar se puede observar ya sea visualmente examinando el crecimiento o pérdida del cabello físico del organismo, o evaluando la expresión de proteína o ARNm usando métodos conocidos en la técnica.

También se pueden realizar ensayos para identificar sistemáticamente compuestos de ensayo que se unen a o que modula la actividad de una proteína Jak3. El compuesto de ensayo se puede obtener mediante cualquier medio adecuado, tal como a partir de bibliotecas de compuestos convencionales. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a una forma de la proteína Jak3 unida a membrana se puede conseguir mediante acoplamiento del compuesto de ensayo con una etiqueta radioisotópica o enzimática de modo que la unión del compuesto de ensayo a la célula que expresa una proteína Jak3 se puede medir detectando el compuesto etiquetado en un complejo. Por ejemplo, el compuesto de ensayo se puede etiquetar con 3H, 14C, 35S, o 125I, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo se puede detectar posteriormente mediante recuento directo de radioemisión o mediante recuento de centelleo. Como alternativa, el compuesto de ensayo se puede etiquetar por vía enzimática con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la etiqueta enzimática se puede detectar mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado para el producto.

Los ensayos basados en células pueden comprender la puesta en contacto de una célula que expresa Jak3 con un agente de ensayo y determinar la capacidad del agente de ensayo para modular (tal como aumentar o disminuir) la actividad por la expresión de la molécula unida a la membrana. La determinación de la capacidad del agente de ensayo para modular la actividad de la molécula de Jak3 unida a la membrana se puede realizar mediante cualquier método adecuado para medir la actividad de una molécula de ese tipo, tal como monitorizando sucesos de señalización cadena abajo (por ejemplo, Thoma et al., (2011) J Med Chem. 54 (1): 284-8; Flanagan (2010) J Med Chem. 53 (24): 8468-84; Lin et al., (2010) Arthritis Rheum. 62 (8): 2283-93; Kim et al., (2010) Mol Cancer. 9: 36; Malabarba et al., (1995) J Biol Chem. 270 (16): 9630-7; JAK3 Kinase Enzyme Systems (N.os del Producto V9441 y V3701, disponibles en Promega (
http://www.promega.com/products/cell-signaling/protein--kinases-and-kinase-- assays/nonreceptor-tyrosine-kinase-enzyme-systems/jak3-kinase-enzyme-system/),.

Una proteína Jak3 o la diana de una proteína Jak3 se puede inmovilizar para facilitar la separación de formas que forman complejos de las que no forman complejos de una o ambas de las proteínas. La unión de un compuesto de ensayo para una proteína Jak3 o una variante de la misma, o interacción de una proteína Jak3 con una molécula harían en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo, se puede realizar en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de los recipientes de ese tipo incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrifugadora. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas de las proteínas se unan a una matriz (por ejemplo, glutatión-S- transferasa (GST) o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa que se pueden adsorber sobre perlas de glutatión y Sepharose (Sigma Chemical; St. Louis, Mo.) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Una proteína Jak3, o una variante de la misma, también se puede inmovilizar mediante su unión a un soporte sólido. Los ejemplos no limitantes de soportes sólidos adecuados incluyen porta objetos de vidrio o plástico, placas de cultivo tisular, pocillos de microtitulación, tubos, chips de silicio, o particular tales como perlas (incluyendo perlas de látex, poliestireno, o vidrio). Cualquier método conocido en la técnica se puede usar para unir un polipéptido (o polinucleótido) que corresponde a Jak3 o una variante del mismo, o compuesto de ensayo a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlaces covalente sino covalente es, o absorción pasiva.

La expresión de una proteína Jak3 también se puede monitorizar. Por ejemplo, los reguladores de la expresión de una proteína Jak3 se pueden identificar a través de puesto en contacto de una célula con un compuesto de ensayo y determinando la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula. El nivel de expresión de una proteína codificada por gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula en presencia del compuesto de ensayo se compara con la proteína o nivel de expresión de ARNm en ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo a continuación se puede identificar como un regulador de la expresión de una proteína Jak3 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula es estadística o significativamente superior en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un estimulador/potenciador de la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula. Se puede decir que el compuesto de ensayo es un compuesto modulador de Jak3 (tal como un agonista).

Como alternativa, cuando la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula es estadística o significativamente menor en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto se identifica como un inhibidor de la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula. también se puede decir que el compuesto de ensayo es un compuesto modulador de Jak3 (tal como un antagonista). El nivel de expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3 o secuencias de ácidos nucleicos de ARNm de Jak3 en la célula en células se puede determinar por métodos que se han descrito anteriormente.

Para ensayos de unión, el compuesto de ensayo puede ser una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión de un polipéptido codificado por un gen de Jak3, o una variante del mismo. esto puede hacer que el sitio de unión del ligando sea inaccesible al sustrato de modo que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de las moléculas pequeñas de ese tipo incluyen, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos. En ensayos de unión, el compuesto de ensayo o un polipéptido codificado por un gen de Jak3 puede comprender una etiqueta detectable, tal como una etiqueta fluorescente, radioisotópica, quimioluminiscente, o enzimática (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, o luciferasa). La detección de un compuesto de ensayo que se une a un polipéptido codificado por un gen de Jak3 a continuación se puede determinar a través de recuento directo de radioemisión, mediante recuento de centelleo, o mediante determinación de la conversión de un sustrato apropiado en un producto detectable.

La determinación de la capacidad de un compuesto de ensayo para unirse a una proteína Jak3 también se puede realizar usando Análisis de Interacción Biamolecular en tiempo real (BIA) (McConnell et al., 1992, Science 257, 1906-1912; Sjolander, Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63, 2338-2345). BiA es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar ninguno de los agentes que interactúan (por ejemplo, BIA- core™). Los cambios en la resonancia por plasmón superficial (SPR) de fenómeno óptico se pueden usar como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Para identificar otras proteínas que se unen a o que interactúan con una proteína Jak3 y modular su actividad, Un polipéptido codificado por un gen de Jak3 se puede usar como una proteína cebo en un ensayo de dos híbridos o un ensayo de tres híbridos (Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.283.317), de acuerdo con métodos que se ponen en práctica en la técnica. El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consiste en dominios de unión y activación de ADN separables.

Ensayos Funcionales. Los compuestos de ensayo se pueden someter al ensayo para la capacidad para aumentar o disminuir la actividad de una proteína Jak3, o una variante de la misma. La actividad se puede medir después de poner en contacto una proteína Jak3 purificada, una preparación de membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad de una proteína Jak3 En aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%,

aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %,

aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95% o un 100% se identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de una proteína Jak3, por ejemplo un antagonista. Un compuesto de ensayo que aumenta la actividad de una proteína Jak3 en aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %,

aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %,

aproximadamente un 95 % o un 100 % se identifica como un agente potencial para aumentar la actividad de una proteína Jak3, por ejemplo un agonista.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tratamiento y Prevención

La solicitud también desvela un método para tratar o prevenir un trastorno de pérdida capilar en un sujeto. El método comprende la detección de la presencia de una alteración en un gen de Jak3 en una muestra del sujeto, la presencia de la alteración siendo indicativo de un trastorno de pérdida capilar, o la predisposición a un trastorno de pérdida capilar, y, la administración al sujeto con necesidad un tratamiento terapéutico contra un trastorno de pérdida capilar. El tratamiento terapéutico puede ser una administración farmacológica (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNsi dirigido a un ácido nucleico de Jak3). La molécula terapéutica que se va a administrar puede comprender un polipéptido codificado por un gen de Jak3, que comprende aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, o un 100 % de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y presenta la función de disminuir la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3. esto puede restablecer la capacidad para iniciar el crecimiento capilar en células obtenidas a partir de folículos pilosos o de la piel. La molécula terapéutica que se pretende administrar puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un gen de Jak3 que codifica un polipéptido, que comprende aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, o un 100 % de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, y codifica un polipéptido con la función de disminuir la expresión de una proteína codificada por un gen de Jak3, restableciendo de ese modo la capacidad para iniciar el crecimiento capilar en células obtenidas a partir de células del folículo piloso o piel.

La presencia de una alteración en un gen que codifica una molécula de Jak3 en la muestra se puede detectar a través de la formación de fenotipos de una muestra, por ejemplo, mediante secuenciación genética, hibridación selectiva, amplificación, análisis de expresión genética, o una combinación de los mismos. La muestra puede comprender sangre, plasma, suero, esputo, secreciones lagrimales, semen, secreciones vaginales, tejido cutáneo, tejido muscular, líquido amniótico, o una combinación de los mismos.

La alteración se puede determinar a nivel del ADN, ARN o polipéptido. Opcionalmente, la detección se puede determinar realizando un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos, un ensayo basado en confirmación, un ensayo de hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de amplificación específico de alelo, un ensayo de microsecuenciación, un análisis de curva de fusión, un ensayo de cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC) (por ejemplo, véase Jones et al., (2000) Hum Genet., 106 (6): 663-8), o una combinación de los mismos. La detección se puede realizar secuenciando todo o parte de un gen de Jak3 o mediante hibridación o amplificación selectiva de todo o parte de un gen de Jak3. Una amplificación específica de gen de Jak3 se puede realizar antes de la etapa de identificación de la alteración.

Una alteración en una región cromosómica ocupada por un gen de Jak3 puede ser cualquier forma de mutación o mutaciones, supresión o supresiones, reordenamiento o reordenamientos y/o inserciones en la región no codificante y/o codificante del locus, solo o en diversas combinaciones. Las mutaciones pueden incluir mutaciones puntuales. Las inserciones pueden incluir la adición de uno o varios restos en una porción codificante o no codificante del locus del gen. Las inserciones pueden comprender una adición de entre 1 y 50 pares de bases en el locus del gen. Las eliminaciones pueden incluir cualquier región de uno, dos o más restos en una porción codificante o no codificante del locus genético, como desde dos restos hasta el gen o locus completo. Las deleciones pueden influir en regiones más pequeñas, tales como dominios (intrones) o secuencias o fragmentos repetidos de menos de aproximadamente 50 pares de bases consecutivos, aunque también se pueden producir deleciones más grandes. La reorganización incluye inversión de secuencias. La alteración en una región cromosómica ocupada por un gen de Jak3 puede da como resultado sustituciones de aminoácidos, corte y empalme o procesamiento de ARN, inestabilidad del producto, la creación de codones de parada, mutaciones por desplazamiento de marco, y/o producción de polipéptidos truncados. La alteración puede dar como resultado la producción de un polipéptido codificado por un gen de Jak3 con función, estabilidad, direccionamiento o estructura alterados. La alteración también puede producir una reducción, o incluso un aumento en la expresión de proteínas. En una realización, la alteración en la región cromosómica ocupada por un gen de Jak3 puede comprender una mutación puntual, una deleción, o una inserción en un gen de Jak3 o producto de expresión correspondiente. En otra realización, la alteración puede ser una deleción o una deleción parcial de un gen de Jak3. La alteración se puede determinar a nivel del ADN, ARN o polipéptido.

El método puede comprender detectar la presencia de expresión de ARN alterado. La expresión de ARN alterado incluye la presencia de una secuencia de ARN alterada, la presencia de un corte y empalme o procesamiento de ARN alterado, o la presencia de una cantidad alterada de ARN. Estos se pueden detectar mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la secuenciación de todo o parte del ARN o mediante hibridación selectiva o amplificación selectiva de todo o parte del ARN. El método puede comprender detectar la presencia de expresión alterada de un polipéptido codificado por un gen de Jak3. La expresión de polipéptidos alterada incluye la presencia de una secuencia polipeptídica alterada, la presencia de una cantidad alterada de polipéptido, o la presencia de una distribución tisular alterada. Estos se pueden detectar mediante diversas técnicas conocidas en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

técnica, incluyendo la secuenciación y/o la unión a ligandos específicos (tales como anticuerpos, por ejemplo, dirigidos a Jak3).

En la técnica se pueden usar diversas técnicas conocidas para detectar o cuantificar la expresión de genes o ARN o secuencias de ácidos nucleicos alterados, que incluyen hibridación, secuenciación, amplificación, y/o unión a ligandos específicos (tales como anticuerpos). Otros métodos adecuados incluyen oligonucleótido específico de alelo (ASO), ligamiento de oligonucleótido, amplificación específica de alelo, transferencia de Southern (para los ADN), transferencia de Northern (para los ARN), análisis conformacional de una sola hebra (SSCA),), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), enfoque isoeléctrico, hibridación in situ fluorescente (FISH), migración en gel, electroforesis en gel desnaturalizante con fijación, HPLC desnaturalizante, análisis de curva de fusión, análisis de heterodúplex, protección de RNasa, escisión de desajustes químicos o enzimáticos, ELISA, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA). En una realización, la detección comprende el uso de una transferencia de Northern; PCR en tiempo real y cebadores dirigidos a la SEQ ID NO: 2; un ensayo de protección de ribonucleasa; una técnica de hibridación, amplificación o secuenciación para distinguir la SEQ ID NO: 2; o una combinación de los mismos.

Algunos de estos enfoques (tales como SSCA y electroforesis en gel de gradiente constante (CGGE)) se basan en un cambio de la movilidad electroforética de los ácidos nucleicos, como resultado de la presencia de una secuencia alterada. De acuerdo con estas técnicas, la secuencia alterada se visualiza mediante un desplazamiento en la movilidad sobre los geles. A continuación, los fragmentos se pueden secuenciar para confirmar la alteración. Algunos otros enfoques se basan en hibridación específica entre ácidos nucleicos del sujeto y una sonda específica para gen o ARN de tipo silvestre o alterado. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizadas sobre un sustrato. Las ondas se pueden etiquetar para facilitar la detección de híbridos. Algunos de estos enfoques son adecuados para evaluar una secuencia de polipéptidos a nivel de expresión, tales como transferencia de Northern, ELISA, y RIA. Estos últimos requieren el uso de un ligando específico para el polipéptido, por ejemplo, el uso de un anticuerpo. El anticuerpo se puede dirigir a una molécula de Jak3 que comprende la SEQ ID NO: 1.

Secuenciación. La secuenciación se puede realizar usando técnicas bien conocidas en la técnica, usando secuenciadores automáticos. La secuenciación se puede realizar en el gen de Jak3 completo o en dominios específicos del mismo, tales como los que se sabe o se sospecha que portan mutaciones u otras alteraciones perjudiciales.

Amplificación. La amplificación se basa en la formación de híbridos específicos entre secuencias de ácidos nucleicos complementarias que sirven para iniciar la reproducción del ácido nucleico. La amplificación se puede realizar de acuerdo con diversas técnicas conocidas en la técnica, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR), reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). Estas técnicas se pueden realizar usando reactivos y protocolos disponibles en el mercado. Las técnicas útiles en la técnica incluyen PCR en tiempo real, PCR específica de alelo, o polimorfismo conformacional de una sola hebra basado en PCR (SSCP). La amplificación normalmente requiere el uso de cebadores de ácido nucleico específicos, para iniciar la reacción. Los cebadores de ácido nucleico útiles para amplificar secuencias de un gen de Jak3 o locus pueden hibridarse de forma específica con una parte de un locus de gen de Jak3 que flanquea una región diana del locus, en el que la región diana esta alterada en ciertos sujetos que tienen un trastorno de pérdida capilar. En una realización, la amplificación puede comprender el uso de cebadores de PCR directos e inversos que comprenden secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Los métodos de amplificación no limitantes incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa, PCR (PCR Protocols. A Guide To Methods And Applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990 y PCR Strategies, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.); reacción en cadena de ligasa (LCR) (Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); amplificación por transcripción (Kwoh (1989) PNAS 86: 1173); y, Replicación de secuencia autosostenida (Guatelli (1990) PNAS 87: 1874); amplificación de Q Beta replicasa (Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491), ensayo automatizado de amplificación de Q-beta replicasa (Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; véase también Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; documentos de Patente de Estados Unidos N.os 4.683.195 y 4.683.202; y Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564). La solicitud desvela un cebador de ácido nucleico, en el que el cebador puede ser complementario para e hibridarse de forma específica con una porción de una secuencia codificante de Jak3 (por ejemplo, gen o ARN) alterado en ciertos sujetos que tienen un trastorno de pérdida capilar. Los cebadores pueden ser específicos para secuencias alteradas en un gen de Jak3 o ARN. Usando cebadores de ese tipo, la detección de un producto de amplificación indica la presencia de una alteración en un gen de Jak3 o la ausencia de tal gen. Los cebadores también se pueden usar para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) situados en o alrededor de un locus de gen de Jak3; los SNP pueden comprender un cambio de un solo nucleótido, o un grupo de los SNP en y aproximadamente un gen de Jak3. Los ejemplos de cebadores de la presente solicitud pueden ser moléculas de ácido nucleicos monocatenarios con una longitud de aproximadamente 5 a 60 nucleótidos, o con una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 nucleótidos. La secuencia se puede obtener directamente a partir de la secuencia de un gen de Jak3. La complementariedad perfecta es útil para asegurar una especificidad elevada; sin embargo, se pueden tolerar determinadas faltas de coincidencias. Por ejemplo, un cebador de ácido nucleico o un par de cebadores de ácido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

nucleico como se ha descrito anteriormente se pueden usar en un método para detectar la presencia de o una predisposición a un trastorno de pérdida capilar en un sujeto.

Hibridación Selectiva. Los métodos de detección de la hibridación se basan en la formación de híbridos específicos entre secuencias de ácidos nucleicos complementarias que sirven para detectar alteración o alteraciones en la secuencia de ácidos nucleicos. Una técnica de detección implica el uso de una sonda de ácido nucleico específica para ARN o gen de tipo silvestre o alterado, seguido de la detección de la presencia de un híbrido. La sonda puede estar en suspensión o inmovilizado en un sustrato o soporte (por ejemplo, como en las tecnologías de matriz de ácido nucleico o chips). La sonda se puede etiquetar para facilitar la detección de híbridos. Por ejemplo, una muestra del sujeto se puede poner en contacto con una sonda de ácido nucleico específica para un gen de Jak3 de tipo silvestre o un gen de Jak3 alterado, y la formación de un híbrido se puede evaluar posteriormente. En una realización, el método comprende la puesta en contacto, de forma simultánea, de la muestra con un conjunto de sondas que son específicas, respectivamente, para un gen de Jak3 de tipo silvestre y para diversas formas alteradas del mismo. Por lo tanto, es posible detectar directamente la presencia de diversas formas de alteraciones en un gen de Jak3 en la muestra. Además, diversas muestras de diversos sujetos se pueden tratar en paralelo.

De acuerdo con la solicitud, una sonda puede ser una secuencia de polinucleótidos que es complementaria a Y que se puede hibridar de forma específica con un (porción diana de un) gen de Jak3 o ARN, y que es adecuada para detectar polimorfismos de polinucleótidos asociados con alelos de un gen de Jak3 (o genes) que predisponen a o están asociados con un trastorno de pérdida capilar. Las sondas útiles son aquellas que son complementarias para un gen de Jak3, ARN, o una parte diana del mismo. Las sondas pueden comprender ácidos nucleicos monocatenarios con una longitud entre 8 y 1000 nucleótidos, por ejemplo, entre 10 y 800, entre 15 y 700, o entre 20 y 500. También se pueden usar sondas de longitud mayor. Una sonda útil de la solicitud es una molécula de ácido nucleico monocatenario con una longitud entre 8 y 500 nucleótidos, que se puede hibridar de forma específica a una región de un gen de Jak3 o ARN que lleva una alteración. Por ejemplo, la sonda se puede dirigir a una región del cromosoma ocupada por un gen de Jak3.

La secuencia de las sondas se puede obtener a partir de las secuencias de un gen de Jak3 y ARN tal como se proporciona en el presente documento. Se pueden realizar sustituciones de nucleótidos, así como modificaciones químicas de la sonda. Las modificaciones químicas de ese tipo se pueden realizar para aumentar la estabilidad de los híbridos (por ejemplo, grupos de intercalado) o para etiquetar la sonda. Algunos ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetado por radiactividad, fluorescencia, luminiscencia, y enzimático.

Una directriz para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra por ejemplo en, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes. Part I. Theory y Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993.

Unión a Ligando Específica

Como se indica en el presente documento, la alteración en una región cromosómica ocupada por un gen de Jak3 o alteración en la expresión de un gen de Jak3, también se puede detectar mediante identificación sistemática de la alteración o alteraciones en una secuencia o nivel de expresión de un polipéptido codificado por un gen de Jak3. Se pueden usar diferentes tipos de ligandos, tales como anticuerpos específicos. En una realización, la muestra se pone en contacto con un anticuerpo específico para un polipéptido codificado por un gen de Jak3 y la formación de un complejo inmune se determina posteriormente. Se pueden usar diversos métodos para detectar un complejo inmune, tales como ELISA, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMa). En una realización, los niveles se miden por ELISA usando un anticuerpo dirigido a la SEQ ID NO: 1; transferencia de Western usando un anticuerpo dirigido a la SEQ ID NO: 1; espectroscopía de masas, enfoque isoeléctrico, o técnicas basadas en electroforesis que se dirigen a epítopos de la SEQ ID NO: 1; o una combinación de los mismos.

Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, así como fragmentos o derivados del mismo que tienen sustancialmente la misma especificidad de antígeno. Los fragmentos incluyen las regiones Fab, Fab'2, o CDR. Los derivados incluyen anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos humanizados, o anticuerpos polifuncionales. Un anticuerpo específico para un polipéptido codificado por un gen de Jak3 puede ser un anticuerpo que se une de forma selectiva a dicho polipéptido, en particular, un anticuerpo generado contra un polipéptido codificado por un gen de Jak3 o un fragmento del mismo que contiene un epítopo. Aunque se puede producir una unión no específica hacia otros antígenos, la unión al polipéptido diana se produce con una afinidad más elevada y se puede discriminar de forma fiable de la unión no específica. El método puede comprender poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo específico para un tipo silvestre o una forma alterada de un polipéptido codificado por un gen de Jak3, y determinar la presencia de un complejo inmune. Opcionalmente, la muestra se puede poner en contacto con un soporte revestido con un anticuerpo específico para el tipo silvestre o la forma alterada de un polipéptido codificado por un gen de Jak3. La muestra se puede poner en contacto de forma simultánea, o en paralelo, o de forma secuencial, con diversos anticuerpos específicos para diferentes formas de un polipéptido codificado por un gen de Jak3, tal como un tipo silvestre y diversas formas alteradas de los mismos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Terapia Genética y Métodos de Reemplazo de Proteína

La administración de ácidos nucleicos en células viables se puede realizar ex vivo, in situ, o in vivo mediante el uso de vectores, tales como vectores virales (por ejemplo, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, o retrovirus), o ex vivo mediante el uso de métodos físicos de transferencia de ADN (por ejemplo, liposomas o tratamientos químicos). Las técnicas no limitantes adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano y el método de precipitación con fosfato cálcico (Véase, por ejemplo, Anderson, Nature, 392 (6679): 25 (1998)). La introducción de un ácido nucleico o un gen que codifica un polipéptido de la invención también se puede conseguir con sustratos extracromosómicos (expresión transitoria) o cromosomas artificiales (expresión estable). Las células también se pueden cultivar ex vivo en presencia de composiciones terapéuticas de la presente invención con el fin de proliferar o producir un efecto deseado o actividad en dichas células. Las células tratadas se pueden introducir a continuación in vivo con fines terapéuticos.

Los ácidos nucleicos se pueden insertar en vectores y usar en vectores de terapia genética. Como vectores de transferencia genética se ha usado un número de virus, incluyendo los papovavirus, por ejemplo, SV40 (Madzak et al., (1992) J Gen Virol. 73 (Pt 6): 1533-6), adenovirus (Berkner (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158: 39-66; Berkner (1988) Biotechniques, 6 (7): 616-29; Gorziglia y Kapikian (1992) J Virol. 66 (7): 4407-12; Quantin et al., (1992) Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (7): 2581-4; Rosenfeld et al., (1992) Cell. 68 (1): 143-55; Wilkinson et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20 (9): 2233-9; Stratford-Perricaudet et al., (1990) Hum Gene Ther. 1 (3): 241-56), virus Vaccinia (Moss (1992) Curr Opin Biotechnol. 3 (5): 518-22), virus adeno-asociado (Muzyczka, (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158: 97-129; Ohi et al., (1990) Gene. 89 (2): 279-82), virus del herpes incluyendo VhS y EBV (Margolskee (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158: 67-95; Johnson et al., (1992) Brain Res Mol Brain Res. 12 (1-3): 95-102; Fink et al., (1992) Hum Gene Ther. 3 (1): 11-9; Breakefield y Geller (1987) Mol Neurobiol. 1 (4): 339-71; Freese et al., (1990) Biochem Pharmacol. 40 (10): 2189-99), y retrovirus de aves (Bandyopadhyay y Temin (1984) Mol Cell Biol. 4 (4): 749-54; Petropoulos et al., (1992) J Virol. 66 (6): 3391-7), murine (Miller et al., (1992) Mol Cell Biol. 12 (7): 3262-72; Miller et al., (1985) J Virol. 55 (3): 521-6; Sorge et al., (1984) Mol Cell Biol. 4 (9): 1730-7; Mann y Baltimore (1985) J Virol. 54 (2): 401-7; Miller et al., (1988) J Virol. 62 (11): 4337-45), y de origen humano (Shimada et al., (1991) J Clin Invest. 88 (3): 1043-7; Helseth et al., (1990) J Virol. 64 (12): 6314-8; Page et al., (1990) J Virol. 64(11):5270-6; Buchschacher y Panganiban (1992) J Virol. 66 (5): 2731-9).

Los ejemplos no limitantes de técnicas de transferencia genética in vivo incluyen transfección con vectores virales (por ejemplo, retrovirales) (véase el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.252.479) y transfección mediada por proteína-liposoma de revestimiento viral (Dzau et al., (1993) Trends in Biotechnology 11: 205-210). Por ejemplo, en la técnica se conoce generalmente vacunas de ADN desnudo; véase Brower, (1998) Nature Biotechnology, 16: 1304-1305. Los vectores para terapia genética se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (véase, por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.328.470) mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia genética puede incluir el vector de terapia genética en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de administración genética. Como alternativa, cuando el vector de administración genética completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración genética.

Para revisiones de protocolos y métodos de terapia genética véase Anderson et al., (1992) Science 256: 808-813; documentos de Patente de Estados Unidos N.os 5.252.479, 5.747.469, 6.017.524, 6.143.290, 6.410.010 6.511.847 8.398.968; y 8.404.653; y Publicaciones de Solicitud de Estados Unidos N.os 2002/0077313 y 2002/00069. Para un ejemplo de tratamiento de terapia genética en seres humanos véase Porter et al., NEJM 2011 365: 725-733 y Kalos et al., Sci. Transl. Med. 2011. 201 3 (95): 95. Para revisiones adicionales de tecnología de terapia genética, véase Friedmann (1989) Science, 244: 1275-1281; Verma, Scientific American: 68-84 (1990); Miller (1992) Nature, 357: 455-460; Kikuchi et al., (2008) J Dermatol Sci. 50 (2): 87-98; Isaka et al., (2007) Expert Opin Drug Deliv. 4 (5): 56171; Jager et al,. (2007) Curr Gene Ther. 7 (4): 272-83; Waehler et al., (2007) Nat Rev Genet. 8 (8): 573-87; Jensen et al., (2007) Ann Med. 39 (2): 108-15; Herweijer et al., (2007) Gene Ther. 14 (2): 99-107; Eliyahu et al., (2005) Molecules 10(1): 34-64; y Altaras et al., (2005) Adv Biochem Eng Biotechnol. 99: 193-260.

Métodos de Administración de Proteína

La terapia de reemplazo de proteínas puede aumentar la cantidad de proteínas mediante la introducción exógena de proteínas de tipo silvestre o biológicamente funcionales mediante infusión. Un polipéptido de reemplazo se puede sintetizar de acuerdo con técnicas químicas conocidas o se puede producir y purificar mediante técnicas de biología molecular conocidas. La terapia de reemplazo de proteínas se ha desarrollado para diversos trastornos. Por ejemplo, una proteína de tipo silvestre se puede purificar a partir de un sistema de expresión celular recombinante (por ejemplo, células de mamífero o células de insecto, véase el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.580.757 de Desnick et al.; documentos de Patente de Estados Unidos N.os 6.395.884 y 6.458.574 de Selden et al.; documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.461.609 de Calhoun et al.; documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.210.666 de Miyamura et al.; documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.083.725 de Selden et al.;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.451.600 de Rasmussen et al.; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.236.838 de Rasmussen et al., y el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.879.680 to Ginns et al.), placenta humana, o leche animal (véase el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.188.045 de Reuser et al.), u otras fuentes conocidas en la técnica. Después de la infusión, la proteína exógena puede ser absorbida por tejidos a través de un mecanismo no específico o mediado por receptor.

Un polipéptido codificado por un gen de Jak3 o un compuesto modulador de Jak3 también se puede administrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido y la molécula se pueden administrar usando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. Se puede usar una bomba (véase Sefton (1987) Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., (1980) Surgery 88: 507; Saudek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321: 574). Se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability. Drug Product Design and Performance. Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy et al., (1985) Science 228: 190; During et al., (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 71: 105). Un sistema de liberación controlada se puede colocar en la proximidad de la diana terapéutica, por lo que de ese modo s olo se requiere una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, mencionado anteriormente, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science (1990) 249: 1527-1533).

Inhibidores

Las citoquinas se producen para activar las células vecinas para comunicar las señales de peligro entre sí y propagar y amplificar la respuesta inflamatoria. A lo largo de los años, se aprendió cómo neutralizar estas citoquinas con el bloqueo de anticuerpos y cómo inhibir su señalización en las células que responden mediante la inhibición de la proteína de molécula pequeña tirosina quinasa. Existen fármacos aprobados por la FDA para ambos enfoques. Siempre que sea posible, se seguirán las formulaciones tópicas de moléculas pequeñas que deberían mejorar la eficacia y limitar la toxicidad sistémica (índices terapéuticos mejorados) alentando la evaluación clínica en AA de otros inhibidores de molécula pequeña en la línea biofarmacéutica.

Para bloquear la señalización de receptores de citoquinas, se pueden usar inhibidores de JAK3 tópicos y/u orales como se describe en el presente documento (por ejemplo, tofacitinib (CP690550), R348 y VX-509)), que han demostrado seguridad preliminar y eficacia en pacientes con RA.

Los inhibidores pueden comprender péptidos (tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos), moléculas pequeñas, ácidos nucleicos (tales como ARNsi o ARN no codificante), u otros agentes) que se pueden unir a una molécula polipeptídica codificada por un gen de interés y/o moléculas que tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad biológica de una proteína de interés o su expresión.

Como se usa en el presente documento, un "inhibidor de Jak 3" puede ser un compuesto que interactúa con un gen Jak 3, o una proteína o polipéptido Jak 3, e inhibe su actividad y/o su expresión. El compuesto puede disminuir la actividad o expresión de una proteína codificada por Jak 3. Un inhibidor de Jak3 puede ser un compuesto modulador de Jak3.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor de Jak3 seleccionado entre el grupo que consiste en: decernotinib, tofacitinib; inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923); NSC114792; PF-956980; un ARN no codificante o ADN no codificante que es específico para un ácido nucleico que codifica un polipéptido de JAK3; y un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3 para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida capilar seleccionado entre el grupo que consiste en alopecia areata y alopecia androgénica.

Un inhibidor de Jak 3 puede ser un fragmento peptídico que se une a una proteína que comprende la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el fragmento puede incluir cualquier porción de aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. El fragmento puede comprender aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 30 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 40 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 50 aminoácidos consecutivos, aproximadamente 60 aminoácidos consecutivos, o aproximadamente 75 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos incluyen todas las longitudes de aminoácido posibles entre e incluyendo aproximadamente 8 y aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 70 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 100 aminoácidos, o entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100 aminoácidos. estos fragmentos peptídicos se pueden obtener en el mercado o se pueden sintetizar mediante métodos de síntesis en fase líquida o en fase sólida (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Un inhibidor de la solicitud puede ser una proteína, tal como un anticuerpo (monoclonal, policlonal, humanizado, quimérico, o completamente humano), o un fragmento de unión de al mismo, dirigido contra un polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 1. Un fragmento de anticuerpo puede ser una forma de un anticuerpo que no sea la forma de longitud completa e incluye porciones o componentes que existen dentro del anticuerpo de longitud completa, además de los fragmentos de anticuerpo que se han diseñado. Los fragmentos de anticuerpos pueden incluir Fv de una sola cadena (scFv), diacuerpos, Fv, y (Fab')2, triacuerpos, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de las CDR, regiones variables, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, regiones marco conservadas, regiones constantes, y similares (véase, Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Los anticuerpos se pueden obtener en el mercado, se pueden generar a medida, o se pueden sintetizar contra un antígeno de interés de acuerdo con los métodos establecidos en la técnica (véase Roland E. Kontermann y Stefan Dübel (editores), Antibody Engineering. Vol. I y II, (2010) 2a ed., Springer; Antony S. Dimitrov (editor), Therapeutic Anticuerpos: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), (2009), Humana Press; Benny Lo (editor) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), (2004) Humana Press.

Un inhibidor de la solicitud también puede ser una molécula pequeña que se une a una proteína e interrumpe su función. Las moléculas pequeñas son un grupo diverso de sustancias sintéticas y naturales que generalmente tienen pesos moleculares bajos. Se pueden aislar a partir de fuentes naturales (por ejemplo, plantas, hongos, microbios y similares), se obtienen en el mercado y/o están disponibles como bibliotecas o colecciones, o se sintetizan. Las moléculas pequeñas candidatas que modulan una proteína se pueden identificar mediante identificación sistemática in silico o identificación sistemática de alto rendimiento (HTP) de bibliotecas combinatorias. La mayoría de los productos farmacéuticos convencionales, tales como aspirina, penicilina y muchos agentes quimioterapéuticos, son moléculas pequeñas, se pueden obtener en el mercado, se pueden sintetizar por vía química, o se pueden obtener a partir de bibliotecas aleatorias o combinatorias (Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5 (1): 32-6). El agente puede ser una molécula pequeña que se une, interactúa, o se asocia con una proteína diana o ARN. Una molécula pequeña de ese tipo puede ser una molécula orgánica que, cuando la diana es una diana intracelular, es capaz de penetrar la bicapa lipídica de una célula para interactuar con la diana. Tales moléculas pequeñas incluyen toxinas, agentes quelantes, metales y compuestos metaloides. Las moléculas pequeñas se pueden unir o conjugar con un agente de direccionamiento con el fin de guiar de forma específica la molécula pequeña a una célula particular.

Se pretende que las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 de la solicitud se administren al sujeto una vez (por ejemplo, como una sola inyección o deposición). Como alternativa, se pretende que las proteínas Jak3 y los compuestos moduladores de Jak3 una o dos veces al día a un sujeto con necesidad del mismo durante un periodo de aproximadamente dos a aproximadamente veintiocho días, o de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. También se pretende la administración de las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 una o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 veces al año, o una combinación de los mismos.

Además, las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 de la solicitud se pueden coadministrar con otro agente terapéutico. En algunas realizaciones, el compuesto modulador de Jak3 (por ejemplo, un inhibidor de Jak3) se puede coadministrar con un inhibidor de Jak1/Jak2 (por ejemplo, un inhibidor de molécula pequeña de Jak1/Jak2, un anticuerpo terapéutico dirigido a Jak1, un anticuerpo terapéutico dirigido a Jak2, un ARNsi dirigido a Jak1, o un ARNsi dirigido a Jak2). Los ejemplos no limitantes de inhibidores de molécula pequeña de Jak1/Jak2 incluyen: AG490 (Caceres-Cortes, (2008) Anticancer Agents Med Chem. 8 (7): 717-22); CYT387 (Pardanani et al., (2009) Leukemia 23 (8): 1441-5; Monaghan et al., (2011) Leukemia. 25 (12): 1891-9); SB1518 (William et al., (2011) J Med Chem. 54 (13): 4638-58; Hart et al., (2011) Leukemia. 25 (11): 1751-9); LY3009104 (Baricitinib; INCB28050) (Incyte y Lilly); TG101348 (Wernig et al., (2008) Cancer Cell. 13 (4): 311-20; Pardanani et al., (2011) J Clin Oncol. 29(7):789-96); INCB018424 (Incyte; Shi et al., (2011) J Clin Pharmacol. 51 (12): 1644-54); CEP-701 (Cephalon; Hexner et al., (2008) Blood. 111 (12): 5663-71); GLPG0634 (Galapagos; véase

http://www.glpg.com/index.php/randd/pipeline/glpg0634-ra/); CYT387 (YM Biosciences; Pardanani (2009) Leukemia. 23 (8): 1441-5); AZD1480 (Selleckchem, Houston TX; Scuto et al., (2011) Leukemia, 25 (3): 538-50); y BMS-911543 (Purandare et al., (2012) Leukemia. 26 (2): 280-8. En una realización, la inhibición de JAK1 también proporciona un modo de inhibición de jAk3 (por ejemplo, véase Haan et al., (2011) Chem Biol. 18(3):314-23).

Los inhibidores de molécula pequeña de JAK1/2 en desarrollo clínico incluyen a) INCB018424, tópico y oral; actividad 5 nM (Incyte); b) CEP-701 (Cephalon); y c) TG101348.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

imagen6

Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, la administración de la cantidad eficaz de las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 que se pretende dar al sujeto puede comprender la cantidad total de producto genético administrado durante todo el régimen de dosificación.

Las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 (por ejemplo, un inhibidor de Jak3) están destinados a su administración a un sujeto por cualquier medio adecuado para administrar las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 a las células del sujeto, tales como la dermis, epidermis, células de la papila dérmica, o células del folículo piloso. Por ejemplo, se pretende la administración de las proteínas Jak3 y compuestos moduladores de Jak3 mediante métodos adecuados para transfectar células. Los métodos de transfección para células eucariotas se conocen bien en la técnica e incluyen la inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia de liposomas o transferencia mediada por materiales lipófilos; administración mediada por receptores de ácido nucleico, biobalística o aceleración de partículas; precipitación con fosfato cálcico y transfección mediada por vectores virales.

Por ejemplo, se pretende la administración de la proteína Jak3 o el compuesto modulador de Jak3 (por ejemplo, un ARNsi de Jak3) ya sea como ARN, en conjunto con un reactivo de la administración, o como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido recombinante o vector viral) que comprende secuencias que expresan el producto genético. Los reactivos de administración adecuados para la administración de Jak3 o compuesto modulador de globulina de Jak3 incluyen el reactivo lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; o policaciones (por ejemplo, polilisina), o liposomas.

Una dosis terapéuticamente eficaz de Jak3 o un compuesto modulador de Jak3 puede depender de una serie de factores conocidos por las personas con una experiencia habitual en la materia. La o las dosis de Jak3 o un compuesto modulador de Jak3 pueden variar, por ejemplo, dependiendo de la identidad, el tamaño y la afección del sujeto o muestra que se está tratando, además dependiendo de la vía mediante la cual se va a administrar la composición, si fuera aplicable, y el efecto que el profesional desea que tenga Jak3 o un compuesto modulador de Jak3 sobre el ácido nucleico o polipéptido de la invención. Un experto en la materia puede determinar fácilmente estas cantidades.

Las composiciones de la presente solicitud se pueden formular y administrar para reducir los síntomas asociados con un trastorno de pérdida capilar por cualquier medio que produzca el contacto del principio activo con el sitio de acción del agente en el cuerpo de un sujeto, tal como un ser humano o un animal (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). Se pueden administrar mediante cualquier medio convencional disponible para su uso en combinación con productos farmacéuticos, ya sea como principios activos terapéuticos individuales o en una combinación de principios activos terapéuticos. Se pueden administrar solos, pero generalmente se administran con un vehículo farmacéutico seleccionado basándose en la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica convencional.

Una dosis terapéuticamente eficaz de los compuestos moduladores de Jak3 puede depender de una serie de factores conocidos por los expertos en la materia. La o las dosis de los compuestos moduladores de Jak3 pueden variar, por ejemplo, dependiendo de la identidad, el tamaño y la afección del sujeto o la muestra que se está tratando, además dependiendo de la vía mediante la cual se administrará la composición, si fuera aplicable, y el efecto que el profesional desea que los compuestos moduladores de Jak3 tengan sobre el ácido nucleico o polipéptido de la invención. Un experto en la materia puede determinar fácilmente estas cantidades se pueden determinar. Cualquiera de las aplicaciones terapéuticas que se describen en el presente documento se puede aplicar a cualquier sujeto que necesite tal terapia, incluyendo, por ejemplo, un mamífero tal como un perro, un gato, una vaca, un caballo, un conejo, un mono, un cerdo, una oveja, una cabra, o un ser humano.

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la invención se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Las composiciones terapéuticas de la invención se pueden formular para una variedad de vías de administración, incluyendo la administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente se pueden encontrar en Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed. Lippincott Williams & Wilkins., Philadelphia, PA (2000).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para administración sistémica, una inyección es útil, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden formular en soluciones líquidas, por ejemplo, en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, las composiciones terapéuticas se pueden formular en forma sólida y volverse a disolver o suspender inmediatamente antes de su uso. También se incluyen formas liofilizadas. Las técnicas farmacéuticas de la presente invención se caracterizan por ser al menos estériles y libres de pirógenos. Estas formulaciones farmacéuticas incluyen formulaciones para uso humano y veterinario.

De acuerdo con la invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Se puede usar cualquier medio o agente convencional que sea compatible con el compuesto activo. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios.

La solicitud también desvela un kit que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto modulador de Jak3 identificado los ensayos de identificación sistemática de la invención empaquetados con instrucciones de uso. Para moduladores que son antagonistas de la actividad de una proteína Jak3, o que reducen la expresión de una proteína Jak3, las instrucciones podrían especificar el uso de la composición farmacéutica para estimular la pérdida de cabello en la superficie corporal de un mamífero (por ejemplo, brazos, piernas, área del bikini, cara).

Para los compuestos moduladores de Jak3 que son agonistas de la actividad de una proteína Jak3 o para aumentar la expresión de una o más proteínas codificadas por genes de Jak3, las instrucciones podrían especificar el uso de la composición farmacéutica para regular crecimiento del cabello. En una realización, las instrucciones podrían especificar el uso de la composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de pérdida capilar.

Una composición farmacéutica que contiene un compuesto modulador de Jak3 se puede administrar en conjunto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos que se discuten en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas de ese tipo pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a polipéptidos codificados por genes que comprenden un gen de Jak3, o variantes de los mismos, o agonistas y antagonistas de un polipéptido codificado por un gen de Jak3. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible, estéril, incluyendo solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, medicamentos u hormonas.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto modulador de Jak3 (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, si fuera necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los que se enumeran en el presente documento. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos ejemplos de métodos de preparación útiles son el secado al vacío y el secado por congelación para obtener un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada y filtrada del mismo

En algunas realizaciones, el inhibidor de Jak3 se puede aplicar mediante sistemas de administración transdérmica, que liberan lentamente el compuesto activo para absorción percutánea. Se pueden usar potenciadores de permeación para facilitar la penetración transdérmica de los factores activos en los medios acondicionados. Los parches trans térmicos se describen, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.407.713; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.352.456; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.332.213;

documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.336.168; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.290.561;

documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.254.346; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.164.189;

documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.163.899; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.088.977;

documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.087.240; documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.008.110; y documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.921.475.

Se pueden usar diversas vías de administración y diversos sitios de implantación celular, tales como, subcutánea o intramuscular, con el fin de introducir la población agregada de células en un sitio de preferencia. Una vez implantadas en un sujeto (tal como un ratón, rata o ser humano), las células agregadas pueden estimular a continuación la formación de un folículo piloso y el posterior crecimiento de una estructura capilar en el sitio de introducción. En otra realización, las células transfectar as (por ejemplo, células que expresan una proteína codificada por un gen de Jak3 se implantan en un sujeto para estimular la formación de folículos pilosos dentro del sujeto. En otras realizaciones, las células transfectadas son células obtenidas a partir del bulbo terminal de un folículo piloso (tal como células de la papila dérmica o células de la vaina dérmica). Se pueden introducir (o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

implantar) células agregadas (por ejemplo, células que crecen en un cultivo de gota colgante) o células transfectadas (por ejemplo, células producidas como se describe en el presente documento) mantenidas durante 1 o más pases en un sujeto (tal como una rata, ratón, perro, gato, ser humano, y similares).

La administración subcutánea puede hacer referencia a la administración justo por debajo de la piel (es decir, debajo de la dermis). Generalmente, el tejido subcutáneo es una capa de grasa y tejido conectivo que alberga vasos sanguíneos y nervios más grandes. El tamaño de esta capa varía en todo el cuerpo y de persona a persona. La Superficie de contacto entre las capas subcutánea y muscular puede ser abarcada por la administración subcutánea.

Este modo de administración puede ser factible cuando la capa subcutánea es lo suficientemente delgada como para que los factores presentes en las composiciones puedan migrar o difundirse desde el lugar de administración y ponerse en contacto con las células del folículo piloso responsables de la formación del cabello. Por lo tanto, cuando se utiliza la administración intradérmica, el bolo de composición administrado se localiza próximo a la capa subcutánea.

La administración de los agregados celulares (tales como agregados de DP o DS) no se limita a una sola vía, sino que puede abarcar la administración mediante múltiples vías. Por ejemplo, las administraciones a modo de ejemplo mediante múltiples vías incluyen, entre otras, una combinación de administración intradérmica e intramuscular, o administración intradérmica y subcutánea. Las administraciones múltiples pueden ser secuenciales o simultáneas. Otros modos de aplicación mediante múltiples vías serán evidentes para el experto en la materia.

En otras publicaciones, este método de implantación será un tratamiento de una sola vez para algunos sujetos. En otras situaciones de la invención, se requerirán múltiples implantaciones de terapia celular. En algunos casos, las células usadas para la implantación generalmente serán células modificadas por ingeniería genética específicas del sujeto. En otra realización, se pueden usar células obtenidas a partir de una especie diferente u otro individuo de la misma especie. Por no tanto, estas células pueden requerir la administración de un inmunosupresor para prevenir el rechazo de las células implantadas. Dichos métodos también se han descrito en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.419.661 y la publicación de la solicitud PCT WO 2001/32840.

En una realización, un inhibidor de la invención se puede incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración, por ejemplo, el inhibidor y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Se puede usar cualquier medio o agente convencional que sea compatible con el compuesto activo. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos suplementarios.

Una composición farmacéutica de la invención se puede administrar en conjunto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos que se describen en el presente documento. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos dirigidas a polipéptidos. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente, como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible, estéril, que incluye solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, medicamentos u hormonas.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación o ingestión), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites No volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o el hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (que son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EM™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil capacidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio disolvente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un poliol farmacéuticamente aceptable tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, en la composición puede ser útil incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir aproximadamente al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el inhibidor (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo o molécula pequeña) o un agonista de la invención en la cantidad requerida y la combinación de ingredientes que se enumeran en el presente documento, si fuera necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los enumerados en el presente documento. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos ejemplos de métodos de preparación útiles son el secado al vacío y la liofilización para obtener un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada y filtrada del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o formando comprimidos mediante compresión. Para la finalidad de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y se puede usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido y posteriormente se pueden tragar.

Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esterotes; una sustancia de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o saborizante de naranja.

La administración sistémica también se puede realizar por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, en la formulación se usan agentes penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, y se incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede presentar a través del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica.

La dosis administrada puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición suficiente para mejorar los síntomas de la alopecia areata, y puede variar dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del principio activo y su modo y vía de administración; edad, sexo, salud y peso del receptor; naturaleza y alcance de los síntomas; tipo de tratamiento simultáneo, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado.

En algunas realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak3 al sujeto en una cantidad de aproximadamente 0,0001 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,00025 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 0,0005 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,00075 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 0,001 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,0025 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 0,005 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,0075 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,025 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,05 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,075 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,25 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,75 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 25 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 75 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 150 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 250 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 300 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 400 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 450 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 550 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 600 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 650 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 700 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 800 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 850 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 900 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 950 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 2000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 3000 pg/kg de peso corporal,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 4000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 6000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 7000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 8000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 9500 pg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10.000 pg/kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de JAK3 al sujeto en una cantidad de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1,5mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 4,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente

5.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 6,5 mg/kg de peso

corporal, aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 7,5 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 9,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 11,0 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 11,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 13 mg/kg de peso corporal, aproximadamente

13.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 14 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 14,5 mg/kg de peso

corporal, aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 15,5 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 16 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 16,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 17 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 17,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 18 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 19,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 21,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 22 mg/kg de peso corporal, aproximadamente

22.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 23 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 23,5 mg/kg de peso

corporal, aproximadamente 24 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 24,5 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 25,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 26 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 26,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 27 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 27,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 28 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 29,5 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal.

En otras realizaciones, se pretende la administración del inhibidor de Jak3 al sujeto en una composición farmacéutica seleccionada entre solución, pomada, ungüento, gel y crema. En algunas realizaciones, el inhibidor de Jak3 está contenido en una composición farmacéutica tópica a una concentración seleccionada entre aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,2%, aproximadamente un 0,3%, aproximadamente un 0,4%,

aproximadamente un 0,5%, aproximadamente un 0,6%, aproximadamente un 0,7%, aproximadamente un 0,8%,

aproximadamente un 0,9%, aproximadamente un 1,0%, aproximadamente un 1,1 %, aproximadamente un 1,2%,

aproximadamente un 1,3%, aproximadamente un 1,4%, aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 1,6%,

aproximadamente un 1,7%, aproximadamente un 1,8%, aproximadamente un 1,9%, aproximadamente un 2,0%,

aproximadamente un 2,1 %, aproximadamente un 2,2%, aproximadamente un 2,3%, aproximadamente un 2,4%,

aproximadamente un 2,5%, aproximadamente un 2,6%, aproximadamente un 2,7%, aproximadamente un 2,8%,

aproximadamente un 2,9%, o aproximadamente un 3,0%, aproximadamente un 3,5%, aproximadamente un 4%,

aproximadamente un 4,5 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 5,5 %, aproximadamente un 6 %,

aproximadamente un 6,5 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 7,5 %, aproximadamente un 8 %,

aproximadamente un 8,5 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 9,5 %, o de aproximadamente un

10 %.

El compuesto modulador de Jak3 (por ejemplo, un compuesto que se describe en el presente documento que se refiere a Jak3, tal como un inhibidor de jAK3 de molécula pequeña), se puede coadministrar con un segundo inhibidor de JAK (tal como un inhibidor de JAK1/2). En una realización, el inhibidor de JAK1/2 se puede administrar como una crema tópica. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del inhibidor de JAK1/2 de molécula pequeña está presente a una concentración de aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,2%, aproximadamente un 0,3%, aproximadamente un 0,4%, aproximadamente un 0,5%, aproximadamente un 0,6%, aproximadamente

un 0,7%, aproximadamente un 0,8%, aproximadamente un 0,9%, aproximadamente un 1,0%, aproximadamente

un 1,1 %, aproximadamente un 1,2%, aproximadamente un 1,3%, aproximadamente un 1,4%, aproximadamente

un 1,5%, aproximadamente un 1,6%, aproximadamente un 1,7%, aproximadamente un 1,8%, aproximadamente

un 1,9%, aproximadamente un 2,0%, aproximadamente un 2,1 %, aproximadamente un 2,2%, aproximadamente

un 2,3%, aproximadamente un 2,4%, aproximadamente un 2,5%, aproximadamente un 2,6%, aproximadamente

un 2,7%, aproximadamente un 2,8%, aproximadamente un 2,9%, o aproximadamente un 3,0%. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del inhibidor de JAK1/2 administrado está presente a una concentración de

aproximadamente un 3,5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 4,5 %, aproximadamente un 5 %,

aproximadamente un 5,5 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 6,5 %, aproximadamente un 7 %,

aproximadamente un 7,5 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 8,5 %, aproximadamente un 9 %,

aproximadamente un 9,5 %, o de aproximadamente un 10 %.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones terapéuticas de la presente invención se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz para un 50 % de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Los agentes terapéuticos que presentan grandes índices terapéuticos son útiles. Se pueden usar composiciones terapéuticas que presentan algunos efectos secundarios tóxicos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende alguien con una experiencia habitual len la materia a la que pertenece la presente invención. A continuación, se describen métodos y materiales a modo de ejemplo, aunque en el presente documento también se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención.

Ejemplos

A continuación, se proporcionan ejemplos para facilitar una comprensión más completa de la invención. Los siguientes ejemplos ilustran los modos a modo de ejemplo para preparar y poner en práctica la invención. Sin embargo, del alcance de la invención no se limita a realizaciones específicas que se desvelan en estos Ejemplos, que son solamente con fines de ilustración, ya que para obtener resultados similares se pueden usar métodos alternativos.

Ejemplo 1 - Modelo de Trasplante de Ratón Para Alopecia Areata

La Alopecia areata (AA) es una de las enfermedades autoinmunes más prevalentes y se manifiesta como pérdida de pelo sin formación de cicatrices. El transcurso de la enfermedad es impredecible, y en la actualidad no hay tratamientos disponibles coherentemente eficaces. Aunque se carece de investigación en la patogénesis de la enfermedad y en el desarrollo de terapias dirigidas, la creación de un modelo de trasplante de ratón con una alta incidencia de enfermedad ha abierto nuevas posibilidades de experimentación preclínica.

Varias líneas de evidencia apoyan la eficacia potencial de los inhibidores de JAK3 en el tratamiento de AA: (1), un estudio de asociación de genoma completo de AA recientemente completado identificó una serie de locus con relevancia inmunológica asociada a genes, incluyendo los de IL-2/IL-2RA e IL-21; (2) los hallazgos iniciales en un modelo de ratón preclínico que sugirió que la interrupción de la señalización de IL-15/IL-15R mejora la enfermedad; y (3) los datos indican que los linfocitos T, dependientes de IL-7 e IL-15 para supervivencia, median la enfermedad en el modelo de ratón y en seres humanos.

Por lo tanto, los inventores evaluaron la eficacia de la inhibición de JAK3 en el desarrollo de alopecia en un modelo de ratón preclínico. Los injertos de piel en ratones C3H/HeJ alopécicos se trasplantaron a receptores de ratones C3H/HeJ no afectados y posteriormente se identificaron con un inhibidor de JAK3 administrado mediante bomba osmótica, vehículo administrado mediante bomba osmótica o inyección de PBS. Aunque 4/4 ratones tratados con PBS y 2/2 ratones tratados con bomba de vehículo desarrollaron alopecia a las seis semanas posteriores al trasplante, 0/5 ratones tratados con el inhibidor de Jak3 desarrollaron alopecia. El análisis de micromatrices de piel, tinciones inmunohistoquímicas de piel para infiltrado de linfocitos T y evaluaciones de marcadores séricos demostraron una disminución de los perfiles inflamatorios en ratones tratados con inhibidores de JAK3. En total, los hallazgos de los inventores sugieren que los inhibidores de JAK3 pueden ser un tratamiento eficaz en pacientes con AA.

Ejemplo 2 - Direccionamiento de la Respuesta del Efector Inmune en AA

Los mecanismos autoinmunes específicos subyacentes a la Alopecia Areata (AA) se han mantenido oscuros y, por lo tanto, la investigación clínica de AA históricamente se ha rezagado con respecto a otras enfermedades autoinmunes.

Identificar terapias eficaces, clínicamente relevantes, en modelos de ratón de alopecia areata.

Tanto en el modelo de AA de ser humano como en el modelo de AA de ratón, la regulación positiva de IL- 15/NKG2DL del folículo piloso (HF) local se identificó como señales inflamatorias fundamentales que reclutan/activan los linfocitos T CD8', probablemente los efectores inmunitarios de AA fundamentales responsables de la producción de IFN-gamma (y) y la citotoxicidad del folículo piloso (HF). Estas observaciones proporcionaron la justificación de los estudios para abordar terapéuticamente el IL-15/NKG2D.

Se ha mostrado que la vía de IL-15 se puede bloquear usando inhibidores de la proteína tirosina quinasa de JAK3 (PTKi).

PTKi de molécula pequeña previene la AA. 5 ratones se trataron de forma sistémica con tofacitinib (CP-69055; 10 mg/kg/día con una bomba Alzet). Entre tofacitinib es un inhibidor de JAK3 conocido por inhibir la señalización de IL-15 en ensayos de sangre completa humana. Ninguno de los ratones tratados desarrolló alopecia areata o linfadenopatía cutánea, mientras que los ratones no tratados manifestaron AA y linfadenopatía cutánea asociada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(Figura 1). Se buscarán enfoques de administración tópica para la reversión de AA en el modelo de ratón que tiene el mayor beneficio de un índice terapéutico mejorado para el desarrollo clínico.

Identificar biomarcadores de AA asociados a la enfermedad y su reversión con terapia eficaz en ratones C3H.

En ratones tratados se han evaluado biomarcadores celulares, inflamatorios y moleculares. La terapia dirigida con tofacitinib eliminó las células CD8+NKG2Dhi patógenas tanto de la piel como de los ganglios linfáticos de drenaje cutáneo y, además, biomarcadores inflamatorios de la piel regulados por disminución, incluyendo las moléculas del MHC y la firma de IFN asociada a AA (Figura 2). La expresión de en NKG2DL el HF se redujo aunque no se eliminó completamente (por ejemplo, expresión de H60 por inmunotinción) (Figuras 2 y 3), lo que indica la regulación positiva de H60 como un suceso proximal.

El análisis de perfiles transcripcionales de la piel tratada con respecto a la no tratada muestra una abrogación del tratamiento cutáneo con la firma de IFN. Estos perfiles transcripcionales murinos se integrarán por vía informática con los perfiles transcripcionales obtenidos a partir de biopsias de piel humana de sujetos alopécicos no tratados para identificar biomarcadores humanos dinámicos candidatos que están asociados con enfermedad estable frente a enfermedad dispersa con respecto a enfermedad progresiva con respecto a alopecia universal.

Interpretación de enfoques dirigidos a PTKi. Los PTKi varían en gran medida en la selectividad de sus quinasas diana. Para tofacitinib, la sensibilidad de JAK es mayor para JAK3 > JAK1 >> JAK2 (CI50 es 28-50 nM, 140-180 nM, 1000-5000 nM, en ensayos de sangre completa, respectivamente). En los ratones tratados, los niveles en suero de tofacitinib podrían ser 30-40 nM, y los impactos potenciales se evaluarán en la actividad tanto de JAK1 como de 3. Para ruxolitinib (un inhibidor de jAk1/2), la sensibilidad es JAK2 > JAK1 >> JAK3 (CI50 es 3,3 nM, 2,8 nM, y 428 nM para una inhibición de quinasa in vitro, respectivamente). Es probable que la inhibición de JAK farmacodinámica en el ratón sea transitoria ya que la dosificación de ruxolitinib es de una vez al día y la semivida en roedores es de 3-6 horas.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak3 puede ejercer actividad de inhibición selectiva de su diana de JAK3 a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 15 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 25 nM,

aproximadamente 30 nM, aproximadamente 35 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 45 nM,

aproximadamente 50 nM, o a aproximadamente 55 nM. Un inhibidor de Jak3 también puede ejercer actividad de inhibición selectiva de su diana de JAK3 a aproximadamente 60 nM, aproximadamente 65 nM, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 75 nM, aproximadamente 80 nM, aproximadamente 85 nM, aproximadamente 90 nM, aproximadamente 95 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 105 nM, aproximadamente 110 nM, aproximadamente 115 nM, aproximadamente 120 nM, aproximadamente 125 nM, aproximadamente 130 nM, o a aproximadamente 135 nM.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak3 también puede ejercer actividad de inhibición de su diana de JAK3, mientras que

también es capaz

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

de ejercer de forma indiscriminada 140 nM, aproximadamente 145 nM, 160 nM, aproximadamente 165 nM, 180 nM, aproximadamente 185 nM, 200 nM, aproximadamente 205 nM,

una actividad de aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

inhibición 150 nM, 170 nM, 190 nM, 210 nM,

de una diana de aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

JAK1, a 155 nM, 175 nM, 195 nM, 215 nM,

aproximadamente 220 nM, o a aproximadamente 225 nM.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak3 también puede ejercer actividad de inhibición de su diana de JAK3 a

aproximadamente 250 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, aproximadamente 400 nM,

aproximadamente 450 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 650 nM, aproximadamente 700 nM,

aproximadamente 750 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 850 nM, aproximadamente 900 nM, o a aproximadamente 950 nM.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak3 también puede ejercer actividad de inhibición de su diana de JAK3, mientras que también es capaz de ejercer de forma indiscriminada una actividad de inhibición de una diana de JAK2, a aproximadamente 1000 nM, aproximadamente 1250 nM, aproximadamente 1500 nM, aproximadamente 1750 nM,

aproximadamente 2000 nM, aproximadamente 2250 nM, aproximadamente 2500 nM, aproximadamente 2750 nM,

aproximadamente 3000 nM, aproximadamente 3250 nM, aproximadamente 3500 nM, aproximadamente 3750 nM,

aproximadamente 4000 nM, aproximadamente 4250 nM, aproximadamente 4500 nM, aproximadamente 4750 nM,

aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 5250 nM, aproximadamente 5500 nM, aproximadamente 5750 nM,

aproximadamente 6000 nM, aproximadamente 6250 nM, aproximadamente 6500 nM, aproximadamente 6750 nM,

aproximadamente 7000 nM, aproximadamente 7250 nM, aproximadamente 7500 nM, aproximadamente 7750 nM, o a aproximadamente 8000 nM.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak1/2 puede ejercer actividad de inhibición selectiva de su diana de JAK1 y/o JAK2 a aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente 1,0 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 2,0 nM,

aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 3,0 nM, aproximadamente 3,5 nM, aproximadamente 4,0 nM,

aproximadamente 4,5 nM, aproximadamente 5,0 nM, aproximadamente 5,5 nM, 6,0 nM, aproximadamente 6,5 nM,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 7,0 nM, aproximadamente 7,5 nM, aproximadamente 8,0 nM, aproximadamente 8,5 nM,

aproximadamente 9,0 nM, aproximadamente 9,5 nM, o aproximadamente 10,0 nM. Por ejemplo, un inhibidor de Jak1/2 puede ejercer actividad de inhibición selectiva de su diana de JAK1 y/o JAK2 a aproximadamente 15 nM,

25 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 35 nM,

45 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 55 nM,

65 nM, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 75 nM,

85 nM, aproximadamente 90 nM, aproximadamente 95 nM,

150 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 250 nM,

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

20 nM, 40 nM, 60 nM, 80 nM, 100 nM,

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente

aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, o a aproximadamente 400 nM.

Por ejemplo, un inhibidor de Jak1/2 también puede ejercer actividad de inhibición de su diana de JAK1 y/o JAK2, a la vez que también es capaz de ejercer de forma indiscriminada actividad de inhibición de una diana de JAK3, a

aproximadamente 425 nM, aproximadamente 525 nM, aproximadamente 625 nM, aproximadamente 725 nM, aproximadamente 825 nM,

aproximadamente 450 nM, aproximadamente 550 nM, aproximadamente 650 nM, aproximadamente 750 nM, aproximadamente 850 nM,

aproximadamente 475 nM, aproximadamente 575 nM, aproximadamente 675 nM, aproximadamente 775 nM, aproximadamente 875 nM,

aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM,

aproximadamente 925 nM, aproximadamente 950 nM, aproximadamente 975 nM, o a aproximadamente 1000 nM.

Para activar la diana de la proteína Jak en la piel, la piel se debería penetrar a aproximadamente 0,5 mm, aproximadamente 1 mm, aproximadamente 1,5 mm, aproximadamente 2 mm, aproximadamente 2,5 mm, aproximadamente 3 mm, aproximadamente 3,5 mm, o a aproximadamente 4 mm. Dependiendo de la profundidad de penetración, la concentración de un inhibidor de JAK, tal como un inhibidor de JAK1/2 o un inhibidor de JAK3, puede variar de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 5000 nM. A los intervalos de concentración más elevados, un inhibidor de JAK puede provocar un efecto inhibitorio no solamente de su diana sino también de otras proteínas JAK.

Integración de Perfiles de Expresión Genética de Ser Humano y Ratón

Las representaciones de cinta que se muestran en la Figura 4 representan datos de micromatrices de perfiles de expresión de piel normalizados de genes seleccionados de ratones tratados con 13 semanas de inhibidor de Jak3 CP690550 y control de PBS. en resumen, después de 13 semanas de tratamiento con el inhibidor de Jak3, la piel se recogió y se sometió a análisis de micromatrices y se comparó con la de los ratones tratados con PBS. Los datos muestran la eliminación relacionada con el tratamiento de las quimioquinas de respuesta a IFN y marcadores de los efectores citotóxicos CD8. Las matrices de expresión de ratón y ser humano se integrarán para comparar los perfiles de expresión y, por último, la respuesta al tratamiento.

Ejemplo 3 - Tratamiento sistémico con JAK3i

Los linfocitos T CD8ap+ de "tipo NK " se expanden de forma masiva en la piel alopécica y LN de drenaje, y son necesarios para la transferencia mediada por linfocitos T, lo que implica a este subconjunto de células citotóxicas como los efectores patógenos probables.

IL-15 es una citoquina fundamental responsable de la inducción de efectores de T CD8 in vitro. Además, la IL-15 es producida por células epiteliales intestinales y es un precipitante conocido de la citotoxicidad de CD8 en la enfermedad celíaca.

La alopecia areata está marcada por la regulación positiva de IL-15/IL-15Ra en el folículo piloso humano y murino e implica a esta citoquina como un desencadenante de órgano final de la autoreactividad mediada por CD8 en AA.

El bloqueo sistémico de IL-15 con un PTKi de JAK3 de molécula pequeña previno de forma eficaz la alopecia areata, eliminando la expansión de la población pato génica de CD8 de tipo NK y eliminando la firma inflamatoria en la piel. La FIG. 22 muestra la reversión de la enfermedad establecida con terapias tópicas.

Ejemplo 4 - La Identidad Celular de los Linfocitos T Citotóxicos en Alopecia Areata Define una Estrategia Terapéutica

La Alopecia areata (AA) es una enfermedad autoinmune común que da como resultado un ataque inmunitario en el folículo piloso-. Aunque los linfocitos T se han implicado en el proceso de la enfermedad, no se han determinado las vías que subyacen a su activación—. Antes del estudio GWAS, la base genética de AA estaba en gran parte indefinida. De forma inesperada, se identificó una región de fuerte asociación dentro del grupo de genes ULBP en el cromosoma 6q25.1, que codifica ligandos activadores del receptor de linfocitos citolíticos naturales, NKG2D, que nunca antes se había implicado en una enfermedad autoinmune. Guiados por los estudios GWAS que implican ligandos NKG2D (NKG2DL)3, aquí se identificaron linfocitos T CD8+ de 'tipo nK' como los efectores dominantes, que son tanto necesarios, suficientes para la inducción de la enfermedad. El perfil transcripcional global de piel de ratón y humano con AA reveló firmas llamativas indicativas de una respuesta sólida de IFNy y la presencia de un infiltrado de linfocitos T citotóxicos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Usando el modelo de injerto de piel de ratón C3H/HeJ para transferir AA, la prevención de la enfermedad se puede sintetizar cuando se trata en el momento del injerto, así como la reversión de la enfermedad establecida permitiendo que los ratones injertados pierdan primero su pelo. Los inhibidores farmacológicos de las proteínas tirosina quinasas de JAK3 administrados por vía sistémica eliminaron la firma de IFN y evitaron el desarrollo de aA, Y la administración tópica revertió la enfermedad establecida. De manera notable con estos efectos fueron duraderos hasta 3 meses después de parar la terapia. Estos hallazgos ilustran la potencia de los estudios de GWAS en el descubrimiento de nuevos mecanismos de la enfermedad, que se han traducido rápidamente en nuevas oportunidades terapéuticas en AA.

La AA es una enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T cell caracterizada por pérdida capilar y, de forma histológica, por infiltración de linfocitos T que rodean el bulbo del folículo piloso, lo denominado "enjambre de abejas1*2. Los estudios previos han demostrado que la transferencia de linfocitos T totales (pero no linfocitos B o sueros), puede otorgar a la enfermedad en modelos de xenoinjerto humano así como el modelo de ratón C3H/HeJ45. Sin embargo, la identidad de los subconjuntos de linfocitos T patogénicos específicos en AA de cualquiera de ser humano o ratón todavía no se ha identificado.

Guiado por un estudio previo de GWAS, que identificó a ULBP3/6 como el locus de riesgo distinto de HLA más altamente significativo en AA (p = 2 x 10-2)3, un enfoque se ha centrado en el establecimiento de las NKG2DL como "señales de peligro" potenciales en el proceso de la enfermedad. La regulación positiva de ULBP3 se ha mostrado previamente en folículos pilosos de aA humana, asociada con un infiltrado denso de linfocitos T CD8+NKG2D+3. Aquí, se investigó el papel de estas células en la inmunopatogénesis de AA, así como una diana para intervención terapéutica potencial.

Para determinar la importancia mecanística de estas células en la patogénesis, se usó el modelo de ratón C3H/HeJ de AA, en el que la enfermedad espontánea se desarrolla con ~15 % de incidencia entre 6 y 12 meses de edad6, y se usó el modelo de C3H de transferencia genética, en el que los injertos de animales afectados pueden transferir la enfermedad a un 100 % de los receptores de C3H/HeJ en un periodo de tiempo de 8-12 semanas7. Las biopsias de piel conexiones desvelaron que los linfocitos T CD8+NKG2D+ se infiltran en las capas epiteliales del folículo piloso que sobre expresa los H60 y Rae-1 de NKG2DL, una situación que es análoga a la de la AA humana (FIG. 23A-B y FlG. 27A-B). El examen de citometría de flujo de la población de leucocitos CD45+ en la piel identificó una expansión llamativa de linfocitos T CD8+NKG2D+ (FlG. 23D). Otros tipos de células, incluyendo los linfocitos T CD4+ estaban presentes en números mucho más pequeños (FlG. 27C). Los ratones C3H/HeJ presentan una linfadenopatía cutánea llamativa (FlG. 23C) con un aumento de la celularidad total y, como se observa en la piel, una expresión espectacular de una población de células CD8+NKG2D+ no presente en ratones C3H/HeJ sin enfermedad (FlG. 23C- D).

El inmunofenotipo de los linfocitos T CD8+ de infiltración cutánea era similar al de la población de CD8+NKG2D+ encontrado en los ganglios linfáticos cutáneos: linfocitos T de memoria efectores de CD8ab+ (CDSelev CD44elev CD62Lbajo CD103+) que portan varios inmunorreceptores de NK, incluyendo CD49b y NKG2A/C/E (FlG. 23E y FlG. 27D). Estos linfocitos T CD8+ de 'tipo NK' expresaban niveles elevados de lFNg y presentaban citotoxicidad dependiente de NKG2D contra células diana de la vaina dérmica singeneicas expandidas ex vivo (FlG. 23F). El análisis de expresión genética de los linfocitos T CD8+NKG2D+ aislados de células de los ganglios linfáticos de ratón C3H/HeJ alopécico usando secuenciación de ARN demostró un perfil de transcripción característico de los CTL efectores tal como lo define el lmmGen Consortium— e identificó varias transcripciones "específicas de NK" adicionales (FlG. 23G y FlG. 28 y Tabla 2).

Tabla 2. Genes expresados de forma diferencial en linfocitos T de memoria de CD8+NKG2D+ con respecto a linfocitos T de memoria de CD8+NKG2D- aislados de ganglios linfáticos cutáneos obtenidos a partir de ratones alopécicos. La secuenciación de ARN se realizó en ARNc que se preparó aislado a partir de células clasificadas por flujo (influjo de BD) de ganglios linfáticos cutáneos totales de dos ratones alopécicos.

Símbolo Genético

FC

Gstm5

63,99

Gzma

52,13

lfitml

44,81

Cx3cr1

38,24

Sprn

35,20

j__________

34,76

lgsf5

32,13

Tmem132e

31,71

Cmklrl

30,91

5430421N21Rik

30,69

Csf1

29,97

Olfr60

28,79

4933431E20Rik

27,87

Metrnl

27,44

Símbolo Genético

FC

Epdrl

27,43

Cd244

27,22

Gpr141

26,45

Ccr1

26,17

Ccr8

23,75

Pkd2

23,23

Lgals3

22,66

Esm1

21,59

AI661453

20,69

Sema6d

20,58

Tmem171

19,13

Havcr2

19,01

Rasgrfl

18,32

Beanl

18,25

Adora3

18,13

Itga1_________

17,66

Tpbg

17,52

Gzmb

17,43

Gpr44

17,11

Stk32c

16,81

Bcarl

16,72

Cntnl

16,70

Slc38a8

16,65

Adam8

16,15

Usp44

15,85

B4galnt4

15,50

Cass4

14,94

Galr3

14,86

Ifitm2

14,77

Rimbp2

14,64

Fam171b

14,02

Srxnl

13,78

Ptger3

13,70

Lrat

13,48

Trpm6

13,43

Lrrn2

13,17

Arnt2

13,06

Yap1

13,04

Anxal

12,85

Gpr56

12,78

Rail4

12,59

Lypd3

12,52

Gm5127

12,23

Pdgfrb

12,13

Tktl1

11,87

Gzmk

11,63

Olfr252

11,61

AF529169

11,57

Olfr523

11,48

Selm

11,43

Sema4c

11,25

Ppp2r2c

11,12

Fxyd4

11,09

Sept5

11,07

Styk1

11,04

Myadm

10,84

Wnt10b

10,65

Fgl2_________

10,61

Gcnt4

10,59

Emp1

10,44

Cacng8

10,38

Car5b

10,36

Símbolo Genético

FC

Ly6g5b

10,32

Lmna

10,16

Vipr2

10,08

Ptpn5

10,01

Plekhfl

9,92

Il13

9,87

9430020K01Rik

9,87

Klrkl

9,80

Itsnl

9,65

Ret

9,62

Itgae

9,58

Col6a3

9,50

Nbea

9,41

Rab27b

9,41

Clec12a

9,36

Mgat3

9,35

Zfp57

9,30

S100a4

9,27

AI414108

9,22

Trim58

9,19

Irak3

9,18

Gpr34

9,15

Mt3

9,04

AW555464

9,02

Perp

9,00

Ace

8,94

Tmeff2

8,92

Slc35f3

8,81

Dyrk3

8,81

Nxnl2

8,72

Galnt3

8,67

Cish

8,63

Vash1

8,58

Klre1

8,58

Dmrt2

8,56

Wnt9a

8,48

Dusp14

8,43

Dmd

8,29

St6galnac2

8,26

Slc41a2

8,26

Cdh1

8,22

Tead1

8,09

Msc

8,05

Ttc39c

8,01

Slc27a6

7,94

Hlx

7,85

Mid2

7,73

Plod2

7,70

Prkcc

7,68

Ptgs1

7,63

6430571L13Rik

7,60

Specc1

7,55

Prss16

7,53

Fam129b

7,46

Spns3

7,49

Lonrf3

7,45

Fat4

7,41

Nphs2

7,39

Cpd

7,34

Cdkn2a

7,26

Ill7rd

7,14

Nebl

7,12

Símbolo Genético

FC

Src

7,10

Scnlb

7,07

Sccpdh

7,04

Igsf9b

7,03

Crispld2

7,02

Plscr4

7,01

Tmigdl

6,96

Camk2n1

6,95

Tratl

6,87

Mtap6

6,85

Qpct

6,85

Thsd7b

6,82

Tceal3

6,76

Nlrp12

6,75

2010002N04Rik

6,70

Lat2

6,68

Susd2

6,61

Ptprj

6,61

P2ry14

6,56

Csgagnact1

6,55

Klri2

6,54

1700001C19Rik

6,48

Spp_________

6,43

Hlf

6,41

Gpx8

6,39

a

6,37

Rtn4r

6,31

Lamc1

6,25

Kndc1

6,23

Slc22a15

6,19

Id2

6,15

Tnfsf13b

6,14

Elovl4

6,13

5830411N06Rik

6,04

Plxnd1

6,00

Vstm2a

5,98

Rora

5,96

Il2

5,93

Klrc1

5,92

Tesc

5,86

Cd401g

5,84

Glis2

5,84

Mt1

5,83

Mdfic

5,82

P2ry2

5,73

Hpse

5,72

Ttc16

5,70

Kit1

5,56

Arhgef25

5,65

Foxf2

5,62

Kir3dl2

5,56

Unc79

5,52

Aim11

5,47

Rgag4________

5,44

Pugl_________

5,41

Efcab6

5,39

Htra3

5,39

Card10

5,39

Nek6

5,38

6720401G13Rik

5,36

Fam131b

5,36

Grb14

5,34

Símbolo Genético

FC

Pdelc

5,33

Pld1

5,31

Gipc2

5,30

8430427H17Rik

5,30

Gabarapll

5,29

Olfr527

5,28

Tencl

5,27

Snx7

5,27

Rgs8

5,25

Slc16a7

5,24

Alcam

5,23

Tmbiml

5,23

Nefl

5,22

Pdcdl

5,21

2810030E01Rik

5,21

Abhd3

5,19

Clnk

5,18

Nlrplb

5,14

Cav2

5,13

Aff2

5,12

Kbtbd13

5,10

Ppap2a

5,07

Gm14718

5,06

Pde4a

5,03

Cnga2

4,95

Acvrll

4,92

Mapkapk3

4,92

Ccr2

4,87

Hip1

4,84

Pkp2

4,83

Nap1l3

4,83

Gorasp1

4,82

Zfp651

4,82

Hmga2-ps 1

4,81

Tceal1

4,81

Atp1a2

4,81

2200002K05Rik

4,81

Mmp2

4,77

Ankrd35

4,77

Klrc2

4,77

Ptgfrn

4,74

Ildr1

4,66

Ptpn3

4,64

5031425F14Rik

4,62

2510009E07Rik

4,58

Emilin2

4,58

2900026A02Rik

4,57

Cd101

4,54

9030425E11Rik

4,52

1500009L16Rik

4,50

Cdh17

4,48

Clec5a

4,48

Dnahc9

4,47

Gpr25

4,45

fng__________

4,44

Socs2

4,42

Pard3

4,42

Nhsl2

4,41

Layn

4,40

Csf2

4,35

Crybb3

4,30

Cxcr6

4,30

Símbolo Genético

FC

Zeb2

4,27

Prkar2b

4,27

Fam70a

4,26

Gdpd5

4,23

Gm8773

4,22

Fbn1

4,20

Itgax

4,20

Rbpj_________

4,17

Cxcl13

4,15

Tmem2

4,14

Tmem205

4,14

Klrc3

4,13

Gcntl

4,13

Zc3h12c

4,12

Mir1199

4,09

Ermn

4,08

Agap1_________

4,07

1810033B17Rik

4,07

Klf8

4,06

4831426I19Rik

4,06

Nin1

4,06

Fbxo44

4,04

Rab39b

4,03

Tspan2

4,02

Adrb1

4,00

Spns2

3,98

Osbpl3

3,97

Rapsn

3,96

Dhrs9

3,94

Mboat2

3,90

Pparg_________

3,90

Clip4

3,89

Apol9a

3,88

Marveld2

3,86

Capn5

3,86

Ranbp17

3,86

Ncam1

3,85

Ctnnd2

3,85

Slc25a24

3,85

Palm

3,84

Fcer1g

3,79

Gzmc

3,78

Prdm1

3,78

Scn8a

3,75

Fkbp9

3,72

Gstt1

3,71

Adssl1

3,71

Prrg4

3,71

Kir3dl1

3,70

Ssbp2

3,67

Swap70

3,67

Trp73

3,67

Il12rb2

3,66

Phka1

3,66

Xcr1

3,65

Stau2

3,64

9130019P16Rik

3,63

Clec7a

3,63

6430531B16Rik

3,63

Marco

3,62

Sulf2

3,61

Reep1

3,61

Símbolo Genético

FC

Anxa4

3,61

Procr

3,60

Slc40a1

3,60

Tnfrsf8

3,59

Matk

3,56

Cysltr2

3,56

Smtn

3,55

Raslllb

3,54

Amph

3,52

Cysltrl

3,52

Klril

3,52

B4alt2

3,51

Mlf1

3,49

B4galt4

3,49

Sle4a11

3,47

Htra1

3,47

Ebf1

3,44

Mpp2

3,44

Ical

3,44

Tigit_________

3,43

Lzts1

3,43

Epha3

3,43

Mrgpre

3,43

Vdr

3,42

Npnt

3,41

D630039A03Rik

3,40

Rapgef3

3,37

Cnksr1

3,37

Napsa

3,37

E030011005Rik

3,37

1700019E19Rik

3,37

Ncald

3,37

Ccl8

3,36

Dhrs3

3,36

Ppap2b

3,36

Gas2l1

3,36

St3gal2

3,35

Phactr2

3,34

Rasd1

3,34

Mafa

3,33

Olfr433

3,33

L1cam

3,31

Pik3r6

3,31

C1qa

3,31

Fgd1_________

3,30

Gm17745

3,30

Apol9b

3,30

Cmtm7

3,29

Bicd1

3,29

Rgs2_________

3,29

Nos1ap

3,29

Bcl2a1d

3,29

Eif4e3

3,28

Sgtb_________

3,28

Fut7

3,28

Kif19a

3,27

Mtmr7

3,27

Fam114a1

3,27

Sdc4

3,27

Farp1

3,26

Fbxl21

3,25

Ccrl2

3,25

Símbolo Genético

FC

H1fx

3,24

Eif2c4

3,24

Ube216

3,23

Gpr68

3,23

4930544D05Rik

3,23

Hrh4

3,22

Ryr1

3,22

9030418K01Rik

3,22

Acotl 1

3,22

Pon3

3,22

Serpine2

3,20

Ly6a

3,20

Lrrn3

3,19

B3galt5

3,19

Ankrd29

3,19

Cel1

3,19

Serpina3f

3,19

St14

3,15

Dscam

3,14

Fam129a

3,14

Med121

3,14

1300014I06Rik

3,13

Rnf216

3,13

St3gal5

3,13

S1e35e4

3,12

Rab3il1

3,12

Tmem176a

3,12

Syngr3

3,12

Il9r

3,12

Lrrk2

3,11

Zfp532

3,11

Ache

3,10

Wipf3

3,09

Cdkn1a

3,09

Ccdc136

3,08

Epn2

3,07

Fam167a

3,07

Syp_________

3,07

Spry2

3,06

Tiam1

3,06

Gnaq

3,05

Armcx6

3,05

Raph1

3,05

F730043M19Rik

3,05

Lag3_________

3,05

Wscd1

3,04

Dkkl1

3,04

Zfp839

3,04

Armcx1

3,03

Zkscan16

3,03

1700009P17Rik

3,02

Nkd1

3,01

Cdkn2b

3,01

Igfbp6

3,01

Dlg2_________

3,01

Plscr1

3,00

Cacnali

3,00

Ckm

3,00

Kcnmb4

3,00

Arhgap8

2,99

Gspt2

2,99

Foxd2

2,98

Símbolo Genético

FC

Vat11

2,98

Bfsp2

2,98

Prrt2

2,98

Wbscr17

2,98

Car13

2,98

Muc20

2,97

Bzrapl

2,96

Frem2

2,96

Fcer2a

2,96

Chn2

2,95

Blk

2,95

Kcnk5

2,95

Mpzll

2,95

Aplpl

2,95

Tlr4

2,95

H2-DMb2

2,95

Lyn

2,94

Meis2

2,94

Camkl

2,93

Pacsin3

2,93

Tub

2,93

Cebpd

2,93

Gm5111

2,92

Fasl

2,92

Lpcat2

2,91

Mybpc2

2,90

Sytl3

2,90

H2-Eb2

2,90

Hdac11

2,89

Slc43a3

2,89

Klf12

2,89

Blnk

2,89

Atp2b4

2,88

Faim3

2,88

C1qc

2,88

Epb4,113

2,87

Ms4a1

2,87

Prr51

2,86

Ferla

2,86

Ell3

2,86

Prdx4

2,85

Adcy9

2,85

Pbx3

2,85

Chmp4c

2,84

Osbpl1a

2,84

Apbb1

2,84

Cd79a

2,84

Slc6a8

2,83

Zcchc14

2,83

5730416F02Rik

2,83

Gm9199

2,82

Ern1

2,82

Lxn

2,82

Armc2

2,82

Cr2

2,82

Ptpn13

2,81

Bcl11a

2,81

Scd1

2,81

Chst3

2,80

Gcnt2

2,80

Lyl1

2,80

Itga2_________

2,79

Símbolo Genético

FC

Scn4a

2,78

Ccl5

2,78

Marchl

2,76

Siglecg

2,76

Islr

2,76

Spib

2,76

Ndrgl

2,75

Tex15

2,75

Rgs1_________

2,74

5031414D18Rik

2,74

Frmd4b

2,74

Ankrd6

2,74

Bcar3

2,74

Rhbdf1

2,72

Slco4a1

2,72

Capg_________

2,71

H2-DMb1

2,71

Hhex

2,71

Postn

2,71

Myole

2,71

Ill5

2,70

Soat2

2,69

Casp1

2,69

Itga3

2,69

Rtnl

2,68

Sema6b

2,68

Ciita

2,68

Haao

2,68

Atf6

2,68

Kcng1

2,67

Ptk7

2,67

Kdelc2

2,67

Cd180

2,67

Rhbd13

2,66

Cd86

2,66

Naip5

2,66

Slc15a3

2,65

BC013712

2,65

Cd74

2,64

C77080

2,64

Fam43a

2,63

S100a6

2,63

Lmo2

2,63

Col8a2

2,63

Celf5

2,63

Lhfpl4

2,63

Col1a1

2,62

Ppap2c

2,62

Ccl3

2,62

Rasgrp3

2,62

Klhl30

2,62

Clu

2,62

Cdl9

2,61

Syk

2,61

Cpne7

2,61

Rasgef1b

2,61

Gml1435

2,60

Vpreb3

2,60

Lhx2

2,58

Cybb

2,58

Mapk8ip1

2,58

Hck

2,57

Símbolo Genético

FC

1110046J04Rik

2,57

Fam59a

2,57

Stx11

2,56

Btk

2,56

H1f0

2,56

Vav3

2,56

F2rl2

2,55

Hspa2

2,55

Slc29a4

2,55

Tubb4a

2,54

Arsb

2,54

Trim7

2,54

Mef2c

2,54

Asb14

2,54

2010001M09Rik

2,54

Ehd2

2,54

Itpripl2

2,53

Ifitm3

2,53

Zfp941

2,53

Pax5

2,53

Cd24a

2,52

Arhgef40

2,51

Rab30

2,51

H2-Eb1

2,50

Serpinb6a

2,50

Kynu

2,50

Klra7

2,48

Maf

2,48

Fcgr2b

2,48

H2-Ea-ps

2,47

Crip3

2,47

Abhd4

2,47

Fcrl1

2,47

Egln3

2,47

Kif15

2,46

H2-Ab1

2,46

Jazf1

2,46

Dennd5a

2,46

Hgfac

2,45

Rtp3

2,45

9130206I24Rik

2,45

Cited2

2,45

Sult4a1

2,45

Gls2

2,44

Cd80

2,44

Tmem176b

2,44

Vcam1

2,44

Ptms

2,43

Tmem154

2,43

Ccl4

2,43

Rgs16

2,42

Pawr

2,42

Wdfy4

2,42

Olfm1

2,42

H2-Aa

2,42

Stac2

2,41

Il18

2,40

Fam164a

2,40

Phlda3

2,39

Ctnnal1

2,39

Tnfsf10

2,39

Cubn

2,38

Símbolo Genético

FC

Abi2

2,38

2410004P03Rik

2,38

Trim36

2,38

Bmf

2,37

Adapl

2,36

Rarg_________

2,36

Tmem151a

2,36

Ly6d

2,36

Irf5

2,35

Bhlhe40

2,35

Zfp608

2,34

Fam184a

2,33

Mafb

2,33

Coch

2,32

Gpr179

2,32

Ffarl

2,32

H2-Ob

2,32

Nav2

2,32

Srpk3

2,31

Cd209b

2,31

Arhgef12

2,31

Arvcf

2,31

Serpina3g

2,30

Ppp1r3f

2,30

Cdc25c

2,30

Tmem159

2,30

Atcay

2,30

Sept4

2,29

Cacna1e

2,29

Plxna1

2,29

Fzd6

2,29

Zcchc24

2,29

Ttbk1

2,28

Cd40

2,28

Atp6v0a1

2,28

Gnao1

2,27

Gsg2_________

2,27

Dock5

2,26

Tlr9

2,26

Fbxo6

2,26

2410022L05Rik

2,26

Ltbp4

2,25

Ncf2

2,25

Cela1

2,25

Ncr1

2,25

Irf4

2,25

Bank1

2,24

El12

2,23

1190002F15Rik

2,23

Unc5b

2,23

Bspry

2,23

D17H6S56E-3

2,23

Chst2

2,23

Slc41a3

2,22

Ctla2b

2,22

Gas213

2,22

Casp4

2,22

Dcxr

2,21

Ndrg4

2,21

Muc1

2,21

Lass6

2,21

Pls3

2,21

Símbolo Genético

FC

Dok3

2,20

Carhspl

2,20

Ppfibpl

2,20

Stxbpl

2,20

Ctsh

2,20

Edaradd

2,20

Galnt10

2,20

Prr5

2,19

Rcbtb2

2,19

Pik3c2b

2,19

Nqo2

2,19

Fbxo30

2,18

Mki67

2,17

Prnp

2,17

Ahr

2,16

C030034L19Rik

2,16

Lgalsl

2,16

Gm11110

2,15

Jup

2,15

Fam20a

2,15

Sfpil

2,15

Lrfn4

2,14

Cdkn2c

2,14

Crybg3

2,14

Trerfl

2,14

Dok4

2,14

Cdk6

2,13

S1pr3

2,13

Rxra

2,13

Cd163l1

2,12

Pwwp2b

2,12

1700017B05Rik

2,12

2310010M20Rik

2,12

Nek2

2,12

Lix1l

2,12

Ggta1

2,11

Rorc

2,11

Fosb

2,11

Rimkla

2,11

Txlnb

2,10

Smox

2,10

Tcf4

2,10

Fgd2_________

2,10

Cd3001f

2,10

Map3k13

2,10

Neil3

2,09

Optn

2,09

A930038C07Rik

2,09

Klra5

2,08

Cyp4f18

2,08

Akap17b

2,08

2700081O15Rik

2,07

Pcyox1l

2,07

Cd226

2,07

Aurkb

2,07

St6galnac6

2,06

Mfge8

2,06

Slamfl

2,06

Zdhhc2

2,06

Bag2_________

2,05

Gpr55

2,05

Dip2a

2,05

Símbolo Genético

FC

BC064078

2,05

S1pr5

2,05

Mlkl

2,04

Arap3

2,04

Ctla2a

2,04

Gypc

2,04

Ccdc88a

2,04

Serpinbla

2,03

Fam19a3

2,03

Cdk1

2,03

Tribl

2,01

Gadd45b

2,01

Pfn2

2,01

Klrdl

2,01

Trp53i11

2,01

Cd22

2,00

Mtss1

2,00

Adam19

2,00

Nusap1

2,00

Hk3

0,50

Pak1

0,50

Irgc1

0,50

Zfp296

0,50

Il6st

0,50

Oas2

0,49

I16ra

0,49

Ctsf

0,49

Lefl

0,49

Gm4951

0,49

Gpr133

0,49

Olfr1033

0,49

Bambi-ps1

0,48

Gtf2ird1

0,48

Dtx1

0,48

Maml3

0,47

Plaur

0,47

Id3

0,47

Tnfrsf25

0,47

Susd4

0,47

Wfikkn2

0,47

4921525O09Rik

0,46

Klra3

0,46

1110032F04Rik

0,46

Car12

0,46

Pard6g

0,46

Slc7a4

0,46

Lrp12

0,46

Spats21

0,45

Dleu7

0,45

Cacna2d4

0,45

Dst

0,45

Osbpl6

0,45

Tmem108

0,44

4930417O13Rik

0,44

Angpt12

0,44

Adam6b

0,44

Lrrc9

0,44

2310042E22Rik

0,44

Lars2

0,44

Ankrd55

0,44

Ly6k

0,43

Kazn

0,43

Símbolo Genético

FC

Dapll

0,43

Slc16a5

0,43

Unc13a

0,42

Gpr113

0,42

Siglech

0,42

Olig3

0,42

Ksr2

0,42

Card9

0,42

Rasipl

0,42

Dlc1

0,41

Gm19705

0,41

Syde2

0,41

Actnl

0,41

Epx

0,41

Mir5109

0,41

Gpr83

0,40

Neb

0,40

Sall2

0,40

Fam5b

0,40

Prickle1

0,40

Nme4

0,40

Lif

0,40

Auts2

0,39

Col6a4

0,39

Ccdc164

0,39

Apol11b

0,39

Plac8

0,39

Kcnf1

0,38

Gm15708

0,38

Wnt5b

0,38

Plat

0,38

Nmnat2

0,38

4933440M02Rik

0,38

Dcaf12l1

0,38

Nacc2

0,38

She

0,37

Snord69

0,37

Mical3

0,37

Cox6a2

0,36

Dmbt1

0,36

Aldh1l1

0,36

Scarna6

0,36

Lrp3

0,35

Car11

0,35

Il1r2

0,35

Atp6v1g3

0,35

Clec9a

0,34

Slc6a9

0,34

Tnni3

0,34

Gpr125

0,34

Ikzf2

0,34

Slc7a10

0,33

Lman1l

0,33

A430105I19Rik

0,33

Eng_________

0,32

Snora17

0,32

Gria4

0,32

Fgfr1

0,32

BC048644

0,31

D830046C22Rik

0,31

Hs6st2

0,31

Hoxa5

0,31

Símbolo Genético

FC

Alp1

0,30

Pgpep1l________

0,30

Adam6a

0,29

Hoxa3

0,29

Fam110b

0,28

Padi1

0,28

Serpina9

0,28

Igfbp4

0,28

Pdzk1ip1

0,27

Fzd1

0,27

4930546C10Rik

0,27

Foxp3

0,26

Hoxa6

0,26

Hoxa7

0,26

Edn3

0,26

Btc

0,26

Myl10

0,26

Hoxa1

0,25

Dnahc7a

0,24

Mira

0,24

Pcdhga10

0,24

Lrrc3b

0,23

Slc4a4

0,23

Rpr13

0,23

Shc2

0,22

Expi

0,22

Shisa2

0,22

Gm12709

0,22

Fbln2

0,21

Sec1

0,21

C85492

0,21

Lamc3

0,21

Dbx1

0,20

Atplb1

0,20

Nek5

0,19

Actg2

0,19

Dntt

0,17

Nrg2

0,17

Sostdc1

0,14

Trnp1

0,14

Lama1

0,14

Rpr12

0,13

0610012H03Rik

0,12

Lrrc32

0,10

Para evaluar el requisito de estos linfocitos T CD8 de 'tipo NK' en la patogénesis de la enfermedad, se usó un enfoque de transferencia adoptivo. Tanto las células CD8+NKG2D+ citotóxicas transferidas solas, así como las células de los ganglios linfáticos totales, fueron capaces de dar lugar a AA en cinco receptores, mientras que las 5 poblaciones de ganglios linfáticos con agotamiento de células NKG2D+ fueron incapaces de transferir la enfermedad (FIG. 23H). Los linfocitos T CD8+NKG2D+ de 'tipo NK' no solamente son el tipo de celular dominante en el infiltrado dérmico, sino que, además, ambos son necesarios y suficientes para transferencia de alopecia areata mediada por linfocitos T.

10 Usando genómica comparativa con el fin de caracterizar el panorama transcriptional de la piel con lesión por AA de ratones C3H/HeJ así como seres humanos con AA, en primer lugar se realice una formación de perfiles con Affymetrix de toda la piel de ratones C3H/HeJ con AA espontánea con respecto a piel C3H/HeJ sin afectar (FIG. 24A, panel superior y FIG. 29). En paralelo, del mismo modo se formaron perfiles de piel humana a partir de biopsias perilesionales de enfermedad activa en cinco pacientes con AA con respecto a controles normales (Tablas 3-5).

Tabla 3. Genes expresados diferencialmente en la piel de ratones C3H/HeJ hembra alopécicos con respecto a piel obtenida a partir de ratones C3H/HeJ hembra emparejados por edades sin alopecia (n = 3 por grupo).

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1419762_at

Ubd 135,60

1418652_at

Cxc19 74,98

1417898_a_at

Gzma 56,37

1419697_at

Cxcl11 53,33

1418930_at

Cxcl10 37,58

1419042_at

Iigp1 34,65

1418776_at

Gbp8 33,06

1418126_at

Ccl5 27,95

1419043_a_at

Iigp1 25,36

1438676_at

Gbp6 25,11

1423467_at

Ms4a4b 23,27

1453196_a_at

Oas12 23,06

1419060_at

Gzmb 21,74

1417141_at

Igtp 21,08

1435639_at

2610528A11Rik 20,88

1423555_a_at

Ifi44 20,58

1417292_at

Ifi47 18,63

1425394_at

BC023105 18,43

1420549_at

Gbp1 17,81

1417793_at

Irgm2 17,25

1435906_x_at

Gbp2 15,15

1450033_a_at

Statl 14,48

1418825_at

Irgm1 14,46

1444078_at

Cd8a 14,23

1422812_at

Cxcr6 13,98

1427747_a_at

Lcn2 13,89

1420699_at

Clec7a 13,82

1418240_at

Gbp2 13,32

1450783_at

Ifit1 13,13

1418392_a_at

Gbp3 12,61

1424305_at

Igj 12,53

1434380_at

Gbp7 12,51

1424865_at

Pyy 12,17

1422588_at

Krt6b 12,07

1434046_at

AA467197 11,98

1418580_at

Rtp4 11,29

1419709_at

Stfa3 11,04

1425156_at

Gbp7 10,72

1449254_at

Spp1 10,61

1440481_at

Stat1 10,53

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1449153_at

Mmp12 10,18

1424921_at

Bst2 9,80

1429947_a_at

Zbp1 9,65

1456907_at

Cxcl9 9,62

1421075_s_at

Cyp7b1 8,74

1451777_at

Ddx60 8,72

1421688_a_at

Ccl1 8,65

1421074_at

Cyp7b1 8,56

1419604_at

Zbpl 8,51

1419714_at

Cd274 8,41

1427102_at

Slfn4 8,40

1424761_at

Fam115c 8,26

1419135 at

Ltb 8,24

1450034_at

Stat1 7,98

1425832_a_at

Cxcr6 7,98

1420915_at

Statl 7,67

1438037_at

Herc6 7,62

1448436_a_at

Irf1 7,61

1448932_at

Krt16 7,12

1435710_at

AI661384 7,10

1451564_at

Parp14 7,08

1452614_at

Bcl2l15 7,00

1417256_at

Mmp13 6,88

1447541_s_at

Itgae 6,79

1432026_a_at

Herc6 6,70

1434372_at

AW112010 6,62

1459913_at

Tnfsf10 6,51

1451426_at

Dhx58 6,51

1452405_x_at

Trav9d-3 6,44

1429570_at

Mlkl 6,41

1444064_at

Samhd1 6,28

1451860_a_at

Trim30a 6,23

1453080_at

Apol7a 6,22

1420380_at

Ccl2 6,12

1434438_at

Samhd1 6,11

1450696_at

Psmb9 6,06

1451537_at

Chi3l1 5,99

1450165_at

Slfn2 5,88

1424727_at

Ccr5 5,83

1421256_at

Gzmc 5,80

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1448162_at

Vcam1 5,80

1453913_a_at

Tap2 5,79

1418191_at

Usp18 5,73

1425005_at

Klrc1 5,65

1439680_at

Tnfsf10 5,64

1433935_at

AU020206 5,51

1426113_x_ at

Trav9d-3 5,51

1422415_at

Ang2 5,44

1460245_at

Klrd1 5,41

1426971_at

Uba7 5,34

1443698_at

Xafl 5,32

1418131_at

Samhd1 5,26

1419591_at

Gsdmc 5,20

1416897_at

Parp9 5,11

1417244_a_at

Irf7 5,08

1449216_at

Itgae 5,06

1448632_at

Psmb10 5,06

1439825_at

Dtx31 5,02

1416714_at

Irf8 5,00

1425917_at

H28 4,99

1447621_s_at

Tmem173 4,93

1425396_a_at

Lck 4,88

1418536_at

H2-Q7 4,84

1449025_at

Ifit3 4,75

1436649_at

Ikzf3 4,75

1425947_at

Ifng 4,71

1417172_at

Ube216 4,70

1438855_x_at

Tnfaip2 4,70

1422962_a_at

Psmb8 4,69

1421186_at

Ccr2 4,66

1418204_s_at

Aif1 4,61

1421911_at

Stat2 4,57

1450753_at

Nkg7 4,55

1450424_a_at

Il18bp 4,53

1450403_at

Stat2 4,52

1452565_x_at

LOC641050 4,44

1441054_at

Apol8 4,43

1449328_at

Ly75 4,39

1422601_at

Serpinb9 4,39

1422177_at

Il13ra2 4,39

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1426170_a_at

Cd8b1 4,38

1460603_at

Samd91 4,37

1448754_at

Rbp1 4,31

1417822_at

D17H6S56E-5 4,28

1435208_at

Dtx31 4,26

1418649_at

Fgln3 4,26

1422160_at

H2-T24 4,23

1456064_at

AI504432 4,21

1449184_at

Pglyrpl 4,19

1438498_at

Zmynd15 4,19

1449195_s_at

Cxcl16 4,11

1439034_at

Spn 4,10

1450678_at

Itgb2 4,10

1437176_at

Nlrc5 4,09

1458299_s_at

Nfkbie 4,07

1421262_at

Lipg 4,06

1426039_a_at

Alox12e 4,05

1429184_at

Gvinl 4,05

1448380_at

Lgals3bp 4,04

1436576_at

Fam26f 4,01

1453939_x_at

Gm9706 3,99

1434457_at

Sp100 3,98

1425295_at

Ear11 3,97

1425065_at

Oas2 3,97

1449846_at

Ear2 3,97

1450582_at

H2-Q5 3,96

1440926_at

Flt1 3,94

1457140_s_at

Rassf10 3,91

1455500_at

Rnf213 3,90

1426970_a_at

Uba7 3,89

1448452_at

Irf8 3,88

1451673_at

Cd8a 3,88

1437929_at

Dact2 3,86

1426774_at

Parp12 3,84

1418648_at

Egln3 3,82

1437811_x_at

Cotl1 3,78

1428420_a_at

1200009I06Rik 3,78

1417961_a_at

Trim30a 3,77

1425225_at

Fcgr4 3,74

1421812_at

Tapbp 3,74

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1451905_a_at

Mx1 3,72

1441752_at

Art3 3,69

1448301_s_at

Serpinb1a 3,69

1436172_at

Gm20559 3,68

1418133_at

Bcl3 3,67

1418655_at

B4galnt1 3,66

1417821_at

D 17H6S56E-5 3,66

1417171_at

Itk 3,63

1460227_at

Timp1 3,61

1455161_at

AI504432 3,61

1421228_at

Ccl7 3,60

1434905_at

Ndufa4l2 3,60

1460218_at

Cd52 3,60

1460437_at

Cyth4 3,54

1430005_a_at

Batf2 3,53

1450188_s_at

Lipg 3,53

1419698_at

Cxcll1 3,52

1439790_at

Serpinb9 3,51

1419413_at

Ccl17 3,51

1421009_at

Rsad2 3,50

1436838_x_at

Cotl1 3,50

1455269_a_at

Corola 3,50

1422828_at

Cd3d 3,49

1440866_at

Eif2ak2 3,47

1420437_at

Idol 3,45

1439814_at

Atp8b4 3,44

1441706_at

Dscaml1 3,44

1421322_a_at

Irf9 3,43

1427076_at

Mpeg1 3,43

1435454_a_at

BC006779 3,41

1444619_x_at

Psmb8 3,40

1444350_at

Slfn10-ps 3,39

1425335_at

Cd8a 3,38

1450484_a_at

Cmpk2 3,38

1435832_at

Lrrc4 3,38

1424067_at

Icam1 3,37

1416318_at

Serpinb1a 3,37

1445897_s_at

Ifi35 3,35

1450291_s_at

Ms4a4c 3,34

1416273_at

Tnfaip2 3,34

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1453304_s_at

Lv6e 3,33

1418770_at

Cd2 3,32

1434067_at

AI662270 3,32

1428735_at

Cd69 3,31

1424965_at

Lpxn 3,31

1455393_at

Cp 3,31

1429567_at

Rassf10 3,30

1436905_x_at

Laptm5 3,30

1428485_at

Car12 3,28

1456211_at

Nlrp10 3,28

1438531_at

A730054J21Rik 3,26

1449175_at

Gpr65 3,25

1424923_at

Serpina3g 3,24

1417995_at

Ptpn22 3,23

1440990_at

Kif26b 3,20

1420338_at

Alox15 3,18

1419300_at

Flt1 3,17

1419128_at

Itgax 3,16

1426872_at

Fcgbp 3,15

1425336_x_at

H2-K1 3,15

1448759_at

Il2rb 3,14

1419178_at

Cd3g 3,11

1420412_at

Tnfsf10 3,11

1433465_a_at

AI467606 3,11

1418203_at

Pmaip1 3,11

1430208_at

Krt42 3,09

1421628_at

Il18r1 3,08

1417620_at

Rac2 3,08

1454850_at

Tbc1d10c 3,07

1439221_s_at

Cd40 3,07

1438658_a_at

S1pr3 3,06

1426278_at

Ifi2712a 3,06

1429692_s_at

Gch1 3,04

1458148_at

Nlrc3 3,03

1440927_x_at

Apol11b 3,03

1436236_x_at

Cotl1 3,03

1448940_at

Trim21 3,02

1421217_a_at

Lgals9 3,02

1451756_at

Flt1 3,01

1455048_at

Igsf3 3,01

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1435560_at

Itgal 3,01

1425719_a_at

Nmi 2,99

1439956_at

Ms4a6b 2,98

1436562_at

Ddx58 2,98

1422632_at

Ctsw 2,98

1436472_at

Slfn9 2,98

1427013_at

Car9 2,98

1449361_at

Tbx21 2,98

1426025_s_at

Laptm5 2,97

1438052_at

A130071D04Rik 2,97

1426276_at

Ifih1 2,97

1456890_at

Ddx58 2,96

1416295_a_at

Il2rg 2,94

1434873_a_at

Acap1 2,93

1456103_at

Pml 2,93

1418678_at

Has2 2,92

1420697_at

Slc15a3 2,91

1436058_at

Rsad2 2,90

1425294_at

Slamf8 2,90

1459151_x_at

Ifi35 2,90

1418991_at

Bak1 2,89

1439068_at

Erap1 2,89

1424617_at

Ifi35 2,89

1417189_at

Psme2 2,89

1451544_at

Tapbpl 2,88

1419412_at

Xcl1 2,88

1419539_at

Irx4 2,88

1452592_at

Mgst2 2,87

1420774_a_at

4930583H14Rik 2,86

1440169_x_at

Ifnar2 2,86

1420499_at

Gch1 2,85

1416002_x_at

Cotl1 2,85

1423754_at

Ifitm3 2,84

1416942_at

Erap1 2,84

1449169_at

Has2 2,83

1419609_at

Ccr1 2,83

1449591_at

Casp4 2,81

1436598_at

Icos 2,81

1427381_at

Irg1 2,81

1419879_s_at

Trim25 2,81

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1449143_at

Rtp4 2,80

1449839_at

Casp3 2,78

1426599_a_at

Slc2a1 2,78

1452117_a_at

Fyb 2,77

1434773_a_at

Slc2a1 2,77

1450378_at

Tapbp 2,76

1419561_at

Ccl3 2,76

1427007_at

Sash3 2,76

1422706_at

Pmepal 2,76

1427892_at

Myolg 2,75

1451335_at

Plac8 2,73

1425974_a_at

Trim25 2,72

1426600_at

Slc2a1 2,67

1418826_at

Ms4a6b 2,67

1430244_at

4921509J17Rik 2,66

1457664_x_at

C2 2,65

1416564_at

Sox7 2,65

1433466_at

AI467606 2,65

1425801_x_at

Cotl1 2,64

1435945_a_at

Kcnn4 2,63

1434268_at

Adar 2,63

1420353_at

Lta 2,63

1418741_at

Itgb7 2,62

1416246_a_at

Corola 2,62

1422280_at

Gzmk 2,61

1421596_s_at

H28 2,60

1415834_at

Dusp6 2,60

1438364_x_at

Ang4 2,60

1439819_at

AU015263 2,60

1451755_a_at

Apobec1 2,59

1416296_at

Il2rg 2,59

1439276_at

Adar 2,59

1417495_x_at

Cp 2,59

1453352_at

Atp10b 2,58

1437478_s_at

Efhd2 2,58

1434366_x_at

C1qb 2,58

1417185_at

Ly6a 2,58

1443858_at

Trim12c 2,58

1417494_a_at

Cp 2,58

1427746_x_at

H2-K1 2,57

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1421034_a_at

Il4ra 2,56

1422005_at

Eif2ak2 2,56

1455000_at

Gpr68 2,56

1415803_at

Cx3c11 2,55

1422782_s_at

Tlr3 2,55

1416097_at

Lrrc4 2,54

1460651_at

Lat 2,53

1427325_s_at

Akna 2,53

1425603_at

Tmem176a 2,49

1439595_at

Tcra 2,49

1424041_s_at

C1s 2,49

1418718_at

Cxc116 2,48

1456061_at

Gimap8 2,47

1417056_at

Psme1 2,46

1418981_at

Casp12 2,46

1421211_a_at

Ciita 2,46

1449235_at

Fasl 2,45

1449265_at

Casp1 2,44

1424383_at

Tmem51 2,44

1425405_a_at

Adar 2,43

1425902_a_at

Nfkb2 2,42

1452817_at

Smyd3 2,42

1416871_at

Adam8 2,42

1457917_at

Lck 2,42

1449127_at

Selplg 2,42

1416514_a_at

Fscnl 2,42

1439773_at

Ly6e 2,41

1436223_at

Itgb8 2,41

1454268_a_at

Cyba 2,41

1451821_a_at

Sp100 2,41

1444242_at

Slco2a1 2,40

1415983_at

Lcp1 2,40

1418293_at

Ifit2 2,39

1420671_x_at

Ms4a4c 2,39

1450534_x_at

H2-K1 2,39

1418077_at

Trim21 2,39

1417496_at

Cp 2,38

1435415_x_at

Marcksl1 2,37

1451320_at

Arhgap8 2,37

1427041_at

BC013712 2,36

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1422139_at

Plau 2,36

1441768_at

9430051O21Rik 2,35

1449455_at

Hck 2,35

1421358_at

H2-M3 2,34

1436312_at

Ikzfl 2,34

1444632_at

BC064078 2,33

1450791_at

Nppb 2,33

1424927_at

Glipr1 2,33

1419764_at

Chi313 2,33

1426093_at

Trim34a 2,33

1420515_a_at

Pglyrp2 2,33

1448061_at

Msr1 2,33

1418641_at

Lep2 2,32

1418842_at

Hcls1 2,31

1434400_at

Tgif2 2,31

1439494_at

Slc5a9 2,30

1448757_at

Pml 2,28

1431339_a_at

Efhd2 2,28

1455581_x_at

Gm20559 2,28

1437132_x_at

Nedd9 2,27

1456307_s_at

Adcy7 2,27

1422932_a_at

Vav1 2,27

1450446_a_at

Socs1 2,27

1434068_s_at

AI662270 2,26

1416069_at

Pfkp 2,26

1421210_at

Ciita 2,26

1437785_at

Adamts9 2,25

1436230_at

Gpr114 2,25

1425119_at

Oaslb 2,25

1449310_at

Ptger2 2,25

1440721_at

5930433N17Rik 2,25

1430352_at

Adamts9 2,25

1456377_x_at

Limd2 2,25

1449991_at

Cd244 2,25

1416051_at

C2 2,25

1455132_at

Rasa13 2,24

1422124_a_at

Ptprc 2,24

1448576_at

Il7r 2,23

1421931_at

Icos 2,22

1436199_at

Trim14 2,21

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1446509_at

Smox 2,20

1430148_at

Rabl9 2,20

1450170_x_at

H2-D1 2,19

1439736_at

5830453J16Rik 2,19

1451567_a_at

Ifi203 2,19

1433920_at

Sema4c 2,18

1420913_at

Slco2a1 2,18

1439148_a_at

Pfkl 2,18

1452544_x_at

H2-D1 2,18

1441600_at

C920021A13 2,17

1422804_at

Serpinb6b 2,16

1453228_at

Stx11 2,15

1427682_a_at

Egr2 2,15

1428378_at

Zc3hav1 2,15

1430165_at

Stk17b 2,15

1451321_a_at

Rbm43 2,15

1457780_at

Stx11 2,15

1439764_s_at

Igf2bp2 2,14

1435913_at

B4galnt4 2,14

1449220_at

Gimap3 2,13

1456251_x_at

Tspo 2,13

1422781_at

Tlr3 2,13

1423135_at

Thy1 2,13

1424375_s_at

Gimap4 2,12

1428660_s_at

Tor3a 2,12

1439012_a_at

Dck 2,12

1441912_x_at

C2 2,12

1424704_at

Runx2 2,11

1424953_at

BC021614 2,11

1431843_a_at

Nfkbie 2,10

1417219_s_at

Tmsb10 2,10

1448160_at

Lcp1 2,10

1427352_at

Krt79 2,10

1419194_s_at

Gmfg 2,09

1460675_at

Igsf8 2,09

1426568_at

Slc2a9 2,08

1424961_at

Tapbpl 2,08

1418099_at

Tnfrsf1b 2,08

1422527_at

H2-DMa 2,08

1426554_a_at

Pgam1 2,08

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1438941_x_at

Ampd2 2,08

1450648_s_at

H2-Ab1 2,07

1440165_at

Ptprc 2,07

1437724_x_at

Pitpnm1 2,07

1434364_at

Map3k14 2,06

1419537_at

Tfec 2,06

1425728_at

Gm12185 2,06

1455966_s_at

Nudt21 2,05

1419282_at

Ccl12 2,05

1420404_at

Cd86 2,05

1415765_at

Hnrnpul2 2,05

1422511_a_at

Ogfr 2,05

1425548_a_at

Lst1 2,05

1427683_at

Egr2 2,05

1453757_at

Herc6 2,04

1435331_at

Phin1 2,04

1419119_at

Hcst 2,03

1458229_at

Robo2 2,03

1422808_s_at

Dock2 2,03

1437213_at

Nudt21 2,02

1429831_at

Pik3ap1 2,01

1439808_at

Ipcef1 2,01

1428891_at

Parm1 2,01

1427765_a_at

Tcrb-J 2,01

1426133_a_at

Mitd1 2,00

1425016_at

Ephb2 2,00

1422562_at

Rrad 2,00

1418110_a_at

Inpp5d 2,00

1420272_at

Samhd1 2,00

1417928_at

Pdlim4 2,00

1460220_a_at

Csf1 2,00

1451828_a_at

Acsl4 2,00

1435672_at

3830612M24 1,99

1453181_x_ at

Plscr1 1,99

1428767_at

Gsdmd 1,99

1436861_at

Il7 1,99

1437270_a_at

Clcf1 1,99

1419202_at

Cst7 1,98

1435529_at

Gm14446 1,98

1419810_x_at

Arhgap9 1,98

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1429525_s_at

Myolf 1,98

1437308_s_at

F2r 1,98

1419676_at

Mx2 1,98

1455019_x_at

Ckap4 1,98

1438948_x_at

Tspo 1,97

1448618_at

Mvp 1,97

1436365_at

Zbtb7c 1,97

1418464_at

Matn4 1,97

1439093_at

Hspa4l 1,97

1435193_at

A230050P20Rik 1,97

1439065_ x_ at

Gm13152 1,97

1423306_at

2010002N04Rik 1,97

1430658_a_at

Gsdma2 1,97

1419469_at

Gnb4 1,96

1426725_s_at

Ets1 1,96

1417288_at

Plekha2 1,96

1456586_x_at

Mvp 1,96

1426415_a_at

Trim25 1,95

1437249_at

Skap1 1,95

1433517_at

Myeov2 1,95

1425374_at

Oas3 1,95

1425681_a_at

Prnd 1,95

1436659_at

Dclk1 1,94

1446326_at

Col1a2 1,94

1435596_at

Pion 1,94

1416492_at

Ccne1 1,94

1422701_at

Zap70 1,93

1435517_x_at

Ralb 1,93

1436902_x_at

Tmsb10 1,93

1425166_at

Rbl1 1,93

1421207_at

Lif 1,93

1460134_at

9330175E14Rik 1,93

1420273_x_at

Samhd1 1,93

1443621_at

Xaf1 1,92

1425078_x_at

C130026I21Rik 1,92

1427994_at

Cd300lf 1,91

1456545_at

Il18rap 1,91

1418346_at

Insl6 1,91

1428372_at

St5 1,91

1417045_at

Bid 1,91

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1433699_at

Tnfaip3 1,91

1440275_at

Runx3 1,91

1460253_at

Cmtm7 1,91

1421188_at

Ccr2 1,90

1427911_at

Tmeml73 1,90

1420653_at

Tgfb1 1,90

1437643_at

Cenpj 1,90

1443687_x_at

H2-DMb2 1,90

1440299_at

E330016A19Rik 1,90

1425151_a_at

Noxo1 1,90

1441097_at

Vangl1 1,90

1449988_at

Gimap1 1,89

1427404_x_at

Gm5506 1,89

1425617_at

Dhx9 1,88

1426926_at

Plcg2 1,88

1424037_at

Itpka 1,88

1449925_at

Cxcr3 1,88

1435394_s_at

Rhoc 1,87

1453392_at

Ttc39b 1,87

1449473_s_at

Cd40 1,87

1419186_a_at

St8sia4 1,86

1455898_x_at

Slc2a3 1,86

1430447_a_at

Lair1 1,86

1418353_at

Cd5 1,85

1449425_at

Wnt2 1,85

1439114_at

Ddx60 1,85

1425084_at

Gimap7 1,85

1425819_at

Zbtb7c 1,85

1416001_a_at

Cotl1 1,84

1422704_at

Gyk 1,84

1445452_at

Traf1 1,84

1438852_x_at

Mcm6 1,84

1436423_at

Themis 1,84

1417599_at

Cd276 1,84

1421930_at

Icos 1,84

1421814_at

Msn 1,83

1419132_at

Tlr2 1,83

1448568_a_at

Slc20a1 1,83

1423602_at

Traf1 1,83

1451931_x _at

H2-L 1,82

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1456836_at

Itk 1,82

1453129_a_at

Rgs12 1,82

1426454_at

Arhgdib 1,82

1451385_at

Fam162a 1,82

1419470_at

Gnb4 1,82

1435697_a_at

Cytip 1,82

1424214_at

Parm1 1,81

1458524_at

Fndc3a 1,81

1455051_at

Rnf31 1,81

1452163_at

Ets1 1,81

1448328_at

Sh3bp2 1,80

1456700_ x_ at

Marcks 1,80

1451784_x_at

H2-D1 1,80

1437606_at

Btbd19 1,80

1439476_at

Dsg2 1,80

1440878_at

Runx1 1,79

1453472_a_at

Slamf7 1,79

1434653_at

Ptk2b 1,79

1436708_x_at

Mcm4 1,79

1454592_at

9430012M22Rik 1,79

1433954_at

4632419I22Rik 1,78

1426315_a_at

6330416G13Rik 1,78

1451289_at

Dclk1 1,78

1443686_at

H2-DMb2 1,78

1449903_at

Crtam 1,78

1418090_at

Plvap 1,78

1460250_at

Sostdc1 1,77

1435749_at

Gda 1,77

1450269_a_at

Pfkl 1,77

1438910_a_at

Stom 1,77

1437868_at

Fam46a 1,77

1448449_at

Ripk3 1,77

1424496_at

5133401N09Rik 1,77

1438854_x at

Pitpnm1 1,77

1424930_s_at

Fam83f 1,77

1460378_a_at

Tes 1,77

1448914_a_at

Csf1 1,76

1448659_at

Casp7 1,76

1427689_a_at

Tnip1 1,76

1428242_at

Hmha1 1,76

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1455975_x_at

Rnf114 1,76

1453076_at

Batf3 1,76

1419125_at

Ptpn18 1,76

1424524_at

Dram1 1,76

1453202_at

E330016A19Rik 1,76

1428346_at

Trafd1 1,76

1451987_at

Arrb2 1,76

1417790_at

Dok1 1,76

1418244_at

Naa20 1,75

1416226_at

Arpc1b 1,75

1438634_x_at

Lasp1 1,75

1419209_at

Cxcl1 1,75

1451363_a_at

Dennd2d 1,75

1430622_at

4833423F13Rik 1,74

1447788_s_at

Tspyl3 1,74

1456310_a_at

2610002J02Rik 1,74

1455251_at

Itga1 1,74

1416750_at

Sigmar1 1,74

1421830_at

Ak4 1,74

1417346_at

Pycard 1,74

1436958_x at

Tpm3 1,74

1434069_at

Prex1 1,74

1440249_at

Aknad1 1,74

1442849_at

Lrp1 1,74

1451174_at

Lrrc33 1,73

1451411_at

Gprc5b 1,73

1460469_at

Tnfrsf9 1,73

1452661_at

Tfrc 1,73

1430534_at

Rnase6 1,73

1456028_x at

Marcks 1,73

1448731_at

Il10ra 1,73

1418257_at

Slc12a7 1,73

1420170_at

Myh9 1,72

1424032_at

Hvcn1 1,72

1435748_at

Gda 1,72

1451285_at

Fus 1,72

1454607_s_at

Psat1 1,72

1434089_at

Synpo 1,71

1421525_a_at

Naip5 1,71

1458415_at

Clec2e 1,71

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1419721_at

Niacrl 1,71

1453328_at

2700008G24Rik 1,71

1435337_at

Tshz3 1,71

1456011_x at

Acaa1a 1,71

1423986_a_at

Shisa5 1,71

1427386_at

Arhgef16 1,70

1443123_at

Tanc2 1,70

1418674_at

Osmr 1,70

1445588_at

Ankrd44 1,70

1424552_at

Casp8 1,70

1439261_ x _at

Mitd1 1,70

1452428_a_at

B2m 1,70

1418045_at

Inpp1 1,70

1441317_x_at

Jakmip1 1,70

1436589_x_at

Prkd2 1,70

1437503_a_at

Shisa5 1,70

1421578_at

Ccl4 1,70

1435227_at

Bel11b 1,70

1436177_at

Plekha2 1,70

1457644_s_at

Cxcl1 1,70

1429527_a_at

Plscr1 1,70

1433531_at

Acsl4 1,69

1420731_a_at

Csrp2 1,69

1438097_at

Rab20 1,69

1426239_s_at

Arrb2 1,69

1427182_s_at

D18Ertd653e 1,69

1435338_at

Cdk6 1,69

1433885_at

Iqgap2 1,69

1450852_s_at

F2r 1,69

1446507_at

Kif24 1,69

1450456_at

Il21r 1,69

1418612_at

Slfn1 1,68

1438974_x_at

Pitpnm1 1,68

1439030_at

Gmppb 1,68

1416619_at

4632428N05Rik 1,68

1441880_ x_ at

Tmem149 1,68

1448797_at

Elk3 1,68

1443794_x_at

Noc41 1,68

1452289_a_at

Rnf135 1,68

1450918_s_at

Src 1,67

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1420955_at

Vsnll 1,67

1418751_at

Sit1 1,67

1447568_at

Gatc 1,67

1460700_at

Stat3 1,67

1419911_at

Corolc 1,66

1452966_at

Bel11b 1,66

1421550_a_at

Trim34a 1,66

1423686_a_at

Prr13 1,66

1455287_at

Cdk6 1,66

1439422_a_at

Fam132a 1,66

1416935_at

Trpv2 1,66

1436183_at

Zc3hav1 1,66

1451314_a_at

Vcam1 1,66

1417300_at

Smpdl3b 1,66

1419097_a_at

Stom 1,66

1446939_at

Trim12a 1,65

1423411_at

Rbm47 1,65

1450355_a_at

Capg 1,65

1436220_at

Zfp287 1,65

1429742_at

Rcbtb2 1,65

1455221_at

Abeg1 1,65

1438934_x_at

Sema4a 1,65

1452836_at

Lpin2 1,65

1427874_at

Rnf114 1,64

1452425_at

Tnfrsf14 1,64

1422303_a_at

Tnfrsfl8 1,64

1418396_at

Gpsm3 1,64

1451462_a_at

Ifnar2 1,64

1447711_x_at

4933412E12Rik 1,64

1454757_s_at

Ifi27l1 1,64

1424246_a_at

Tes 1,64

1459872_x_at

H2-DMa 1,64

1424304_at

Tpcn2 1,64

1416695_at

Tspo 1,64

1451475_at

Plxnd1 1,64

1428727_at

Cepl92 1,64

1440779_s_at

Slc5a9 1,63

1433451_at

Cdk5r1 1,63

1450531_at

H2-B1 1,63

1458601_at

8030447M02Rik 1,63

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1426739_at

Donson 1,63

1423350_at

Socs5 1,63

1456467_s_at

Nlk 1,63

1447803_ x_ at

Capg 1,63

1453201_at

Rassf10 1,63

1438148_at

Cxl3 1,63

1444197_at

Rinl 1,63

1428859_at

Paox 1,63

1455656_at

Btla 1,63

1455080_at

Ppp1r16b 1,63

1424857_a_at

Trim34a 1,62

1450140_a_at

Cdkn2a 1,62

1438095_x_at

Noc4l 1,62

1460231_at

Irf5 1,62

1426318_at

Serpinb1b 1,62

1427348_at

Zc3h12a 1,62

1451862_a_at

Prf1 1,62

1442944_at

C76555 1,62

1420635_a_at

Tcirg1 1,62

1435143_at

Elk3 1,62

1449623_at

Txnrd3 1,61

1458345_s_at

Colec11 1,61

1423812_s_at

Vopp1 1,61

1417561_at

Apoc1 1,61

1455818_at

4930427A07Rik 1,60

1426757_at

Ampd2 1,60

1418265_s_at

Irf2 1,60

1434185_at

Acaca 1,60

1437327_ x_ at

Enoph1 1,60

1456240_x_at

Cdca4 1,60

1443086_at

Alcam 1,60

1442018_at

Btg1 1,60

1418686_at

Oas1c 1,60

1441843_s_at

5230400M03Rik 1,60

1443882_at

Slc26a2 1,60

1420909_at

Vegfe 1,60

1439587_at

Lemd3 1,60

1433169_at

5830456J23Rik 1,60

1437451_at

Ecscr 1,59

1436074_at

Nfkbid 1,59

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1437789_at

Birc6 1,59

1450716_at

Adamtsl 1,59

1438828_at

Rapgef6 1,59

1453064_at

Etaal 1,59

1439047_s_at

Recql 1,59

1435316_at

Psma6 1,59

1428484_at

Osbp13 1,59

1417627_a_at

Limk1 1,59

1459884_at

Cox7c 1,59

1455660_at

Csf2rb 1,59

1448511_at

Ptprcap 1,59

1440245_at

Ccdc88b 1,59

1418587_at

Traf3 1,59

1424339_at

Oasl1 1,58

1416166_a_at

Prdx4 1,58

1427095_at

Cdcp1 1,58

1456288_at

Slfn5 1,58

1452239_at

Gt(ROSA)26Sor 1,58

1449516_a_at

Rgs3 1,58

1424829_at

A830007P12Rik 1,58

1454402_at

Zfp942 1,58

1434139_at

Parp 11 1,58

1428583_at

Nufip2 1,58

1451097_at

Vasp 1,58

1458595_at

Intu 1,58

1457550_at

9530059O14Rik 1,58

1419530_at

Il12b 1,58

1447762_x_at

Car12 1,58

1417588_at

Galnt3 1,58

1437052_s_at

Slc2a3 1,58

1435084_at

C730049014Rik 1,58

1419235_s_at

Helb 1,57

1440147_at

Lgi2 1,57

1460347_at

Krt14 1,57

1452991_at

Chd2 1,57

1429758_at

1700017B05Rik 1,57

1449508_at

Il27ra 1,57

1416087_at

Ap1s1 1,57

1438673_at

Slc4a7 1,57

1438750_at

Atrx 1,57

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1423869_s_at

Txnrd3 1,57

1420692_at

Il2ra 1,57

1449227_at

Ch25h 1,57

1425241_a_at

Wsb1 1,57

1450387_s_at

Ak4 1,56

1427164_at

Il13ra1 1,56

1455084_x_at

Shmt2 1,56

1452169_a_at

Dgkz 1,56

1420505_a_at

Stxbp1 1,56

1455839_at

Uggt1 1,56

1428118_at

Lingo1 1,56

1427539_a_at

Zwint 1,56

1418271_at

Bhlhe22 1,56

1447851_x_at

Atp10a 1,56

1452837_at

Lpin2 1,56

1420171_s_at

Myh9 1,55

1439253_x_at

Prelid1 1,55

1452803_at

Glipr2 1,55

1456914_at

Slc16a4 1,55

1448202_x_at

Prelid1 1,55

1452391_at

Cxadr 1,55

1435595_at

1810011O10Rik 1,55

1452903_at

6230427J02Rik 1,55

1451110_at

Egln1 1,55

1435564_at

Neurl1b 1,55

1422489_at

Mogs 1,55

1452337_at

4930427A07Rik 1,54

1459983_at

Impa2 1,54

1432997_at

5830462P14Rik 1,54

1457304_at

D13Ertd787e 1,54

1417955_at

Ccdc71 1,54

1428034_a_at

Tnfrsf9 1,54

1439455_x_at

Capza1 1,54

1451608_a_at

Tspan33 1,54

1417878_at

E2f1 1,54

1448894_at

Akr1b8 1,54

1455067_at

Psd4 1,53

1457410_at

Arhgap5 1,53

1436848_x_at

Impa1 1,53

1436395_at

Card6 1,53

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1436729_at

Afapl 1,53

1437185_s_at

Tmsb10 1,53

1428018_a_at

AF251705 1,53

1431528_at

5830427D02Rik 1,53

1425760_a_at

Pitpnml 1,53

1418492_at

Grem2 1,53

1445201_at

Zfp53 1,53

1459894_at

Iqgap2 1,53

1438154_x_at

2610002J02Rik 1,53

1434573_at

Traf3ip3 1,53

1433739_at

Nol10 1,53

1434070_at

Jag1 1,52

1423826_at

Noc41 1,52

1416875_at

Parvg 1,52

1447792_x_at

Gpr174 1,52

1417128_at

Plekhol 1,52

1427260_a_at

Tpm3 1,52

1416379_at

Panxl 1,52

1437239_x_at

Phc2 1,52

1451415_at

1810011O10Rik 1,52

1448713_at

Stat4 1,52

1421937_at

Dappl 1,51

1433748_at

Zdhhc18 1,51

1454350_at

Intu 1,51

1429128_x_at

Nfkb2 1,51

1418004_a_at

Tmem176b 1,51

1423154_at

BC005537 1,51

1426677_at

Fina 1,51

1448600_s_at

Vav3 1,51

1457539_at

D10Ertd709e 1,51

1420914_at

Slco2a1 1,51

1429247_at

Anxa6 1,51

1452411_at

Lrrcl 1,51

1449619_s_at

Arhgap9 1,51

1420351_at

Tnfrsf4 1,51

1437242_at

Ttli12 1,51

1439444_x_at

Tmed10 1,50

1448933_at

Pcdhb17 1,50

1434219_at

Stim2 1,50

1455428_at

Fam53b 1,50

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1419226_at

Cd96 1,50

1435169_at

A930001N09Rik 0,67

1451348_at

Deptor 0,67

1425411_at

Arl4a 0,67

1428864_at

Dusp8 0,67

1426522_at

Hadhb 0,67

1417312_at

Dkk3 0,67

1418190_at

Pon1 0,67

1454078_a_at

Gal3st1 0,66

1425145_at

IMrl1 0,66

1417421_at

S100a1 0,66

1460192_at

Osbp11a 0,66

1419963_at

Deptor 0,66

1415743_at

Hdac5 0,66

1435559_at

Myo6 0,66

1450395_at

Slc22a5 0,66

1428469_a_at

Dzip1 0,66

1429884_at

Srgap2 0,66

1450971_at

Gadd45b 0,66

1436344_at

C2cd2 0,66

1418921_at

Cadm3 0,65

1421471_at

Npy1r 0,65

1453571_at

Deptor 0,65

1452283_at

Rassf8 0,65

1416268_at

Ets2 0,65

1423364_a_at

Aktip 0,65

1453069_at

Pik3cb 0,65

1422838_at

Kcnul 0,65

1433977_at

Hs3st3b1 0,65

1426010_a_at

Epb4,113 0,65

1455029_at

Kif21a 0,65

1460406_at

Pls1 0,65

1434581_at

2410066E13Rik 0,65

1422740_at

Tnfrsf21 0,65

1435396_at

Stxbp6 0,65

1419688_at

Gpc6 0,65

1418658_at

Fam82b 0,65

1419457_at

Rgnef 0,65

1443904_at

Fads6 0,65

1425186_at

Lmbrd1 0,65

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1450286_at

Npr3 0,65

1425037_at

Fgd4 0,64

1437871_at

Pgm5 0,64

1416774_at

Wee1 0,64

1458129_at

Rora 0,64

1433460_at

Ttc7b 0,64

1451200_at

Kiflb 0,64

1448320_at

Stim1 0,64

1452309_at

Cgnl1 0,64

1454824_s_at

Mtus1 0,64

1415981_at

Herpud2 0,64

1419505_a_at

Ggps1 0,64

1457686_at

Akap17b 0,63

1437149_at

Slc6a6 0,63

1437661_at

AU021092 0,63

1443906_at

Cd55 0,63

1451714_a_at

Map2k3 0,63

1435693_at

Mall 0,63

1451563_at

Emr4 0,63

1452333_at

Smarca2 0,63

1428835_at

Myh14 0,63

1433711_s_at

Sesn1 0,63

1448669_at

Dkk3 0,63

1416778_at

Sdpr 0,63

1449082_at

Mfap5 0,63

1425891_a_at

Grtp1 0,63

1418250_at

Arl4d 0,63

1458882_at

Serpinb8 0,62

1418714_at

Dusp8 0,62

1431216_s_at

Dnajc6 0,62

1426208_x_at

Plagl1 0,62

1425138_at

Gucalb 0,62

1425318_a_at

Tmem116 0,62

1423176_at

Tob1 0,62

1425515_at

Pik3r1 0,62

1455665_at

Lonrf1 0,62

1426576_at

Sgms1 0,62

1440559_at

Hmga2-ps1 0,62

1417545_at

Trpv4 0,62

1418954_at

Camkk1 0,62

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1424701_at

Pcdh20 0,62

1454881_s_at

Upk3b 0,62

1419378_a_at

Fxyd2 0,62

1448926_at

Hoxa5 0,62

1437731_at

C2cd2 0,62

1436501_at

Mtus1 0,61

1450110_at

Adh7 0,61

1417013_at

Hspb8 0,61

1443969_at

Irs2 0,61

1450206_at

Dlc1 0,61

1428774_at

Gpc6 0,61

1422904_at

Fmo2 0,61

1425321_a_at

Clmn 0,61

1426743_at

Appl2 0,61

1427945_at

Dpyd 0,61

1428321_at

Eml1 0,60

1431226_a_at

Fndc4 0,60

1421848_at

Slc22a5 0,60

1428731_at

Usp54 0,60

1456939_at

Fam154b 0,60

1424408_at

Lims2 0,60

1426139_a_at

Ccrl1 0,60

1426332_a_at

Cldn3 0,60

1416823_a_at

Osbpl1a 0,60

1423994_at

Kif1b 0,60

1415904_at

Lp1 0,60

1429656_at

Rhobtb1 0,60

1421158_at

Cgnl1 0,60

1456150_at

Jhdm1d 0,60

1454604_s_at

Tspan12 0,59

1434307_at

Tmem64 0,59

1431188_a_at

Tom1 0,59

1416926_at

Trp53inp1 0,59

1423447_at

Clpx 0,59

1451782_a_at

Slc29a1 0,59

1423174_a_at

Pard6b 0,59

1436293_x_at

Ildr2 0,59

1444073_at

Maf 0,59

1447462_at

D7Wsu130e 0,59

1424280_at

Mospd1 0,59

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1451270_at

Dusp18 0,59

1451207_at

Micul 0,59

1455056_at

Lmo7 0,59

1437409_s_at

Gpr126 0,59

1436988_at

Ism1 0,58

1420718_at

Odz2 0,58

1425456_a_at

Map2k3 0,58

1450318_a_at

P2rv2 0,58

1436853_a_at

Snca 0,58

1424437_s_at

Abcg4 0,58

1426285_at

Lama2 0,58

1417962_s_at

Ghr 0,58

1455340_at

Dennd5b 0,58

1415874_at

Spry1 0,58

1435105_at

Rnf208 0,58

1428240_at

Nrxn1 0,58

1425906_a_at

Sema3e 0,58

1454926_at

Sphkap 0,58

1416316_at

Slc27a2 0,58

1434917_at

Cobl 0,57

1429778_at

Optn 0,57

1436350_at

Fam171b 0,57

1452207_at

Cited2 0,57

1428547_at

Nt5e 0,57

1426263_at

Cadm4 0,57

1429036_at

Otop3 0,57

1435763_at

Tbcldl6 0,57

1420942_s_at

Rgs5 0,57

1450974_at

Timp4 0,57

1434639_at

Klhl29 0,56

1421346_a_at

Slc6a6 0,56

1433742_at

Kank1 0,56

1435207_at

Dixdc1 0,56

1450838_x_at

Rpl37 0,56

1457671_at

Homer2 0,56

1422008_a_at

Aqp3 0,56

1415864_at

Bpgm 0,56

1437181_at

Peli2 0,56

1416072_at

Cd34 0,56

1460514_s_at

Ascl2 0,56

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1420941_at

Rgs5 0,56

1423966_at

Cd99l2 0,55

1435435_at

Cttnbp2 0,55

1428336_at

Agpat4 0,55

1419458_at

Rgnef 0,55

1424567_at

Tspan2 0,55

1419491_at

Defb1 0,55

1415865_s_at

Bpgm 0,55

1422667_at

Krt15 0,55

1417355_at

Peg3 0,55

1439478_at

Acot2 0,55

1450460_at

Aqp3 0,55

1426510_at

Sccpdh 0,55

1422996_at

Acot2 0,55

1433454_at

Abtb2 0,55

1436640_x_at

Agpat4 0,55

1453008_at

Trnp1 0,55

1424392_at

Adhfe1 0,54

1417332_at

Rfx2 0,54

1419197_x_at

Hamp 0,54

1429001_at

Pir 0,54

1438496_a_at

Ddx26b 0,54

1454699_at

Sesn1 0,54

1437217_at

Ankrd6 0,54

1418412_at

Tpd5211 0,54

1424747_at

Kiflc 0,54

1454646_at

Tcp11l2 0,54

1421040_a_at

Gsta2 0,53

1434326_x_at

Coro2b 0,53

1417027_at

Trim2 0,53

1460242_at

Cd55 0,53

1453119_at

Otud1 0,53

1420688_a_at

Sgce 0,53

1450119_at

Dst 0,53

1448119_at

Bpgm 0,53

1456481_at

Esyt3 0,53

1422168_a_at

Bdnf 0,53

1434542_at

Gpt2 0,52

1422905_s_at

Fmo2 0,52

1425809_at

Fabp4 0,52

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1439549_at

Prrg3 0,52

1448416_at

Mgp 0,52

1437197_at

Sorbs2 0,52

1422619_at

Ppap2a 0,52

1436737_a_at

Sorbs1 0,52

1422620_s_at

Ppap2a 0,52

1427378_at

Krt75 0,52

1416779_at

Sdpr 0,51

1451501_a_at

Ghr 0,51

1423506_a_at

Nnat 0,51

1422974_at

Nt5e 0,51

1425761_a_at

Nfatc1 0,51

1458268_s_at

Igfbp3 0,51

1460241_a_at

St3gal5 0,50

1417028_a_at

Trim2 0,50

1456397_at

Cdh4 0,50

1434156_at

Rab11fip4 0,50

1429024_at

Rbm20 0,50

1441254_at

Pard3b 0,50

1419289_a_at

Syngr1 0,50

1422112_at

Ccbp2 0,50

1444559_at

Phtf2 0,50

1451410_a_at

Crip3 0,50

1420017_at

Tspan8 0,50

1416194_at

Cyp4b1 0,50

1434013_at

Ablim3 0,49

1419706_a_at

Akap12 0,49

1451762_a_at

Kif1b 0,49

1427371_at

Abca8a 0,49

1424007_at

Gdf10 0,49

1424155_at

Fabp4 0,48

1428357_at

2610019F03Rik 0,48

1454654_at

Dirc2 0,48

1456796_at

Snai3 0,48

1417702_a_at

Hnmt 0,48

1450738_at

Kif21a 0,48

1422007_at

Aqp3 0,48

1417014_at

Hspb8 0,47

1438422_at

Lrrc20 0,47

1417029_a_at

Trim2 0,47

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1417673_at

Grb14 0,47

1428471_at

Sorbs 1 0,47

1439117_at

Clmn 0,47

1427946_s_at

Dpyd 0,46

1418317_at

Lhx2 0,46

1424367_a_at

Homer2 0,46

1454691_at

Nrxn1 0,46

1419082_at

Serpinb2 0,46

1434651_a_at

Cldn3 0,46

1460569_x_at

Cldn3 0,45

1431056_a_at

Lp1 0,45

1443832_s_at

Sdpr 0,45

1451701_xat

Cldn3 0,45

1419490_at

Fam19a5 0,45

1428792_at

Bcas1 0,45

1419492_s_at

Defb1 0,45

1424393_s_at

Adhfe1 0,44

1448978_at

Ngef 0,44

1429344_at

9,13E+15 0,44

1437637_at

Phtf2 0,44

1425826_a_at

Sorbs1 0,44

1451620_at

Clql3 0,44

1450759_at

Bmp6 0,43

1433638_s_at

Hoxd8 0,43

1415996_at

Txnip 0,43

1448551_aat

Trim2 0,43

1426981_at

Pcsk6 0,43

1427673_a_at

Sema3e 0,43

1451527_at

Pcolce2 0,43

1434877_at

Nptx1 0,42

1453435_a_at

Fmo2 0,42

1449621_s_at

Thsd1 0,42

1431805_a_at

Rhpn2 0,42

1449824_at

Prg4 0,41

1416129_at

Errfi1 0,41

1434628_a_at

Rhpn2 0,41

1455214_at

Mitf 0,41

1427345_a_at

Sult1a1 0,41

1418205_at

Thsd1 0,40

1419414_at

Gng13 0,40

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1437840_s_at

D2hgdh 0,40

1423635_at

Bmp2 0,40

1423679_at

2810432L12Rik 0,39

1418063_at

Kera 0,39

1434667_at

Col8a2 0,39

1424649_a_at

Tspan8 0,39

1446498_at

Il20ra 0,39

1441918_x_at

Serpinb6e 0,39

1415997_at

Txnip 0,39

1431833_a_at

Hmgcs2 0,38

1418589_a_at

Mlfl 0,38

1419717_at

Sema3e 0,38

1429166_s_at

Clmn 0,38

1435459_at

Fmo2 0,38

1434669_at

Ralgps1 0,38

1431099_at

Hoxd8 0,38

1434657_at

Gls 0,37

1418595_at

Plin4 0,36

1434474_at

Abca5 0,36

1417168_a_at

Usp2 0,36

1427029_at

Htra3 0,35

1456895_at

Cd209b 0,34

1416225_at

Adh1 0,34

1454969_at

Lypd6 0,34

1456741_s_at

Gpm6a 0,34

1442226_at

Sema3e 0,33

1451478_at

Angpt17 0,33

1418706_at

Slc38a3 0,32

1436279_at

Slc26a7 0,32

1460244_at

Upb1 0,32

1459737_s_at

Ttr 0,31

1419816_s_at

Errfi1 0,31

1417765_a_at

Amy1 0,30

1446681_at

BB086117 0,30

1433837_at

8430408G22Rik 0,30

1454965_at

Fam171b 0,29

1433596_at

Dnajc6 0,29

1425357_a_at

Grem1 0,29

1455913_x_at

Ttr 0,29

1433836_a_at

8430408G22Rik 0,28

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1451382_at

Chacl 0,28

1454608_x_at

Ttr 0,26

1433877_at

Fam46b 0,26

1425281_a_at

Tsc22d3 0,25

1451535_at

Il31ra 0,24

1423405_at

Timp4 0,23

1435184_at

Npr3 0,23

1437665_at

Il22ra2 0,22

1456512_at

Pdzrn4 0,22

1417788_at

Sncg 0,21

1460012_at

Wfdc3 0,20

1452543_a_at

Scgb1a1 0,19

1419332_at

Egfl6 0,19

1436643_x_at

Hamp2 0,18

1453327_at

Krt24 0,17

1456487_at

Adcy1 0,14

1449545_at

Fgf18 0,12

Tabla 4. Genes expresados de forma diferencial en piel de alopecia areata de ser humano con respecto a piel de individuos normales. Las biopsias por punción perilesional de 5 pacientes con alopecia areata moteada que no se sometieron a tratamientoslocales o sistémicos se recogieron y se compararon con biopsias de cuero cabelludo de 5 5 individuos sin afectar no relacionados.

ID_Affy

Símbolo Genético FC

221728_x_at

XIST 56,06

211696_x_at

HBB 13,20

204533_at

CXCL10 12,37

203915_at

CXCL9 9,53

204580_at

MMP 12 4,04

235763_at

SLC44A5 3,83

205488_at

GZMA 3,65

223809_at

RGS18 3,54

201858_s_at

SRGN 3,33

215784_at

CD1E 3,19

216714_at

CCL13 3,15

232024_at

GIMAP2 3,13

1555745_a_at

LYZ 3,09

205758_at

CD8A 3,04

214059_at

IFI44 3,03

226736_at

CHURC1 3,02

206749_at

CD1B 2,96

242943_at

ST8SIA4 2,94

ID_Affy

Símbolo Genético FC

204439_at

IFI44L 2,88

210656_at

EED 2,87

220122_at

MCTP1 2,78

210164_at

GZMB 2,75

206134_at

ADAMDEC1 2,70

209875_s_at

SPP1 2,69

206666_at

GZMK 2,68

204110_at

HNMT 2,67

217147_s_at

TRAT1 2,66

204057_at

IRF8 2,64

212588_at

PTPRC 2,63

214467_at

GPR65 2,60

1554899_s_at

FCER1G 2,60

242557_at

ZNRD1-AS1 2,58

209541_at

IGF1 2,58

205991_s at

PRRX1 2,56

228956_at

UGT8 2,55

207651_at

GPR171 2,54

216598_s_at

CCL2 2,54

211742_s_at

EVI2B 2,52

231879_at

COL12A1 2,52

1555827_at

CCNL1 2,51

1552398_a_at

CLEC12A 2,50

213797_at

RSAD2 2,49

211559_s_at

CCNG2 2,47

209612_s_at

ADH1B 2,45

230422_at

FPR3 2,44

221978_at

HLA-F 2,44

212230_at

PPAP2B 2,44

210198_s_at

PLP1 2,43

220330_s_at

SAMSN1 2,42

203561_at

FCGR2A 2,41

239345_at

SLC19A3 2,41

227609_at

EPSTI1 2,41

205226_at

PDGFRL 2,37

1553678_a_at

ITGB1 2,37

206247_at

MICB 2,37

208016_s_at

AGTR1 2,36

1405_i_at

CCL5 2,36

214972_at

MGEA5 2,35

ID_Affy

Símbolo Genético FC

204774_at

EVI2A 2,34

1557116_at

APOL6 2,34

1558604_a_at

SSBP2 2,33

208894_at

HLA-DRA 2,32

219607_s_at

MS4A4A 2,32

238461_at

EIF4E3 2,31

222587_s_at

GALNT7 2,30

214617_at

PRF1 2,30

204222_s_at

GLIPR1 2,29

205039_s_at

IKZF1 2,29

215073_s_at

NR2F2 2,29

220477_s_at

TMEM230 2,29

205270_s_at

LCP2 2,29

226757_at

IFIT2 2,28

1555229_a_at

C1S 2,28

1559584_a_at

C16orf54 2,28

203504_s_at

ABCA1 2,28

202902_s_at

CTSS 2,27

1552612_at

CDC42SE2 2,27

205158_at

RNASE4 2,26

203708_at

PDE4B 2,26

206271_at

TLR3 2,25

205992_s_at

IL15 2,24

228938_at

MBP 2,24

1554712_a_at

GLYATL2 2,24

214279_s_at

NDRG2 2,23

205831_at

CD2 2,22

239364_at

ETV6 2,22

206070_s_at

EPHA3 2,22

224976_at

NFIA 2,22

229584_at

LRRK2 2,21

206693_at

IL7 2,20

1558820_a_at

C18orf34 2,20

213882_at

TM2D1 2,20

229450_at

IFIT3 2,19

203680_ at

PRKAR2B 2,17

210889_s_at

FCGR2B 2,17

227458_at

CD274 2,17

203000_at

STMN2 2,16

226603_at

SAMD9L 2,16

ID_Affy

Símbolo Genético FC

208885_at

LCP1 2,15

222726_s_at

EXOC5 2,15

222722_at

OGN 2,15

1558972_s_at

THEMIS 2,14

204118_at

CD48 2,13

217649_at

ZFAND5 2,13

204972_at

OAS2 2,12

231577_s_at

GBP1 2,11

228218_at

LSAMP 2,11

230867_at

COL6A6 2,11

229383_at

1-Mar 2,11

227677_at

JAK3 2,10

230391_at

CD84 2,09

204923_at

SASH3 2,09

203416_at

CD53 2,08

204116_at

IL2RG 2,08

206307_ s_at

FOXD1 2,08

206120_ at

CD33 2,08

204563_at

SELL 2,07

225957_at

CREBRF 2,07

220416_at

ATP8B4 2,07

200605_ s_at

PRKAR1A 2,07

209006_s_at

C1orf63 2,07

232911_at

ZFP14 2,06

1556209_at

CLEC2B 2,06

1555938_x_at

VIM 2,05

219179_at

DACT1 2,05

206366_x_at

XCL1 2,05

235737_at

TSLP 2,04

206978_at

CCR2 2,04

235175_at

GBP4 2,04

220868_s_at

SLC7A10 2,03

211676_s_at

IFNGR1 2,03

214887_at

N4BP2L1 2,03

230206_at

DOCK5 2,03

203100_ s_at

CDYL 2,02

203471_s_at

PLEK 2,02

208925_at

CLDND1 2,02

202820_ at

AHR 2,02

231366_at

FDPSL2A 2,02

ID_Affy

Símbolo Genético FC

204607_at

HMGCS2 2,01

220199_s_at

AIDA 2,01

204070_at

RARRES3 2,01

227870_ at

IGDCC4 2,01

204865_at

CA3 2,01

205842_s_at

JAK2 2,00

241925_x_at

SLC16A7 2,00

214533_at

CMA1 2,00

209770_at

BTN3A1 1,99

229543_at

FAM26F 1,99

226847_at

FST 1,99

210971_s at

ARNTL 1,98

204279_at

PSMB9 1,98

205291_at

IL2RB 1,98

204959_at

MNDA 1,98

227467_at

RDH10 1,98

206545_at

CD28 1,98

203758_at

CTSO 1,98

214724_at

DIXDC1 1,98

216231_s_at

B2M 1,97

210029_at

IDO1 1,97

206914_at

CRTAM 1,97

211734_s_at

FCER1A 1,97

218404 _at

SNX10 1,96

206960_at

LPAR4 1,96

202742_s_at

PRKACB 1,96

213293_s_at

TRIM22 1,96

1555778_a_at

POSTN 1,96

227266_s_at

FYB 1,96

217465_at

NCKAP1 1,95

244774_at

PHACTR2 1,95

232392_at

SRSF3 1,94

213193_x_at

TRBC 1 1,94

216511_s_at

TCF7L2 1,94

228504_at

SCN7A 1,93

201151_s_at

MBNL1 1,93

242268_at

CELF2 1,92

220777_at

KIF13A 1,92

205987_at

CD1C 1,92

201008_s_at

TXNIP 1,92

ID_Affy

Símbolo Genético FC

202527_s_at

SMAD4 1,91

224480_s_at

AGPAT9 1,91

223220_s_at

PARP9 1,91

209960_at

HGF 1,91

210057_at

SMG1 1,91

203305_at

F13A1 1,91

213649_at

SRSF7 1,90

226392_at

RASA2 1,90

205159_at

CSF2RB 1,90

213435_at

SATB2 1,90

226743_at

SLFN11 1,90

204205_at

APOBEC3G 1,90

203936_s_at

MMP9 1,90

223501_at

TNFSF13B 1,90

212208 _at

MED13L 1,89

203966_s_at

PPM1A 1,89

204438_at

MRC1 1,89

235458_at

HAVCR2 1,89

207610s_at

EMR2 1,89

222859_s_at

DAPP1 1,89

1552628_a_at

HERPUD2 1,89

221207s_at

NBEA 1,88

205101 _at

CIITA 1,88

205083_at

AOX1 1,88

230023_at

NSUN4 1,88

214450_at

CTSW 1,88

1568752_s_at

RGS13 1,88

237919_at

RFFL 1,88

232898_at

DAB2 1,87

234975_at

GSPT1 1,87

227198_at

AFF3 1,87

205799_s_at

SLC3A1 1,87

242974_at

CD47 1,87

1555852_at

LOC100507463 1,87

201604_s_at

PPP1R12A 1,87

244455_at

KCNT2 1,86

210163_at

CXCL11 1,86

219279_at

DOCK10 1,86

203165_s_at

SLC33A1 1,86

222161_at

NAALAD2 1,86

ID_Affy

Símbolo Genético FC

221724_s_at

CLEC4A 1,86

226841_at

MPEG 1 1,86

229713_at

PIP4K2A 1,85

231776_at

EOMES 1,85

209040_ s_at

PSMB8 1,85

221760_at

MAN1A1 1,85

215303_at

DCLK1 1,85

208191_x_at

PSG4 1,85

228057_at

DDIT4L 1,85

230364_at

CHPT1 1,85

206637_at

P2RY14 1,84

218806_s_at

VAV3 1,84

224451_x_at

ARHGAP9 1,84

215363_x_at

FOLH1 1,84

212298_at

NRP1 1,84

206082_at

HCP5 1,84

223271_s_at

CTDSPL2 1,84

222235_s_at

CSGALNACT2 1,84

237753_at

IL21R 1,84

210895_s_at

CD86 1,84

201619_at

PRDX3 1,84

237189_at

HOXB-AS1 1,84

1552658_a_at

NAV3 1,84

205803_s_at

TRPC1 1,83

208121_s_at

PTPRO 1,83

243352_at

ALPK1 1,83

1555749_at

SF1 1,83

227629_at

PRLR 1,83

210896_s_at

ASPH 1,83

211671_s_at

NR3C1 1,83

221423_s_at

YIPF5 1,82

204821_at

BTN3A3 1,82

204951_at

RHOH 1,82

219093_at

PID1 1,82

230177_at

GTF2H2B 1,82

234305_s_at

GSDMC 1,82

204149_s_at

GSTM4 1,82

221428_s_at

TBL1XR1 1,82

219427_at

FAT4 1,82

1565939_at

C5orf22 1,81

ID_Affy

Símbolo Genético FC

238725_at

IRF1 1,81

205681_at

BCL2A1 1,81

203302_at

DCK 1,81

220005_at

P2RY13 1,80

208671_at

SERINC1 1,80

215318_at

MINOS1P1 1,80

223217_s_at

NFKBIZ 1,80

242172_at

MEIS1 1,80

214038_at

CCL8 1,80

201688_s_at

TPD52 1,80

239384_at

FLJ44342 1,80

214917_at

PRKAA1 1,80

201720_ s_at

LAPTM5 1,80

1554462_a_at

DNAJB9 1,79

226702_at

CMPK2 1,79

208131_s_at

PTGIS 1,79

239297_at

KIAA1456 1,79

223802_s_at

RBBP6 1,79

1555193_a_at

ZNF277 1,78

225415_at

DTX3L 1,78

203932_at

HLA-DMB 1,78

203320_at

SH2B3 1,78

228704_s_at

CLDN23 1,78

228094_at

AMICA1 1,78

204955_at

SRPX 1,77

206752_s_at

DFFB 1,77

1557071_s_at

NUB1 1,77

204011_at

SPRY2 1,77

210280_ at

MPZ 1,77

214855_s_at

RALGAPA1 1,77

227900_at

CBLB 1,77

1558523_at

FAM184A 1,77

205280_ at

GLRB 1,77

228225_at

PEX2 1,77

218986_s_at

DDX60 1,76

210184_at

ITGAX 1,76

242900_at

ALG10B 1,76

213016_at

BBX 1,76

208146_s_at

CPVL 1,76

1556498_at

FAM69A 1,76

ID_Affy

Símbolo Genético FC

206420_at

IGSF6 1,76

205660_at

OASL 1,76

225700_ at

GLCCI1 1,76

1554479_a_at

CARD8 1,76

210176_at

TLR1 1,76

203157_s_at

GLS 1,76

207113_s_at

TNF 1,76

228617_at

XAF1 1,76

205907_s_at

OMD 1,76

202411_at

IFI27 1,75

204567_s_at

ABCG1 1,75

209788_s_at

ERAP1 1,75

213426_s_at

CAV2 1,75

225980_at

C14orf43 1,75

220560_at

C11orf21 1,75

1559265_at

SKIDA1 1,75

238858_at

TIFA 1,75

210538_s_at

BIRC3 1,75

207957_s_at

PRKCB 1,75

207175_ at

ADIPOQ 1,74

229866_at

STK32A 1,74

216198_at

ATF7IP 1,74

235228_at

CCDC85A 1,74

205821_at

KLRK1 1,74

203387_s_at

TBC1D4 1,74

226459_at

PIK3AP1 1,74

233898_s_at

FGFR1OP2 1,74

220103_s_at

MRPS18C 1,73

239921_at

COL28A1 1,73

227910_at

XPNPEP3 1,73

203741_s_at

ADCY7 1,73

229431_at

RFXAP 1,73

226641_at

ANKRD44 1,73

205934_at

PLCL1 1,73

225975_at

PCDH18 1,73

215990_ s_at

BCL6 1,73

201417_at

SOX4 1,73

241440_ at

FLJ30375 1,73

231955_s_at

HIBADH 1,72

234165_at

PTGDR 1,72

ID_Affy

Símbolo Genético FC

219292_at

THAP1 1,72

1567628_at

CD74 1,72

203434_s_at

MME 1,72

211922_s_at

CAT 1,72

210571_s_at

CMAHP 1,72

206030_ at

ASPA 1,72

1554547_at

FAM13C 1,72

207977_s_at

DPT 1,72

219230_at

TMEM100 1,72

213475_s_at

ITGAL 1,72

227529_s_at

AKAP12 1,72

227148_at

PLEKHH2 1,72

243407_at

MFSD8 1,72

223620_at

GPR34 1,72

214181_x_at

LST1 1,72

208510_s_at

PPARG 1,72

235165_at

PARD6B 1,71

218400_at

OAS3 1,71

228826_at

BZRAP1-AS1 1,71

206098_at

ZBTB6 1,71

209869_at

ADRA2A 1,71

1552497_a_at

SLAMF6 1,71

204614_at

SERPINB2 1,71

213496_at

LPPR4 1,71

244395_at

FLJ41455 1,71

225163_at

FRMD4A 1,71

219528_s_at

BCL11B 1,71

220014_ at

PRR16 1,71

221024_s_at

SLC2A10 1,71

229523_at

TMEM200C 1,71

201951_at

ALCAM 1,71

222538_s_at

APPL1 1,71

222791_at

RSBN1 1,71

229568_at

MOB3B 1,71

238449_at

LOC595101 1,70

1555349_a_at

ITGB2 1,70

217816_s_at

PCNP 1,70

1556364_at

ADAMTS9-AS2 1,70

228368_at

ARHGAP20 1,70

206157_at

PTX3 1,70

ID_Affy

Símbolo Genético FC

242852_at

LOC285147 1,70

207606_s_at

ARHGAP12 1,69

210425_x_at

GOLGA8B 1,69

224583_at

COTL1 1,69

222839_s_at

PAPOLG 1,69

1557954_at

TXLNG 1,69

213289_at

APOOL 1,69

225579_at

PQLC3 1,69

1554464_a_at

CRTAP 1,69

228618_at

PEAR1 1,69

233005_at

ZNHIT6 1,68

203991_s_at

KDM6A 1,68

227857_at

APMAP 1,68

241698_at

RFTN2 1,68

215046_at

KANSL1L 1,68

212850_s_at

LRP4 1,68

205098_at

CCR1 1,68

204646_at

DPYD 1,68

232563_at

ZNF684 1,68

206181_at

SLAMF1 1,67

228167_at

KLHL6 1,67

210839_s_at

ENPP2 1,67

221039_s_at

ASAP1 1,67

202957_at

HCLS1 1,67

210321_at

GZMH 1,67

228948_at

EPHA4 1,67

223854_at

PCDHB10 1,67

229222_at

ACSS3 1,67

220327_at

VGLL3 1,67

1552370_at

C4orf33 1,67

238907_at

ZNF780A 1,67

206715_at

TFEC 1,67

213603_s_at

RAC2 1,67

210279_at

GPR18 1,67

238520_ at

TRERF1 1,67

232137_at

ZNF616 1,67

225769_at

COG6 1,67

235970_at

LCORL 1,67

213566_at

RNASE6 1,67

216944_s_at

ITPR1 1,66

ID_Affy

Símbolo Genético FC

202983_at

HLTF 1,66

220532_s_at

TMEM176B 1,66

235226_at

CDK19 1,66

205839_s_at

BZRAP1 1,66

219033_at

PARP8 1,66

207277_at

CD209 1,66

218236_s_at

PRKD3 1,66

37793_r_at

RAD51D 1,66

230403_at

RFX3 1,66

225992_at

MLLT10 1,66

243664_at

TXNL1 1,65

229234_at

ZC3H12B 1,65

1569652_at

MLLT3 1,65

201311_s_at

SH3BGRL 1,65

212262_at

QKI 1,65

244572_at

KY 1,65

1553764_a_at

AJUBA 1,65

207861_at

CCL22 1,65

203639_s_at

FGFR2 1,65

229828_at

CDC73 1,65

220146_at

TLR7 1,65

241808_at

ZC2HC1A 1,65

229309_at

ADRB1 1,65

218614_at

KIAA1551 1,65

213415_at

CLIC2 1,65

224339_s_at

ANGPTL1 1,65

223696_at

ARSD 1,64

1566472_s_at

RETSAT 1,64

218197_s_at

OXR1 1,64

242940_x_at

DLX6 1,64

226932_at

SSPN 1,64

34210_at

CD52 1,64

209555_s_at

CD36 1,64

232234_at

SLA2 1,64

205234_at

SLC16A4 1,64

211776_s_at

EPB41L3 1,64

235304_at

LOC100507486 1,64

224682_at

ANKIB1 1,64

204719_at

ABCA8 1,64

212558_at

SPRY1 1,64

ID_Affy

Símbolo Genético FC

219743_at

HEY2 1,64

1555600_s_at

APOL4 1,64

215013_s_at

USP34 1,64

230783_at

LOC283713 1,64

223595_at

TMEM133 1,64

213539_at

CD3D 1,64

209357_at

CITED2 1,64

218345_at

TMEM176A 1,64

226655_at

STX17 1,63

225499_at

RALGAPA2 1,63

213915_at

NKG7 1,63

209821_at

IL33 1,63

217257_at

SH3BP2 1,63

214470_at

KLRB1 1,63

228869_at

SNX20 1,63

217478_s_at

HLA-DMA 1,63

243747_at

ZNF599 1,63

37145_at

GNLY 1,63

209949_at

NCF2 1,63

1563458_at

PARVA 1,63

226508_at

PHC3 1,63

206373_at

ZIC1 1,63

203372_s_at

SOCS2 1,63

218344_s_at

RCOR3 1,63

204174_at

ALOX5AP 1,63

212655_at

ZCCHC14 1,63

206513_at

AIM2 1,62

205486_at

TESK2 1,62

207782_s_at

PSEN1 1,62

238438_at

CNOT6L 1,62

230381_at

C1orf186 1,62

202765_s_at

FBN1 1,62

1565162_s_at

MGST1 1,62

235840_at

ZKSCAN3 1,62

1558346_at

COX17 1,62

205624_at

CPA3 1,62

202579_x_at

HMGN4 1,62

214913_at

ADAMTS3 1,62

1556069_s_at

HIF3A 1,62

235051_at

CCDC50 1,62

ID_Affy

Símbolo Genético FC

236782_at

SAMD3 1,62

236673_at

TIFAB 1,62

233641_s_at

FAM167A 1,62

225426_at

PPP6C 1,62

215310_ at

APC 1,61

1556277_a_at

PAPD4 1,61

227553_at

PIK3R5 1,61

1553718_at

ZNF548 1,61

212746_s_at

CEP170 1,61

219684_at

RTP4 1,61

205225_at

ESR1 1,61

204103_at

CCL4 1,61

205859_at

LY86 1,61

212704_at

ZCCHC11 1,61

208893_s_at

DUSP6 1,61

206618_at

IL18R1 1,61

212502_at

ADO 1,61

213160_at

DOCK2 1,61

204042_at

WASF3 1,61

203275_at

IRF2 1,61

201741_x_at

SRSF1 1,61

219023_at

AP1AR 1,61

217989_at

HSD17B11 1,61

203156_at

AKAP11 1,61

201133_s_at

PJA2 1,61

231558_at

INSM1 1,60

226381_at

LOC100506748 1,60

231779_at

IRAK2 1,60

242680_at

AVPR1A 1,60

232197_x_at

ARSB 1,60

203199_s_at

MTRR 1,60

235171_at

LOC100505501 1,60

206974_at

CXCR6 1,60

1561226_at

XCR1 1,60

206584_at

LY96 1,60

202995_s_at

FBLN1 1,60

217504_at

ABCA6 1,60

207375_s_at

IL15RA 1,60

1559369_at

C5orf44 1,60

216250_s_at

LPXN 1,60

ID_Affy

Símbolo Genético FC

235648_at

ZNF567 1,59

224797_at

ARRDC3 1,59

1552670_a_at

PPP1R3B 1,59

223320_s_at

ABCB10 1,59

202430_s_at

PLSCR1 1,59

209708_at

MOXD1 1,59

206589_at

GFI1 1,59

222414_at

MLL3 1,59

223588_at

THAP2 1,59

213208_at

KIAA0240 1,59

203153_at

IFIT1 1,59

223343_at

MS4A7 1,59

155599_s_at

EIF4A2 1,59

219666_at

MS4A6A 1,59

215446_s_at

LOX 1,59

235160_at

ATF7 1,59

229480_at

MAGI2-AS3 1,59

204122_at

TYROBP 1,59

228967_at

EIF1 1,59

230141_at

ARID4A 1,59

226366_at

SHPRH 1,58

218854_at

DSE 1,58

219895_at

FAM70A 1,58

226344_at

ZMAT1 1,58

207068_at

ZFP37 1,58

227025_at

PPHLN1 1,58

222496_s_at

RBM47 1,58

219694_at

FAM105A 1,58

205220_ at

HCAR3 1,58

203645_s_at

CD163 1,58

239651_at

ANAPC5 1,58

1555812_a_at

ARHGDIB 1,58

226908_at

LRIG3 1,58

212956_at

TBC1D9 1,58

229560_at

TLR8 1,58

231610_at

TTBK2 1,58

204176_at

KLHL20 1,58

205307_s_at

KMO 1,58

229618_at

SNX16 1,58

213596_at

CASP4 1,58

ID_Affy

Símbolo Genético FC

208666_s_at

ST13 1,58

238678_at

FLJ45340 1,58

219161_s_at

CKLF 1,58

217777_s_at

PTPLAD1 1,58

209582_s_at

CD200 1,57

235155_at

BDH2 1,57

205407_at

RECK 1,57

215493_x_at

BTN2A1 1,57

242979_at

IRS1 1,57

212277_at

MTMR4 1,57

213170_at

GPX7 1,57

214146_s_at

PPBP 1,57

210354_at

IFNG 1,57

226181_at

TUBE 1 1,57

224600_at

CGGBP1 1,57

206519_x_at

SIGLEC6 1,57

212672_at

ATM 1,57

207431_s_at

DEGS1 1,56

226358_at

APH1B 1,56

208450_at

LGALS2 1,56

212820_at

DMXL2 1,56

205191_at

RP2 1,56

218486_at

KLF11 1,56

225931_s_at

RNF213 1,56

241399_at

FAM19A2 1,56

224701_at

PARP14 1,56

205127_at

PTGS1 1,56

226799_at

FGD6 1,56

227475_at

FOXQ1 1,56

230413_s_at

AP1S2 1,56

242521_at

LOC100505812 1,56

44790_s_at

KIAA0226L 1,56

204032_at

BCAR3 1,56

224865_at

FAR1 1,56

221556_at

CDC14B 1,56

230158_at

DPY19L2 1,56

217915_s_at

RSL24D1 1,56

243370_at

CAPRJN1 1,56

227722_at

RPS23 1,55

212486_s_at

FYN 1,55

ID_Affy

Símbolo Genético FC

220992_s_at

TRMT1L 1,55

205421_at

SLC22A3 1,55

214070_s_at

ATP10B 1,55

1556300_s_at

SIM1 1,55

206170_ at

ADRB2 1,55

217104_at

ST20 1,55

212530_at

NEK7 1,55

227226_at

MRAP2 1,55

201455_s_at

NPEPPS 1,55

1553150_at

KDM1B 1,55

202181_at

KIAA0247 1,55

222279_at

HLA-F-AS1 1,55

214732_at

SP1 1,55

205433_at

BCHE 1,55

206682_at

CLEC10A 1,54

236539_at

PTPN22 1,54

212598_at

WDFY3 1,54

226251_at

ASXL2 1,54

215743_at

NMT2 1,54

1559490_at

LRCH3 1,54

238453_at

FGFBP3 1,54

226878_at

HLA-DOA 1,54

220770_s_at

C5orf54 1,54

209892_at

FUT4 1,54

206765_at

KCNJ2 1,54

202377_at

LEPROT 1,54

235450_ at

FBXL4 1,54

219599_at

EIF4B 1,54

238581_at

GBP5 1,54

221231_s_at

C14orf102 1,54

212764_at

ZEB1 1,54

214162_at

LOC284244 1,54

227425_at

REPS2 1,53

221823_at

C5orf30 1,53

227428_at

GABPA 1,53

204451_at

FZD1 1,53

211089_s_at

NEK3 1,53

203799_at

CD302 1,53

224965_at

GNG2 1,53

206159_at

GDF10 1,53

ID_Affy

Símbolo Genético FC

207181_s_at

CASP7 1,53

1556770_a_at

FBXL13 1,53

212408_at

TOR1AIP1 1,53

201653_at

CNIH 1,53

235520_at

ZNF280C 1,53

1553906_s_at

FGD2 1,53

233241_at

PLK1S1 1,53

228728_at

CPED1 1,53

225872_at

SLC35F5 1,53

229067_at

SRGAP2C 1,53

209969_s_at

STAT1 1,53

1554062_at

XG 1,53

211548_s_at

HPGD 1,53

215023_s_at

PEX1 1,53

210135_s_at

SHOX2 1,53

215307_ at

ZNF529 1,53

226326_at

PCGF5 1,53

222659_at

IPO11 1,52

227351_at

C16orf52 1,52

202510_ s_at

TNFAIP2 1,52

204114_at

NID2 1,52

210355_at

PTHLH 1,52

221950_at

EMX2 1,52

226884_at

LRRN1 1,52

226741_at

SLC12A6 1,52

202073_ at

OPTN 1,52

236244_at

HNRNPU 1,52

210340_s_at

CSF2RA 1,52

228788_at

YPEL1 1,52

214581_x_at

TNFRSF21 1,52

201422_at

IFI30 1,52

204172_at

CPOX 1,52

225207_ at

PDK4 1,52

205590_at

RASGRP1 1,52

227210_ at

SFMBT2 1,52

231975_s_at

MIER3 1,52

212067_s_at

C1R 1,52

202026_at

SDHD 1,52

1555858_at

LOC440944 1,52

219940_s_at

PCID2 1,52

ID_Affy

Símbolo Genético FC

207339_s_at

LTB 1,52

235537_at

OCIAD1 1,52

238081_at

WDFY3-AS2 1,52

218769_s_at

ANKRA2 1,51

212406_s_at

PCMTD2 1,51

235885_at

P2RY12 1,51

227171_at

CCT4 1,51

209546_s_at

APOL1 1,51

204591_at

CHL1 1,51

213974_at

ADAMTSL3 1,51

221757_at

PIK3IP1 1,51

220350_ at

ZNF235 1,51

213605_s_at

LOC728093 1,51

235151_at

LOC283357 1,51

239237_at

LOC100506776 1,51

219209_at

IFIH1 1,51

205498_at

GHR 1,51

218918_at

MAN1C1 1,51

203097_s_at

RAPGEF2 1,51

1556116_s_at

TNPO1 1,51

239843_at

RIT1 1,51

228010_at

PPP2R2C 1,51

209687_at

CXCL12 1,51

213095_x_at

AIF1 1,51

208018_s_at

HCK 1,51

211958_at

IGFBP5 1,51

238923_at

SPOP 1,51

234888_at

CACHD1 1,51

201218_at

CTBP2 1,51

218311_at

MAP4K3 1,51

202171_at

VEZF1 1,51

229969_at

SEC63 1,51

230780_at

LOC730091 1,51

1564276_at

C5orf56 1,50

209168_at

GPM6B 1,50

222938_x_at

ENPP3 1,50

205051_s_at

KIT 1,50

231993_at

ITGBL1 1,50

221965_at

MPHOSPH9 1,50

222218_s_at

PILRA 1,50

ID_Affy

Símbolo Genético FC

222572_at

PDP1 1,50

222075_s_at

OAZ3 0,67

1555677_s_at

SMC1A 0,67

223894_s_at

AKTIP 0,67

218488_at

EIF2B3 0,67

226355_at

POC1A 0,67

239319_at

LOC728342 0,67

202041_s_at

FIBP 0,67

229119_s_at

ZSWIM7 0,67

212123_at

TCTN3 0,67

206653_at

POLR3G 0,67

202570_s_at

DLGAP4 0,66

213546_at

DKFZP58611420 0,66

220021_at

TMC7 0,66

219944_at

CLIP4 0,66

219693_at

AGPAT4 0,66

229900_at

CD109 0,66

219395_at

ESRP2 0,66

227844_at

FMNL3 0,66

202870_s_at

CDC20 0,66

200643_at

HDLBP 0,66

40850_at

FKBP8 0,66

229635_at

LOC100505702 0,66

227410_at

FAM43A 0,66

204328_at

TMC6 0,66

220244_at

LINC00312 0,66

225496_s_at

SYTL2 0,66

213571_s_at

EIF4E2 0,66

208297_s_at

EVI5 0,66

208932_at

PPP4C 0,66

230362_at

INPP5F 0,66

222810_s_at

RASAL2 0,66

200601_at

ACTN4 0,66

210480_s_at

MYO6 0,66

214752_x_at

FLNA 0,66

213067_at

MYH10 0,66

227477_at

ZMYND19 0,66

224898_at

WDR26 0,66

223701_ s_at

USP47 0,66

207865_s_at

BMP8B 0,66

ID_Affy

Símbolo Genético FC

220203_at

BMP8A 0,66

206312_at

GUCY2C 0,66

203727_at

SKIV2L 0,66

202756_s_at

GPC1 0,66

213899_at

METAP2 0,66

242624_at

ABLIM2 0,66

205423_at

AP1B1 0,66

207321_s_at

ABCB9 0,66

235536_at

SNORD89 0,66

241436_at

SCNN1G 0,66

213008_at

FANCI 0,66

201291_s_at

TOP2A 0,66

206034_at

SERPINB8 0,66

239196_at

ANKRD22 0,66

225788_at

RRP36 0,66

235086_at

THBS1 0,66

204616_at

UCHL3 0,66

221063_x_at

RNF123 0,66

203382_s_at

APOE 0,66

1552314_a_at

EYA3 0,66

1554049_s_at

DCAF8 0,66

232074_at

PRSS27 0,66

229936_at

GFRA3 0,65

205138_s_at

UST 0,65

227060_ at

RELT 0,65

205268_s_at

ADD2 0,65

213822_s_at

UBE3B 0,65

219842_at

ARL15 0,65

204840_ s_at

EEA1 0,65

235948_at

RIMKLA 0,65

208676_s_at

PA2G4 0,65

210020_x_at

CALML3 0,65

227898_s_at

ZFP41 0,65

200710_ at

ACADVL 0,65

207390_s_at

SMTN 0,65

218360_at

RAB22A 0,65

204454_at

LDOC1 0,65

211564_s_at

PDLIM4 0,65

201911_s_at

FARP1 0,65

214374_s_at

PPFIBP1 0,65

ID_Affy

Símbolo Genético FC

212374_at

FEM1B 0,65

208555_x_at

CST2 0,65

225591_at

FBXO25 0,65

217933_s_at

LAP3 0,65

1569064_at

C15orf62 0,65

1569868_s_at

EME2 0,65

226615_at

XPR1 0,65

226697_at

FAM114A1 0,65

235998_at

RHPN1 0,65

200598_s_at

HSP90B1 0,65

235709_at

GAS2L3 0,65

212878_s_at

KLC1 0,65

221005_s_at

PTDSS2 0,65

238528_at

UBR1 0,65

225955_at

METRNL 0,65

202107_s_at

MCM2 0,65

202806_at

DBN1 0,65

1554333_at

DNAJA4 0,65

223682_s_at

EIF1AD 0,65

214324_at

GP2 0,65

202109_at

ARFIP2 0,65

214337_at

COPA 0,65

203634_s_at

CPT1A 0,65

227318_at

TMEM178B 0,65

222240_s_at

ISYNA1 0,65

221713_s_at

MAP6D1 0,65

209912_s_at

AP5Z1 0,65

218489_s_at

ALAD 0,65

227880_s_at

TMEM185A 0,65

223419_at

FBXW9 0,65

222348_at

MAST4 0,65

209848_s_at

PMEL 0,65

219904_at

ZSCAN5A 0,65

231928_at

HES2 0,65

244889_at

LOC388210 0,65

205521_at

EXOG 0,65

1552296_at

BEST4 0,65

203722_at

ALDH4A1 0,65

221585_at

CACNG4 0,65

202714_s_at

KIAA0391 0,65

ID_Affy

Símbolo Genético FC

232270_at

C9orf3 0,65

219084_at

NSD1 0,65

202356_s_at

GTF2F1 0,65

208190_s_at

LSR 0,64

221521_s_at

GINS2 0,64

228236_at

SLC52A3 0,64

227217_at

WNK2 0,64

238460_at

FAM83A 0,64

206277_at

P2RY2 0,64

226359_at

GTPBP1 0,64

1552578_a_at

MYO3B 0,64

216212_s_at

DKC1 0,64

215235_at

SPTAN1 0,64

221981_s_at

WDR59 0,64

203263_s_at

ARHGEF9 0,64

210428_s_at

HGS 0,64

225794_s_at

C22orf32 0,64

226313_at

C10orf35 0,64

204608_at

ASL 0,64

230674_at

LGR4 0,64

219560_at

C22orf29 0,64

225301_s_at

MYO5B 0,64

219555_s_at

CENPN 0,64

219358_s_at

ADAP2 0,64

1559399_s_at

ZCCHC10 0,64

233167_at

SELO 0,64

202315_s_at

BCR 0,64

226009_at

DPCD 0,64

229380_at

ILDR2 0,64

223518_at

DFFA 0,64

1558173_a_at

LUZP1 0,64

202391_at

BASP 1 0,64

224987_at

C6orf89 0,64

204378_at

BCAS1 0,64

201353_s_at

BAZ2A 0,64

1569659_at

LOC100506895 0,64

238594_x_at

DUSP8 0,64

202580_x_at

FOXM1 0,64

208998_at

UCP2 0,64

1557165_s_at

KLHL18 0,64

ID_Affy

Símbolo Genético FC

205164_at

GCAT 0,64

212563_at

BOP1 0,64

211846_s_at

PVRL1 0,64

240233_at

LOC100506714 0,64

212983_at

HRAS 0,64

242283_at

DNAH14 0,64

228922_at

SHF 0,64

202924_s_at

PLAGL2 0,64

208693_s_at

GARS 0,64

218874_s_at

ATAT1 0,64

222245_s_at

FER1L4 0,64

225193_at

KIAA1967 0,64

225096_at

C17orf79 0,64

202461_at

EIF2B2 0,64

219916_s_at

RNF39 0,64

217785_s_at

YKT6 0,64

202705_at

CCNB2 0,64

211531_x_at

PRB1 0,64

226027_at

SWI5 0,64

203201_at

PMM2 0,64

209667_at

CES2 0,64

203903_s_at

HEPH 0,64

1552803_a_at

STMN1 0,64

205348_s_at

DYNC1I1 0,64

231406_at

ORAI2 0,64

232203_at

NKD 1 0,64

213467_at

RND2 0,64

209495_at

CEP250 0,63

216555_at

PRR14L 0,63

229494_s_at

PHLDA2 0,63

231233_at

KDM5B-AS1 0,63

242729_at

TTN-AS1 0,63

38710_at

OTUB1 0,63

204256_at

ELOVL6 0,63

218619_s_at

SUV39H1 0,63

1557136_at

ATP13A4 0,63

242722_at

LMO7 0,63

1569044_at

CDC42BPG 0,63

1553226_at

LINC00052 0,63

1552389_at

C8orf47 0,63

ID_Affy

Símbolo Genético FC

219752_at

RASAL1 0,63

213096_at

TMCC2 0,63

209679_s_at

SMAGP 0,63

224227_s_at

BDP1 0,63

204879_at

PDPN 0,63

203235_at

THOP1 0,63

220482_s_at

SERGEF 0,63

205864_at

SLC7A4 0,63

205796_at

TCP11L1 0,63

229405_at

KIF7 0,63

205375_at

MDFI 0,63

228587_at

FAM83G 0,63

1553211_at

ANKFN1 0,63

227437_at

LOC100506668 0,63

225682_s_at

POLR3H 0,63

232322_x_at

STARD10 0,63

219722_s_at

GDPD3 0,63

225751_at

RBM17 0,63

223346_at

VPS18 0,63

208637_x_at

ACTN1 0,63

204958_at

PLK3 0,63

207525_s_at

GIPC1 0,63

201797_s_at

VARS 0,63

2028_s_at

E2F1 0,62

205145_s_at

MYL5 0,62

205436_s_at

H2AFX 0,62

203668_at

MAN2C1 0,62

229581_at

ELFN1 0,62

55065_at

MARK4 0,62

229933_at

Clorf74 0,62

218257_s_at

UGGT1 0,62

238909_at

S100A10 0,62

235461_at

TET2 0,62

220308_at

CCDC19 0,62

205547_s_at

TAGLN 0,62

223919_at

TP53AIP1 0,62

230104_s_at

TPPP 0,62

235852_at

STON2 0,62

1564231_at

IFT80 0,62

38340_at

HIP1R 0,62

ID_Affy

Símbolo Genético FC

219785_s_at

FBXO31 0,62

226828_s_at

HEYL 0,62

210081_at

AGER 0,62

227283_at

EFR3B 0,62

221779_at

MICALL1 0,62

215714_s_at

SMARCA4 0,62

229004_at

ADAMTS15 0,62

238703_at

FAM207A 0,62

204284_at

PPP1R3C 0,62

217080_s_at

HOMER2 0,62

213270_ at

MPP2 0,62

222622_at

PGP 0,62

1554469_at

ZBTB44 0,62

1552755_at

C9orf66 0,62

231230_at

KCNK10 0,62

1568617_a_at

CAMSAP3 0,62

226373_at

SFXN5 0,62

220620_at

CRCT1 0,62

1553023_a_at

NOX5 0,62

238028_at

C6orf132 0,62

212570_at

ENDOD1 0,62

1569787_at

RFTN1 0,62

204745_x_at

MT1G 0,62

230847_at

WRNIP1 0,62

227744_s_at

HNRNPD 0,61

223078_s_at

TMOD3 0,61

205592_at

SLC4A1 0,61

201149_s_at

TIMP3 0,61

210065_s_at

UPK1B 0,61

203612_at

BYSL 0,61

240288_at

KCNRG 0,61

227672_at

C8orf73 0,61

210689_ at

CLDN14 0,61

1554804_a_at

CLDN19 0,61

31846_at

RHOD 0,61

214657_s_at

NEAT1 0,61

222783_s_at

SMOC1 0,61

227069_at

CUX1 0,61

243362_s_at

LEF1-AS1 0,61

215471_s_at

MAP7 0,61

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1552618_at

STX6 0,61

214073_at

CTTN 0,61

221389_at

PLA2G2E 0,61

218376_s_at

MICAL1 0,61

225317_at

ACBD6 0,61

200611_s_at

WDR1 0,61

235683_at

SESN3 0,61

206315_at

CRLF 1 0,61

230092_at

UBXN10 0,61

220953_s_at

MTMR12 0,61

210357_s_at

SMOX 0,61

203004_s_at

MEF2D 0,61

205214_at

STK17B 0,61

209945_s_at

GSK3B 0,61

238625_at

Clorf168 0,61

212154_at

SDC2 0,61

229854_at

OBSCN 0,61

228274_at

SDSL 0,61

1563796_s_at

EARS2 0,61

222671_s_at

JMJD4 0,61

219844_at

C10orf118 0,60

212810_ s_at

SLC1A4 0,60

209922_at

BRAP 0,60

219271_at

GALNT14 0,60

222222_s_at

HOMER3 0,60

205918_at

SLC4A3 0,60

210609_s_at

TP53I3 0,60

1554038_at

LARP1B 0,60

239061_at

TPRXL 0,60

200720_s_at

ACTR1A 0,60

218961_s_at

PNKP 0,60

210624_s_at

ILVBL 0,60

202525_at

PRSS8 0,60

233208_x_at

CPSF2 0,60

204736_s_at

CSPG4 0,60

202005_at

ST14 0,60

1558281_a_at

TMEM184A 0,60

239263_at

LOC100506813 0,60

218960_at

TMPRSS4 0,60

201516_at

SRM 0,60

ID_Affy

Símbolo Genético FC

239174_at

LOC100505912 0,60

210021_s_at

CCNO 0,60

217150_s_at

NF2 0,60

201861_s_at

LRRFIP 1 0,60

219976_at

HOOK1 0,60

212834_at

DDX52 0,60

37408_at

MRC2 0,60

218906_x_at

KLC2 0,60

228068_at

GOLGA7B 0,60

1554095_at

RBM33 0,60

238636_at

CACNA1C 0,60

1560068_a_at

LOC729870 0,60

237169_at

TNC 0,60

218872_at

TESC 0,60

65635_at

ENGASE 0,60

229084_at

CNTN4 0,60

1558050_at

EIF2B5 0,60

206828_at

TXK 0,60

239707_at

SLC5A10 0,60

208622_s_at

EZR 0,60

214763_at

ACOT11 0,60

208002_s_at

ACOT7 0,59

217930_s_at

TOLLIP 0,59

219194_at

SEMA4G 0,59

204857_at

MAD1L1 0,59

209037_s_at

EHD1 0,59

219806_s_at

C11orf75 0,59

1553672_at

ENAH 0,59

1556308_at

PRRT3 0,59

203367_at

DUSP14 0,59

224097_s_at

F11R 0,59

1554701_a_at

TBC1D16 0,59

232069_at

KIF26A 0,59

228515_at

LOC90784 0,59

216804_s_at

PDLIM5 0,59

226584_s_at

FAM110A 0,59

227506_at

SLC16A9 0,59

202198_s_at

MTMR3 0,59

226661_at

CDCA2 0,59

219529_at

CLIC3 0,59

ID_Affy

Símbolo Genético FC

228900_at

SPECC1 0,59

211702_s_at

USP32 0,59

225249_at

SPPL2B 0,59

225160_x_at

MDM2 0,59

203027_s_at

MVD 0,59

222435_s_at

UBE2J1 0,59

223471_at

RAB3IP 0,59

232300_at

LOC100133190 0,59

214838_at

SFT2D2 0,59

228176_at

S1PR3 0,59

200924_s_at

SLC3A2 0,59

222874_s_at

CLN8 0,59

206858_s_at

HOXC6 0,59

229275_at

IGFN1 0,59

217924_at

C6orf106 0,59

228303_at

GALNT6 0,59

214490_at

ARSF 0,58

228996_at

RC3H1 0,58

203287_at

LAD1 0,58

219229_at

SLCO3A1 0,58

1553352_x_at

ERVW-1 0,58

227174_at

WDR72 0,58

231609_at

C10orf82 0,58

1570156_s_at

FMN1 0,58

228235_at

MGC16121 0,58

209442_x_at

ANK3 0,58

212915_at

PDZRN3 0,58

229715_at

NCR3LG1 0,58

204657_s_at

SHB 0,58

233123_at

SLC40A1 0,58

201050_at

PLD3 0,58

1553785_at

RASGEF1B 0,58

228360_ at

LYPD6B 0,58

1554821_a_at

ZBED1 0,58

203842_s_at

MAPRE3 0,58

1555783_x_at

PQLC2 0,58

205872_x_at

PDE4DIP 0,58

212807_s_at

SORT1 0,58

205406_s_at

SPA17 0,58

235095_at

CCDC64B 0,58

ID_Affy

Símbolo Genético FC

203707_ at

ZNF263 0,58

237981_at

CMYA5 0,58

237423_at

RSPO4 0,58

243955_at

LOC388820 0,57

216222_s_at

MYO10 0,57

230976_at

AK8 0,57

225258_at

FBLIM1 0,57

206044_s_at

BRAF 0,57

226535_at

ITGB6 0,57

202402_s_at

CARS 0,57

215547_at

TSC22D2 0,57

201043_s_at

ANP32A 0,57

205948_at

PTPRT 0,57

223461_at

TBC1D7 0,57

1553710_at

FAM218A 0,57

212686_at

PPM1H 0,57

239569_at

FLJ31485 0,57

202275_at

G6PD 0,57

211538_s_at

HSPA2 0,57

202895_s_at

SIRPA 0,57

204556_s_at

DZIP 1 0,57

214433_s_at

SELENBP1 0,57

206472_s_at

TLE3 0,57

220193_at

SH3D21 0,57

230144_at

GRIA3 0,57

204420_ at

FOSL1 0,57

234925_at

LOC732275 0,57

200906_s_at

PALLD 0,56

229929_at

SPSB4 0,56

209589_s_at

EPHB2 0,56

213793_s_at

HOMER1 0,56

218876_at

TPPP3 0,56

213385_at

CHN2 0,56

223468_s_at

RGMA 0,56

217966_s_at

FAM129A 0,56

213607_x_at

NADK 0,56

204730_at

RIMS3 0,56

203160_s_at

RNF8 0,56

229163_at

CAMK2N1 0,56

243209_at

KCNQ4 0,56

ID_Affy

Símbolo Genético FC

213358_at

SOGA2 0,56

213030_s_at

PLXNA2 0,56

226187_at

CDS1 0,56

224008_ s_at

KCNK7 0,56

236263_at

SHH 0,55

229518_at

FAM46B 0,55

201481_s_at

PYGB 0,55

208653_s_at

CD164 0,55

228720_ at

SORCS2 0,55

236275_at

KRBA1 0,55

210402_at

KCNJ1 0,55

219554_at

RHCG 0,55

236926_at

TBX1 0,55

207144_s_at

CITED1 0,55

209696_at

FBP1 0,55

206758_at

EDN2 0,55

219478_at

WFDC1 0,55

223575_at

KIAA1549 0,55

228486_at

SLC44A1 0,55

206046_at

ADAM23 0,54

229892_at

EP400NL 0,54

220245_at

SLC45A2 0,54

228473_at

MSX1 0,54

211071_s_at

MLLT11 0,54

222027_at

NUCKS1 0,54

206623_at

PDE6A 0,54

220317_at

LRAT 0,54

215729_s_at

VGLL1 0,54

219511_s_at

SNCAIP 0,54

229909_at

B4GALNT3 0,54

230498_at

MCHR1 0,54

230469_at

RTKN2 0,54

209438_at

PHKA2 0,54

36829_at

PER1 0,54

228262_at

MAP7D2 0,54

217395_at

MT4 0,54

203827_at

WIPI1 0,53

33767_at

NEFH 0,53

209698_at

CCHCR1 0,53

237899_at

LOC100506374 0,53

ID_Affy

Símbolo Genético FC

223427_s_at

EPB41L4B 0,53

200744_s_at

GNB1 0,53

204157_s_at

SIK3 0,53

215779_s_at

HIST1H2BG 0,53

1553388_at

FAM26D 0,53

221031_s_at

APOLD1 0,53

222871_at

KLHDC8A 0,53

235479_at

CPEB2 0,53

1552496_a_at

COBL 0,53

231371_at

TDRD10 0,53

220795_s_at

BEGAIN 0,53

234978_at

SLC36A4 0,53

206132_at

MCC 0,52

230087_at

PRIMA1 0,52

221114_at

AMBN 0,52

206912_at

FOXE1 0,52

225142_at

JHDM1D 0,52

229160_at

MUM1L1 0,52

229596_at

AMDHD1 0,52

212479_s_at

RMND5A 0,52

242660_at

C10orf112 0,52

210048_at

NAPG 0,52

1555007_s_at

WDR66 0,52

207192_at

DNASE1L2 0,51

205125_at

PLCD1 0,51

204682_at

LTBP2 0,51

203650_at

PROCR 0,51

240024_at

SEC14L2 0,51

220011_at

AUNIP 0,51

208399_s_at

EDN3 0,51

203184_at

FBN2 0,51

1569852_at

C7orf53 0,51

204105_s_at

NRCAM 0,51

203021_at

SLPI 0,51

206306_at

RYR3 0,51

211782_at

IDS 0,51

232067_at

FAXC 0,50

216665_s_at

TTTY2 0,50

210236_at

PPFIA1 0,50

222774_s_at

NETO2 0,50

ID_Affy

Símbolo Genético FC

223720_at

SPINK7 0,49

239136_at

LOC728978 0,49

206994_at

CST4 0,49

219250_s_at

FLRT3 0,49

1553539_at

KRT74 0,49

224762_at

SERINC2 0,49

210221_at

CHRNA3 0,49

220289_s_at

AIM1L 0,49

218834_s_at

TMEM132A 0,49

227482_at

ADCK1 0,49

222277_at

C1QTNF9B-AS1 0,48

200790_at

ODC1 0,48

224293_at

TTTY10 0,48

226698_at

FCHSD1 0,48

232682_at

MREG 0,48

214168_s_at

TJP1 0,48

226899_at

UNC5B 0,48

204351_at

S100P 0,47

209591_s_at

BMP7 0,47

226473_at

CBX2 0,47

236651_at

KALRN 0,47

208701_ at

APLP2 0,47

237466_s_at

HHIP 0,47

214357_at

C1orf105 0,47

228977_at

LOC729680 0,47

1552960_at

LRRC15 0,47

223991_s_at

GALNT2 0,47

205534_at

PCDH7 0,47

231867_at

ODZ2 0,47

1557321_a_at

CAPN14 0,46

208613_s_at

FLNB 0,46

218980_ at

FHOD3 0,46

203304_at

BAMBI 0,46

207703_at

NLGN4Y 0,46

206196_s_at

RUNDC3A 0,46

215253_s_at

RCAN 1 0,46

205376_at

INPP4B 0,46

214636_at

CALCB 0,46

213913_s_at

TBC1D30 0,46

233586_s_at

KLK12 0,46

ID_Affy

Símbolo Genético FC

213556_at

PINLYP 0,45

207213_s_at

USP2 0,45

227450_at

ERP27 0,45

203921_at

CHST2 0,45

208250_ s_at

DMBT1 0,45

224412_s_at

TRPM6 0,45

206774_at

FRMPD 1 0,45

214313_s_at

EIF5B 0,44

227650_at

HSPA14 0,44

1562247_at

LOC286058 0,44

202208_s_at

ARL4C 0,44

217276_x_at

SERHL2 0,44

1553494_at

TDH 0,44

213774_s_at

PPP1R2 0,44

220624_s_at

ELF5 0,43

239913_at

SLC10A4 0,43

207147_at

DLX2 0,43

219946_x_at

MYH14 0,43

244760_at

HERC6 0,43

236255_at

PLEKHG4B 0,43

219463_at

LAMP5 0,43

239202_at

RAB3B 0,43

242138_at

DLX1 0,43

204903_x_at

ATG4B 0,43

206882_at

SLC1A6 0,43

209343_at

EFHD1 0,43

229252_at

ATG9B 0,43

221416_at

PLA2G2F 0,42

227736_at

C10orf99 0,42

1553829_at

CYP1B1-AS1 0,42

224279_s_at

CABYR 0,42

215785_s_at

CYFIP2 0,42

221627_at

TRIM10 0,42

205290_s_at

BMP2 0,42

223739_at

PADI1 0,42

203130_s_at

KIF5C 0,42

232555_at

CREB5 0,42

220067_at

SPTBN5 0,41

210311_at

FGF5 0,41

1558687_a_at

FOXN1 0,41

ID_Affy

Símbolo Genético FC

231875_at

KIF21A 0,40

220129_at

SOHLH2 0,40

209800_ at

KRT16 0,40

1552807_a_at

SIGLEC10 0,40

210335_at

RASSF9 0,40

213713_s_at

GLB1L2 0,40

1556533_at

C17orf52 0,39

242329_at

LOC401317 0,39

209859_at

TRIM9 0,39

229730_at

SMTNL2 0,39

239572_at

GJA3 0,39

241985_at

JMY 0,38

215711_s_at

WEE1 0,38

206604_at

OVOL1 0,38

214226_at

PRSS53 0,37

205724_at

PKP1 0,37

225809_at

PARM1 0,36

227764_at

LYPD6 0,36

218935_at

EHD3 0,36

219659_at

ATP8A2 0,36

231778_at

DLX3 0,36

202376_at

SERPINA3 0,36

222015_at

CSNK1E 0,36

220984_s_at

SLCO5A1 0,35

224262_at

IL1F10 0,35

206375_s_at

HSPB3 0,35

237225_at

ZFY-AS1 0,35

226872_at

RFX2 0,35

202752_x_at

SLC7A8 0,35

210948_s_at

LEF1 0,35

208216_at

DLX4 0,34

229823_at

RIMS2 0,34

214983_at

TTTY15 0,34

237003_at

BEST3 0,34

205637_s_at

SH3GL3 0,34

1555019_at

CDHR1 0,34

205555_s_at

MSX2 0,33

228975_at

SP6 0,33

214576_at

KRT36 0,33

204720_s_at

DNAJC6 0,33

ID_Affy

Símbolo Genético FC

217031_at

KRT84 0,32

218266_s at

NCS1 0,32

219612_s_at

FGG 0,31

219301_s_at

CNTNAP2 0,31

233301_at

OXCT2 0,31

211429_s_at

SERPINA1 0,31

219832_s_at

HOXC13 0,31

232684_at

ZNF503-AS1 0,30

222878_s_at

OTUB2 0,30

220090_at

CRNN 0,30

206279_at

PRKY 0,30

222351_at

PPP2R1B 0,30

206423_at

ANGPTL7 0,29

209981_at

CSDC2 0,29

205374_at

SLN 0,28

243445_at

BNC2 0,28

206004_at

TGM3 0,27

240967_at

KRTAP19-3 0,26

229158_at

WNK4 0,26

207065_at

KRT75 0,26

220635_at

PSORS1C2 0,26

228705_at

CAPN12 0,25

155641_a_at

KRTAP19-1 0,24

229030_ at

CAPN8 0,24

21451_at

KRTAP5-9 0,24

209921_at

SLC7A11 0,23

210082_at

ABCA4 0,23

206677_at

KRT31 0,23

230760_at

ZFY 0,23

230720_at

RNF182 0,22

1564435_a_at

KRT72 0,22

237507_at

KRT73 0,21

208092_s_at

FAM49A 0,21

234683_at

KRTAP4-6 0,21

234635_at

KRTAP4-1 0,21

233640_x_at

KRTAP9-4 0,20

205713_s_at

COMP 0,20

233681_at

KRTAP3-3 0,20

216810_at

KRTAP4-7 0,19

234639_x_at

KRTAP9-8 0,19

ID_Affy

Símbolo Genético FC

234631_at

KRTAP4-8 0,19

206969_at

KRT34 0,19

224269_at

KRTAP4-12 0,18

208483_x_at

KRT33A 0,18

211149_at

UTY 0,18

211029_x_at

FGF18 0,18

234772_s_at

KRTAP2-2 0,17

234678_at

KRTAP4-3 0,17

1564803_at

KRTAP11-1 0,17

233534_at

KRTAP3-2 0,17

220976_s_at

KRTAP1-1 0,17

234684_s_at

KRTAP4-4 0,17

1554398_at

LYG2 0,17

206224_at

CST1 0,17

208532_x_at

KRTAP5-8 0,17

1561330_at

DSG4 0,16

207146_at

KRT32 0,16

242301_at

CBLN2 0,16

234880_x_at

KRTAP1-3 0,16

234691_at

KRTAP2-1 0,16

234679_at

KRTAP9-3 0,16

234680_at

KRTAP17-1 0,15

206027_at

S100A3 0,15

1555775_a_at

ZAR1 0,15

234633_at

KRTAP4-11 0,15

234637_at

KRTAP4-5 0,14

220779_at

PADI3 0,14

1555673_at

KRTAP2-3 0,14

220972_s_at

KRTAP9-9 0,14

234671_at

KRTAP4-2 0,13

232887_at

PIRT 0,13

207670_at

KRT85 0,13

233537_at

KRTAP3-1 0,13

221297_at

GPRC5D 0,12

233158_at

KRT82 0,12

237853_x_at

KRTAP10-12 0,12

219270_at

CHAC1 0,12

1562629_a_at

KRT40 0,11

207787_at

KRT33B 0,11

228492_at

USP9Y 0,11

5

10

15

20

25

30

35

40

ID_Affy

Símbolo Genético FC

1564960_at

KRTAP7-1 0,11

207457_s_at

LY6G6D 0,11

213711_at

KRT81 0,10

216921_s_at

KRT35 0,10

1560897_a_at

KRTAP10-11 0,10

1564974_at

KRTAP8-1 0,09

207669_at

KRT83 0,09

207063_at

NCRNA00185 0,08

232618_at

TXLNG2P 0,07

205000_at

DDX3Y 0,05

206700_s_at

KDM5D 0,04

201909_ at

RPS4Y1 0,04

204409_s_at

EIF1AY 0,04

208331_at

BPY2 0,03

Al comparar los listados correspondientes de genes identificados como expresados diferencialmente entre sí (FIG. 24A, panel en la parte inferior), se descubrieron tres firmas de expresión de genes sorprendentes en este análisis. En primer lugar, muchos de los genes regulados de forma positiva en piel alopécica de ambas especies fueron genes de respuesta a IFN, incluyendo las quimioquinas inducibles por IfN, CXCL 9, 10 y 11— (FIG. 24A, FIG. 29). En segundo lugar, se identificaron varias transcripciones específicas de CTL fundamentales, incluyendo CD8A y granzimas A y B (FIG. 24A).

A su vez, usando los efectores de CTL, se demostró que el inhibidor de JAK3 de molécula pequeña, tofacitinib (selectividad JAK3 > JAK1 >> JAK2)—, bloquea la activación de pSTAT3 desencadenada por Il-15 (FIG. 24B), e inhibe las funciones de efector de CTL, incluyendo citotoxicidad de las células de la vaina dérmica de (FIG. 24C), introducción de granzima B/IPNy (FIG. 24D). Por lo tanto, la producción de folículos pilosos de IL-15 proporciona un eje de citoquinas que se puede interrumpir farmacológicamente al inhibir su señalización en efectores inmunes.

A continuación, se determinó si los efectos del bloqueo de IL-15 se podrían recapitular interviniendo cadena abajo usando inhibidores de JAK3 de molécula pequeña. Usando tofacitinib, la administración sistémica del tratamiento con JAK3i (FIG. 25) impidió el desarrollo de aA y la expansión de linfocitos T CD8+NKG2D+ en todos los receptores injertados. La piel de los ratones tratados con el inhibidor de la proteína tirosina quinasa (PTKi) no mostró signos histológicos de inflamación y evitó la aparición de la firma transcripcional de ALADIN (^/opecia ^reata Disease Activity Index) y el análisis del Índice Dinámico de Expresión Genética (GEDI) en todos los ratones (FIG. .25).

Para evaluar la eficacia de JAK3i en el contexto clínico de AA, se determinó si el tratamiento sistémico con JAK3i podría revertir la enfermedad establecida al iniciar la terapia 7 semanas después del injerto, un momento en el que todos los ratones habían desarrollado una amplia AA. Es importante destacar que la terapia sistémica indujo el crecimiento del cabello en todo el cuerpo y del mismo modo eliminó la expansión de los linfocitos T CD8+NKG2D+ y revirtió los marcadores histológicos de la enfermedad (FIG. 30), un efecto que persistió 2-3 meses después de la interrupción del tratamiento.

Por último, para someter a ensayo una vía de administración más conveniente desde el punto de vista clínico, se determinó si la administración tópica de los PTKi podría revertir la alopecia areata de larga duración con una cinética similar a la administración sistémica. En la enfermedad establecida, el tofacitinib tópico fue altamente eficaz para revertir la enfermedad en las lesiones tratadas (aplicado en la piel de la espalda), y se observó un crecimiento completo del cabello dentro de las 12 semanas posteriores a la terapia tópica (FIG. 26A-B). La terapia tópica se asoció con la desaparición de los linfocitos T CD8+NKG2D+ en la piel tratada (FIG. 26C) y la inversión de los marcadores histológicos de enfermedad (FIG. 26D), así como la normalización de la firma transcripcional de ALADIN (FIG. 26E), y el índice GEDI en todos los ratones tratados (FIG. 26F). De forma notable, las áreas no tratadas en el abdomen permanecieron alopécicas (FIG. 26A, paneles en la parte media), lo que demuestra que la terapia tópica fue localmente eficaz y los efectos terapéuticos no fueron el resultado de la absorción sistémica. Además, estos efectos fueron duraderos 2-3 meses después del cese del tratamiento (FIG. 26A, paneles en la parte derecha).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tomados juntos, los datos identifican a los linfocitos T CD8+NKG2D+ como los efectores celulares inmunes responsables del ataque autoinmune del folículo piloso y proporcionan soporte para un modelo de patogénesis de AA.

De manera importante, estos fundamentos mecanísticos comunes fueron desvelados por primera vez por el estudio GWAS, que colocó a AA directamente en este grupo de enfermedades aliadas autoinmunes que implican el reclutamiento mediado por NKG2DL de efectores de linfocitos T CD8, incluyendo diabetes de tipo I —, —, enfermedad celíaca —,25 y artritis reumatoide26. Estas rutas pueden ser interrumpidas por inhibidores de molécula pequeña de las quinasas JAK de efector cadena abajo de IL-15, siendo lo último especialmente atractivo como un enfoque terapéutico tópico en esta enfermedad cutánea. Los inhibidores de JAK aprobados por la FDA se usaron para mostrar el efecto terapéutico, argumentando la evaluación clínica en AA con estos compuestos u otros PTKi de JAK en el desarrollo clínico —.

En muy poco tiempo desde los hallazgos de GWAS, no solo se ha identificado el subconjunto específico de linfocitos T citotóxicos que dan lugar a AA, sino que también se han dirigido exitosamente a la eliminación mediante terapias racionales y relevantes seleccionadas de acuerdo con los estudios mecanísticos de los inventores. Los hallazgos ilustran el poder de los estudios GWAS para descubrir nuevas vías de la enfermedad y, junto con los enfoques de traducción —, han abierto rápidamente una nueva e inesperada avenida para la intervención en AA.

Métodos

Ratones. Se usaron ratones C57B1.6 y C3H/HeJ hembra de 7-10 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos.

Transferencia de alopecia Areata usando piel de C3H/HeJ injertada. Los ratones C3H/HeJ de pelo normal fueron injertados a las 8 semanas de edad (durante la segunda fase telogénica) de piel de un ratón C3H/HeJ que desarrolló aA de forma espontánea, como se ha descrito anteriormente7. En resumen, los ratones afectados de forma espontánea con Aa se sacrificaron con eutanasia, se retiraron injertos de piel de grosor total de aproximadamente 2 cm de diámetro y se injertaron en ratones C3H/HeJ de pelo normal. La pérdida de pelo generalmente comenzó alrededor de 4-6 semanas después del injerto.

Análisis por citometría de flujo de piel y ganglios linfáticos cutáneos. Para preparar una suspensión celular única de piel de ratón, la grasa se retiró de la piel suprayacente en PBS frío y a continuación se incubó en colagenasa de tipo I (2 mg/ml en PBS) a 32 °C durante 75 minutos. Después de la digestión, la piel se troceó en RPMI/suero bovino fetal al 10%, se filtró a través de un filtro de células de 70 mM y se centrifugó a 1100 g durante 5 minutos. El sedimento se volvió a suspender en RPMI/suero bovino fetal al 10 %, se filtró a través de a través de un filtro de células de 40 mM y se centrifugó a 400 g durante 5 mins. El sedimento se volvió a suspender en tampón FAC (PBS/BSA al 5 %), DAPI para regular las células vivas y tinción de anticuerpos (enumerados en Datos Suplementarios). Los ganglios linfáticos cutáneos se combinaron troceados en RPMI, se filtraron a través de un filtro de células de 40 mM, se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos, se tiñeron y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR II.

Transferencia de poblaciones de linfocitos T en ratones C3H/HeJ receptores. Para la selección positiva de poblaciones de linfocitos T, las células de los ganglios linfáticos se obtuvieron de 5 ratones C3H/HeJ alopécicos, se tiñeron con anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-NKG2D, a continuación, se clasificaron (BD Influx) para obtener dos fracciones: linfocitos T CD8+NKG2D+, y linfocitos T CD8+NKG2D'. Se inyectaron de tres a cinco ratones C3H/HeJ de 7 semanas de edad por grupo por vía subcutánea con dos millones de células clasificadas de cada población. Para poblaciones seleccionadas negativamente, las células NKG2D+ se agotaron incubando células de ganglios linfáticos totales de 3 ratones C3H/HeJ alopécicos con anti-NKG2D biotinilado (CX5) y a continuación con perlas conjugadas con estreptavidina (Miltenyi) antes de la eliminación en una columna magnética Miltenyi. Cinco millones de células (células con agotamiento de CD8/NKG2D o células de ganglios linfáticos totales) se suspendieron en 100 ul de PBS y se transfirieron en cada uno de 5 ratones mediante inyección subcutánea.

Estudios de Prevención y Tratamiento. Para estudios de prevención, el tratamiento de los ratones comenzó el día del injerto (n = 5-10 ratones por grupo). Para experimentos de JAK3i: a los ratones se les implantaron por vía subcutánea mini-bombas osmóticas Alzet (bombas, modelo 2004, Durect Corporation) en el lomo de cada ratón para administrar el vehículo (poli(etilenglicol) (PEG)300) o vehículo que contenía el tofacitinib de JAK3i (Abmol) a 15 mg/kg/día durante 12 semanas.

Para estudios de tratamiento tópico, los ratones infectados con AA de larga duración (más de 8 semanas) se trataron una vez al día durante 12 semanas en la piel afectada en el lomo dorsal con vehículo (Aquaphor) o vehículo que contenía el inhibidor de Jak3 (pomada al 0,5 %). Se realizaron biopsias de piel de grosor completo de la superficie dorsal de cada ratón en momentos intermedios, y las muestras de piel se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para extracción de ARN o se congelaron instantáneamente en OCT para inmunotinción. El estado del pelo se examinó dos veces a la semana y el índice de crecimiento capilar se calculó como se ha descrito 2°.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Las secciones de piel de ratón congeladas fijadas con acetona 8 mM se secaron al aire y se tiñeron durante una noche con Abs anti-ratón (véase a continuación) a 4 °C en una cámara de humedad. Los folículos pilosos humanos se microdiseccionaron y se embebieron en compuesto de OCT antes de hacer las secciones y la tinción (véase a continuación).

Cultivo de vaina dérmica primaria y de linfocitos citolíticos activados por linfoquina (LAK). Las células de la vaina dérmica (DS) se aislaron de folículos de vibrisa de ratón microdiseccionados y se cultivaron en FBS DMEM al 20 % con 5 ng/ml de FGF murino (Pepro Tech). Las células LAK se generaron a partir de esplenocitos sembrados 4*10® en placas de 6 pocillos con JAK3i 50 nM (tofacitinib) o 50 ng/ml de IL-15 murino más JAK3i 50 nM, y se incubaron a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 % durante 96 horas.

Ensayos de citotoxicidad in vitro. La determinación de la eliminación específica de las células diana se realizó usando células DS etiquetadas con CFSE enviadas mezcladas con diferentes proporciones de células efectoras incubadas durante 5 horas a 37 °C con CO2 al 5 % con o sin neutralización de anticuerpo NKG2D de rata anti-ratón (20 ug/ml) (Biolegend, CX5). La lisis específica de las células DS se determinó mediante citometría de flujo midiendo la muerte celular de las células CFSE+ DS usando Anexina V/7-AAD.

Análisis de expresión genética en células cutáneas y linfocitos T de piel de ser humano y ratón. El ARN total se aisló usando el Kit miRNeasy Mini (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) con digestión de ADN en la columna usando el conjunto de Dnasa sin Rnasa (Qiagen, Inc.). Para el análisis de sec de ARN las células CD3+CD8+CD44+NKG2D+ y CD3+ CD8+CD44+NKG2D- se clasificaron mediante flujo a partir de ganglios linfáticos de razones C3H/HeJ alopécicos. El ARN se extrajo como se ha mencionado anteriormente y se preparó para secuenciación de ARN usando el Kit v2 de Prep de Muestra de ARN TruSeq. Las muestras se secuenciaron en el secuenciador HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA) durante 50 ciclos. Los archivos de Sec de ARN se desmultiplexaron en las instalaciones del Rockefeller University Genomics Core.

Para formación de perfiles de transcripción global en piel de ratón, el ARN extraído total se procesó usando el Kit 3' IVT Express de Affymetrix. Las muestras de ADNc biotinilado resultantes se hibridaron con los chips genéticos 430 2.0 del Genoma del Ratón y posteriormente se lavaron, se tiñeron con estreptavidina-ficoeritrina, y se examinaron en un Escáner GeneArray de HP (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA).

Para muestras de AA humana, se recogieron biopsias de punción perilesional de 5 pacientes con alopecia areata parcheada que no se habían sometido a tratamientos locales o sistémicos y se compararon con las biopsias de piel sin pelo de 5 individuos no afectados sin relacionar.

El ARN total extraído se transcribió de forma inversa y se amplificó usando el kit V2 de Amplificación de ARN Ovation (NuGEN Technologies, Inc., San Carlos, CA). El ADNc amplificado se biotiniló con el Módulo de Biotina Encore (NuGEN Technologies) y a continuación se hibridó con los chips genéticos U133A Plus 2.0.

Anticuerpos usados para citometría de flujo e inmunotinción. El análisis de citometría de flujo usó los siguientes anticuerpos anti-ratón: CD3 (17A2, Ebioscience), CD4 (GK1.5, BD), CD8a (53-6.7, BD), CD8a (YTS156.7.7, Biolegend), NKG2D (CX5, Ebioscience), NKG2A/C/E (clon 20d5, Ebioscience), CD44 (IM7, BD), CD45 (30-F11, BD), CD49b (Dx5, BD), CD62L (MEL-14, BD), CD69 (H1.2F3, BD), CD103 (2E7, eBioscience), IFNy (XMG1.2, Ebioscience), Granzima B (NGZB, eBioscience), Rae-1 (186107, R&D).

Para estudios inmunohistoquímicos de piel de ratón, las secciones de piel congelada fijada con metanol 8 pM se tiñeron con anticuerpos de raza primarios (Biolegend) incluyendo: anti-CD4 (clon RM4-5), anti-CD8 (clon 53-6.7), clase I anti-MHC de Biotina (clon 36-7.5), clase II anti-MHC (clon M5/114.15.2). Como anticuerpo secundario se usó IgG de cabra anti-rata biotinilada (Life Technologies). Para estudios de inmunofluorescencia se usaron anti-H60 (R&D, clon 205326), anti-Pan Rae-1(R&D, clon 186107), anti-NKG2D (R&D clon 191004), anticuerpo primario anti- K71 (Abcam) en inmunofluorescencia. Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo de cabra anti-Rata conjugado con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 594, burro anti-Conejo o burro anti-Cabra (Life Technologies).

Los folículos pilosos humanos se microdiseccionaron y se embebieron en compuesto OCT antes de la sección y tinción. Las secciones congeladas fijadas con metanol 8 pM se tiñeron con CD8 (SCBT, C8/144B) seguido de tinción con anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 594 (Life Technologies). Todas las imágenes se capturaron con un Microscopio Confocal SDRC Zeiss Exciter.

Análisis Estadístico y Control de Calidad de Firmas de Expresión Genética

Análisis de Sec de ARN. Las muestras se secuenciaron en el secuenciador HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA) durante 50 ciclos. Los archivos de Sec de ARN se desmultiplexaron en la Rockefeller University Genomics Core Facility. El control de calidad de los archivos fastq de la muestra se realizó usando fastqc'S1. TopHat'S2 se usó para hacer mapas de transcripciones con respecto al genoma de referencia de UCSC mm9 de iGenome. Se usó la anotación genética de RefSeq empaquetada con esta versión de iGenome del UCSC mm9. La utilidad del htseq- count del paquete de HTSeq se usó para convertir los archivos bam de TopHat en recuentos que se podrían usar

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

como entrada para análisis cadena debajo de la expresión diferencial con edgeR'S3. Los genes ausentes se retiraron y se añadió un pseudorrecuento de 1 con el fin de evitar la visión entre cero en el análisis cardenal abajo. EdgeR se usó para identificar genes diferencialmente expresados usando un diseño de parejas unidas por coincidencias con tres replicados biológicos.

Análisis de Micromatriz

Control de Calidad, Procesamiento Previo. Para el ratón, las muestras de ADNc de ratón se hibridaron a 430 2.0 de Genoma de Ratón y posteriormente se lavaron, se tiñeron con estreptavidina-ficoeritrina, y se hizo un barrido con un Escáner GeneArray de HP (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA). Para el ser humano, el ADNc se hibridó los chips genéticos de U133A 2.0.

El control de calidad se realizó usando el paquete affyanalysisQC de
http://arravanalvsis.org/. AffyanalysisQC usa paquetes de R/BioConductor: affy, affycomp, affypdnn, affyPLM, affyQCReport, ArrayTools, bioDistm biomaRt, simpleaffy, yaqcaffy para realizar Qc dentro de un solo script. La normalización de RMAS4 se realizó en cada grupo experimental por separado. La corrección del defecto del lote usando ComBat se necesitó para los experimentos de prevención.

El procesamiento previo de la micromatriz se realizó usando BioConductor en R. El procesamiento previo de los tres experimentos, 1) ratones con AA espontánea con respecto a ratones normales, 2) ratones de prevención con tres tratamientos con respecto a placebo y ratones operados de forma simulada, y 3) ratones de tratamiento para dos tratamientos con respecto a placebo se realizó por separado usando la misma fuente. Además del procesamiento previo que se realizó para las muestras de piel de ratón, se usó Harshlight para corregir los defectos de imagen de las muestras de piel humana.

Identificación de Firmas Genéticas.

Análisis No Supervisado. El agrupamiento jerárquico se realizó usando Cluster'S5 en los 363 genes del ser humano 5x5 y 583 genes del ratón espontáneo 3x3 con el fin de satisfacer el umbral de abs(logFC) > 1, valor de p sin ajustar <= 0,05. En primer lugar se seleccionaron los genes que satisfacían el umbral de logFC >1, y el valor de p sin ajustar <= 0,05. Los genes se centraron en la mediana y se normalizaron. La correlación de clasificación de Spearman se usó como la medida de similitud y la relación del promedio se usó para realizar agrupamientos sin procesar (genes) y de columna (muestra). La visualización de los grupos jerárquicos se realizó con java TreeView'S6. El análisis del Índice Dinámico de Expresión Genética (GEDI) se usó para visualizar cómo se identificaban las variaciones de los "metagenes" con un algoritmo de mapa de autoorganización a través de las muestras'S7. Los metagenes son grupos de genes que muestran patrones de expresión similares a través de muestras y que se asignan a un solo píxel en una cuadrícula de dos dimensiones. Los píxeles cercanos demostraron patrones de expresión similares entre sí.

Análisis Supervisado. El análisis inicial de la expresión genética diferencial se realizó en los conjuntos de datos de ratón espontáneo 3x3 y del ser humano 5x5 usando limma'S8. Un umbral de factor de cambio de 1,5 y valor de p sin ajustar de 0,05.

Validación de RT-PCR. Los genes expresados diferencialmente predichos en ser humano y ratón se confirmaron usando RT-PCR. La primera hebra del ADNc se sintetizó usando una proporción de cebadores aleatorios de 2:1: cebador Oligo (dT) y SuperScript III RT (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La qRT-PCR se realizó en una máquina ABI 7300 y se analizó con el software de Estudio de Cuantificación Relativa ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Los cebadores se diseñaron de acuerdo con las directrices de ABI y todas las reacciones se realizaron usando la Mezcla Maestra para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems), cebadores 250 nM (Invitrogen) y 20 ng de ADNc en un volumen de reacción de 20 pl. Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla 5.

Tabla 5. Cebadores de RTR-PCR para estudios de validación de ARNm de ratón.

imagen7

* Para PCR de Rae-1a, Rae-1b, Rae-1c, Rae-1d, Rae-1e y GAPDH se usaron los conjuntos de cebadores y sondas AX-047904-01, AAX-047854-01, AX-047833-01, AX-049954-01, AX-042357-01 y AX-040917-00 (Thermo Scientific) del sistema de PCR en tiempo real de Commercial Solaris.

5 Los resultados se expresan como “índice de aumento” en la expresión del ARNm.

Tabla 6. Cebadores de RTR-PCR para estudios de validación de ARNm de ser humano.

imagen8

10 Se usó el siguiente protocolo de PCR: etapa 1: 50 °C durante 2 min; etapa 2: 95 °C durante 10 min; etapa 3: 95 °C durante 15 s; etapa 4: 60 °C durante 1 min; repetir las etapas 3 y 4 durante 40 ciclos. Todas las muestras se desarrollaron por cuadriplicado para tres realizaciones independientes y se normalizaron contra un control interno endógeno tal como se indica.

15 Puntuaciones de ALADIN. Las firmas de IFN y CTL se usaron para desarrollar una estadística de puntuación bivariable. Las puntuaciones individuales de las firmas de IFN y CTL se determinaron usando los siguientes procedimientos en SLE S-,S— humano. Los conjuntos de genes seleccionados para que comprendieran las firmas de IFN y CTL de los inventores fueron CD8A, GZMB, e ICOS para la firma de CTL, y CxCl9, CXCL10, CXCL11, STAT1, y MX1 para la firma de IFN. Las puntuaciones para los ratones de prevención se calcularon con respecto a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ratones simulados; mientras que las puntuaciones para los experimentos de tratamiento tópico se calcularon con

respecto a todas las muestras en la semana cero.

Referencias

1 McDonagh, A. J. y Messenger, A. G. The pathogenesis of alopecia areata. Dermatol Clin 14, 661-670 (1996).

2 McElwee, K. J., Tobin, D. J., Bystryn, J. C., King, L. E., Jr. y Sundberg, J. P. Alopecia areata: an autoimmune disease? Exp Dermatol 8, 371-379 (1999).

3 Petukhova, L. et al., Genome-wide association study in alopecia areata implicates both innate and adaptive immunity. Nature 466, 113-117 (2010).

4 Gilhar, A., Ullmann, Y., Berkutzki, T., Assy, B. y Kalish, R. S. Autoimmune hair loss (alopecia areata) transferred by T lymphocytes to human scalp explants on SCID mice. J Clin Invest 101,62-67 (1998).

5 McElwee, K. J. et al., Transfer of CD8(+) cells induces localized hair loss whereas CD4(+)/CD25(-) cells promote systemic alopecia areata y CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset en the C3H/HeJ mouse model. J Invest Dermatol 124, 947-957 (2005).

6 Sundberg, J. P., Cordy, W. R. y King, L. E., Jr. Alopecia areata in aging C3H/HeJ mice. J Invest Dermatol 102, 847-856 (1994).

7 McElwee, K. J., Boggess, D., King, L. E., Jr. y Sundberg, J. P. Experimental induction of alopecia areata-like hair loss in C3H/HeJ mice using full-thickness skin grafts. J Invest Dermatol 111, 797-803 (1998).

8 Best, J. A. et al., Transcriptional insights in the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nat Immunol, 4, 404-12 (2013).

9 Bezman, N. A. et al., Molecular definition of the identity and activation of natural killer cells. Nat Immunol 13, 1000-1009 (2012).

10 Heng, T. S. y Painter, M. W. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells. Nat Immunol 9, 1091-1094 (2008).

11 Kota, R. S. et al., Regulation of gene expression in RAW 264.7 macrophage cell line by interferon-gamma. Biochem Biophys Res Commun 342, 1137-1146 (2006).

12 Fehniger, T. A. y Caligiuri, M. A. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood 97, 14-32 (2001).

13 Ye, W., Young, J. D. y Liu, C. C. Interleukin-15 induces the expression of mRNAs of cytolytic mediators and augments cytotoxic activities in primary murine lymphocytes. Cell Immunol 174, 54-62 (1996).

14 Meresse, B. et al., Reprogramming of CTLs in natural killer-like cells in celiac disease. J Exp Med 203, 1343-1355 (2006).

15 Saikali, P., Antel, J. P., Pittet, C. L., Newcombe, J. y Arbour, N. Contribution of astrocyte-derived IL-15 to CD8 T cell effector functions in multiple sclerosis. J Immunol 185, 5693-5703 (2010).

16 Meresse, B. et al., Coordinated induction by IL15 of a TCR-independent NKG2D signaling pathway converts CTL in lymphokine-activated killer cells in celiac disease. Immunity 21, 357-366 (2004).

17 Quintas-Cardama, A. et al., Preclinical characterization of the selective JAK1/2 inhibitor INCB018424: therapeutic implications for the treatment of myeloproliferative neoplasms. Blood 115, 3109-3117 (2010).

18 Ghoreschi, K. et al., Modulation of innate and adaptive immune responses by tofacitinib (CP-690,550). Journal of Immunology 186, 4234-4243 (2011).

19 Eichler, G. S., Huang, S. y Ingber, D. E. Gene Expression Dynamics Inspector (GEDI): for integrative analysis of expression profiles. Bioinformatics 19, 2321-2322 (2003).

20 Paus, R., Nickoloff, B. J. e Ito, T. A 'hairy' privilege. Trends Immunol 26, 32-40 (2005).

21 Freyschmidt-Paul, P. et al., Interferon-gamma-deficient mice are resistant to the development of alopecia areata. The British journal of dermatology 155, 515-521 (2006).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

22 Waldmann, T. A. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cáncer therapy and vaccine design. Nature reviews. Immunology 6, 595-601 (2006).

23 Ogasawara, K. et al., NKG2D blockade prevents autoimmune diabetes in NOD mice. Immunity 20, 757-767 (2004).

24 Markiewicz, M. A. et al., RAElepsilon ligand expressed on pancreatic islets recruits NKG2D receptor- expressing cytotoxic T cells independent of T cell receptor recognition. Immunity 36, 132-141 (2012).

25 Hue, S. et al., A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity 21, 367-377 (2004).

26 Andersson, A. K., Feldmann, M. y Brennan, F. M. Neutralizing IL-21 y IL-15 inhibits pro-inflammatory cytokine production in rheumatoid arthritis. Scand J Immunol 68, 103-111 (2008).

27 Baslund, B. et al., Targeting interleukin-15 in patients with rheumatoid arthritis: a proof-of-concept study. Arthritis and rheumatism 52, 2686-2692 (2005).

28 Dolgin, E. Companies hope for kinase inhibitor JAKpot. Nature reviews. Drug discovery 10, 717-718 (2011).

29 Fugger, L., McVean, G. y Bell, J. I. Genomewide association studies and common disease-realizing clinical utility. The New England Journal of Medicine 367, 2370-2371 (2012).

30 Tang, L. et al., Topical mecloretamina restores autoimmune-arrested follicular activity in mice with an alopecia areata-like disease by targeting infiltrated lymphocytes. J Invest Dermatol 120, 400-406 (2003).

51 Andrews, S.
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

52 Trapnell, C., Pachter, L. y Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25, 1105-1111, doi:10.1093/bioinformatics/btp120 (2009).

53 Robinson, M. D., McCarthy, D. J. y Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140, doi:10.1093/bioinformatics/btp616 (2010).

54 Irizarry, R. A. et al., Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucleic acids research 31, e15 (2003).

55 Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O. y Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 14863-14868 (1998).

56 Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics 20, 3246-3248, doi:10.1093/bioinformatics/bth349 (2004).

57 Eichler, G. S., Huang, S. y Ingber, D. E. Gene Expression Dynamics Inspector (GEDI): for integrative analysis of expression profiles. Bioinformatics 19, 2321-2322 (2003).

58 Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. En: "Bioinformatics y Computational biology Solutions using R and Bioconductor". 397-420 (Springer, New York, 2005).

59 Kirou, K. A. et al., Coordinate overexpression of interferon-alfa-induced genes in systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism 50, 3958-3967, doi:10.1002/art20798 (2004).

S10 Feng, X. et al., Association of increased interferon-inducible gene expression with disease activity and lupus nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism 54, 2951-2962, doi:10.1002/art.22044 (2006).

EJEMPLO 5 - Efecto del inhibidor de JAK3 en la inducción del crecimiento capilar

La ruta de señalización de JAK-STAT se ha visto implicada en varios procesos del desarrollo, y más recientemente en el mantenimiento, activación y diferenciación de células madre. En el transcurso de los estudios de tratamiento tópico de los inventores usando JAK3 en el modelo de ratón de C3H/HeJ AA, se observó que los pelos que volvían a crecer lo hacían con características sorprendentes que eran diferentes de las de la administración sistémica: 1) el recrecimiento capilar era muy rápido; y 2) el revestimiento del cabello estaba pigmentado de color muy oscuro. Sin desear quedar ligado por la teoría, además de los linfocitos T patogénicos que eliminan el inhibidor de Jak3 de la

5

10

15

20

25

30

piel, el inhibidor de Jak3 también tiene un efecto directo en el propio folículo piloso, por ejemplo, mediante un efecto de estimulación de la fase anagénica.

La dinámica de la ruta de señalización de JAK-STAT se cuestionó primero usando una matriz de RT-PCR dirigida que contenía lecturas de señalización de JAK-STAT (FIG. 32), y se comparó con la expresión genética entre las etapas de fase telogénica con respecto a anagénica del ciclo capilar normal (FIGS. 32-35).

Estos datos desvelaron que muchos componentes de la señalización de JAK-STAT estaban regulados de forma positiva en la fase telogénica y regulados de forma negativa en la fase anagénica del ciclo capilar normal, lo que indica que, en el contexto del ciclo capilar, la señalización de JAK-STAT se puede asociar con el mantenimiento de la inactividad de las células madre en la fase telogénica (FIG. 35).

Para someter a ensayos y la inhibición de la señalización de JAK-STAT podría desencadenar por lo tanto la transición de fase telogénica a anagénica, se aplicó un inhibidor de JAK3 tópico para someter a ensayo si la en la fase anagénica se podría inducir en piel de ratón normal en la fase telogénica.

De hecho, la administración tópica de un inhibidor de JAK3 dio como resultado una inducción de la fase anagénica llamativa en piel de ratón en la fase telogénica, en comparación con el vehículo solo. Esto estaba asociado con una proliferación notable de células de la matriz queratinocítica, y la inducción y crecimiento de pelos en la fase anagénica pigmentados robustos después de 1-2 semanas (véanse las FIGS. 38-43).

Esta observación se comparó con un control positivo de SAG (agonista hedgehog sónico) que se sabe que tiene el mismo efecto, y el efecto del inhibidor de Jak3 era comparable en la inducción de la fase Anagénica (FIGs. 38, 42, 43).

Sin desear quedar ligado por la teoría, estos hallazgos indican que el bloqueo de la señalización de JAK-STAT en la fase telogénica imita en parte los sucesos moleculares de iniciación de la fase anagénica, y podría ser un agente terapéutico útil para el crecimiento capilar, usando inhibidores de JAK tópicos para inducir la de entrada de los pelos de la fase telogénica a la fase anagénica.

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un inhibidor de Jak3 seleccionado entre el grupo que consiste en: decernotinib; tofacitinib; inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923); NSC114792; PF-956980; un ARN no codificante o ADN no codificante que es específico para un ácido nucleico que codifica un polipéptido de JAK3; y un ARNsi que se dirige específicamente al gen de Jak3 para uso en el tratamiento de un trastorno de pérdida capilar seleccionado entre el grupo que consiste en alopecia areata y alopecia androgénica.
2. 2. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor es decernotinib.
3. 3. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor es tofacitinib.
4. 4. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor es inhibidor IV de JAK3 (ZM-39923); NSC114792; o PF-956980.
5. 5. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el trastorno de pérdida capilar es alopecia areata.
6. 6. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el trastorno de pérdida capilar es alopecia androgénica.
7. 7. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en las que se pretende

   la administración del inhibidor de Jak3 por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía

   intradérmica, mediante inyección intravenosa; mediante una infusión; por vía parenteral, por vía transdérmica, por vía transmucosal, por vía rectal, por vía oral, por vía nasal, o mediante administración tópica; o una combinación de los mismos.
8. 8. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en las que se pretende la administración del inhibidor de Jak3 1 vez a la semana, 2 veces a la semana, 3 veces a la semana, 4 veces a la semana, 5 veces a la semana, 6 veces a la semana, 7 veces a la semana, 8 veces a la semana, 9 veces a la semana, 10 veces a la semana, 11 veces a la semana, 12 veces a la semana, 13 veces a la semana, o 14 veces a la semana.
9. 9. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en las que se pretende la administración del inhibidor de Jak3 durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, o al menos 16 semanas.
10. 10. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en las que se pretende la administración del inhibidor de Jak3 con un inhibidor de Jak 1/2 al sujeto.
11. 11. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que se pretende la administración del inhibidor de Jak1/2 de forma simultánea con el inhibidor de Jak3; o en la que se pretende la administración del inhibidor de Jak1/2 en cualquier orden con el inhibidor de Jak3.
12. 12. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en las que el inhibidor de Jak1/2 es ruxolitinib, figlotinib, AG490, momelotinib, pacritinib, baricitinib, fedratinib, BMS-911543, o lestaurtinib.
13. 13. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor es tofacitinib, el trastorno de pérdida capilar es alopecia areata, y se pretende la administración del inhibidor por vía tópica.
14. 14. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor se administra al sujeto en una composición farmacéutica seleccionada entre solución, pomada, ungüento, gel, y crema.
15. 15. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor está contenido

    composición farmacéutica aproximadamente un 0,2 % aproximadamente un 0,6 % aproximadamente un 1,0% aproximadamente un 1,4% aproximadamente un 1,8% aproximadamente un 2,2 % aproximadamente un 2,6 % aproximadamente un 3,0 % aproximadamente un 5 %,

    tópica a una , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente , aproximadamente aproximadamente

    concentración seleccionada de aproximadamente un

    un 0,3 % un 0,7 % un 1,1 % un 1,5 % un 1,9 % un 2,3 % un 2,7 % un 3,5 % un 5,5 %,

    aproximadamente un 0,4 % aproximadamente un 0,8% aproximadamente un 1,2% aproximadamente un 1,6% aproximadamente un 2,0 % aproximadamente un 2,4 % aproximadamente un 2,8% , aproximadamente un 4 % aproximadamente un 6 %,

    , aproximadamente un , aproximadamente un , aproximadamente un , aproximadamente un , aproximadamente un , aproximadamente un , aproximadamente un aproximadamente un aproximadamente un

    en una

    0,1 %, 0,5 %, 0,9 %, 1,3 %, 1,7 %, 2,1 %,
16. 2.5 %, 2,9 %,
17. 4.5 %,
18. 6.5 %,

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 7,5 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 8,5 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 9,5 %, o aproximadamente un 10 %.
19. 16. El inhibidor de Jak3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el inhibidor se administra al sujeto en una cantidad de aproximadamente 0,0001 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,00025 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,0005 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,00075 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,001 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,0025 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 0,005 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,0075 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,025 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,05 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,075 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,25 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,75 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 25 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 75 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 150 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 250 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 300 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 400 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 450 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 550 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 600 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 650 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 700 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 800 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 850 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 900 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 950 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 2000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 3000 pg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 4000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 6000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 7000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 8000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 9500 pg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10.000 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1,5mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 4,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente
20. 5.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 6,5 mg/kg de peso

    corporal, aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 7,5 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 9,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 11,0 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 11,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 13 mg/kg de peso corporal, aproximadamente
21. 13.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 14 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 14,5 mg/kg de peso

    corporal, aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 15,5 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 16 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 16,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 17 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 17,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 18 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 19,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 21,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 22 mg/kg de peso corporal, aproximadamente
22. 22.5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 23 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 23,5 mg/kg de peso

    corporal, aproximadamente 24 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 24,5 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 25,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 26 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 26,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 27 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 27,5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 28 mg/kg de peso corporal,

    aproximadamente 29,5 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal.