KR20180002838A - 모발 생장을 촉진하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20180002838A
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안젤라 크리스티아노
라파엘 클라인즈
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더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 발명은 특정 구현예에서 모발 생장을 유도하기 위해 JAK-STAT 경로를 저해하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 모발 생장을 유도하기 위해 JAK-STAT 경로의 소분자 저해제를 이용한 국소 치료 방법에 관한 것이다.

Description

모발 생장을 촉진하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 2015년 5월 7일자로 출원된 미국 가출원 제 62/157,959호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
지원 정보
본 발명은 미국 국립 보건원으로부터 정부 지원 R01AR056016 및 R21AR061881 하에 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
본 발명은, 특정 구현예에서, 모발 생장을 유도하기 위해 JAK-STAT 경로를 저해하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 체모 생장을 유도하기 위해 JAK-STAT 경로의 소분자 저해제를 이용한 국소 치료 방법에 관한 것이다.
몇가지 모발 생장 장애는 모발 주기의 생장 단계 (성장기)로의 재진입 불능을 특징으로 한다. 이는 안드로겐성 탈모증 (androgenetic alopecia)의 경우 모낭 (HF)의 축소 또는 원형 탈모증의 경우 면역 기능 부전으로 인한 것일 수 있다. 안드로겐성 탈모증에 대한 현재의 약리학적 요법은 주로 탈모가 더 이상 진행되지 않게 방지하는데 집중되어 있고, 모발 주기를 재개하기 위한 약리학적 물질에 대한 어려운 연구는 대체적으로 만족스럽지 않은 편이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 투여가 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기인 시기에 실시되는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 상기 개체가 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증 (telogen effluvium), 원형 탈모증 (alopecia areata), 머리 백선 (tinea capitis), 전두 탈모증 (alopecia totalis), 감모증 (hypotrichosis), 유전성 단순 감모증 (hereditary hypotrichosis simplex), 전두부 섬유화 탈모증 (frontal fibrosing alopecia), 반흔성 탈모증 (cicatricial alopecia), 모공 편평태선 (lichen planopilaris), 고리형 탈모증 (ring alopecia), 흉터성 탈모증 (scarring alopacia), 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증 (alopecia universalis)을 앓고 있는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ를 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 변이체 또는 변형체, 또는 소분자인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 룩솔리티닙 (INCB 018424)인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 토팍시티닙 (tofacitinib, CP690550)인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (momelotinib, CYT387), 파르트시티닙 (partcitinib, SB1518), 바리시티닙 (baricitinib, LY3009104), 페드라티닙 (fedratinib, TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (lestaurtinib, CEP-701), 플루다라빈 (fludarabine), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙 (pacritinib), 페피시티닙 (peficitinib), ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙 (decernmotinib), 필고티닙 (filgotinib), 간도티닙 (gandotinib), INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙 (cerdulatinib), INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물 (lumbricus rebellus extract), ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 (hyperforin) 또는 이들의 조합물인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 OSM-Rβ에 대한 항체인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 개체가 인간인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 모발이 두피 또는 얼굴의 털이거나 또는 개체의 눈썹 또는 속눈썹을 구성하는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 모발이 코털 (nasal hair)인, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 국소적으로 투여되는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 저해제가 경구 투여되는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 발현 수준이 상기 저해제의 투여 후 달라지는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 하나 이상의 바이오마커가 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 개체에서 모발 생장을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 투여하는 단계를 포함하며; 모낭이 휴지기 초기 이외의 단계에 있는,포유류 개체에서 모발 생장을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 투여하는 단계를 포함하며; 모낭이 성장기에 있는, 포유류 개체에서 모발 생장을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭으로부터 유래되는 모유두 3D 스피어 (dermal papilla 3D sphere)에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 상기 투여는 모유두 스피어를 개체에게 투여하기 전에 이루어지는, 모유두의 유도성을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭으로부터 유래되는 모유두 3D 스피어에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며; 모유두 스피어를, 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증, 전두부 섬유화 탈모증, 반흔성 탈모증, 모공 편평태선, 고리형 탈모증, 흉터성 탈모증, 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증을 치료하기 위해, 개체에게 투여하기 전에, 상기 투여가 이루어지는, 모유두의 유도력 (inductivity)을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, (a) 개체로부터 수득되는 모낭 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 테라피 (therapy) 수행 중에 여러 시점 중 한 시점에 개체로부터 수득되는 모낭 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 1차 샘플에 비해 2차 또는 이후 샘플들에서 하나 이상의 바이오마커의 변화가 존재하는 경우 상기 테라피는 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는데 유효한 것인, 모유두 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는 테라피의 효능을 평가하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 (a) Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 포유류 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하기 위한 키트를 추가로 제공한다.
도 1A-1E. JAK -STAT 신호전달 저해는 야생형 마우스에서 성장기를 재개한다. 7주령 야생형 마우스를 면도하고, 비히클 대조군, SAG (sonic hedgehog agonist), 3% 룩솔리티닙 (JAK1/2 저해제), 토파시티닙 (JAK3 저해제)을 매일 국소 적용 처리하였다. 피부를 지정된 시간대에 회수하여, H&E으로 염색하였다. 처리 D21에 마우스 사진을 촬영하였다. 1B. 8.5주령의 마우스에 룩솔리티닙, 토파시티닙 또는 비히클 대조군을 5일간 처리하고, 성장기 개시 신호인 피부 색소 침착 외양을 모니터링하였다. 모발 증식 (및 색소 침착)이 없을 경우 임의 값 0을 할당하였다. 피부 흑화 (skin darkening)는 0-100%의 값을 매겼으며, 값이 높을수록 더 진한 피부색/가시적인 모발 생장을 의미한다. 각 조건 당 마우스 5마리를 사용하였다. 비-모수적 종단 데이타 분석을 처리 후 8-18일 동안 수행하여, 대조군 vs. 룩솔리티닙 p= 7.6 X10-34, 그리고 대조군 vs. 토파시티닙 P= 1.5 X10-10을 수득하였다. 1C. 비히클 대조군, 룩솔리티닙 및 토파시티닙을 4일간 처리한 마우스로부터 수득한 전체 피부를 마이크로어레이로 분석하였다. 발현 데이타를 이용해, 3가지 처리군 각각에서 T0와 T5 간에 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. 조건 당 마우스 3마리를 사용하였고, 2번의 시기에 생검하였다. 1D. IPA (Ingenuity Pathway Analysis)를 사용해 차별적으로 발현된 유전자 리스트에서 과다로 표시된 분자 경로와 프로세스를 동정하였다. 차별적으로 발현된 유전자 리스트를 비교한 결과, 룩솔리티닙 및 토파시티닙에 의해 조절되는 유전자 서브세트가 드러났다. 적색 = 약물 처리시 T5 vs. T0에서 상향 조절된 유전자, 녹색 = 약물 처리시 T5 vs. T0에서 하향 조절된 유전자. 1E. 8.5주령의 마우스의 등 피부 한쪽에는 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을, 다른 쪽에는 비히클 대조군을 처리하였다. 처리 4시간 후, Edu를 각 마우스에 주사하고, 1시간 후 피부를 회수하였다. 처리는 1회, 2회 및 3회 수행하였으며, Edu+ 세포의 존재를 피부에서 분석하였다.
도 2A-2D. JAK -STAT 경로는 모낭 주기 동안에 다이나믹하게 조절된다. 2A. 8주령의 Rag1-/- 및 Tcr β/δ-/- 마우스에 JAK 저해제를 매일 처리하였다. 마우스를 1주일간 처리하고, 매일 처리 중단 후 7일째에 사진을 촬영하였다. 마우스 3마리/유전자형의 대표적인 사진을 도시한다. 2B. 전체 피부를 생후 17일 (퇴화기), 23일 (휴지기), 29일 (성장기 초기) 및 33일 (성장기 중기)에 마우스에서 회수하였다. 유전자 발현 변화는 JAK-STAT 경로에 참여한 유전자와 기준 대조군 (normalizing control) (Qiagen)이 포함된 JAK-STAT qPCR 어레이를 이용해 분석하였다. 시간대 별로 마우스 3마리를 사용하였고, 각각은 별개의 qPCR 플레이트에서 혼성화하였다. 유전자 발현의 log 2 배수 변화를 사용해, GEDI (gene expression dynamics inspector) 자가-조직 맵 (SOM)을 구축하여, 모발 사이클 동안의 유전자 발현의 동역학적 변화를 가시화하였다. GEDI 클러스터를 경시적인 유사 발현 패턴을 기초로 메타유전자 (metagene)로 전사하여 5X6 그리드 상에 배치하였다. 실험 샘플 (각각 D23, D29, D33) 대 대조군 샘플 (D17)에서 억제된 메타유전자는 녹색 내지 청색인 반면, 실험 샘플에서 메타유전자에서 나타난 메타유전자는 적색이다. 상위 역치 및 하위 역치는 2배 변화에 해당된다. 2X 보다 큰/작은 변화를 최고 색상으로 설정하였다. 2C. A에서 강조 표시된 (박스 표시된 픽셀) 억제된 메타유전자의 유전자 내용을 표에 상세히 나타낸다. 박스 표시된 픽셀의 색상은 표에서 글자의 색과 일치한다. 2D. 야생형 마우스로부터 성장기 (30일), 퇴화기 (42일) 및 휴지기 (D50)에 피부를 회수하여, 고정하고, 항-포스포 STAT3 및 항-포스포 STAT5 뿐만 아니라 Krt15 (벌지 마커) 및 P-카드헤린 (모원배 마커)로 염색하였다. 포스포 STAT3는 성장기 중에 모낭-외 세포 (extra-follicular cell) 뿐만 아니라 DP 세포 (흰색 화살표)에서 발현된다. 퇴화기에, 포스포-STAT3는 DP (적색 화살표) 및 모원배 (오렌지색 화살표)에서 발현된다. 휴지기 초기에, 포스포 STAT3는 DP (녹색 화살표)에 가장 근접한 모원배 세포에 존재한다. 포스포 STAT5는 모발 주기내내 DP에서 강하게 발현되며, 퇴화기 (노란색 화살표)에 최고 수준으로 발현된다. 포스포-STAT5는 또한 퇴화기 모낭의 벌지 (마젠타색 화살표)에서 검출할 수 있다. 제이스 공초점 현미경을 사용해 40X 배율로 사진을 촬영하였다.
도 3A-3E. JAK -STAT의 저해는 인간 조직에서 모발 생장을 촉진한다. 3A. 인간 두피 피부를 SCID 마우스에 이식하고, 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 4주간 국소 처리하였다. 이식체를 3-5일마다 사진 촬영하였다. 비히클-처리면과 약물-처리면 간의 차이를 정량하기 위해, ImageJ를 사용해 이식체 전체에서 색소 침착 정도를 측정하였다. 각 히스토그람에서 수직선은 비히클과 약물 처리 간의 경계에 해당된다. 3B. 성인 인간 두피 조직으로부터 각각의 HF를 절개하여, 비히클 대조군, 룩솔리티닙 및 토파시티닙 존재 하에 배양하였다. 모낭의 사진을 2주간 2일마다 촬영하고, 각 모낭의 길이를 경시적으로 측정하였다. 토파시티닙 및 록솔리티닙 처리는 성장기의 생장 속도를 현저하게 증가시켜 (각각 P=0.017 및 P=0.025), HF의 전체 길이를 증가시켰다. 한명의 공여자로부터 취한 모낭에 대해 처리 당 모낭 3-4개로 실험 사진을 촬영하였다. P-값은 비-모수적 종단 데이타 분석을 이용해 구하였다. 3C. DP 스피어는 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙의 존재 하에 행잉 드롭 (hanging drop) 형태로 배양한 다음, 마우스 신생아 각질 형성 세포와 조합하여 생체내 주입하였다. 3D. 그래프는 3명의 공여체로부터 입수한 스피어를 이용한 3건의 별개 실험을 나타낸다. DP 공여자/조건 별로, 인간 DP 스피어 및 마우스 각질 형성 세포 슬러리를 1회 주사하여, 유도된 모낭을 함유한 낭포를 형성시켰다. 3E. 낭포를 분리하고 모발을 현미경으로 수동으로 계수한, 유도된 모낭의 수에 대한 그래프. 대조군과 토파시티닙 처리군 간의 차이는 통계적으로 유의하다 (P=0.00013). P-값을 랜덤효과 (random effect)로서 선형 복합 효과 분석 (linear mixed effect analysis)을 이용해 처리 공여체에서 계산하였다.
도 4A-4D. 토파시티닙은 유도성 분자 시그니처를 강화한다. 4A. 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙이 처리된 DP 스피어를 마이크로어레이를 사용해 분자 프로파일링을 수행하였다. 조건 당 개개 공여체 3명에서 유래한 세포를 사용하였다. 유전자 발현의 log2 배수 변화를 이용해 GEDI 플롯을 작성하여 약물 처리 (Z 축 및 색상 스케일)에 따른 유전자 발현의 동역학적 변화를 가시화하였다. 메타유전자로 그룹핑된 전사체 클러스터를 18x19 그리드 (X,Y) 상에 배치하였다. 3가지 비교 그룹은 다음과 같다: 룩솔리티닙 vs. 대조군, 토파시티닙 vs. 대조군, 및 룩솔리티닙 vs. 토파시티닙. 플롯에서 대상 영역 4곳을 강조 표시하는데, 이는 토피시티닙 처리에 의해 나타난 유전자 (영역 1 & 2)와 토파시티닙 처리에 의해 상향 조절된 유전자 (영역 3 & 4)이다. 4B. 1-4 영역에서 선택된 유전자를 표에 나타낸다. 4C. 유전자 세트 농화 분석 (gene set enrichment analysis)으로, DP 유도력에에 기여하는 것으로 기존에 확인된 유전자들의 그룹 (Higgins et al. (35)에 의해 동정된 T2 및 T4내 유전자들)이 토파시티닙 처리에 의해 현저하게 농화되는 것으로 드러났다 (p=1.3X10-5). 회색 점선은, 이 분석에서 정상 분포 (농화 안됨)일 것으로 생각되는 것을 표시한다. X 축은 토파시티닙 처리 세포를 무처리 세포와 비교하였을 때 과다 발현 수준이 가장 높은 것에서 가장 낮은 순서로 어레이에 모든 유전자 패싱 콜의 순위를 나타낸다. Y 축은 해당 순위에서 T2 및 T4의 조합된 유전자 세트의 농화 스코어 (ES)를 나타낸다. 정규화된 농화 스코어 (NES: normalized enrichment score)는 랜덤화된 데이타에서 관찰되는 ES 분포를 구하는 Z-스코어 확률을 나타내며, 관련 p-값을 표시한다. T2 및 T4의 유전자에 대한 개별 유전자 순위를 플롯 하단의 바코드에 블랙 해시로 표시한다. 4D. 도 3 및 4에서 수득한 결과 요약: 온전한 (intact) DP는 완전 유도성으로서, 모낭 생장 유도 잠재력은 모유두를 시험관내에서 배양하였을 때 상실한다. 본 발명자들은, 기존에, 스페로이드 배양물 (spheroid culture) 형태로 증식 중인 DP 세포가, 온전한 DP와 관련된 분자 시그니처의 유전자 서브세트 (영역 1 및 3 (T1 및 T3))를 조절함으로써, 일부 유도 잠재성을 회복한다는 것을 입증하였다 (35). DP 스피어에 토파시티닙 처리는, 3차원 배양 조건에 의해 기존에 변형되지 않은 경로들 중 일부를 타겟팅함으로써 배양된 DP의 유도력을 증가시켰다 (T2 및 T4). 청색 = 비-유도성 상태에 해당되는 영역내에서의 유전자 발현, 적색 = 유도성 상태에 해당되는 영역내에서의 유전자 발현. 토파시티닙은 T2 및 T4 영역내 유전자들을 복원시키지만, 복원은 충분히 온전한 DP (밝은 적색 영역)와 비교해 불완전하다.
도 5A-5E: JAK 저해 매개 모발 생장은 내인성 모발 생장을 되풀이하며, 휴지기의 기간에 의존한다. 5A. 야생형 마우스에 휴지기 (8.5주)에 비히클 대조군, 2% 토파시티닙 또는 2% 룩솔리티닙을 4일간 처리하였다. 피부를 회수하여, 단편으로 잘라 Ki67 (증식 마커) 및 P-카드헤린 (모원배 마커)으로 염색하였다. 사진은 처리군 당 마우스 3마리를 도시한다. 5B. 7주령의 야생형 마우스에 비히클, 토파시티닙 또는 룩솔리티닙을 처리하고, 지정된 시기에 피부를 회수하였다. 지정된 시기에 모낭의 수와 두께를 정량하였다. 대조군으로서, 매우 전형적인 방식으로 진행되는 과정인 털 빠짐 이후의 모발 생장을 이용하였다 (8). 5C. 7주령 또는 8.5주령의 마우스 2 그룹을 면도하고, 매일 룩솔리티닙, 토파시티닙 또는 비히클 대조군을 처리하였다. 마우스에 1주일간 처리하고, 매일 처리가 끝난 후 7일째에 사진을 촬영하였다. 피부를 회수하여 H&E로 염색하였다. 마우스들 모두 여전히 불응성 휴지기에 있게 하기 위해, 발모 후 모발 생장은 양쪽 주령 그룹에서 유사한 카이네틱스를 따르는 것을 확인한다. 마우스 사진과 H&E 염색 사진은 그룹 당 마우스 3마리로, 2번의 실험을 도시한다. 5D. 7주령의 마우스 (출생 후 49일)에 24일간 룩솔리티닙, 토파시티닙 또는 비히클 대조군을 처리하고, 지정된 시기에 생검을 취하였다. 나타낸 바와 같이, 록솔리티닙으로 18일간 처리시 그리고 토파시티닙으로 21일간 처리시, 처리된 모낭에서 성장기가 재개되었다. 5E. 8.5주령 마우스에 대조군 (C 좌측) 또는 룩솔리티닙 (R 우측)을 매일 처리하였다. 처리 후 5일째부터 매일 사진을 촬영하였고, 피부를 피부 흑화 수준에 따라 점수를 매겼다. 처리 후 8, 12 및 16일에 마우스 처리 (마우스 4마리/처리군) 사진을 도시한다.
도 6A-6C: 유전자 농화된 분자 경로는 각각의 JAK -STAT 저해제에 의해 차별적으로 조절된다. 6A. 0일 (T0) 또는 4일간 (T5) 룩솔리티닙 및 토파시티닙을 처리한 전체 피부 샘플을, 마이크로어레이 분석에 의해 동정한 선택 유전자에 대해 qPCR로 분석하였다. 결과는 3건의 별개 실험들을 나타내며, paired t-검정으로 측정시 p 값은 >0.05이다. 6B. 마이크로어레이 발현 데이타를 이용해 DMSO, 룩솔리티닙 및 토파시티닙 처리군들에서 T0 및 T5 간에 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. IPA (Ingenuity Pathway Analysis)를 이용해, 모든 처리에서, 처리 서브세트에서 차별적으로 또는 각 조건에서 독점적으로 조절되는 유전자를 동정하였다. 다음으로, IPA를 이용해 차별적으로 발현된 유전자 리스트에서 과다로 표시된 분자 경로와 프로세스를 조사하였다. 룩솔리티닙 처리에 의해 강화된 경로들을 도시한다. 6C. 토파시티닙 처리에 의해 강화된 경로. 적색 = 약물 처리 샘플에서 상향 조절된 유전자, 녹색 = 약물 처리 샘플에서 하향 조절된 유전자.
도 7A- 7C: JAK 저해 효과는 T 세포에 독립적이며, 대신 세포 고유 특성을 나타낸다. 7A. 림프구 결함성 마우스에서 임의의 모발 주기 이상이 있는지를 확인하기 위해, B 및 T 세포가 결핍된 Rag1-/- 마우스 및 이동성 및 거주성 T 세포가 결핍된 Tcr β/δ-/- 마우스 뿐만 아니라 생후 30일 (성장기), 42일 (퇴화기) 및 D50 (휴지기 초기)에 이형접합성 대조군으로부터 피부를 회수하여 분석하였다. 마우스 3마리/유전자형의 H&E 사진을 도시한다. 7B. 퇴화기에서 이후 성장기로의 전이를 나타내는, 경시적인 유전자 발현 변화를 선택된 유전자 번호에 대해 그래프를 작성하였다. 7C. 포스포-STAT 3 및 포스포-STAT 5의 저배율 사진. 사진은 Zeiss 공초점 현미경에서 20X 배율로 촬영하였다.
도 8A- 8E: JAK -STAT 저해는 인간 모낭 생장을 촉진한다. 8A. 인간 두피 피부를 SCID 마우스에 이식하고, 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 4일간 국소 처리하였다. 시간 경과에 따른 피부 흑화를 정량한 결과를 도시한다. 8B. 인간 배아성 두피 피부에 토파시티닙을 처리한 제2 예. 이 경우, 여러가지 처리가 가능할 만큼 이식체의 크기가 크지 않아, 동일 개체로부터 유래된 2종의 별개 이식체에서 처리를 수행하였다. 8C. 장기 배양 실험을 2명의 개체로부터 유래된 모낭으로 반복 실시하였다. 토파시티닙 및 룩솔리티닙 처리시 성장기의 생장 속도가 빨라져, 이전에 관찰된 경향이 반복되었지만, 결과는 통계적인 유의 수준에는 도달하지 못하였다. 8D. 성장기의 인간 HF를 포스포 STAT 3, 포스포 STAT 5 또는 이소형 대조군으로 염색하였다. 사진은 Zeiss 공초점 현미경에서 20X 배율로 촬영하였다. 8E. T2 역시 토파시티닙 처리에 의해 강화되었지만, 통계적인 오버랩 (statistical overlap)은 매우 조금 유의하였다 (P=0.03).
도 9A-9E: OSM 및 OSM - Rβ는 휴지기 동안에 활성화된 STAT3 및 STAT5와 벌지 (bulge)내에 함께 위치한다. A. 인산화된 STAT3 및 STAT5 단백질은 휴지기 초기 및 중기 (P40, P60) 동안에 HFSC 구획에 존재하며, 휴지기 후기 (P80)에는 감소한다. OSM 면역 형광은 이 시기에 HFSC에 공동-위치한다. B. OSM 수용체 (OSM-Rβ) 역시 HFSC 벌지 구획에 면역조직화학 결과와 공동-위치한다. 사진들 모두 X20 배율에서 촬영하였다. C. 시험관내 배양한 각질 형성 세포, OSM은 OSM 처리 10분 이내에 STAT1, STAT3 및 STAT5 전사 인자들을 활성화하며, 이는 토파시티닙 (TOFA)에 의해 효과적으로 상쇄된다. D. TOFA 처리된 생체내 전체 피부 역시 STAT3 및 STAT5 활성화를 효과적으로 저해하는 것으로 확인된다. E. P60 휴지기 피부에 매일 피하 주사된 OSM-Rβ 중화 항체는 국소 성장기를 유도한다. PBS 대조군과 IL-6 및 이의 수용체에 대한 중화 항체는 효과가 없는 것으로 확인된다. F. gp130 역시 벌지에서 증가된다.
도 10A-10G: OSM은 마우스 각질 형성 세포에 생장-저해 특성을 가지며, 벌지내 HF 줄기 세포 구획 상에 작용한다. A. 휴지기에 회수한 마우스 각질 형성 세포를 이용한 콜로니 형성 분석 결과, OSM이 각질 형성 세포에 생장 저해 효과를 가지는 것으로 확인되며, 이는 토파시티닙 첨가시 부분적으로 반전된다. B. 토파시티닙 단독은 각질 형성 세포 콜로니를 수적으로 증가시킨다. C. 7.5주 및 8.5주 (P56 및 P60)에 2차 휴지기에 회수한 피부를 해리시켜, 상피와 진피를 qRT-PCR로 분석하였다. D. OSM-Rβ는 상피에서 선호적으로 발현되는 반면 OSM은 진피에서 생산된다. OSM 생산 역시 P53에서 P60 사이에 증가한다. E. 상피에서, OSM-Rβ는 벌지 구획에서 증가한다. F. CD34+ ITGA6+ HFSC를 분리하기 위한 마우스 상피에 대한 세포 분류 전략. G. 배양한 마우스 각질 형성 세포에서, 재조합 마우스 OSM을 20ng/ml로 처리하면 OSM-Rβ의 발현이 상향 조절된다.
도 11A-11F: JAK 저해는 마우스 피부에서 OSM - Rβ 발현을 억제하며, 이는 선호적으로 정지 상태의 감퇴로 이어진다. A. JAK-저해제 실험에서 수득한 기존 마이크로어레이 데이타를 재분석하였으며, JAK 저해는 휴지기에 처리된 전체 마우스 피부에서 OSM-Rβ를 계속적으로 하향 조절한다. B. qRT-PCR을 이용해 검증한 생체내 OSM-Rβ 하향 조절, 토파시티닙 또는 록솔리티닙을 5일간 처리하면서 매일 전체 피부 생검을 수집하였다. C. 배양한 마우스 각질 형성 세포에서 시험관내 OSM-Rβ 전사의 하향 조절. D. 룩솔리티닙으로 처리된 휴지기 마우스 피부로부터 유래된 분류된 각질 형성 세포 역시 3일 후 OSM-Rβ의 하향 조절을 나타낸다. E. JAK2 저해제로서 생체내 룩솔리티닙 처리는 초기 STAT3/5 저해를 유도하며, 이후 Akt 및 ERK 경로가 활성화되어, OSM-Rβ의 하향 조절을 유도한다. F. 진피 구획, 아마도 모유두 세포 (dermal papilla)에서 생산된 OSM이, OSM-Rβ 발현을 유지하면서 동시에, 생장 및 분화 억제를 통해 휴지기 동안에 정지 상태를 유지하기 위해 벌지에서 HFSC 상의 OSM-Rβ에 결합함을 개략적으로 도시한 도.
표 1: 실험에 사용된 항체 리스트와 희석율
표 2: 실험에 사용된 qPCR 프라이머 리스트
표 3: T2 및 T4 영역에 속하는 유전자 리스트 (as adapted from Higgins et al., PNAS 2013)
명확하게 하기 위해, 비-제한적인 방식으로, 본 발명의 상세한 설명은 하기 세부 항목으로 나뉜다:
5.1 정의
5.2 JAK-STAT 경로 유전자
5.3 치료 방법
5.4 약학적 조성물 및 투여
5.5 치료 효능의 모니터링 방법
5.6 키트.
최근들어, 본 발명자들은, JAK-STAT 경로의 약리학적 저해가 마우스 및 인간 둘다에서 원형 탈모증 (AA)의 신속한 모발 재생을 촉진한다는 것을 입증하였다 (1) (WO2013149194 A1, Christiano, et al., 본원에 포함됨). 예상치못하게도, AA 마우스에 대한 실험 기간 중에, JAK-STAT 저해제를 이용한 국소 치료가 특이적으로 건강한 모발 생산을 야기하는 것으로 관찰되었는데, 이는 모발 사이클의 개시에 국소적인 효과가 있다는 것을 의미한다. 본원에 언급된 바와 같이, JAK-STAT 신호전달에 대한 약리학적 저해는 정상 마우스에서 모발 사이클을 개시하며, 인간에서 모발 생장을 촉진한다.
전술한 내용에 비추어, 본 발명은, 특정 구현예에서 모발 생장을 유도하기 위한 JAK-STAT 경로 저해용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 모발 생장을 유도하기 위해 JAK-STAT 경로의 소분자 저해제를 이용한 국소 치료에 관한 것이다.
5.1 정의
본원에서, "개체" 또는 "환자"는 인간 또는 인간을 제외한 동물이다. 동물 개체는 바람직하게는 인간이지만, 본 발명의 화합물 및 조성물은 수의학 약물에 유용성을 가지며, 뿐만 아니라 예를 들어 개, 고양이, 뮤라인 및 다양한 기타 애완 동물과 같은 가축 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지 등의 농장 동물 종; 및 야생 동물, 예를 들어, 인간을 제외한 영장류 등의 야생 또는 동물원의 동물을 치료하는데 유용성을 가진다.
본원에서, "약학적 조성물" 및 "약학적 제형"은 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 허용하기 위한 형태의 조성물로서, 제형이 투여되는 환자에게 허용불가하게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 조성물을 지칭한다.
본원에서, "약제학적으로 허용가능한"은, 예를 들어, "약제학적으로 허용가능한 담체"와 관련하여, 개체에게 무독성인 특성을 나타낸다. 약학적 제형에서 약제학적으로 허용가능한 성분은 활성 성분 이외에 무독성인 다른 성분일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로 완충제, 부형제, 안정제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
본원에서, "Jak1 저해제"는 Jak1 유전자 또는 Jak1 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는, 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Jak1에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 낮출 수 있다.
본원에서, "Jak2 저해제"는 Jak2 유전자 또는 Jak2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는, 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Jak2에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 낮출 수 있다.
본원에서, "Jak3 저해제"는 Jak3 유전자 또는 Jak3 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는, 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Jak3에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 낮출 수 있다. 일 구현예에서, Jak3 저해제는 Jak3 조절 화합물일 수 있다.
본원에서, "Tyk2 저해제"는 Tyk2 유전자, 또는 Tyk2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 Tyk2에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다. 일 구현예에서, Tyk2 저해제는 Tyk2 조절 화합물일 수 있다.
본원에서, "STAT1 저해제"는 STAT1 유전자, 또는 STAT1 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT1에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT2 저해제"는 STAT2 유전자, 또는 STAT2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT2에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT3 저해제"는 STAT3 유전자, 또는 STAT3 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT3에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT4 저해제"는 STAT4 유전자, 또는 STAT4 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT4에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT5a 저해제"는 STAT5a 유전자, 또는 STAT5a 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT5a에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT5b 저해제"는 STAT5b 유전자, 또는 STAT5b 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT5b에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "STAT6 저해제"는 STAT6 유전자, 또는 STAT6 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 STAT6에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "OSM 저해제"는 OSM 유전자, 또는 OSM 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 OSM에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "gp130 저해제"는 gp130 유전자, 또는 gp130 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 gp130에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "LIFR 저해제"는 LIFR 유전자, 또는 LIFR 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 LIFR에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "OSM-Rβ 저해제"는 OSM-Rβ 유전자, 또는 OSM-Rβ 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물일 수 있다. 이 화합물은 OSM-Rβ에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본원에서, "Jak/STAT 저해제"는 Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6/OSM/gp130/LIFR/OSM-Rβ 유전자 또는 Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a /STAT5b/STAT6/OSM/gp130/LIFR/OSM-Rβ 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는, 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Jak1/Jak2/Jak3/Tyk2/STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6/OSM /gp130/LIFR/OSM-Rβ에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본 발명의 저해제는, 본원에 언급된 대응되는 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한, 항체 (단일클론, 다클론, 인간화된, 키메라 또는 완전 인간)와 같은 단백질, 또는 이의 결합 단편일 수 있다. 항체 단편은 전장 형태 이외의 항체 형태일 수 있으며, 조작된 항체 단편 외에도, 전장 항체 범위에 존재하는 영역 또는 구성 성분을 포함하며, 항체 단편으로는, 비-제한적으로, 단쇄 Fv (scFv), 다이아바디, Fv 및 (Fab')2, 트리아바디, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, CDR들의 조합, 가변부, 테트라바디, 이중 특이성 하이브리드 항체, 프래임워크 영역, 불변부 등을 포함한다 (Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed . Eng . 2:339-76; Hudson (1998) Curr . Opin. Biotechnol . 9:395-402). 항체는 상업적으로 구입하거나, 주문 제작하거나, 또는 당해 기술 분야에 확립된 방법에 따라 대상 항원에 대해 합성할 수 있다 (Janeway et al., (2001) Immunobiology , 5th ed., Garland Publishing).
본 발명의 저해제는 단백질에 결합하여 이의 기능을 파괴하는 소분자일 수 있다. 소분자는 일반적으로 저분자량의 다양한 그룹의 합성 및 천연 물질이다. 이는, 천연 소스 (예, 식물, 진균, 미생물 등)로부터 분리하거나, 상업적으로 입수하거나 및/또는 라이브로리 또는 콜렉션으로서 이용가능하거나, 또는 합성할 수 있다. 단백질을 조절하는 소분자 후보 물질은, 인 실리코 스크리닝 또는 조합 라이브러리의 고-성능-풋 (HTP) 스크리닝을 통해 동정할 수 있다. 아스피린, 페니실린 및 많은 화학치료제 등의 대부분의 기존 약제들은 소분자이거나, 상업적으로 입수할 수 있거나, 화학 합성할 수 있거나, 랜덤 또는 조합 라이브러리로부터 수득할 수 있다 (Werner et al., (2006) Brief Funct . Genomic Proteomic 5(1):32-6). 일부 구현예에서, 물질은 타겟 단백질 또는 RNA와 결합, 상호작용 또는 조합하는 소분자이다. 이러한 소분자는, 타겟이 세포내 타겟일 경우, 세포의 지질 이중층을 침투하여 타겟과 상호작용할 수 있는, 유기 분자일 수 있다. 소분자로는, 비-제한적으로, 독소, 킬레이트제, 금속 및 준금속 화합물 등이 있다. 소분자는 소분자를 특정 세포로 특이적으로 안내하도록 하기 위해 타겟팅 물질에 결합 또는 접합될 수 있다.
본원에서, "치료학적인 유효량"은 투여되는 조성물에 함유된 본 발명의 저해제의 양이 의도한 목적을 달성하기에, 예를 들어, 이 경우, 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하기에 충분한 양인 것을 지칭한다. 본 발명의 목적에서, 모발 생장을 측정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있어 본원에 반복 기술하지 않는다. 저해제를 모발 생장을 유도하기 위해 투여한다는 맥락에서, 조성물의 유효량은 모낭이 성장기 단계로 재-진입하게 유도하는데 충분한 양이다. 성장기 단계에서 모발 생장을 촉진하기 위해 저해제를 투여한다는 맥락에서, 저해제의 유효량은 모발 생장 속도를 증가시키는데 충분한 양이다. 예를 들어, 증가는 모발 생장 속도의 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 5000%, 10000% 또는 그 이상의 증가일 수 있다. 각 투여시 치료학적인 유효량은 1 ng 내지 1 ㎍, 1 ㎍ 내지 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 1 g의 임의의 양 또는 그 이상, 또는 이의 임의 중간 수준의 양일 수 있다. 치료학적인 유효량은 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 저해제의 치료학적인 유효량은 국소, 경구 또는 정맥내로 투여할 수 있다. 저해제를 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와의 혼합물로 사용하는 경우, 저해제의 유효량은 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 중량%의 함량이거나 또는 이의 임의의 중간 수준의 함량일 수 있다.
본원에서, "성장기 단계"는 모낭의 활성 생장 단계를 지칭한다. 전형적으로, 성장기에서, 모근에서 세포는 빠르게 분열하여, 모간 (hair shaft)으로 보충된다. 성장기 종료시, 특정 생물학적 신호는 모낭이 퇴화기 단계로 진입하도록 유도한다.
본원에서, "퇴화기 단계"는 성장기 단계시 종료시 이루어지는 과도기 단계 (transition stage)를 지칭한다. 모발의 활성 생장을 종료하는 신호를 전달한다.
본원에서, "휴지기 단계"는 모낭이 휴식하는 단계를 지칭한다. 휴지기 단계 중에, 모낭은 무-활동성 상태로 유지된다. 특정 생물학적 신호에서, 모낭은 성장기 단계로 재-진입하여 다시 생장을 시작하게 될 것이다. 휴지기 단계 초기는 기간의 5%-40%가 휴지기 단계의 시작기인 것을 지칭한다. 휴지기 후기는 기간의 5%-40%가 휴지기 단계의 말기인 것을 지칭한다. 휴지기 중기는 휴지기 초기와 휴지기 후기 사이의 기간을 지칭한다.
본원에서, "안드로겐성 탈모증"은 또한 남성형 탈모증이라고도 하며, 안드로겐성 호르몬의 영향으로 인한 모낭의 근원적인 수축 감수성으로 인해 발생하는 탈모증이다.
본원에서, "휴지기 탈모증"은 모발이 휴지기 단계에 일찍 돌입함으로써 유발되는 모발의 가늘어짐 또는 탈락 (shedding)이 특징적인 두피 장애이다.
본원에서, "원형 탈모증"은 또한 스팟 대머리 (spot baldness)라고도 하며, 이는 신체가 자신의 세포를 인지하는데 실패하여 자신의 조직을 파괴함으로써 신체의 일부 또는 전 영역에서 탈모가 발생되는, 자가면역 질환이다.
본원에서, "머리 백선"은 두피의 피부 진균 감염증 (피부진균증)이다. 이 질환은 주로 모간에 침입하는 트리코피톤 (Trichophyton) 및 마이크로스포럼 (Microsporum) 속의 피부사상균에 의해 유발된다. 임상적인 증상은 전형적으로 1곳 또는 여러 곳의 탈모이며, 때때로 '검은 점' 패턴 (종종 모발 갈라짐)을 수반하며, 염증, 비듬, 농포 및 가려움을 동반할 수 있다.
본원에서, "전두 탈모증"은 전체 머리카락 소실을 지칭한다.
본원에서, "감모증"은 비정상적인 모발 패턴 - 주로 소실 또는 감소 증상을 지칭한다.
본원에서, "유전성 단순 감모증"은 기타 외배엽성 또는 전신성 이상 없이 구조적 결함을 동반하지 않는, 머리카락이 성기거나 없는 것을 특징으로 하는, 유전 장애를 지칭한다.
본원에서, "전두부 섬유화 탈모증"은 두피 전두부 상의 머리카락 경계부에 발생하는 흉터성 탈모증 형태를 지칭한다.
본원에서, "반흔성 탈모증"은 흉터성 탈모증이라고도 하며, 모낭을 파괴하는 일군의 희귀 장애를 지칭한다. 모낭은 흉터 조직으로 교체되어 영구적인 탈모를 유발한다.
본원에서, "모공 편평태선"은 편평 태선으로 알려진 비교적 흔한 피부 질환이 털이 난 피부 영역에 발생할 때 생기는 흉터성 탈모 타입이다. 모공 편평태선은 모낭을 파괴하고 이를 흉터로 바꾼다.
본원에서, "고리형 탈모증"은 두부를 둘러싸거나 또는 부분적으로 둘러싸고 있는 고리 또는 밴드형의 탈모로서; 뒷쪽 후두부를 따라 귀 위 또는 이마까지 두피 측두 영역 주위로 확장할 수 있다.
본원에서, "화학요법 유발성 탈모증"은 암 또는 루푸스 및 류마티스 관절염과 같은 비-암성 질환을 치료하기 위한 화학요법 이후에 발생하는 탈모증 타입이다.
본원에서, "전신 탈모증"은 두피와 신체에 완전한 탈모가 특징적인 병태를 지칭한다. 원형의 탈모를 유발하는 병태인 원형 탈모증이 진행된 형태이다.
5.2 JAK -STAT 경로 유전자
JAK-STAT 신호전달 경로는 세포외 환경에서 핵으로 생물학적 신호를 전송하여, 분화, 세포자살, 면역, 증식 및 발암에 참여하는 유전자의 DNA 전사 및 발현을 유발한다. 이 경로의 3가지 주 구성 성분은 세포 표면 수용체, Janus 키나제 (JAK) 및 신호 전달인자 및 전사 활성인자 (STAT, Signal Transducer and Activator of Transcription) 단백질이다.
JAK는 세포내 비-수용체성 티로신 키나제 계열이다. STAT는 세포내 전사 인자의 한 계열이다. 인터페론, 인터루킨 및/또는 성장인자와 같은 리간드가 세포 표면 수용체에 결합하면, 관련 JAK를 활성화하여 수용체 상의 티로신 잔기를 인산화하고 SH2 도메인에 대한 결합 부위를 형성하게 된다. 그런 다음, SH2 도메인을 가진 STAT는, JAK에 의해 또한 티로신-인산화됨으로써 그 수용체로 동원된다. 활성화된 STAT는 헤테로다이머 또는 호모다이머를 형성하고, 세포 핵으로 전위되어 타겟 유전자의 전사를 유도하게 된다. 또한, STAT는 수용체 티로신 키나제 (예, 상피 성장 인자 수용체) 및/또는 비-수용체 티로신 키나제 (예, c-src)에 의해 직접 티로신-인산화될 수 있다.
JAK 패밀리 유전자는 Janus 키나제 1 (JAK1, GenBank ID: 3716), Janus 키나제 2 (JAK2, GenBank ID: 3717), Janus 키나제 3 (JAK3, GenBank ID: 3718), 및 티로신 키나제 2 (TYK2, GenBank ID: 7297)를 포함한다.
STAT 패밀리 유전자는 신호 전달인자 및 전사 활성인자 1 (STAT1, GenBank ID: 6772), 신호 전달인자 및 전사 활성인자 2 (STAT2, GenBank ID: 6773), 신호 전달인자 및 전사 활성인자 3 (STAT3, GenBank ID: 6774), 신호 전달인자 및 전사 활성인자 4 (STAT4, GenBank ID: 6775), 신호 전달인자 및 전사 활성인자 5A (STAT5A, GenBank ID: 6776), 신호 전달인자 및 전사 활성인자 5B (STAT5B, GenBank ID: 6777), 및 신호 전달인자 및 전사 활성인자 6 (STAT6, GenBank ID: 6778)를 포함한다.
온코스타틴 (oncostatin) M (OSM, GenBank ID: 5008)은 백혈병 저해 인자/온코스타틴-M (LIF/OSM) 계열의 단백질에 속하는 구성원을 코딩하는 유전자이다. 코팅된 프리프로단백질은 단백질 분해에 의해 프로세싱되어 성숙형 단백질이 된다. 이 단백질은 다수의 종양 세포주의 증식을 저해하는 분비형 사이토카인이자 성장 조절인자이다. 이 단백질은 또한 내피 세포에서 인터루킨 6, 과립구-콜로니 자극 인자 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 등의 다른 사이토카인의 생산을 조절한다. OSM은 2개의 서로 다른 헤테로다이머 수용체를 통해 이의 생물 활성을 매개한다. gp130 수용체는 백혈병 저해 인자 수용체 (LIFR) 또는 OSM 수용체 β (OSM-Rβ)와 이량체를 형성하여 각각 I형 및 II형의 OSM 수용체를 형성하는 공통 구성 성분이다. I형 및 II형 OSM 수용체는 JAK-STAT 신호 경로를 활성화한다.
당단백질 130 (gp130, GenBank ID: 3572, 인터루킨 6 신호 전달인자라고도 함, IL6ST, IL6-beta 또는 CD130)은 인터루킨 6 (IL6), 섬모형 신경양영 인자 (CNTF), 백혈병 저해 인자 (LIF) 및 온코스타틴 M (OSM) 등의 다수 사이토카인들에 공유되는 막관통 신호 전달인자 단백질이다. 이 단백질은 사이토카인 수용체 복합체의 일부로서 작용한다. 이 단백질의 활성화는 사이토카인의 이의 수용체와의 결합에 의존한다.
OSM 수용체 β (OSM-Rβ, GenBank ID: 9180, 온코스사틴 M 수용체이라고도 함, 또는 OSMR)는 I형 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 구성원을 코딩하는 유전자이다. 코딩된 단백질은 gp130과 헤테로다이머를 이루어 II형 온코스사틴 M 수용체를 형성하게 되며, 인터루킨 31 수용체 A와 헤테로다이머를 이루어 인터루킨 31 수용체를 형성함으로써, 온코스사틴 M 및 인터루킨 31 유도된 신호전달 현상을 전달하게 된다.
백혈병 저해 인자 수용체 (LIFR, GenBank ID: 3977, 백혈병 저해성 인자 수용체 alpha라고도 함)는 I형 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 이 단백질은 고-친화성의 컨버터 서브유닛 gp130과 조합하여, 백혈병 저해 인자, 즉 성체 및 배아에서 세포 분화, 증식 및 생존에 참여하는 다중기능성 사이토카인의 작용을 매개하는 수용체 복합체를 형성한다.
5.3 치료 방법
모발 생장을 유도 또는 촉진하는 방법
본 발명은, 모발의 생장을 유도 또는 촉진하기 위한, 치료학적인 유효량의, 하나 이상의 JAK/STAT 단백질 (예, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ) 저해제 (예, 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543, CEP-701, 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, 레스타우르티닙, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린)의 용도에 관한 것이다. 이러한 모발 생장의 유도 또는 촉진이 바람직한 비-제한적인 겨우로는, 비-제한적으로, 개체가 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증, 전두부 섬유화 탈모증, 반흔성 탈모증, 모공 편평태선, 고리형 탈모증, 흉터성 탈모증, 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증을 앓고 있는 경우를 포함한다. 특정 구현예에서, 저해제는 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기일 때 개체의 모낭에 투여된다. 특정 구현예에서, 저해제는 국소 또는 경구 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체에게 치료학적인 유효량의 Jak/STAT 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 Jak/STAT 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체; Jak/STAT 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체; Jak/STAT 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; 소분자; 또는 이들의 조합물이다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 토팍시티닙 (CP690550)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물이다. 특정 구현예에서, 저해제는 OSM, gp130, LIFR, OSM-Rβ 또는 이의 조합에 대한 항체이다.
소분자, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 임의 변이체 또는 변형체를 전달하는 방법은 필요에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 선택된 물질의 구성 성분은 하나 이상의 플라스미드 형태의 DNA 구조체로서 전달된다. 특정 구현예에서, 구성 성분은 바이러스 벡터를 통해 전달된다. 일반적인 전달 방법으로는, 비-제한적으로, 전기천공 (electroporation), 미세주입 (microinjection), 유전자 총 (gene gun), 임팔레펙션 (impalefection), 정수압 (hydrostatic pressure), 연속 주입 (continuous infusion), 음파 처리 (sonication), 자기주입 (magnetofection), 아데노-부속 바이러스 (adeno-associated viruse), 바이러스 벡터의 외막 단백질 슈도타이핑, 복제-컴피턴트 벡터 cis 및 trans-작용 인자 (replication-competent vectors cis and trans-acting element), 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 화학적 비히클 (예, 올리고뉴클레토이드, 리포플렉스, 폴리머솜, 폴리플렉스, 덴드리머, 무기 나노입자 및 세포-침투성 펩타이드) 등이 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 모발 생장 바이어마커의 유전자 발현 수준. 본원에서, 모발 생장 바이오마커는 표 3에 열거된 유전자, Wnt 경로, Shh 경로, 모발 발달 경로 (hair development pathway) 및 멜라닌형성 경로의 임의 유전자, CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17을 포함하는 그룹의 임의 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 표 3에 열거된 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 Wnt 경로, Shh 경로, 모발 발달 경로, 멜라닌형성 경로, 또는 이들의 임의 조합의 유전자들로부터 선택되며, 상기 저해제의 투여 후 달라진다.
Wnt 및 Shh 신호전달 경로는 세포 표면 수용체를 통해 신호를 세포 안으로 통과시키는 세포 신호 경로이다. Wnt 경로에 참여하는 유전자로는, 비-제한적으로, Aes (TLE/Groucho), Apc, Axin1, Bcl9 , Csnk1a1, Csnk1d, Csnk1g1, Csnk2a1, Ctbp1, Ctbp2, Ctnnb1, Ctnnbip1 (Icat), Cxxc4, Dixdc1, Dkk1, Dvl1, Dvl2, Ep300, Frat1, Fzd1, Fzd2, Fzd3, Fzd4, Fzd5, Fzd6, Fzd7, Fzd8, Gsk3a, Gsk3b, Lef1, Lrp5, Lrp6, Nkd1, Porcn, Ppp2ca, Ppp2r1a, Pygo1, Senp2, Sfrp1, Sfrp4, Sox17, Tcf7, Tcf7l1, Wif1, Wnt1, Wnt10a, Wnt16, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b 및 Wnt8a 등이 있다. Wnt 경로에 참여하는 유전자로는, 비-제한적으로, Dhh, Hhat, Hhip, Ihh, Shh, Siah1, C18orf8, C6orf138, Npc1, Npc1l1, Ptch1, Ptch2, Ptchd1, Ptchd2, Ptchd3, Gli1, Gli2, Gli3, Gsk3b, Smo, Sufu, Cdon, Cep76 (C18orf9), Fgf9, Fkbp8, Ift52 및 OTX2 등이 있다.
모발 발달 경로는 모낭 형태형성 (hair follicle morphogenesis)에 관여하는 Wnt, Shh, Notch, BMP 및 기타 신호전달 경로를 포함한다. 모발 발달 경로에 참여하는 유전자로는, 비-제한적으로, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4 및 Gli2 등이 있다.
멜라닌형성 경로는 멜라노사이트 형성 및 성숙화를 담당하는 세포 신호 경로를 포함한다. 멜라닌형성 경로에 참여하는 유전자로는, 비-제한적으로, Sox10, p300 family, Bcl2, MAP 키나제, POMC, Lef-1, Tyrp1, Trp1, Trp2, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17 등이 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기일 때 개체의 모낭에 저해제를, Jak/STAT 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 Jak/STAT 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체; Jak/STAT 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; Jak/STAT 단백질의 발현을 낮추는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; 소분자; 또는 이들의 조합이며, 저해제는 휴지기 중기 또는 휴지기 후기에 개체의 모낭에 투여된다. 특정 구현예에서, 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기인 시기에 개체의 모낭에 투여되는 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424)이다. 특정 구현예에서, 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기인 시기에 개체의 모낭에 투여되는 저해제는 토팍시티닙 (CP690550)이다. 특정 구현예에서, 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기인 시기에 개체의 모낭에 투여되는 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (tofacitinib, CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물이다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 개체에게 Jak/STAT 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 모발 생장을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 휴지기 초기 이외의 시기에 투여된다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 성장기 단계에 투여된다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 Jak/STAT 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체; Jak/STAT 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 낮추는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; Jak/STAT 단백질의 발현을 낮추는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; 소분자; 또는 이들의 조합물이다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 토팍시티닙 (CP690550)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물이다.
모유두의 유도력을 촉진하는 방법
본 발명은, 추가적으로, 모유두의 유도력 (inductivity)을 촉진하기 위한, 하나 이상의 JAK/STAT 단백질 (예, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ) 저해제 (예, 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물)의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은, 개체의 모낭으로부터 유래되는 모유두 3D 스피어에 Jak/STAT 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 모유두의 유도력을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 모낭에서, 모낭-유래 진피 세포는 국소 상피와 상호작용하여, 털이 없는 다양한 수여체 피부 부위에 새로운 모낭을 유도할 수 있는 것으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (Higgins, et, al., Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19679 (Dec 3, 2013), 본원에 포함됨). 또한, 3D 스페로이드로서 배양하였을 때, 인간 모유두 세포가 인간 피부에서 새로운 모낭을 유도할 수 있다는 것 역시 공지되어 있다 (Higgins, et, al.; Y. Zheng et al., J Invest Dermatol 124, 867 (May, 2005), 본원에 포함됨). 특정 구현예에서, 모유두 3D 스피어는 후속적으로 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증, 전두부 섬유화 탈모증, 반흔성 탈모증, 모공 편평태선, 고리형 탈모증, 흉터성 탈모증, 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증을 치료하기 위해 개체에게 투여된다.
5.4 약학적 조성물 및 투여
특정 구현예에서, 본 발명의 JAK-STAT 저해제 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합함으로써 약학적 조성물 또는 약학적 제형으로서 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 제형은 치료학적인 유효량의 JAK-STAT 저해제와 생리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료학적 성분 및/또는 보강제를 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 제형은 고체 투여 형태 (solid dosage form)일 수 있다. 특정 구현예에서, 고체 투여 형태는 정제 또는 캡슐제일 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 제형은 액체 제형일 수 있다. 특정 구현예에서, 액체 제형은 경구 용액 또는 경구 현탁액일 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 제형은 경피 약물 전달 시스템, 예를 들어, 패치, 크림, 겔 및/또는 마이크로에멀젼일 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 제형은 리포좀, 나노입자 및/또는 기타 담체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 제형은 보강제 또는 강화제, 예를 들어, 효소 저해제를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 제형은 직접 주입제일 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 제형은 이식가능한 디바이스일 수 있다.
다수의 방법들을 사용해 본원에 언급된 제형을 도입할 수 있으며, 이러한 방법으로는, 비-제한적으로, 경구, 국소, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하 및 폐내 경로를 포함한다. 이러한 경로들 모두 이들 조성물을 투여하는데 적합하며, 환자 및 증상이 있는 경우 치료 증상, 및 유사 인자에 따라 주치의에 의해 선택될 수 있다. 바람직한 투여 경로에 따라, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 액체, 산제, 에어로졸, 정제, 캡슐제, 장 코팅 정제 또는 캡슐제, 또는 좌제의 형태로 제조된다.
본 발명의 조성물을 프라이밍 (priming)하기에 적절한 투여량의 선택은 포유류의 신체 상태를 기초로 할 수 있으며, 특히 포유류의 전반적인 건강 상태와 체중 등의 신체 상태를 기초로 할 수 있다. 이러한 유효량의 선택과 증가 또는 감소 조절은 당해 기술 분야의 당업자의 능력내에서 이루어진다.
본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 무균 수성 또는 비-수성 용액제, 현탁제 및 유제를 더 포함한다. 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 보조제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow et al., eds., The Merck Manual, 15th edition, Merck and Co., Rahway, N.J. (1987); Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y. (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. (1987); Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa. pp. 1324-1341 (1980); Katzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn. (1992)을 참조하며, 이들 참조문헌과 이에 인용된 참조문헌은 최신 기술을 나타내는 바와 같이 원용에 의해 본 명세서에 전체적으로 포함된다.
특정 구현예에서, 비경구 투여를 위한 조제물로는 무균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁제 및/또는 유제 등이 있으며, 이들은 당해 기술 분야에 공지된 보조제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올리에이트가 있다. 담체 또는 밀봉 드레싱을 사용해 피부 투과성을 높이고 흡수를 강화할 수 있다. 액체 투여 형태는, 경우 투여용인 경우, 일반적으로 액체 투여 형태를 함유한 리포좀 용액을 포함할 수 있다. 리포좀을 현탁하는데 적합한 형태로는 정제수와 같이 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유한, 유제, 현탁제, 용액제, 시럽제 및 엘릭서제 등이 있다. 불활성 희석제 외에도, 이러한 조성물은 또한 보강제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 또는 감미제, 착향제 또는 향제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아래 Berkow, Goodman, Avery's, Osol 및 Katzung 문헌들을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 개체로의 투여에 사용되는, 본 발명의 조성물은, 염, 보존제, 화학 안정화제, 완충제, 보강제 또는 조성물의 효능을 개선하는데 적합한 기타 물질을 더 포함할 수 있다. 전형적으로, 타겟 인간 또는 동물에서 효능에 최상인 제형을 결정하기 위해 안정화제, 보강제 및 보존제를 최적화한다. 적합한 예시적인 보존제로는 클로로부탄올 포타슘 소르베이트, 소르브산, 황 다이옥사이드, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀 등이 있다. 사용될 수 있는 적합한 안정화 성분으로는, 예를 들어, 카사미노산, 슈크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노포타슘 다이포스페이트, 락토스, 락트알부민 가수분해물 및 건조 우유 등이 있다. 통상적으로, 보강제 및 조성물은 포유류의 동일 부위로 적용 (presentation) 또는 별도로 적용하기 전에 혼합된다. 이러한 보강제로는, 특히 MPL. (3-O-데타실화된 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), 미네랄 오일 및 물, 알루미늄 하이드록사이드, Amphigen, Avridine, L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코시드, 플루로닉 플리오이스 (pluronic plyois), 무라밀 다이펩타이드, 사멸된 보르데텔라 (killed Bordetella), 사포닌, 예를 들어 Quil A 또는 Stimulon QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.) 및 콜레라 독소 (야생형 또는 돌연변이 형태, 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/US99/22520에 따라 아미노산 29번 위치의 글루탐산이 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 치환됨, 본 문헌은 원용에 의해 본 명에서에 포함됨) 등이 있다. 본원의 조성물에 사용하기 적합한 부가적인 물질의 예들은 Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa. (1980), pp. 1324-1341에 제공되며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
5.5 치료 효능을 모니터링하는 방법
본 발명은 포유류 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는 테라피의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 방법은, (a) 개체에서 수득한 모낭 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 수준을 측정하는 단계, 및 (b) 테라피 중에 여러 시점 중 한 시점에 개체로부터 수득한 모낭 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 제1 샘플과 비교해 제2 또는 이후의 샘플에서 하나 이상의 바이오마커에 변화가 있을 경우 이 테라피는 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는데 유효한 것이다. 특정 구현예에서, 바이오마커는 Wnt 경로, Shh 경로, 모발 발달 경로, 멜라닌형성 경로, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 바이오마커는 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
모발 생장 바이오마커는 핵산 또는 펩타이드/단백질일 수 있다. 핵산 바이오마커의 발현 수준을 정성적으로 및 정량적으로 검출 및/또는 측정하는 방법으로는, 비-제한적으로, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 예를 들어, 통상적인 PCR, qPCR 및 디지탈 PCR, 인 시추 혼성화 (예, 비제한적으로, 형광 인 시추 혼성화 ("FISH")), 겔 전기천공, 시퀀싱 및 서열 분석, 마이크로어레이 분석 및 그외 당해 기술 분야에 공지된 기법 등이 있다.
특정 구현예에서, 검출 방법은 실시간 PCR (RT-PCR), 정량 PCR, 형광 PCR, RT-MSP (RT 메틸화 특이적인 중합효소 연쇄 반응), PicoGreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR) DNA 검출, 방사성 면역분석 및 DNA 직접 방사성 표지일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 핵산 바이오마커는 cDNA로 역전사한 다음 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 수행하거나; 또는 하나의 효소를 미국 특허 5,322,770에 언급된 바와 같이 2가지 공정에 이용할 수 있거나, 또는 바이오마커를 R. L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994)에 기술된 바와 같이 cDNA로 역전사한 다음 대칭적인 갭 리가제 연쇄 반응 (RT-AGLCR)을 수행할 수 있다.
특정 구현예에서, 정량적인 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용해 바이오마커의 mRNA 수준을 평가한다. 바이오마커와 대조군 mRNA의 수준을 암 조직 또는 세포 및 인접한 양성 조직에서 정량할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준을 생물 샘플에서 정량할 수 있다.
비-제한적인 구현예에서, 본 발명의 검출 방법은, 증폭하지 않고, 예를 들어, 타겟 서열의 임의의 카피 또는 복제를 실시하지 않고, 임의의 중합효소를 사용하지 않고, 또는 임의의 열 사이클링을 적용하지 않고, 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 검출은 2006년 6월 19일자 미국 출원번호 11/471,025에 언급된 Quantigene™ 방법에 개시된 원리를 이용해 수행할 수 있으며, 상기 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 방사성 표지된 안티센스 RNA 프로브를 얇은 생물학적 샘플 단편, 예를 들어, 생검 샘플과 혼성화하고, 세척한 다음 RNase로 절단하여 자동방사선 촬영을 위한 감지 에멀젼에 노출시키는, 인 시추 혼성화 가시화를 채택할 수 있다. 샘플은 헤마톡실린으로 염색하여, 샘플의 조직학적 구성을 확인할 수 있으며, 적합한 광 필터를 사용한 암 시야 사진은 현상된 에멀젼 (developed emulsion)을 나타낸다. 비-방사성 표지 물질, 예를 들어, 디곡시게닌도 사용할 수 있다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 핵산 바이오마커의 발현 평가는 형광 인 시추 혼성화 (FISH)에 의해 수행할 수 있다. FISH는 세포에서 DNA 또는 RNA의 특정 부분을 직접 동정하여, 조직 샘플에서 바이오마커의 발현을 가시적으로 측정할 수 있는, 기법이다. FISH 방법은 보다 객관적인 평가 시스템의 이점을 가지며, 동일 샘플에서 모든 비-신생물성 세포에 존재하는 바이오마커 유전자 신호들로 구성되는 빌트-인 내부 대조군이 존재한다. FISH는 비교적 신속하고 민감할 수 있는 직접 인 시추 기법이며, 또한 자동화될 수 있다. 바이오마커의 발현 수준이 FISH 단독으로 측정하기 어려울 경우, 면역조직화학을 FISH 방법과 조합할 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 바이오마커의 발현은 qPCR 분석, DNA 어레이, 칩 또는 마이크로어레이에서 검출할 수 있다. 바이오마커(들)에 대응되는 올리고뉴클레오티드를 칩에 고정한 다음 개체에서 수득한 생물 샘플, 예를 들어 종양 샘플의 표지된 핵산과 혼성화한다. 혼성화 양성 신호를 바이오마커 전사체를 함유한 샘플에서 입수한다. DNA 어레이 제조 방법과 그 용도는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다 (예, 미국 특허 6,618,6796; 6,379,897; 6,664,377; 6,451,536; 548,257; 미국 특허 출원번호 20030157485 및 Schena et al. 1995 Science 20:467-470; Gerhold et al. 1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173; Lennon et al. 2000 Drug discovery Today 5: 59-65, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 연속적인 유전자 발현 분석 (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 역시 수행할 수 있다 (예, 미국 특허 출원번호 20030215858).
특정 구현예에서, 핵산 바이오마커를 모니터링하기 위해, 테스트할 생물 샘플에서 mRNA를 추출한 다음 역 전사하고 형광-표지된 cDNA 프로브로 제작할 수 있다. 그런 후, 표지된 cDNA 프로브를 바이오마커에 혼성화할 수 있는 마이크로어레이에 적용하여, 프로브를 마이크로어레이에 혼성화하고, 슬라이드를 스캔하여 형광 강도를 측정할 수 있다. 이들 강도는 바이오마커의 발현 수준 및 혼성화 세기와 상호 연관되어 있다.
핵산 바이오마커를 검출하기 위한 프로브 타입으로는 cDNA, 리보프로브, 합성 올리고뉴클레오티드 및 게놈 프로브 등이 있다. 사용되는 프로브 타입은, 일반적으로, 예를 들어, 인 시추 혼성화용 리보프로브 및 노던 블롯팅용 cDNA 등의, 특정 상황에 따라 정해질 것이다. 비-제한적인 특정 구현예에서, 프로브는 특정 바이오마커 RNA에 고유한 뉴클레오티드 영역에 대한 것이다. 프로브는 특정 바이오마커 mRNA 전사체를 차별적으로 인지할 만큼 짧을 수 있으며, 예를 들어 염기 15개로 짧을 수 있다. 염기 17개 이상, 18개 이상 및 20개 이상으로 된 프로브 역시 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 프라이머 및 프로브는 엄격 조건에서 타겟 유전자에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 단편에 특이적으로 혼성한다. 본원에서, 용어 "엄격 조건"은 서열들 간의 동일성이 95% 이상 또는 97% 이상인 경우에만 혼성화가 이루어지는 것을 의미한다.
프로브의 표지 형태는 방사성 동위원소, 예를 들어, 32P 및 35S 또는 형광단의 사용과 같이 적절한 임의 형태일 수 있다. 방사성 동위원소를 이용한 표지는, 프로브가 적절하게 표지된 염기를 이용하여 화학적으로 또는 생물학적으로 합성되든 간, 달성할 수 있다.
단백질 바이오마커의 수준을 검출 및/또는 측정하는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 비-제한적으로, 질량 분강측정 기법, 1-D 또는 2-D 겔을 이용한 분석 시스템, 크로마토그래피, 효소 연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (RIA), 효소 면역분석 (EIA), 웨스턴 블롯팅, 면역침강 및 면역조직화학 등이 있다. 이들 방법들은 단백질을 검출하거나 또는 생물물리학적 기법을 이용하기 위해 항체 또는 항체 등가물을 이용한다. 항체 어레이 또는 단백질 칩 또한 사용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원번호 2003/0013208; 2002/0155493, 2003/0017515 및 미국 특허 6,329,209 및 6,365,418을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 단백질 바이오마커 발현을 측정하기 위한 검출 방법은, 생물 샘플, 예를 들어, 조직 샘플에, 바이오마커에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 변이체 (예, 단편)을 접촉시키는 단계, 및 항체 또는 이의 변이체가 샘플에 결합되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 본 방법은 샘플을 2차 항체, 예를 들어, 표지된 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 방법은 예를 들어 하나 이상의 시약을 제거하기 위해 하나 이상의 세척 단계를 더 포함할 수 있다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 웨스턴 블롯팅을 바이오마커 단백질의 발현 수준을 검출 및 정량하는데 이용할 수 있다. 세포를 세포용해 완충제에서 균질화하여, 세포용해물을 제조한 다음 이를 SDS-PAGE를 수행하여 니트로셀룰로스 필터 등의 막으로 블롯팅할 수 있다. 그런 다음, (비-표지된) 항체를 막에 접촉시키고, 표지된 단백질 A 또는 항-면역글로불린 (125I, 호스래디시 퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제 등의 적정 표지물질 모함) 등의 2차 면역 시약으로 분석할 수 있다. 또한, 크로마토그래피 검출도 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 보강된 화학발광 시스템을 이용해 바이오마커에 대한 항체로 면역검출을 수행할 수 있다 (예, PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.). 그런 후, 막을 취하여 대조군 단백질, 예를 들어 액틴에 특이적인 대조군 항체로 다시 블롯팅할 수 있다.
면역조직화학을 이용해 예를 들어 생검 샘플에서 바이오마커의 발현 및/또는 존재를 검출할 수 있다. 적절한 항체는, 예를 들어 얇은 세포 층과 접촉시킨 다음 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 헹구고, 그런 후 2차 표지된 항체와 접촉시킬 수 있다. 표지는 형광 마커, 효소, 예를 들어, 퍼옥시다제, 아비딘 또는 방사성 표지물질에 의한 것일 수 있다. 분석은 현미경을 사용해 가시적으로 평가할 수 있으며, 그 결과를 정량할 수 있다. 기계를 이용한 또는 자동이미징 시스템을 사용해 바이오마커에 대한 면역염색 결과를 측정할 수 있다.
당해 기술 분야에서 면역조직화학과 함께 이용하기에 적합한 다양한 자동 샘플 처리, 스캐닝 및 분석 시스템들이 이용가능하다. 이러한 시스템은 자동 염색 (예, the Benchmark system, Ventana Medical Systems, Inc.) 및 현미경 스캐닝, 컴퓨터 이미지 분석, (샘플의 오리엔테이션 및 크기 차이를 조절하기 위한) 연속 섹션 비교, 디지탈 리포터 생성, 및 샘플 아카이빙 및 트랙킹 (예, 조직 단편이 배치된 슬라이드)을 포함할 수 있다. 면역염색된 샘플 등의 세포 및 조직에 대한 정량적인 분석을 수행하기 위해, 디지탈 이미지 처리 시스템을 통례적인 광 현미경과 조합하는 세포 이미징 시스템을 상업적으로 이용할 수 있다. 예를 들어, CAS-200 system (Becton, Dickinson & Co.)을 참조한다.
또한, 바이오마커에 대한 표지된 항체를 영상화할 목적으로, 예를 들어 개체의 세포에서 바이오마커의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 표지 물질로는 방사성 동위원소, 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중 수소 (3H), 인듐 (112In) 및 테크네튬 (99mTc), 형광 표지 물질, 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민, 및 바이오틴 등이 있다. 면역효소적인 상호작용은 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 등의 여러가지 효소 또는 여러가지 발색단, 예를 들어, DAB, AEC 또는 Fast Red를 사용해 가시화할 수 있다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 바이오마커를 함유한 세포 위치에서 선호적으로 축적될 것이다. 그런 후, 표지된 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어 단편을 공지된 기법을 이용해 검출할 수 있다.
항체는, 천연 또는 합성, 전장 또는 이의 단편, 단일클론 또는 다클론이든 간에, 검출할 바이오마커에 충분히 강하고 특이적으로 결합하는, 임의의 항체이다. 항체는 최대 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 및 10-12M의 Kd를 가질 수 있다. "특이적으로 결합한다"라는 표현은, 예를 들어, 항체가, 에피토프, 항원 또는 항원 결정기에, 동일한 또는 유사한 에피토프, 항원 또는 항원 결정기 제2 조제물과 치환 또는 경쟁할 수 있는 방식으로, 결합하는 것을 의미한다.
사용될 수 있는 항체 및 이의 유도체는, 다클론 또는 단일클론 항체, 합성 및 조작된 항체, 키메라, 인간, 인간화된, 영장류화된 (CDR-그래프팅된), 베니어화된 (veneered) 또는 단쇄 항체, 파지 생산된 항체 (예, 파지 디스플레이 라이브러리 유래) 뿐만 아니라 항체의 기능성 결합 단편을 포괄한다. 예를 들어, 비-제한적인 예로, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등의, 바이오마커 또는 그 일부에 결합할 수 있는 항체 단편을 사용할 수 있다. 이러한 단편은 효소적 분해 또는 재조합 기법에 의해 생산할 수 있다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 항체 이외에, 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 펩타이드가 사용된다. 특이적으로 결합하는 펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단에 의해, 예를 들어, 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 동정할 수 있다. 일반적으로, 바이오마커의 존재를 검출 및/또는 정량하도록, 바이오마커 폴리펩타이드를 검출할 수 있는 물질을 사용할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, "물질"은 생물 샘플에서 바이오마커를 동정 또는 검출 (예, 바이오마커의 mRNA, 바이오마커의 DNA, 바이오마커의 단백질을 동정 또는 검출)할 수 있는 물질을 의미한다.
또한, MALDI/TOF (비행 시간), SELDI/TOF, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (LC-MS), 기체 크로마토그래피-질량 분광측정 (GC-MS), 고 성능 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (HPLC-MS), 모세관 전기영동-질량 분광측정, 핵 자기 공명 분광측정 또는 탠덤 질량 분광측정 (예, MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS, 등) 등의 질량 분광측정을 이용해 바이오마커를 측정할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원번호 2003/0199001, 2003/0134304, 2003/0077616을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체 내용애 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
질량 분광측정 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 단백질과 같은 생체 분자를 정량 및/또는 동정하는데 사용되고 있다 (예, Li et al. (2000) Tibtech 18:151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; 및 Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). 또한, 단리된 단백질의 서열을 적어도 부분적으로 신규 분석하는 질량 분광측정 기법이 개발되어 있다. Chait et al., Science 262:89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999); Bergman, EXS 88:133-44 (2000)을 참조한다.
바이오마커 또는 그외 물질의 존재를 검출하는 방법은 전형적으로 신호 강도를 검출하는 단계를 수반한다. 이는 기질에 결합된 폴리펩타이드의 양 및 특성을 반영할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 제1 샘플과 제2 샘플의 스펙트럼에서 피크 값의 신호 강도를 (예, 가시적으로 또는 컴퓨터 분석에 의해) 비교하여, 특정 바이오마커의 상대적인 양을 결정할 수 있다. Biomarker Wizard program (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용해 질량 스펙트럼 분석을 보조할 수 있다.
샘플에서 핵산 및/또는 단백질 바이오마커의 발현을 측정하는 부가적인 방법들은, 예를 들어, 미국 특허 6,271,002; 미국 특허 제 6,218, 122; 미국 특허 제 6,218, 114; 미국 특허 제 6,004,755; Wang et al, J. Clin. Oncol., 22(9): 1564-1671 (2004); 및 Schena et al, Science, 270:467-470 (1995)에 기술되어 있으며, 이들 모두 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
5.5 키트.
본 발명은 포유류 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는 키트에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 키트는, (a) Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, Jak/STAT 저해제는 Jak/STAT 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체; Jak/STAT 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 낮추는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; Jak/STAT 단백질의 발현을 낮추는, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이의 변이체 또는 변형체; 소분자; 또는 이들의 조합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 토팍시티닙 (CP690550)이다. 특정 구현예에서, 저해제는 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물이다.
6. 실시예
아래 실시예는, 비-제한적인 예로, JAK-STAT 경로의 저해제를 투여함으로써 모발 생장을 유도하는 조성물 및 방법 등의, 본 발명을 구성하고 이용하는 방법에 대한 충분한 설명 및 기술과 더불어, 당해 기술 분야의 당업자에게 예를 제공하기 위해 제시된다. 아래 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 전술한 전반적인 설명을 감안하여 다양한 그외 구현예들을 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
6.1 실시예 1: JAK -STAT 신호전달에 대한 약리학적 저해는 모발 생장을 촉진한다
결과
JAK -STAT를 저해하면 마우스에서 모발 생장이 빨리 개시된다. 휴지기의 C57/B6 마우스에 비히클 대조군 (음성 대조군, 좌측), 성장기 개시를 촉진하는 것으로 기존에 공지된 Shh (sonic hedgehog) 작용제 (2) (양성 대조군) 또는 토파시티닙 (JAK1/3>JAK2>TYK2)(3) 및 룩솔리티닙 (JAK1/2> Tyk2> JAK3)(4-7) (우측) 등의 JAK-STAT 경로에 대한 수종의 소분자 저해제를, 등의 절반에 3주간 먼저 처리하였다 (도 1A). 예상된 바와 같이, Shh 작용제를 7일간 처리한 기간내에 성장기로의 진입이 입증되었으며, 비히클-처리 마우스는 실험 기간 동안 휴지기에 남아있었다. 흥미롭게도, JAK 저해제를 이용한 치료는 모발 사이클로 빨리 재-진입하게 만들며, Shh 작용제와 유사한 카이네틱스를 가진다 (도 1A). 줄기 세포 활성화에 대한 직접적인 효과를 조사하기 위해, 휴지기의 마우스에 4일간의 짧은 기간 동안 토파시티닙 또는 룩솔리티닙을 처리하였다. 약물 처리된 HF의 모원배 구획내 (P-cad+)에서 유의한 증식이 나타났으며 (도 5A), 이는 전구세포 집단의 활성화를 의미한다. 피부 항상성에 대한 약물 처리 효능을 정량한 결과, 약물-유발성 모발 생장이 정상적인 모발 생장을 되풀이하는 것으로 입증되었다 (도 5B). 요컨대, 이들 데이타는 JAK-STAT 경로의 국소 저해가 모발 생장의 빠른 개시를 달성함을 시사한다.
JAK -STAT 저해 효과는 휴지기 기간에 의존적이다. C57/B6 마우스에서 1차 생후 모발 사이클은 정확한 시간적인 진행에 따라 이루어진다. 그런 다음, 자발적이고, 고르지 않은 패턴으로 약 12-13주령에 시작하여 재생 (성장기 재-도입)이 진행된다 (8, 9). 휴지기의 마우스에 대한 JAK 저해제를 이용한 치료는 지속적으로 이른 균질한 모발 생산을 달성할 수 있지만 (도 1A), 성장기를 재개하기 위해 필요한 치료 지속 기간은 불가해하게도 가변적이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 휴지기 초기 (7주) 또는 휴지기 중기 (8.5주)에서 마우스에 처리하였다. 처리 결과, 7주령의 마우스에서는 생장이 발생하지 않는 반면, 8.5주령의 마우스에서는 성장기가 빠르게 재개되었다 (도 5C). 8.5주령에 처리한 마우스가 여전히 성장기 재-도입 증폭이 중단된 휴지기의 불응 상태에 있게 하기 위해 (9, 10), 7주령 및 8.5주령의 마우스에서 털을 뽑았는데, 모발을 뽑은 후 모발 생장은 양쪽 시점 모두 유사한 카이네틱스를 따라 이루어졌다 (도 5C). 특히, 7주령의 마우스에 18-21일 동안 장기간 처리한 경우, 궁극적으로 처리된 마우스는 8.5주령에 도달한 이후에만 모발 생장이 유도되었다 (도 5D). 이런 사실은, JAK 저해가 휴지기 초기 단계에서는 정지 상태를 조장하는 미세환경을 중단시킬 순 없지만 (9, 10), 휴지기 후기 단계에서는 모발 생장을 촉진하기에는 충분하다는 것을 암시한다.
8.5주령에 JAK 저해제를 이용한 치료에 의해 유발되는 모발 생장의 강건함과 재생력을 입증하기 위해, C57/B6 마우스에서 모발 재생의 대리물로서 피부 흑화를 이용하였다 (11). 실제, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 5일간 처리한 8.5주령의 마우스들 중 ~90%에서, 처리 개시 10일 이내에 피부 흑화와 모발 재생이 나타났지만, 대조군 처리 마우스에서는 모발 생장이 명확하게 나타나지 않았다 (룩솔리티닙 처리시 P<0.0001, 토파시티닙 처리시 p=0.04) (도 1B 및 5E).
JAK -STAT 저해 이후의 모발 생장은 Wnt 및 Shh 신호전달 경로를 활성화함으로써 정상적인 성장기 개시를 모방한다. JAK 저해제 처리 후 성장기의 개시가 정상적인 성장기 개시와 분자적으로 유사한 지를 확인하기 위해, 모원배에서 증식은 개시되었지만 모발 생장은 아직 명확하지 않은 시점에, 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 4일간 처리한 8.5주령의 마우스를 대상으로, 마이크로어레이 실험을 수행하였다 (도 5A). 처리 0일 (T0) 및 4일 (T5)에 회수한 전체 세포 간에 차별적으로 발현되는 유전자 리스트를 비교한 결과, JAK 저해제에 의해 조절되는 유전자 서브세트들이 드러났다 (도 1C). IPA (Ingenuity Pathway Analysis) 소프트웨어를 이용한 경로 분석에서, 멜라닌형성 경로 및 Wnt 경로가 룩솔리티닙 처리 및 토파시티닙 처리에서 강화된 것으로 나타났지만, 비히클 처리군에서 그렇지 않았다. 이들 2가지 약물 처리시 차별적으로 발현된 유전자들에 대한 추가적인 분석에서, JAK 저해제로 처리된 피부에서 유의하게 상향 조절되는 Shh 및 Prom1 (2, 12-16)과 같은, 다른 주요 모발 사이클 조절제가 동정되었다 (도 1D). 주요 유전자의 차별적인 조절을 qPCR에 의해 검증하였다 (도 6A). Wnt 및 Shh 경로의 상향 조절이 멜라노사이트 줄기 세포의 성장기 개시와 활성화에 중요하기 때문에 (16, 17), 이러한 사실은 JAK-STAT 신호전달의 차단이 모발 생장의 정상적인 진행을 허용한다는 것을 시사한다. 약물 처리 중 오직 하나에 의해 조절되는 유전자에 대한 추가적인 분석으로, 명확한 분자 시그니처가 드러났다 (도 6B & 6C). 룩솔리티닙 처리는 mTOR 및 NfkB 경로를 강화하는데, 이들 모두 모발 사이클 조절에 참여하는 것으로 기존에 공지되어 있지만 (12, 18-20), 토파시티닙 처리는 Roh 및 인테그린 신호전달 등의 세포 운동성과 이동에 참여하는 경로를 강화하였다. 흥미롭게도, STAT3-/- 각질 형성 세포는 자극에 반응한 이동에 결함이 있는 것으로 기존에 입증되었는데 (21, 22), 이는 JAK-STAT 경로가 휴지기와 성장기 사이의 과도기에 세포 운동성 (cellular motility)에 필수적이라는 것을 시사해준다.
JAK -STAT 저해는 모낭 전구 세포의 활성화를 유발한다. JAK-STAT 저해된 후 HF의 활성화를 담당하는 세포 기전을 조사하기 위해, 휴지기의 마우스에 룩솔리티닙, 토파시티닙 또는 비히클 대조군을 처리하고, 1차, 2차 및 3차 처리 후 5시간째에 피부를 회수하였다 (도 1E, 도식). EDU를 각 회수 시점 1시간 전에 매일 주사하고, 피부 샘플에서 EDU+ (증식) 세포의 존재를 분석하였다. Edu+ 세포는 룩솔리티닙 및 토파시티닙 처리 피부 둘다에서 3번의 처리 후 모원배 (P-cadherin+) 구획내에서 명확하게 가시화되었지만, 대조군 처리 피부에서는 그렇지 않았다 (도 1E). 이 결과는, JAK-STAT 저해 후 HF 활성화가 모원배 증식이 벌지 줄기 세포 증식을 선행하는 정상적인 성장기 개시를 따른다는 것을 의미한다 (23). 요컨대, 이 데이타는 JAK-STAT 신호전달이 정상적으로 성장기에 재-돌입하는 것을 방지하도록 작용하며, JAK 차단이 이러한 저해를 완화시켜 정상적인 모발 사이클의 진행을 허용한다는 것을 암시한다.
JAK 저해의 모발 유도 효과는 림프구 활성에 의존하지 않는다. JAK-STAT 경로는 T 세포 생물학에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며 (24), HF 미세환경은 거주성 T 세포와 이동성 T 세포로 된 실질적인 집단을 함유하고 있다. 최근 실험들에서, γδT 세포가 마우스에서 HF 신생 뿐만 아니라 모발 주기의 측면들을 조절하는 인자를 분비한다는 것이 제기되었다 (25, 26). 또한, 본 발명자들은, 이전에, AA에서 JAK-STAT 저해제가 모발 재생 개시를 위한 필수적인 과정인 HF 미세환경으로부터 세포독성 T 세포를 제거하도록 작용한다는 것을 입증한 바 있다.
JAK-STAT 저해제를 처리한 이후의 정상적인 모발 생장이 T 세포에 의해 매개되는 지를 평가하기 위해, 국소 약물 처리 효과를 2종의 림프구-결함성 마우스 모델에서 조사하였다. B 세포와 T 세포에 결함이 있는 Rag1-/- 마우스와, 이동성 T 세포와 잔류성 T 세포에 결함이 있는 Tcr β/δ-/- 마우스는 모발 사이클에 진입하는 능력 (도 7A) 뿐만 아니라 약물 처리에 대한 반응성 (도 2A) 측면에서도 대조군과 크게 구별하기 어려웠다. 이는, 정상 피부에서 JAK 저해제의 모발 유도 효과가 림프구의 활성에 의존하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 대식세포 등의 모발 사이클에 작용하거나 (27) 또는 골수성 수지상 세포와 같이 JAK 저해에 의해 동요되는 (28) 것으로 알려진 다른 면역 세포에 대한 JAK-STAT 저해제의 효과를 배제하였었지만, 이 결과는 JAK-STAT 저해로 인한 성장기 유도 효과가 모발-고유 특성일 가능성을 나타낸다.
JAK -STAT 경로는 모발 사이클 내내 다이나믹하게 조절된다. HF 발달 및 사이클에서 JAK-STAT 경로의 카이네틱스를 조사하기 위해, 성장기에서 휴지기로 전환되는 동안에 전체 피부에서 유전자 발현 변화를 조사하였다 (29). qPCR 어레이를 이용해, JAK-STAT 경로와 관련된 유전자의 발현을 측정하였다. 유전자 발현의 다이나믹한 변화를, qPCR 어레이 상의 각 유전자에 대한 발현 값들을 경시적인 발현 프로파일에서 유사성에 기초한 메타유전자 카테고리로 클러스터링하고 이를 5x6 그리드 상의 1-30곳에 배치하는 알고리즘인, 유전자 발현 다이나믹스 인스펙터 (GEDI, Gene Expression Dynamics Inspector)를 사용해 가시화하였다. 퇴화기 (D17)와 성장기 초기 (D29)를 비교한 결과, 모발 사이클이 진행됨에 따라 억제되기 시작하는 메타유전자 클러스터가 확인되었다 (박스 표시된 픽셀, 도 2B). 억제된 메타유전자의 내용을 조사한 바, STAT5A/B, STAT3, Jak1, Jak3 및 Socs2/3 등의 JAK-STAT 경로의 주요 구성원이 퇴화기 및 휴지기에 높은 수준으로 발현되었으며, 성장기 초기에는 억제되는 것으로 밝혀졌다 (도 2B, 2C & 7B).
성장기, 퇴화기 및 휴지기에 HF에 대한 면역형광 실험에서, 활성화된 (인산화된) STAT3가 모유두 (DP), 일부 모낭외 세포 및 기저 상피의 증식성 세포에서 발현되는 것으로 검증되었다 (도 2D 및 7C). 퇴화기 및 휴지기에, 포스포-STAT3 역시 모원배 세포에서 검출할 수 있다. 활성화된 포스포-STAT5는 세포 주기 내내 DP에서 강하게 발현되며, 퇴화기에 발현 최대에 도달하며 벌지에서도 검출할 수 있다 (도 2D). 휴지기에 주요 HF 줄기 세포 구획에서의 놀라운 포스포-STAT5 발현 패턴은 정지 상태를 조절하는데 잠재적으로 중요한 역할을 부각시킨다.
토파시티닙 처리는 인간 모낭의 생장을 촉진한다. 모발 생장에 대한 JAK 저해 효과를 인간 조직에서 조사하였다. 마우스와는 대조적으로, 인간 두피 HF는 비동기적으로 생장하며, 이중 90%는 임의의 소정의 시기에 모발 사이클의 성장기 단계에 존재한다 (34). 따라서, 휴지기에서 성장기로의 전환을 인간에서 평가하기는 매우 어렵다. 인간 태아 두피 피부를 Scid 마우스에 이식하여, 적어도 6주일 간 회복되게 두었다. 각 이식물에 매일 한쪽에는 비히클 대조군을 다른 쪽에는 토파시티닙 (도 3A) 또는 룩솔리티닙 (도 8A)을 국소 적용하였다. 이식물에 이미 작은 HF가 존재하였으므로, 본 발명자들은 태아 HF가 최종 모발로 발달하는 것은 저해하지만 HF 신생은 저해하지 않는, JAK 효과를 조사하였다. 토파시티닙 처리로 대조군에 비해 밀집된 HF 생장이 관찰되었으며, 이는 토파시티닙 처리가 모간 신장 (hair shaft elongation) 속도를 높인다는 것을 의미한다. 그 결과를 정량하기 위해, 본 발명자들은 이식된 백색 마우스에서 어두운 색 모발의 밀도에 대한 대리물로서 색소 침착 밀도를 측정하였으며, 처리 일수에 따라 토파시티닙/비히클 비율이 높아지는 것으로 확인되었다. 실험들은 여러가지 공여체로부터 수득한 피부로 수행하였으며, 유사한 결과가 수득되었다 (도 8B).
JAK 저해가 모간 신장에 미치는 영향을, 널리 사용되는 인간 HF 장기 배양 모델을 이용해 추가로 분석하였다. 각 HF를 인간 성인 두피 조직으로부터 미세적출하여, 비히클 대조군, 룩솔리티닙 및 토파시티닙을 처리하여 배양하였다 (도 3B). JAK 저해제를 처리한 경우, 룩솔리티닙 및 토파시티닙의 처리시 모간의 길이를 현저하게 늘이는 것으로 나타났으며, 이는 모발 연장 속도에 대한 긍정적인 효과를 의미한다 (룩솔리티닙 및 토파시티닙에 대해 각각 P=0.023 및 P=0.025). 2명의 추가적인 공여체로부터 수득한 HF를 이용한 실험에서도 비슷한 경향이 나타났다 (도 8C). 요컨대, 본 데이타는, JAK-STAT 저해가 장기 배양 모델에서 모발 섬유 생장을 더 빠르게 촉진한다는 것을 제시한다.
토파시티닙 처리는 모유두의 유도력을 촉진한다. 퇴화기 및 휴지기에 마우스 DP에서 포스포-STAT5가 강하게 발현된 (도 2D) 이후로, 성장기의 인간 HF의 진피 근초와 DP에서 포스포 STAT 3가 존재하는 것으로 검증되었으며, 포스포 STAT5의 발현은 DP에서 약하지만 DP의 제일 윗부분에는 존재하였다 (도 8D).
본 발명자들은, 최근에, 3D 스피어 형태로 배양 중인 인간 DP 세포가 HF 생장을 유도하는 능력이 개선되었음을 입증하였다 (35). HF 유도 효능에 대한 JAK 저해 효과를 조사하기 위해, 인간 DP 스피어에 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 처리하여 배양한 다음, 마우스 신생아의 각질 형성 세포와 조합하여 누드 마우스에 주입하였다. 이 패치 분석이 HF 형태형성을 되풀이하는 것으로 확인된 바 있어, 발모력을 평가하기 위해 이용하였다 (36). 토파시티닙-처리된 인간 DP 스피어는 전체적으로 보다 크고 현저하게 많은 수의 HF를 유도하였는데 (P=0.00013) (도 3D), 이는 인간 DP의 유도력이 JAK1/3 신호전달 저해에 의해 강화된다는 것을 의미한다.
토파시티닙 처리는 완전 유도성 모유두에서 농화된 유전자를 타겟팅함으로써 모발 생장을 촉진한다. 토파시티닙 처리가 DP 유도력을 개선하는 기전을 조사하기 위해, 대조군, 룩솔리티닙 및 토파시티닙 처리된 DP 스피어를 대상으로 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 유전자 발현의 log2 배수 변화를 이용해, GEDI 그래프를 작성하였다. 유전자 변화에서 관련 변화를 분석하기 위해, 본 발명자들은 룩솔리티립 처리 (유도력 강화를 부여하지 않았음) 대 대조군, 토파시티닙 처리 (유도력을 강화하였음) 대 대조군 및 룩솔리티닙 처리군과 토파시티닙 처리군을 서로 비교하였다. JAK 저해로 인한 허용된 유전자 발현 변화 실험은 2종의 약물에 의해 제공되었으며, 토파시티닙 처리시 특이적인 변화에 집중하였다. GEDI 알고리즘으로 차별적으로 발현된 전사체를 전체 마이크로어레이에서의 유사한 발현 패턴을 기초로 메타유전자로 클러스터링하였다. 데이타는 3D 형태로 나타내며, Z 축과 색상은 유전자 변화이고, X 및 Y축은 18x19 그리드에 작성한 GEDI 메타픽셀의 좌표이다 (도 4A). 그래프의 토포그라피를 기초로, 대상이 되는 영역 4곳을 선택하였다 (영역 1-4).
흥미롭게도, 양쪽 처리에서 억제되지만 토파시티닙 처리 시 더 적은 유전자들 (영역 1)은 FGFR1, ACVRL1, IGFR1, OSMR 및 PTGFR 등의 DP 유도력 조절에 참여하는 것으로 알려진 수용체들이다 (32, 37-41). 룩솔리티닙 처리에 의해 상향 조절되지만 토파시티닙 처리에 의해 하향 조절된 유전자가 포함된 영역 (영역 2)에서는, BAX, BCL2L11 및 CASP12 등의 세포자살 유도 유전자가 동정되었다. 토파시티닙 처리에 의해 상향 조절된 유전자 (영역 3 및 4)에는, 모유두 유도력에 중요한 역할을 하는 것으로 기존에 확인된, TGFβ 경로와 BMP 경로의 구성원들이 포함되었다 (40-44). 진피-상피 상호작용을 조절하는 것으로 알려진, LEF1과 같은, WNT 경로의 주 조절인자 (45, 46), 그리고 HF 운명을 제어하는 것으로 알려진 NOTCH 경로의 구성원들(47, 48)이 토파시티닙 처리시 과도하게 나타났다. 요컨대, 이는 토파시티닙 처리가 배양된 모유두의 유도 기능과 생존을 모두 조절함으로써 유도력을 촉진한다는 것을 의미한다.
DP 유도력에 대해 토파시티닙 처리와 공개된 실험을 직접 비교하기 위해, 본 발명자들은 신선하게 분리한 인간 DP (모발 생장을 유도하는 능력을 유지함), 배양된 DP (자체 유도 잠재력을 상실함) 및 배양된 진피 스페로이드 (회복된 유도 잠재력을 가짐) 간의 분자적인 차이를 조사하는 선행 실험으로 전환하였으며, 각 상태와 관련된 독특한 유전자 시그니처를 동정하였다 (35). 이들 유전자를 공동-발현에 따라 영역 (T1-T4)으로 언급한 4개의 카테고리로 클러스터링하였다. T1 및 T3는 배양시 발현이 조절로부터 이탈하여 스페로이드에서 생장에 의해 회복된 유전자를 포함하는 것으로 확인되었으며, T2 및 T4는 스페로이드 배양에 의해 발현이 회복되지 않는 유전자를 포함하였다 (35). T2 영역내 유전자 (배양된 세포에서 상향 조절되지만, 스피어 형성시 회복되지 않음) 및 T4의 유전자 (배양된 세포에서 하향 조절되지만 스피어 형성시 회복되지 않음)는 완전 유도성 DP에 필수적인 것으로 보이는 분자 시그니처를 나타낸다.
토파시티닙 처리가 모발 생장을 강화하므로, 본 발명자들은 T1-T4 영역의 유전자의 발현이 통계적으로 유의한 방식으로 농화되는지를, 토파시티닙-처리 샘플과 무처리 샘플과 비교하여, 분석하였다. 이들 처리 군들에서 최고에서 최저 발현으로 p-값으로 순위를 매긴 차별적으로 발현된 유전자에 대한 유전자 세트 농화 분석 (49)에서, 영역 T4가 토파시티닙 처리된 스피어에서 현저하게 강화되는 것으로 드러났다 (P=2x10-6, 표 3에 제시된 유전자 리스트) (도 4C & 4D). T2 역시 토파시티닙 처리시 강화되었지만, 통계학적인 오버랩 (statistical overlap)은 매우 조금 유의하였다 (P=0.03) (도 8E). T2 및 T4에 속하는 유전자들이 모두 이전 실험에서 예측된 방식으로 변동하는 것은 아니므로, 이는 토파시티닙 처리에 의한 유도력 회복이 완전하지 않을 수 있다는 것이 시사되었다. 토파시티닙 처리는, 모두 모발 생장의 공지된 조절인자인 LEF1, WIF1 및 CD133 등의 유전자 발현을 상향 조절하여 (40, 41), 토파시티닙 처리가 유도력을 개선시키는데 성공적인 이유에 대한 역학적인 설명을 제시해준다. 놀랍게도, 도 2B에서 이용된 qPCR 마이크로어레이에 의해 동정된 T2 및 T4 영역내 모든 JAK STAT 유전자들의 농화 스코어 분석을 통해, 통계학적으로 매우 유의한 오버랩이 드러났으며 (1.45 X 10-7, 표 1에 제시된 유전자 리스트), 이는 T2 및 T4 유도 시그니처에 주류 JAK-STAT 구성 성분이 존재한다는 것을 시사한다.
고찰
본원에 제시된 결과는, JAK-STAT 신호전달의 저해가 모발 생장을 촉진한다는 것을 입증해준다. 이러한 사실은 JAK-STAT와 항-모발 생장 패턴의 조합과 일치되며 (29), 성체 마우스에서 정상적인 모발 사이클 진행에 있어 STAT3 역할의 증거가 된다 (21, 22). 또한, 최근 실험들을 통해, 노화된 마우스에서 JAK-STAT 신호전달 증가가 HF 줄기 세포의 기능을 시험관내에서 저해하며 (50), STAT5 신호전달이 임신 및 수유기에 HF 줄기 세포 정지를 제어하는 (51) 것으로 확인되었다.
JAK-STAT 신호 저해가 줄기 세포/전구 세포의 활성화 또는 분화를 촉진할 수 있다는 관찰 결과는 HF에 고유한 것은 아니다. 조혈계 줄기 세포에서 STAT5 감소는 정지 상태로부터의 탈출을 유도하여, 방사선 조사 후 골수 재생력 (repopulating capacity) 증가를 유도한다 (52). JAK-STAT 신호전달 저해는 대칭적인 위성 세포의 확장 촉진 및 근분화로의 구속 퇴행을 통해 노화된 마우스에서 골수 재생을 개선한다 (53, 54). 따라서, 정지 상태를 조장하는데 있어 JAK-STAT 신호전달의 역할은 성체 줄기 세포 집단에서 일반화된 기전으로 제시할 수 있다.
본 실험에서, 본 발명자들은, JAK-저해제-매개 모발 생장이 T 림프구 기능과는 독립적이고, 모발-고유 특성을 나타낼 가능성이 높다는 것을, 관찰하였다. 최근 들어, 본 발명자들은, AA 환자를 JAK 저해제로 치료하면, 부분적으로 CD8+ NKG2D+ 세포독성 T 세포 침윤 제거로 인해 모발 재생장이 유도된다는 것을 입증하였지만, HF에 대한 직접적인 효과를 배제하진 않았다 (1). 이러한 2가지 사실은, AA 환자에서 모발 생장을 2-단계 기전으로서 간주할 경우, 조합된다: 첫째, 상피 세포에 대한 T 세포 매개 면역 공격이 없어져야 하며, 둘째, 성장기 생장이 재개되어야 한다 (55). 본 발명자들은, JAK 저해제로 국소 처리하면, 특히, HF 미세환경에서 약물의 국소 농도를 증가시켜 2가지 작용이 발생하도록 하기 때문에, 전신 처리한 경우에 비해 모발 생장이 더 왕성하게 나타난다는 것을 관찰하였다. 질병이 없는 (unaffected) 개체 또는 정상 마우스에서는, JAK 저해제를 이용한 처리가 (마우스에서) 모발 사이클을 재시작하거나 또는 (인간에서) 모발 생장을 촉진하는데 충분할 수 있다.
마우스에서, JAK 신호전달 억제는 휴지기 중에 생장 촉진 (pro-growth)/항-정지 신호를 활성화하여 (9, 56, 57), 성장기로의 재-진입을 허용하게 된다. 본 발명자들은, 전구 세포가 함유된 모원배 구획의 활성화가 JAK-저해 매개 모발 생장에서 초기 현상이라는 것을 관찰하였으며, 성장기 초기에 활성화된 경로들이 JAK 저해 후 상향 조절된다는데 주목하였다. 이들 결과는, JAK-저해 매개 모발 생장이 항상성 모발 주기의 정상적인 증식 패턴을 따른다는 것을 시사한다 (16, 23).
데이타에 따르면, 약물 처리 후 성장기 재-진입은, 휴지기 중기에 마우스에 처리하였을 때 발생되지만, 휴기지 초기에는 그렇지 않은 것으로 확인되었는데, 이는 JAK 저해가 휴지기 초기에는 정지 상태를 조장하는 미세환경을 넘어설 수 없다는 것을 시사해준다. BMP 저해제와 Wnt 작용제는 휴지기 동안에 상승하여, HF 줄기 세포 활성화에 필요한 역치를 낮춘다 (9). 모유두에서 Tgfβ2 및 Fgf7/10의 상향 조절은 정지/활성화 단계에서 BMP 신호전달을 약화시키고, 성장기 초기 개시에 기여한다 (23, 44). 휴지기가 진행됨에 따라, 모원배는 세포 주기로의 진입과 신호 전이에 참여하는 유전자들을 상향 조절하게 된다 (23). 즉, HF 줄기 세포의 활성화는 미세환경에서 전반적인 응답성 상태로 도달하는 것에 의존한다.
토파시티닙 처리는 인간 DP 스피어에서 TGFβ2, BMP6 및 LEF1의 발현을 상향 조절하며, 이는 JAK 저해가 DP를 활성화는 잠재적인 기전임을 제안한다. 즉, 모발 주기의 완전한 활성화는 저해 신호와 활성화 신호 간의 균형에 의해 좌우될 가능성이 높으며, 단일 세포 타입 또는 인풋 (input)에 의해 좌우되진 않는다. 따라서, DP (또는 모원배)의 JAK 저해는 휴지기 초기 단계에 신호들에 반대로 작용함으로써 완충되지만, 환경이 점점 관대해질 수록 신호가 활성화를 유도할 가능성이 있다.
인간에서, 토파시티닙 처리를 통한 JAK3 저해가 성장기 모간 (피부 이식물 및 기관형 배양 분석 (organotypic culture assay))의 생장 속도를 높이고, 인간 DP 스피어의 유도력을 강화 (신생 분석)하는 것으로, 데이타에서 시사되었다. 토파시티닙 처리에 대한 분자적인 효과를 조사한 결과, 처리를 통해, 배양시 파괴되지만 완전 유도성 DP 세포에서는 존재하는 유전자 서브세트를 분자적으로 회복시킬 수 있는 것으로 드러났다 (도 4C, 4D). 이들 결과는, 토파시티닙 처리가 탈모를 치료하기 위한 동종 세포 이식 방법 등의 이용성을 강화할 수 있다는 것을 시사한다.
재료 및 방법
실험 설게. JAK-STAT 신호전달의 저해가 마우스에서 모발 사이클로의 진입을 촉진한다고 가정하였다. 성장기 개시를 확인하기 위해, 등 피부의 털을 전기 면도기로 밀고, 피부 흑화 외양과 모발 재생을 통해 HF의 성장기 진입을 관찰하였다. 도 1A에 나타낸 모발 사이클 실험을 위해, 시간대 별 마우스 2마리로부터 생검을 취하고, 한배새끼 3 세트에서 실험을 반복하였다. 도 1B의 그래프에 나타낸 데이타는 도 5E에 나타낸 바와 같이, 처리 후 시간 경과에 따른 피부 흑화를 관찰함으로써 작성하였다. 상기 도 1C 및 D에 언급된 실험의 경우, 그룹 당 마우스 3-4마리를 사용하였으며 (7주령 대 8.5주령), 실험을 3번 반복하였다. 도 1B 및 5E에 언급된 실험의 경우, 마우스 4마리에 대조군 (등 피부 절반)과 룩솔리티닙 (등 피부 절반)을 처리하고, 마우스 4마리에 대조군 (등 피부 절반)과 토파시티닙 (등 피부 절반)을 처리하였다. 도 1E에 나타낸 실험은 조건 별로 마우스 3마리를 사용해 독립적으로 1회 반복 실시하였다. 도 2A에 나타낸 실험에서는 유전자형 별로 마우스 3마리를 사용하였고, 실험은 한배세끼 2 세트로 반복 실시하였다.
유전자 발현 프로파일링을 8.5주령의 B6/C57 암컷 마우스 12마리로부터 수득한 전체 피부 생검을 대상으로 수행하였다. 생검은 실험 0일 (T0)에 등 피부에서 취하였다. 마우스에 DMSO, 룩솔리티닙 및 토파시티닙을 1-4일에 매일 처리하였으며, 5일째 (T5)에 처리한 마우스로부터 2차 생검을 취하였다. 품질 관리는 affy analysisQC package from　http://arrayanalysis.org/를 사용해 수행하였다. 2종의 샘플 DMSO1 T5 및 RUXO3 T5는, 품질 관리에 실패하여, 추가적인 하위 분석에서 제외시켰다. 데이타는 affyAnalysisQC에서 실행되는 GCRMA 방법을 이용해 정규화하였다. LIMMA를 멀티레벨 모델과 함께 사용하여, 각 처리군 (DMSO, RUXO 및 TOFA)에서 역치로 배수 변화=1.5 및 P<0.05를 사용해, T5 및 T0의 샘플에서 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. 차별적인 발현 분석 결과를 IPA (Ingenuity Pathway Analysis)에 업로드하여, 각 처리군에서 차별적으로 발현되는 유전자의 각 리스트에서 과다 표시된 분자 경로를 동정하였다.
DP 스피어 마이크로어레이 분석에서는, 3가지 다른 공여체로부터 세포를 준비하고, Affymetrix human HG-U133 PLUS 2.0 어레이를 CUMC genomics facility에서 혼성화를 수행하였다. 품질 관리 및 데이타 정규화는 전술한 바와 같이 수행하였다. 장기 배양 실험을 위해, 반복 세트 3회를 수행하였으며, 각각 한명의 개체로부터 수득한 HF를 사용하였다.
마우스. 본 실험에서 모든 야생형 마우스 (성체 및 신생아)는 C57/B6 백그라운드를 가지며, 잭슨 레보레이토리에서 구입하거나 또는 실험실에서 교배하였다. 이식 실험을 위한 ICR-SCID 마우스 (IcrTac:ICR-Prkdc scid )는 Taconic에서 구입하였다. 모발 패치 분석을 위한 무-흉선 누드 마우스는 찰스 리버 사에서 구입하였다. Rag1-/- 및 Tcr β/δ-/- 마우스는 잭슨 레보레이토리 (각각 스톡 번호 002216 및 002122)에서 구입하였다. 동물들 모두 콜롬비아 대학에서 비교 의료를 위한 AAALAC 시설에서 유지시켰다. 절차는 동물 관리 시설을 이용하여 수행하였으며, 위원회로부터 승인받은 프로토콜을 이용하였다.
인간 표본. 이식 실험을 위한 두피 피부는 ABR (Advanced Bioscience Resources) Inc.로부터 입수하였다. 후두부 두피 모낭은, 콜롬비아 대학에서 생명윤리위원회 면제에 의해 45 CFR 46 하에 면제를 허가받은 후, 모발 이실 수술 중에 수득되는 폐기된 조직으로부터 헬싱키 조약에 따라 수득하였다.
본 실험에 사용된 JAK -STAT의 약리학적 저해제 및 기타 약물들. 룩솔리티닙 (INCB018424)은 ChemieTek (카탈로그 번호 CT-INCB)에서 구입하였다. 토파시티닙은 AbMole BioScience (카탈로그 번호 477600-75-2)에서 구입하였다. Hedgehog 작용제 (SAG)는 EMD Millipore (카탈로그 번호 566660)에서 구입하였다. JAK-STAT 저해제는 DMSO에 용해하여, 생체내 실험에서는 나타낸 바와 같이 2-3%에서 사용하고, 시험관내 실험에서는 400nM로 사용하였다. SAG는 Paladini et al (2)에 언급된 바와 같이 120μM로 사용하였다.
항체 및 면역형광 . 마우스 피부의 신선한 동결 조직 단편에 대한 면역 형광 실험은 기존에 개시된 바와 같이 수행하였다 (1). 모든 형광 사진은 Zeiss LSR Excited 공초점 현미경을 사용해 촬영하였다. 명 시야 사진들은 모두 Zeiss Axioplan 2 system을 사용해 촬영하였다. 사용된 1차 항체와 희석율은 표 1에서 확인할 수 있다. 핵은 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하였다.
qPCR 분석에 의한 차별적인 유전자 발현 분석 . 마우스 등 피부에서 지정된 시점에 RNeasy Minikit (Qiagen)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 전체 RNA를 분리하였다. 피부는 시간대 별 마우스 3마리로부터 회수하였으며, 4번의 시점을 조사하였다 (분석에 12마리의 마우스가 사용됨). 전체 RNA (2 ㎍)을 oligo (dT) 프라이머와 SuperScript III (Invitrogen)를 사용해 역전사하였다. 각 샘플에서 제조되는 cDNA를 하나의 JAK-STAT 신호전달 qPCR 어레이 (Qiagen/SABbioscience 카탈로그 번호 PAMM-039, 유전자 리스트은 온라인으로 제공됨)에 나누어 넣었다. 어레이는 JAK-STAT 경로와 관련된 유전자 84개와 5종의 하우스키핑 우전자 및 품질 대조군을 포함한다. 실시간 PCR을 ABI 7300 (Applied Biosystems)에서 수행하였다. 데이타 분석은 SABioscience 사에서 제공한 RT2 Profiler PCR 어레이 데이타 분석 소프트웨어를 사용해 수행하였다. 발현의 배수 변화는 ΔΔC t 방법을 이용해 측정하였으며, 하위 분석에서 사용된 수치들은 시간대 별 생물학적 레플리케이트 3개에서 평균 배수 변화를 구하여 도출하였다.
GEDI . 평균 log2FC 값은 생후 17일 (휴지기 초기) 대비 DDCt로서 계산하고, 이를 이용해 GEDI (Gene Expression Dynamic Index) 분석을 수행하여, 자가-조직화 맵 알고리즘으로 동정된 "메타유전자"가 샘플 전체에서의 변화되는 방식을 가시화하였다. 메타유전자는, 샘플들 간에 유사한 시간적 발현 패턴을 가지며 (61), 2차원 그리드에서 하나의 픽셀로 할당되는, 유전자들로 된 클러스터이다. 이웃한 픽셀은 다른 것과 유사한 패턴을 나타낸다. 이후, 격자 패키지 R에서 레펠 플롯 함수 (level plot function)를 이용해 자가-조직화 맵을 구한다.
증식 실험. 8.5주령의 C57/B6 마우스에, 등 피부 절반에는 국소 비히클 대조군 (좌측) 또는 JAK 저해제 (우측)를 처리하였다. 처리 4시간 후, 각 마우스에 20 mg/kg 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) (Invitrogen)을 1회 주사하였다. 주사한 지 1시간 후, 피부를 회수하여 고정하고, Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트 (Life Technologies)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 염색한 다음 P-카드헤린으로 대조-염색하였다. 실험은 시간대 별 마우스 1마리를 사용해 1회 반복하였다.
마이크로어레이 분석. 전체 RNA는 Qiagen RNAeasy 마이크로 키트로 추출하였다. Ovation RNA 증폭 키트 (Nugen)를 사용해, 마이크로어레이 분석을 위한 cDNA 증폭물을 제조하였다. 사용된 어레이는 Affymetrix mouse 430 2.0이며, CUMC 마이크로어레이 시설에서 혼성화를 수행하였다. qPCR 분석은 ABI 7300 사이클러에서 수행하였다. 표 2에 프라이머 서열을 나타낸다.
DP 스피어 마이크로어레이 분석을 위해, 3명의 공여체 각각으로부터 유래된, DMSO, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙 중에 배양한 DP 스피어에서, Qiagen RNAeasy 마이크로 키트를 사용해 총 RNA를 추출하였다. Ovation RNA 증폭 키트 (Nugen)를 사용해 마이크로어레이 분석을 위한 증폭된 cDNA를 제작하였다. LIMMA를 고정효과로서 처리제 및 차단 인자를 모두 공여체에 처리하는 선형 모델과 함께 사용하였다. 처리군들 간의 대상 대비 (contrasts of interest)를 적용하여 처리군 DMSO, RUXO 및 TOFA에서 처리쌍 간에 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. 역치로서 절대 배수 변화 = 1.5 및 P<0.05를 적용하였다. GSEA의 경우, ftp.broad.mit.edu//pub/gsea/annotations/에서 다운받은 HG_U133_Plus_2.0 칩 주석 파일을 이용해, Affymetrix ProbeSets에 주석을 붙이고, 주어진 유전자 심볼에 대한 두플리케이트 ProbeSets를 제거하였다. 두플리케이트는 각 유전자 심볼에서 관찰되는 최대 절대 배수-변화를 기반으로 제거하였다. LIMMA에 의해 되돌아온 조절 t-통계를 이용해 각 처리군의 대상 대비를 위해 사전-랭킹된 유전자 리스트를 작성하였다. GSEA를 이들 리스트에 대해 수행하여, 각 리스트에서 과다 표시된 KEGG 경로를 동정하였다 (ES p-값 0.01).
유전자 세트 농화 분석. 차별적인 발현 (p-값) 순으로 열거되고 배수 변화 방향 (증가 또는 감소)이 표시된 검출된 모든 전사체 리스트를 작성하여 토파시티닙-처리 세포와 대조군 세포를 비교하는 유전자 세트 농화 분석을 수행하였다. 이러한 순서 리스트에서 영역 2와 4 (표 3에 제시된 유전자 리스트)의 유니온의 농화를 기존에 알려진 바와 같이 테스트하였다 (35). 정규화된 농화 스코어 (NES, normalized enrichment score) 및 관련 p-값을 계산하기 위한 null 분포는 유전자 랭킹을 랜덤화하기 위한 라벨 재편성 (label shuffling)에 의해 수득하였다. 이들 랜덤화된 세트를 사용해 5000회 반복시 null 농화 스코어를 계산하여 null 분포를 구하였다. 관찰된 리딩 에지 농화 스코어 (leading edge enrichment score)를 상기한 분포로 정규화하고, 이 NES에 대해 2-tailed p-값을 구하였다.
인간 모낭 장기 배양 분석. 성인 인간 모낭을 후두부 피부로부터 무균 조건 하에 기존에 공지된 바와 같이 미세적출하였다. 각각의 모낭을 24웰 조직 배양 플레이트에서 하이드로코르티손, 인슐린 및 글루타민이 첨가된 윌리암스 E 배지 (62) 중에, DMSO, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙 (400nM) 존재 하에 접종하였다. 배지를 2일마다 교체하고, 각 모낭의 사진을 2일마다 촬영하였다. 각 모낭의 생장속도를 이미지 J를 사용해 분석하였다.
모유두 스피어를 이용한 패치 분석. DP 세포를 기존에 알려진 바와 같이 스피어 형태로 배양하였다 (35). DMSO, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙를 배지에 첨가하였다 (400nM). 각 행잉 드롭에는 세포 1000개가 포함되며, 이들은 24시간 후 응집되어 DP 스페로이드를 형성하였다. 접종한 지 48시간 후, 각 조건에서 스피어 500개를 패치 분석용으로 수집하였다. 각 실험은 한명의 개체로부터 유래된 세포를 사용해 수행하였으며, 4건의 별개의 실험을 수행하였다. 각질 형성 세포는 Lichti et al (63)에 개략적으로 언급된 프로토콜에 따라 신생아 마우스에서 분리하였다. 세포는 패치 분석을 위해 회수하기 전 2-4일간 dkSFM 중에 배양하였다. 신생아 뮤라인의 각질 형성 세포 1 x 106개를 인간 DP 스피어 500개와 각 조건에서 혼합한 다음, 누드 마우스의 등 피부에 피하 주사하였다. 주사 후 12일 후에, 모낭이 진피에서 발달하였으며, 이중 일부는 HF와 모발 섬유를 함유하였다. 이들 모낭을 수집하여 사진 촬영한 다음 0.35% 콜라게나제로 효소 분해하였다. 분해된 슬러리를 현미경 슬라이드 위에 펼친 다음, 입체현미경 하에서 모발 섬유의 수를 수동으로 계수하였다.
인간 피부 이식 분석. 직경이 대략 2 x 2 cm인 인간 배아 두피 피부 (16주령)를 SCID 마우스 등에 이식하였다. 마우스를 붕대로 감고, 6주간 이식부가 회복되도록 두었다. 6주 후, 이식부에서 짧은 털을 관찰할 수 있었다. 이식물에 매일 비히클 대조군, 룩솔리티닙 또는 토파시티닙을 국소 처리하였다. 처리는 4주간 계속하였으며, 3-5일마다 사진을 촬영하였다. 실험은 3명의 별개 공여체로부터 수득한 피부로 수행하였다.
모발 생장의 정량 분석은 ImageJ를 이용해 수행하였다. 공여체의 모발은 어둡고, 이식받은 마우스는 흰색이라는 점을 이용하여, 색소 침착 정도를 HF 밀도를 나타내는 대리물로서 측정하였다. 대조군 및 실험군 처리를 동일 이식체에 수행하였기 때문에, 각 사진으로 비히클-처리 피부와 약물-처리 부피를 직접 비교할 수 있다. 색소 침착 정도는 사진 당 라인 3개를 측정하여 점수를 매기고, 평균을 내어 도 3A 및 8A에 나타낸 히스토그람을 작성하였다. 영역이 어두울수록 밝은 영역 보다 낮은 값을 나타낸다. 이식체 상의 모발 생장에 있어 전-처리 차이와 경시적인 모발 밀도 변화를 설명하기 위해, 대조군 처리한 쪽의 세기 값을 약물 처리한 쪽의 세기 값으로 나누어 비율을 계산하였다.
통계학적 분석. 모든 테스트에서 유의 수준 p=0.05를 적용하였다. 장기 배양 종단 실험 (도 3 B& C)과 피부 색소 침착 실험 (도 1B) 둘다에서, R package nparLD를 이용해 비-모수적인 종단 데이타 분석을 수행하여, 처리군 쌍을 비교하는데 있어 처리군에 따른 시간별 상호작용 (treatment by time interaction), 즉 시간 프로파일들이 평행하지 않다는 가설을 조사하였다. 장기 배양 실험에서 F1-LD-F1 설계를 채택하였다. 피부 색소 침착 실험에서는 쌍을 이룬 설계를 감안하여 LD-F2 모델을 이용해 Ruxo vs 대조군 및 Tofa vs 대조군 비교를 수행하였으며, Tofa vs Ruxo 비교에서는 데이타가 쌍이 형성되지 않아 F1-LD-F1 모델을 이용하였다. ANOVA-타입의 통계는 alpha=0.05에서 유의성을 검정하였다 (무작위 완전 구획 설계를 적용해 인간 모유두 스피어 패치 분석을 분석함)(도 3E). 3명의 공여체 각각으로부터 수득한 DP 스피어에 3가지 처리를 각각 적용하였다. 공여체는 차단성 정 인자 (fixed blocking factor)로서 처리하였다. 통계적 분석 유닛은 관찰된 모낭의 개수이다. 데이타는 차단 요소, 즉 공여체를 랜덤효과 (random effect)로서 처리하는 선형적인 복합 효과 모델 (linear mixed effects model)을 사용해 분석하였다. R 패키지 lme4 및 lmerTest를 이용해, 고정 인자, 처리가 관찰되는 모낭의 개수에 유의하게 기여하는 지를 검사하고, 처리 수단에 대한 사후 비교를 수행하였다. 패키지 lmerTest는 p-값과 분모 자유도를 구하기 위해 Satterthwaite 추정을 적용하였다.
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6.2 실시예 2: 온코스타틴 M은 JAK -STAT 신호전달을 통해 모낭 줄기세포의 정지를 촉매한다
서론
JAK-STAT 신호전달은 뮤라인 모발 주기의 휴지기 (휴식 단계) 동안에 모낭 줄기 세포 (HFSC)가 정지 상태를 유지하는데 참여한다. JAK 저해가 야생형 마우스 휴지기 피부에서 성장기를 개시할 수 있다는 것은 입증되어 있다 (1). 유전자 발현 및 세포의 다이나믹 분석을 통해, 이러한 과정은, 모유두에 인접한 이차 모원배에서 첫번째 증식 신호가 관찰됨으로써, 천연적인 모발 사이클의 초기 현상을 되풀이할 수 있다는 것도 확인된 바 있다. JAK-STAT 신호전달은 사이토카인 신호전달과 함께 복합적으로 참여하는 것으로 시사된다. 특히, IL-6 계열의 사이토카인은 마우스 피부에서 성장기를 길항하고, 퇴화기/휴지기를 촉진하는 것으로 알려져 있다. IL-6 계열의 사이토카인들 중, 온코스타틴 M (OSM)은 다른 시스템에서 줄기 세포, 즉 근육 줄기 세포의 정지 상태를 유지시키는데 관여한다. 면역형광 실험을 이용해, 본 발명자들은 뮤라인 모낭의 2차 모원배에서 OSM과 이의 수용체 (OSM-Rβ)가 활성화된 (인산화된) STAT3 및 STAT5 신호전달 분자와 상호 보완적인 패턴으로 공동 발현한다는 것을 발견하였는데, 이는 이 구획에서 정지 상태를 유지하는데 있어 OSM의 자가분비 역할을 의미한다. 이러한 관찰 결과는 배양된 마우스 각질 형성 세포에 대한 시험관내 실험에서 검증되었다. 본 발명자들은, OSM 및 OSM-Rβ와 더불어, JAK-STAT 신호전달 구성 성분에 대한 시간적 및 공간 특이적 낫-아웃을 수행하여, OSM 및 이의 수용체가 2차 모원배에서 HFSC와, 잠재적으로는 HF의 다른 줄기 세포에서 정지 상태를 유지하는데 필수적이고 충분한 것인지를 조사하였다. HFSC에서 정지 상태를 형성하는데 있어 활성형 JAK-STAT 신호전달의 놀라운 역할로 인해, 이는, 휴지기를 유지하는 BMP 신호전달 및 Wnt 저해 등의 경로들과 나란히 배치된다.
결과
인산화된 STAT3 및 STAT5 단백질은 휴지기 초기 및 중기 (P46, P60) 동안에 HFSC 구획에서 검출되었으며, 휴지기 후기 (P80)에 감소되었다 (도 9A). OSM 면역형광은 이 기간 동안 HFSC에 공동-위치되었다. OSM 수용체 (OSM-Rβ) 역시 면역조직화학에서 HFSC 벌지 구획에 공동-위치하는 것으로 확인되었다 (도 9B). 사진들은 모두 x20 배율로 촬영하였다. 시험관내에서 배양된 각질 형성 세포에서, OSM은 OSM 처리 10분 이내의 STAT1, STAT3 및 STAT5 전사 인자들을 활성화하였고, 그 효과는 토파시티닙 (TOFA) 처리에 의해 효과적으로 상쇄되었다 (도 9C). TOFA로 처리된 생체내 전체 피부에서도, STAT3 및 STAT5 활성화가 효과적으로 저해되었다 (도 9D). P60 휴지기 피부에 매일 피하 주사한 OSM-Rβ 중화 항체는 국소 성장기를 유도하였으며, 이는 HFSC 구획에서의 OSM-Rβ 활성화가 휴지기에 정지 상태를 유지하는데 필수적이라는 것을 의미한다 (도 9E). PBS 대조군과 IL-6 및 이의 수용체에 대한 중화 항체는 효과가 없었다 (도 9E). 도 9F는 gp130 역시 벌지에서 증가됨을 보여준다.
휴지기에 회수한 마우스 각질 형성 세포를 이용한 콜로니 형성 분석을 통해, OSM이 각질 형성 세포에 대한 생장 저해 효과를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 저해 효과는 토파시티닙을 첨가한 경우 부분적으로 역전되었다 (도 10A). 토파시티닙 단독으로도 각질 형성 세포 콜로니의 수적 증가를 유도하는 것으로 나타나 (도 10B), 기존의 결과들과 일치하였다 (4). 2차 휴지기, 7.5 및 8.5주령에 회수한 피부 (P56 및 P60)를 분리하여, 상피와 진피를 qRT-PCR로 분석하였다. OSM-Rβ는 진피에서 선호적으로 발현되는데 반해 OSM은 진피에서 생산되었다 (도 10C). 또한, OSM 생산은 P53에서 P60 사이에 증가하였다. 상피에서는, 벌지 구획에서 OSM-Rβ가 증가되어, OSM 신호전달이 휴지기 동안에 이 집단의 정지 상태를 유지시키는 것으로 추가로 시사되었다 (도 10E). 도 10F는 (5)에서 개량된, CD34+ ITGA6+ HFSC를 단리하기 위한 마우스 상피에 대한 세포 분류 전략을 도시한다. 배양된 마우스 각질 형성 세포에서는, 재조합 마우스 OSM을 20ng/ml로 처리하였을 때 OSM-Rβ의 발현이 상향 조절되었다 (도 10G). 이는, 파지티브-피드백 기전이 HFSC의 정지 상태를 유지시킨다는 것을 시사한다.
JAK-저해 실험을 통해 수득한 기존 마이크로어레이 데이타 (1,2)를 다시 분석하였으며, JAK 처리는 휴지기에 처리된 전체 마우스 피부에서 지속적으로 OSM-Rβ를 하향 조절하였다 (도 11A). OSM-Rβ의 하향 조절은, 토파시티닙 또는 룩솔리티닙을 5일간 처리하면서 매일 피부 생검을 수집한, 생체내 qRT-PCR에서도 검증되었다 (도 11B). 배양된 마우스 각질 형성 세포에서도 OSM-Rβ의 전사의 하향 조절이 시험관내에서 확인되었다 (도 11C). 룩솔리티닙으로 처리된 휴지기 마우스 피부로부터 분류한 각질 형성 세포 역시 3일 후 OSM-Rβ의 하향 조절을 나타내었다 (도 11D). JAK2 저해제로서 룩솔리티닙을 생체내 처리하면, 초기에 STAT3/5 저해가 발생하였고, 이후 Akt 및 ERK 경로가 활성화되어 OSM-Rβ의 하향 조절로 이어졌다 (도 11E). 이들 데이타는, 진피 구획에서, 잠재적으로 모유두에서 생산되는 OSM이 벌지내 HFSC 상의 OSM-Rβ에 결합하여, OSM-Rβ의 발현을 유지하면서 동시에 생장 및 분화를 억제함으로써, 휴지기 동안에 정지 상태를 유지시킴을 시사한다. JAK 저해는 이러한 파지티브 피브백 루프를 파괴하여 모낭을 성장기로 진입시킬 가능성이 높다.
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항체 클론/카탈로그 번호 희석율
Phospho Stat 3 (마우스) D3A7 1:100
Phospho Stat5 (마우스) C11C5 1:100
Krt 14 Covance PRB-155p 1:1000
Krt 15 Covance PCK-153p 1:1000
P-cadherin Invitrogen 13-2000z 1:100
Phospho Stat 3(인간) BD cat #:562071 1:100
Phospho Stat 5 (인간) BD cat #:562075 1:100
프라이머 명 서열
B2M Fwd TTCTGGTGCTTGTCTCACTGA
B2M Rev CAGTATGTTCGGCTTCCCATTC
Tyr Fwd CACCATGCTTTTGTGGACAG
Tyr Rev GTTACTGCGACTGGTGCG
Sfrp4 Fwd AGAAGGTCCATACAGTGGAAG
Sfrp4 Rev GTTACTGCGACTGGTGCG
Shh Fwd AAGCAGGTTTCGACTGGGT
Shh Rev CCGGGACGTAAGTCCTTCAC
Gli2 Fwd CAACGCCTACTCTCCCAGAC
Gli2 Rev GAGCCTTGATGTACTGTACCAC
Socs3 Fwd ATGGTCACCCACAGCAAGTTT
Socs3 Rev TCCAGTAGAATCCGCTCTCCT
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Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROMOTING HAIR GROWTH <130> 070050.5751 <140> PCT/US2016/031541 <141> 2016-05-09 <150> 62/157,959 <151> 2015-05-07 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ttctggtgct tgtctcactg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 cagtatgttc ggcttcccat tc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 caccatgctt ttgtggacag 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gttactgcga ctggtgcg 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 agaaggtcca tacagtggaa g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 aagcaggttt cgactgggt 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ccgggacgta agtccttcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 caacgcctac tctcccagac 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 gagccttgat gtactgtacc ac 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 atggtcaccc acagcaagtt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 tccagtagaa tccgctctcc t 21

Claims (61)

  1. 포유류 개체에서 모발의 생장을 유도하는 방법으로서,
    개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 투여는, 상기 모낭이 휴지기 중기 또는 휴지기 후기일 때, 실시되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 개체는 안드로겐성 탈모증 (androgenetic alopecia), 휴지기 탈모증 (telogen effluvium), 원형 탈모증 (alopecia areata), 머리 백선 (tinea capitis), 전두 탈모증 (alopecia totalis), 감모증 (hypotrichosis), 유전성 단순 감모증 (hereditary hypotrichosis simplex), 전두부 섬유화 탈모증 (frontal fibrosing alopecia), 반흔성 탈모증 (cicatricial alopecia), 모공 편평태선 (lichen planopilaris), 고리형 탈모증 (ring alopecia), 흉터성 탈모증 (scarring alopacia), 비-흉터성 탈모증 (nonscarring alopacia), 화학요법 유발성 탈모증 (chemotherapy induced alopecia) 또는 전신 탈모증 (alopecia universalis)을 앓고 있는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저해제가, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ를 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 변이체 또는 변형체; 또는 소분자인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 저해제가 룩솔리티닙 (ruxolitinib, INCB 018424)인, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 저해제가 토팍시티닙 (tofacitinib, CP690550)인, 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 소분자가 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (momelotinib, CYT387), 파르트시티닙 (partcitinib, SB1518), 바리시티닙 (baricitinib, LY3009104), 페드라티닙 (fedratinib, TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (lestaurtinib, CEP-701), 플루다라빈 (fludarabine), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙 (momelotinib), 파크리티닙 (pacritinib), 페피시티닙 (peficitinib), ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙 (decernmotinib), 필고티닙 (filgotinib), 간도티닙 (gandotinib), INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙 (cerdulatinib), INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물 (lumbricus rebellus extract), ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 (hyperforin ) 또는 이들의 조합물인, 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 저해제가 OSM-Rβ 항체인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 모발이 개체의 두피 또는 얼굴의 털이거나, 또는 눈썹 또는 속눈썹을 구성하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 모발이 코털인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 저해제가 국소 투여되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 저해제가 경구 투여되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 저해제 투여 후 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 발현 수준이 변화되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 하나 이상의 모발 생장 바이오마커가 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 정량적인 PCR 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 효소 연계된 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay) 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  18. 포유류 개체에서 모발 생장을 촉진하는 방법으로서,
    개체의 모낭에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 투여가, 모낭이 휴지기 초기를 제외한 시기일 때, 실시되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 모낭이 성장기 단계인, 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 개체는 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증, 전두부 섬유화 탈모증, 반흔성 탈모증, 모공 편평태선, 고리형 탈모증, 흉터성 탈모증, 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증을 앓고 있는, 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 개체가 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ를 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 변이체 또는 변형체; 또는 소분자인, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 저해제가 룩솔리티닙 (INCB 018424)인, 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 저해제가 토팍시티닙 (CP690550)인, 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 소분자가 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물인, 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 저해제가 OSM-Rβ 항체인, 방법.
  27. 제18항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  28. 제18항에 있어서,
    상기 모발이 개체의 두피 또는 얼굴의 털이거나, 또는 눈썹 또는 속눈썹을 구성하는, 방법.
  29. 제18항에 있어서,
    상기 모발이 코털인, 방법.
  30. 제18항에 있어서,
    상기 저해제가 국소 투여되는, 방법.
  31. 제18항에 있어서,
    상기 저해제가 경구 투여되는, 방법.
  32. 제18항에 있어서,
    상기 저해제 투여 후 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 발현 수준이 변화되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 하나 이상의 모발 생장 바이오마커가 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 정량적인 PCR 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 효소 연계된 면역흡착 분석 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  36. 모유두 (dermal papilla)의 유도력 (inductivity)을 촉진하는 방법으로서,
    개체의 모낭으로부터 유래되는 모유두 3D 스피어 (dermal papilla 3D sphere)에 Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며;
    상기 투여는 모유두 스피어를 상기 개체에게 투여하기 전에 이루어지는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 모유두 3D 스피어는, 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증, 전두부 섬유화 탈모증, 반흔성 탈모증, 모공 편평태선, 고리형 탈모증, 흉터성 탈모증, 비-흉터성 탈모증, 화학요법 유발성 탈모증 또는 전신 탈모증을 치료하기 위해, 상기 개체에게 후속적으로 투여되는, 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 저해제가, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ를 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 변이체 또는 변형체; 또는 소분자인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 저해제가 룩솔리티닙 (INCB 018424)인, 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 저해제가 토팍시티닙 (CP690550)인, 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 소분자가 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물인, 방법.
  42. 제38항에 있어서,
    상기 저해제가 OSM-Rβ 항체인, 방법.
  43. 제36항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  44. 제36항에 있어서,
    상기 모발이 개체의 두피 또는 얼굴의 털이거나, 또는 눈썹 또는 속눈썹을 구성하는, 방법.
  45. 제36항에 있어서,
    상기 모발이 코털인, 방법.
  46. 제36항에 있어서,
    상기 저해제가 국소 투여되는, 방법.
  47. 제36항에 있어서,
    상기 저해제가 경구 투여되는, 방법.
  48. 제36항에 있어서,
    상기 저해제 투여 후 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 발현 수준이 변화되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 하나 이상의 모발 생장 바이오마커가 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제48항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 정량적인 PCR 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  51. 제48항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 효소 연계된 면역흡착 분석 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  52. 포유류 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는 테라피 (therapy)의 효능을 평가하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득한 모낭 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 테라피 동안에 여러 시점 중 한 시점에, 개체로부터 수득한 모낭 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 테라피는, 제1 샘플과 비교해, 제2 또는 그 이후 샘플에서 하나 이상의 모발 생장 바이오마커에 변화가 있을 경우, 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하는데 유효한 것인, 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커가 CD34, Lhx2, NFATc1, Axin2, FoxC1, OSMR, OSM, Jak3, FAS, Irf1, Ifnar1, Nr3c1, Stat5A, Il6st, Ptprc, Ghr, IL10ra, Il2rg, Pdgfra, Spfi1, Socs2, Stat5b, Crp, Il4, Prlr, Insr, IL2ra, Cebpd, Stat3, Jak1, Acvr2a, Sfrp4, Sox5, Cdh2, Fzd5, Wif1, Wnt2, Fzd8, Apc, Sox9, Ilk, Shh, Krt25, Dlx2, Prom1, S100a9, Vegfc, Ptgfr, Pdgfrl, Igfbp4, Gli2, Tyrp1, Syt4, Mlana, Pmel, Dct, Tyr, Sos1, Dbf4, Pax3, PIK3ca, Rps6kb1, Mlph 및 Stx17으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제52항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 정량적인 PCR 또는 이의 변형 방법에 의해 검출돠는, 방법.
  55. 제52항에 있어서,
    하나 이상의 모발 생장 바이오마커의 유전자 발현의 수준 변화는 효소 연계된 면역흡착 분석 또는 이의 변형 방법에 의해 검출되는, 방법.
  56. 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 포유류 개체에서 모발 생장을 유도 또는 촉진하기 위한 키트:
    (a) Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 및/또는 OSM-Rβ 저해제; 및
    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 저해제가, Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, OSM, gp130, LIFR 또는 OSM-Rβ를 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, microRNA 또는 이들의 변이체 또는 변형체; 또는 소분자인, 키트.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 저해제가 룩솔리티닙 (INCB 018424)인, 키트.
  59. 제57항에 있어서,
    상기 저해제가 토팍시티닙 (CP690550)인, 키트.
  60. 제57항에 있어서,
    상기 소분자가 룩솔리티닙 (INCB 018424), 토팍시티닙 (CP690550), AG490, 모멜로티닙 (CYT387), 파르트시티닙 (SB1518), 바리시티닙 (LY3009104), 페드라티닙 (TG101348), BMS-911543, 레스타우르티닙 (CEP-701), 플루다라빈, 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 바리시티닙, 모멜로티닙, 파크리티닙, 페피시티닙, ABT 494, AT 9283, 데세른모티닙, 필고티닙, 간도티닙, INCB 39110, PF 4965842, R348, AZD 1480, BMS 911543, 세르둘라티닙, INCB 052793, NS 018, C 410, CT 1578, JTE 052, PF 6263276, R 548, TG 02, 룸브리쿠스 레벨루스 추출물, ARN 4079, AR 13154, UR 67767, CS510, VR588, DNX 04042 또는 히포포린 또는 이들의 조합물인, 키트.
  61. 제57항에 있어서,
    상기 저해제가 OSM-Rβ 항체인, 키트.
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